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CN119654136A - 一种脂质组合物 - Google Patents

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CN119654136A
CN119654136A CN202380057606.6A CN202380057606A CN119654136A CN 119654136 A CN119654136 A CN 119654136A CN 202380057606 A CN202380057606 A CN 202380057606A CN 119654136 A CN119654136 A CN 119654136A
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CN
China
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lipid
compound
alkyl
lipid composition
glycero
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Application number
CN202380057606.6A
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English (en)
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黄雷
沈明云
李航文
沈海法
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Siwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Siwei Shanghai Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Publication of CN119654136A publication Critical patent/CN119654136A/zh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
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Abstract

一种药物递送系统，具体涉及脂质组合物，所示包含治疗剂和/或预防剂如RNA的脂质组合物可用于将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物细胞或器官，以例如调控多肽、蛋白质或基因表达。

Description

一种脂质组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年8月9日提交的中国专利申请号202210948906.0的优先权，其整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及药物递送系统，并且具体涉及脂质组合物以及相关产品和在肌内注射上的应用。
背景技术
含脂质的纳米粒子组合物、脂质体和脂质体复合物(lipoplex)作为运输媒介物，能有效地将生物活性物质如小分子药物、蛋白质和核酸运送至细胞和/或细胞内隔室中。这些脂质组合物一般包含阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和/或表面活性剂。
现有的基于脂质的药物递送系统，如脂质体，脂质纳米颗粒(LNP)药物递送系统等在这几年得到广泛应用。但在实际使用过程中，发现这些基于脂质的药物递送系统存在着许多问题，例如脂质体生产方法复杂且需要使用有机溶剂、药物包封效率低；例如未经修饰的LNP系统体内稳定性差，靶向性差。并且现有的脂质递送系统在递送核酸至生物体后，核酸在体内的表达量较低，而且在冻干保存过程中，存在稳定性问题，冻干复溶后的核酸表达量明显降低，影响使用。为了提高稳定性，也通常需要添加如N-(甲氧基-聚(乙二醇)-氧羰基)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等稳定剂，使制备过程复杂，成本提高。所以需要研究更高效稳定的脂质递送系统。
目前已开发出许多新型高效的脂质递送系统。例如CN110974954A提供了一种增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒，其具有对核酸的包封效率高，粒径分布窄的优点。例如CN110638759A也提供了一种用于体外转染和体内递送mRNA的制剂，能有更低毒性并且使核酸在体内有更好的免疫效果。虽然基于脂质的药物递送系统的研究已经取得了显著进展，但是仍然需要更加高效、稳定、靶向性好的脂质递送系统。
发明内容
本发明一方面提供一种脂质组合物，其包含治疗剂或预防剂以及包封治疗剂或预防剂的脂质，其中包封所述治疗剂或预防剂的脂质包含阳离子脂质、磷脂、类固醇和聚乙二醇修饰的脂质；所述组合物还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述治疗剂或预防剂缔合为复合物，共同包封在脂质中形成脂质多聚复合物。
在一实施方案中，所述治疗剂或预防剂为核酸，例如RNA，特别是mRNA。
在一实施方案中，所述阳离子脂质包含式(I)、(II)、(III)、(IV)的脂质化合物或其药学上可接受的盐，其如本文所限定。优选地，所述阳离子脂质为M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
在一实施方案中，所述阳离子脂质不包括T5’。
在一优选方案中，所述脂质组合物包含
10-70摩尔％的阳离子脂质、10-70摩尔％的磷脂、10-70摩尔％的类固醇和0.05-20摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质；
优选包含35-50摩尔％的阳离子脂质、10-30摩尔％的磷脂、24-44摩尔％的类固醇和1-1.5摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质；和/或
阳离子脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG；
优选地，其包含50摩尔％的阳离子脂质、10摩尔％的DOPE、38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG或40摩尔％的阳离子脂质、15摩尔％的DOPE、43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG。
在一实施方案中，所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸包含编码区，所述编码区编码修饰的刺突蛋白，其中所述修饰的刺突蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；并且其中所述多核苷酸为RNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者其中所述多核苷酸为DNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸为RNA，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者所述多核苷酸为DNA，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的脂质组合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
在又一方面，本发明还提供一种注射剂，其包含本发明的脂质组合物，以及药学上可接受注射用赋形剂。
在另一方面，本发明还提供本发明的脂质组合物、本发明的药物组合物或本发明的注射剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症。
在另一方面，本发明还提供本发明的脂质组合物、本发明的药物组合物或本发明的注射剂在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
在另一方面，本发明还提供一种预防或治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用本发明的脂质组合物、本发明的药物组合物或本发明的注射剂。所述脂质组合物、药物组合物可以通过注射施用，优选肌内注射。
在一方面，本发明还提供一种将治疗剂或预防剂递送至受试者哺乳动物细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的脂质组合物或药物组合物，所述施用包括使所述细胞与所述脂质组合物接触，由此将所述治疗剂及/或预防剂递送至所述细胞。
在又一方面，本发明还提供一种在受试者哺乳动物细胞中产生目标多肽的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的脂质组合物或药物组合物接触，其中所述治疗剂或预防剂是mRNA，且其中所述mRNA编码目标多肽，由此所述mRNA能够在所述细胞中翻译以产生目标多肽。
在一些实施方案中，所述脂质组合物、所述药物组合物或所述药物通过以下途径施用：肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内或阴道内；优选通过肌内注射施用。
附图说明
图1示出CDC处方和BIC处方制备的LPP制剂在小鼠肝脏和注射部位的荧光素酶表达结果。
图2A-2B示出SW0123.351-LPP储藏不同时间后体内荧光素酶表达和体外理化性质的检测结果。图2A为体内荧光素酶表达结果。图2B为平均粒径(Z-Average)检测结果。
图3A-3B示出SW0123.351-LPP溶液经不同冻融次数处理后的体内荧光素酶表达和体外理化性质的检测结果。图3A为体内荧光素酶表达结果。图3B为平均粒径(Z-Average)检测结果。
图4示出SW0123.351-LPP冻干前后在小鼠体内的免疫原性检测结果。
图5A-5C示出SW0123.351-LPP冻干粉在25℃储藏不同时间后粒径、包封效率、免疫原性的检测结果。图5A为平均粒径(Z-Average)检测结果。图5B为包封效率检测结果。图5C为免疫原性检测结果。
图6示出阳离子脂质为M5的不同处方制备的LNP或LPP制剂在小鼠注射部位0-24小时的荧光素酶表达结果。
图7A-7C示出阳离子脂质为M5的不同处方制备的LNP或LPP制剂在给药后3小时、6小时，在小鼠注射部位或肝脏的荧光素酶表达结果。图7A为给药后3小时检测结果。图7B为给药后6小时检测结果。图7C为注射后6小时，小鼠肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。
图8示出阳离子脂质为SM-102、ALC-0315、SW-II-115、SW-II-121的不同处方制备的LNP或LPP制剂在小鼠注射部位0-24小时的荧光素酶表达结果。
图9示出阳离子脂质为M5、SM-102、ALC-0315、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2、SW-II-140-2、SW-II-122的不同处方制备的LNP或LPP制剂的小鼠肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。
图10示出阳离子脂质为M5、MC3、SW-II-121的不同处方制备的LNP制剂在小鼠注射部位和肝脏的荧光素酶表达结果。
图11A-11E示出阳离子脂质为SW-II-121的不同处方制备的LPP制剂在小鼠注射部位和肝脏0-24小时的荧光素酶表达结果。图11A为各脂质组合物在注射部位(肌肉组织)中的表达。图11B为不同磷脂和PEG的组合在注射部位(肌肉组织)中的表达。图11C为各脂质组合物在肝脏中的表达。图11D为不同磷脂和PEG的组合在肝脏中的表达。图11E为各脂质组合物肌肉/肝脏的荧光素酶表达的比值。
图12示出LPP/mRNA疫苗的制备与表征。(A)示出四种包封荧光素酶mRNA的LPP制剂的处方；(B和C)示出四种包封荧光素酶mRNA的LPP制剂在注射后24小时在注射部位和肝脏的mRNA表达效率；(D)示出通过冷冻电镜对LPP-B2进行表征的图像；(E)示出注射LPP/eGFP 6小时后，小鼠荧光素酶表达的生物发光图像；(F)示出通过流式细胞术检测的C2C12细胞和DC2.4细胞与LPP/eGFP孵育24小时后细胞中eGFP的表达结果；(G)示出通过流式细胞术检测的注射LPP/eGFP 24小时后小鼠淋巴结细胞亚群中eGFP的表达结果；(H)示出通过流式细胞术检测的注射空白运载体LPP或LPP/Luc 24小时后小鼠淋巴结DC成熟标志物CD40、CD80、CD86和MHC-II的结果。(F、G和H)的数据以平均值±SEM(n＝5)表示。
图13示出通过流式细胞术检测的A20细胞、Jurkat T细胞和HSkMC细胞与LPP/eGFP孵育24小时后细胞中eGFP的表达结果
图14示出注射LPP/eGFP 24小时后，小鼠体内荧光素酶表达的生物发光情况。(A)示出注射LPP/eGFP 24小时后，小鼠肝脏和注射部位的荧光素酶表达的统计结果；(B)示出小鼠局部注射部位和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结)的荧光素酶表达的生物发光图像。
图15示出识别淋巴结细胞群的门控策略。
图16示出识别淋巴结中CD11c+细胞的门控策略。
图17示出LPP/mRNA体外抗原表征和体内免疫原性。(A)示出编码修饰后刺突蛋白的mRNA的示意图；(B)示出刺突糖蛋白表达和去糖基化分析，箭头分别表示糖基化或去糖基化的刺突蛋白的条带，三角形分别表示糖基化或去糖基化的S1蛋白条带；(C)示出C57BL/6小鼠(n＝8)免疫程序；(D)示出通过ELISA检测的免疫小鼠的血清中RBD特异性IgG滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(E)示出通过假病毒中和测定检测的免疫小鼠的血清中针对野生型毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(F)示出通过ELISpot检测的免疫小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的T 细胞频率，数据以平均值±SEM表示；(G-J)示出通过流式细胞术检测的疫苗诱导的T细胞的细胞因子模式，数据以平均值±SEM表示；(K)示出通过ELISA检测的接种2周后收集的小鼠血清中疫苗特异性IgG1和IgG2c滴度以及IgG2c/IgG1比值；(L)示出BALB/c年老小鼠免疫和攻毒实验策略；(M)和(N)分别示出攻毒后小鼠存活率以及体重变化情况，数据以平均值±SEM表示(n＝8)。
图18示出通过流式细胞术检测的编码修饰的刺突蛋白的mRNA在HEK-293细胞和DC2.4细胞细胞表面的表达情况。
图19示出通过流式细胞术检测的LPP/mRNA疫苗诱导的IL-4分泌结果。
图20示出LPP/mRNA在恒河猴体内诱导强免疫原性。(A)示出恒河猴免疫、攻毒、样本采集和评估的实验策略；(B)示出通过ELISA检测的免疫恒河猴的血清中RBD特异性IgG滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(C)示出通过假病毒中和测定检测的免疫恒河猴的血清中针对野生型毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(D)示出通过假病毒中和测定检测的免疫恒河猴的血清中针对Delta和Omicron(BA.1)变异毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(E)示出活病毒细胞病变效应(CPE)试验检测的针对变异毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(F)示出通过ELISpot检测的免疫恒河猴PBMC中分泌IFN-γ的T细胞的频率，数据以平均值±SEM表示；(G)示出通过流式细胞术检测的恒河猴PBMC中刺突蛋白特异性MBC的频率，数据以平均值±SEM表示。
图21示出LPP/mRNA保护恒河猴免受SARS-CoV-2感染而死亡。病毒攻击后，通过RT-PCR检测(A)鼻拭子、(B)口咽拭子和(C)肛门拭子中的病毒RNA拷贝；(D)示出RT-PCR检测的肺组织病毒RNA拷贝数。(E)示出攻击后第7天恒河猴肺部的组织病理学变化。
图22(A和B)分别示出攻毒后1-7天，疫苗组和生理盐水组的恒河猴的体重和体温的变化情况。
图23示出同源或异源LPP/mRNA加强剂增强疫苗效力。(A)示出同源加强免疫的实验策略；(B)示出通过ELISA检测的免疫小鼠第84天的血清中RBD特异性IgG滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(C)示出通过假病毒中和测定检测的免疫小鼠第84天的血清中针对野生型毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(D)示出通过ELISpot检测的免疫小鼠第84天脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞频率，数据以平均值±SEM表示；(E-G)示出通过假病毒中和测定检测的第84天免疫小鼠的血清中针对Delta和Omicron(BA.1和BA.4/5)变异毒株的中和抗体滴度，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(H)示出异源加强免疫的实验策略；(I)示出通过ELISA检测的免疫小鼠第84天相对于第28天血清中RBD特异性IgG的倍数变化，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(J)示出通过假病毒中和测定检测的免疫小鼠第84天相对于第28天血清中针对野生型毒株的中和抗体滴度的倍数变化，数据表示为几何平均值，95％置信区间；(K)示出通过ELISpot检测的免疫小鼠第84天脾脏和肺脏中分泌IFN-γ的T细胞频率，数据以平均值±SEM表示；(L-N)示出通过假病毒中和测定检测的免疫小鼠第84天相对于第28天的血清中针对Delta和Omicron(BA.1和BA.4/5)变异毒株的中和抗体滴度的倍数变化，数据表示为几何平均值，95％置信区间。
图24示出LPP/mRNA疫苗在恒河猴中的安全性研究。(A)示出恒河猴免疫、样本采集以及评估策略。(B-E)分别示出特定时间点白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYMPH)、谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的检测结果。(F和G)分别示出在整个研究期间恒河猴体温和体重增加的变化情况，数据以平均值±SEM表示；(H)示出恒河猴的注射部位在第30天和第59天时的组织病理学变化。
图25示出给药前，第1天和第29天给药24小时后以及给药后第56天，恒河猴体内细胞因子IL-6的检测结果。
具体实施方案
一般定义和术语
本文引用的所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书和指南等，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学相关术语均为相应领域内广泛使用的术语。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，表述“包括”、“包含”、“含有”和“具有”是开放式的，表示包括所列举的元素、步骤或组分但不排除其他未列举的元素、步骤或组分。表述“由……组成”不包括未指定的任何元素、步骤或组分。表述“基本上由……组成”是指范围限于指定的元素、步骤或组分，加上不显著影响要求保护的主题的基本和新颖性质的任选存在的元素、步骤或组分。应当理解，表述“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖在表述“包含”的含义之内。
如本文所用，除非上下文另外指明，单数形式的表述“一个”、“一种”或“这个”包括复数指代。术语“一个或多个”或者“至少一个”涵盖1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个。
本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非明确指出相反，在本文示出的数值或范围均由“约”修饰，表示所列举或声称的数值或范围±20％、±10％、±5％或±3％。
除非另有说明，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。
在本文中，“核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及其衍生物。如本文所用，“核糖核苷酸”是核糖核酸(RNA)的构成物质，由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸组成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置具有羟基的核苷酸。而“脱氧核糖核苷酸”是脱氧核糖核酸(DNA)的构成物质，也由一分子碱基，一分子五碳糖，一分子磷酸构成，其是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2’位置的羟基被氢取代的核苷酸，是染色体的主要化学成分。“核苷酸”通常由代表其中碱基的单字母来指代：“A(a)”指含有腺嘌呤的脱氧腺苷酸或腺苷酸，“C(c)”指含有胞嘧啶的脱氧胞苷酸或胞苷酸，“G(g)”指含有鸟嘌呤的脱氧鸟苷酸或鸟苷酸，“U(u)”指含有尿嘧啶的尿苷酸，“T(t)”指含有胸腺嘧啶的脱氧胸苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，用于指脱氧核糖核苷酸的聚合物(脱氧核糖核酸，DNA)或核糖核苷酸的聚合物(核糖核酸，RNA)。“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，用来表示多核苷酸中核苷酸的排序。本领域人员应当理解，DNA编码链(有义链)与其编码的RNA可以看作具有相同的核苷酸序列，DNA编码链序列中的脱氧胸苷酸对应其编码的RNA序列中的尿苷酸。
如本文所用，关于序列的术语“％相同性”是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。两个序列之间的差异可以分布在待比较序列的局部区域(区段)或整个长度上。通常在对区段或“比较窗口”最佳比对之后，确定两个序列之间的相同性。最佳比对可以手动进行，或者借助于本领域已知算法，包括但不限于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482和Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443描述的局部同源性算法，Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444描述的相似性搜索方法，或使用计算机程序，例如Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA进行。例如，可以利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公共可用的BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序 列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得％相同性。在一些实施方案中，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的区域给出相同性程度。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
如本文所用，“修饰过的”指非天然的。例如，RNA可以是修饰过的RNA。也就是说，RNA可以包括一个或多个非天然存在的核碱基、核苷、核苷酸或连接基团。“修饰过的”基团在本文中还可以称为“改变的”基团。基团可以在化学上、结构上或功能上进行修饰或改变。例如，修饰过的核碱基可以包括一个或多个非天然存在的取代。
如本文所用，术语“表达”包括核苷酸序列的转录和/或翻译。因此，表达可以涉及转录物和/或多肽的产生。术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录为RNA(转录物)的过程。术语“体外转录”指在不含细胞的系统中(例如在适当的细胞提取物中)体外合成RNA，特别是mRNA。可以用于产生转录物的载体又称为“转录载体”，其中包含转录所需的调控序列。术语“转录”涵盖“体外转录”。
如本文所用，术语“宿主细胞”指用于接受、保持、复制、表达多核苷酸或载体的细胞。
如本文所使用，“脂肪族”基团是其中碳原子连接成链的非芳香族基团，并且可以是饱和或不饱和。
如本文所用，术语“烷基”指包括一个或多个碳原子的任选被取代的直链或分支链饱和烃。术语“C1-C12烷基”或“C1-12烷基”指包括1-12个碳原子的任选被取代的直链或分支链饱和烃。如本文所用，术语“烷氧基”指本文所述的烷基，其通过氧原子连接至分子的剩余部分。术语“亚烷基”指失去一个氢原子的相应烷基形成的二价基团。术语“C1-C12亚烷基”或“C1-12亚烷基”指包括1-12个碳原子的任选被取代的直链或分支链亚烷基。
如本文所用，术语“烯基”指包括两个或更多个碳原子和至少一个双键的任选被取代的直链或分支链烃。术语“C2-C12烯基”或“C2-12烯基”指包括2-12个碳原子和至少一个碳-碳双键的任选被取代的直链或分支链烃。烯基可以包括一个、两个、三个、四个或更多个碳-碳双键。
如本文所用，术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。
如本文所使用，术语“碳环”指包括一个或多个由碳原子构成的环的单环或多环非芳香系统。术语“C3-8碳环”意思指包括3-8个碳原子的碳环。碳环可以包括一个或多个碳-碳双键或三键。碳环的实例包括但不限于环丙基、环戊基、环己基等。如本文所使用，当碳环为饱和时(即，不含不饱和键)，也可以指代相应的环烷基。除非另外具体说明，否则本文所述的碳环是指未取代和被取代，即，任选被取代的碳环。
如本文所使用，术语“杂环”指包括一个或多个环且包括至少一个杂原子的单环或多环系统。杂原子可以是例如氮、氧、磷或硫原子。杂环可以包括一个或多个双键或三键并且可以是非芳香族的。杂环的实例包括但不限于咪唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、吡唑烷基、异噁唑烷基、异噻唑烷基、吗啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基和哌啶基。杂环可以包含例如3-10个原子(非氢)，即3-10元杂环(例如3、4、5、6、7、8、9或10元)，其中一个或多个原子为杂原子(例如N、O、S或P)。当杂环为饱和时(即，不含不饱和键)，也可以指代相应的杂环烷基。除非另外具体说明，否则本文所述的杂环是指未取代和被取代的杂环基团两种，即，任选被取代的杂环。
如本文所用，术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，C6-C10烷基芳基可以具有6-10个碳原子，例如6、7、8、9、10个碳原子。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基等。
如本文所用，术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C，并且具有至少一个芳香环。杂芳基可以具有5-10个环原子(5-10元杂芳基)，其包括5、6、7、8、9或10元，特别是5或6元杂芳基。杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三 唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。
如本文所用，术语“被一个或多个基团中断”是指碳链上存在此一个或多个基团，并且碳链的其余部分与所述一个或多个基团两端相连。
除非另外具体说明，否则本文所述的基团(例如，R1-R7中的任一个，如烷基、亚烷基、烯基、芳基、氨基等)可以任选被取代。可选取代基可以选自以下，但不限于：卤素原子(例如氯基、溴基、氟基或碘基)、羧酸(例如-C(O)OH)、醇(例如羟基，-OH)、酯(例如-C(O)OR或-OC(O)R)、醛(例如-C(O)H)、羰基(例如-C(O)R，或由C＝O表示)、酰基卤(例如-C(O)X，其中X是选自溴、氟、氯和碘的卤基)、碳酸酯基(例如-OC(O)OR)、烷氧基(例如-OR)、缩醛(例如-C(OR)2R””，其中各OR是相同或不同的烷氧基并且R””是烷基或烯基)、磷酸根(例如P(O)4 3-)、硫醇(例如-SH)、亚砜(例如-S(O)R)、亚磺酸(例如-S(O)OH)、磺酸(例如-S(O)2OH)、硫醛(例如-C(S)H)、硫酸根(例如S(O)4 2-)、磺酰基(例如-S(O)2-)、酰胺(例如-C(O)NR2或-N(R)C(O)R)、叠氮基(例如-N3)、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如-NC)、酰氧基(例如-OC(O)R)、氨基(例如-NR2、NRH或-NH2)、氨甲酰基(例如-OC(O)NR2、-OC(O)NRH或-OC(O)NH2)、磺酰胺(例如-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H、-N(H)S(O)2H)、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基或3-10元杂环。在前述任一种中，R各自独立地可以是如本文所定义的取代基，如烷基、烷氧基、亚烷基、卤素、碳环、杂环、芳基、杂芳基、烯基。在一些实施方案中，取代基本身可以进一步被例如一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所定义的取代基取代。例如，烷基可以进一步被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的取代基取代。
如本文所用，术语“化合物”意在包括所描绘结构的同位素化合物。“同位素”是指具有相同原子数但因核中的中子数量不同而具有不同质量数的原子，例如氘同位素。例如，氢的同位素包括氚和氘。另外，本发明的化合物、盐或复合物可以与溶剂或水分子组合制备以通过常规方法形成溶剂化物和水合物。
术语“任选”或“任选地”(例如，任选地被取代)是指随后描述的事件可能会或可能不会发生，并且描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况不发生的实例。例如，“任选取代的烷基”是指烷基可以被取代，也可以不被取代，并且该描述包括取代的烷基自由基和没有取代的烷基自由基。
应理解，当化学基团按特定顺序书写时，除非另外说明，还涵盖了相反顺序。例如在M1定义为-C(O)NH-的通式-(R)i-(M1)k-(R)m-(即，-(R)i-C(O)-NH-(R)m-)中，除非另外说明，还涵盖了M1为-NHC(O)-的化合物(即，-(R)i-NHC(O)-(R)m-)。
如本文所用，术语“接触”指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与脂质组合物接触意味着，使哺乳动物细胞和脂质纳米颗粒共有物理连接。使细胞与外部实体在体内和离体接触的方法是生物领域中众所周知的。例如，使脂质组合物与处于哺乳动物体内的哺乳动物细胞接触可以通过不同施用途径(例如静脉内、肌内、皮内和皮下)进行并且可以涉及不同量的脂质组合物。此外，脂质组合物可以接触超过一个哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“递送”指将实体提供至目标。例如，将治疗剂或预防剂递送至受试者可涉及将包括该治疗剂或预防剂的组合物施用给该受试者。
如本文所用，术语“受试者”描述了可以对其提供使用本发明组合物的生物体。预期可施用这些组合物的受试者包括但不限于人、其他灵长类动物和其他哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠。优选地，受试者可以为哺乳动物，特别是人。
如本文所用，“包封效率”是指变为组合物的一部分的治疗剂或预防剂的量与用于制备组合物中的治疗剂或预防剂的初始总量的比率。例如，如果在最初提供至组合物中的总计100mg治疗剂或预防剂中有97mg治疗剂或预防剂被包封于组合物中，则可以得出包封效率是97％。如本文所用，“包封”可以指完全、大部分或部分封装、密封、包围或包装。
如本文所用，“脂质组分”是包括一种或多种脂质的组合物的组分。例如，脂质组分可以包括一种或多种阳离子脂质、聚乙二醇化脂质、结构脂质或辅助脂质。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内、适于与人类和动物组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，并且与合理的效益/风险比相符的化合物、 盐、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化成其盐形式(例如通过使游离碱性基团与适合有机酸反应)而改变。药物可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐等。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、褐藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括但不限于钠、锂、钾、钙、镁盐等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本发明的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明的药学上可接受的盐可以由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。一般而言，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中，或在这两种的混合物中反应来制备；一般优选非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
如本文所用，“多分散指数”或“PDI”是描述一个系统的粒度分布的均质性的一种比率。较小的值，例如小于0.3，指示较窄的粒度分布。
如本文所用，“ζ电位”是指例如脂质组合物中脂质的电动电位，是表征分散系稳定性的重要指标。
如本文所用，在组合物情况下“大小”或“平均大小”是指组合物的平均直径。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全地减轻、改良、改善、缓解特定感染、疾病、病症或病况的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度或减少其发生。“预防”指防范潜在疾病或防范症状恶化或疾病发展。
术语“预防或治疗有效量”是指足以预防或抑制疾病或症状的发生和/或减缓、减轻、延迟疾病或症状的发展或严重程度的试剂(例如核酸、药物、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。预防或治疗有效量受到包括但不限于以下因素的影响：疾病或症状的发展速度和严重程度，受试者的年龄、性别、体重和生理状况，治疗的持续时间以及具体施用途径。预防或治疗有效量可以在一个或多个剂量中施用。预防或治疗有效量可以通过持续或间断施用实现。
脂质组合物
本文提供一种脂质组合物。所述脂质组合物为脂质递送载体，脂质可将治疗剂或预防剂(如核苷酸)包封形成纳米颗粒，从而递送至生物体内。
如本文所用，术语“脂质”是指包含疏水部分并且任选地还包含亲水部分的有机化合物。脂质通常难溶于水但可溶于许多有机溶剂。通常，包含疏水部分和亲水部分的两亲性脂质可以在水环境中组织为脂质双层结构，例如以囊泡形式存在。脂质可以包括但不限于：脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、糖脂和类固醇和胆固醇酯等。
如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，其是由脂质形成的颗粒，脂质成分发生分子间相互作用而形成纳米结构实体。治疗剂或预防剂(如核酸，例如mRNA)被包封在脂质中。
特别优选的脂质组合物可以是例如本文所述的脂质多聚复合物(LPP)。制备这类组合物的方法可以如本文所述。LPP是具有核-壳结构的颗粒，其中治疗剂或预防剂(如核酸，例如mRNA)包含于多聚复合物中，而多聚复合物本身被包封于生物相容性脂质双层壳中以构成本发明的脂质纳米颗粒。 在一些实施方案中，本发明的脂质组合物为脂质多聚复合物(LPP)。在一些实施方案中，本发明的组合物为包含RNA的脂质多聚复合物(LPP)。
在一些实施方案中，所述的包封治疗剂或预防剂(如核酸，例如mRNA)的脂质选择如下脂质的一种或者几种：阳离子脂质、磷脂、类固醇和/或聚乙二醇修饰的脂质。在一优选实施方案中，所述阳离子脂质为可离子化阳离子脂质。
在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质，其中阳离子脂质包含DOTMA、DOTAP、DDAB、DOSPA、DODAC、DODAP、DC-Chol、DMRIE、DMOBA、DLinDMA、DLenDMA、CLinDMA、DMORIE、DLDMA、DMDMA、DOGS、N4-胆固醇基-精胺、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、如本文所述的式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其组合。在一优选实施方案中，阳离子脂质包含M5、MC3、ALC-0315、SM-102。在一优选实施方案中，阳离子脂质包含SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。在一优选实施方案中，阳离子脂质包含M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
在一实施方案中，脂质组合物包含磷脂和/或类固醇。在一实施方案中，脂质组合物包含如本文所述的磷脂，其中磷脂包含1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或其组合。在一实施方案中，脂质组合物包含如本文所述的类固醇，其中类固醇包含胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其衍生物。在一实施方案中，脂质组合物包含如本文所述的磷脂和类固醇。在一实施方案中，脂质组合物包含DOPE。在一实施方案中，脂质组合物包含DSPC。在一实施方案中，脂质组合物包含胆固醇。在一实施方案中，脂质组合物包含DOPE和胆固醇。在一实施方案中，脂质组合物包含DSPC和胆固醇。
在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，磷脂DOPE和胆固醇。在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，磷脂DSPC和胆固醇。
在一些实施方案中，包封多核苷酸的脂质进一步包含聚乙二醇修饰的脂质。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质包含DMG-PEG(例如DMG-PEG 2000)、DOG-PEG和DSPE-PEG或其组合。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质为DSPE-PEG。在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质为DMG- PEG(例如DMG-PEG 2000)。
在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG。
在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG。
在一实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DMG-PEG。
在一优选的实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG。
在一优选的实施方案中，脂质组合物包含阳离子脂质M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2、DOPE、胆固醇和DMG-PEG。
在一些实施方案中，本发明的脂质组合物进一步包含阳离子聚合物，所述阳离子聚合物与所述治疗剂或预防剂(如核酸，例如mRNA)缔合为复合物，共同包封在所述脂质中。
在一实施方案中，阳离子聚合物包含聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)或其组合。在一实施方案中，阳离子聚合物为鱼精蛋白。在一实施方案中，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。
在一实施方案中，脂质组合物中脂质的量以摩尔百分比(摩尔％)来计算，摩尔百分比基于组合物中脂质的总摩尔来确定。除非特别指明，组合物中各脂质的量(摩尔％)的总和为100摩尔％，即阳离子脂质、磷脂、类固醇和聚乙二醇修饰的脂质的量(摩尔％)的总和为100摩尔％。
在一实施方案中，脂质组合物中阳离子脂质的量为约10-约70摩尔％。在一些实施方案中，脂质组合物中阳离子脂质的量为约20-约60摩尔％、约30-约50摩尔％、约35-约50摩尔％、约35-约45摩尔％、约38-约45摩尔％、约40-约45摩尔％、约40-约50摩尔％或约45-约50摩尔％。例如，阳离子脂质的量可为约10、15、20、25、30、35、38、40、45、50、55、60、65、70摩尔％。
在一实施方案中，脂质组合物中磷脂的量为约10-约70摩尔％。在一实施方案中，脂质组合物中磷脂的量为约20-约60摩尔％、约30-约50摩尔％、约10-约30摩尔％、约10-约20摩尔％或约10-约15摩尔％。例如，磷脂的量可为约10、15、20、25、30、33.5、35、40、45、50、53.5、55、60、65或70摩尔％。
在一实施方案中，脂质组合物中胆固醇的量为约10-约70摩尔％。在一实施方案中，脂质组合物中胆固醇的量为约20-约60摩尔％、约24-44摩尔％、约30-约50摩尔％、约35-约40摩尔％、约35-约45摩尔％、约40-约45摩尔％或约45-约50摩尔％。例如，胆固醇的量可为约10、13.5、15、18.5、18.75、20、23.5、23.75、24、25、28.5、28.75、29、30、33.75、34、35、38.5、38.75、39、40、43、43.5、44、45、48.5、50、55、60、65或70摩尔％。
在一实施方案中，脂质组合物中聚乙二醇修饰的脂质的量为约0.05-约20摩尔％。在一实施方案中，脂质组合物中聚乙二醇修饰的脂质的量为约0.5-约15摩尔％、约1-约10摩尔％、约5-约15摩尔％、约1-约5摩尔％、约1-约1.5摩尔％、约1.5-约3摩尔％或约2-5摩尔％。例如，聚乙二醇修饰的脂质的量可为约0.05、1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15或20摩尔％。
在一实施方案中，脂质组合物包含10-70摩尔％的阳离子脂质、10-70摩尔％的磷脂、10-70摩尔％的类固醇和0.05-20摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质。在一优选实施方案中，脂质组合物包含35-50摩尔％的阳离子脂质、10-30摩尔％的磷脂、24-44摩尔％的类固醇和1-1.5摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质。
在一实施方案中，LPP包含本发明的治疗剂或预防剂(如核酸，例如mRNA)，其与阳离子聚合物缔合为复合物；以及包封所述复合物的脂质，其中所述包封复合物的脂质包含阳离子脂质、磷脂、类固醇和聚乙二醇修饰的脂质。在一实施方案中，所述磷脂选自1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)或其组合。在一实施方案中，所述类固醇为胆固醇。在一实 施方案中，所述阳离子聚合物为鱼精蛋白。在一实施方案中，所述聚乙二醇修饰的脂质选自1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)或其组合。在一实施方案中，所述阳离子脂质选自M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
在一实施方案中，所述包封复合物的脂质包含50摩尔％的M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，10摩尔％的DOPE，38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG。在一实施方案中，所述包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，15摩尔％的DOPE，43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG。
在一实施方案中，所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸包含编码区，所述编码区编码修饰的刺突蛋白，其中所述修饰的刺突蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；并且其中所述多核苷酸为RNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者其中所述多核苷酸为DNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，所述多核苷酸为RNA，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者所述多核苷酸为DNA，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，15摩尔％的DOPE，43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG；所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸包含编码区，所述编码区编码修饰的刺突蛋白，其中所述修饰的刺突蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；并且其中所述多核苷酸为RNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者其中所述多核苷酸为DNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5，15摩尔％的DOPE，43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG；所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸包含编码区，所述编码区编码修饰的刺突蛋白，其中所述修饰的刺突蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；并且其中所述多核苷酸为RNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者其中所述多核苷酸为DNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2，15摩尔％的DOPE，43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG；所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸为RNA，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者所述多核苷酸为DNA，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，包封复合物的脂质包含40摩尔％的M5，15摩尔％的DOPE，43.5摩尔％的 胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG；所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸为RNA，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者所述多核苷酸为DNA，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
阳离子脂质
阳离子脂质是在指定pH下可以带有净正电荷的脂质。带有净正电荷的脂质可以通过静电相互作用与核酸缔合。
阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium-propane，DOTMA)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、双十烷基二甲基溴化铵(Didecyldimethylammonium bromide，DDAB)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓三氟乙酸盐(2,3-dioleoyloxy-N-[2(spermine carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamium trifluoroacetate，DOSPA)、双十八烷基二甲基氯化铵(dioctadecyldimethyl ammonium chloride，DODAC)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane，DODAP)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(3-(N—(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氨鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine，DMOBA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯基氧基)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane，CLinDMA)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺鎓溴化物(N-(2-aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-aminium bromide，DMORIE)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)propan-1-amine，DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-amine，DMDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine，DOGS)、N4-胆固醇基-精胺(N4-cholesteryl-spermine)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、如本文所述的式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其组合。
在一些实施方案中，阳离子脂质优选为可离子化阳离子脂质。可离子化阳离子脂质在例如酸性pH下带有净正电荷，而在较高pH(例如生理pH)下是中性的。可离子化阳离子脂质的实例包括但不限于：双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine，DOGS)、N4-胆固醇基-精胺(N4-cholesteryl-spermine)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、如本文所述的式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其组合。
在一实施方案中，阳离子脂质包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1和R2各自独立选自键、C1-C12烷基和C2-C12烯基；
R3和R4各自独立选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；
R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
M1和M2各自独立地选自键、H、-O-、-S-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、3-10元杂环、-NR7-，或者
R5与M1和M2之一连同所连接的N原子一起形成3-10元杂环，且对应的R1/R3或者R2/R4不存在，所述杂环任选地被R7取代；
R5选自C3-8碳环、-C1-12亚烷基-Q，Q选自H、-OR7、-SR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)S(O)2R7、-N(R7)C(S)R7、-N(R7)2、氰基、C3-8碳环、3-10元杂环、C6-C10芳基，上述基团各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代；
m和n各自独立为选自0-12的整数；
所述烷基、烯基和亚烷基各自任选地独立地被一个或多个选自以下的基团中断：-O-、-S-、-NR7-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、C3-8碳环，且所述烷基、烯基和亚烷基各自任选地被一个或多个R7取代；
R7各自独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、C3-8碳环，上述基团各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在一实施方案中，R1和R2各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基，例如C1-C12烷基。在又一实施方案中，R1和R2之一为键，另一个独立地选自C1-C12烷基和C2-C12烯基，例如C1-C12烷基。
在一实施方案中，R3和R4各自独立选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基。在又一实施方案中，R3和R4各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基。
R3和R4可以各自独立任选被t个R6取代，t为1、2、3、4、5。在一实施方案中，R6各自独立选自C1-C12烷基。
在又一实施方案中，R3和R4中至少一个为C6-C10芳基或5-10元杂芳基，例如C6-C10芳基。
在一实施方案中，R5选自C3-8碳环、-C1-12亚烷基-Q。Q可以选自H、-OR7、-SR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)S(O)2R7、-N(R7)C(S)R7、-N(R7)2、氰基、C3-8碳环、3-10元杂环、C6-C10芳基。上述基团，包括涵盖Q的选项的基团，当合适时，可以各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在又一实施方案中，R5选自C3-8碳环、-C1-12亚烷基-Q，Q选自H、-OR7、-SR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)S(O)2R7、-N(R7)C(S)R7、-N(R7)2、氰基、C3-8碳环、3-10元杂环、C6-C10芳基。上述基团，包括涵盖Q的选项的基团，当合适时，可以各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在式(I)的化合物中，R7可以各自独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、C3-8碳环，优选选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基。上述基团(当 合适时，例如H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、C3-8碳环)各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在一实施方案中，上述描述中的各个基团，例如C3-8碳环、-C1-12亚烷基-Q，包括涵盖Q选项的-OR7、-SR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)S(O)2R7、-N(R7)C(S)R7、-N(R7)2、C3-8碳环、3-10元杂环、C6-C10芳基，C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、C3-8碳环等可以各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在一实施方案中，式(I)化合物中的(例如R1-R7中提及的)烷基、烯基和亚烷基可以各自任选地独立地被一个或多个选自以下的基团中断：-O-、-S-、-NR7-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、C3-8碳环，且所述烷基、烯基和亚烷基各自任选地被一个或多个R7取代。即，所述烷基、烯基和亚烷基的链(直链或支链)中，可以各自任选地包含一个或多个选自以下的基团：-O-、-S-、-NR7-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、C3-8碳环。
R7各自独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、C3-8碳环；优选地，R7独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基。上述基团(当合适时，例如H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、C3-8碳环)各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
在式(I)的化合物中，m和n可以各自独立为选自0-12的整数，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。当取0时，表示对应的基团不存在。
在一实施方案中，M1或M2为键，相应的m或n不为0，M1或M2前的碳链与相应的R1或R2连接。
在一实施方案中，m或n为0，相应的M1或M2不为键，N原子直接与M1或M2相连接。
在一实施方案中M1或M2为键，相应的m或n为0，N原子直接与相应的R1或R2相连接。
在一实施方案中，M1和M2各自独立地选自-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-。在又一实施方案中，M1和M2各自独立地选自-NR7-，R7如上文所述。
在另一实施方案中，R5与M1和M2之一连同所连接的N原子一起形成3-10元杂环，且对应的R1/R3或者R2/R4不存在，所述杂环任选地被R7取代，R7如上文所述。
在一实施方案中，R5选自-C1-12亚烷基-Q，Q选自H、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)2、氰基，R7如上文所述。
在一优选实施方案中，R1和R2各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
其中R3和R4各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基。
M1和M2各自独立选自-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-和-C(S)S-；
R5选自-C1-12亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
m和n各自独立为选自1-12的整数。
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含M5或SM-102。
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含MC3。
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含ALC-0315。
在一实施方案中，阳离子脂质包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
R1和R2各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
R3和R4各自独立选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
条件是R3和R4中至少一个为C6-C10芳基或5-10元杂芳基，并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
M1和M2各自独立选自-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-和-C(S)S-；
R5选自-C1-12亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
m和n各自独立为选自1-12的整数。
在一实施方案中，R2选自C1-C12烷基。在另一实施方案中，R2选自C1-C6烷基。
在一实施方案中，R3和R4之一为C6-C10芳基或5-10元杂芳基，另一个为C1-C12烷基或C2-C12烯基。
在一具体实施方案中，R3和R4各自独立选自C1-C12烷基和苯基，条件是R3和R4中至少一个为苯基。在另一实施方案中，R3和R4之一为苯基，另一个为C1-C12烷基。
在又一实施方案中，R3和R4各自独立被t个R6取代，t为选自1-5的整数；例如1、2、3、4或5。优选地，t为1-3的整数，例如1、2或3，特别是1或2。
在一实施方案中，R6各自独立选自C1-C12烷基，例如C1-C10烷基。
在一实施方案中，t为1，R6取代于苯环上相对于R1或R2的间位或对位。
在另一实施方案中，t为2，R6取代于苯环上相对于R1或R2的间位和对位。
在一实施方案中，R4取代于R2的1位或末位。所述1位是指R2中与M2直接相连的C原子的位置。所述末位是指R2中与M2距离最远的C原子的位置。在一具体实施方案中，R4选自C1-C12烷基，R3为苯基。
在一实施方案中，R3取代于R1的1位或末位。所述1位是指R1中与M1直接相连的C原子的位置。所述末位是指R1中与M1距离最远的C原子的位置。在一具体实施方案中，R3选自C1-C12烷基，R4为苯基。
在一实施方案中，M1和M2各自独立选自-OC(O)-和-C(O)O-。
在一实施方案中，R5选自-C1-5亚烷基-Q，例如C1、C2、C3、C4或C5亚烷基-Q。在示例性实施方案中，R5选自-C1-3亚烷基-Q，例如C1、C2或C3亚烷基-Q。
在另一实施方案中，Q选自-OH和-SH，特别是-OH。
在一些实施方案中，m和n各自独立为选自2-9的整数，例如2、3、4、5、6、7、8或9。优选地，m和n各自独立为选自2-7的整数，例如2、3、4、5、6或7，更优选地，m和n各自独立为选自5-7的整数，例如5、6或7。
在某些实施方案中，式(I)的化合物包括式(II)所示的化合物：
或其药物可接受的盐，其中各基团如本文所定义。
在一实施方案中，
R1选自C1-C6烷基；
R2选自C1-C10烷基；
R4选自C1-C10烷基；
M1和M2各自独立选自-OC(O)-和-C(O)O-；
R5选自-C1-5亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基和C2-C12烯基；
R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基，特别是C1-C12烷基；
m和n各自独立为选自2-9的整数，例如2、3、4、5、6、7、8或9；
t为选自1-3的整数。
在一实施方案中，R5选自-C1-3亚烷基-Q，Q选自-OH和-SH，特别是-OH。
在一实施方案中，m和n各自独立为选自2-7的整数，例如2、3、4、5、6或7。
在一些实施方案中，t为1或2。
在一实施方案中，R4取代于R2的1位或末位。所述1位是指R2中与M2直接相连的C原子的位置。所述末位是指R2中与M2距离最远的C原子的位置。
在一实施方案中，t为1，R6取代于苯环上相对于R1的间位或对位。
在另一实施方案中，t为2，R6取代于苯环上相对于R1的间位和对位。
在某些实施方案中，式(I)的化合物包括式(III)所示的化合物：
或其药物可接受的盐，其中各基团如本文所定义。
在一实施方案中，
R1选自C1-C6烷基；
R2选自C1-C10烷基；
R4选自C1-C10烷基；
R5选自-C1-3亚烷基-Q，Q选自-OH和-SH，特别是-OH；
t为1或2；
R6选自C1-C12烷基和C2-C12烯基，特别是C1-C12烷基；
m和n各自独立为选自2-7的整数，例如2、3、4、5、6或7。
在一实施方案中，R4取代于R2的1位或末位。所述1位是指R2中与部分直接相连的C原子的位置。所述末位是指R2中与部分距离最远的C原子的位置。
在一实施方案中，t为1，R6取代于苯环上相对于R1的间位或对位。
在另一实施方案中，t为2，R6取代于苯环上相对于R1的间位和对位。
在某些实施方案中，式(I)的化合物包括式(IV)所示的化合物：
或其药物可接受的盐，其中各基团如本文所定义。
在一实施方案中，
R1选自C1-C6烷基；
R2选自C1-C10烷基；
R4选自C1-C10烷基；
t为1或2；
R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基，特别是C1-C12烷基；
m和n各自独立为选自2-7的整数，例如2、3、4、5、6或7。
在一实施方案中，R4取代于R2的1位或末位。所述1位是指R2中与部分直接相连的C原子的位置。所述末位是指R2中与部分距离最远的C原子的位置。
在一实施方案中，t为1，R6取代于苯环上相对于R1的间位或对位。
在另一实施方案中，t为2，R6取代于苯环上相对于R1的间位和对位。
在一特定的实施方案中，本发明的脂质化合物中的取代基中(例如，R1-R7)不包含烯基。
在优选的实施方案中，阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含以下脂质化合物：SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
在一优选实施方案中，阳离子脂质不包含T5’，
在一优选实施方案中，阳离子脂质包含以下脂质化合物：M5、MC3、ALC-0315、SM-102、SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
磷脂
本发明的脂质组合物中包含磷脂，其可以辅助脂质组合物的细胞渗透。
磷脂的实例包括但不限于：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血 磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或其组合。
类固醇
本发明的脂质组合物中包含类固醇，其可以充当脂质组合物的结构组分。
类固醇的实例包括但不限于例如胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其衍生物。
聚乙二醇修饰的脂质
如本文所用，术语“聚乙二醇修饰的脂质”或“PEG改性的脂质”或“PEG脂质”指包含聚乙二醇部分和脂质部分的分子，其是用聚乙二醇改性的脂质。PEG脂质可以选自由以下组成的非限制性组：PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺(PEG-CER)、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油(PEG-DEG)、PEG改性的二烷基甘油或其组合。例如，聚乙二醇修饰的脂质的实例包括但不限于：1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol，DMG-PEG)、1,2-二油酰基-rac-甘油,甲氧基-聚乙二醇(1,2-Dioleoyl-rac-glycerol,methoxypolyethylene Glycol，DOGPEG))和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly(ethylene glycol)，DSPE-PEG)。
在一实施方案中，聚乙二醇修饰的脂质为DMG-PEG，例如DMG-PEG 2000。在一实施方案中，DMG-PEG 2000具有以下结构：
其中n的平均值为44。
阳离子聚合物
如本文所用，术语“阳离子聚合物”涉及在指定pH下能够带有净正电荷从而与核酸静电结合的任何离子聚合物。阳离子聚合物的实例包括但不限于：聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)或其组合。聚乙烯亚胺可以是线性或支化的聚乙烯亚胺。
术语“鱼精蛋白”是指富含精氨酸的低分子量碱性蛋白，其存在于各种动物(特别是鱼)的精细胞中并代替组蛋白与DNA结合。在一优选实施方案中，阳离子聚合物为鱼精蛋白(例如硫酸鱼精蛋白)。
理化性质
脂质组合物的理化性质可以取决于其组分。例如，包括胆固醇作为结构性脂质的组合物可以具有与包括不同结构性脂质的组合物不同的理化性质。类似地，组合物的理化性质可以取决于其组分的绝对或相对量。例如，包括较高摩尔分数磷脂的组合物可以具有与包括较低摩尔分数磷脂的组合物不同的理化性质。理化性质还可以取决于制备组合物的方法和条件而变化。
脂质组合物的理化性质可以通过多种方法表征。例如，可以使用显微术(例如透射电子显微术或扫描电子显微镜捡查)检查组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电势分析法(例如电势滴定法)可以用于测量ζ电位。动态光散射还可以用于测定粒度。还可以使用仪器如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)测量组合物的多个特征，如粒度、多分散指数和ζ电位。
例如通过动态光散射(DLS)所测量，组合物的平均尺寸可以在数十纳米与数百纳米之间。例如，所述平均尺寸可以是约40nm至约250nm，如约40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、 230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm或300nm。在一些实施方案中，组合物的平均尺寸可以是约50nm至约300nm、约50nm至约290nm、约50nm至约280nm、约50nm至约270nm、约50nm至约260nm、约60nm至约300nm、约60nm至约290nm、约60nm至约280nm、约60nm至约270nm、约70nm至约300nm、约70nm至约290nm、约70nm至约280nm、约70nm至约270nm、约70nm至约260nm、约80nm至约280nm、约80nm至约270nm、约80nm至约260nm、约80nm至约250nm、约90nm至约280nm、约90nm至约270nm或约90nm至约260nm。在某些实施方案中，脂质组合物的平均尺寸可以是约90nm至约290nm或约100nm至约250nm。在一个特定实施方案中，平均尺寸可以是约100nm。在其它实施方案中，平均尺寸可以是约150nm。在其它实施方案中，平均尺寸可以是约200nm。
脂质组合物可以相对均质的。多分散指数可以用于指示脂质组合物的均质性，例如脂质组合物的粒度分布。较小(例如小于0.3)多分散指数一般指示较窄的粒度分布。组合物的多分散指数可以是约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，脂质组合物的多分散指数可以是约0.10至约0.20。
组合物的ζ电位可以用于指示该组合物的电动电势。例如，ζ电位可以描述组合物的表面电荷。具有相对较低电荷，即带正电或带负电的组合物一般是所希望的，因为带较高电荷的组合物可能与体内的细胞、组织和其它元件发生不希望的相互作用。在一些实施方案中，组合物的ζ电位可以是约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
治疗剂或预防剂的包封效率描述了在制备后被包封在组合物中或以其它方式与组合物结合的治疗剂或预防剂的量相对于所提供的初始量的比率。较高的包封效率是理想的(例如接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂分裂组合物前后含组合物的溶液中治疗剂或预防剂的量来测量。荧光可以用于测量溶液中治疗剂或预防剂(例如RNA)的量。对于本文所述的组合物，治疗剂或预防剂的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可以是至少80％。在某些实施方案中，包封效率可以是至少90％。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的脂质组合物以及药学上可接受的载剂。
药学上可接受的载剂可以包括但不限于：稀释剂、粘合剂和胶粘剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂、媒介物、分散剂、助流剂、甜味剂、包衣、赋形剂、防腐剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等)、增溶剂、胶凝剂、软化剂、溶剂(例如，水、酒精、乙酸和糖浆)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和乙酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如非离子表面活性剂，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或聚乙二醇)、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、吸收延迟剂、螯合剂和乳化剂。对于包含脂质组合物的药物组合物而言，合适的载剂可以选自缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、组氨酸盐缓冲液)、等渗剂(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆)或其组合。
本文提供的药物组合物可以为多种剂型，包括但不限于固体、半固体、液体、粉末或冻干形式。对于包含脂质组合物的药物组合物而言，优选的剂型通常可以为例如注射液和冻干粉。药物组合物可以被制备成适于多种施用途径和方法的多种形式。例如，药物组合物可以被制备成液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型 (例如胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂)、供表面和/或透皮施用的剂型(例如油膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、散剂和其它形式。
本发明的药物组合物可以为注射用药物组合物，其可以相应地包含药学可接受的注射用赋形剂。优选肌内注射用赋形剂。
因此，本发明还提供一种注射剂，其包含本发明的脂质组合物，以及药学上可接受的注射用赋形剂。例如可以包括无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可以是于无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如于1,3-丁二醇中的溶液。
上述注射用赋形剂可以包括水、糖类溶液、电解质液、氨基酸溶液中的一种或多种。例如注射用赋形剂可以包括林格氏溶液、葡萄糖溶液、葡萄糖氯化钠溶液、等渗氯化钠溶液、果糖液、右旋糖酐、氨基酸溶液、肝素溶液、甘露醇溶液、碳酸氢钠溶液中的一种或多种。也可以采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。脂肪酸如油酸可以被用于制备可注射制剂。
治疗剂/预防剂
脂质组合物可以包含一种或多种治疗剂或预防剂。本发明提供将治疗剂或预防剂递送至哺乳动物细胞或器官、在哺乳动物细胞中产生目标多肽以及治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的方法，这些方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂或预防剂的脂质组合物。
治疗剂或预防剂包括生物活性物质并且替代地称为“活性剂”。治疗剂或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞或器官中或者其它身体组织或系统中引起所希望的变化的物质。此类物质可用于治疗一种或多种疾病、病症或病况。在一些实施方案中，治疗剂或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病况的小分子药物。可用于组合物的药物的实例包括但不限于抗赘生剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracycline)、烷化剂、铂类化合物、抗代谢物以及核苷类似物，如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉剂(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素能阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、第莫洛(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高压剂(例如可乐定(clonidine)和肼酞嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、奈替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂。
在一些实施方案中，治疗剂或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫响应的化合物或另一治疗剂或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)，以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够提供针对与感染性疾病如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、 破伤风、瘟疫、肝炎和肺结核相关的一种或多种病况的免疫性的化合物和制剂并且可以包括编码感染性疾病源性抗原和/或表位的mRNA。疫苗还可以包括引导针对癌细胞的免疫响应的化合物和制剂并且可以包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA。引起免疫响应的化合物可以包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)和其它物质。在一些实施方案中，通过包括根据式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的组合物肌肉内施用能够引起免疫响应的疫苗和/或化合物。其它治疗剂或预防剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC-1065)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、罗莫司丁(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉醇和类美登素)。
在其它实施方案中，治疗剂或预防剂是蛋白质。可用于本发明中的纳米粒子中的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。
多核苷酸
在一些实施方案中，治疗剂或预防剂是多核苷酸或核酸(例如核糖核酸或脱氧核糖核酸)。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂或预防剂是RNA。如本文所用，“RNA”的定义涵盖单链、双链、线性和环状RNA。本发明的RNA可以是通过化学合成的、重组产生的和体外转录的RNA。在一实施方案中，本发明的RNA用于在宿主细胞中表达多肽。
在一实施方案中，本发明的治疗剂或预防剂是单链RNA。在一实施方案中，本发明的RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)。IVT-RNA可以通过RNA聚合酶利用DNA模板进行体外转录获得。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂或预防剂是信使RNA(mRNA)。一般而言，mRNA可以包含5’-UTR序列、多肽的编码序列、3’-UTR序列和任选存在的poly(A)序列。mRNA可以例如通过体外转录或化学合成产生。在一实施方案中，本发明的mRNA包含(1)5’-UTR、(2)编码序列、(3)3’-UTR和(4)任选存在的poly(A)序列。在一实施方案中，本发明的mRNA是核苷修饰的mRNA。在一实施方案中，本发明的mRNA包含任选存在的5’帽。
如本文所用，术语“非翻译区(UTR)”一般指RNA中(如mRNA)中不翻译为氨基酸序列的区域(非编码区)，或者DNA中的相应区域。通常，位于开放阅读框(起始密码子)的5’端(上游)的UTR可以称为5’非翻译区5’-UTR；位于开放阅读框(终止密码子)的3’端(下游)的UTR可以称为3’-UTR。在5’帽存在的情况下，5’-UTR位于5’帽的下游，例如，与5’帽直接相邻。在特定实施方案中，可以在5’-UTR中，例如在临近起始密码子的位置，包含优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在poly(A)序列存在的情况下，3’-UTR位于poly(A)序列的上游，例如与poly(A)序列直接相邻。
如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly(A)尾”是指包含连续或不连续腺苷酸的核苷酸序列。poly(A)序列通常位于RNA的3’端，例如3’-UTR的3’端(下游)。在一些实施方案中，poly(A)序列在其3’端不包含腺苷酸以外的核苷酸。Poly(A)序列可以在制备IVT-RNA期间，由DNA依赖性RNA聚合酶根据DNA模板的编码序列转录产生，或者通过不依赖于DNA的RNA聚合酶(poly(A)聚合酶)连接至IVT-RNA的游离3’端，例如3’-UTR的3’端。
如本文所用，术语“5’帽”一般涉及通过5’至5’三磷酸键连接至mRNA的5’端的N7-甲基鸟苷结构(又称为“m7G帽”、“m7Gppp-”)。5’帽可以在体外转录中共转录加至RNA中(例如使用抗反向帽类似物“ARCA”)，或者可以利用加帽酶在转录后连接至RNA。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂或预防剂是DNA。这样的DNA可以是例如用于在体外转录本发明的RNA的DNA模板或者用于在宿主细胞中表达多肽抗原的DNA疫苗。DNA可以是双链、单链、线性和环状DNA。
DNA模板可以在合适的转录载体中提供。一般而言，DNA模板可以是双链复合物，其包含与本文所述编码序列相同的核苷酸序列(编码链)和与本文所述编码序列互补的核苷酸序列(模板链)。如本领域技术人员已知的，DNA模板可以包含启动子、5’-UTR、编码序列、3’-UTR和任选存在的poly(A)序列。启动子可以是本领域技术人员已知的合适RNA聚合酶(特别是DNA依赖性RNA聚合酶)可用的启动子，包括但不限于SP6、T3和T7 RNA聚合酶的启动子。DNA模板中的5’-UTR、编码序列、3’-UTR和poly(A)序列为本文所述RNA中包含的相应序列或者与之互补。作为DNA疫苗的多核苷酸可以在质粒载体(例如环状质粒载体)中提供。
在一优选的实施方案中，本发明的治疗剂或预防剂为编码修饰的SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA。其示例性核酸序列可以参见SEQ ID NO:3、5、6或7。
冠状病毒
如本文所用，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”、“新型冠状病毒”和“SARS-CoV-2”可以互换使用。已知SARS-CoV-2是导致“冠状病毒病2019(COVID-19)”的病原体。
SARS-CoV-2是一种正义单链RNA((+)ssRNA)包膜病毒，属于冠状病毒科的β属。SARS-CoV-2编码4种结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。其中，刺突蛋白(S蛋白)介导病毒对宿主细胞的特异性结合以及病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，因此是病毒感染宿主细胞的关键分子。
如本文所用，“SARS-CoV-2刺突蛋白”、“SARS-CoV-2S蛋白”或“S蛋白”是指SARS-CoV-2的刺突蛋白。SARS-CoV-2包括但不限于原型株和变异株。目前已发现多个SARS-CoV-2变异株，包括但不限于Alpha(B.1.1.7和Q谱系)、Beta(B.1.351和后代谱系)、Gamma(P.1和后代谱系)、Delta(B.1.617.2和AY谱系)和Omicron(谱系B.1.1.529和BA谱系)变异株。SARS-CoV-2变异株可以具有突变型SARS-CoV-2S蛋白。可以例如根据刺突蛋白的序列鉴定SARS-CoV-2变异株。例如，突变型SARS-CoV-2S蛋白可以包含与原型SARS-CoV-2S蛋白(例如SEQ ID NO:11)相比的突变，例如氨基酸缺失和/或取代。
SARS-CoV-2S蛋白合成为具有约1273-1300个氨基酸的糖蛋白(示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:11)，其包含N端信号肽、S1亚基和S2亚基。S1亚基中包含N端结构域、受体结合结构域(RBD)和亚结构域1和2(SD1/2)。S2亚基包含融合肽(FP)、七肽重复序列HR1、HR2、跨膜结构域和胞质结构域。有关SARS-CoV-2S蛋白的描述还可以参见例如Huang Y et al.,Acta Pharmacol Sin.2020；41(9):1141-1149。
研究表明，S1亚基的RBD通过与特异性受体血管紧张素转化酶2(ACE2)识别靶宿主细胞，而S2亚基负责膜融合。在自然状态下，S蛋白以亚稳定的融合前三聚体构象存在于病毒表面。在感染期间，RBD与宿主细胞受体结合，宿主蛋白酶(如弗林蛋白酶(Furin))切割S蛋白的S1/S2切割位点，破坏融合前三聚体的稳定性，导致S1亚基脱落和S2亚基转变为融合后的稳定构象。Furin切割位点是一个含有多个精氨酸残基的暴露的环型结构，其包含氨基酸基序Arg-Xaa-Xbb-Arg(其中Xaa为任意氨基酸；Xbb为任意氨基酸，优选为Arg或Lys。在一实施方案中，Furin切割位点的氨基酸序列为Arg-Arg-Ala-Arg(“RRAR”)，对应于SEQ ID NO:11中氨基酸682-685。
本发明的治疗剂或预防剂所编码的修饰的刺突蛋白可以包含失活的Furin切割位点。具体地，本 发明的多肽抗原包含失活的Furin切割位点Gln-Ser-Ala-Gln(QSAQ)，从而在宿主细胞中具有更高的表达水平和/或在受试者中诱导更强的免疫应答。如本文所用，“失活的弗林蛋白酶(Furin)切割位点”是指不能被弗林蛋白酶识别和切割的氨基酸序列。如本文所用，“活性弗林蛋白酶切割位点”或“弗林蛋白酶切割位点”是指能够被弗林蛋白酶识别并切割的氨基酸序列。
在一方面，本发明的治疗剂或预防剂为多核苷酸，其编码修饰的刺突蛋白，所述修饰的刺突蛋白包含失活的弗林蛋白酶切割位点，并且其中所述失活的弗林蛋白酶切割位点具有QSAQ的氨基酸序列，并且所述多肽包含：
根据SEQ ID NO:11编号的以下氨基酸取代：D614G、K986P、V987P(“K986P/V987P”，又称为“2P突变”)。
在一些实施方案中，本发明多核苷酸编码的多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码区，编码区编码修饰的刺突蛋白。
如本文所用，“编码序列”是指多核苷酸中可以作为模板用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列可以是DNA序列或RNA序列。如果对应于DNA序列(包括与mRNA序列相同的编码链和与之互补链的模板链)的mRNA在生物过程中翻译成多肽，可以认为所述DNA序列或mRNA序列编码所述多肽。
如本文所用，“密码子”指多核苷酸中三个连续的核苷酸序列(又称三联体密码)，其编码特定的氨基酸。同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)在不同物种中使用的频率不同，称为“密码子偏好性”。通常认为，对于给定物种，使用其偏好的密码子的编码序列可以在该物种表达系统中具有较高的翻译效率和准确率。因此，可以对多核苷酸进行“密码子优化”，即改变多核苷酸中的密码子以反映宿主细胞偏好的密码子，而优选不改变其编码的氨基酸序列。本领域技术人员会理解，由于密码子的简并性，本发明的多核苷酸可以包含这样的编码序列，其与本文所述编码序列不同(例如与本文所述编码序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性)但编码相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，本发明的RNA包含针对宿主(例如受试者，特别是人)细胞优化的密码子，使得本发明的多肽在宿主(例如受试者，特别是人)中最佳表达。
在一实施方案中，本发明的多核苷酸包含如本文所述多肽的编码序列。在一实施方案中，本发明的多核苷酸包含与本文所述多肽的编码序列互补的核苷酸序列。在一实施方案中，编码序列在其5’端包含起始密码子，并且在其3’端包含终止密码子。在一实施方案中，编码序列包含本文所述的开放阅读框(ORF)。
在一实施方案中，本发明的编码序列编码多肽，所述多肽包含：
(1)SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或者(2)与SEQ ID NO:12中的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，本文所述的多肽的编码序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含：(1)SEQ ID NO:3的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO:5的核苷酸序列；或者(4)与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，本发明的RNA还包含有助于提高RNA的稳定性和/或翻译效率的结构元件，包括但不限于5’帽、5’-UTR、3’-UTR和poly(A) 序列。
在一些实施方案中，本发明的RNA包含5’-UTR。在一优选实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。在一优选实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的RNA包含5’-UTR和3’-UTR。在一具体实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，3’-UTR包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的RNA包含poly(A)序列。在一实施方案中，poly(A)序列包含连续的腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、30、40、50、60、70、75、80、85、95或100以及多达120、150、180、200、300个腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少50个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少80个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约70、80、90、100、120或150个核苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列中的连续腺苷酸序列被包含U、C或G核苷酸的序列中断。在一实施方案中，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
在一实施方案中，本发明的RNA包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一实施方案中，本发明的RNA包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
在一实施方案中，本发明的RNA(a)包含与SEQ ID NO:3或6的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，本发明的DNA包含如本文所述多肽的编码序列。在一些实施方案中，本发明的DNA从5’端至3’端包含如本文所述的(1)T7启动子、(2)5’-UTR、(3)编码序列、(4)3’-UTR和(5)任选存在的poly(A)序列。
在一些实施方案中，T7启动子包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的DNA包含5’-UTR。在一优选实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。在一优选实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的RNA包含5’-UTR和3’-UTR。在一具体实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列，3’-UTR包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的DNA包含poly(A)序列。在一实施方案中，poly(A)序列包含连续的脱氧腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、30、40、50、60、70、75、80、85、95或100以及多达120、150、180、200、300个脱氧腺苷酸。在一实施方案中，poly(A)序列中的连续腺苷酸序列被包含T、C或G核苷酸的序列中断。在一实施方案中，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
在一实施方案中，本发明的DNA包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一实施方案中，本发明的DNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
在一实施方案中，本发明的DNA(a)包含与SEQ ID NO:5或7的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列；并且(b)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
经过修饰的核苷酸
在一些方式中，本文的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选择如下一种或者几种核苷酸：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞 苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷；甲基化碱基；插入碱基；2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖；硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。以及PCT/CN2020/074825，PCT/CN2020/106696中所描述的改性核苷酸进行修饰。
在一实施方案中，本发明的RNA(例如mRNA)通过包含一个或多个修饰的核碱基进行修饰。在一实施方案中，修饰的核碱基包括修饰的胞嘧啶、修饰的尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶独立地选自假尿嘧啶、1-甲基-假尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的胞嘧啶独立地选自5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或其组合。在一实施方案中，本发明的RNA中修饰的核碱基的比例为10％-100％，即本发明的RNA可以通过用修饰的核碱基代替其中10％-100％的核碱基来修饰。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如mRNA)通过用修饰的尿嘧啶代替一个或多个尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括1-甲基假尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶或其组合。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括假尿嘧啶。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括5-甲基-尿嘧啶。在一实施方案中，修饰的尿嘧啶包括1-甲基-假尿嘧啶。
在一实施方案中，所述RNA通过用修饰的尿嘧啶代替至少一个尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，所述RNA通过用修饰的尿嘧啶代替所有尿嘧啶进行修饰。在一实施方案中，所述RNA中修饰的尿嘧啶的比例为10％-100％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一实施方案中，所述RNA中修饰的尿嘧啶的比例为20％-100％。在一实施方案中，所述RNA中20％-100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。在优选的实施方案中，所述RNA中100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。
1-甲基-假尿苷具有如下结构：
在一具体实施方案中，本发明的mRNA包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，并且其中100％的尿嘧啶被1-甲基假尿嘧啶代替。
脂质组合物和药物组合物的应用
脂质组合物、药物组合物和注射剂可以用于治疗疾病、病症或病况。确切地说，这些脂质组合物、药物组合物和注射剂可以用于治疗以遗失或异常蛋白质或多肽活性为特征的疾病、病症或病况。例如，包含编码遗失或异常多肽的mRNA的脂质组合物和药物组合物可以被施用或递送至细胞。该mRNA随后翻译可以产生所述多肽，由此减少或消除由该多肽的不存在或异常活性引起的问题。由于翻译可以迅速地发生，故这些方法和脂质组合物、药物组合物和注射剂可以用于治疗急性疾病、病症或病况如败血症、中风和心肌梗塞。脂质组合物中包括的治疗剂或预防剂还能够改变给定mRNA的转录速率，由此影响基因表达。
可以被施用脂质组合物、药物组合物和注射剂的以功能失常或异常蛋白质或多肽活性为特征的疾病、病症或病况包括但不限于罕见病、感染性疾病(呈疫苗和治疗剂形式)、癌症和增生性疾病、遗传疾病(例如囊肿性纤维化)、自体免疫疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病、以及 代谢性疾病。有多种疾病、病症或病况可以通过蛋白质活性遗失(或大体上降低使得无法出现适当蛋白质功能)表征。这些蛋白质可能不存在，或者其可能基本上无功能。功能失常的蛋白质的具体实例是囊肿性纤维化跨膜传导调控蛋白(CFTR)基因的错义突变变体，这些突变变体产生CFTR蛋白质的功能失常的蛋白质变体，由此引起囊肿性纤维化。本发明提供了一种通过施用脂质组合物、药物组合物或者注射剂来治疗受试者的此类疾病、病症或病况的方法，所述脂质组合物包括RNA和脂质组分，该脂质组分包括阳离子脂质、磷脂、PEG脂质和结构性脂质，其中RNA可以是编码拮抗或以其它方式克服受试者细胞中存在的异常蛋白质活性的多肽的mRNA。
本发明提供的方法涉及施用含一种或多种治疗剂或预防剂的脂质组合物、包含这些组合物的药物组合物或者注射剂。对于本发明的特征和实施方案，术语治疗剂和预防剂可以在本文中互换使用。脂质组合物和药物组合物可以使用任何合理量和任何施用途径施用给受试者，所述合理量和施用途径可有效实现疾病、病症或病况的预防、治疗、诊断或用于任何其它目的。施用至给定受试者的具体量可以取决于受试者的物种、年龄和一般状况；施用目的；具体组合物；施用模式等而变化。
在一些实施方案中，本发明的包含治疗剂或预防剂的脂质组合物和药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法施用受试者，例如肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下或腹腔内。优选地，本发明的脂质组合物通过肌内注射。
在一方面，本发明提供的脂质组合物、药物组合物或者注射剂，用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染。
在一方面，本发明还提供本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
在一方面，本发明还提供一种用于在受试者中预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂。在一实施方案中，所述方法包括给药治疗有效量的包含本发明的mRNA的药物组合物，特别是包含如本文所述的LNP或LPP的药物组合物。
在一实施方案中，SARS-CoV-2感染包括至少一种SARS-CoV-2引起的感染。在一实施方案中，所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2原型株以及BA.1、BA.2、Beta和Delta变异株。
在一具体实施方案中，本发明提供一种在受试者中预防和/或治疗至少一种SARS-CoV-2引起的感染的方法，所述方法包括给药预防或治疗有效量的本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂。在一实施方案中，所述SARS-CoV-2选自SARS-CoV-2原型株以及Alpha、Beta、Omicron(BA.1)、Omicron(BA.4/5)、和Delta变异株。
在一些实施方案中，预防或治疗有效量在一次或多次给药中提供。在一些实施方案中，，预防或治疗有效量在两次给药中提供。在一些实施方案中，，预防或治疗有效量在三次给药中提供。
在一些实施方案中，本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂可以以同源加强策略或者异源加强策略给药。术语“同源加强”指使用相同技术路线疫苗的间隔接种。术语“异源加强”指不同技术路线疫苗的间隔接种。在一实施方案中，给药三次本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂以提供预防或治疗有效量。在一实施方案中，在给药一次灭活疫苗后再间隔给药本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂以提供预防或治疗有效量。在一实施方案中，在给药两次灭活疫苗后再间隔给药本发明的脂质组合物、药物组合物或者注射剂以提供预防或治疗有效量。
有益效果
本发明提供的脂质组合物、药物组合物或注射剂可以呈现出优异的效果，例如但不限于：(1)提高所包含的mRNA的表达效率；(2)在不同储藏条件下都具有高稳定性，所包含的mRNA的表达效率和脂质组合物的体外理化性质都维持稳定；(3)在重复冻融之后仍具有高稳定性；(4)在冻干之后仍具有高稳定性；(5)靶向性好，肝毒性较低；(6)导致有效的APC摄取和DC成熟。
进一步地，本发明提供的包含编码修饰的刺突蛋白的mRNA的脂质组合物、药物组合物或注射剂可以呈现出优异的效果，例如但不限于：(1)诱导受试者体内高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答；(2)保护受试者免受SARS-CoV-2感染导致的死亡和相应病变，对SARS-CoV-2在肺部的复制具有显著的预防作用；(3)同源或异源加强免疫能增强对变异毒株的免疫应答；(4)具有良好的安全性。
实施例
通过参考以下实施例进一步描述本发明。应当理解，这些实施例仅作为示例，而不对本发明构成限制。以下材料和仪器均是可商购的或根据本领域公知的方法制备。以下实验均按照制造商的说明书或根据本领域公知的方法和步骤进行。
实验材料
根据式(I)所述的阳离子脂质为斯微生物合成或者参考，例如CN110520409A、WO2018081480A1或US11,246,933B1制备；磷脂(DOPE)采购自CordenPharma；胆固醇采购于Sigma-Aldrich；mPEG2000-DMG(即DMG-PEG 2000)采购于Avanti Polar Lipids,Inc.；PBS采购于Invitrogen；硫酸鱼精蛋白采购自北京斯利安药业有限公司；mPEG2000-DSPE采购于lipoid GmbH；DSPC采购于Avanti Polar Lipids,Inc。
实施例1合成根据式(I)所述的化合物
一般考虑
除非另外指出，否则使用的所有溶剂和试剂都是商购得到并且以原样使用。1H NMR谱是在300K下使用Bruker Ultrashield 300MHz仪器在CDCl3中记录。化学位移是关于1H以相对于TMS(0.00)的百万分率(ppm)报导。硅胶色谱法是在ISCO CombiFlash Rf+Lumen仪器上，使用ISCO RediSep Rf Gold快速柱(粒度：20-40微米)执行。
以下描述的程序可用于合成化合物SW-II-115至SW-II-140-2。
本文采用了以下缩写： THF: 四氢呋喃 MeCN: 乙腈 LAH: 氢化铝锂 DCM: 二氯甲烷 DMAP: 4-二甲基氨基吡啶 LDA: 二异丙基氨基锂 rt: 室温 DME: 1,2-二甲氧基乙烷 n-BuLi: 正丁基锂 CPME: 环戊基甲基醚 EDCI: N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳酰二亚胺 DIEA: N,N-二异丙基乙胺 PE: 石油醚 EA: 乙酸乙酯
A.化合物SW-II-115
1、中间体3的合成
向含有化合物1(10g,45mmol,1eq.)和化合物2(7.8g,54mmol,1.2eq.)的DCM溶液(100mL)中加入EDCI(17.3g,90mmol,2eq.)和DMAP(2.2g,18mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(23.2g,180mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在N2保护下搅拌16小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)显示化合物1被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用DCM(20mL)稀释并用H2O(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-20:1)洗脱，得到无色油状化合物3(4.365g，28％)。
2、中间体5的合成
将化合物3(500mg,1.437mmol,1eq.)和化合物4(2.63g,43.103mmol,30eq.)的EtOH溶液在N2保护下在60℃下搅拌16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示化合物3被消耗，TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示观察到新的主要点。在减压下浓缩反应混合物。残余物用EtOAc(50mL)稀释并用H2O(3×50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1:0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物5(264mg，56％)。
3、中间体8的合成
向化合物6(500mg,1.712mmol,1eq.)和化合物7(1.113g,8.562mmol,5eq)在二氧六环/水(5mL/0.5mL)混合溶剂中加入Pd(dppf)Cl2(112mg,0.171mmol,0.1eq.)和碳酸钾(709mg,5.136mmol,3eq.)。将混合物在N2下于100℃搅拌过夜。TLC(PE:EA＝15:1)显示反应完成并观察到新的主要点。混合物用EA萃取并用水洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE:EA(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物8(455mg，88％)。
4、中间体9的合成
在0℃和N2保护下，向化合物8(455mg,1.497mmol,1eq.)的THF(5mL)溶液中加入LiAlH4(1.5mL,1.497mmol,1M，THF中,1eq.)。将混合物在室温下在N2下搅拌2小时。TLC(PE:EtOAc＝5:1)显示反应完成并观察到新的主要点。混合物用水(1.5mL)淬灭并用2N HCl处理以将PH调节在6和7之间，用EA萃取并用盐水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到粗品化合物9(419mg，>100％)，为无色油状物，无需进一步纯化。
5、中间体10的合成
向含有化合物1(339mg,1.518mmol,1eq.)和化合物9(419mg,1.518mmol,1eq.)的DCM(4mL)溶液中加入EDCI(583mg,3.036mmol,2eq.)和DMAP(74mg,0.607mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(783mg,6.072mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在N2保护下搅拌16小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)显示形成了所需产物。反应混合物用EA萃取并用水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-10:1)洗脱，得到化合物10(443mg，60.7％)，为无色油。
6、终产物SW-II-115的合成
向含有化合物10(307mg,0.64mmol,1eq.)和化合物5(210mg,0.64mmol,1eq.)的混合溶剂CPME/CH3CN(3mL/3mL)中加入K2CO3(530mg,3.84mmol,6eq.)和KI(212mg,1.28mmol,2eq.)。添加完毕后，将混合物在N2下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示反应完成并观察到新的主要点。混合物用EA萃取并用水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM:MeOH(1:0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-115(266mg,57％)。
LCMS:Rt:1.293min；MS m/z(ELSD):730.5[M+H]+；
HPLC:99.472％纯度，ELSD；RT＝4.895min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.21–6.99(m,3H),5.05(s,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.58(t,J＝5.3Hz,2H),2.69–2.46(m,10H),2.31(dt,J＝20.0,7.5Hz,4H),1.69–1.18(m,51H),0.89(dt,J＝12.4,6.3Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.90(s),173.68(s),140.80(d,J＝13.0Hz),133.31(s),129.25(d,J＝16.2Hz),128.30(s),125.75(s),77.30(d,J＝11.5Hz),77.04(s),76.72(s),66.22(s),64.43(s),58.12(s),55.72(s),53.90(s),34.32(d,J＝1.9Hz),32.69(s),32.48(s),31.81(d,J＝11.2Hz),31.25(s),29.59–28.91(m),28.66(s),27.17(s),26.64(s),25.94(s),24.91(d,J＝5.1Hz),22.65(d,J＝3.3Hz),14.10(s).
B.化合物SW-II-118
1、中间体3的合成
化合物1(1.22g,5.0mmol,1.0eq.)和化合物2(765mg,7.5mmol,1.5eq.)、Pd(PPh3)4(四三苯基膦钯，289mg,0.25mmol,0.05eq.)和K2CO3(1.38g,10.0mmol,2.0eq.)的甲苯(10ml)和H2O(1ml)溶液在110℃下，N2保护下搅拌1小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝19:1)显示化合物1被消耗并且观察到一个新点。反应混合物用DCM(50mL)稀释并用H2O(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物3(0.5g，45％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(dd,J＝23.5,8.1Hz,4H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),3.57(s,2H),2.64–2.48(m,2H),1.66–1.51(m,2H),1.35(dd,J＝15.0,7.4Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).
2、中间体4的合成
在-78℃下将LiAlH4(193mg，5.09mmol，4.0eq.)加入到含有化合物3(280mg，1.27mmol，1.0eq.)THF(10mL)溶液，然后将反应在10℃下反应3小时。TLC显示反应很好，将反应浓缩并用Na2SO4(20mL)稀释并用EA(30mLx2)萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到黄色油状化合物4(3.12g，粗品)。
3、中间体6的合成
含有化合物4(215mg,1.2mmol,1.0eq.)、化合物5(404mg,1.8mmol,1.5eq.)、EDCI(1.15g,6.0mmol,5.0eq.)、DMAP(732mg,1.8eq.)，DIEA(1.29g,12.0mmol,10.0eq.)和DIEA(1.29g,12.0mmol,10.0eq.)的DCM(5mL)溶液在N2保护下，10℃下搅拌16h。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示反应完成并观察到新的主要点。减压浓缩混合物，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE:EA(1:0-10:1,v/v)洗脱，得到无色油状化合物6(145mg,31％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(s,4H),4.27(t,J＝7.1Hz,2H),3.52(t,J＝6.7Hz,1H),3.40(t,J＝6.8Hz,1H),2.90(t,J＝7.1Hz,2H),2.65–2.50(m,2H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.93–1.70(m,2H),1.64–1.56(m,4H),1.44–1.27(m,8H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).
4、终产物SW-II-118的合成
含有化合物6(140mg,0.37mmol,1.0eq.)、化合物7(243mg,0.55mmol,1.5eq.)、K2CO3(153mg,1.11mmol,3.0eq.)和KI(123mg,0.74mmol,2.0eq.)的混合物在CPME(1mL)和CH3CN(1mL)混合溶剂在N2下在90℃搅拌16小时。减压浓缩反应混合物，残余物用EtOAc(50mL)稀释并用NaHCO3(30mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用 DCM:MeOH(1:0-10:1，v/v)洗脱，得到呈黄色油状SW-II-118(105mg,61％)。
LCMS:Rt:1.946min；MS m/z(ELSD):744.4[M+H]+；
HPLC:99.64％纯度，ELSD；RT＝5.875min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11(s,4H),4.91–4.79(m,1H),4.26(t,J＝7.2Hz,2H),3.80–3.68(m,2H),2.90(t,J＝7.1Hz,4H),2.81–2.67(m,4H),2.62–2.52(m,2H),2.28(td,J＝7.5,2.6Hz,4H),1.64–1.51(m,11H),1.38–1.17(m,42H),0.93–0.82(m,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.61(d,J＝11.7Hz),141.11(s),134.90(s),128.74(s),128.51(s),77.40(s),77.08(s),76.77(s),74.17(s),64.90(s),57.48(s),56.24(s),53.98(s),35.25(s),34.66(d,J＝14.4Hz),34.16(d,J＝5.1Hz),33.67(s),31.86(s),29.52(d,J＝2.4Hz),29.24(s),29.21–28.74(m),26.90(d,J＝4.9Hz),25.42–24.92(m),24.92–24.88(m),24.74(s),22.67(s),22.37(s),14.04(d,J＝15.7Hz).
C.化合物SW-II-120
1、中间体3的合成
含有化合物1(1.22g,5.0mmol,1.0eq.)、化合物2(1.30mg,10.0mmol,2.0eq.)、Pd(PPh3)4(289mg,0.25mmol,0.05eq.)和K2CO3(1.38g,10.0mmol,2.0eq.)在甲苯(10ml)和H2O(1ml)的混合溶液中在110℃下，N2保护下搅拌1小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝19:1)显示化合物1被消耗并且观察到一个新点。反应混合物用DCM(50mL)稀释并用H2O(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物3(0.78g，62％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝8.1Hz,2H),7.13(d,J＝8.1Hz,2H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),3.57(s,2H),2.62–2.51(m,2H),1.58(d,J＝11.1Hz,2H),1.35–1.21(m,9H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).
2、中间体4的合成
在-78℃下将LiAlH4(477mg,12.56mmol,4.0eq.)加入到含有化合物3(780mg,3.14mmol,1.0eq.)的THF(10mL)溶液中，然后将反应在10℃下搅拌3小时。薄层色谱显示反应进行得很好。将反应浓缩并用Na2SO4(20mL)稀释并用EA(30mL*2)萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到无色油状化合物4(640mg，粗品)。
3、中间体6的合成
含有化合物4(640mg,3.10mmol,1.0eq.)、化合物5(1.06g,4.70mmol,1.5eq.)、EDCI(2.98g,15.5mmol,5.0eq.)、DMAP(1.85g,15.0eq.)和DIEA(4.0g,31.0mmol,10.0eq.)的DCM(10mL)溶液，在N2保护下，在10℃下搅拌16h。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示反应完成并观察到新的主要点。减压浓缩混合物，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE:EA(1:0-10:1，v/v)洗脱，得到无色油状化合物6(465mg，36％)。
4、终产物SW-II-120的合成
含有化合物6(100mg,0.25mmol,1.0eq.)、化合物7(161mg,0.36mmol,1.5eq.)、K2CO3(104mg,0.75mmol,3.0eq.)和KI(83mg,0.50mmol,2.0eq.)的混合物在CPME(1mL)和CH3CN(1mL)在N2下在90℃搅拌16小时。在减压下浓缩反应混合物，残余物用EtOAc(50mL)稀释并用NaHCO3(30mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM:MeOH(1:0-10:1，v/v)洗脱，得到呈黄色油状的SW-II-120(100mg，52％)。
LCMS:Rt:2.500min；MS m/z(ELSD):772.4[M+H]+；
HPLC:99.70％纯度，ELSD；RT＝8.675min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(d,J＝8.9Hz,4H),4.89–4.73(m,1H),4.23(t,J＝7.2Hz,2H),3.83–3.65(m,2H),2.87(t,J＝7.2Hz,4H),2.82–2.67(m,4H),2.61–2.45(m,2H),2.25(td,J＝7.5,2.5Hz,4H),1.65–1.44(m,15H),1.27(dd,J＝13.2,11.3Hz,42H),0.85(t,J＝6.8Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.57(d,J＝11.5Hz),141.13(s),134.88(s),128.73(s),128.48(s),77.45(s),77.13(s),76.81(s),74.14(s),64.89(s),57.34(s),56.17(s),53.92(s),35.57(s),34.64(d,J＝16.1Hz),34.14(d,J＝3.3Hz),31.79(d,J＝13.4Hz),31.49(s),29.50(d,J＝2.2Hz),29.23(s),29.10–28.71(m),26.85(d,J＝5.0Hz),25.49–25.38(m),25.13(d,J＝35.4Hz),24.72(s),22.63(d,J＝5.8Hz),14.11(s).
D.化合物SW-II-121
1、中间体3的合成
向含有化合物1(1.3g,5.86mmol,1.5eq.)和化合物2(1g,3.9mmol,1.0eq.)的DCM(20mL)溶液中加入EDCI(1.495g,7.8mmol,2.0eq.)、DMAP(0.19g,1.56mmol,0.4eq.)和DIEA(2.57mL,15.6mmol,4.0eq.)。将反应混合物在室温下在N2下搅拌16小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝19:1)显示化合物2被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用DCM(20mL)稀释并用H2O(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-10:1)洗脱，得到黄色油状化合物3(1.2g，66.9％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.92–4.82(m,1H),3.42(t,J＝6.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.95–1.82(m,2H),1.70–1.19(m,36H),0.90(t,J＝6.8Hz,6H).
2、中间体5的合成
含有化合物3(5.2g,11.30mmol,1.0eq.)和化合物4(20.6g,339mmol,30eq.)的EtOH(5mL)溶液在N2保护下于60℃搅拌16小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝19:1)显示化合物3被消耗并且TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示观察到新的主要点。在减压下浓缩反应混合物，残余物用EtOAc(50mL)稀释并用H2O(3×50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM:MeOH(1:0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物5(3g，60％)。
3、中间体8的合成
含有化合物6(1g,4.115mmol,1eq.)和化合物7(889mg,6.173mmol,1.5eq)的甲苯/水(10mL/1mL)混合溶液中加入Pd(pph3)4(238mg,0.206mmol,0.05eq.)、K2CO3(1.7g,12.35mmol,3eq)。将混合物在N2和110℃下搅拌2小时。TLC(PE:EA＝10:1)显示反应完成并观察到新的主要点。混合物用EA萃取并用水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE:EA(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物8(714mg,66％)。
4、中间体9的合成
N2保护下，在0℃下向化合物8(714mg,2.725mmol,1eq.)的THF(7mL)溶液中的混合物中加入LiAlH4(2.7mL,2.725mmol,1M,THF中，1eq.)，混合物在室温下搅拌2小时。TLC(PE:EtOAc＝10:1)显示反应完成并观察到新的主要点。混合物用水(2.7mL)淬灭并用2N HCl处理以将PH调节在6和7之间，用EA萃取并用盐水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE:EA(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物9(103mg，63％)。
5、中间体11的合成
向含有化合物9(300mg,1.364mmol,1eq.)和化合物10(363mg,1.64mmol,1.2eq.)的DCM(3mL)中加入EDCI(524mg,2.728mmol,2eq.)、DMAP(67mg,0.546mmol,0.4eq.)，和DIEA(704mg,5.456mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在N2下搅拌16小时。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)显示形成了所需产物。反应混合物用EA萃取并用水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚:乙酸乙酯(1:0-10:1)洗脱，得到无色油状化合物11(169mg，29％)。
6、终产物SW-II-121的合成
向含有化合物11(169mg,0.399mmol,1eq.)和化合物5(176mg,0.399mmol,1eq.)的CPME/CH3CN(2mL/2mL)混合溶剂中加入K2CO3(330mg,2.394mmol,6eq.)和KI(132mg,0.798mmol,2eq.)。添加完毕后，将混合物在N2下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM:MeOH＝10:1)显示反应完成并观察到新的主 要点。混合物用EA萃取并用水洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM:MeOH(1:0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-121(145mg，46％)。
LCMS:Rt:1.493min；MS m/z(ELSD):786.5[M+H]+；
HPLC:99.869％纯度，ELSD；RT＝10.655min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11(s,4H),4.92–4.80(m,1H),4.26(t,J＝7.2Hz,2H),3.80(s,2H),2.87(dd,J＝26.6,19.4Hz,7H),2.62–2.51(m,2H),2.28(td,J＝7.2,3.6Hz,4H),1.75–1.45(m,14H),1.42–1.09(m,45H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.61(d,J＝12.3Hz),141.20(s),134.90(s),128.75(s),128.51(s),77.35(s),77.03(s),76.72(s),74.21(s),64.93(s),54.15(s),35.59(s),34.66(d,J＝16.6Hz),34.16(d,J＝3.0Hz),31.85(d,J＝4.4Hz),31.55(s),29.64–29.15(m),29.15–28.78(m),26.85(d,J＝4.5Hz),25.33(s),24.95(s),24.72(s),22.68(s),14.12(s).
E.化合物SW-II-122
1、化合物3的合成
化合物1(1g,4.65mmol,1eq.)和化合物2(726mg,5.58mmol,1.2eq.)溶解在甲苯/水(10/1,20mL)中，然后向该混合物中加入K2CO3(1.92g,13.9mmol,3eq.)和Pd(pph3)4(269mg,0.23mmol,0.05eq)。将反应混合物置于N2中加热至110℃搅拌2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝19/1)显示化合物1被消耗并且观察到新的主要斑点。反应混合物用H2O(80mL)淬灭并且用乙酸乙酯(60mL×3)萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(800mg,78％)。
2、化合物4的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在THF(14mL)的化合物3(700mg,3.18mmol,1.0eq.)中加入LiAlH4(3.2mL,3.18mmol,1eq)。反应物升至室温氮气保护下搅拌2小时。TLC(PE/EtOAc＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物分别用水(3.2mL)和1M HCl(3.2mL)淬灭。再向混合物中加入水(6mL)，乙酸乙酯(60mL×3)萃取。有机层用盐水(30mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚＝1/10洗脱，得到黄色油状化合物4(600mg,98％)。
3、化合物6的合成
化合物4(680mg,3.5mmol,1.0eq.)和化合物5(1.13g,5.1mmol,1.5eq.)溶解在DCM(10mL)中，向 该混合物中加入EDCI(1.20g,6.25mmol,2.0eq.)，DMAP(166mg,1.36mmol,0.4eq.)和DIEA(1.78g,13.8mmol,4.0eq.)。添加完后，反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝30/1)显示起始材料被消耗并且形成了一个新斑点。混合物用水(70mL)淬灭并用DCM(80mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(2×20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚＝3/97溶液洗脱，得到黄色油状化合物6(680mg,48.5％)。
4、SW-II-122的合成
化合物6(108mg,0.27mmol,1.2eq)和化合物7(100mg,0.23mmol,1eq.)溶解在CPME(2mL)和CH3CN(2mL)中，向该混合物中加入碳酸钾(157mg,1.14mmol,5.0eq)和碘化钾(75mg,0.45mmol,2.0eq)。添加完后，反应混合物在氮气保护下90℃搅拌16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成。减压浓缩反应混合物。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到SW-II-122(68mg,40％)，为无色油状物。
LCMS:Rt:1.487min；MS m/z(ELSD):758.5[M+H]+；
HPLC:97.3％纯度，ELSD；RT＝7.622min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(d,J＝26.4Hz,1H),7.17(dd,J＝27.2,21.1Hz,3H),5.09(s,2H),4.91–4.79(m,1H),3.85(s,2H),2.98(s,2H),2.87(s,4H),2.65–2.54(m,2H),2.35(t,J＝7.6Hz,2H),2.28(t,J＝7.6Hz,2H),1.74–1.57(m,9H),1.50(d,J＝5.6Hz,4H),1.37–1.15(m,43H),0.94–0.80(m,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.55(d,J＝2.4Hz),143.35(s),135.92(s),128.67–128.19(m),125.47(s),77.36(s),77.04(s),76.73(s),74.22(s),66.27(s),57.15(s),56.74(s),54.14(s),35.88(s),34.55(s),34.15(d,J＝3.6Hz),31.79(d,J＝15.2Hz),31.43(s),29.52(d,J＝2.8Hz),29.25(s),28.92(dd,J＝14.2,5.8Hz),26.77(d,J＝4.8Hz),25.33(s),24.92(s),24.71(s),24.48(s),22.64(d,J＝6.8Hz),14.12(s).
F.化合物SW-II-127
1、化合物3的合成
化合物1(1.3g,5.86mmol,1.5eq.)和化合物2(1g,3.9mmol,1.0eq.)溶解在DCM(20mL)中，向该混合物中加入EDCI(1.495g,7.8mmol,2.0eq.)和DMAP(0.19g,1.56mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(2.57mL,15.6mmol,4.0eq.)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝19/1)显示化合物2被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用DCM(20mL)稀释并用H2O(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(1.2g，66.9％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.92–4.82(m,1H),3.42(t,J＝6.8Hz,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.95–1.82(m,2H),1.70–1.19(m,36H),0.90(t,J＝6.8Hz,6H).
2、化合物5的合成
将化合物3(5.2g,11.30mmol,1.0eq.)和化合物4(20.6g,339mmol,30eq.)加入到EtOH(5mL)中，然后混合物在氮气保护下60℃搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝19/1)显示化合物3被消耗并且TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示观察到新的主要斑点。减压下浓缩反应混合物。残余物用EtOAc(50mL)稀释并用H2O(3X 50mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状的化合物5(3g，60％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.95–4.75(m,1H),3.74–3.58(m,2H),2.87–2.74(m,2H),2.69–2.56(m,2H),2.36(s,2H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.65–1.42(m,8H),1.38–1.17(m,30H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H).
3、化合物8的合成
化合物7(522mg,2.5mmol,1.2eq.)和化合物6(400mg,2.083mmol,1eq.)溶解在DCM(4mL)中，向该混合物中加入EDCI(800mg,4.166mmol,2eq.)，DMAP(102mg,0.833mmol,0.4eq.)和DIEA(1.075mg,8.332mmol,4eq.)。添加完后，反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。TLC(PE:EA＝10:1)显示起始材料被消耗并且形成了一个新斑点。减压浓缩反应混合物。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状的化合物8(454mg,57％)。
4、SW-II-127的合成
化合物8(100mg,0.262mmol,1eq.)和化合物5(139mg,0.314mmol,1.2eq.)溶解在CPME/CH3CN(1mL/1mL)中，向该混合物中加入碳酸钾(217mg,1.572mmol,6eq.)和碘化钾(87mg,0.524mmol,2eq.)。添加完后，反应混合物在氮气保护下90℃搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完全并且形成了所需产物。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-127(42.49mg,22％)。
LCMS:Rt:1.323min；MS m/z(ELSD):744.5[M+H]+；
HPLC:99.742％纯度，ELSD；RT＝7.339min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.25(s,2H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),5.07(s,2H),4.91–4.82(m,1H),3.83(s,2H),2.90(d,J＝44.8Hz,5H),2.64–2.55(m,2H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),2.28(t,J＝7.5Hz,2H),1.76–1.46(m,14H),1.42–1.19(m,41H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.50(d,J＝8.5Hz),133.17(s),128.61(s),128.34(s),77.29(d,J＝11.4Hz),77.03(s),76.71(s),74.23(s),66.19(s),54.20(s),35.71(s),34.56(s),34.10(d,J＝8.8Hz),31.80(d,J＝15.4Hz),31.43(s),29.53(d,J＝2.5Hz),29.25(s),28.95(d,J＝10.5Hz),28.63(s),26.71(d,J＝18.2Hz),25.33(s),24.93(s),24.62(s),22.65(d,J＝6.6Hz),14.13(s).
G.化合物SW-II-134-1
1、化合物3的合成
向化合物1(500mg,2.283mmol,1eq.)和化合物2(890mg,6.849mmol,3eq)在甲苯/水(5mL/1mL)中的混合物中加入醋酸钯(51mg,0.228mmol,0.1eq.)、Ruphos(213mg,0.457mmol,0.2eq.)和碳酸钾(945mg,6.849mmol,3eq)。将混合物在氮气下于110℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(723mg，99.6％)。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(723mg,2.27mmol,1eq.)在THF(8mL)中的混合物中加入氢化铝锂(2.3mL,2.27mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(2.3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(381mg，58％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(381mg,1.3mmol,1eq.)和化合物5(352mg,1.6mmol,1.2eq.)在DCM(4mL)中的混合物中加入EDCI(499mg,2.6mmol,2eq.)和DMAP(63mg,0.52mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(671mg,5.2mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物6(272mg，44％)。
4、SW-II-134-1的合成
向化合物6(150mg,0.303mmol,1eq.)和化合物7(110mg,0.333mmol,1.1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(251mg,1.818mmol,6eq.)和碘化钾(101mg,0.61mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝15/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-134-1(168mg， 75％)。
LCMS:Rt:1.276min；MS m/z(ELSD):744.4[M+H]+；
HPLC:98.481％纯度，ELSD；RT＝10.724min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.01–6.93(m,2H),4.25(t,J＝7.3Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.85–3.72(m,2H),2.98–2.69(m,8H),2.62–2.48(m,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,4H),1.72–1.48(m,14H),1.45–1.17(m,36H),0.89(dt,J＝11.9,6.0Hz,9H).
13CNMR(101MHz,CDCl3)δ173.78(d,J＝16.7Hz),140.72(s),138.81(s),134.91(s),129.70(s),129.22(s),126.19(s),77.30(d,J＝11.4Hz),77.03(s),76.72(s),65.02(s),64.49(s),57.42(s),56.36(s),54.08(s),34.76(s),34.22(d,J＝4.2Hz),32.74(s),32.36(s),31.81(d,J＝9.1Hz),31.35(d,J＝5.3Hz),29.49(d,J＝2.8Hz),29.24(d,J＝2.2Hz),28.92(s),28.66(s),26.86(s),25.93(s),25.04(s),24.78(d,J＝6.6Hz),22.65(d,J＝2.6Hz),14.10(s).
H.化合物SW-II-134-2
1、化合物3的合成
向化合物1(500mg,2.283mmol,1eq.)和化合物2(1.08g,6.849mmol,3eq)在甲苯/水(5mL/1mL)中的混合物中加入醋酸钯(51mg,0.228mmol,0.1eq.)、Ruphos(213mg,0.457mmol,0.2eq.)和碳酸钾(945mg,6.849mmol,3eq)。将混合物在氮气下于110℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(854mg,100％)。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(854mg,2.28mmol,1eq.)在THF(9mL)中的混合物中加入氢化铝锂(2.3mL,2.28mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(2.3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(724mg,92％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(724mg,2.09mmol,1eq.)和化合物5(560mg,2.51mmol,1.2eq.)在DCM(8mL)中的混 合物中加入EDCI(803mg,4.18mmol,2eq.)和DMAP(102mg,0.84mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(1.078g,8.36mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物6(473mg,41％)。
4、SW-II-134-2的合成
向化合物6(150mg,0.27mmol,1eq.)和化合物7(108mg,0.33mmol,1.1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(225mg,1.63mmol,6eq.)和碘化钾(90mg,0.54mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝15/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-134-2(71.77mg,33％)。
LCMS:Rt:1.527min；MS m/z(ELSD):800.4[M+H]+；
HPLC:97.311％纯度，ELSD；RT＝9.025min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.06(d,J＝7.6Hz,1H),6.96(d,J＝9.6Hz,2H),4.25(t,J＝7.3Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.80–3.66(m,2H),2.86(dd,J＝12.8,5.6Hz,4H),2.78–2.67(m,4H),2.60–2.52(m,4H),2.29(t,J＝7.5Hz,4H),1.57(dt,J＝15.8,7.3Hz,14H),1.30(d,J＝20.3Hz,45H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.82(d,J＝16.9Hz),140.73(s),138.82(s),134.91(s),129.71(s),129.23(s),126.19(s),77.36(s),77.14(d,J＝20.4Hz),76.72(s),65.03(s),64.49(s),57.57(s),56.13(s),54.02(s),34.76(s),34.25(d,J＝4.2Hz),32.76(s),32.37(s),31.89(d,J＝5.3Hz),31.40(d,J＝6.0Hz),29.84(d,J＝3.7Hz),29.63–29.14(m),28.97(s),28.65(s),26.93(s),25.66(d,J＝54.4Hz),24.80(d,J＝6.6Hz),22.68(d,J＝1.8Hz),14.12(s).
1.化合物SW-II-134-3
1、化合物3的合成
向化合物1(10g,45mmol,1eq.)和化合物2(7.8g,54mmol,1.2eq.)在DCM(100mL)中的混合物中加入EDCI(17.3g,90mmol,2eq.)和DMAP(2.2g,18mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(23.2g,180mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝30/1)显示化合物1被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯(20mL)萃取并用水(40mL×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(4.365g,28％)。
2、化合物5的合成
将化合物3(5g,14.38mmol,1eq.)和化合物4(8.8g,143.7mmol,10eq.)在乙醇(2mL)中的混合物在55℃下在氮气下搅拌16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示观察到新的主要斑点。反应混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取并用水(3×50mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物5(1.008g，21％)。
3、化合物8的合成
向化合物6(500mg,2.283mmol,1eq.)和化合物7(699mg,6.849mmol,3eq)在甲苯/水(5mL/1mL)中的混合物中加入醋酸钯(51mg,0.228mmol,0.1eq.)、Ruphos(213mg,0.457mmol,0.2eq.)和碳酸钾(945mg,6.849mmol,3eq)。将混合物在氮气下于110℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物8(507mg,85％)。
4、化合物9的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物8(507mg,1.935mmol,1eq.)在THF(5mL)中的混合物中加入氢化铝锂(2mL,1.935mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(2mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物9(492mg,>100％)，无需进一步纯化。
5、化合物10的合成
向化合物9(492mg,2.103mmol,1eq.)和化合物1(563mg,2.523mmol,1.2eq.)在DCM(5mL)中的混合物中加入EDCI(808mg,4.206mmol,2eq.)和DMAP(103mg,0.84mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(1.085g,8.412mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状化合物10(329mg,36％)。
6、SW-II-134-3的合成
向化合物10(150mg,0.34mmol,1eq.)和化合物5(134mg,0.41mmol,1.2eq.)在CPME/CH3CN (2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(282mg,2.04mmol,6eq.)和碘化钾(113mg,0.68mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-134-3(63.59mg,25％)。
LCMS:Rt:1.247min；MS m/z(ELSD):688.3[M+H]+；
HPLC:95.945％纯度，ELSD；RT＝6.186min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(d,J＝7.6Hz,1H),6.97(dd,J＝9.9,2.2Hz,2H),4.26(t,J＝7.2Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),2.88(dd,J＝14.8,7.6Hz,4H),2.78–2.74(m,2H),2.67–2.54(m,8H),2.29(t,J＝7.5Hz,4H),1.68–1.47(m,15H),1.37–1.22(m,27H),0.98–0.86(m,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.86(d,J＝17.1Hz),140.66(s),138.76(s),134.93(s),129.74(s),129.24(s),126.19(s),77.36(s),77.04(s),76.72(s),65.01(s),64.48(s),57.73(s),55.73(s),53.93(s),34.76(s),34.28(d,J＝3.9Hz),33.54(d,J＝4.5Hz),32.41(s),31.95(d,J＝16.5Hz),29.49(s),29.15(dd,J＝21.1,2.4Hz),28.66(s),27.04(s),25.95(d,J＝3.3Hz),24.85(d,J＝6.6Hz),22.98–22.58(m),14.08(d,J＝7.5Hz).
J.SW-II-135-1
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,2.16mmol,1.0eq.)和化合物2(750mg,6.46mmol,3.0eq.)溶解在甲苯/H2O(5mL/1mL)中，向该混合物中加入Ruphos(201mg,0.43mmol,0.2eq)，Pd(OAc)2(48.5mg,0.22mmol,0.1eq)和Cs2CO3(2.10g,6.46mmol,3.0eq.)。反应混合物在氮气保护下110℃加热回流16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示反应完成并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(40mL)洗涤并用EA(50mL)萃取3次，所得有机相用盐水(20mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-30/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(540mg,82.44％)。
2、化合物4的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在THF(5mL)的化合物3(540mg,1.78mmol,1.0eq.)中加入LiAlH4(3.55mL,3.55mmol,1M THF中,2eq.)。反应物升至室温氮气保护下搅拌2小时。TLC(PE/EtOAc＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(10mL)淬灭，然后用1M盐酸调节pH＝6-7，用乙酸乙酯(50mL)萃取3次。有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状的化合物4(442mg,90.2％)。
3、化合物6的合成
将化合物4(442mg,1.60mmol,1.0eq.)和化合物5(428.5mg,1.92mmol,1.2eq.)溶解在DCM(5mL)中，向该混合物中加入EDCI(612mg,3.2mmol,2.0eq.)和DMAP(78.2mg,0.64mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(826mg,6.4mmol,4.0eq.)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示化合物4被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(40mL)洗涤并用EA(50mL)萃取3次，所得有机相用盐水(20mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(342mg,44.5％)。
4、SW-II-135-1的合成
化合物6(175mg,0.365mmol,1.2eq.)和化合物7(100mg,0.304mmol,1.0eq)溶解在CPME/CH3CN(1mL/1mL)中，向该混合物中加入碳酸钾(210mg,1.52mmol,5.0eq)和碘化钾(101mg,0.61mmol,2.0eq)。添加完后，反应混合物在氮气保护下90℃搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完全并且形成了所需产物。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-135-1(83.89mg,55.6％)。
LCMS:Rt:1.356min；MS m/z(ELSD):730.5[M+H]+；
HPLC:100％purity at ELSD；RT＝12.614min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.97(d,J＝7.6Hz,1H),6.91–6.74(m,2H),4.76(s,1H),3.99(dt,J＝13.6,6.4Hz,4H),3.72–3.58(m,2H),2.85–2.73(m,2H),2.72–2.61(m,4H),2.59–2.41(m,6H),2.22(dd,J＝13.2,7.2Hz,4H),1.93–1.79(m,2H),1.62–1.41(m,14H),1.23(d,J＝24.4Hz,32H),0.82(ddd,J＝13.6,8.0,5.6Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.81(d,J＝6.4Hz),139.55(s),137.38(s),137.14(s),128.16(d,J＝2.4Hz),124.69(s),76.51(s),76.19(s),75.88(s),63.43(s),62.78(s),56.53(s),54.90(s),52.84(s),33.23(d,J＝2.4Hz),31.73(s),31.28(s),30.91(dd,J＝20.0,6.4Hz),30.10(d,J＝3.2Hz),29.29(s),28.36(d,J＝22.8Hz),28.23(s),27.97(s),27.64(s),25.92(s),24.92(s),24.34(s),23.84(s),21.62(d,J＝7.6Hz),13.08(d,J＝4.7Hz).
K.化合物SW-II-135-2
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,2.16mmol,1.0eq.)和化合物2(931mg,6.46mmol,3.0eq.)溶解在甲苯/H2O(5mL/1mL)中，向该混合物中加入Ruphos(201mg,0.43mmol,0.2eq)、Pd(OAc)2(48.5mg,0.22mmol,0.1eq)和Cs2CO3(2.10g,6.46mmol,3.0eq.)。反应混合物在氮气保护下110℃加热回流16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示反应完成并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(40mL)洗涤并用EA(50mL)萃取3次，所得有机相用盐水(20mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-30/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(651mg,84％)。
2、化合物4的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在THF(7mL)的化合物3(651mg,1.81mmol,1.0eq.)中加入LiAlH4(3.62mL,3.62mmol,1M，THF中,2eq.)。反应物升至室温氮气保护下搅拌2小时。TLC(PE/EtOAc＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(10mL)淬灭，然后用1M盐酸调节pH＝6-7，用乙酸乙酯(50mL)萃取3次。有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状的化合物4(571mg,95.2％)。
3、化合物6的合成
将化合物4(571mg,1.72mmol,1.0eq.)和化合物5(459mg,2.06mmol,1.2eq.)溶解在DCM(6mL)中，向该混合物中加入EDCI(657mg,3.44mmol,2.0eq.)和DMAP(84mg,0.68mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(887.5mg,6.88mmol,4.0eq.)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示化合物4被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(50mL)洗涤并用EA(60mL)萃取3次，所得有机相用盐水(25mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(245mg,26.5％)。
4、SW-II-135-2的合成
化合物6(245mg,0.456mmol,1.5eq.)和化合物7(100mg,0.3mmol,1.0eq)溶解在CPME/CH3CN(1mL/1mL)中，向该混合物中加入碳酸钾(210mg,1.52mmol,5.0eq)和碘化钾(101mg,0.61mmol,2.0eq)。添加完后，反应混合物在氮气保护下90℃搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完全并且形成了所需产物。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-135-2(31.41mg,21.9％)。
LCMS:Rt:1.608min；MS m/z(ELSD):786.4[M+H]+；
HPLC:95.16％纯度，ELSD；RT＝7.919min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.98(d,J＝7.6Hz,1H),6.87(d,J＝2.4Hz,2H),4.28–4.13(m,1H),4.04–3.95(m,4H),3.94–3.84(m,2H),3.14–2.89(m,6H),2.59–2.43(m,6H),2.23(dd,J＝13.8,7.2Hz,4H),1.88–1.82(m,2H),1.70(s,4H),1.57–1.46(m,10H),1.33–1.16(m,40H),0.90–0.72(m,9H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.82(d,J＝6.8Hz),139.61(s),137.29(d,J＝16.4Hz),128.15(s),124.67(s),76.41(s),76.09(s),75.77(s),63.50(s),62.87(s),55.49(s),54.92(s),52.98(s),33.16(d,J＝2.4Hz),31.77(s),31.33(s),30.80(d,J＝6.5Hz),30.42(d,J＝3.6Hz),29.29(s),28.99–28.66(m),28.47(s),28.23(d,J＝2.8Hz),28.06–27.45(m),25.58(s),24.91(s),23.71(s),22.79(s),21.66(s),13.10(s).
L.化合物SW-II-136-2
1、化合物3的合成
化合物1(3g,13.70mmol,1.0eq.)和化合物2(5.34g,41.09mmol,3.0eq.)溶解在甲苯/H2O(30mL/3mL)中，向该混合物中加入Ruphos(1.28g,2.74mmol,0.2eq)，Pd(OAc)2(308.3mg,1.37mmol,0.1eq)和K2CO3(5.67g,41.10mmol,3.0eq.)。反应混合物在氮气保护下110℃加热回流16小时。TLC(PE/EA＝10/1)显示反应完成并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(90mL)洗涤并用EA(110mL)萃取3次，所得有机相用盐水(40mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-30/1)洗脱，得到黄色油状化合物3(1.98g,45.5％)。
2、化合物4的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在THF(20mL)的化合物3(1.98g,6.23mmol,1.0eq.)中加入LiAlH4(1M,12.45mL,2.0eq)。反应物升至室温氮气保护下搅拌2小时。TLC(PE/EtOAc＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用H2O(70mL)淬灭，然后用1M盐酸调节pH＝6-7，用EA(80mL)萃取3次。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状的化合物4(1.28g,71.1％)。
3、化合物7的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在DCM(9mL)的化合物4(900g,3.1mmol,1.0eq.)中加入DMSO(3.63g,51.72mmol,15eq)、TEA(1.25g,12.4mmol,4.0eq)和PySO3(1.27g,7.97mmol,2.57eq)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后升至室温氮气保护下下搅拌90分钟。然后向混合物中添加化合物6(4.74g,13.62mmol,3.0eq.)，反应混合物在氮气保护下25℃反应2小时。TLC(PE/EA＝10/1)显示反应完成并且形成了所需产物。反应混合物用H2O(60mL)洗涤并用EA(70mL)萃取3次，所得有机相用盐水(40mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到黄色油状化合物7(345mg,27.9％)。
4、化合物8的合成
将化合物7(340mg,0.95mmol,1.0eq.)和Pd/C(100mg)加入到MeOH(4ml)中，反应混合物在室温下在氢气保护下搅拌16h。TLC(PE/EA＝10/1)显示原料消耗完全，并生成了所需产物。反应混合物通过硅藻土过滤并用MeOH(40mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩滤液，获得淡黄色油状化合物8(298mg,88.2％)。
5、化合物9的合成
在氮气保护0℃下，向溶解在THF(3mL)的化合物8(298mg,0.83mmol,1.0eq.)中加入LiAlH4(1M,1.66mL,2.0eq)。反应物升至室温氮气保护下搅拌2小时。TLC(PE/EtOAc＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用H2O(20mL)淬灭，然后用1M盐酸调节pH＝6-7，用EA(30mL) 萃取3次。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状的化合物9(254mg,98.3％)。
6、化合物11的合成
将化合物9(254mg,0.80mmol,1.0eq.)和化合物10(214mg,0.96mmol,1.2eq.)溶解在DCM(3mL)中，向该混合物中加入EDCI(305.6mg,1.6mmol,2.0eq.)和DMAP(39mg,0.32mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(412.8mg,3.2mmol,4.0eq.)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌16小时。TLC(PE/EA＝10/1)显示化合物9被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用1M盐酸调节pH＝4-6，并用EA(30mL)萃取3次，所得有机相用盐水(15mL)洗涤两次，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-7/1)洗脱，得到黄色油状化合物11(210mg,50.5％)。
7、SW-II-136-2的合成
化合物11(200mg,0.38mmol,1.2eq.)和化合物12(105mg,0.32mmol,1.0eq)溶解在CPME/CH3CN(1.5mL/1.5mL)中，向该混合物中加入K2CO3(220.2mg,1.60mmol,5.0eq)和KI(106mg,0.64mmol,2.0eq)。添加完后，反应混合物在氮气保护下90℃搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完全并且形成了所需产物。混合物用EA萃取并用水洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-136-2(208mg,90.4％)。
LCMS:Rt:2.146min；MS m/z(ELSD):773.3[M+H]+；
HPLC:99.49％纯度，ELSD；RT＝8.055min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.04(d,J＝7.6Hz,1H),6.92(d,J＝9.6Hz,2H),4.45(s,1H),4.06(dd,J＝12.0,5.2Hz,4H),3.64(t,J＝5.2Hz,2H),2.72(t,J＝5.2Hz,2H),2.65–2.50(m,10H),2.29(t,J＝7.6Hz,4H),1.69–1.48(m,18H),1.41–1.24(m,36H),0.95–0.78(m,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.86(d,J＝2.8Hz),140.48(s),139.24(s),138.01(s),129.13(d,J＝14.8Hz),125.67(s),77.37(s),77.05(s),76.73(s),64.45(s),64.23(s),57.88(s),55.91(s),53.94(s),35.07(s),34.29(d,J＝3.2Hz),32.79(s),32.35(s),31.82(d,J＝8.4Hz),31.38(s),29.50(d,J＝2.4Hz),29.16(dd,J＝18.0,2.0Hz),28.66(s),28.35(s),27.78(s),27.08(s),26.02(d,J＝17.2Hz),24.89(d,J＝1.6Hz),22.65(s),14.10(s).
M.化合物SW-II-137-1
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,1.95mmol,1.0eq.),溶解在甲苯(5.0mL)中，然后加入化合物2(239mg,2.34mmol,1.2eq.)、Pd(PPh3)4(225mg,0.19mmol,0.1eq)、水(1mL)和K2CO3(808g,5.85mmol,3.0eq.)。氮气保护下 110℃反应3小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料已经反应完并且形成所要产物。反应加H2O(70mL)，EA(80mL×3)萃取。合并有机相饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并且减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物(320mg,70％)。
2、化合物4的合成
化合物3(300mg,1.28mmol,1.0eq.)溶解在THF(4.0mL)中，氮气保护下0℃加LAH(97mg,2.56mmol,2.0eq)。然后室温下反应2小时。TLC(PE/EA＝10/1)显示原料反应完全并且生成要的产物。加HCl(1M,4mL)溶液和H2O(10mL)淬灭，EA(50mL×3)萃取。有机相使用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并且减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-10/1，v/v)洗脱得到黄色油状化合物4(224mg,84.8％)。
3、化合物6的合成
化合物4(90mg,0.47mmol,1.0eq.)溶解在DCM(3.0mL)中，添加化合物5(127mg,0.56mmol,1.2eq.)、EDCI(180mg,0.94mmol,2.0eq.)、DIEA(242mg,1.88mmol,4.0eq.)和DMAP(23mg,0.18mmol,0.4eq.)。然后，氮气保护下室温反应过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示原料已经反映完并且形成需要产物。用HCl(1M)溶液淬灭反应，调PH＝4～6，用EA(40mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物使用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-20/1，v/v)洗脱得到无色油状化合物6(90mg,48.6％)。
4、SW-II-137-1的合成
化合物6(90mg,0.25mmol,1.0eq.)溶解在MeCN(2mL)中加入化合物7(110mg,0.25mmol,1.0eq)、KI(76mg,0.50mmol,2.0eq)、CPME(2mL)和K2CO3(157mg,1.25mmol,5.0eq)。氮气保护下90℃反应过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料反应完全并且形成了需要的产物。用水(50mL)淬灭，EA(40mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10/1,v/v)洗脱得到黄色油状化合物(98mg,52.12％，SW-II-137-1)。
LCMS:Rt:1.596min；MS m/z(ELSD):758.4[M+H]+；
HPLC:98.02％纯度，ELSD；RT＝5.993min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.02(d,J＝8.8Hz,4H),4.92–4.71(m,1H),4.01(t,J＝6.4Hz,2H),3.78(s,1H),3.55(t,J＝5.2Hz,2H),2.76–2.40(m,10H),2.21(dd,J＝15.6,7.7Hz,4H),1.95–1.80(m,2H),1.49(ddd,J＝24.4,15.8,6.2Hz,15H),1.34–1.13(m,37H),0.82(dt,J＝13.6,7.2Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.79(s),173.57(s),140.49(s),138.30(s),128.43(s),128.22(s),77.43(s),77.11(s),76.79(s),74.11(s),63.66(s),57.96(s),55.75(s),53.90(s),35.22(s),34.63(s),34.20(d,J＝11.6Hz),33.70(s),31.80(d,J＝11.2Hz),30.30(s),29.51(d,J＝2.8Hz),29.13(dd,J＝9.6,6.8Hz),27.12(d,J＝2.8Hz),26.29(s),25.31(s),24.97(d,J＝15.6Hz),22.66(s),22.37(s),14.02(d,J＝15.2Hz).
N.化合物SW-II-137-2
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,2.06mmol,1.0eq.),化合物2(286mg,2.47mmol,1.2eq.)，Pd(PPh3)4(119mg,0.1mmol,0.1eq)和K2CO3(851mg,6.21mmol,3.0eq.)溶解在甲苯(5.0mL)中，加水(0.5mL)。然后，氮气保护下110℃反应3小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料反应完全并且形成了所要的化合物。用H2O(70mL)淬灭反应，EA(80mL×3)萃取。用饱和食盐水(2×30mL)洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用(PE/EA＝5/1,v/v)洗脱得到无色油状化合物3(420mg,87.5％)。
2、化合物4的合成
化合物3(420mg,1.78mmol,1.0eq.)溶解在THF(3.0mL)中，氮气保护下0℃滴加LAH(1M,7mL,2.0eq)。然后，室温反应2小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料反应完并且形成了需要的产物。用HCl(1M,4mL)溶液和H2O(10mL)淬灭，EA(50mL×3)萃取。有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并且减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用(PE/EA＝5/1，v/v)洗脱得到无色油状化合物4(320mg,94％)。
3、化合物6的合成
化合物4(320mg,1.55mmol,1.0eq.)溶解在DCM(4.0mL)中，加化合物5(416mg,1.86mmol,1.2eq.)，EDCI(594mg,3.11mmol,2.0eq.)，DIEA(802mg,6.21mmol,4.0eq.)和DMAP(76mg,0.62mmol,0.4eq.)。然后，氮气保护下室温反应过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示原料反应完并形成需要产物。反应用HCl(1M)溶液淬灭并调PH＝4～6，DCM(60mL×3)萃取。有机相用饱和食盐水(2×35mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用(PE/EA＝5/1,v/v)洗脱得到无色油状化合物6(300mg,47.17％)。
4、SW-II-137-2的合成
化合物6(167mg,0.41mmol,1.2eq.)，化合物7(150mg,0.34mmol,1.0eq)，KI(113mg,0.68mmol,2.0eq)和CPME(2mL)溶解在MeCN(2mL)中，加K2CO3(235mg,1.70mmol,5.0eq)。氮气保护下90℃反应过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料反应完全并且生成需要的产物。反应用水(50mL)淬灭，EA(60mlx3)萃取。有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10/1,v/v)洗脱得到浅黄色油状化合物(105mg,40.3％,SW-II-137-2)。
LCMS:Rt:1.660min；MS m/z(ELSD):772.4[M+H]+；
HPLC:98.38％纯度，ELSD；RT＝8.743min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝8.8Hz,4H),5.04–4.74(m,1H),4.08(t,J＝6.4Hz,2H),3.58(t,J＝5.2Hz,2H),2.65(dd,J＝9.6,5.6Hz,4H),2.60–2.44(m,6H),2.29(dd,J＝16.4,7.6Hz,4H),2.01–1.88(m,2H),1.59(dt,J＝9.2,7.2Hz,6H),1.54–1.42(m,8H),1.39–1.11(m,41H),0.88(dt,J＝11.8,6.0Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.86(s),173.63(s),140.59(s),138.34(s),128.45(s),128.24(s),77.36(s),77.04(s),76.72(s),74.14(s),63.69(s),58.11(s),55.71(s),53.90(s),35.53(s),34.68(s),34.23(d,J＝14.8Hz),31.82(d,J＝11.6Hz),31.56(s),31.26(s),30.32(s),29.53(d,J＝2.8Hz),29.19(dd,J＝8.0,4.4Hz),27.20(d,J＝2.4Hz),26.64(s),25.33(s),25.02(d,J＝15.6Hz),22.62(d,J＝11.6Hz),14.08(d,J＝8.0Hz).
O.化合物SW-II-137-3
1、化合物3的合成
向化合物1(11.8g,53mmol,1.2eq.)和化合物2(11.2g,44mmol,1eq.)在DCM(110mL)中的混合物中加入EDCI(16.9g,88mmol,2eq.)和DMAP(2.1g,18mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(22.7g,176mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝30/1)显示化合物1被消耗并且形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯(200mL)萃取并用水(200mL×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(7.391g,37％)。
2、化合物5的合成
将化合物3(7.391mg,16.07mmol,1eq.)和化合物4(29.4g,482.02mmol,30eq.)在乙醇(2mL)中的混合物在55℃下在氮气下搅拌16小时。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示观察到新的主要斑点。反应混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取并用水(3×100mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物5(3.695g,52％)。
3、化合物8的合成
向化合物6(1g,4.12mmol,1eq.)和化合物7(803g,6.17mmol,1.5eq)在1,4-二氧六环/水(10mL/1mL)中的混合物中加入Pd(dtbpf)Cl2(269mg,0.41mmol,0.1eq.)和碳酸钾(1.7g,12.36mmol,3eq)。将混合物在氮气下于100℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化， 用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物8(568mg,56％)。
4、化合物9的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物8(568mg,2.29mmol,1eq.)在THF(6mL)中的混合物中加入氢化铝锂(2.3mL,2.29mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(2.3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物9(541mg,>100％)，无需进一步纯化。
5、化合物10的合成
向化合物9(441mg,2mmol,1eq.)和化合物1(536mg,2.4mmol,1.2eq.)在DCM(5mL)中的混合物中加入EDCI(768mg,4mmol,2eq.)和DMAP(98mg,0.8mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(1.032g,8mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-10/1)洗脱，得到无色油状化合物10(372mg,44％)。
6、SW-II-137-3的合成
向化合物10(150mg,0.353mmol,1eq.)和化合物5(156mg,0.353mmol,1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(244mg,1.765mmol,6eq.)和碘化钾(117mg,0.706mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-137-3(56.17mg,20％)。
LCMS:Rt:1.550min；MS m/z(ELSD):786.4[M+H]+；
HPLC:98.597％纯度，ELSD；RT＝13.153min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.09(s,4H),4.92–4.78(m,1H),4.08(t,J＝6.6Hz,2H),3.62(t,J＝5.2Hz,2H),2.78–2.50(m,10H),2.35–2.22(m,4H),2.00–1.88(m,2H),1.57(ddd,J＝28.9,13.5,4.5Hz,14H),1.38–1.20(m,42H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.83(s),173.60(s),140.60(s),138.33(s),128.44(s),128.24(s),77.36(s),77.04(s),76.72(s),74.15(s),63.69(s),57.95(s),55.83(s),53.95(s),35.56(s),34.65(s),34.21(d,J＝13.0Hz),31.81(d,J＝12.3Hz),31.54(s),30.32(s),29.52(d,J＝3.1Hz),29.34–28.94(m),27.13(d,J＝2.5Hz),26.31(s),25.33(s),24.99(d,J＝15.7Hz),22.64(d,J＝5.7Hz),14.11(s).
P.化合物SW-II-138-1
1、化合物2的合成
化合物1(4g,16.46mmol,1.0eq.)溶解在MeOH(40mL)中，冷却至0℃滴加SOCl2(3.9g,32.92mmol,2.0eq)。然后室温反应1小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完并形成了需要产物。体系直接减压旋干，残留物中加入NaHCO3(70mL)溶液，用EA(80mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1，v/v)洗脱得到黄色油状化合物2(4.1mg,95％)。
2、化合物4的合成
化合物2(500mg,1.95mmol,1.0eq.),化合物3(239mg,2.34mmol,1.2eq.)、Pd(PPh3)4(225mg,0.19mmol,0.1eq)和K2CO3(808g,5.85mmol,3.0eq.)溶解在甲苯(5.0mL)中加水(1mL)。然后氮气保护下110℃反应3小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应加H2O(70mL)淬灭，EA(80mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物使用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1，v/v)洗脱得到黄色油状化合物4(320mg,70％)。
3、化合物5的合成
化合物4(300mg,1.28mmol,1.0eq.)溶解在THF(4.0mL)中，0℃加LAH(97mg,2.56mmol,2.0eq)。然后氮气保护下室温反应2小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。加HCl(1M,4mL)溶液和H2O(10mL)淬灭反应,用EA(50mL×3)萃取。有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1，v/v)洗脱得到黄色油状化合物5(224mg,84.8％)。
4、化合物7的合成
化合物7(224mg,1.09mmol,1.0eq.)溶解在DCM(3.0mL)中，加化合物6(290mg,1.30mmol,1.2eq.)，EDCI(415mg,2.17mmol,2.0eq.)、DIEA(561mg,4.35mmol,4.0eq.)和DMAP(53mg,0.43mmol,0.4eq.)。然后，氮气保护下室温反应过夜。TLC(PE/EA＝30/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应用HCl(1M)溶液淬灭并调节PH＝4～6，用DCM(80mL×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-30:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物7(208mg,46.7％)。
5、SW-II-138-1的合成
化合物10(110mg,0.25mmol,1eq.)、化合物7(153mg,0.37mmol,1.5eq)、KI(83mg、0.50mmol,2.0eq)和CPME(2mL)溶解在MeCN(2mL)中加K2CO3(172mg,1.25mmol,5.0eq)。氮气保护下90℃反应过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应直接减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱得到浅黄色油状化合物(65mg,32％，SW-II-138-1)。
LCMS:Rt:1.684min；MS m/z(ELSD):772.4[M+H]+；
HPLC:96.56％纯度，ELSD；RT＝6.346min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.09(s,4H),4.86(s,1H),4.09(d,J＝6.0Hz,2H),3.97(s,2H),3.07(d,J＝38.8Hz,6H),2.69–2.51(m,4H),2.28(td,J＝7.3,3.6Hz,4H),1.79(s,4H),1.70–1.46(m,16H),1.42–1.17(m,37H),0.90(dt,J＝13.6,7.2Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.80(s),173.53(s),140.32(s),139.13(s),128.28(d,J＝13.6Hz),77.43(s),77.11(s),76.80(s),74.21(s),64.22(s),56.85(s),55.98(s),53.93(s),35.22(s),35.01(s),34.54(s),34.14(d,J＝5.6Hz),33.71(s),31.85(s),29.50(d,J＝2.8Hz),29.22(s),29.12–28.60(m),28.26(s),27.78(s),26.70(d,J＝4.4Hz),25.31(s),24.82(d,J＝17.6Hz),24.28(s),22.65(s),22.37(s),14.03(d,J＝15.2Hz).
QSW-II-138-2
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,1.95mmol,1.0eq.),化合物2(271mg,2.34mmol,1.2eq.)、Pd(PPh3)4(225mg,0.20mmol,0.1eq)和K2CO3(809g,5.86mmol,3.0eq.)溶解在甲苯(5.0mL)中加水(1mL)，然后氮气保护下110℃反应3小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应加水(70mL)淬灭，用EA(80mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-30:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物3(320mg,70％)。
2、化合物4的合成
化合物3(320mg,1.29mmol,1.0eq.)溶解在THF(3.0mL)中，0℃加LAH(67mg,1.77mmol,2.0eq),然后，氮气保护下室温反应2小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应用HCl(1M,2mL)溶液和H2O(10mL)淬灭，EA(50mL×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-30:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物4(180mg,64％)。
3、化合物6的合成
化合物4(180mg,0.82mmol,1.0eq.)溶解在DCM(3.0mL)中加化合物5(245mg,1.10mmol,1.2eq.)、EDCI(347mg,1.82mmol,2.0eq.)、DIEA(470mg,3.63mmol,4.0eq.)和DMAP(45mg,0.36mmol,0.4eq.)。然后，反应在氮气保护下室温过夜。TLC(PE/EA＝30/1)显示原料消耗完全并形成了需要的产物。反应用HCl(1M)溶液淬灭并调节PH＝5～6，用DCM(80mL×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-30:1,v/v)洗脱得到无色油状化合物6(220mg,63.6％)。
4、SW-II-138-2的合成
化合物6(158mg,0.37mmol,1.5eq.)和化合物7(110mg,0.25mmol,1.0eq)、KI(83mg,0.50mmol,2.0eq)和CPME(2mL)溶解在MeCN(2mL)中，加K2CO3(172mg,1.25mmol,5.0eq)。然后，反应在氮气保护下90℃反应过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料消耗完并形成了需要的产物。反应直接减压旋干，残留物用硅胶柱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱得到无色油状目标产物(100mg,51％,SW-II-138-2)。
LCMS:Rt:1.834min；MS m/z(ELSD):786.4[M+H]+；
HPLC:99.20％纯度，ELSD；RT＝7.990min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00(s,4H),4.88–4.73(m,2H),4.00(t,J＝5.6Hz,2H),3.81–3.54(m,2H),3.00–2.81(m,2H),2.81–2.65(m,4H),2.50(dd,J＝16.4,8.4Hz,4H),2.20(td,J＝7.6,3.2Hz,4H),1.56(ddd,J＝18.4,10.4,5.2Hz,13H),1.43(d,J＝5.6Hz,4H),1.34–1.07(m,40H),0.81(dt,J＝11.2,5.6Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.78(s),173.52(s),140.32(s),139.11(s),128.25(d,J＝11.6Hz),77.49(s),77.17(s),76.85(s),74.14(s),64.17(s),57.25(s),55.82(s),53.85(s),35.50(s),35.01(s),34.56(s),34.14(d,J＝7.2Hz),31.84(s),31.53(s),31.23(s),29.49(d,J＝2.8Hz),29.21(s),28.94(dd,J＝6.4,4.4Hz),28.25(s),27.77(s),26.84(d,J＝4.4Hz),25.30(s),25.25–24.59(m),22.59(d,J＝11.2Hz),14.05(d,J＝7.6Hz).
R.SW-II-138-3
1、化合物3的合成
化合物1(500mg,1.95mmol,1.0eq.)、化合物2(305mg,2.34mmol,1.2eq.)、Pd(PPh3)4(225mg,0.20mmol,0.1eq)和K2CO3(809g,5.86mmol,3.0eq.)溶解在甲苯(5.0mL)中加水(1mL)。然后，反应在氮气保护下110℃反应3小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料消耗完全并且形成要的化合物。反应加水(80mL)淬灭，用EA(80mL×3)萃取。合并有机相并用饱和食盐水(2×40mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并且减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物3(260mg, 51.3％)。
2、化合物4的合成
化合物3(260mg,0.99mmol,1.0eq.)溶解在THF(4.0mL)中，0℃加LAH(75mg,1.98mmol,2.0eq)。然后，氮气保护下室温反应2小时。TLC(PE/EA＝5/1)显示原料反应完并形成了需要的化合物。反应用HCl(1M,4mL)溶液和H2O(20mL)淬灭，EA(50mL×3)萃取。合并有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-5:1,v/v)洗脱得到无色油状化合物4(230mg,98％).
3、化合物6的合成
化合物4(240mg,1.03mmol,1.0eq.)溶解在DCM(4.0mL)中，依次加入化合物5(275mg,1.23mmol,1.2eq.)、EDCI(392mg,2.07mmol,2.0eq.)、DIEA(530mg,4.10mmol,4.0eq.)和DMAP(50mg,0.41mmol,0.4eq.)。然后氮气保护下室温反应过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示原料消耗完并且形成了需要的化合物。反应用HCl(1M)淬灭并且调节PH＝5～6，DCM(80mL×3)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(2×30mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并且减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用PE/EA(1/0-20:1，v/v)洗脱得到无色油状化合物6(180mg,40.9％)。
4、SW-II-138-3的合成
化合物6(164mg,0.37mmol,1eq.)和化合物7(110mg,0.24mmol,1.0eq)、KI(83mg,0.49mmol,2.0eq)和CPME(2mL)溶解在MeCN(2mL)中加入K2CO3(172mg,1.24mmol,5.0eq)。然后，氮气保护下90℃反应过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示原料消耗完并且形成要的产物。反应直接减压旋干。残留物用硅胶柱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱得到无色油状目标产物(108mg,52.76％，SW-II-138-3)。
LCMS:Rt:2.007min；MS m/z(ELSD):800.4[M+H]+；
HPLC:97.95％纯度，ELSD；RT＝9.455min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(s,4H),4.86(p,J＝6.4Hz,1H),4.08(s,2H),3.60(t,J＝5.2Hz,3H),2.76–2.42(m,10H),2.28(td,J＝7.6,2.8Hz,4H),1.70–1.42(m,18H),1.28(d,J＝20.0Hz,41H),0.88(t,J＝6.8Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.85(s),173.59(s),140.39(s),139.15(s),128.27(d,J＝12.0Hz),77.38(s),77.07(s),76.75(s),74.13(s),64.17(s),58.06(s),55.75(s),53.92(s),35.57(s),35.03(s),34.66(s),34.22(d,J＝13.2Hz),31.81(d,J＝12.4Hz),31.54(s),29.52(d,J＝2.9Hz),29.34–28.95(m),28.29(s),27.79(s),27.16(d,J＝3.6Hz),26.50(s),25.32(s),24.99(d,J＝17.6Hz),22.64(d,J＝5.6Hz),14.10(s).
S.化合物SW-II-139-1
1、化合物3的合成
向化合物1(1g,4.37mmol,1eq.)和化合物2(852g,6.55mmol,1.5eq)在1,4-二氧六环/水(10mL/1mL)中的混合物中加入Pd(dtbpf)Cl2(286mg,0.437mmol,0.1eq.)和碳酸钾(1.8g,13.11mmol,3eq)。将混合物在氮气下于100℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(691mg,68％)。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(691mg,2.95mmol,1eq.)在THF(7mL)中的混合物中加入氢化铝锂(3mL,2.95mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(547mg,90％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(447mg,2.17mmol,1eq.)和化合物5(581mg,2.6mmol,1.2eq.)在DCM(5mL)中的混合物中加入EDCI(833mg,4.34mmol,2eq.)和DMAP(106mg,0.87mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(1.12g,8.68mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物6(455mg,51％)。
4、SW-II-139-1的合成
向化合物6(150mg,0.365mmol,1eq.)和化合物7(161mg,0.365mmol,1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(252mg,1.825mmol,6eq.)和碘化钾(121mg,0.73mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1，v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-139-1(54.53mg,19％)。
LCMS:Rt:1.521min；MS m/z(ELSD):772.4[M+H]+；
HPLC:99.637％纯度，ELSD；RT＝12.347min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(t,J＝7.7Hz,1H),7.03(t,J＝6.8Hz,3H),4.94–4.78(m,1H),4.27(t,J＝7.2Hz,2H),3.65(t,J＝5.1Hz,2H),2.90(t,J＝7.2Hz,2H),2.73(t,J＝4.9Hz,2H),2.67–2.41(m,6H),2.28(td,J＝7.5,2.7Hz,4H),1.67–1.45(m,14H),1.41–1.19(m,42H),0.88(dd,J＝7.9,5.7Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.65(d,J＝11.3Hz),143.17(s),137.67(s),129.04(s),128.34(s), 126.61(s),126.11(s),77.30(d,J＝11.6Hz),77.04(s),76.72(s),74.16(s),64.85(s),57.88(s),55.93(s),53.97(s),35.94(s),35.13(s),34.64(s),34.20(d,J＝10.5Hz),31.80(d,J＝13.7Hz),31.50(s),29.52(d,J＝2.9Hz),29.34–28.92(m),27.08(d,J＝3.9Hz),26.10(s),25.33(s),25.05(s),24.82(s),22.64(d,J＝6.5Hz),14.11(s).
T.化合物SW-II-139-2
1、化合物3的合成
向化合物1(1g,4.37mmol,1eq.)和化合物2(668g,6.55mmol,1.5eq)在1,4-二氧六环/水(10mL/1mL)中的混合物中加入Pd(dtbpf)Cl2(286mg,0.437mmol,0.1eq.)和碳酸钾(1.8g,13.11mmol,3eq)。将混合物在氮气下于100℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(605mg,67％)油。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(605mg,2.94mmol,1eq.)在THF(7mL)中的混合物中加入氢化铝锂(3mL,2.94mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(534mg,>100％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(434mg,2.44mmol,1eq.)和化合物5(652mg,2.93mmol,1.2eq.)在DCM(5mL)中的混合物中加入EDCI(937mg,4.88mmol,2eq.)和DMAP(119mg,0.976mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(1.259g,9.76mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物6(355mg,38％)。
4、SW-II-139-2的合成
向化合物6(122mg,0.319mmol,1eq.)和化合物7(140mg,0.319mmol,1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(220mg,1.595mmol,5eq.)和碘化钾(106mg,0.638mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-139-2(45.48mg,19％)。
LCMS:Rt:1.346min；MS m/z(ELSD):744.3[M+H]+；
HPLC:97.994％纯度，ELSD；RT＝11.235min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(t,J＝7.8Hz,1H),7.03(t,J＝7.6Hz,3H),4.91–4.81(m,1H),4.27(t,J＝7.2Hz,2H),3.89–3.75(m,2H),2.99–2.79(m,7H),2.64–2.48(m,2H),2.28(td,J＝7.5,3.1Hz,4H),1.74–1.08(m,53H),0.90(dt,J＝13.6,7.2Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.60(d,J＝11.7Hz),143.13(s),137.65(s),129.06(s),128.34(s),126.64(s),126.11(s),77.30(d,J＝11.4Hz),77.04(s),76.72(s),74.22(s),64.88(s),57.28(s),56.55(s),54.11(s),35.60(s),35.12(s),34.56(s),34.15(d,J＝4.0Hz),33.68(s),31.86(s),29.52(d,J＝2.8Hz),29.24(s),28.91(dd,J＝7.0,4.2Hz),26.81(d,J＝3.9Hz),25.33(s),25.12–24.98(m),24.83(d,J＝22.2Hz),22.67(s),22.40(s),14.04(d,J＝14.4Hz).
U.化合物SW-II-140-1
1、化合物3的合成
向化合物1(1g,4.37mmol,1eq.)和化合物2(852g,6.55mmol,1.5eq)在1,4-二氧六环/水(10mL/1mL)中的混合物中加入Pd(dppf)Cl2(286mg,0.437mmol,0.1eq.)和碳酸钾(1.8g,13.11mmol,3eq)。将混合物在氮气下于100℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(748mg,73％)。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(748mg,3.2mmol,1eq.)在THF(8mL)中的混合物中加入氢化铝锂(3.2mL,3.2mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(3mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(493mg,75％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(393mg,1.91mmol,1eq.)和化合物5(511mg,2.29mmol,1.2eq.)在DCM(5mL)中的混合物中加入EDCI(733mg,3.82mmol,2eq.)和DMAP(93mg,0.76mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(986mg,7.64mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到化合物6(327mg,42％)，为无色油。
4、SW-II-140-1的合成
向化合物6(150mg,0.365mmol,1eq.)和化合物7(161mg,0.365mmol,1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(302mg,2.19mmol,6eq.)和碘化钾(121mg,0.73mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-140-1(180mg,64％)。
LCMS:Rt:1.568min；MS m/z(ELSD):772.4[M+H]+；
HPLC:98.053％纯度，ELSD；RT＝8.702min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.23–7.05(m,4H),4.95–4.79(m,1H),4.25(t,J＝7.4Hz,2H),3.62(t,J＝4.8Hz,2H),2.96(dd,J＝15.4,8.0Hz,2H),2.74–2.49(m,8H),2.28(dd,J＝14.2,7.2Hz,4H),1.67–1.44(m,14H),1.41–1.20(m,42H),0.90(dt,J＝13.2,7.1Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.68(d,J＝10.2Hz),141.26(s),135.23(s),129.73(s),129.37(s),126.72(s),125.92(s),77.35(s),77.03(s),76.71(s),74.17(s),64.52(s),57.99(s),55.87(s),53.94(s),34.66(s),34.21(d,J＝11.5Hz),32.75(s),31.83(d,J＝9.8Hz),31.32(s),29.65–28.88(m),27.15(d,J＝3.7Hz),26.35(s),25.33(s),25.07(s),24.83(s),22.66(d,J＝3.4Hz),14.12(s).
V.SW-II-140-2
1、化合物3的合成
向化合物1(1g,4.37mmol,1eq.)和化合物2(668g,6.55mmol,1.5eq)在1,4-二氧六环/水(10mL/1mL)中的混合物中加入Pd(dppf)Cl2(286mg,0.437mmol,0.1eq.)和碳酸钾(1.8g,13.11mmol,3eq)。将混合物 在氮气下于100℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝20/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用PE/EA(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物3(406mg,45％)。
2、化合物4的合成
在0℃和氮气环境下，向化合物3(406mg,1.97mmol,1eq.)在THF(5mL)中的混合物中加入氢化铝锂(2mL,1.97mmol,1M,THF中,1eq.)。将混合物在室温下搅拌3小时。TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用水(2mL)淬灭并用2N盐酸处理以将PH调节在6和7之间，用乙酸乙酯萃取并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到无色油状化合物4(341mg,97％)，无需进一步纯化。
3、化合物6的合成
向化合物4(241mg,1.35mmol,1eq.)和化合物5(361mg,1.62mmol,1.2eq.)在DCM(3mL)中的混合物中加入EDCI(518mg,2.7mmol,2eq.)和DMAP(66mg,0.54mmol,0.4eq.)，然后加入DIEA(697mg,5.4mmol,4eq.)。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌16小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝15/1)显示形成了所需产物。反应混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1/0-20/1)洗脱，得到无色油状化合物6(185mg,32％)。
4、SW-II-140-2的合成
向化合物6(185mg,0.483mmol,1eq.)和化合物7(213mg,0.483mmol,1eq.)在CPME/CH3CN(2mL/2mL)中的混合物中加入碳酸钾(400mg,2.898mmol,6eq.)和碘化钾(160mg,0.966mmol,2eq.)。添加后，将混合物在氮气下在90℃下搅拌过夜。TLC(DCM/MeOH＝10/1)显示反应完成并观察到新的主要斑点。混合物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(1/0-10:1,v/v)洗脱，得到黄色油状化合物SW-II-140-2(161mg,45％)。
LCMS:Rt:1.696min；MS m/z(ELSD):744.3[M+H]+；
HPLC:94.658％纯度，ELSD；RT＝5.938min.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22–7.03(m,4H),4.94–4.78(m,1H),4.25(t,J＝7.3Hz,2H),3.70–3.54(m,2H),2.96(t,J＝7.4Hz,2H),2.77–2.41(m,8H),2.28(dd,J＝14.3,7.1Hz,4H),1.65–1.18(m,52H),0.91(dt,J＝13.3,7.1Hz,9H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.67(d,J＝10.8Hz),141.22(s),135.23(s),129.73(s),129.39(s),126.72(s),125.92(s),77.36(s),77.04(s),76.72(s),74.17(s),64.52(s),57.92(s),55.92(s),53.96(s),34.66(s),34.21(d,J＝11.2Hz),33.51(s),32.44(s),31.83(d,J＝9.3Hz),29.53(d,J＝2.9Hz),29.14(dd,J＝11.3,8.5Hz),27.12(d,J＝4.1Hz),26.23(s),25.33(s),25.06(s),24.82(s),22.73(d,J＝9.9Hz),14.08(d,J＝8.8Hz).
实施例2 CDC处方和BIC处方制备的LPP制剂的体内表达情况
本实施例采用CDC处方(参见，例如Yang R et al.A core-shell structured COVID-19 mRNA vaccine with favorable biodistribution pattern and promising immunity.Signal Transduct Target Ther.2021 May 31；6(1):213)和BIC处方(见下文)制备包含荧光素酶mRNA(Trilink Biotechnologies，SEQ ID NO:1)的LPP制剂。
其中CDC处方制备LPP制剂的制备过程为：脂质混合液的制备：按重量比例将M5:DOPE:mPEG2000-DSPE＝49:49:2溶解于乙醇溶液。
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将荧光素酶mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.2mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米粒溶液：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米粒溶液与脂质溶液进行二次混合：体积＝4.0mL，流速比＝3(核纳米粒溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温，获得LPP-mRNA溶液。
离心超滤：将LPP-mRNA溶液通过超滤离心去除乙醇(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，制得CDC处方制备的LPP制剂。
BIC处方制备LPP制剂的制备过程为：脂质混合液的制备：按摩尔比例将M5:DOPE:胆固醇:mPEG2000-DMG＝40:15:43.5:1.5溶解于乙醇溶液；
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将荧光素酶mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.2mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米粒溶液：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米粒溶液与脂质溶液进行二次混合：体积＝4.0mL，流速比＝3(核纳米粒溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温，获得LPP-mRNA溶液。
离心超滤：将LPP-mRNA溶液通过超滤离心去除乙醇(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，制得BIC处方制备的LPP制剂。
将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)分为三组(CDC处方组、BIC处方组和PBS组，每组3只)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的CDC处方制备的LPP溶液，BIC处方制备的LPP溶液和对照PBS。于给药后的6小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物(茂康生物科技)，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠注射部位和肝脏中的体内表达情况。
实验结果如图1所示，每组的3个柱从左至右分别为注射部位的荧光素酶表达、肝脏中的荧光素酶表达和肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。观察到BIC处方制备的LPP在注射部位的荧光高于CDC处方制备的LPP，而肝脏/注射部位(％)的荧光素酶表达比值低于CDC处方制备的LPP。说明BIC处方制备的LPP的表达效率高于CDC处方制备的LPP，并且在肝脏表达少，靶向性好，肝毒性低，考虑到BIC处方中的LPP为四脂质组合物，而CDC处方中的LPP为三脂质组合物，下述 实施例进一步研究四脂质组合物，优化此脂质组合物递送系统。
实施例3不同脂质比例的LPP制剂的表达量的比较
本实施例采用表1配方制备包含eGFP mRNA(Trilink Biotechnologies，SEQ ID NO:2)的四脂质LPP制剂SW0123.351-1LPP～SW0123.351-23LPP。
SW0123.351-1LPP的制备过程为：脂质混合液的制备：按比例将M5:DOPE:胆固醇:mPEG2000-DMG＝40:15:43.5:1.5溶解于乙醇溶液。
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将荧光素酶mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.2mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米粒溶液：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米粒溶液与脂质溶液进行二次混合：体积＝4.0mL，流速比＝3(核纳米粒溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温，获得LPP-mRNA溶液。
离心超滤：将LPP-mRNA溶液通过超滤离心去除乙醇(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，制得编号为SW0123.351-1LPP的LPP制剂。
编号为SW0123.351-2LPP～SW0123.351-23LPP的LPP制剂的制备方法与SW0123.351-1LPP一致，区别在于脂质比例(如表1所示)。分别取100ng的含eGFP mRNA的SW0123.351-1LPP～SW0123.351-23LPP溶液，并以PBS作为对照，对树突细胞(DC2.4细胞)进行转染，于给药后的24小时将细胞进行裂解并检测GFP蛋白的表达量，结果如表1所示，其中SW0123.351-1、SW0123.351-5、SW0123.351-6、SW0123.351-9、SW0123.351-10、SW0123.351-12、SW0123.351-13、SW0123.351-18、SW0123.351-19、SW0123.351-20、SW0123.351-21都显示了良好的体外转染效果，而SW0123.351-2、SW0123.351-3、SW0123.351-4基本无表达。说明了M5、DOPE、胆固醇、mPEG2000-DMG的比例关系影响表达效果，当脂质摩尔比例为M5:DOPE:胆固醇:mPEG2000-DMG＝35-50:15-30:24-44:1-1.5时，具有表达量增加的效果(所述表达量增加是指表达量大于GFP表达的平均值)。
下述实施例以SW0123.351-13LPP作为SW0123.351-LPP进行进一步研究。
表1.不同脂质比例对表达量的影响
实施例4 SW0123.351-LPP在不同储藏环境下体内表达量和体外理化性质的比较
本实施例采用如实施例3提供的制备方法，制备含荧光素酶mRNA(SEQ ID NO:1，0.1mg/ml)的SW0123.351-LPP溶液。
取适量的含荧光素酶mRNA的SW0123.351-LPP溶液，储藏于4℃环境，另取适量的含荧光素酶mRNA的SW0123.351-LPP溶液储藏于-20℃环境，并记为第0天。分别于储藏后的第4周，8周，12周即第28天，第56天，第84天进行取样，检测其体内的荧光素酶信号表达和体外理化性质。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)分为八组(PBS和LPP-D0组各3只，LPP-D28--20℃、LPP-D56--20℃、LPP-D84--20℃、LPP-D28-4℃、LPP-D56-4℃和LPP-D84-4℃组各4只)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药对照PBS，含10μg荧光素酶mRNA的第0天的SW0123.351-LPP溶液、储藏于-20℃环境下第28天，第56天，第84天的SW0123.351-LPP溶液和储藏于4℃环境下第28天，第56天，第84天的SW0123.351-LPP溶液。于给药后6小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠体内的表达情况。
粒径检测：取50ul的LPP样品(第0天的SW0123.351-LPP溶液2个重复、储藏于-20℃环境下第28天，第56天，第84天的SW0123.351-LPP溶液和储藏于4℃环境下第28天，第56天，第84天的SW0123.351-LPP溶液各6个重复)，并用纯化水950uL稀释，得到稀释后的LPP样品，将样品置于动态光散射激光粒径仪(Malvern，ZS-90)检测。
不同储藏环境下体内荧光素酶信号表达结果如图2A所示，SW0123.351-LPP分别在4℃环境和-20℃储藏12周后，体内荧光素酶表达均没有发生显著性变化，非常稳定。
不同储藏环境下体外理化性质即平均粒径(Z-Average)如图2B所示，SW0123.351-LPP在4℃环境和-20℃储藏12周后，脂质纳米颗粒的粒径大小都非常稳定，一直维持在150nm左右，没有显著变化，说明其稳定性。
上述实验结果说明本文提供的SW0123.351-LPP在冷藏4℃环境下和冷冻-20℃环境下的体内表达水平和体外理化性质都能维持长时间的稳定状态，说明此四脂质组合物在不同储藏环境下的高稳定性。
实施例5 SW0123.351-LPP在不同冻融次数处理后的体内表达量和体外理化性质的比较
本实施例采用如实施例3提供的制备方法，制备含荧光素酶mRNA(SEQ ID NO:1，0.1mg/ml)的SW0123.351-LPP溶液。
分别取适量的含荧光素酶mRNA的SW0123.351-LPP溶液，储藏于-20℃环境，分别经2次，4次，6次，8次，10次冻融处理，检测其体内的荧光素酶信号表达和体外理化性质，并将未经冻融处理的样品记为LPP-FT0，经2次，4次，6次，8次，10次冻融处理的LPP分别记为LPP-FT2，LPP-FT4，LPP-FT6，LPP-FT8，LPP-FT10。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)分为七组(PBS和LPP-FT0组各3只，LPP-FT2、LPP-FT4、LPP-FT6、LPP-FT8、LPP-FT10组各4只)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药对照PBS和储藏于-20℃环境下含10μg荧光素酶mRNA的分别经0次、2次，4次，6次，8次，10次冻融处理的SW0123.351-LPP溶液。于给药后6小时，小鼠腹腔 注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠体内的表达情况。
粒径检测：取50ul的LPP样品(LPP-FT02个重复、LPP-FT2、LPP-FT4、LPP-FT6、LPP-FT8、LPP-FT10各6个重复)，并用纯化水950uL稀释，得到稀释后的LPP样品，将样品置于动态光散射激光粒径仪(Malvern，ZS-90)检测。
SW0123.351-LPP溶液经不同冻融次数处理后的体内荧光素酶信号表达结果如图3A所示，SW0123.351-LPP在经2次、4次、6次、8次、10次冻融次数处理后的体内荧光素酶信号表达始终无显著性变化，保持稳定。
SW0123.351-LPP溶液经不同冻融次数处理后的体外理化性质即平均粒径(Z-Average)如图3B所示，SW0123.351-LPP在经2次、4次、6次、8次、10次冻融次数处理后，脂质纳米颗粒的粒径大小也无显著性变化，一直维持在150nm左右。
上述实验结果说明本文提供的SW0123.351-LPP在冻融多次后体内表达水平和体外理化性质都能维持稳定状态，说明此四脂质组合物重复冻融情况下的高稳定性。
实施例6 SW0123.351冻干前后在小鼠体内的免疫原性
本实施例采用如实施例3提供的制备方法，分别制备含COVID-19mRNA(SEQ ID NO:3)的SW0123.351-LPP，进行冷冻干燥，制得含COVID-19mRNA(0.1mg/ml)的SW0123.351-LPP冻干粉。
将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)分为三组(PBS组、新鲜制备的SW0123.351-LPP溶液组和复溶后的SW0123.351-LPP溶液组，各组5只小鼠)。取适量的含COVID-19mRNA的SW0123.351-LPP冻干粉用纯化水复溶。并通过肌内注射(小鼠后肢)于第1天和第14天对C57BL/6小鼠进行免疫，分别给药10μg的含COVID-19mRNA的复溶后的SW0123.351-LPP溶液和含COVID-19mRNA的新鲜制备的SW0123.351-LPP溶液，于二免后的第14天对小鼠进行眼眶取血，并检测血清中的S蛋白特异性结合抗体，以PBS作为对照。具体检测方法如下：
使用碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)稀释重组SARS-CoV-2刺突蛋白抗原(50ng，义翘神州)，包被至EIA/RIA板(康宁)4℃过夜；将板在PBST(0.05％Tween-20)中洗涤并用10％山羊血清(在PBS中)在37℃封闭2小时。使用2％山羊血清连续稀释样品血清，起始稀释滴度为50，后以2倍比稀释待检血清样品，在每块板中设置阴性血清对照。加入稀释的血清样品，每孔100μl，37℃(恒温箱)孵育2小时；弃去血清样品，使用排枪，每孔加入250μl PBST洗液，洗涤3次；每孔加入100μl稀释10000倍的山羊抗小鼠IgG HRP(abcam)，37℃(恒温箱)孵育1小时；弃去二抗，使用排枪，每孔加入300μl PBST洗液，洗涤5次；清洗后，每孔加入100μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(ebioscience)显色液避光显色5分钟；每孔加入100μl 2N H2SO4终止反应并检测；使用酶标仪(BioTek)在450nm波长处读取OD值。将终点滴度确定为最后一次稀释血清的倒数。样品OD450nm大于2.1倍阴性对照组OD450nm判定为阳性值。
免疫原性结果如图4所示，冻干前后SW0123.351-LPP的S蛋白特异性结合抗体相当，没有显著差异。说明此四脂质组合物在冻干后的免疫原性的稳定性。
实施例7 SW0123.351冻干粉稳定性研究
本实施例采用如实施例3提供的制备方法，分别制备含COVID-19mRNA(SEQ ID NO:3)的SW0123.351-LPP，进行冷冻干燥，制得含COVID-19mRNA(0.1mg/ml)的SW0123.351-LPP冻干粉。
取适量的SW0123.351-LPP冻干粉，储藏于25℃环境，并记为第0天。分别于储藏后的第1个月，第2个月和第3个月进行取样复溶，检测复溶后LPP溶液的粒径、包封效率和免疫原性。具体检测方法如下：
粒径检测：取50ul的SW0123.351冻干粉储藏于25℃环境第0天、第1个月、第2个月和第3个月的取样复溶后的溶液，并用纯化水950uL稀释，得到稀释后的LPP样品，将样品置于动态光散射激光粒径仪(Malvern，ZS-90)检测。
包封效率检测：用Quant-iTTM RiboGreenTM RNA试剂(Thermo Scientific)检测SW0123.351冻干粉储藏于25℃环境第0天、第1个月、第2个月和第3个月复溶后的LPP溶液中的mRNA含量。 首先用nuclease-free水和1XTE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.00)稀释LPP溶液，然后与等体积的2％Triton X-100混合并在室温下孵育1小时释放出被包封的mRNA。然后每个样品取100μL转移到96孔板中，向其中加入100μL的200倍稀释的RiboGreenTM RNA试剂。将板摇动并在室温下孵育10分钟。之后，通过Bio-Tek Synergy I读板器(BioTek)读取荧光值。标准样品以相同方式处理。通过线性回归绘制荧光和mRNA浓度的校准曲线，从中计算样品的mRNA浓度。LPP溶液的包封效率定义为测试样品中包封的mRNA占总mRNA量的百分比。
免疫原性检测：将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)分为四组(SW0123.351冻干粉储藏于25℃环境第0天、第1月、第2月和第3月组，各组5只小鼠)。通过肌内注射(小鼠后肢)于第1天和第14天对C57BL/6小鼠进行免疫，分别给药含10μg COVID-19 mRNA的储藏于25℃环境第0天、第1个月、第2个月和第3个月复溶后的SW0123.351-LPP溶液，于二免后的第14天对小鼠进行眼眶取血，并如实施例6所述检测血清中的S蛋白特异性结合抗体，以PBS作为对照。
冻干粉储藏于25℃环境第0天、第1个月、第2个月和第3个月的粒径检测结果和包封效率检测结果分别如图5A和图5B所示，SW0123.351-LPP冻干粉在25℃环境储藏3个月后，体外理化性质均没有发生显著性变化，非常稳定。进一步说明本文提供的SW0123.351LPP冻干粉储藏在25℃环境下，各方面性能都能维持稳定状态，说明此四脂质组合物冻干粉的体外理化性质的稳定性。
冻干粉储藏于25℃环境第0天、第1个月、第2个月和第3个月的免疫原性结果如图5C所示，SW0123.351-LPP冻干粉在25℃环境储藏3个月后，体内表达未发生显著性变化，可见其免疫原性的稳定性，进一步说明此四脂质组合物冻干粉的免疫原性的稳定性。
实施例8阳离子脂质为M5的不同处方制备的LNP与LPP制剂的比较
8.1.LNP-mRNA制剂与LPP-mRNA制剂的制备
8.1.1脂质纳米颗粒(LNP-mRNA)制剂的制备：
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将荧光素酶mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
脂质溶液的配制：根据表2所列的脂质种类将M5(或MC3):磷脂:胆固醇:PEG以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶解于乙醇溶液，配制成10mg/mL脂质溶液。
LNP的制备：使用微流控技术(迈安纳(上海)科技股份有限公司，型号：Inano D)，在以下条件下将脂质溶液和mRNA水溶液混合：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA水溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，获得LNP-mRNA溶液。
离心超滤：将LNP-mRNA溶液加入到超滤管中进行离心超滤浓缩(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，获得编号为M5-A、M5-B、M5-C、M5-D和MC3的LNP-mRNA制剂。
8.1.2脂质多聚复合物(LPP-mRNA)制剂的制备：
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将荧光素酶mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
脂质溶液的配制：根据表2所列的脂质种类将M5(或MC3):磷脂:胆固醇:PEG以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶解于乙醇溶液，配制成10mg/mL脂质溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.2mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米粒溶液：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米粒溶液与脂质溶液进行二次混合：体积＝4.0mL，流速比＝3(mRNA水溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温， 获得LPP-mRNA溶液。
离心超滤：将LPP-mRNA溶液通过超滤离心去除乙醇(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，获得编号为M5-A、M5-B、M5-C、M5-D和MC3的LPP-mRNA制剂。
8.2.不同磷脂和PEG组合后的理化性质
本实施例采用如实施例8.1.1和8.1.2制备的M5-A、M5-B、M5-C、M5-D和MC3的LNP制剂和LPP制剂来检测不同磷脂和PEG组合后的理化性质。具体检测方法如下：
粒径和zeta电位的检测：取50ul的LPP或LNP样品，并用纯化水950uL稀释，得到稀释后的LPP或LNP样品，将样品置于动态光散射激光粒径仪(Malvern，ZS-90)检测。
包封效率检测：如实施例7所述，用Quant-iTTM RiboGreenTM RNA试剂(Thermo Scientific)检测LPP溶液或LNP溶液的包封效率。
多分散指数(PDI)检测：使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)测定LPP或LNP溶液的多分散指数(PDI)。
实验结果如表2所示，制备得到的LPP纳米粒的粒径都比LNP纳米粒的粒径大，M5-B、M5-C、M5-D和M5-E的LPP制剂的包封效率高于LNP。多分散指数方面LNP更小，但LNP和LPP都小于0.3，指示都有较窄的粒度分布。Zeta电位方面两者相近。
表2.不同磷脂和PEG组合后的理化性质表
8.3.不同处方制备的制剂的体内表达量的比较
本实施例采用如实施例8.1.1和8.1.2制备的M5-A、M5-B、M5-C、M5-D和MC3的LNP制剂和LPP制剂来检测不同处方制备的制剂在小鼠体内荧光素酶信号表达的情况。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为10组(MC3-LNP、MC3-LPP、A-LNP、A-LPP、B-LNP、B-LPP、C-LNP、C-LPP、D-LNP和D-LPP组，各组3只小鼠)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的MC3-LNP、MC3-LPP、M5-A-LNP、M5-A-LPP、M5-B-LNP、M5-B-LPP、M5-C-LNP、M5-C-LPP、M5-D-LNP、M5-D-LPP溶液。于给药后的3小时、6小时和24小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA分别在小鼠注射部位和肝脏中的表达情况。
在0-24小时中，在小鼠注射部位的不同处方制备的制剂的总荧光素酶信号表达结果如图6所 示，所有脂质组合物的结果都显示，在相同处方下，LPP在小鼠体内的荧光表达信号高于LNP，说明在相同处方下，LPP的表达量高于LNP，并且LPP递送系统中脂质组合物B的表达量最高，说明当磷脂为DOPE，PEG种类为PEG-DMG时达到最优的表达。
在给药后3小时，在小鼠肝脏和注射部位的不同处方制备的制剂的荧光素酶信号表达结果如图7A和表3所示，每组的3个柱从左至右分别为注射部位的荧光素酶表达、肝脏中的荧光素酶表达和肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。观察到LPP制剂与LNP制剂在注射部位肌肉组织的表达相近，M5-A/B/C/D-LPP在注射部位的表达高于M5-A/B/C/D-LNP组，MC3-LPP也高于MC3-LNP组，同时在肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值中，LPP组的值均低于LNP组的值。说明在肌内注射后3小时，LPP在注射部位的表达量高于LNP，并且靶向性好，进入肝脏中表达的比例小，对肝脏影响小，肝毒性小。
在给药后6小时，在小鼠肝脏和注射部位的不同处方制备的制剂的荧光素酶信号表达结果如图7B和表4所示，每组的3个柱从左至右分别为注射部位的荧光素酶表达、肝脏中的荧光素酶表达和肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。观察到M5-A/B/C/D-LPP在注射部位的表达2-4倍高于M5-A/B/C/D-LNP组，MC3-LPP也明显高于MC3-LNP组，同时在肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值中，LPP组的值仍低于LNP组的值。说明在肌内注射后6小时，LPP制剂与LNP制剂在表达上的差异进一步增大，LPP制剂在注射部位的表达量明显高于LNP制剂，并且仍有优异的靶向性。其中，观察到在相同处方下，M5-B-LNP与M5-B-LPP的肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值都较低，主要在注射部位表达，在肝脏表达少，进一步说明当磷脂为DOPE，PEG种类为PEG-DMG时，制剂会有更好的体内分布，靶向性更强。
在给药6小时后，肝脏/注射部位荧光素酶表达的比值如图7C所示，LPP的肝脏/注射部位荧光素酶表达的比值显著高于LNP。进一步说明LPP制剂相较于LNP制剂，不仅在体内表达效率更高，并且靶向性好，对肝脏影响小，肝毒性小。
表3.肌内给药后3小时，各制剂在肌肉和肝脏的荧光素酶表达
表4.肌内给药后6小时，各制剂在肌肉和肝脏的荧光素酶表达
实施例9阳离子脂质为SM102、ALC0315、SW-II-115和SW-II-121的不同处方制备的LNP与LPP制剂的比较
本实施例采用如实施例2提供的制备方法，制备如表5所述的阳离子脂质分别为SM-102、ALC-0315、SW-II-115和SW-II-121的含荧光素酶mRNA(0.1mg/ml)的LPP和LNP制剂，以检测不同处方制备的LNP与LPP制剂在小鼠体内荧光素酶信号表达的情况。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为8组(ALC0315-LNP、ALC0315LPP、SM102-LNP、SM102-LPP、SW-II-115-LNP、SW-II-115-LPP、SW-II-121-LNP、SW-II-121-LPP组，各组3只小鼠)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的ALC0315-LNP、ALC0315LPP、SM102-LNP、SM102-LPP、SW-II-115-LNP、SW-II-115-LPP、SW-II-121-LNP、SW-II-121-LPP溶液。于给药后的3小时、6小时和24小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，评估荧光素酶mRNA在小鼠体内的表达情况。
在0-24小时中，各组的总荧光素酶信号表达结果如图8所示，所有脂质组合物结果都显示在相同处方下，LPP制剂在小鼠体内的荧光表达信号高于LNP，说明在相同处方下，虽然阳离子脂质不同，但LPP制剂的表达量都高于LNP制剂，有更好的表达效率。
表5.阳离子脂质为SM102、ALC0315、SW-II-115和SW-II-121的不同处方
实施例10阳离子脂质为M5、SM102、ALC0315、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2和SW-II-140-2的不同处方制备的LNP与LPP制剂的比较
本实施例采用如实施例8.1.1和8.1.2提供的制备方法，制备阳离子脂质分别为M5、SM-102、ALC-0315、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2、SW-II-140-2的含荧光素酶mRNA(0.1mg/ml)的LPP和LNP制剂，以检测不同处方制备的脂质组合物在小鼠体内荧光素酶信号表达的情况。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为18组(M5-LNP、M5-LPP、SM102-LNP、SM102-LPP、ALC0315-LNP、ALC0315LPP、SW-II-121-LNP、SW-II-121-LPP、SW-II-122-LNP、SW-II-122-LPP、SW-II-134-3-LNP、SW-II-134-3-LPP、SW-II-138-2-LNP、SW-II-138-2-LPP、SW-II-139-2-LNP、SW-II-139-2-LPP、SW-II-140-2-LNP、SW-II- 140-2-LPP组，各组3只小鼠)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的M5-LNP、M5-LPP、SM102-LNP、SM102-LPP、ALC0315-LNP、ALC0315LPP、SW-II-121-LNP、SW-II-121-LPP、SW-II-122-LNP、SW-II-122-LPP、SW-II-134-3-LNP、SW-II-134-3-LPP、SW-II-138-2-LNP、SW-II-138-2-LPP、SW-II-139-2-LNP、SW-II-139-2-LPP、SW-II-140-2-LNP、SW-II-140-2-LPP溶液。于给药后6小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠肝脏和注射部位(肌肉)的表达情况。
在注射后6小时，不同阳离子脂质处方制备的LNP与LPP制剂肝脏/肌肉的荧光素酶信号表达比值结果如图9和表6所示，每组的2个柱从左至右分别为LNP制剂的肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值和LPP制剂的肝脏/注射部位的荧光素酶表达比值。观察到在相同处方下，LPP制剂在小鼠体内的荧光表达信号高于LNP，再次说明在相同处方下，虽然阳离子脂质不同，但LPP制剂的表达量都高于LNP制剂，有更好的表达效率。
表6.不同阳离子脂质处方制备的LNP与LPP制剂肝脏/肌肉的荧光素酶表达比值
实施例11阳离子脂质为SW-II-121的不同处方制备的制剂的比较
11.1阳离子脂质为MC3、M5和SW-II-121的不同LNP制剂的比较
本实施例采用如实施例8.1.1提供的制备方法，制备如表7所述的阳离子脂质分别为M5、MC3和SW-II-121的含荧光素酶mRNA(0.1mg/ml)的LNP制剂，以检测不同阳离子脂质的LNP制剂在肌内给药后6h的体内表达情况。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为3组(M5-LNP、MC3-LNP和SW-II-121-LNP，各组3只小鼠)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的M5-LNP、MC3-LNP和SW-II-121-LNP溶液。于给药后6小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠肝脏和注射部位(肌肉)的表达情况。
结果如图10所示，每组的2个柱从左至右分别为注射部位的荧光素酶表达和肝脏的荧光素酶表达。观察到SW-II-121在肌内给药后6h的体内表达显著好于M5-LNP与MC3-LNP，说明更好的表达效率。所以将SW-II-121作为优选阳离子脂质，进一步研究脂质比例对脂质组合物的影响。
表7.阳离子脂质为M5、SM102、SW-II-121的不同处方
11.2脂质种类和脂质比例变化对体内表达的影响
本实施例采用如实施例8.1.2提供的制备方法，制备如表9所述的阳离子脂质为SW-II-121，其余脂质种类和脂质比例不同的含荧光素酶mRNA(0.1mg/ml)的LPP制剂，以检测脂质种类和脂质比例变化对体内表达的影响。具体检测方法如下：
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为12组(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11和A12组，各组3只小鼠)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药含10μg荧光素酶mRNA的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11和A12的LPP溶液。于给药后的24小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠肝脏和注射部位(肌肉)的表达情况。
在肌内注射0-24小时后，各制剂在小鼠注射部位(肌肉组织)的表达情况如图11A、11B和表9所示，当磷脂为DOPE，PEG为PEG-DMG时，小鼠注射部位的荧光表达最高，显著优于其余脂质种类的组合，并且当脂质比例为50％摩尔SW-II-121、10％摩尔DOPE、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG时，注射部位的表达效率最高。在肌内注射0-24小时后，各制剂在小鼠肝脏的表达情况如图11C、11D和表9所示。四组之间无明显差异，但从纵坐标的数量级可以看出各制剂在小鼠肝脏中的表达显著低于注射部位。
并且如图11E和表9所示，当磷脂为DOPE，PEG为PEG-DMG时，肌肉/肝脏的荧光素酶表达比值最高，靶向性最好，肝毒性最小。尤其是当脂质比例为50％摩尔SW-II-121、10％摩尔DOPE、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG时，肌肉/肝脏的荧光素酶表达比值最高，靶向性最好。进一步说明了优选磷脂为DOPE，优选的PEG为PEG-DMG，并且优选脂质组合物包含50摩尔％的阳离子脂质SW-II-121，10摩尔％的磷脂DOPE，38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的PEG-DMG。
表8.阳离子脂质为SW-II-121的不同处方
表9.阳离子脂质为SW-II-121的不同脂质组合物的肌肉/肝脏的荧光表达的比值
实施例12脂质纳米颗粒(LNP-mRNA)制剂和脂质多聚复合物(LPP-mRNA)制剂的制备
12.1实验材料
脂质DOPE、DSPC、PEG-DMG、PEG-DSPE购自Avanti Polar lipids(美国阿拉巴马州伯明翰)。胆固醇获得自上海A.V.T制药公司提供。
12.2 LNP-mRNA制剂的制备
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
脂质溶液的配制：将SM-102(或ALC-0315):磷脂:胆固醇:PEG以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶解于乙醇溶液，配制成10mg/mL脂质溶液。
LNP的制备：使用微流控技术(迈安纳(上海)科技股份有限公司，型号：Inano D)，在以下条件下将脂质溶液和mRNA水溶液混合：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA水溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，获得LNP-mRNA溶液。
离心超滤：将LNP-mRNA溶液加入到超滤管中进行离心超滤浓缩(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，获得编号为SM-102LNP和ALC0315-LNP的LNP-mRNA制剂。
12.3 LPP-mRNA制剂的制备
mRNA水溶液的配制：用50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3～4)将mRNA稀释为0.35mg/mL mRNA水溶液。
脂质溶液的配制：根据表10和表11中所列的处方中的脂质种类和摩尔比将脂质溶解于乙醇溶液，配制成10mg/mL脂质溶液。
硫酸鱼精蛋白溶液的配制：将硫酸鱼精蛋白溶解于无核酸酶水中配制成工作浓度为0.2mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液。
核纳米粒(core nanoparticle)溶液的制备：使用微流控技术，在以下条件将硫酸鱼精蛋白溶液与mRNA溶液混合获得由鱼精蛋白和mRNA形成的核纳米粒溶液：体积＝4.0mL；流速比＝3(mRNA):1(鱼精蛋白溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温。
LPP的制备：在以下条件下将核纳米粒溶液与脂质溶液进行二次混合：体积＝4.0mL，流速比＝3(mRNA水溶液):1(脂质溶液)，总流速＝12mL/min，前废＝0.35mL，后废＝0.1mL，室温，获得LPP-mRNA溶液。
离心超滤：将LPP-mRNA溶液通过超滤离心去除乙醇(离心力3400g，离心时间60min，温度4℃)，获得相应的LPP-mRNA制剂。
用动态光散射仪(Zetasizer Nano ZS90,Malvern)测量LPP的粒径，用冷冻电镜(Glacios,Thermo Fisher Scientific)检测LPP的形态。
表10.四种制剂的不同处方
表11.七种制剂的不同处方
实施例13优化的LPP制剂导致有效的APC摄取和DC成熟
为了最大限度地减少局部注射疫苗的全身暴露，本实施例采用如实施例12提供的制备方法，制备如图12(A)所述的包含不同脂质的含荧光素酶mRNA(编码序列如SEQ ID NO:1所示，0.1mg/ml)的LPP制剂用于肌内递送，其中包含磷脂(DOPE和DSPC)以及PEG脂质(PEG-DMG和PEG-DSPE)的不同组合。4种不同LPP制剂的具体脂质比例和组成参见表10。
如图12(B)所示，在4种肌内注射的LPP制剂中，LPP-B制剂在注射部位引起的荧光素酶信号最强，肝脏荧光素酶表达最少。因此，基于这一脂质组合进一步优化LPP制剂。
采用如实施例12提供的制备方法，制备如表11所示的脂质比例不同的7种包含荧光素酶mRNA(0.1mg/ml)的LPP制剂LPP/Luc，并对其进行表征。如图12(C)和表11所示，LPP-B2的粒径适中、生物分布良好(mRNA局部表达较高，肝脏表达有限)，因此基于LPP-B2处方进一步研究。如图12(D)的冷冻电镜(Cryo-TEM)图像显示，LPP-B2具有浓缩核和包封其的一层脂质壳，这表明LPP-B2纳米颗粒具有典型的核壳结构。
体外实验证实了LPP-B2处方转染肌肉细胞和免疫细胞的能力。体外实验的操作步骤如下所示。
采用如实施例12提供的制备方法，制备基于LPP-B2处方的包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)mRNA(编码序列如SEQ ID NO:2所示，0.1mg/ml)的LPP制剂。流式细胞术观察GFP的表达情况。简而言之，将A20(小鼠B细胞淋巴瘤细胞，购自ATCC)、DC2.4(小鼠骨髓来源树突状细胞，购自ATCC)、C2C12(小鼠成肌细胞，购自中国科学院细胞库)、HSkMC(人骨骼肌细胞，购自ATCC)和Jurkat T细胞(人T淋巴细胞白血病细胞，购自中国科学院细胞库)分别以1×105/孔的密度接种于6孔板的完全培养基中。细胞与LPP/eGFP孵育24小时(转染量2.5μg/孔)，流式细胞仪(BD FACSCanto II,Becton Dickinson)测定GFP阳性细胞的百分比。
结果如图12(F)和图13所示，LPP-B2/eGFP处理后，近90％的C2C12、HSkMC和Jurkat T细胞合成了GFP蛋白，60％的A20细胞和30％的DC2.4细胞呈现GFP阳性，这表明LPP-B2处方能够有效诱导肌肉细胞和免疫细胞中蛋白的表达。
为了测试LPP-B2的肌肉靶向递送，本实施例还比较了LPP-B2和LNP(SM-102LNP和ALC0315-LNP)递送的荧光素酶在体内的表达量。具体操作方法如下。
体内荧光素酶信号表达检测：将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)分为3组(SM-102LNP、ALC0315-LNP和LPP-B2组各3只)，通过肌内注射(小鼠后肢)分别给药包含10μg荧光素酶mRNA的LPP-B2、SM-102LNP和ALC0315-LNP制剂。于给药后24小时，小鼠腹腔注射30mg的D-荧光素底物(D-荧光素底物购自茂康生物技术公司)，于底物注射后15分钟，在Xenogen IVIS-200成像系统中测量生物发光情况，以评估荧光素酶mRNA在小鼠体内的表达情况。
结果如图12(E)所示，肌内注射6小时后，LPP-B2主要在注射部位表达，而肝脏部位几乎不表达。如图14(A)所示，肌内注射24小时后，与商业LNP相比，LPP-B2在注射部位引起的荧光素酶信号高4-6倍，而在肝脏中的荧光素酶表达低4-5倍。如图14(B)所示，进一步离体解剖证实LPP-B2主要在局部注射部位表达蛋白，主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结)未见明显荧光素酶信号。这些结果表明，与商业LNP相比，肌内靶向的LPP-B2递送系统可能引起更少的全身不良事件。
本实施例进一步研究了基于LPP-B2处方的包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)mRNA(0.1mg/ml)的LPP制剂在淋巴结中的不同类型免疫细胞中的表达情况。检测方法如下。
为了检测淋巴结中不同类型细胞的mRNA表达情况，在检测前24小时，向C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，n＝5)肌内注射对照PBS或者基于LPP-B2处方的包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)mRNA(0.1mg/ml)的LPP制剂，剂量为30μg/小鼠。流式细胞仪(BD FACSCanto II,Becton Dickinson)检测不同细胞类型的GFP阳性细胞。T细胞、B细胞、DC细胞(树突状细胞)、巨噬细胞、粒细胞和单核细胞分别定义为CD45+CD3+CD19-、CD45+CD3-CD19+、CD45+CD3-CD19-CD11c+、CD45+CD11b+F4/80+、CD45+CD11b+Ly6G+和CD45+CD11b+Ly6C+Ly6G-(CD45、CD3、CD19、CD11c、CD11b、F4/80、Ly6C检测抗体均购自Biolegend，Ly6G检测抗体购自BD Biosciences)，识别细胞群的门控策略如图15所示。
结果如图12(G)所示，DC和巨噬细胞的eGFP表达率分别约为7％和8％。相比之下，T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞未表现出阳性信号。这些结果表明抗原呈递细胞在LPP摄取和mRNA翻译方面更有效。
更进一步地，检测了注射基于LPP-B2处方的LPP制剂后，DC细胞的成熟标志物。检测方法如下。
向C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，n＝5)肌内注射PBS、空白运载体LPP(指不包含mRNA的LPP)或基于LPP-B2处方的包含荧光素酶mRNA的LPP制剂LPP/Luc，剂量为10μg mRNA/小鼠。注射24h后，收集淋巴结，在70μm细胞滤器中机械破坏。离心(2000rpm,5min)沉淀细胞，用FACS缓冲液调节浓度至1×106个细胞/管。将得到的细胞用Fixable Viability Stain(BD)处理，室温孵育10分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，并且用CD11c、CD40、CD80、CD86和I-A/I-E特异性抗体(均购自Biolegend)在4℃下染色30分钟。细胞清洗两次，然后用BD FACSCanto II,Becton Dickinson)进行流式细胞术分析。识别细胞群的门控策略如图16所示。
结果如图12(H)所示，与PBS处理组相比，注射LPP/Luc后24小时，小鼠体内DC细胞成熟标志物(CD40、CD80、CD86和MHC-II)的水平显著上调，进一步证明了LPP的辅助作用，能导致有效的DC成熟。
实施例14优化的抗原设计提高刺突蛋白在体外的翻译
提高所呈递的有效表位的浓度和效力是疫苗产品抗原设计的首要目标。目前获得许可的SARS-CoV-2mRNA疫苗的抗原是在2020年初设计的。随着疫情的发展和对刺突蛋白结构的了解，需要对新一代SARS-CoV-2mRNA疫苗的抗原设计进行改进。
在本实施例中，设计并制备了编码引入3个突变的SARS-CoV-2全长刺突蛋白的mRNA，序列结构如图17(A)所示。其中2P突变(986-987aa)和furin突变(682-685aa)稳定了锁定在预融合构象中的全长刺突蛋白，阻止了S1/S2亚基的裂解，从而维持了S蛋白的完整性和构象。这些设计已被证明可以提高S蛋白的免疫原性(W.B.Alsoussi,et al.,SARS-CoV-2 Omicron boosting induces de novo B cell response in humans.Nature,1–3(2023)和J.Pallesen,et al.,Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen.Proceedings of the National Academy of Sciences.114,E7348–E7357(2017))。由于所有受关注的变体都含有D614G突变(B.Korber,et al.,Tracking changes in SARS-CoV-2 Spike:evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus.Cell.182,812–827(2020))，在抗原设计中也引入了D614G取代。这种设计进一步限制了过早转化为融合后构象，并使变体具有潜在的更广泛的中和能力(P.-A.Koenig,et al.,Spike D614G—A Candidate Vaccine Antigen Against Covid-19.New England Journal of Medicine.384,2349–2351(2021))。此外，G614的取代在“上”位置支持RBD结构域，增加了有效表位的呈递，从而增强了免疫原性。编码刺突蛋白(S蛋白)的mRNA的表达是通过体外细胞转染来表征的。mRNA合成、体外转染和表达检测方法如下。
mRNA合成：如上所述，设计的候选mRNA疫苗的抗原是基于野生型毒株(GenBank登录号:MN908947.3)的刺突蛋白，并且含有D614G突变，脯氨酸取代(KV986-987PP)和furin切割位点消除(RRAR682-685QSAQ)等稳定修饰。mRNA合成是基于最广泛使用的用于体外转录的T7 RNA聚合酶和共转录加帽技术。首先，将经密码子优化的编码修饰刺突蛋白的核苷酸序列克隆至pUC质粒，并且侧接T7启动子序列、源自人acot7基因的5′-UTR、源自小鼠α-珠蛋白基因的3′-UTR和75nt的poly(A)尾等非编码元件。mRNA用T7 RNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)在Reagent AG(Trilink)进行共转录加帽反应，进行体外转录RNA。体外转录中使用1-甲基-假尿苷-三磷酸代替三磷酸尿苷(UTP)，1-甲基-假尿嘧啶的修饰比例为100％。RNA经DNase I处理后，经色谱纯化，过滤后溶解于1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)中。琼脂糖凝胶电泳和离子对反向液相色谱(IPRP-HPLC)检测RNA纯度，均相时间分辨荧光(HTRF)技术检测双链RNA。然后分装mRNA，在≤-60℃保存至使用。参照上述方法制备编码天然刺突蛋白的mRNA。编码天然刺突蛋白的核酸序列和编码修饰的刺突蛋白的核酸序列如表12所示。
表12.编码天然刺突蛋白的核酸序列和编码修饰的刺突蛋白的核酸序列
体外转染：为了评估S蛋白的体外表达，将HEK293细胞(购自中科院上海细胞库)和DC2.4细胞(购自中科院上海细胞库)以1.2×106或8×105细胞/孔的速度接种于6孔板中。18小时后，使用Lipofectamine MassengerMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific)，按照制造商的说明，用2μg编码天然刺突蛋白的mRNA或上述设计的编码修饰的刺突蛋白mRNA瞬时转染细胞。转染24小时后，收集细胞进行western blot或者流式细胞术分析。
Western blot：将转染mRNA的细胞裂解，在加或不加PNGase F(NEB)的情况下，在37℃下处理2小时，然后与SDS上样缓冲液混合变性，随后进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶电泳并与抗体孵育。用多克隆兔抗-SARS-CoV-2RBD蛋白抗体(1:2000，sinobologic)和二抗兔抗辣根过氧化物酶(HRP)-缀合抗体(Beyotime)检测S蛋白。用单克隆小鼠抗Actin HRP-缀合抗体(Cell signaling technology)检测β-actin。印迹采用高信号ECL Western Blotting Substrate(Tanon)进行显色，并用ECL Imager(Azure)和Image Lab 6.0版软件成像。
流式细胞术：通过直接移液(HEK293细胞)或10mM EDTA处理(DC2.4细胞)收集转染mRNA的细胞，并在细胞染色缓冲液(biolegend)中重悬。采用Fixed Viability Stain(BD)对细胞进行染色，评估细胞的生存能力，并用FcR阻断试剂(Miltenyi)封闭。用hACE2-Fc(GenScript)染色缓冲液在4℃下染色细胞30min，检测细胞表面刺突表达。随后，用细胞染色缓冲液冲洗细胞2次，然后用在4℃细胞染色缓冲液中的PE抗人IgG Fc(Biolegend)孵育30min。在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上使用BD FACSDiva软件版本8.0.1进行样本采集。
Western blot结果如图17(B)所示，编码天然刺突蛋白的mRNA转染的细胞显示两条主要条带(S和S1)(图2B，泳道1和2)，表明大多数刺突蛋白已被切割成S1和S2亚基。但是上述设计的mRNA所表达的修饰的刺突蛋白尽管也存在部分切割，但是主要作为一个完整的蛋白存在(图2B，泳道3和4)。同时，可以发现相较于编码天然刺突蛋白的mRNA，上述设计的mRNA表达更高水平的修饰的刺突蛋白(图2B，泳道1和3)。
流式细胞术结果如图18所示，修饰的刺突蛋白与hACE2-Fc的结合能力明显高于天然刺突蛋白。
以上所有数据表明设计的mRNA在细胞内翻译效率高，并在细胞表面表达。
实施例15 LPP/mRNA疫苗诱导小鼠体内的强体液免疫应答和细胞免疫应答
本实施例采用如实施例12提供的制备方法，制备基于LPP-B2处方的包含上述编码修饰的刺突蛋白mRNA(0.1mg/ml)的LPP制剂LPP/mRNA疫苗。为了研究疫苗的免疫原性，如图17(C)所示，在第0天和第14天分别将对照PBS，包含1μg、5μg或10μg mRNA的LPP/mRNA通过双侧肌内注射免疫两批6-8周的C57/BL6小鼠(Charles River Laboratories，其中第一批受试者n＝8，第二批受试者n＝5)，并且在第21天收集第一批受试者的脾脏，在第28天收集第二批受试者的血液检测分析体液免疫应答和细胞免疫应答水平。具体检测方法如下。
酶联免疫吸附测定(ELISA)检测RBD特异性结合抗体：用在0.05M碳酸钠缓冲液中的重组RBD蛋白(Genscript,330-530aa)包被高结合Elisa板(Greiner)，4℃过夜。用PBS-T(0.05％Tween-20，pH 7.4)洗涤，用在PBS-T中的1％BSA封闭。每孔加入连续两倍稀释的待测的热灭活血清。三次洗涤后，用合适的HRP缀合二抗(Abcam)孵育，并用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(ebioscience)底物孵育。使用读板仪(BioTek)在450/610nm读取吸光度。终点滴度被确定为血清最后稀释度的倒数值，以产生大于0.21临界值的吸光度。
假病毒中和测定：进一步通过SARS-CoV-2假病毒中和测定(pVNT)检测了病毒进入的抑制情况。根据南京Vazyme生物技术公司的方案测定免疫小鼠血清中和抗体滴度。简而言之，将SARS-CoV-2假病毒与连续稀释的阳性对照或血清在Opti-MEM中37℃预孵育1小时，然后添加至96孔板的非洲绿猴肾细胞(Vero，购于中科院上海细胞库)中。孵育24小时后，细胞裂解，使用BriteliteTM plus发光报告基因测定试剂盒(PerkinElmer)，按照制造商的方案检测荧光素酶信号。使用读板仪(BioTek)测量发光强度。中和效价(NT50)定义为与病毒对照孔相比，荧光素酶活性抑制50％所需的血清稀释倒数。
酶联免疫斑点检测(ELISpot)：根据制造商的说明，用IFNγELISpotPLUS试剂盒(Mabtech)检测 小鼠脾细胞中的刺突蛋白或RBD特异性T细胞应答。简而言之，用刺突蛋白RBD(Genscript)体外刺激3×105个脾细胞，或用植物血凝素(PHA)和离子霉素刺激作为阳性对照，或用RPMI 1640培养基作为阴性对照。在37℃，5％CO2孵育20h后，依次用生物素化的IFNγ-检测抗体、链霉亲和素碱性磷酸酶(ALP)处理板，并添加5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑兰-plus(BCIP/NBT-plus)底物显色。当斑点强烈到足以肉眼观察到时，用去离子水终止显色。使用ELISpot读板仪(ImmunoSpot S6Core Analyzer(CTL))对IFNγ斑点形成细胞进行计数。
细胞内细胞因子染色：手动研磨小鼠全脾制备脾细胞单细胞悬液，然后70μm和40μm过滤。将过滤后的脾细胞重悬在R10培养基中(RPMI 1640中添加青霉素-链霉素抗生素，10％热灭活胎牛血清)，在37℃下孵育12小时，并用刺突蛋白肽池(Genscript)刺激。采用终浓度为每种肽2μg/ml的肽池。以佛波酯(PMA)(500ng/ml,Dakewe)和离子霉素(Iononomycin)(10μg/ml,Dakewe)作为阳性对照刺激细胞。刺激后，用PBS洗涤细胞，然后在室温下用活细胞/死细胞染料(Fixable Viability Stain,BD,1:1000)染色5分钟。然后将细胞在PBS中洗涤，并在含有以下抗体的表面染色混合物中重悬：在染色缓冲液中的CD3-APC/Cyanine 7(Biolgend，1:50)，CD4PerCP/Cyanine 5.5(Biolgend，1:50)，CD8a APC(Biolgend，1:50)，FcR阻断试剂(Miltenyi，1:50)。孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞，然后用固定缓冲液(BD)固定20分钟，细胞在perm/wash溶液(BD)中洗涤，并用以下抗体的混合物进行细胞内染色(4℃，30分钟)：在1×perm/wash缓冲液(BD，用无菌水稀释)中的IFN-γBV421(Biolgend，1:50)，TNF-αPE/Cyanine7(Biolgend，1:100)，IL-4PE(Biolgend,1:100)。最后，用perm/wash溶液洗涤细胞，再用PBS重悬。在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上使用BD FACSDiva软件版本8.0.1进行样本采集。
结合抗体检测结果如图17(D)所示，在第28天，肌内注射含1μg、5μg和10μg mRNA的LPP/mRNA制剂的小鼠体内的RBD结合血清IgG的几何平均滴度(GMT)分别为39481、51200和72408。这表明在二免后，LPP/mRNA在小鼠体内诱导了高水平的RBD特异性结合抗体。
假病毒中和测定结果如图17(E)所示，LPP/mRNA在小鼠体内诱导了强效的假病毒中和活性，初免后第28天的中和抗体几何平均滴度(GMT)分别为34771(1μg)、53538(5μg)和55882(10μg)(图2E)。体液免疫应答结果无剂量依赖性，这表明接受1μg剂量的小鼠的体内抗体产生就能达到最高。
通过细胞内细胞因子染色和ELISpot检测，发现在第21天，在脾脏中检测到高比例的IFN-γ(Th1细胞因子)和有限的IL-4(Th2细胞因子)分泌(如图17(F)和图19所示)。进一步地，在初免后第21天通过细胞内细胞因子染色检测了疫苗诱导的T细胞的细胞因子模式。结果如图17(G和H)所示，用刺突蛋白肽池再刺激后LPP/mRNA诱导的CD4+T细胞表现出Th1主导的应答，特别是在较高的免疫原剂量下。此外，如图17(I和J)所示，观察到对刺突蛋白肽池刺激的强烈CD8+T细胞应答。
更进一步地，申请人还通过IgG2c heavy chain(HRP)抗体(ab97255，abcam)和Goat Anti-mouse IgG1,Human ads-HRP抗体(1070-05，SouthernBiotech)，按照制造商说明，通过ELISA检测血清IgG1和IgG2c抗体滴度(具体检测方法参见上述ELISA检测方法)。结果如图17(K)所示，较高的IgG2c/IgG1比值表明LPP/mRNA疫苗具有Th1型体液免疫应答。
综上，这些数据表明LPP/mRNA能诱导优越的体液免疫应答和Th1-主导的细胞免疫应答。
实施例16 LPP/mRNA疫苗在老年小鼠中的保护效力
小鼠适应的SARS-CoV-2毒株通过体内传代产生，在老年小鼠中导致100％致死率，这种毒株已被用于评估候选疫苗的保护效果(S.Sun,et al.,Characterization and structural basis of a lethal mouse-adapted SARS-CoV-2.Nature Communications.12,5654(2021)和F.Yan,et al.,Characterization of two heterogeneous lethal mouse-adapted SARS-CoV-2 variants recapitulating representative aspects of human COVID-19.Frontiers in Immunology.13(2022))。
在本实施例中，如图17(L)所示，在第0天和第14天时分别将对照PBS，包含1μg或10μg mRNA的LPP/mRNA疫苗通过肌内注射免疫8-9月龄的BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，n＝8)。注射加强疫苗10天后(第24天)，所有小鼠通过鼻内途径注射小鼠适应的SARS-CoV-2毒株C57MA14(50X LD50)进行攻毒(在中国农业科学院长春兽医研究所进行攻毒实验)。每日观察攻毒后的小鼠的情况，并记录14天体重。
结果如图17(M和N所示)，所有接种LPP/mRNA疫苗的小鼠均在致死剂量攻击后存活，仅表现出短暂和轻微的体重减轻，随后完全恢复，没有任何疾病加重的证据。相比之下，对照组体重迅速下降，并在挑战后6天内死亡。这些结果表明LPP/mRNA对C57MA14致命感染具有充分的保护作用。
实施例17 LPP/mRNA疫苗引起恒河猴体内的强免疫原性
为了评估LPP/mRNA在恒河猴体内的免疫原性，如图20(A)所示，将6岁雄性恒河猴随机分为LPP/mRNA组和生理盐水对照组(每组n＝6)。在第0天和第21天分别以体积为500μL的包含100μg mRNA的LPP/mRNA或生理盐水通过双侧肌内注射免疫雄性恒河猴(在四川横竖生物科技股份有限公司对恒河猴进行免疫)。并且在第0、14、21、28、35天取血进行检测分析。具体的RBD特异性结合抗体检测方法和假病毒中和测定方法参见实施例15。
结合抗体检测结果如图20(B)所示，早在初免后第14天就可以通过ELISA检测到RBD结合的IgG，在二免后第7天(第28天)，恒河猴体内的结合抗体水平进一步升高，峰值GMT为182,456。假病毒中和测定结果如图20(C)所示，单次注射LPP/mRNA可在所有疫苗接种的动物中引起高水平的中和抗体，初免后第14天，其50％抑制稀释度倒数(ID50)几何平均滴度(GMT)为234，二免后第7天急剧增加至8396。
本实施例还检测了对其它毒株的假病毒(均购于南京诺维赞生物科技股份有限公司)的中和作用，如图20(D)所示(从左至右依次为第28天和第35天数据)，与野生型毒株相比，对Delta毒株中和作用仅略有下降(1.75倍)。相反，对Omicron(BA.1)毒株假病毒的中和显著降低(16.5倍)。
此外，利用活病毒细胞病变效应(CPE)试验，评估了对野生型毒株的中和活性。并且为了测试中和反应的广度，还使用CPE法进一步测试了血清对多种变体(Alpha/Beta/Delta/Omicron)的中和活性。检测方法如下所示。
除了野生型菌株外，还评估了4个受关注的新变异体。野生型毒株(GD108)和beta变异毒株(B.1.351,GDPCC-nCOV84,CSTR.16698.06.NPRC 2.062100001)，alpha变异毒株(B.1.1.7,SARS-CoV-2/C-Tan-BJ202101,CSTR.16698.06.NPRC 2.062100002)，delta变异毒株(B.1.617.2,CQ79,CSTR.16698.06.NPRC 6.CCPM-B-V-049-2105-8)和omicron变异毒株(B.1.1.529CCPM-B-V-049-2112-18)保存于中国医学科学院医学实验动物研究所。采用Vero E6细胞进行扩增和滴度测定。简而言之，将T225培养瓶中的Vero-E6细胞单层接种病毒。接种72小时后观察病毒诱导的CPE，收集上清，并于-80℃保存。次日4℃缓慢解冻后，将病毒上清离心，超滤浓缩，用200ml PBS洗脱。最后得到的病毒用半数组织培养感染剂量(TCID50)法滴度测定。在攻毒前第4天采集恒河猴血清，评估其对SARS-CoV-2感染的中和作用。简而言之，将Vero E6细胞(5×104)接种于96孔组织培养板中，培养过夜。将100TCID50SARS-CoV-2病毒与等体积的免疫后的恒河猴的连续稀释的血清预孵育，37℃孵育1h。将混合物加入Vero E6细胞单层。感染后第3天在显微镜下记录病毒诱导的CPE，用Reed-Meunch法计算50％的孔中完全阻止CPE的血清稀释度的倒数值来确定中和效价。
攻毒前第二次剂量后三周(第44天)收集的血清。结果如图20(E)所示，对于野生型毒株，持续到 这个时间点，所有疫苗接种动物的血清样本都仍显示出优异的NAb滴度，NAb的几何平均滴度接近2299，而对照组中没有检测到病毒特异性中和抗体。与野生型毒株相比，LPP/mRNA疫苗接种也导致了对Alpha/Beta/Delta/Omicron变异毒株的优异的中和活性，尽管中和活性分别下降了3.7倍，19.8倍，8.2倍和64.6倍。
为了评估SARS-CoV-2-特异性T细胞应答，分别从免疫前(D0)、第一次免疫后14天(D14)和第二次免疫后14天(D35)采集的血液样本中分离外周血单个核细胞(PBMC)，在体外用S蛋白或RBD蛋白再刺激后，用ELISpot检测产生干扰素γ(IFN-γ)的刺突蛋白或RBD特异性T细胞。ELISpot检测方法参见实施例15，其检测结果如图20(F)所示，LPP/mRNA诱导了强烈的IFN-γ应答，特别是在第二次给药后。
记忆B细胞(MBC)的诱导是实现持久保护性体液免疫应答的关键(W.B.Alsoussi,et al.,SARS-CoV-2Omicron boosting induces de novo B cell response in humans.Nature,1–3(2023).)。采用多参数流式细胞术对接种LPP/mRNA的恒河猴在指定时间点免疫前后的PBMC内的SARS-CoV-2特异性记忆B细胞应答进行了评估。检测方法如下。
通过将荧光标记的链霉亲和素连续添加至PBS中的生物素化的刺突蛋白，生成检测冻存的恒河猴PBMC中SARS-CoV-2特异性记忆B细胞的探针。用藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)标记链霉亲和素。冻存的恒河猴PBMC在处理前解冻并恢复至少4小时。细胞用Fixable Viability Stain(BD)染色，用FcR阻断试剂(Miltenyi)封闭，然后在4℃下用以下标记的单克隆抗体染色30分钟：CD3 APC-Cy7(BD)，CD8 APC-Cy7(BD)，CD14 APC-Cy7(Biolegend)，IgM PerCP-Cy5.5(BD)，CD20 PE-Cy7(Biolegend)，IgG FITC(BD)，CD16 BV421(Biolegend)。洗涤细胞，在FACSCanto II流式细胞仪(BD)上使用BD FACSDiva软件版本8.0.1采集。
检测结果如图20(G)所示，在第二次给药后14天，PBMC中鉴定出的SARS-CoV-2特异性记忆B细胞显著增加。
以上数据表明LPP/mRNA在非人灵长类动物模型中也具有高免疫原性，具有广泛的交叉中和活性以及对长期免疫保护至关重要的T细胞和B细胞应答。
实施例18 LPP/mRNA疫苗保护恒河猴免受SARS-CoV-2感染
在本实施例中进一步评估了LPP/mRNA疫苗对恒河猴的保护效力。如图20(A)所示，通过肌内注射两剂包含100μg mRNA的LPP/mRNA或生理盐水免疫恒河猴，接种后48天，通过鼻内和气管内联合途径(通过鼻滴和气管注射给药)接种1×106TCID50mL-1SARS-CoV-2(GD108)原型毒株(体积分别为0.5mL)进行攻毒(在国家昆明高等级生物安全灵长类动物实验中心进行攻毒实验)。实验期间定期进行体检，并记录攻毒前后动物的体温和体重，记录时间点参见图20(A)。在不同指定的时间点检测攻毒前后鼻/口咽/肛门拭子的病毒载量和肺叶的病毒载量。并且，在攻毒7天后，对恒河猴进行麻醉和尸检，采集左肺或右肺上、中、下肺叶组织进行病毒载量测定和病理分析。病毒载量检测方法和病理分析如下所示。
RT-qPCR检测SARS-CoV-2病毒RNA：采用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测病毒基因组RNA(gRNA)。所使用的引物和探针序列设计为靶向N基因(正向引物如SEQ ID NO:20所示，5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'；反向引物如SEQ ID NO:21所示，5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'；探针序列如SEQ ID NO:22所示，5′-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′)，序列参考世界卫生组织和中国疾控中心推荐的序列。
组织病理学：将采集的肺组织经福尔马林固定，切片，苏木精和伊红染色，观察组织学变化。两名病理学家在显微镜下双盲评估肺组织病理变化，然后综合评估整个肺叶的组织病理图像进行评 分。通过病理图和综合评分来评价疫苗的保护效果。每个脑叶都有一个单独的分数，每只恒河猴的最终分数被报告为单独分数的平均值。
病毒载量检测结果如图21(A-C)所示，在攻毒后1天，所有动物的拭子样本中都观察到病毒gRNA的峰值载量，这表明攻毒成功。在感染病毒后的整个评估期间，所有注射安慰剂(生理盐水)的恒河猴的鼻/口咽/肛门拭子都表现并维持了过量的病毒基因组RNA拷贝。相比之下，疫苗组拭子的病毒载量在攻毒后3天显著降低，并且在采样的其余时间点(攻毒后5天和攻毒后7天)仍低于对照组。特别是，在攻毒后，疫苗组的几只恒河猴的口咽拭子中未检测到病毒gRNA(攻毒后第3天的6只中有2只，攻毒后第5天的6只中有3只，攻毒后第7天的6只中有2只)。在肛门拭子中，疫苗组的6只动物中仅有1只在第3天检测到病毒感染。同样地，如图21(D)所示(从左至右依次为生理盐水组和LPP-mRNA组数据)，在攻毒后7天，生理盐水组的所有6只动物的肺组织中至少有4个肺叶中观察到高水平的病毒载量。然而，在疫苗组的6只动物的肺组织的大多数肺叶中未检测到病毒或病毒载量显著降低。
固定肺组织病理分析结果如图21(E)所示，生理盐水组的病理组织中可见明显的间质性肺炎，肺隔膜增厚出血，炎性细胞浸润，尘细胞分布伴色素沉着。相比之下，所有接受疫苗接种的恒河猴的肺组织病理接近正常，在极少数肺叶有局灶性和轻度的组织病理学改变，没有观察到免疫增强的炎症。因此，疫苗组动物肺部的综合组织病理学评分明显低于生理盐水组。此外，如图22所示，攻毒后1-7天，疫苗组和生理盐水组的恒河猴的体重和体温构没有显著波动。
综上所述，这些数据表明LPP/mRNA对SARS-CoV-2在肺部的复制具有显著的预防作用，并有效地保护恒河猴免受感染和肺部病变。
实施例19第三剂LPP/mRNA加强疫苗对Omicron变异毒株产生优异的免疫应答
为了研究同源加强免疫引发的免疫原性，如图23(A)所示，分别通过肌内注射以包含1μg、10μg mRNA的LPP/mRNA或者对照PBS免疫C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，n＝8)，免疫间隔为两周(在第0天和第14天进行免疫)，初免后70天给予加强注射。在第84天，安乐死小鼠，并取血、脾脏和肺脏进行检测分析。RBD特异性结合抗体检测方法和假病毒中和测定的方法参见实施例15。
RBD特异性结合抗体检测结果如图23(B)所示(从左至右依次为1μg LPP/mRNA组和10μg LPP/mRNA组数据)，与1μg LPP/mRNA相比，在初免后第84天，10μg LPP/mRNA在小鼠体内诱导了更高水平的RBD特异性结合抗体，1μg LPP/mRNA免疫组和10μg LPP/mRNA免疫组小鼠的结合抗体GMT分别达到7747515和315845。与第28天GMT为46951(1μg mRNA/LPP)和315845(10μg mRNA/LPP)的结合抗体水平相比，加强免疫进一步提高了IgG滴度。
针对野生型SARS-CoV-2毒株的假病毒中和测定结果如图23(C)所示(从左至右依次为1μg LPP/mRNA组和10μg LPP/mRNA组数据)，10μg LPP/mRNA免疫组小鼠在第28天和第84天的中和抗体GMT分别为44494和85808，而1μg LPP/mRNA免疫组小鼠在第28天和第84天的中和抗体GMT分别为19193和41359。这些数据进一步显示，加强注射增加了中和抗体水平。
通过ELISpot法(具体方法参见实施例15)检测细胞免疫应答，结果如图23(D)所示(从左至右依次为PBS组、1μg LPP/mRNA组和10μg LPP/mRNA组数据)，LPP/mRNA疫苗在脾脏或肺脏中均引起强烈的分泌IFN-γ的T细胞应答。
由于2针免疫对BA.1的中和能力较低(如图20D)所示，在本实施例中进一步评估3针同源免疫是否会增加变异毒株的中和活性。选择免疫后28天和84天的血清样本来评估交叉中和活性。具体检测方法参见实施例15和17。
假病毒中和测定结果如图23(E-G)所示(从左至右依次为1μg LPP/mRNA组和10μg LPP/mRNA组数据)，在第84天，10μg LPP/mRNA在小鼠血清中诱导对Delta、BA.1和BA.4/5毒株较强的中和抗体效价，GMT分别达到38528、4138、1871。
接下来，进一步比较了同源和异源免疫作为第三剂的疫苗接种策略。
如图23(H)所示，通过肌内注射以50U/小鼠的灭活疫苗(由中国医学科学院医学生物学研究所馈赠(商品名称：科维福，通用名称：新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞))免疫C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，n＝5或8)，免疫间隔为两周(在第0天和第14天进行免疫)，初免后70天，第三次注射相同的灭活疫苗或者1μg、5μg LPP/mRNA作为加强剂。并且在免疫后第84天(第三次免疫后14天)采集血清样品，检测结合抗体和中和抗体应答(具体结合抗体和中和抗体检测方法参见实施例15)。
结合抗体检测结果如图23(I)所示(从左至右依次为同源灭活疫苗加强免疫组、异源1μg LPP/mRNA加强免疫组和异源5μg LPP/mRNA加强免疫组数据)，第三针以同源灭活疫苗作为加强剂的小鼠在第28天和第84天，其体内的IgG抗体水平没有明显提高，GMT分别为19401和38802，而与用同源灭活疫苗加强免疫相比，而LPP/mRNA(5μg)异源免疫在第28天和第84天诱导的结合抗体GMT分别达到13958和157922。这表明以LPP/mRNA疫苗进行异源加强免疫能显著增加结合抗体水平。
针对野生型毒株的中和抗体检测结果如图23(J)所示(从左至右依次为同源灭活疫苗加强免疫组、异源1μg LPP/mRNA加强免疫组和异源5μg LPP/mRNA加强免疫组数据)，接受以灭活疫苗作为加强剂的小鼠的中和抗体滴度没有明显增加，在第28天和第84天的中和抗体GMT分别达到2833和6859，而LPP/mRNA/LPP免疫显著提高了中和抗体水平，LPP/mRNA(5μg)异源免疫在第28天和第84天诱导的中和抗体GMT分别达到2559和28672。
此外，还通过ELISpot检测异源或同源加强对细胞免疫应答的影响，结果如图23(K)所示(从左至右依次为同源灭活疫苗加强免疫组、异源1μg LPP/mRNA加强免疫组和异源5μg LPP/mRNA加强免疫组数据)，以LPP/mRNA疫苗作为加强剂在诱导分泌IFN-γ的T细胞应答方面优于灭活疫苗，接受以灭活疫苗作为加强剂的小鼠的脾脏和肺脏中均未检测到细胞免疫应答。
此外，还进行了中和测定，以评估同源或异源免疫对Delta，BA.1和BA.4/5变异毒株的交叉中和活性，检测结果如图23(L-N)所述(从左至右依次为同源灭活疫苗加强免疫组、异源1μg LPP/mRNA加强免疫组和异源5μg LPP/mRNA加强免疫组数据)，与结合抗体的结果一致，与灭活疫苗加强免疫相比，LPP/mRNA(1μg或5μg mRNA)加强免疫能进一步增强对Delta、BA.1和BA.4/5变异毒株的中和能力。特别地，对于BA.4/5毒株，注意到通过两次注射LPP/mRNA或灭活疫苗进行的免疫对BA.4/5的中和能力非常低，小鼠的中和抗体GMT均仅为60，但在LPP/mRNA(5μg mRNA)加强免疫后，小鼠的中和抗体GMT能达到2790，而灭活疫苗加强免疫后，小鼠的中和抗体GMT仅为108。
综上所述，这些结果表明LPP/mRNA疫苗作为同源或异源加强策略在诱导体液免疫应答和细胞免疫应答方面优于灭活疫苗加强策略。
实施例20 LPP/mRNA疫苗在恒河猴中展现良好的安全性
为了进行重复给药毒性研究，如图24(A)所示，将40只恒河猴(雌雄各20只)分为4组，分别以0.9％氯化钠、LPP/eGFP(给药系统对照)、0.02mg/kg和0.1mg/kg LPP/mRNA肌内给药。在第1天、第15天和第29天给药，恢复期4周。并且在整个研究过程中，评估以下终点和参数：死亡率、濒死率、临床观察、体重、食物消耗、体温、心电图、呼吸、血压、眼科、血液学和凝血、临床化学、免疫功能、尿液分析、粪便隐血、细胞因子、器官重量、肉眼尸检、组织病理学检查、组织分布和抗 体滴度。
在给药前两天(D-2)、适应期(D7、D30)和恢复期(D58)采集血清进行血液学和凝血检测。收集血液学分析样本至含有EDTA-K2作为抗凝剂的管中，用ADVIA 2120i自动血液学分析仪进行分析。用于凝血分析的样品被收集到含有柠檬酸钠作为抗凝血剂的管中，并通过Sysmex CS-5100自动凝血分析仪进行分析。采集血清进行细胞因子分析和抗体滴度分析。
在整个研究期间未发现动物死亡或濒死的情况。在食物消耗、心电图、呼吸、血压、眼科学、临床化学、免疫功能、尿液分析、粪便隐血、器官重量、肉眼尸检中均未发现与测试品相关的异常。临床观察中，LPP/eGFP和LPP/mRNA给药组有部分动物出现稀便，但适应期和0.9％氯化钠组也有类似现象。在第一次给药后开始监测体温。LPP/eGFP和LPP/mRNA(0.02mg/kg和0.1mg/kg)组的动物在给药后第1天和第29天6小时后体温升高，24、48小时后可恢复正常。
在给药前两天(D-2)、适应期(D7、D30)和恢复期(D58)采集血清进行血液学和凝血检测。检测结果如图24(B-E)所示(从左至右依次为0.9％氯化钠组、LPP/eGFP 0.1mg/kg组、LPP/mRNA 0.02mg/kg组和LPP/mRNA 0.1mg/kg组数据)，第一次给药后，与0.9％氯化钠组相比，LPP/eGFP和LPP/mRNA(0.02mg/kg和0.1mg/kg)组恒河猴的血液学和凝血检测结果(包括谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYMPH)检测)无显著差异。体温和体重监测结果如图24(F和G)所示，LPP/eGFP组和高剂量LPP/mRNA组恒河猴的体温和体重变化波动幅度相似。
在第31天处死部分受试者，取组织以检测组织病理学，并且第59天处死剩余受试者，收集组织以检测组织病理学。组织病理学检查结果如图6H所示，在给药2天后，在LPP/eGFP组和LPP/mRNA组小鼠的给药部位观察到了炎性细胞浸润(图6H，D31样本)，但是都没有造成永久损伤，在给药29天后恢复正常(图6H，D59样本)。
申请人还采用相同免疫程序处理另一批受试者，并于给药前两天(D-2)、第1天给药后24小时、第29天给药后24小时和第56天采集血清，使用U-PLEX TH17Combo 1(NHP)检测试剂盒(货号K15079K)，根据制造商的说明，通过ELISA法检测细胞因子IL-6。细胞因子IL-6的检测结果如图25所示(从左至右依次为0.9％氯化钠组、LPP/eGFP 0.1mg/kg组、LPP/mRNA 0.02mg/kg组和LPP/mRNA 0.1mg/kg组数据)，在第1天和第29天给药24小时后，与0.9％氯化钠组相比，LPP/eGFP组和LPP/mRNA(0.02mg/kg和0.1mg/kg)组恒河猴的IL-6水平显著升高，并且在第56天恢复。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表

Claims (40)

  1. 一种脂质组合物，其包含治疗剂或预防剂以及包封治疗剂或预防剂的脂质，其中所述包封治疗剂或预防剂的脂质包含阳离子脂质、磷脂、类固醇和聚乙二醇修饰的脂质；所述组合物还包含阳离子聚合物，其中所述阳离子聚合物与所述治疗剂或预防剂缔合为复合物，共同包封在所述脂质中形成脂质多聚复合物。
  2. 权利要求1的脂质组合物，其中所述治疗剂或预防剂为核酸，例如RNA，特别是mRNA。
  3. 权利要求1或2的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐
    其中，
    R1和R2各自独立选自键、C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    R3和R4各自独立选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；
    R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    M1和M2各自独立地选自键、H、-O-、-S-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、3-10元杂环、-NR7-，或者
    R5与M1和M2之一连同所连接的N原子一起形成3-10元杂环，且对应的R1/R3或者R2/R4不存在，所述杂环任选地被R7取代；
    R5选自C3-8碳环、-C1-12亚烷基-Q，Q选自H、-OR7、-SR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)S(O)2R7、-N(R7)C(S)R7、-N(R7)2、氰基、C3-8碳环、3-10元杂环、C6-C10芳基，上述基团各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代；
    m和n各自独立为选自0-12的整数；
    所述烷基、烯基和亚烷基各自任选地独立地被一个或多个选自以下的基团中断：-O-、-S-、-NR7-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-、-C(S)S-、C3-8碳环，且所述烷基、烯基和亚烷基各自任选地被一个或多个R7取代；
    R7各自独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、C3-8碳环，上述基团各自任选地被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12烷氧基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基、3-10元杂环、卤素、羟基、氧代(＝O)取代。
  4. 权利要求3的脂质组合物，其中，
    R1和R2各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    其中R3和R4各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基。
    M1和M2各自独立选自-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-和-C(S)S-；
    R5选自-C1-12亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12 烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
    m和n各自独立为选自1-12的整数。
  5. 权利要求3的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
  6. 权利要求3的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
  7. 权利要求3的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐
  8. 权利要求3的脂质组合物，其中，
    R1和R2各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    R3和R4各自独立选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
    条件是R3和R4中至少一个为C6-C10芳基或5-10元杂芳基，并且R3和R4各自独立任选被t个R6取代，t为选自1-5的整数；R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    M1和M2各自独立选自-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(S)-和-C(S)S-；
    R5选自-C1-12亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C1-C12 烷氧基、羧酸、亚磺酸、磺酸、磺酰基、硝基、氰基、氨基、氨甲酰基、磺酰胺、C6-C10芳基和5-10元杂芳基；
    m和n各自独立为选自1-12的整数。
  9. 权利要求8的脂质组合物，其中，
    R1和R2各自独立选自C1-C12烷基。
  10. 权利要求8或9的脂质组合物，其中，
    R3和R4各自独立选自C1-C12烷基和C6-C10芳基；
    条件是R3和R4之一为C6-C10芳基，另一个为C1-C12烷基；
    R3和R4各自独立被t个R6取代，t为选自1-3的整数；
    R6各自独立选自C1-C12烷基。
  11. 权利要求8-10中任一项所述的脂质组合物，其中，
    M1和M2各自独立选自：-OC(O)-和-C(O)O-。
  12. 权利要求8-11中任一项所述的脂质组合物，其中，
    R5选自-C1-5亚烷基-Q，Q为-OH。
  13. 权利要求8-12中任一项所述的脂质组合物，其中，
    m和n各自独立为选自2-7的整数。
  14. 权利要求8-13中任一项所述的脂质组合物，其中，
    R4取代于R2的1位或末位；和/或
    R3取代于R1的1位或末位。
  15. 权利要求8-14中任一项所述的脂质组合物，其中，
    t为1或2，R6取代于苯环上相对于R1或R2的间位和/或对位。
  16. 权利要求8-15中任一项所述的脂质组合物，其中，
    t为1或2，R6各自独立选自C1-C10烷基。
  17. 权利要求8-16中任一项的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐：
    其中R1、R2、R4、R5、R6、M1、M2、t、m和n如权利要求8-16中任一项所定义；
    优选地，在式(II)中
    R1选自C1-C6烷基；
    R2选自C1-C10烷基；
    R4选自C1-C10烷基；
    M1和M2各自独立选自：-OC(O)-和-C(O)O-；
    R5选自-C1-5亚烷基-Q，Q选自-OR7和-SR7，R7独立选自H、C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    m和n各自独立为选自2-9的整数；
    t为选自1-3的整数；
    R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基。
  18. 权利要求8-16中任一项的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含式(III)的化合物，或其药学上可接受的盐：
    其中R1、R2、R4、R5、R6、t、m和n如权利要求8-16中任一项所定义；
    优选地，在式(III)中，
    R1选自C1-C6烷基；
    R2选自C1-C10烷基；
    R4选自C1-C10烷基；
    R5选自-C1-3亚烷基-Q，Q选自-OH和-SH；
    t为1或2；
    R6选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    m和n各自独立为选自2-7的整数。
  19. 权利要求8-16中任一项的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含式(IV)的化合物，或其药学上可接受的盐：
    其中R1、R2、R4、R6、t、m和n如权利要求8-16中任一项所定义；
    优选地，在式(IV)中，
    R1选自C1-C6烷基；
    R2选自C1-C10烷基；
    R4选自C1-C10烷基；
    t为1或2；
    R6各自独立选自C1-C12烷基和C2-C12烯基；
    m和n各自独立为选自2-7的整数。
  20. 权利要求8的脂质组合物，其中所述阳离子脂质包含具有如下所示结构的脂质化合物或其药学上可接受的盐：
    优选地，所述阳离子脂质为SW-II-115、SW-II-121、SW-II-122、SW-II-134-3、SW-II-138-2、SW-II-139-2或SW-II-140-2。
  21. 权利要求1的脂质组合物，其中所述阳离子脂质不包括T5’
  22. 权利要求3-21中任一项的脂质组合物，其中所述磷脂包含1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或其组合；
    优选DSPC、DOPE或其组合。
  23. 权利要求22的脂质组合物，其中所述类固醇包含胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其衍生物；优选地，所述类固醇为胆固醇。
  24. 权利要求23的脂质组合物，其中所述聚乙二醇修饰的脂质包含1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)、1,2-二油酰基-rac-甘油,甲氧基-聚乙二醇(DOGPEG))和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)；优选DSPE-PEG、DMG-PEG或其组合。
  25. 权利要求24的脂质组合物，其包含
    10-70摩尔％的阳离子脂质、10-70摩尔％的磷脂、10-70摩尔％的类固醇和0.05-20摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质；
    优选包含35-50摩尔％的阳离子脂质、10-30摩尔％的磷脂、24-44摩尔％的类固醇和1-1.5摩尔％的聚乙二醇修饰的脂质；和/或
    阳离子脂质、DOPE、胆固醇和DMG-PEG；
    优选包含50摩尔％的阳离子脂质、10摩尔％的DOPE、38.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG或40摩尔％的阳离子脂质、15摩尔％的DOPE、43.5摩尔％的胆固醇和1.5摩尔％的DMG-PEG。
  26. 权利要求25的脂质组合物，其中所述阳离子聚合物包含聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)或其组合；优选地，所述阳离子聚合物为鱼精蛋白。
  27. 权利要求1-26中任一项的脂质组合物，其中所述治疗剂或预防剂为多核苷酸，所述多核苷酸包含编码区，所述编码区编码修饰的刺突蛋白，其中
    所述修饰的刺突蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列；并且
    其中所述多核苷酸为RNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者
    其中所述多核苷酸为DNA，其中所述编码区包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。
  28. 权利要求27的脂质组合物，其中所述多核苷酸进一步包含5’-UTR；和/或所述多核苷酸进一步包含3’-UTR；
    优选地，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列；和/或所述3’-UTR包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列；或者
    所述5’-UTR包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列；和/或所述3’-UTR包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
  29. 权利要求27或28的脂质组合物，其中所述多核苷酸进一步包含poly(A)序列；
    优选地，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列；或者
    所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
  30. 权利要求27-29中任一项的脂质组合物，其中
    所述多核苷酸为RNA，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；或者
    所述多核苷酸为DNA，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具 有至少85％相同性的核苷酸序列。
  31. 一种药物组合物，其包含权利要求1-26中任一项的脂质组合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
  32. 一种药物组合物，其包含权利要求27-30中任一项的脂质组合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂。
  33. 权利要求1-26中任一项的脂质组合物或权利要求31的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症。
  34. 权利要求33的用途，其中所述疾病或病症以功能失常或异常蛋白质或多肽活性为特征。
  35. 权利要求33或34的用途，其中所述疾病或病症选自罕见病、感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传疾病、自体免疫疾病、糖尿病、神经退行性疾病、心血管和肾血管疾病、以及代谢性疾病。
  36. 权利要求27-30中任一项的脂质组合物或者权利要求32的药物组合物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
  37. 一种将治疗剂或预防剂递送至受试者哺乳动物细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-30中任一项的脂质组合物或者权利要求31或32的药物组合物，所述施用包括使所述细胞与所述脂质组合物接触，由此将所述治疗剂及/或预防剂递送至所述细胞。
  38. 一种在受试者哺乳动物细胞中产生目标多肽的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-30中任一项的脂质组合物或者权利要求31或32的药物组合物接触，其中所述治疗剂或预防剂是mRNA，且其中所述mRNA编码目标多肽，由此所述mRNA能够在所述细胞中翻译以产生目标多肽。
  39. 权利要求1-30中任一项的脂质组合物、权利要求31或32的药物组合物、权利要求33-36中任一项的用途或者权利要求37或38的方法，其中所述脂质组合物、药物组合物或药物通过以下途径施用：肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内或阴道内；优选通过肌内注射施用。
  40. 一种注射剂，其包含权利要求1-30中任一项的脂质组合物以及药学上可接受的注射用赋形剂。
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