CN119638838B - 一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的CDR1和SEQ ID No.2所示的CDR3；所述纳米抗体的氨基酸序列还包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的CDR2。本发明制备的纳米抗体特异性高，可以阻断PD‑1和PD‑L1的结合，增强免疫细胞的功能。

Description

一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用。

背景技术

在免疫系统中，T细胞介导的细胞免疫是消灭肿瘤的“主力军团”。T细胞需要活化才能发挥抗肿瘤效应，T细胞的活化幅度和质量取决于活化信号和抑制信号之间的平衡，活化性抗体发出活化信号就像车的油门，抑制性抗体发出抑制信号就像踩刹车。免疫检查点可以认为是免疫细胞的刹车系统，是指在免疫细胞上表达、能调节免疫激活程度的一系列分子，使T细胞的活化水平保持在正常范围，防止对机体健康组织的损伤。

程序化死亡分子1（programmed death 1，PD-1），广泛表达于免疫细胞表面，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1隶属免疫球蛋白超家族CD28/B7，是由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，为免疫抑制性受体。其有至少PD-L1和PD-L2两种配体。在正常情况下，T细胞表面的PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生。但在肿瘤中，肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，能通过对T淋巴细胞的抑制作用，导致T细胞增殖下调，甚至诱导T细胞凋亡，促进肿瘤的免疫逃逸。而阻断PD-1/PD-L1负调控通路，可激活免疫系统功能，杀伤肿瘤细胞。目前市面上已有多种靶向PD-1单克隆抗体，包括纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、西米普利单抗（Cemiplimab）、特瑞普利单抗（Toripalimab）、信迪利单抗（Cindilimab）等。这些PD-1单抗在临床中已经取得成功应用。但这些抗体均为普通抗体。

普通抗体的研究载体以小鼠、兔子为主，与普通抗体相比，羊驼抗体拥有诸多优势：一是体积小，是普通抗体的十分之一，这使得它能够渗透到组织和细胞内部，特别是能够穿透血脑屏障。二是稳定性强，纳米抗体在极端的温度和pH值条件下都能保持稳定性，在高达90度的高温下仍能保持生物活性。三是结构简单，纳米抗体更容易进行改造，如人源化、多价性构建等，且生产成本低，适合大规模生产。四是高特异性，羊驼的免疫系统能够产生对特定抗原有高度特异性和亲和力的抗体，且对人的免疫原性弱。纳米抗体引起免疫反应的风险较低。

因此，如何制备抗程序化死亡分子1的纳米抗体已成为目前亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体及其应用，本发明制备的羊驼抗体特异性高，可以阻断PD-1和PD-L1的结合，增强免疫细胞的功能。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的CDR1 SEQ ID No.2所示的CDR3。

所述纳米抗体的氨基酸序列还包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的CDR2。

SEQ ID No.1：GTIFSMND。

SEQ ID No.2：NREIRGSSGSWYPLHY。

SEQ ID No.3：IDSGLSA。

SEQ ID No.4：IDSALSA。

本发明中，采用PD-1免疫羊驼后获得纳米抗体，体积小，特异性高，羊驼的免疫系统能够产生对特定抗原有高度特异性和亲和力的抗体，且对人的免疫原性弱。经过试验检测，该抗体具有较高的亲和力，特异性高，用于科研领域，例如可用于探究免疫检查点的理论研究，用于筛选更多的治疗PD-1高表达的疾病的药物等等。

优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列包括SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的序列。

SEQ ID No.5：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTIFSMNDMGWYRQAPGKQRELVARIDSGLSANYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNREIRGSSGSWYPLHYWGQGTQVTVSP。

SEQ ID No.6：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTIFSMNDMGWYRQAPGKQRELVARIDSALSANYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNREIRGSSGSWYPLHYWGQGTQVTVSS。

第二方面，本发明提供一种重组抗体，所述重组抗体包括第一方面所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体和人源Ig Fc片段融合后的序列。

优选地，所述人源Ig Fc包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种或至少两种组合。

优选地，所述人源Ig Fc片段的序列如SEQ ID No.7所示。

SEQ ID No.7：

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

优选地，所述重组抗体的序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。

SEQ ID No.8：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTIFSMNDMGWYRQAPGKQRELVARIDSGLSANYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNREIRGSSGSWYPLHYWGQGTQVTVSPAHHSEDPSSAAASGATKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

SEQ ID No.9：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTIFSMNDMGWYRQAPGKQRELVARIDSALSANYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNREIRGSSGSWYPLHYWGQGTQVTVSSAHHSEDPSSAAASGATKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

本发明中，采用纳米抗体、人源Ig Fc片段和启动子构建的重组抗体能够显著阻断PD-1与PD-L1结合的能力较强，能有效促进Jurkat-PD-1-Luciferase表达Luciferase，且在较低的浓度下仍具有较强的阻断能力。

第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或第二方面所述的重组抗体。

第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第三方面所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染、转导或转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达第一方面所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或第二方面所述的重组抗体。

优选地，所述表达载体还包括启动子。

优选地，所述启动子包括EF1a、PGK1、Ubc、human beta actin、CAG或SV40中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或第二方面所述的重组抗体。

优选地，所述药物组合物还包括免疫细胞。

第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体、第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的药物组合物在制备阻断PD-1的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

1.本发明中抗程序化死亡分子1的纳米抗体，体积小，稳定性强，结构简单。经试验检测特异性高，羊驼的免疫系统能够产生对特定抗原有高度特异性和亲和力的抗体，且对人的免疫原性弱，纳米抗体引起免疫反应的风险较低。

2.本发明中制备的重组抗体，亲和力高，阻断PD-1与PD-L1结合的能力较强，能有效促进Jurkat-PD-1-Luciferase表达Luciferase，可用于研发免疫增强型药物。

附图说明

图1为检测重组单域抗体195-1-D08的特异性的流式细胞术检测图。

图2为检测重组单域抗体195-1-G06的特异性的流式细胞术检测图。

图3为ELISA检测重组单域抗体195-1-D08的EC50的结果图。

图4为ELISA检测重组单域抗体195-1-G06的EC50的结果图。

图5为重组抗体195-1-D08阻断功能检测的结果图。

图6为重组抗体195-1-G06阻断功能检测的结果图。

图7为ELISA检测重组单域抗体195-1-D08的IC50的结果图，其中，A图为194-1-D08阻断曲线图，B图为阴性对照抗体阻断曲线图，C图为阳性对照抗体阻断曲线。

图8为ELISA检测重组单域抗体195-1-G06的IC50的结果图，其中，A图为194-1-D08阻断曲线图，B图为阴性对照抗体阻断曲线图，C图为阳性对照抗体阻断曲线。

以下实施例中用到的试剂：

PE-anti-Human IgG (eBioscience, CAT# 12-4998-82)；

PBS(bico, CAT# 14190-250)；

Goat anti-Llama IgG (H+L))Secondary Antibody [HRP] (Novus, AT#NB7242)；

Nivolumab（MedChemExpress，HY-P9903）；

Streptavidin PE（eBioscience，CAT# 12-4317-87）；

Adjuvant（GERBU，CAT# 3030）；

HRP-ProteinA（Boster，CAT# BA1080）；

HRP-Streptavidin（Boster，CAT# BA1088）；

PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，CAT# 6210B）；

DNA片段回收kit（TakaRa，CAT# 9761）；

THE™ V5 Tag抗体 [iFluor 647], mAb（金斯瑞，CAT# A01805）。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

羊驼免疫和抗体效价测定

采用PD-1蛋白对羊驼进行免疫，在颈部淋巴结两侧各注射约1000 μg乳化的抗原，每3周免疫一次，进行4次免疫。分别于免疫前、第二次、第三次和第四次免疫后采集5 mL外周血，800 g离心10 min，收集上层血清。以100 μl/孔加入1 µg/mL的PD-1-His蛋白至96孔板中，4℃包被过夜；随后弃去上清，使用PBST缓冲液（含0.05%的Tween-20的PBS缓冲液）洗涤5次；加入200 μl/孔的封闭缓冲液，于37℃孵育2 h；弃去封闭缓冲液后，使用PBST缓冲液洗涤孔板5次；用PBS缓冲液梯度稀释上述收集的血清，加入100 μL梯度稀释的血清至96孔酶标板上，25℃孵育60 min，对照孔为PBS缓冲液。弃去孔内的液体，并使用PBST缓冲液洗涤5次。加入100 μl HRP抗美洲驼IgG（H+L）抗体（1:50000稀释），25℃孵育60 min。弃去孔内的液体后，使用PBST缓冲液洗涤孔板5次；加入100 μl/孔TMB显色液；25℃避光孵育15 min。加入50 μL/孔终止液；使用酶标仪读取孔内的OD450值。

用“1:X”表示抗体效价（X指抗体可以被检测出来的最大稀释倍数）。羊驼免疫前的血清与PD-1蛋白的结合效价均低于1:2000，说明其中含有的抗PD-1特异性抗体含量极低，第四次免疫后的血清与PD-1蛋白的结合效价均显著高于1:64,000，说明经过多次免疫后羊驼血清中抗PD-1特异性抗体的含量显著提升，可用于酵母展示文库的构建。

实施例2

单域抗体酵母展示文库的构建

（1）克隆VHH抗体片段：采集羊驼外周血100 mL并分离PBMC，提取RNA，用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录获得cDNA。以PBMC cDNA为模板，PCR扩增羊驼重链抗体序列。其中，上游引物结合在VHH抗体ORF的信号肽，序列如SEQ IDNO.10所示；下游引物结合在CH2区，序列如SEQ ID NO.11所示。使用1%琼脂糖电泳回收大小为750 bp左右的目的片段。

SEQ ID NO.10：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG。

SEQ ID NO.11：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。

以首轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增重链抗体VHH片段。其中，上游引物结合在抗体FR1区，5’端含SfiI酶切位点GGCCCAGCCGGCC，序列如SEQ ID NO.12所示；下游引物结合在铰链区和FR4区，5’端含SfiI酶切酶位点GGCCACGAAGGCC，序列如SEQ ID NO.13所示。使用1%琼脂糖电泳回收分子量大小为450 bp左右的目的片段，获得VHH片段文库。

SEQ ID NO.12：ACTACATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGG。

SEQ ID NO.13：GGCCCAGCCGGCCGATCACTAGTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG。

（2）检测文库载体的电转化以及文库容量和多样性：用SfiI将酵母表面展示载体pYDisplay和VHH片段文库进行酶切。电泳回收5000 bp的pYDisplay载体片段。将-80°C冻存的酵母感受态菌株划线到YPD固体培养基平皿上，30°C培养5天。将酵母感受态接种到50 mLYPD培养基中，30°C摇床培养2天。将线性化载体片段和PCR产物混合后电击转化；电击后的酵母感受态转移到培养瓶中，30°C摇床培养1 h。取20 μl重悬液，用SDCAA培养基稀释5000倍，吸取100 μL，涂SDCAA平板，培养3天后计算库容，其余菌液继续培养1天。3000 g离心5min收集剩余菌液，弃去上清；加入10 mL SDCAA培养基重悬，用50%甘油:重悬液=1:1混合，-80°C冻存。结果显示，羊驼PBMC获得的单域抗体酵母展示文库的库容大小约为1.2×10⁹。

实施例3

淘选酵母展示文库

（1）链霉亲和素磁珠及酵母细胞的预处理：为筛选到对PD-1亲和力高的抗体，取10mL酵母菌文库（约2×10⁸酵母细胞），3000 g，离心5 min，去上清。用0.5% PBSA（PBS+0.5%BSA）重悬酵母菌文库，转移至1.5 mL离心管中，3000 g，离心5 min，弃上清后，重复洗涤一次。向3个1.5 mL离心管中加入1 mL 0.5% PBSA，再加入10 μL链霉亲和素磁珠。将离心管装在袋子中，固定到旋转混合仪上，4°C旋转孵育5 min。将离心管置于磁力架上5 min，吸弃上清。随后再次加入1 mL 0.5% PBSA，4°C再旋转孵育5 min，弃上清。

（2）空磁珠负淘选酵母展示文库：将洗涤后的酵母菌液转移至空磁珠管中，并装在袋子中，4°C旋转孵育60 min；将孵育酵母的空磁珠管置于磁力架上10 min，吸取酵母菌液转移至新的空磁珠管中，4°C旋转孵育30 min。孵育结束后，置于磁力架上15 min，吸取酵母菌液转移至新的空磁珠管中。

（3）生物素-PD-1-His磁淘选酵母展示文库：将100 μL的50 μg/mL生物素-PD-1-His蛋白溶液（0.5% PBSA缓冲液稀释）加入到含有链霉亲和素磁珠的离心管中，将离心管装在袋子中，4°C旋转孵育60 min。然后加入1 mL 0.5% PBSA缓冲液，静置5 min，并保持离心管放置于磁力架上，弃去上清，加入1 mL 0.5% PBSA缓冲液。将离心管从磁力架上取下，吹打混匀，再次将离心管置于磁力架上，静置5 min，并保持离心管放置于磁力架上，弃去上清。再次重复上述清洗步骤一次后，获得完成生物素-PD-1-His包被的正淘选磁珠。将结合了生物素-PD-1-His的正淘选磁珠加到完成负淘选的酵母菌体中，4°C旋转孵育60 min。孵育结束后，置于磁力架上，25°C静置15 min；保持离心管置于磁力架上，弃去酵母菌液。从磁力架上取下1.5 mL离心管，并向离心管中加入1 mL 0.5% PBSA缓冲液，轻柔吹打磁珠，将其转移到无菌的1.5 mL离心管中。将离心管置于磁力架上，25°C静置5 min，弃上清；再重复洗涤两次。洗涤结束后，将磁珠及粘附的酵母细胞用1 mL SDCAA培养基重悬，吸取20 μl重悬液到180 μL SDCAA培养基中涂板两块，每块涂板体积为100 μL，再吸取5 μL重悬液到95 μLSDCAA培养基中涂板一块。

（4）流式检测淘选后酵母菌：将经过上述两步淘选的酵母菌与含有His标签的PD-1蛋白4°C旋转孵育60 min。随后离心去除上清，加入抗-His标签和抗-V5标签的流式抗体（酵母表达载体中含有V5标签以指示表达载体是否成功转入酵母菌），4°C旋转孵育60 min。随后离心去除上清，加入1 mL PBS缓冲液重悬细胞。随后离心去除上清，加入500 μL PBS缓冲液重悬细胞，进行流式分析。结果显示，与淘选前相比，淘选后的酵母菌抗体展示文库中能结合PD-1蛋白的酵母菌增加35%。

（5）挑选单克隆：挑取酵母单克隆，接种到培养基诱导表达。48 h后将菌液与含有His标签的PD-1蛋白于4°C旋转孵育60 min。随后离心弃去上清，使用含有生物素偶联的抗-His标签的流式抗体的溶液重悬沉淀，4°C旋转孵育60 min。随后离心弃去上清，使用含有PE-链霉亲和素的溶液重悬沉淀，4°C旋转孵育60 min。随后离心弃去上清，500 μl PBS重悬细胞，进行流式分析。最终挑选到阳性率高的两株单克隆，分别命名为195-1-D08和195-1-G06。经Sanger测序，195-1-D08和195-1-G06的CDR1序列均为SEQ ID No.1，CDR3序列均为SEQ ID No.2。195-1-D08的CDR2序列为SEQ ID No.3，195-1-G06的CDR2序列为SEQ IDNo.4。195-1-D08的氨基酸序列为SEQ ID No.5，195-1-G06的氨基酸序列为SEQ ID No.6。

实施例4

重组单域抗体的表达及与靶蛋白结合的检测

为了表达重组单域抗体195-1-D08和195-1-G06，用PCR仪器分别扩增候选195-1-D08和195-1-G06的VHH序列，CMV启动子序列和IgG1 Fc序列，取50 μL的PCR产物，加入1/10体积10×loading buffer，使用1%的琼脂糖进行电泳分析，CMV的条带大小为750 bp，Fc的条带大小为1400 bp，195-1-D08和195-1-G06的VHH的条带大小为分别为500 bp和450 bp。从胶上切除目的条带，并纯化PCR产物。使用PCR仪器分别对195-1-D08和195-1-G06 VHH序列，分别与MV启动子和IgG1 Fc序列进行连接，随后取50 μL的PCR产物，加入1/10体积10×loading buffer，使用1%的琼脂糖进行电泳分析，从胶上切除目的条带，并纯化PCR产物，将获得的PCR产物瞬时转染至HEK293细胞后，收获的细胞培养上清中分别含有重组单域抗体195-1-D08和195-1-G06。

检测195-1-D08和195-1-G06的结合特异性。用分别含有195-1-D08和195-1-G06的培养上清分别与3×10⁵个CHO-K1或CHO-K1-PD-1细胞室温孵育1 h。800g室温离心5 min后，弃去上清，并用PBS洗涤细胞3次。加入100 μL的PE标记的Anti-human IgG抗体（1:500稀释），室温避光孵育45 min。800g室温离心5 min后，弃去上清，并用PBS洗涤细胞3次。使用500 μL的PBS重悬细胞，进行流式分析。

195-1-D08的结果如图1所示，阴性对照组的表达上清对CHO-K1或CHO-K1-PD-1都没有显著结合；阳性对照抗体对CHO-K1-PD-1有显著结合而不结合CHO-K1细胞，表明CHO-K1细胞不表达PD-1蛋白，CHO-K1-PD-1细胞表达PD-1蛋白，可作为羊驼抗体的检测细胞。195-1-D08对CHO-K1细胞不结合，对CHO-K1-PD-1有显著结合，且能检测到大部分的CHO-K1-PD-1细胞表达PD-1蛋白，表明195-1-D08有较好的亲和力和特异性。

195-1-G06的结果如图2所示，195-1-G06对CHO-K1细胞不结合，对CHO-K1-PD-1有显著结合，且能检测到大部分的CHO-K1-PD-1细胞表达PD-1蛋白，表明195-1-G06有较好的亲和力和特异性。

实施例5

重组抗体的纯化和半数效应浓度（EC50）测定

为测定195-1-D08抗体和195-1-G06抗体的EC50，分别将表达重组重链羊驼抗体的表达质粒瞬时转染至293F细胞，摇瓶震荡培养，以进行抗体的表达和纯化。由于目的重组抗体含有人IgG片段，可用Protein A磁珠进行亲和纯化。按顺序用30 mL的PBS缓冲液、0.1M氢氧化钠、PBS缓冲液分别洗涤Protein A磁珠两次。根据样品的需求量向293F细胞摇瓶中投入相应体积Protein A磁珠（按20 mg IgG/mL Protein A磁珠计算）。在震荡培养箱中120rpm室温下孵育2 h。用磁选架收集Protein A磁珠并转移至50 mL离心管。用30 mL的PBS缓冲液和去离子水各洗涤两次后，用1 mL洗脱缓冲液重悬。室温下孵育5 min后，用磁分离架收集磁珠，将磁珠转移到15 mL离心管中。对Protein A磁珠重复洗脱两次后，合并洗脱液，并加入中和缓冲液调节溶液pH。洗脱的样品用至少样品100倍体积的PBS进行透析，先在20℃透析2 h，换液1次后再于6℃透析15 h。最后测定蛋白浓度并用0.22 μm无菌滤膜过滤样品并分装，-80°C冰箱保存待用。

使用包被液稀释PD-1蛋白至2 μg/mL，以100 μL/孔吸取到96孔酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗涤5次，200 μL/孔加入封闭液，室温封闭2 h。PBST洗涤5次，加入不同浓度的195-1-D08候选抗体，分别为10 μg/mL，3.3 μg/mL，1.1 μg/mL，0.37 μg/mL，0.12 μg/mL，0.04 μg/mL，0.014 μg/mL，0 μg/mL，室温孵育60min。PBST洗涤5次，将HRP-Protein A以1：50000稀释，按100 μL/孔加入酶标板中，室温孵育45 min。PBST洗涤5次，每孔加入100 μL的TMB显色液室温避光显色10 min。每孔加入50 μL终止液，在酶标仪上以450 nm波长读取吸光度。

结果如表1和图3所示，195-1-D08对CHO-K1-PD-1的EC50值为0.018 μg/mL，表明195-1-D08具有较高的亲和力。

结果如表2和图4所示，195-1-G06对CHO-K1-PD-1的EC₅₀值为0.083 μg/mL，表明195-1-G06具有较高的亲和力。

表1 195-1-D08在不同稀释浓度下的OD450nm处吸光值

表2 195-1-G06在不同稀释浓度下的OD450nm处吸光值

实施例6

重组抗体阻断功能检测

为了检测195-1-D08和195-1-G06阻断PD-1与PD-L1结合的功能，在96孔板中，加入100 μL细胞悬液，每孔包括2×10⁴个效应细胞Jurkat-PD-1-Luciferase（表达PD-1分子，与PD-L1结合后可抑制Luciferase荧光蛋白的表达）和8×10⁴个靶细胞CHO-K1-PD-L1（表达PD-L1分子，可与PD-1结合，抑制Jurkat-PD-1-Luciferase细胞Luciferase荧光蛋白的表达）。随后在对应的孔中分别独立加入100 μL不同浓度的195-1-D08和195-1-G06，使其对应孔中终浓度分别为120 μg/mL，40 μg/mL，13.3 μg/mL，4.4 μg/mL，1.6 μg/mL，0.5 μg/mL，0.16 μg/mL，0.05 μg/mL，0.02 μg/mL，0 μg/mL。共培养18 h后，每孔加入20 μL的One-Glo试剂，读取Luciferase荧光值。

结果图5所示，195-1-D08的最大诱导效应值为2.2（最大Luciferase荧光值相对于0μg/mL Luciferase荧光值的差值），表明195-1-D08阻断PD-1与PD-L1结合的能力较强，能有效促进Jurkat-PD-1-Luciferase表达Luciferase，可用于研发免疫增强型药物。

结果图6所示，195-1-G06的最大诱导效应值为2.0（最大荧光值相对于0 μg/mL荧光值的差值），表明195-1-G06阻断PD-1与PD-L1结合的能力较强，能有效促进Jurkat-PD-1-荧光素酶表达荧光素酶，可用于研发免疫增强型药物。

实施例7

重组抗体半抑制浓度（IC50）实验

为了检测195-1-D08和195-1-G06阻断PD-1与PD-L1结合的半抑制浓度，使用包被液稀释PD-1蛋白至2 μg/mL，以100 μL/孔吸取到96孔酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗涤5次，200 μL/孔加入封闭液，室温封闭2 h。PBST洗涤5次，分别独立加入不同浓度195-1-D08和195-1-G06，分别为25μg/mL，8.3μg/mL，2.8μg/mL，0.9μg/mL，0.3 μg/mL，0μg/mL)和抗PD-1阳性对照抗体Nivolumab，室温孵育15 min。加入Biotin-PD-L1蛋白（4 µg/mL），室温孵育45 min。PBST洗涤5次，将二抗（Streptavidin-HRP）以1：10000稀释，按100 μL/孔加入酶标板中，室温孵育45 min。PBST洗涤5次，每孔加入100 μL的TMB显色液室温避光显色10 min。每孔加入50 μL终止液，在酶标仪上以450 nm波长读取吸光度。

结果如表3和图7所示，195-1-D08的IC50值为0.24 μg/mL，阳性对照抗体的IC50值为0.3 μg/mL，195-1-D08的IC50值低于阳性对照抗体Nivolumab。同时，在抗体浓度仅为0.034 μg/ml的情况下，195-1-D08处理组的吸光值（2.207和2.168）仍显著低于未加入抗体的对照组（3.079和3.092）；相反，阳性对照抗体在此浓度下的吸光值（1.626和1.669）与未加入抗体的对照组（1.703和1.602）已无显著差异。这一结果表明195-1-D08阻断能力强于阳性对照抗体Nivolumab。

结果如表4和图8所示，195-1-G06的IC50值为0.29 μg/mL，阳性对照抗体的IC50值为0.3 μg/mL，195-1-G06的IC50值与阳性对照抗体Nivolumab相当，表明195-1-G06阻断能力与阳性对照抗体Nivolumab相当。（上述结果来源于同一批次实验，所以表3和图7中的对照组结果与表4和图8是相同的）

表3 195-1-D08在不同浓度下的阻断能力

表4 195-1-G06在不同浓度下的阻断能力

综上所述，本发明使用PD-1蛋白免疫羊驼。通过ELISA确定羊驼血清中PD-1特异性抗体的效价后，分离羊驼外周血单个核细胞（PBMC），提取RNA并反转录获得cDNA。用羊驼单域抗体特异性引物，扩增VHH序列，并克隆至酵母表达质粒中，构建酵母展示文库。然后用生物素-PD-1蛋白-链霉素磁珠或链霉素磁珠对酵母展示文库进行正负筛选，富集结合PD-1蛋白的酵母菌。从富集产物中挑取单克隆，通过ELISA检测候选抗体与PD-1的特异性结合情况。阳性抗体表达纯化后，检测其与PD-1蛋白结合的亲和力。选择与PD-1亲和力强的抗体克隆，检测阻断PD-1和PD-L1结合的能力。结果显示，羊驼抗体的特异性高，阻断PD-1和PD-L1结合的效果强于现有技术，增强免疫细胞的功能。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1. 一种抗程序化死亡分子1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的CDR1和SEQ ID No.2所示的CDR3；

所述纳米抗体的氨基酸序列还包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的CDR2。

2. 根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括SEQID No.5或SEQ ID No.6所示的序列。

3. 一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包括权利要求1或2所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体和人源Ig Fc片段融合后的序列。

4. 根据权利要求3所述的重组抗体，其特征在于，所述人源Ig Fc包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种或至少两种组合；

所述人源Ig Fc片段的序列如SEQ ID No.7所示。

5. 根据权利要求3所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体的序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或权利要求3-5中任一项所述的重组抗体。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的核酸分子；并且所述表达载体在转染、转导或转化宿主细胞后，使得宿主细胞表达权利要求1或2所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或权利要求3-5中任一项所述的重组抗体。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括启动子；

所述启动子包括EF1a、PGK1、Ubc、human beta actin、CAG、CMV或SV40中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体或权利要求3-5中任一项所述的重组抗体；

所述药物组合物还包括免疫细胞。

10.一种权利要求1或2所述的抗程序化死亡分子1的纳米抗体、权利要求3-5中任一项所述的重组抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7或8所述的表达载体、权利要求9所述的药物组合物在制备阻断PD-1的疾病药物中的应用；

所述疾病为卵巢癌。