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CN119630812A - 作为先兆子痫的生物标志物的细胞游离dna信号 - Google Patents

作为先兆子痫的生物标志物的细胞游离dna信号 Download PDF

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CN119630812A
CN119630812A CN202480003030.XA CN202480003030A CN119630812A CN 119630812 A CN119630812 A CN 119630812A CN 202480003030 A CN202480003030 A CN 202480003030A CN 119630812 A CN119630812 A CN 119630812A
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Abstract

本发明包括用于在怀孕女性中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法和计算机程序，该方法包括在从怀孕女性获得的生物样品中鉴定细胞游离DNA信号，包括浓度、胎儿分数和片段大小分布。这些方法提供在妊娠前三个月鉴定具有先兆子痫风险的患者。

Description

作为先兆子痫的生物标志物的细胞游离DNA信号
继续申请案数据
本申请要求2023年2月17日提交的美国临时申请序列号63/446,404和2024年2月12日提交的美国临时申请序列号63/552,234的权益，这些临时申请各自以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明整体涉及用于对妊娠并发症先兆子痫进行检测和早期风险评估的方法和材料。
背景技术
先兆子痫是仅在妊娠期间发生的病症，影响所有妊娠的5%至8%。它是10%至15%的母体死亡和40%的胎儿死亡的直接原因。先兆子痫的三种主要症状可以包括在妊娠第20周之后发生的高血压、手足肿胀和尿中蛋白质过量（蛋白尿）。先兆子痫的其他病征和症状可以包括由肺中的流体引起的严重头痛、视力变化（包括视力暂时丧失、视力模糊或光敏感性）、恶心或呕吐、尿排出量减少、血小板水平降低（血小板减少症）、肝功能受损和呼吸短促。参见例如Steegers等人，2010, Lancet, 376:631-644. doi: 10.1016/80140-6736(10)60279-6；和Miller等人，2008, Semin Perinatal；32:274-280. doi: 10.1053/j.semperi.2008.04.010。
先兆子痫越严重并且在妊娠中发生得越早，对母亲和胎儿的风险就越大。先兆子痫可能需要引产分娩或剖腹产分娩。若不治疗，先兆子痫可能导致母亲和胎儿双方的严重、甚至致命的并发症。先兆子痫的并发症包括胎儿生长受限、出生体重低、早产、胎盘早剥、HELLP综合征（溶血、肝酶升高和低血小板计数综合症）、子痫（导致癫痫发作的严重形式的先兆子痫）、器官损害（包括肾、肝、肺、心脏、眼损害）、卒中或其他脑损伤。参见例如，2022年4月15日的“Preeclampsia - Symptoms and causes - Mayo Clinic”，该文献可在万维网上以链接mayoclinic.org/diseases-conditions/preeclampsia/symptoms-causes/syc-20355745获得。
就早期检测和治疗而言，如果早期检测到先兆子痫并且用常规的产前护理进行治疗，则大多数妇女可以分娩健康的婴儿。虽然各种蛋白质生物标志物在症状发生前阶段显示母体血清中的水平变化，但是这些生物标志物在个体患者中缺乏辨别力和预测力（Karumanchi和Granger，2016, Hypertension；67(2): 238-242）。因此，用于先兆子痫早期检测的生物标志物的识别对于先兆子痫的早期诊断和治疗至关重要。
发明内容
在一个方面，本公开描述一种在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，该方法包括：
提供从获自怀孕女性受试者的生物样品获得的细胞游离DNA（cfDNA）序列信息；以及
从cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率
指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，cfDNA序列信息从基于定序的非侵入式产前测试（NIPT）测试获得。
在一个方面，本公开描述一种在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，该方法包括：
从获自怀孕女性的生物样品中移除完整细胞；
从生物样品中分离细胞游离DNA（cfDNA）分子；
对所得富集的cfDNA进行定序以获得cfDNA序列信息；以及
从cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率
指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，该方法包括：
确定cfDNA内的胎儿分数；以及
确定cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物，cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，该方法包括：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定cfDNA内的胎儿分数；以及
确定cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在一个方面，本公开描述了一种方法，该方法包括：
a)访问来自cfDNA的序列读段并确定：
i)cfDNA浓度；
ii)cfDNA内的胎儿分数；
iii)cfDNA内的片段大小分布；和/或
iv)包括胎儿分数和片段大小分布的参数；
b)比较
i)cfDNA浓度与第一阈值量；
ii)胎儿分数与第二阈值量；
iii)片段大小分布与第三阈值量；和/或
iv)包括胎儿分数和片段大小分布的参数与第四阈值量；
其中第一阈值量、第二阈值量、第三阈值量和第四阈值量是基于多个正常样品确定的；
c)确定怀孕女性受试者具有先兆子痫和/或先兆子痫风险升高，其中
i)cfDNA浓度高于第一阈值量；
ii)胎儿分数低于第二阈值量；
iii)片段大小分布高于第三阈值量；并且/或者
iv)包括胎儿分数和片段大小分布的参数小于第四阈值量；
指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，生物样品是从妊娠期小于16周的怀孕女性获得的。
在本文所公开的方法的一些方面，生物样品是从妊娠期为约11周至约14.2周的怀孕女性受试者获得的。
在本文所公开的方法的一些方面，生物样品是从妊娠期超过20周的怀孕女性获得的。
在本文所公开的方法的一些方面，生物样品是从妊娠期为约17.6周至约25.5周的怀孕女性受试者获得的。
在本文所公开的方法的一些方面，检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测早发型先兆子痫和/或确定早发型先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测晚发型先兆子痫和/或确定晚发型先兆子痫风险升高。
在本文所公开的方法的一些方面，生物样品包括全血、血清或血浆。
在本文所公开的方法的一些方面，该方法还包括向怀孕女性提供选自由以下组成的组的治疗干预措施：增加产前访视频率、降低血压的抗高血压药物、皮质类固醇药物、抗惊厥药物、卧床休息、住院治疗、早期分娩以及它们的组合，和/或用低剂量阿司匹林治疗怀孕女性，其中低剂量阿司匹林包括每天约50mg至约150mg。
在一个方面，本公开描述一种系统，该系统包括一个或多个微处理器和存储器，该存储器包括能够由该一个或多个微处理器执行的指令，并且该存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中该序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由该一个或多个微处理器执行的指令被配置为执行本文所述的方法。
在一个方面，本公开描述一种机器，该机器包括一个或多个微处理器和存储器，该存储器包括能够由该一个或多个微处理器执行的指令，并且该存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中该序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由该一个或多个微处理器执行的指令被配置为执行本文所述的方法。
在一个方面，本公开描述一种非暂态计算机可读存储介质，可执行程序存储在所述非暂态计算机可读存储介质上，其中所述程序指示微处理器访问映射到参考基因组的序列读段并且执行本文所述的方法。
如本文所用，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖（例如，存在于脱氧核糖核酸（DNA）中）或核糖（例如，存在于核糖核酸（RNA）中）。核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可包括天然的或非天然的碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。术语“模板”和“靶”当用于提及核酸时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符，并且不一定限制核酸的结构或功能，除非另有明确指示。
如本文所用，“扩增”或“扩增反应”及其派生词通常是指核酸分子的至少一部分被复制或拷贝到至少一个另外的核酸分子中的任何动作或过程。另外的核酸分子任选地包含与靶核酸分子的至少一些部分基本上相同或基本上互补的序列。靶核酸分子可为单链或的双链的，并且另外的核酸分子可独立地为单链的或双链的。扩增任选地包括线性或指数复制核酸分子。在一些实施方案中，这种扩增可使用等温条件进行；在其他实施方案中，这种扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是多重扩增，其包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或组合扩增基于DNA和RNA的核酸的至少一些部分。扩增反应可包括本领域普通技术人员已知的任何扩增过程。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应（PCR）。
如本文所用，“扩增条件”及其派生词通常是指适于扩增一个或多个核酸序列的条件。这种扩增可以是线性的或指数的。在一些实施方案中，扩增条件可包括等温条件，或者另选地可包括热循环条件，或者等温条件和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适用于扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链反应（PCR）条件。通常，扩增条件是指足以扩增核酸（例如一个或多个靶序列）或扩增连接至一个或多个衔接子的靶序列（例如，衔接子连接的经扩增靶序列）的反应混合物。一般来讲，扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增核酸具有一定程度互补性的引物；以及核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP），从而一旦与核酸杂交就促进引物的延伸。扩增条件可能需要引物与核酸的杂交或退火、引物的延伸和其中延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离的变性步骤。通常，但不是必须的，扩增条件可包括热循环；在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离的步骤。通常，扩增条件包括阳离子诸如Mg++或Mn++，并且还可包括各种离子强度改性剂。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”（“PCR”）是指美国专利第4,683,195号和第4,683,202号的方法，其描述了用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中所关注多核苷酸的区段的浓度的方法。该扩增所关注多核苷酸的方法包括将大量过量的两种寡核苷酸引物引入包含所需所关注多核苷酸的DNA混合物中，然后在存在DNA聚合酶的情况下进行一系列热循环。这两种引物与它们相应的所关注双链多核苷酸的链互补。首先将混合物在较高温度下变性，然后将引物与所关注多核苷酸分子内的互补序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复多次（称为热循环），以获得高浓度的期望的所关注多核苷酸的扩增片段。期望的所关注多核苷酸（扩增子）的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此，该长度是可控参数。由于重复该过程，该方法被称为“聚合酶链反应”（下文“PCR”）。因为所关注多核苷酸的期望扩增片段成为混合物中的主要核酸序列（就浓度而言），所以认为它们是“PCR扩增的”。在上述方法的修改形式中，可使用多个不同的引物对（在一些情况下，每个所关注的靶核酸分子一个或多个引物对）PCR扩增靶核酸分子，从而形成多重PCR反应。
如本文所用，术语“引物”及其派生词通常是指可与所关注靶序列杂交的任何多核苷酸。通常，引物用作底物，核苷酸可以通过聚合酶聚合到该底物上；然而，在一些实施方案中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。这些术语应理解为包括由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物作为等同物，并且适用于单链（诸如有义或反义）和双链多核苷酸。如本文所用，该术语还涵盖cDNA，即由RNA模板例如通过逆转录酶的作用产生的互补DNA或拷贝DNA。该术语仅是指分子的主要结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸（“DNA”），以及三链、双链和单链核糖核酸（“RNA”）。
如本文所用，术语“文库”和“测序文库”是指在其5'末端共用共同序列并且在其3'末端共用共同序列的模板分子集合或多个模板分子。在其3'末端和5'末端含有已知的共同序列的模板分子集合也可以称为3'和5'修饰文库。
如本文所用，术语“流通池”是指包括固体表面的室，一种或多种流体试剂可流过该固体表面。可以容易地用于本公开的方法中的流通池以及相关流体系统和检测平台的示例描述于例如以下文献中：Bentley等人，Nature 456:53-59 (2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082。
如本文所用，术语“阵列”是指可根据相对位置彼此区分的一组位点。位于阵列的不同位点处的不同分子可根据位点在阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个位点可包含一种或多种特定类型的分子。例如，位点可包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可包含具有相同序列（和/或其互补序列）的若干核酸分子。阵列的位点可以是位于同一基底上的不同特征。示例性特征包括但不限于基板中的孔、基板中或基板上的小珠（或其他粒子）、基板的突出部、基板上的脊或基板中的通道。阵列的位点可以是各自带有不同分子的单独的基底。可根据基底在与基底相关联的表面上的位置，或者根据基底在液体或凝胶中的位置，来识别附接到单独基底的不同分子。其中单独的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有小珠的那些阵列。
本文中术语“下一代测序（NGS）”是指允许对克隆扩增分子和单个核酸分子进行大规模平行测序的测序方法。NGS的非限制性实例包括边连接边测序和使用可逆染料终止子的边合成边测序。
如本文所用的术语“灵敏度”等于真阳性的数目除以真阳性和假阴性之和。
如本文所用的术语“特异性”等于真阴性的数目除以真阴性和假阳性之和。
本文中的术语“富集”是指扩增样品的一部分中所包含的核酸的过程。富集包括靶向特定序列（例如多态性序列）的特异性富集，以及扩增样品DNA片段的全基因组的非特异性富集。
本文中术语“母体样品”是指从妊娠受试者（例如，女性）中获得的生物样品。
本文中术语“生物流体”是指取自生物来源的液体，并且包括例如血液、血清、血浆、痰、灌洗液、脑脊液、尿液、精液、汗液、泪液、唾液等。如本文所用，术语“血液”、“血浆”和“血清”明确地涵盖其级分或加工部分。类似地，在样品取自活检、拭子、涂片等的情况中，“样品”明确地涵盖衍生自活检、拭子、涂片等的处理级分或部分。
本文中术语“母体核酸”和“胎儿核酸”分别指妊娠女性受试者的核酸和该妊娠女性受试者所怀的胎儿的核酸。
如本文所用，术语“胎儿分数”是指存在于包含胎儿和母体核酸的样品中的胎儿核酸的分数。胎儿分数通常用于表征母体血液中的cfDNA。
如本文所用，术语“每个”当用于提及参考项目的集合时，旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目，除非文中另外明确指出。
如本文所用，在组合物、制品、核酸或细胞核的上下文中，“提供”意指制备组合物、制品、核酸或细胞核，购买组合物、制品、核酸或细胞核，或以其他方式获得化合物、组合物、制品或细胞核。
术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本公开的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的叙述并不意味着其他实施方案是无用的，也不旨在将其他实施方案排除在本公开的范围之外。
术语“包括”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制的含义。
应当理解，在本文以语言“包括”、“包含”或“含有”等描述实施方案的任何地方，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施方案。
除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多于一个。
同样在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值（例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“某些实施方案”或“一些实施方案”等意指结合该实施方案描述的特定特征、构型、组成或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇的多处出现的此类短语不一定指本公开的相同实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、构型、组成或特性可以任何合适的方式组合。
对于本文所公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以任何可行的顺序进行。并且，视情况而定，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。
本公开的上述发明内容并非旨在描述本公开的每个所公开的实施方案或每种具体实施。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本申请全文的若干地方，通过示例的列表提供了指导，这些示例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表仅用作代表性的组，并且不应理解为排他性列表。
附图说明
图1A至图1D.在时间点A处，使用cfDNA信号来区分晚期PE、早期PE和对照样品。使用时间点A处的浓度来区分这三个患者群组（图1A）；使用时间点A处的片段大小分布来区分这三个患者群组（图1B）；使用时间点A处的胎儿分数来区分这三个患者群组（图1C）；线性回归曲线图显示了在时间点A处，使用胎儿分数和片段大小分布来区分PE样品和对照样品（图1D）。星号（*）代表特定PE组与对照组之间的显著性。
图2A-2D.在时间点B处，使用cfDNA信号来区分晚期PE、早期PE和对照样品。使用时间点B处的浓度来区分这三个患者群组（图2A）；使用时间点B处的片段大小分布来区分这三个患者群组（图2B）；使用时间点B处的胎儿分数来区分这三个患者群组（图2C）；线性回归曲线图显示了在时间点B处，使用胎儿分数和片段大小分布来区分PE样品和对照样品（图2D）。星号（*）代表特定PE组与对照组之间的显著性。
图3A和图3B.图3A是在时间点A处的胎儿分数-片段大小分布-浓度的图。图3B是在时间点B处的胎儿分数-片段大小分布-浓度的图。
图4.图4是显示在时间点A处，使用胎儿分数和片段大小分布来区分PE样品和对照样品的线性回归曲线图。PE样品由正方形表示。对照样品由正方形表示。
图5.图5是概率对结果的曲线图。
示意图未必按比例绘制。附图中使用的类似标号可以指代类似的部件。然而，应当理解，在给定附图中使用数字来指代部件并非旨在限制在另一附图中用相同数字标记的部件。此外，使用不同的数字来指代部件并非旨在指示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或类似。
具体实施方式
本公开确定了细胞游离DNA（cfDNA）可用作用于鉴定具有发展为先兆子痫（PE）风险的患者的高效生物标志物。使用逻辑回归模型，浓度、胎儿分数和片段大小分布这三个cfDNA信号与临床结果关联。例如，在时间点A处（约11至约14.2周妊娠），在PE患者与对照病例之间观察到所有三种cfDNA信号的显著差异，而在时间点B处（约17.6至约25.5周妊娠），在PE患者与对照病例之间，胎儿分数和浓度两者均显著不同。总体而言，在时间点A处，该模型的灵敏度高达100%并且特异性高达87.5%。使用该逻辑回归模型可鉴定妊娠前三个月中有风险的患者。
本公开包括在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，该方法包括提供从获自怀孕女性受试者的生物样品获得的cfDNA序列信息，并且确定cfDNA浓度，确定cfDNA内的胎儿分数，和/或从cfDNA序列信息确定片段大小分布。
通过本文所公开的方法，相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度、相对于正常对照物的较低的cfDNA内的胎儿分数、相对于正常对照物的较高的片段大小分布和/或在正常对照物中小于该比率的胎儿分数与片段大小分布的比率指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在一些实施方案中，这三个cfDNA信号中的两个信号可以经测量，并且可以指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。例如，可以确定cfDNA浓度和胎儿分数，其中相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度和相对于正常对照物的较低的cfDNA内的胎儿分数指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。在一些实施方案中，可以确定cfDNA浓度和片段大小分布，其中相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度和相对于正常对照物的较高的片段大小分布指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。或者，可以确定胎儿分数和片段大小分布，其中相对于正常对照物的cfDNA内的较低的胎儿分数和相对于正常对照物的较高的片段大小分布指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在一些实施方案中，所有三个cfDNA信号中的两个信号可以经确定，并且可以指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。例如，确定cfDNA浓度、胎儿分数和片段大小分布，其中相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度、相对于正常对照物的cfDNA内的较低的胎儿分数和相对于正常对照物的较高的片段大小分布指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
在一些实施方案中，这三个cfDNA信号中的两个信号的比率可以指示怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。例如，小于在正常对照物中的该比率的胎儿分数与片段大小分布的比率指示妊娠女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。在另一个实施方案中，相对于正常对照物中的该比率，cfDNA浓度与胎儿分数的比率可指示妊娠女性中的先兆子痫和/或先兆子痫的风险升高。在另一个实施方案中，相对于正常对照物中的该比率，cfDNA浓度与片段大小分布的比率可以指示妊娠女性中的先兆子痫和/或先兆子痫的风险升高。
母体血浆中循环的胎儿来源的细胞游离DNA（cfDNA）的浓度称为胎儿分数（FF）。胎儿分数浓度是来源于胎儿的样品中的总细胞游离DNA（cfDNA）的百分比。
在一些具体实施中，一个或多个胎儿分数值包括使用关于细胞游离核酸片段大小的信息计算的胎儿分数值。在一些具体实施中，通过获得片段大小的频率分布来计算胎儿分数值；以及将该频率分布应用于将胎儿分数与片段大小的频率相关联的模型，以获得胎儿分数值。在一些具体实施中，将胎儿分数与片段大小的频率相关的模型包括具有针对多个片段大小的多个项和系数的一般线性模型。
在一些具体实施中，该一个或多个胎儿分数值包括使用参考基因组的仓的覆盖信息计算的胎儿分数值。在一些具体实施中，通过将多个仓的覆盖值应用于将胎儿分数与仓的覆盖相关的模型以获得胎儿分数值来计算胎儿分数值。在一些具体实施中，将胎儿分数与仓的覆盖相关的模型包括具有针对多个仓的多个项和系数的一般线性模型。在一些具体实施中，该多个仓在训练样品中的胎儿分数与覆盖之间具有高相关性。在美国专利号10622094中描述了此种方法的一个示例，其内容以引用方式全文并入本文。
在一些具体实施中，该一个或多个胎儿分数值包括使用在读段中发现的多个8聚体的频率计算的胎儿分数值。在一些具体实施中，通过将多个8聚体的频率应用于将胎儿分数与8聚体频率相关的模型以获得胎儿分数值，来计算胎儿分数值。在一些具体实施中，将胎儿分数与8聚体频率相关的模型包括具有针对多个8聚体的多个项和系数的一般线性模型。在一些具体实施中，该多个8聚体在胎儿分数与8聚体频率之间具有高相关性。
在一些具体实施中，该一个或多个胎儿分数值包括使用性染色体的仓的覆盖信息计算的胎儿分数值。
在某些实施方案中，根据男性胎儿特异性的标记（例如，Y-染色体STR标记（例如，DYS 19、DYS 385、DYS 392标记）；RhD阴性女性的RhD标记）、多态序列的等位基因比率或根据胎儿核酸而非母体核酸特异性的一个或多个标记（例如，母亲与胎儿之间的差异表观遗传生物标记（例如，甲基化；下文进一步详细描述）或母体血浆中的胎儿RNA标记。
胎儿核酸含量（例如，胎儿分数）的确定有时使用胎儿定量分析（FQA）来进行。该类型的测定法允许基于样品中的核酸的甲基化状态来检测和定量母体样品中的胎儿核酸。在某些实施方案中，可相对于所存在的核酸的总量来确定来自母体样品的胎儿核酸的量，从而提供样品中的胎儿核酸的百分比。用于基于甲基化状态来区分核酸的方法包括但不限于甲基化敏感性捕获，例如使用MBD2-Fc片段，其中MBD2的甲基结合结构域融合至抗体的Fc片段（MBD-FC）；甲基化特异性抗体；亚硫酸氢盐转化方法，例如，MSP（甲基化敏感性PCR）、COBRA、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE）或Sequenom MassCLEAVE™技术；以及甲基化敏感性限制性酶的使用（例如，使用一种或多种甲基化敏感性限制性酶消化母体样品中的母体DNA，从而富集胎儿DNA）。甲基敏感性酶还可用于基于甲基化状态来区分核酸，从而例如在其DNA识别序列未甲基化时可优先或基本上在该序列处裂解或消化。因此，未经甲基化的DNA样品会被切成比甲基化的DNA样品更小的片段，而高甲基化的DNA样品不会被裂解。
在某些实施方案中，可以基于多态性序列（例如，单核苷酸多态性（SNP））的等位基因比率来确定胎儿分数。在此类方法中，针对母体样品获得核苷酸序列读段，并通过比较在参考基因组中的信息多态位点（例如，SNP）处映射至第一等位基因的核苷酸序列读段的总数与映射至第二等位基因的核苷酸序列读段的总数来确定胎儿分数。在某些实施方案中，通过例如在样品中的胎儿和母体核酸的混合物中，相比于母体核酸对混合物的较大贡献，胎儿等位基因的相对较小贡献来识别胎儿等位基因。因此，对于多态位点的两个等位基因中的每个等位基因而言，可作为映射至参考基因组上的靶核酸序列的独特序列读段的总数的参数来确定母体样品中的胎儿核酸的相对丰度。
可以测量cfDNA的样品中不同大小片段的分布，并且与参考样品的片段大小分布进行比较。测量片段大小分布的一种方式是利用累积分布函数。可以使用本领域的技术人员已知的许多方法中的任一种将测试样品的片段大小分布与参考（或期望的）分布进行比较。在一些实施方案中，可以应用Kolmogorov- Smirnov测试（K-S测试）来将样品分布与参考概率分布进行比较。在一些实施方案中，可以应用自相关来将样品分布与参考概率分布进行比较。在一些实施方案中，可以应用互相关来将样品分布与参考概率分布进行比较。例如，在本文呈现的实施方案中，“frag_size_dist”是在cfDNA的分析期间产生的度量，并且被定义为实际与期望的累积片段大小分布之间的差异的标准偏差。
合适的对照物可以是正常对照物，例如，来自健康的、孕龄匹配的怀孕女性的样品。在一些实施方案中，适当对照物的结果已经预先获得，并且作为历史结果被记录和存储在例如电子存储介质上。
虽然体内的大部分DNA和RNA位于细胞内，但是也可能发现细胞外核酸在血液中自由循环。细胞游离DNA（cfDNA）是指血流中未被包裹的DNA。细胞游离DNA是通过细胞死亡的自然过程释放到血流中的DNA的短片段。它是由Mandel和Metais在1948年首次发现的（Mandel和Metais, 1948, C R Seances Soc Biol Fil；142:241-243）。cfDNA可见于血浆和其他体液中。
先前的研究已经指示大多数血浆cfDNA分子来源于健康个体的造血系统（Lui等人，2002, Clin Chem; 48:421-427；以及Sun等人，2015, Proc Natl Acad Sci USA; 112:E5503-E5512）。然而，在某些生理或病理条件下，诸如妊娠、器官移植和癌症，相关/受影响的组织将额外的DNA释放到周边循环中（Leon等人，1977, Cancer Res; 37:646-650；Lo等人，1997, Lancet; 350:485-487；以及Lo等人，1998, Lancet; 351 : 1329-1330）。
近年来，基于cfDNA分析的多种技术已经出现，用于非侵入式产前测试（NIPT）（Lo等人，1997, Lancet; 350:485-487；Lo等人，2007, Proc Natl Acad Sci USA; 104:13116-13121；Hyett等人，2005, Prenat Diagn; 25: 1111-1116；Wong和Lo，2015, TrendsMol Med; 21 :98-108；Hudecova和Chiu，2017, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol;39:63-73；Bianchi和Chiu，2018, N Engl J Med; 379:464-473；Malan等人，2018, JAMA;320:557-565；Vivanti等人，2019, Ultrasound Obstet Gynecol; 53:87-94；以及ZhangJ.等人，2019, Nat Med; 25:439-447），用于监测器官移植（Lo等人，1998, Lancet; 351 :1329-1330；Gielis等人，2015, Am J Transplant; 15:2541-2551；Gala-Lopez等人，2018,Transplantation; 102:978-985；以及Sherwood和Weimer，2018），并且用于检测免疫性疾病（Zhang等人，2014；Beranek等人，2017, Arch Dermatol Res; 309:815-821；Dunaeva等人，2018, Mol Neurobiol; 55:4681-4688；Xu等人，2018, Eur J Clin Invest; 48:el3015；以及Duvvuri和Lood，2019, Front Immunol; 10:502）以及癌症。
在怀孕期间，母亲的血液包含细胞游离DNA（cfDNA），既来自她自己的组织，也通过胎盘来自胎儿。母体血液中的总cfDNA的约2%-20%是胎盘的（Barrett等人，2011, PLoSOne; 6(10):e25202；以及Nigam等人，2012, J Interntl Med Sci Acad; 25(3): 119-120）。
近年来，产前测试一直朝着非侵入式方法发展，以确定胎儿遗传疾病的风险。2011年10月，在美国，使用母体循环中的cfDNA进行胎儿染色体异常的非侵入式产前测试（NIPT）在临床上可用。经由各种分子方法来测定母体血浆中存在的细胞游离胎儿DNA现在被用于鉴定一系列胎儿染色体非整倍体，诸如例如，21三体、13三体和18三体，确定胎儿的性别，并且鉴定各种基因突变，诸如例如泰-萨二氏病、镰状细胞性贫血、地中海贫血、囊性纤维化、肌营养不良和脆性X综合征。使用母体循环中的细胞游离DNA进行胎儿染色体异常的非侵入式产前测试可以用于筛查目的或用于诊断目的。
本文所述方法的与先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的诊断相关联的母体循环中的cfDNA的检测、定量和/或表征可涉及多种技术中的任一种技术，包括但不限于多种高通量定序技术中的任一种技术。例如，用于测定cfDNA的方法包括但不限于本文所述的方法或本文提供的示例中使用的方法。
在一些实施方案中，所述方法的与先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的诊断相关联的母体循环中的cfDNA的检测、定量和/或表征可以作为母体样品的NIPT非整倍性筛查的一部分进行。与先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的诊断相关联的母体循环中的cfDNA的检测、定量和/或表征可以在例如进行这种NIPT分析之前、同时或之后进行。在此处呈现的某些实施方案中，先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的检测利用了在NIPT分析期间获得的某些度量。例如，可以在NIPT分析中确定的一些度量包括总cfDNA浓度、片段大小、片段大小分布和胎儿分数。由于母体血浆样品表示母体和胎儿cfDNA的混合物，因此任何给定NIPT方法的成功取决于其对检测低胎儿分数样品中拷贝数变异的灵敏度。对于基于计数的方法，它们的灵敏度取决于(a)测序深度和(b)数据归一化减小技术差异的能力。用于NIPT和其他应用的分析方法可以包括通过从例如配对端读段中推导片段大小信息，并且在分析管线中使用该信息。提高的分析灵敏度提供了在覆盖度降低（例如，测序深度降低）时应用NIPT方法的能力，这使得该技术能够用于对平均风险妊娠的低成本检测。
典型的NIPT分析流水线包括确定测试样品中的不同所关注序列的拷贝数和拷贝数变异（CNV），该测试样品包含来源于两种或更多种不同基因组的核酸混合物，并且已知或疑似一种或多种所关注序列的量不同。通过此种方法确定的拷贝数变异包括整个染色体的获得或丢失，涉及显微镜可见的非常大的染色体片段的改变，以及DNA片段的大量亚显微镜拷贝数变异，范围从单个核苷酸到千碱基（kb）到兆碱基（Mb）大小。
NIPT分析的一些具体实施包括cfDNA的片段长度（或片段大小），以改善从母体血浆中的cfDNA检测胎儿非整倍体的灵敏度和特异性。一些实施方案使用无PCR文库制备外加配对末端DNA测序来实施。在一些实施方案中，利用片段大小和覆盖来增强胎儿非整倍性检测。在一些实施方案中，该方法包括将较短片段的独立计数与较短片段在跨基因组的仓中的相对分数相结合。
NIPT分析的一些具体实施包括通过移除样品内GC含量偏差来改善序列数据分析的灵敏度和/或特异性的方法。在一些实施方案中，样品内GC含量偏差的移除基于针对跨未受影响的训练样品常见的系统变异而校正的序列数据。
NIPT分析的一些具体实施包括从细胞游离核酸片段获得具有高信噪比的参数的方法，用于确定与拷贝数和CNV相关的各种遗传条件，相对于常规方法具有改善的灵敏度、选择性和/或效率。这些参数包括但不限于覆盖、片段大小加权覆盖、片段在所定义范围内的分数或比率、片段的甲基化水平、从覆盖获得的t统计、从覆盖信息获得的胎儿分数估计等。已经发现所描绘的过程特别有效地改善来自所考虑的基因组（例如，胎儿的基因组）的具有相对低分数DNA的样品中的信号。这种样品的示例是来自怀有异卵双胞胎、三胞胎等的个体的母体血液样品，其中该过程评估其中一个胎儿的基因组中的拷贝数变异。
在NIPT分析的一些具体实施中，可使用不需要PCR扩增的非常低的cfDNA输入，通过简单的文库制备来实现高分析灵敏度和特异性。无PCR方法简化了工作流程，改善了周转时间，并且消除了PCR方法固有的偏差。在一些实施方案中，来自母体血浆的胎儿非整倍体的检测可以比常规方法更稳健和高效，需要更少的独特cfDNA片段。两者相结合，以非常低的cfDNA片段数、以非常快速的周转时间实现了改善的分析灵敏度和特异性。这有可能使NIPT以低得多的成本进行，以促进在普通产科群体中的应用。
在NIPT分析的各种具体实施中，利用所公开的方法，无PCR的文库制备是可能的。一些具体实施消除了PCR方法的固有偏差，降低了测定复杂性，减少了所需要的定序深度（低2.5x），提供了更快的周转时间，例如一天周转一次，实现了过程中的胎儿分数（FF）测量，便于使用片段大小信息来区分母体和胎儿/胎盘cfDNA。
在一些实施方案中，作为NIPT方案的一部分，使用诸如美国专利号10,095,831中描述的方法，进行与先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的诊断相关联的母体循环中的cfDNA的检测、定量和/或表征，该专利的内容以引用的方式全文并入本文。在一些实施方案中，作为NIPT方案的一部分，使用诸如Illumina的VERISEQ™ NIPT Solution v2测定（Illumina, Inc., Foster City, CA）的方法，进行与先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的诊断相关联的母体循环中的cfDNA的检测、定量和/或表征。
样品可以是生物样品，包括但不限于血液、血清、血浆、汗液、泪液、尿液、痰液、淋巴液、唾液、羊水、组织活检物、拭子或涂片，包括例如但不限于胎盘组织样品。在一些优选的实施方案中，生物样品是无细胞血浆样品。生物样品可以是从怀孕女性受试者获得的母体样品。
如本文所用，术语“受试者”是指人类受试者以及非人类哺乳动物受试者。虽然本文的实施例涉及人类，并且该语言主要针对人类问题，但是本公开的概念适用于任何哺乳动物，并且可用于兽医、动物科学、研究实验室等领域。
受试者可以是怀孕女性，包括处于怀孕的任何妊娠阶段的怀孕女性。怀孕的妊娠阶段可以是例如第一孕期、第二孕期（包括第二孕期的晚期）或第三孕期（包括第三孕期的早期）。
在一些实施方案中，怀孕的妊娠阶段可以是例如怀孕约10周之前、怀孕约11周之前、怀孕约12周之前、怀孕约16周之前、怀孕约20周之前或怀孕约25周之前。
在一些实施方案中，怀孕的妊娠阶段可以是，例如，约10周妊娠期、约11周妊娠期、约12周妊娠期、约13周妊娠期、约14周妊娠期、约15周妊娠期、约16周妊娠期、约17周妊娠期、约18周妊娠期、约19周妊娠期、约20周妊娠期、约21周妊娠期、约22周妊娠期、约23周妊娠期、约24周妊娠期、约25周妊娠期、约26周妊娠期、约27周妊娠期、约28周妊娠期、约29周妊娠期、约30周妊娠期、约31周妊娠期、约32周妊娠期、约33周妊娠期、约34周妊娠期、约35周妊娠期、约36周妊娠期或其任何范围。例如，在一些实施方案中，怀孕的妊娠阶段可以是，例如，约8至约18周的妊娠期、约9至约12周的妊娠期、约9至约14周的妊娠期、约10至约14周的妊娠期、约10至约15周的妊娠期、约11至约14周的妊娠期、约11至约13周的妊娠期、约11至约15周的妊娠期、约12至约13周的妊娠期、约12至约14周的妊娠期、约12至约28周的妊娠期、约13至约16周的妊娠期、约17至约20周的妊娠期、约17至约25周的妊娠期、约17至约26周的妊娠期、约18至约26周的妊娠期、约21至约24周的妊娠期、约24至约27周的妊娠期或约25至约28周的妊娠期。
在一些实施方案中，怀孕的妊娠阶段可以是，例如，约11至约14.2周妊娠期或17.6至约25.5周妊娠期。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以检测早发型先兆子痫和/或确定早发型先兆子痫的风险升高，其中早发型先兆子痫是在妊娠期约34周之前发生的先兆子痫。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以检测晚发型先兆子痫和/或确定晚发型先兆子痫的风险升高，其中晚发型先兆子痫是在妊娠期约34周时或其之后发生的先兆子痫。
本公开包括用于诊断先兆子痫和识别有患上先兆子痫的风险的怀孕妇女的试剂盒。试剂盒是任何包含至少一种试剂的制品（例如，包装或容器），该试剂用于特异性检测、定量和/或表征如本文所述的母体循环内指示先兆子痫或发展为先兆子痫的风险的浓度、胎儿分数和/或片段大小分布的cfDNA信号。试剂盒可作为用于执行本公开的方法的单元来宣传、分销或销售。
在母体循环中发现的指示先兆子痫的细胞游离DNA生物标志物在用于诊断先兆子痫和鉴定有发展为先兆子痫的风险的怀孕妇女的非侵入式方法中的用途可以与适当的监测和医疗管理相结合。例如，可能需要进一步的测试。这种测试可以包括例如用于测量肝功能、肾功能和/或血小板和各种凝血蛋白的血液测试，用于测量蛋白质或肌酸酐水平的尿液分析，用于测量监测胎儿生长、体重和羊水的胎儿超声，用于通过胎儿运动来测量胎儿心率的无应激测试，以及/或者使用超声来测量胎儿的呼吸、肌肉张力和运动以及可能需要的羊水体积的胎儿生理活动评估。治疗干预措施可以包括例如增加产前就诊的频率、抗高血压药物以降低血压、皮质类固醇药物、抗惊厥药物、卧床休息、住院和/或提前分娩。参见例如，Townsend等人，2016 “Current best practice in the management of hypertensivedisorders in pregnancy,” Integr Blood Press Control；9: 79-94。
治疗干预措施可以包括向被识别为有患上先兆子痫的风险的怀孕妇女施用低剂量阿司匹林。最近的一项多中心、双盲、安慰剂对照试验证明，与安慰剂相比，用低剂量阿司匹林治疗早产型先兆子痫高风险女性导致该诊断的发生率较低（Rolnik等人，2017, NEngl J Med; 377(7):613-622）。随机试验的荟萃分析发现，在妊娠期16周之前开始服用适当每日剂量的阿司匹林可以预防大多数PE病例及其相关并发症（Bujold, 2022,Hypertension; 79:323-324；Bujold等人，2010, Obstet Gynecol; 116:402-414；以及Roberge等人，2018, Am J Obstet Gynecol; 218(3):287-293el）。美国妇产科医师学会（ACOG）建议，具有任何PE高风险因素的妇女和具有多于一个中度风险因素的妇女应在妊娠期12至28周（优选地在妊娠期16周之前）开始接受低剂量阿司匹林，直到分娩（ACOGPractice Bulletin, Number 222. Gestational Hypertension and Preeclampsia.Obstetrics and gynecology 2020, 135, e237-e260, doi: 10.1097/aog.0000000000003891）。因此，最好在妊娠前三个月进行PE筛查。
低剂量阿司匹林的剂量包括但不限于每天约50mg至约150mg、每天约60mg至约80mg、每天约100mg或更多mg，或每天约150mg。施用可以例如在妊娠16周或之前，或者从妊娠11周至14周开始。施用可以持续到妊娠36周。
本公开还包括一种系统，该系统包括一个或多个微处理器和存储器，该存储器包括能够由该一个或多个微处理器执行的指令，并且该存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中该序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由该一个或多个微处理器执行的指令被配置为执行本文所述的方法。
本公开还包括包含一个或多个微处理器和存储器的机器，该存储器包括能够由一个或多个微处理器执行的指令，并且该存储器包含映射到参考基因组的序列读段，其中所述序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中该一个或多个微处理器可执行的指令被配置为执行本文所述的方法。
本公开还包括一种非暂态计算机可读存储介质，可执行程序存储在所述非暂态计算机可读存储介质上，其中所述程序指示微处理器访问映射到参考基因组的序列读段并且执行本文所述的方法。
示例性方面
本发明在权利要求书中限定。然而，下文提供了非限制性示例性方面的非穷举性列表。这些方面的特征中的任何一个或多个特征可与本文所述的另一示例、实施方案或方面的任何一个或多个特征组合。本发明的示例性实施方案包含但不限于以下：
方面1包括在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，该方法包括：
提供从获自所述怀孕女性受试者的生物样品获得的细胞游离DNA（cfDNA）序列信息；以及
从所述cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
方面2是根据方面1所述的方法，其中所述cfDNA序列信息从基于定序的非侵入式产前测试（NIPT）测试获得。
方面3是一种在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法个体，所述方法包括：
从获自所述怀孕女性的生物样品中移除完整细胞；
从所述生物样品中分离细胞游离DNA（cfDNA）分子；
对所得富集的cfDNA进行定序以获得cfDNA序列信息；以及
从所述cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
方面4是根据方面1至3中任一项所述的方法，所述方法包括：
确定所述cfDNA内的胎儿分数；以及
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
方面5是根据方面1至4中任一项所述的方法，所述方法包括：
确定细胞游离DNA（cfDNA）浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；以及
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
方面6是一种方法，所述方法包括：
a)访问来自cfDNA的序列读段并确定：
i)cfDNA浓度；
ii)所述cfDNA内的胎儿分数；
iii)所述cfDNA内的片段大小分布；和/或
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的参数；
b)比较
i)所述cfDNA浓度与第一阈值量；
ii)所述胎儿分数与第二阈值量；
iii)所述片段大小分布与第三阈值量；和/或
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的所述参数与第四阈值量；
其中所述第一阈值量、第二阈值量、第三阈值量和第四阈值量是基于多个正常样品确定的；
c)确定所述怀孕女性受试者具有先兆子痫和/或先兆子痫风险升高，其中
i)所述cfDNA浓度高于所述第一阈值量；
ii)所述胎儿分数低于所述第二阈值量；
iii)所述片段大小分布高于所述第三阈值量；并且/或者
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的所述参数小于所述第四阈值量；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
方面7是根据方面1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期小于16周的所述怀孕女性获得的。
方面8是根据方面1至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期为约11周至约14.2周的所述怀孕女性受试者获得的。
方面9是根据方面1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期大于20周的所述怀孕女性获得的。
方面10是根据方面1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期为约17.6周至约25.5周的所述怀孕女性受试者获得的。
方面11是根据方面1至10中任一项所述的方法，其中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测早发型先兆子痫和/或确定早发型先兆子痫风险升高。
方面12是根据方面1至10中任一项所述的方法，其中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测晚发型先兆子痫和/或确定晚发型先兆子痫风险升高。
方面13是根据方面1至12中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括全血、血清或血浆。
方面14是根据方面1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述怀孕女性提供选自由以下组成的组的治疗干预措施：增加产前访视频率、降低血压的抗高血压药物、皮质类固醇药物、抗惊厥药物、卧床休息、住院治疗、早期分娩以及它们的组合，和/或用低剂量阿司匹林治疗所述怀孕女性，其中低剂量阿司匹林包括每天约50mg至约150mg。
方面15是一种系统，所述系统包括一个或多个微处理器和存储器，所述存储器包括能够由所述一个或多个微处理器执行的指令，并且所述存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中所述序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由所述一个或多个微处理器执行的所述指令被配置为执行根据方面1至14中任一项所述的方法。
方面16是一种机器，所述机器包括一个或多个微处理器和存储器，所述存储器包括能够由所述一个或多个微处理器执行的指令，并且所述存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中所述序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由所述一个或多个微处理器执行的所述指令被配置为执行根据方面1至14中任一项所述的方法。
方面17是一种非暂态计算机可读存储介质，可执行程序存储在所述非暂态计算机可读存储介质上，其中所述程序指示微处理器访问映射到参考基因组的序列读数并且执行根据方面1至14中任一项所述的方法。
通过以下实施例说明本发明。应当理解，应当根据如本文所述的本发明的范围和实质广义地解释特定实施例、材料、量和程序。
实施例
实施例1
使用细胞游离DNA信号作为早期和简易预测先兆子痫的生物标志物
先兆子痫（PE）是全球孕产妇和围产期发病率的主要原因。然而，目前的筛查方法很复杂，并且需要特殊的技能要求。在本实施方案中，评估了细胞游离（cf）DNA作为鉴定有风险患者的高效生物标志物。在加拿大一家私人产前诊所就诊的一百名患者在其妊娠前三个月登记，并且在妊娠期11.0-14.2周（时间点A）和17.6-25.5周（时间点B）进行抽血。十二名患者发展为PE，其中四名为早期PE，并且八名为晚期PE。CfDNA信号，即浓度、胎儿分数和片段大小分布，与测试群体的临床结果相关，以建立逻辑回归模型。在时间点A处，在PE患者与对照病例之间观察到所有三个cfDNA信号的显著差异，而在时间点B处，PE患者与对照病例之间的胎儿分数和浓度两者显著不同。总体而言，该模型在时间点A处具有高达100%的灵敏度和高达87.5%的特异性。该研究表明，使用该逻辑回归模型可以在妊娠前三个月鉴定具有先兆子痫风险的患者。
概述
在世界范围内，先兆子痫（PE）通常影响2%-8%的怀孕女性，并且是孕产妇和围产期发病率的主要原因之一（Steegers等人，2010, Lancet, 376(9741):631-644）。严重的PE可导致早产、胎儿生长受限、母亲多器官功能障碍、母亲癫痫发作和围产期死亡，每年有76,000名妇女和500,000名婴儿死于这种疾病（Poon等人，2019, Int J Gynaecol Obstet;145(Suppl 1): 1-33；以及Bujold, 2022, Hypertension; 79:323-324）。此外，具有PE的母亲和来自受影响怀孕的子女具有长期心血管疾病和慢性病的风险升高，发展为早产PE的妇女的预期寿命平均减少10年（Poon等人，2019, Int J Gynaecol Obstet; 145(Suppl1): 1-33；以及Chaemsaithong等人，2022, Am J Obstet Gynecol; 226(2S):S1071-S1097.e2）。先兆子痫是具有高度可变的临床表现的多方面的综合征，并且可分为两个主要亚型，即早发型PE和晚发型PE。国际妊娠期高血压研究学会（ISSHP）将（新）PE分类为妊娠高血压，伴有妊娠期≥20周的三种新发疾病中的一种，即蛋白尿、其他母体终末器官功能障碍或子宫胎盘功能障碍（Magee等人，2022, Pregnancy Hypertens; 27:148-169）。
存在许多与PE发展相关联的风险因素，包括高龄产妇、慢性高血压、诸如抗磷脂抗体综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、孕前糖尿病和多胎妊娠（Poon等人，2019,Int J Gynaecol Obstet; 145(Suppl 1): 1-33；以及Burton等人，2019, BMJ; 366:12381）。目前，对PE没有特殊的治疗，过早引产是严重病例的唯一治疗。随机试验的荟萃分析发现，在妊娠期16周之前开始服用适当每日剂量的阿司匹林可以预防大多数PE病例及其相关并发症（Bujold, 2022, Hypertension; 79:323-324；Bujold等人，2010, ObstetGynecol; 116:402-414；以及Roberge等人，2018, Am J Obstet Gynecol; 218(3):287-293e1）。美国妇产科医师学会（ACOG）建议，具有任何PE高风险因素的妇女和具有多于一个中度风险因素的妇女应在妊娠期12至28周（优选地在妊娠期16周之前）开始接受低剂量阿司匹林，直到分娩（ACOG Practice Bulletin, Number 222.Gestational Hypertensionand Preeclampsia.Obstetrics and gynecology 2020, 135, e237-e260, doi:10.1097/aog.0000000000003891）。因此，最好在妊娠前三个月进行PE筛查。
已经提出了各种不同的方法来筛查怀孕期间的PE患者。目前使用的主要筛查方法中的一种是基于贝叶斯的竞争风险（CR）模型。这种PE筛查方法结合了母体特征和产科病史以及用于风险评估的生物标志物，包括平均动脉压、子宫动脉搏动指数和胎盘生长因子（PlGF）（Poon等人，2009, Hypertension; 53:812-818；以及Wright等人，2015, Am JObstet Gynecol; 213 :62）。尽管这种方法优于仅基于母亲病史和人口统计学特征的传统方法，但它很复杂，并且需要多种不同的测试和信息来计算PE风险评估。
该实施例确定了细胞游离（cf）DNA可用作用于鉴定具有发展为先兆子痫（PE）风险的患者的高效生物标志物。目前，从在怀孕期间抽取的母体血液中获得的cfDNA被广泛用于产前非整倍体筛查。该实施例观察了在两个不同时间点（11.0-14.2周妊娠期和17.6-25.5周妊娠期）的基于cfDNA的信号在他们怀孕期间发展和不发展为先兆子痫的患者之间是否不同。它还比较了所提出的模型的筛查性能和CR模型的筛查性能。该实施例发现，所提出的模型能够在逻辑回归模型中使用来自妊娠前三个月的cfDNA信号来区分PE与对照病例，其灵敏度高达100%，并且特异性高达87.5%。
材料和方法
该所提出的模型的测试群体由来自魁北克市一家私人产前诊所（CliniquesPrenato, Canada）的怀孕患者的样品组成，这些怀孕患者接受妊娠前三个月的常规非侵入式产前测试（NIPT）以检查非整倍体和其他不良产科结局。从2020年7月至2021年5月，在11.0-25.5周妊娠期进行访视，其中护士记录母体特征和病史，包括母亲年龄；孕龄；母亲的身高和体重；种族来源；如果患者在怀孕期间吸烟；患者母亲是否存在任何PE病史；以及目前怀孕的受孕方法。然后由专业医生进行检查。患者还抽血测定PlGF血清水平，测量他们的平均动脉压，并且使用经腹彩色多普勒超声波检查法来测量左右子宫动脉搏动指数。如果患者年龄至少为18岁，具有单胎妊娠，并且孕龄（GA）为11.0-14.2周，则入选该研究。如果患者具有慢性高血压，正在服用阿司匹林或任何抗凝剂药物，正在使用免疫抑制剂，或者目前或以前具有癌症，则被排除在研究之外。
出于本研究的目的，在妊娠期的11.0-14.2周（时间点A）采集血液样品作为常规NIPT筛查过程的一部分，并且在妊娠期的17.6-25.5周（时间点B）重复抽血。使用VERIFI™实验室开放的测试（Illumina的VERISEQ™ NIPT Solution v2测定的改编版本（Illumina,Inc. clinical services laboratory, Foster City, CA））来处理来自时间点A的血液样品。来自时间点B的血液样品在RUO版本上运行。未向患者报告来自时间点A或时间点B的罕见常染色体三体或拷贝数变异的NIPT结果。仅将来自时间点A的21三体、18三体和13三体的验证结果返回给患者。所有女性都书面同意参与并分享研究中获得的数据。该项目已获得产前诊所机构研究审查委员会的批准（批准号12302019-2）。
对所有研究参与者进行随访，直至分娩。如果报告了不良结果，则收集新生儿检查报告。结果信息包括出生体重、分娩时的GA、分娩方式以及是否存在任何分娩并发症。结果包括PE或分娩合并PE以及其他不良怀孕/分娩结果；PE根据国际妊娠高血压研究学会来定义（Brown等人，2001, Hypertens Pregnancy; 20(l):IX-XIV）。
来自时间点A的NIPT生物信息学分析的CfDNA参数用于模型的开发。拟合多元逻辑回归模型，其中先兆子痫结果是二进制因变量，cfDNA胎儿分数和片段大小分布（FragSizeDist）、+/-浓度（Conc）为自变量。具体来说，逻辑回归预测先兆子痫的概率是基于FragSizeDist作为自变量，以及包括FF和Conc在内的交互项。在训练集和测试集中使用最少数量的PE案例对模型进行监督的5重交叉验证。所选择的模型的训练利用了-80%的患者数据（n=75，8个PE病例+ 67个非PE病例），其中-20%的患者数据（n = 20，4个PE病例+ 16个非PE病例）用于测试集。该模型呈现出90%的准确性。
所有生物信息学统计分析均使用RStudio软件程序v 2022.07.2 build 576©2009-2022来进行。
结果
对于该实施例，从怀孕患者中预期收集总计100个样品。五个样品没有结果数据，并且因此被排除在研究之外。十二名患者发展为PE，其中四名为早期（妊娠期34周之前），并且八名为晚期PE（妊娠期34周之后）；在发展为PE的患者组中没有检测到非整倍体。测试群体的患者人口统计学示于表1中。根据所观察的PE结果和竞争风险模型或该实施例的cfDNA信号模型的筛查阳性状态，将患者分为四个单独的类别。具有任何不良妊娠结局的患者被排除在对照组之外。测量所有研究参与者的生物标志物水平，包括血压、子宫动脉搏动指数和PlGF。表1中还显示了这四组中的每一组的详细情况。
对于所提出的模型，考虑了三种不同的cfDNA信号，即cfDNA浓度、胎儿分数和片段大小分布。图1A-图1C显示了这些不同的cfDNA信号对在时间点A（妊娠期11.0-14.2周）从对照样品中区分早期和晚期PE患者病例的影响。从图1A可以看出，与对照样品相比，来自早期PE病例的cfDNA的浓度显著更高（p=0.048），而在晚期PE组与对照之间没有观察到显著差异。与对照物相比，发现晚期PE病例的片段大小分布显著更高（p=0.036；图1B），同时发现与对照物相比，晚期PE组的胎儿分数显著更低（p=0.028；图1C）。此外，线性回归图展示，除了一个异常值（病例# 85；图1D）外，胎儿分数和片段大小分布的使用可有助于区分PE病例与对照病例。图3A显示了时间点A与所有三个cfDNA信号的线性回归曲线图。
表1.研究参与者的母亲人口统计学和妊娠史。
除非另外指明，否则数据以中位数（四分位数范围）或n（%）表示。APO，不良妊娠结局；MoM，中值的倍数；Pe，先兆子痫；PlGF，胎盘生长因子；UAPI，子宫动脉搏动指数；wk；周；yr，年。
*基于测试集。
**仅基于一个患者。
对于时间点B（妊娠期17.6-25.5周；图2A-图2C），与对照物相比，早期（p=0.021）和晚期（p=0.007）PE病例两者的cfDNA浓度显著更高，而与对照物相比，早期（p=0.044）和晚期（p=0.015）PE病例两者的FF显著更低。在时间点B处没有观察到片段大小分布的显著差异。与时间点A相似，线性回归曲线图展示使用胎儿分数和片段大小分布可有助于区分PE病例与对照病例（图2D）。可以看出，来自时间点A的异常值病例（#85）与时间点B的PE病例一致。图3B显示了时间点A与所有三个cfDNA信号的线性回归曲线图。
最后一步，与所建立的CR模型相比，在时间点A和时间点B两者处，所提出的模型的性能（基于测试数据集）。从表2可以看出，在时间点A处（妊娠前三个月），与CR模型相比，即时模型具有更高的灵敏度（100%对58.3%）和更高的PPV（66.7%对41.0%），两个模型都观察到相同的特异性（87.5%）。
表2.cfDNA筛查方法（n=20）和竞争风险方法（n=95）的测试性能总结。
讨论
该实施例确立基于cfDNA的信号可以用于区分在怀孕期间发展为PE的患者与没有发展为PE的那些患者。在逻辑回归模型中使用cfDNA信号能够鉴定有风险患者，在PE患者与对照病例之间观察到浓度、胎儿分数和片段大小分布的显著差异。
如该实施例中所提出的，与对照病例相比，在时间点A处，早期PE患者的cfDNA浓度显著更高，而在时间点B处，早期和晚期PE患者两者的cfDNA浓度均显著更高。类似于该实施例，许多其他研究也注意到cfDNA浓度与先兆子痫之间的联系。Lo等人早在1999年首次展示，先兆子痫患者中的循环胎儿DNA的中值浓度比非先兆子痫患者高得多（Lo等人，1999,Clin Chem; 45(2): 184-188）。作者提出循环DNA的测量可能是诊断PE的有用标志物。更近期的研究发现，总cfDNA在诊断时在先兆子痫中显著更高，并且这种更高的总cfDNA与分娩时更早的孕龄和更高的收缩压相关（Kolarova等人，2021, J Am Heart Assoc; 10(15):e021477）。另一项研究也发现，与正常怀孕相比，PE与更高的母体血清总cfDNA浓度相关联（Rafaeli-Yehudai等人，2018, PloS One; 13(7):e0200360）。虽然Rolnik等人的研究表明，与对照物相比，早期PE患者中的中值总cfDNA显著增加，但作者发现，在妊娠器11-13周和20-24周测量总cfDNA并不能预测PE（Rolnik等人，2015, Ultrasound Obstet Gynecol;45:106-111）。该实施例还发现，在逻辑回归模式中使用浓度是针对时间点A测试的三个cfDNA参数中最不重要的预测因子，但对于时间点B却变得非常重要且具有预测性。该实施例的低n排除了针对该模型的早期PE患者与晚期PE患者的区分，但初步数据表明，浓度可能对未来的模型开发具有重要意义。
时间点A与B之间的浓度动态值得进一步探索和理解，因为它可能与PE发作相关，并且将进一步告知cfDNA筛查的最佳时间。在该实施例中，与未发展为PE的患者相比，在时间点A处，晚期PE患者的胎儿分数显著降低，而在时间点B处，早期和晚期PE患者两者的胎儿分数均显著降低。其他研究也表明，低FF与PE相关联（Becking等人，2021, Prenat Diag;41(10):1296-1304；Gerson等人，2019, Pregnancy Hypertens; 16:148-153；Yuan等人，2020, Pregnancy Hypertens; 22:101-108；以及Sapantzoglou等人，2021, J MaternFetal Neonat Med; 35(25):5363-5368）。Rolnik等人发现FF结果与不良妊娠结局的第一孕期标志物（包括PAPP -A和P1GF）之间存在显著相关性，其结果表明，PE风险升高的患者往往具有较低的胎儿分数（Rolnik等人，2018, Ultrasound Obstet Gynecol; 52:722-727）。
已经进行了大量的研究，以使在怀孕期间将发展为PE的患者能够进行容易且有效的第一孕期筛查。然而，到目前为止，尚未鉴定出有效的生物标志物，这将在独特的抽血中实现这一点，这可能有助于部分地解释为什么PE筛查尚未在世界范围内普及。该研究的主要优势中的一个优势是它能够开发和测试整合多个cfDNA信号的新型PE筛查模型。与竞争风险模型相比，所提出的cfDNA模型似乎具有改善的灵敏度，该竞争风险模型被认为是筛查PE的金标准，并且因此可能更有效。此外，这是第一次在将发展或不发展为PE的患者中报告cfDNA片段大小数据。该cfDNA模型的另一个优点是它易于使用，并且因此避免了许多并发症和其他PE筛查方法所需要的特殊技能。理论上，它也很容易被纳入常规非侵入式产前筛查。除了包括其他关键变量之外，该模型的未来迭代将可能扩展该模型以描绘早期与晚期先兆子痫。
如来自时间点A的数据所示，可在妊娠期16周之前获得结果，这将允许实施ACOG所推荐的以阿司匹林进行预防性治疗（ACOG Practice Bulletin, Number 222.GestationalHypertension and Preeclampsia.Obstetrics and gynecology 2020, 135, e237-e260,doi:10.1097/aog.0000000000003891）。然而，该实施例的缺陷是小样品大小，在我们的测试群体中仅具有12名PE患者。未来的前瞻性研究将需要在更大的怀孕患者群组中进行，以确定我们提出的模型在鉴定有风险患者中的可行性。
总之，用cfDNA胎儿分数、片段大小分布和浓度对先兆子痫结局进行逻辑回归建模，可有助于对有发展为先兆子痫风险的怀孕进行概率预测。所提出的模型在理论上是有用的额外工具，用于筛查，并随后咨询患者关于先兆子痫发展的风险和预防。
该实施例现已公布为Gekas等人，“Use of cell-free signals as biomarkersfor early and easy prediction of preeclampsia,” Frontiers in Medicine, 2023年5月24日：10:1191163. doi: 10.3389/fmed.2023.1191163. eCollection 2023，该文献以引用的方式全文并入本文。
实施例2
使用细胞游离DNA信号作为检测先兆子痫的生物标志物的进一步分析
使用下式对实施例1的数据进行进一步分析：
yi = β0 - β1 (FragSizeDist) + β2 (FragSizeDist:FF) - β3 (FragSizeDist:FF:Conc)。
该式继续确定PE与非PE样品之间的分离，最终灵敏度为83%，并且特异性为62%。图4是显示在时间点A处，使用胎儿分数和片段大小分布来区分PE样品和对照样品的线性回归曲线图。PE样品由圆形表示。对照样品由正方形表示。图5是概率对结果的曲线图；截止值=0.098；准确度：0.6526；灵敏度：0.8333；并且特异性为0.6265。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整公开内容，以及以电子方式获得的材料（包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译）全文以引用方式并入。出版物中引用的补充材料（诸如补充表、补充图、补充材料和方法和/或补充实验数据）同样全文以引用方式并入。在本申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性的情况下，应以本申请的公开内容为准。上述详细描述和实施例仅为了清楚地理解本发明而给出。不应将其理解为不必要的限制。本公开不限于所示和所述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变型将包括在由权利要求所限定的公开内容内。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示组分的量、分子量等的所有数字在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本公开寻求获得的期望性质而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数值参数应至少根据所报告的有效数位的数目并通过应用惯常的四舍五入法来解释。
尽管阐述本公开的广义范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含一个范围，该范围必然是由存在于其相应测试测量中的标准偏差引起。
除非另外指明，否则所有标题都是为了方便读者，而不应用于限制该标题后面的文本的含义。

Claims (17)

1.一种在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，所述方法包括：
提供从获自所述怀孕女性受试者的生物样品获得的细胞游离DNA(cfDNA)序列信息；以及
从所述cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA(cfDNA)浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
2.其中所述cfDNA序列信息从基于定序的非侵入式产前测试(NIPT)测试获得。
3.一种在怀孕女性受试者中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高的方法，所述方法包括：
从获自所述怀孕女性的生物样品中移除完整细胞；
从所述生物样品中分离细胞游离DNA(cfDNA)分子；
对所得富集的cfDNA进行定序以获得cfDNA序列信息；以及
从所述cfDNA序列信息：
确定细胞游离DNA(cfDNA)浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；并且/或者
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；和/或
胎儿分数与片段大小分布的比率小于正常对照物中的此比率指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括：
确定所述cfDNA内的胎儿分数；以及
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法包括：
确定细胞游离DNA(cfDNA)浓度；
确定所述cfDNA内的胎儿分数；以及
确定所述cfDNA内的片段大小分布；
其中：
相对于正常对照物的较高的cfDNA浓度；
相对于正常对照物，所述cfDNA内较低的胎儿分数；以及
相对于正常对照物的较高的片段大小分布；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
6.一种方法，所述方法包括：
a)访问来自cfDNA的序列读段并确定：
i)cfDNA浓度；
ii)所述cfDNA内的胎儿分数；
iii)所述cfDNA内的片段大小分布；和/或
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的参数；
b)比较
i)所述cfDNA浓度与第一阈值量；
ii)所述胎儿分数与第二阈值量；
iii)所述片段大小分布与第三阈值量；和/或
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的所述参数与第四阈值量；
其中所述第一阈值量、所述第二阈值量、所述第三阈值量和所述第四阈值量是基于多个正常样品确定的；
c)确定所述怀孕女性受试者具有先兆子痫和/或先兆子痫风险升高，其中
i)所述cfDNA浓度高于所述第一阈值量；
ii)所述胎儿分数低于所述第二阈值量；
iii)所述片段大小分布高于所述第三阈值量；并且/或者
iv)包括所述胎儿分数和所述片段大小分布的所述参数小于所述第四阈值量；
指示所述怀孕女性中的先兆子痫和/或先兆子痫风险升高。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期小于16周的所述怀孕女性获得的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期为约11周至约14.2周的所述怀孕女性受试者获得的。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期超过20周的所述怀孕女性获得的。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物样品是从妊娠期为约17.6周至约25.5周的所述怀孕女性受试者获得的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测早发型先兆子痫和/或确定早发型先兆子痫风险升高。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中检测先兆子痫和/或确定先兆子痫风险升高包括检测晚发型先兆子痫和/或确定晚发型先兆子痫风险升高。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括全血、血清或血浆。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述怀孕女性提供选自由以下组成的组的治疗干预措施：增加产前访视频率、降低血压的抗高血压药物、皮质类固醇药物、抗惊厥药物、卧床休息、住院治疗、早期分娩以及它们的组合，和/或用低剂量阿司匹林治疗所述怀孕女性，其中低剂量阿司匹林包括每天约50mg至约150mg。
15.一种系统，所述系统包括一个或多个微处理器和存储器，所述存储器包括能够由所述一个或多个微处理器执行的指令，并且所述存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中所述序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由所述一个或多个微处理器执行的所述指令被配置为执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法。
16.一种机器，所述机器包括一个或多个微处理器和存储器，所述存储器包括能够由所述一个或多个微处理器执行的指令，并且所述存储器包括映射到参考基因组的序列读段，其中所述序列读段是来自怀孕女性受试者的测试样品的cfDNA的读段，并且其中能够由所述一个或多个微处理器执行的所述指令被配置为执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法。
17.一种非暂态计算机可读存储介质，可执行程序存储在所述非暂态计算机可读存储介质上，其中所述程序指示微处理器访问映射到参考基因组的序列读段并且执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法。
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