CN119619497A - 使用抗原检测抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用抗原检测抗体。示例复合物包括固体支持物和附着在固体支持物上的至少两种不同类型的抗原。复合物包括附着在固体支持物上的载体蛋白。载体蛋白上附着至少一种不同类型的抗原。至少一种不同类型的抗原通过载体蛋白附着在固体支持物上。

Description

使用抗原检测抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求标题为"使用抗原检测抗体"，于2023年9月12日提交的第63/538,042号美国临时申请的利益和优先权。美国临时申请第63/538,042号通过引用并入本申请。

技术领域

本说明书涉及使用抗原检测抗体。

发明背景

抗核抗体(ANA)是一种与细胞核内容物结合的自身抗体，是自身免疫性结缔组织病的一个显著特征。ANA检测的一个示例是检测受试者生物液体如血液或身体组织中的ANA。在某些情况下，当使用HEp-2细胞进行间接免疫荧光(IIF)检测时，会检测并报告靶向细胞质抗原(如Jo-1或核糖体P蛋白)的自身抗体。因此，建议将术语改为抗细胞抗体或"ACA"。然而，文献中仍使用ANA一词，因此本文中ANA和ACA可互换使用。

阳性ANA检测结果意味着受试者中存在自身抗体，这可能是疾病或其他病症的征兆。检测多种类型ANA的多分析物测定/检测系统使用固定在单一固体支持物(如颗粒或微珠)上的单一抗原。样品中的抗体与抗原结合，并且结果基于例如结合的抗原/抗体的荧光等检测。检测到的荧光量与样品中含有的抗体量成正比。相对大量的抗体指示与靶抗原相关的疾病的较高可能性。

与细胞基质(如HEp-2细胞)上的IIF测定相比，上述类型的一些多分析物测定/检测系统不包括足够的抗原来捕获足够的抗体，因此在某些情况下检测疾病和其他病症具有挑战性。此外，根据疾病或病症的不同，这些测定中需要使用多种微珠，这可能导致工作流程效率低下，因为每种微珠都需要检测，并分析综合信号以确定疾病或病症。使用多种微珠进行校准也会耗费大量时间，而且分析可能需要复杂的计算辅助以及技术人员的高超技能。

发明概述

示例复合物包括固体支持物和附着在固体支持物上的至少两种不同类型的抗原。复合物可单独或组合包括以下一种或多种特征。

复合物可包括附着在固体支持物上的载体。不同类型抗原中的至少一种可附着在载体上。不同类型抗原中的至少一种可通过载体附着在固体支持物上。复合物可包括接头，用于将不同类型抗原中的至少一种附着到载体上。接头可包括聚乙二醇(PEG)间隔物或生物素。

载体可包括链霉亲和素、聚合蛋白质、聚合链霉亲和素与生物素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)间隔附着物或己二酸二酰肼(ADH)中的至少一种。

复合材料可包括多个载体。每个载体都可以附着在固体支持物上。每种不同类型的抗原可分别附着在多个载体中的一个载体上。每种不同类型的抗原可通过多个载体中的各自一个附着到固体支持物上。

复合物可包括附着在固体支持物上的载体。每种不同类型的抗原都可以附着在载体上。每种不同类型的抗原都可以通过载体附着在固体支持物上。

至少两种不同类型的抗原可包括一组受试者疾病或病症的标志物。至少一种不同类型的抗原可以是附着在固体支持物上的细胞提取物的一部分。第一种不同类型的抗原可以包括纯化抗原，第二种不同类型的抗原可以是细胞提取物的一部分。

至少两种不同类型的抗原可包括以下抗原中的至少两种：Scl-70、着丝粒、dsDNA、Ro52、Ro60、SS-B、Ribo-P、DFS-70、EJ、Sp100、Gp210、肌动蛋白、AMA-M2、AMA-M2/MIT3、TIF1-γ、NXP-2、SAE、PL-7、PL-12、OJ、HMGCR、SRP、Mi-2、MDA-5、RNA螺旋酶、Ki/SL、Sm/RNP、SS-A、PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白、Sm、Ku、Jo-1、RNP、BICD2、HK、KL、LC1、LKM-1、SLA、SS-A/Ro52、Scl-70、Ku、着丝粒蛋白、U11/U12 RNP、己糖激酶-1或Kelch-12。

至少一种不同类型的抗原可与抗核抗体(ANA)结合。复合物可包括与固体支持物缔合的标记。标记可与疾病、病症或分析物相关联，而这些疾病、病症或分析物可通过至少两种不同的抗原进行检测。

一个试剂盒实例包括：第一固体支持物，包括附着其上的第一抗原，其中第一抗原包括至少两种不同类型的抗原；第二固体支持物，包括附着其上的至少一种第二抗原，其中至少一种第二抗原不同于每一种第一抗原。一种或多种第一抗原或至少一种第二抗原可包括纯化的抗原或细胞提取物的一部分。示例试剂盒可单独或组合包括以下一个或多个特征。

第一固体支持物可包括第一标记，第二固体支持物可包括第二标记。第一标记可以不同于第二标记。第一抗原可包括第一种疾病或病症的标志物。第一标记可与第一种疾病或病症相关联。至少一种第二抗原可包括第二种疾病或病症的标志物。第二标记可与第二种疾病或病症相关联。

第一抗原可包括响应于与相应抗体的结合产生信号的第一标记。至少一个第二抗原可包括至少一个第二标记，该标记响应于与至少一种相应抗体的结合产生信号。第一标记和至少一种第二标记可以是相同类型的，也可以是不同类型的。

一种示例方法包括将受试者的生物样品与复合物接触，复合物包括固体支持物和附着在固体支持物上的至少两种不同类型的抗原；检测生物样品中与复合物结合的抗体的存在，其中与复合物结合的抗体的存在表明疾病的存在。该方法可单独或组合包括以下一个或多个特征。

该方法可包括根据固体支持物上的标记检测固体支持物。标记可以与疾病相关。检测可包括检测来自至少两种不同类型抗原上的标记的信号。

复合物可包括与生物样品接触的多个复合物之一。每个复合物都可以具有与不同疾病相关的不同构型。多个复合物中的每个复合物可包括各自的固体支持物；以及附着在各自固体支持物上的一种或多种抗原。

通过在一个或多个处理设备上执行存储在一个或多个非暂时性机器可读存储介质上的指令，可以控制本说明书中描述的系统和技术(包括测定)的至少一部分。非暂时性机器可读存储介质的示例包括只读存储器、光盘驱动器、存储磁盘驱动器和随机存取存储器。本说明书中描述的系统和技术(包括测定)的至少一部分可以使用计算系统进行控制，计算系统包含一个或多个处理设备和存储指令的存储器，指令可由一个或多个处理设备执行，以进行各种控制操作。本说明书所述的组合物、装置、系统和技术(包括测定)可通过设计、构造、配制、排列、放置、编程、操作、激活、停用和/或控制等方式进行配置。

本说明书(包括本摘要部分)中描述的两个或多个特征可以组合形成本说明书中未具体描述的实施方式。

一个或多个实施方式的细节如附图和以下描述所示。其他特征和优点将从描述、附图和权利要求中显而易见。

附图说明

图1A、1B和1C显示了抗原及其登录号的表。

图2是从概念上显示了固体支持物-抗原复合物的示例的图，其中包含一种载体和十种抗原。

图3是从概念上显示了固体支持物-抗原复合物的示例的图，其中包含通过接头附着到载体上的抗原。

图4是从概念上显示了抗原在四种不同固体支持物上的四种组合示例的图。

图5是从概念上显示了抗原在四种不同固体支持物上的四种组合示例的图。

图6是从概念上显示了抗原在四种不同固体支持物上的四种组合示例的图。

图7显示了三种自身抗体示例的照片，所述自身抗体可产生阳性间接免疫荧光结果，但在结缔组织病(CTD)的鉴别诊断中并不常用。

图8是显示了使用固体支持物-抗原复合物确定受试者具有某种疾病、病症或分析物的可能性的过程(测定)中包括的操作示例的流程图。

图9是显示了受体操作特征曲线(ROC)分析示例的图，描述了使用与单个珠子偶联的抗原混合物检测单个自身抗原(Ro52、Ro60、RNP、La/SS-B)的自身抗体的能力。

图10是显示了单个抗原的反应性相对于与珠子偶联的单个抗原的反应性的比较的条形图。

图11是显示了临床研究的结果的图，该研究使用一个固体支持物上的十种抗原，并使用经FDA(食品与药物管理局)批准的设备，对生物样品进行疾病筛查。

图12是显示了使用十种抗原筛查疾病的临床研究结果如何与使用先前技术和数千个样品获得的检测结果比较的图。

图13是显示了以下的图：使用一个固体支持物上的十种抗原对疾病进行筛查的临床研究的结果，以及如何将这些结果与使用先前技术和数千个样品获得的检测结果进行比较。

相同的参考数字指示相同的元素。

发明详述

本文描述的是用于筛查生物样品中抗体(如抗核抗体(ANA)/抗细胞抗体(ACA))的多分析物测定实例。在一些实施方式中，与筛查ANA的ANA固相测定相比，多分析物测定经配置以覆盖更多的分析物，并接近ANA HEp-2细胞测定检测的更广泛的抗体覆盖范围。

示例抗原是能与特异性抗体结合的分子、物质、外来颗粒物质或过敏原。抗原可以通过化学合成、重组合成或从天然来源中分离。

抗体包括经配置用于与抗原特异性结合的结合剂。示例抗体包括B细胞或其重组等效物的多肽产物，它能与特异性分子抗原结合并包含两条重链和两条轻链。每条链的每个氨基末端部分都包括赋予结合特异性的可变区。抗体可包括全长抗体以及诸如这些抗体的功能片段。当针对抗体使用时，示例功能片段包括抗体的一部分，包括例如，保留了衍生片段的抗体的部分或全部的结合活性的重链或轻链多肽。这些功能片段可包括Fd、Fv、Fab、F(ab’)、F(ab)2、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、二抗体、三抗体、四抗体和微抗体等，可参见例如以下中的描述：Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York(1989)；Myers(ed.),Molec.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference,New York:VCH Publisher,Inc.；Huston et al,CellBiophysics,22:189-224(1993)；Pluckthun and Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)；以及Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,Second Ed.,Wiley-Liss,Inc.,NewYork,NY(1990)()()(()()。诸如此类的抗体功能片段可用于本文所述的测定中。

ANA是自身抗体的一种。自身抗体包括受试者自身免疫系统产生的针对受试者自身多肽或抗原的一种或多种的抗体。当免疫系统不能全部或部分区分自身组织成分和非自身组织成分时，受试者的免疫系统就会产生自身抗体。自身抗体的示例包括针对产生自身抗体的受试者的组织成分的免疫球蛋白(Ig)。

当针对ANA使用时，示例抗X抗体包括对抗原X特异性的ANA或对一种或多种抗原X泛特异性的ANA。例如，抗着丝粒抗体就是对着丝粒特异性或泛特异性的ANA。抗X抗体可包括任何抗体类别(IgG、IgM、IgD、IgA和IgE)和亚类别(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或其功能片段。在一些实施方式中，抗X抗体包括针对人抗原X的人ANA。

本文所述的示例测定将多种抗原固定在固体支持物上，作为检测方案的一部分。例如，可将两种或更多种(如多种)类型的抗原固定在单个固体支持物上。固定在单个固体支持物上的抗原形成固体支持物-抗原复合物，能够检测两种或更多种类型的抗体，如两种或更多种类型的ANA。

在一些实施方式中，固体支持物可以预先制备好，并使用一种或多种结合技术与抗原偶联。结合技术可包括但不限于经由羧基的共价结合、通过点击化学的共价结合、生物素-链霉亲和素、吸附、His捕捉或标签(如下面鉴定的标签)。共价结合试剂可包括可用于将抗原直接共价固定在固体支持物表面的任何化学或生物试剂。共价结合试剂可包括羧基-胺反应基团，如碳化二亚胺，如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)或DCC(N,N′-二环己基碳二亚胺)、胺反应基团如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚胺酯、巯基反应交联剂如马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；羰基反应型交联剂如肼或烷氧基胺；光反应型交联剂如芳基叠氮化物或二嗪；或化学选择性连接基团如施陶丁格反应对。点击化学结合可包括烯和四唑的光点击反应、烯和叠氮化物的[3+2]环加成反应、烯和四嗪的逆需求Diels-Alder、铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)、应变促进的叠氮-炔环加成反应(SPAAC)、应变促进的炔-硝酮环加成反应(SPANC)以及应变烯的反应。

在一些情况下，利用共价结合将两种或更多种抗原组合到单一的固体支持物上可能具有挑战性，因为不同的抗原可能会相互竞争结合到固体支持物的同一部位。在一些情况下，如果一种或多种抗原无法与固体支持物结合，使用这些抗原进行检测就不会存在。有时，可以采用不同的抗原比例和不同的抗原与固体支持物偶联策略来解决这些问题。例如，与结合亲和力较高的抗原相比，结合亲和力较低的抗原可以以较高的浓度加入，以增加与固体支持物结合的量。这种对抗体比例的控制还可用于考虑各种抗体与其相应抗原之间结合亲和力的差异。例如，如果第一种抗原与其相应抗体的结合力较弱，那么珠子可能需要珠子上的第一种抗体的用量高于与其相应抗体结合力较高的第二种抗体的用量。

非共价结合可以使用任何化学或生物试剂，将抗原非共价地固定在固体支持物的表面上，如亲和标签包括生物素或捕获试剂如链霉亲和素或抗标签抗体，如抗-His6或抗-Myc抗体。

在一些实施方式中，示例测定使用载体与抗原结合。例如，载体与固体支持物结合，抗原与载体结合。因此，在这些示例中，抗原间接附着在固体支持物上。例如，通过为抗体提供统一的结合/反应表面，这种配置可以降低单个抗原以不可预测的方式相互竞争结合到固体支持物上的可能性。此外，与载体结合的抗原类型和/或数量可以如上所述选择，以引导结合，从而使不同的抗原以可控的比例与载体结合。在一些实施方式中，第一抗原和第二抗原之间的摩尔比可以在10:1到1:10的范围内。

可使用的载体示例包括但不限于链霉亲和素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等蛋白质，以及聚合链霉亲和素等蛋白质缀合物。载体可以包括交联剂，例如戊二醛、二异氰酸酯、碳二酰亚胺(例如，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺)、聚环氧化合物(例如，1,4-丁二醇二缩水甘油醚和苯基缩水甘油醚)、酰基叠氮化物、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DGS)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-脒基己酸酯)(LC-SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、甲醛、氮芥和己二酸二酰肼(ADH)。其他载体可包括合成或天然衍生的聚合物，如树枝状聚合物和超支化聚合物。树枝状聚合物和超支化聚合物的示例包括聚酯-8-羟基-1-乙炔双-MPA树枝状聚合物第3代(Sigma产品编号686646)、聚酯-16-羟基-1-乙炔双-MPA树枝状聚合物，第4代(Sigma产品编号686638)、聚酯-32-羟基-1-乙炔双-MPA树枝状聚合物，第5代(Sigma产品编号686611)、聚酯-8-羟基-1-羧基双-MPA树枝状聚合物，第3代(Sigma产品编号686670)、聚酯-16-羟基-1-羧基双-MPA树枝状聚合物，第4代(Sigma产品编号686662)、聚酯-32-羟基-1-羧基双-MPA树枝状聚合物，第5代(Sigma产品编号686654)、超支化双-MPA聚酯-16-羟基，第2代(Sigma产品编号686603)、超支化双MPA聚酯-32-羟基，第3代(Sigma产品编号686581)和超支化双MPA聚酯-64-羟基，第4代(Sigma产品编号686573)。天然衍生聚合物的示例包括多糖，如纤维素、甲壳素、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸，蛋白质和聚合物缀合物。在一些实施方式中，可使用的载体包括链霉亲和素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)以及蛋白质缀合物如聚合链霉亲和素。

在一些实施方式中，两种或更多种不同的抗原可与同一种载体结合，从而增加(间接)附着在固体支持基底上的抗原数量。不同的抗原可使用接头与载体结合，如生物素、聚乙二醇(PEG)、his-标签、采用SpyCatcher技术的SpyTag或其他小分子合成蛋白质或肽。

可直接或间接经由载体同时附着在单个固体支持物上的抗原包括但不限于以下抗原：Scl-70、着丝粒、dsDNA、Ro52、Ro60、SS-B、Ribo-P、DFS-70、EJ、Sp100、Gp210、肌动蛋白、AMA-M2、AMA-M2/MIT3、TIF1-γ、NXP-2、SAE、PL-7、PL-12、OJ、HMGCR、SRP、Mi-2、MDA-5、RNA螺旋酶、Ki/SL、Sm/RNP、SS-A、PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白、Sm、Ku、Jo-1、RNP、BICD2、HK、KL、LC1、LKM-1、SLA、SS-A/Ro52、Scl-70、Ku、着丝粒蛋白、U11/U12 RNP、己糖激酶-1和Kelch-12。在一些实施方式中，抗原是原生抗原、重组抗原或靶向整个蛋白质的特异性抗体表位的小肽序列。

跨图1A、1B和1C所示的表10显示了可直接或间接经由载体同时附着到单个固体支持物上的抗原11(蛋白质)的示例及其登录号。图1A、1B和1C中所示的两种或更多种抗原和/或以上所列抗原的任意组合可同时附着在同一固体支持物上。图1A、1B和1C中所示的两种或更多种抗原和/或以上所列抗原的任何组合可同时附着在同一载体(附着在固体支持物上)上。

在一些实施方式中，抗原可以是细胞提取物或片段的一部分。示例细胞提取物或片段包括未经蒸馏或纯化成单个抗原的细胞的完整部分。示例细胞提取物可以包含多种抗原。因此，细胞提取物本身可以使用本文所述的任何技术附着到固体支持物上--例如，直接附着或直接地或通过接头附着到载体上。细胞提取物可以附着在与纯化抗原相同的固体支持物上，也可以附着在不同的固体支持物上。附着在固体支持物上的细胞提取物可以与附着在固体支持物上的纯化抗原相同的方式，使用本文所述的测定进行检测。

在一个示例中，多分析物测定可包括单个的和纯化的抗原和细胞提取物(如HEp-2细胞提取物)，它们附着在不同的固体支持物上，但一起进行分析，以提高ANA/ACA检测的性能。在一个示例中，细胞提取物和纯化抗原结合使用，但在不同的固体支持物上。通过将细胞提取物与固体支持物结合，测定可对细胞提取物中的所有抗原进行检测。

图2显示了固体支持物14的示例，在本示例中是珠子，其上经由各自的载体18附着十种抗原16。在本示例中，除了RNP/SM是两种抗原的复合物外，其他抗原都是附着在一种相应的载体上。下表显示了制备以附着抗原的过程中的抗原相对摩尔比。

图3显示了固体支持物20的示例，在本示例中是珠子，其上经由各自的接头和载体连接有15种抗原22。在本示例中，15种抗原22分别经由各自的接头26(此处为生物素)连接到相同的载体24上。虽然图3中只有一个载体24附着到固体支持物20上，但固体支持物3上可以附着多个载体，每个载体具有附着于其上的多个抗原。

任何数量的抗原都可以直接或间接(例如，通过带或不带接头的载体)附着到单个固体支持物上。例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多的抗原可以直接或间接地附着到单个固体支持物上。在示例中，每个载体上可以附着两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多抗原。

固体支持物、固体表面或其他语法等同物的示例包括适合或可改性为适合附着可结合自身抗体的抗原的任何材料。示例材料包括例如，玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、聚氨酯、Teflon^TM等)、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、氧化钛、胶乳或交联葡聚糖(如琼脂糖)、纤维素多糖、尼龙或硝化纤维素、陶瓷、树脂、硅或硅基材料(包括硅和改性硅)、碳金属、无机玻璃、光纤束以及各种其他聚合物。

在一些实施方式中，固体支持物可以是或包括表面上的孔或孔阵列或凹陷。这些可以使用光刻、冲压、模压和微蚀刻等技术制造。在一些实施方式中，固体支持物可以包括多孔板，如96孔板、384孔板或1536孔板。在一些实施方式中，固体支持物可以位于流动池或流动池装置(例如，Biacore^TM芯片或蛋白质芯片上的流动池)内。

示例固体支持物可以是或包括珠子、球体、颗粒、膜、芯片、载玻片或试管。珠子可包括球体或颗粒。球体、颗粒或其语法等同物可包括离散的非平面颗粒，例如，微米或纳米尺寸的颗粒。球体可包括例如微球。颗粒可以包括例如纳米颗粒。在一些实施方式中，珠子的形状可以是不规则的。替代性地或额外地，珠子也可以是多孔的。示例的珠子尺寸范围可以从纳米到毫米，在一些实施方式中，使用的珠子从约0.2微米到约200微米。在一些实施方式中，珠子的尺寸范围可以从约0.5到约5微米。在一些实施方式中，可以使用小于0.2微米和大于200微米的微珠。

固体支持物可以是或包括适合以有序图案固定纯化蛋白质(如抗原)的图案化表面(如在蛋白质芯片上)。示例图案化表面包括固体支持物暴露层中或暴露层上不同区域的排列。例如，一个或多个区域可以是存在一个或多个纯化蛋白质的特征。这些特征可以被不存在纯化蛋白质的间隙区域分隔开来。在一些实施方式中，图案可以是以行和列为单位的x-y格式的特征。在一些实施方式中，图案可以是特征和/或间隙区域的重复排列。在一些实施方式中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机排列。在美国专利申请公开号2008/0280785、美国专利申请公开号2003/0153013和PCT公开号WO2009/039170中描述了可用于示例测定和复合物的图案化表面的示例，其中每一个都通过引用并入本文。

本文所述的示例固体支持物也可用于本文所述的试剂盒和技术(如方法/测定)中。

不同类型的抗原可以使用相同或不同的固定化技术附着在同一个固体支持物上。在这方面，"固定化"与"附着"在本文中可互换使用，这两个术语均旨在包括但不限于共价附着或结合以及非共价附着或结合，除非另有明确说明或上下文另有说明。

单一固体支持物上的抗原类型和/或单一固体支持物上的抗原比例可根据要检测的抗体而变化。抗原类型和比例可因疾病状态或抗原组而异。在一些实施方式中，抗原按疾病领域(如SjS/MCTD谱、SSc/肌炎、SLE和肝脏疾病)组合在单个固体支持物上。此外，抗原的比例也可根据要检测的分析物或疾病进行调整。

例如，固体支持物上的抗原组合可能与特定疾病或病症有关。在示例中，图2中固体支持物14上的抗原组合与结缔组织疾病有关。因此，图2中的复合物15可用来与受试者生物样品中的抗体结合，这些抗体指示受试者的结缔组织疾病。在另一个示例中，本文所述的复合物可以使用与自身免疫性肝病有关的抗原，因为这类疾病中的一些抗体会产生阳性的ANA。与自身免疫性肝病有关的抗原可与固体支持物结合，因为这类疾病中的一些抗体会产生阳性ANA。附着这些抗原可以提高系统性自身免疫疾病的鉴别诊断能力。

附着在单个固体支持物上的抗原和/或细胞提取物组可包括按其疾病领域分组的抗原和/或细胞提取物，如但不限于

1.一种用于测定SjS、MCTD光谱的固体支持物(30，图4)，包括抗原Sm/RNP、SS-A、Ro52、Ro60和SS-B。

2.一种用于测定SSc/肌炎的固体支持物(31，图4)，包括PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白和Mi-2。

3.一种用于测定SLE的固体支持物(32，图4)，包括dsDNA、Sm、Ribo-P和Ku。

4.一种用于测定肝脏自身免疫疾病的固体支持物(33，图4)，包括gp210、AMA-M2/MIT3和sp100。

附着在单个固体支持物上的抗原和/或细胞提取物组可包括按其重要性/认知度和灵敏度分组的抗原和/或细胞提取物，如

5.一种固体支持物(ENA 4)(36，图5)，包括Sm、RNP、SS-A/Ro52、Ro60和SS-B+dsDNA。

6.一种固体支持物(ENA 7)(37，图5)，包括+Scl-70和Jo-1。

7.一种固体支持物(CTD Screen Plus)(38，图5)，包括+Ku、PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白和Mi-2。

8.一种固体支持物(肝脏)(39，图5)，包括gp210、AMA-M2/MIT3和sp100。

9.一种固体支持物(40，图6)，含有Sm、RNP、SS-A/Ro52、Ro60、SS-B、SCL-70、Jo-1+dsDNA。

10.一种固体支持物(41，图6)，含有+Ku、PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白、Mi-2、Ki/SL以及可能的一种或多种其他物质。

11.一种固体支持物(43，图6)，含有HEp-2细胞提取物。

12.一种固体支持物(44，图6)，含有gp210、AMA-M2/MIT3和sp100。

13.一种用于测定肌炎特异性抗体的固体支持物，包括EJ、HMGCR、MDA5、Mi-2、NXP2、OJ、PL-7、PL-12、SAE、SRP、TIF1γ。

14.一种用于测定肝脏自身免疫疾病的固体支持物，包括gp210、己糖激酶-1、Kelch-12、LC1、LKM-1、AMA-M2/MIT3、SLA、sp100。

在一些实施方式中，抗原和/或细胞提取物的组合可用于检测分析物，而不是确定受试者是否患有疾病或病症。分析物可以是与固体支持物上的抗原结合的抗体。

在一些实施方式中，可将用于检测不同疾病或病症的复合物组合在单一测定中。例如，用于检测不同疾病的复合物可以有不同的标记，如色度标记、染料或本文所述的其他标记。这些标记使得区分同一测定中的复合物成为可能，从而鉴定哪种疾病复合物对特定疾病呈阳性。因此，单一测定可用于检测多种疾病，从而节省时间和金钱。与包括多个珠子的方法相比，分析也可简化，因为后者必须解释多个信号才能确定是否存在疾病或病症。在一些实施方式中，用于检测分析物的复合物和用于检测一种或多种疾病或病症的复合物可在单一测定中组合使用。

可以使用本文所述的测定和复合物检测或诊断的疾病或病症包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SjS)、系统性硬化症(SSc)、混合结缔组织病(MCTD)、特发性炎症性肌病(IIM)、不明/未分化CTD、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性肝炎(AIH)、抗磷脂综合征(APS)、致密斑点型或核仁型IFA、自身免疫性胃炎(AIG)、感染性HIV、HCV、梅毒、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、ANCA相关性血管炎(AAV)和特发性炎症性肌病(IIM)。

标记可与本文所述的任何抗原缀合。缀合可包括非共价或共价交联。例如，标记可包括能发出信号的分子实体，可用作检测分析物的读出或测量。标记存在多种类型的标记。这些类别的示例包括荧光团、酶、化学发光部分、放射性部分、有机染料、小分子、多肽或其功能片段。

荧光团的示例包括荧光染料，如藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明(TRITC)、BODIPY和染料。荧光染料还包括荧光共振能量转移(FRET)染料或时间分辨(TR)-FRET染料。荧光团标记还包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)和青色荧光蛋白(CFP)。酶标记的示例包括碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。””当将底物S^’S^’-四甲基联苯胺(TMB)、3,3’-二氨基联苯胺(DAB)或2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)中的任一个应用于HRP时，会产生颜色(显色)或光(化学发光)信号。放射性标记的示例包括例如碳-14或氚等。小分子标记的示例包括生物素、树脂如琼脂糖珠和荧光标记的磁珠或纳米粒子如胶体金。多肽或功能片段标记的示例包括对生物素有亲和力的抗生物素蛋白、链霉亲和素或中性抗生物素蛋白。多肽或功能片段标记的示例还包括血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或c-myc。

在一些构型中，与抗原缀合的标记包括额外的底物或结合剂。例如，与抗原缀合的HRP标记包括底物以鉴定抗原。已知多种其他标记构型。任何标记都可用于本文所述的测定中。在一些实施方式中，标记构型可包括与抗原X缀合的PE、抗原X:抗-X抗体复合物结合剂、抗X抗体结合剂或Ig结合剂。本文所述的标记可用于本文所述的测定，以检测与抗原结合的抗体。本文所用的"抗原X"包括但不限于本文所列的任何抗原。

可以选择附着在单个固体支持物上的抗原比例，以达到对一种或多种抗体的期望灵敏度。例如，可以控制用于将抗原添加到固体支持物上的反应混合物中抗原的比例，以达到期望的检测灵敏度。这可以包括在单个固体支持物上添加比一种或多种其他类型抗原更多的一种抗原。例如，为了检测狼疮，可以向反应混合物中添加额外量的dsDNA，使其附着在固体支持物上，以增强狼疮信号。在一些实施方式中，含有细胞提取物(如HEp-2细胞)的珠子可以比单个抗原和细胞提取物具有更高的细胞提取物重量比。例如，细胞提取物与单个抗原的重量比可以大于1:1，如在10:1和1:1之间。

本文所述的示例测定可利用抗原改善系统性自身免疫病症的鉴别诊断。这些测定的示例可通过以下方式检测针对细胞抗原的抗体：(i)在多分析物测定中将单个固体支持物上的不同抗原与相同的唯一标识符相结合，和/或(ii)在单个固体支持物上提供与针对细胞抗原的自身抗体结合的抗原，但这些抗原通常不用于CTD诊断。这类抗原的示例包括但不限于下表1所列的抗原。

表1：与结缔组织病无关，但使用HEp-2 IIF方法时产生ANA阳性的抗体所靶向的细胞内自身抗原

图7还显示了可产生阳性间接免疫荧光但通常不用于诊断CTD的自身抗体45的示例。

图8是流程图，显示了使用本文所述类型的固体支持物-抗原复合物检测或诊断疾病的示例过程(测定)50中包括的操作。操作包括将受试者的生物样品与一种或多种本文所述类型的复合物接触(50a)。这可以通过将生物样品与含有复合物的流体接触来实现。每个复合物可以包括一个固体支持物和附着在固体支持物上的至少两种不同类型的抗原。不同的复合物可配置为检测与不同疾病、病症或分析物相关的抗体。操作包括检测(50b)生物样品中与复合物结合的一种或多种抗体的存在。

与复合物结合的一种或多种抗体的存在指示与复合物有关的疾病。可使用诊断测试仪器或检测器进行检测，以鉴定来自复合物的信号，如荧光或化学发光，并鉴定与发出信号的复合物相关的标记。可将信号的水平(如强度)与预定基准进行比较(50c)，以确定(50d)受试者患有与结合到复合物的抗体相关的疾病病症的可能性。

举例来说，可以事先测量已知患有与每个复合物相关的疾病的受试者的信号(如荧光或化学发光信号)，并将其用于创建一条将信号水平与受试者患有特定疾病的可能性相关联的曲线。可在操作50c中检索该曲线。可将测量到的信号水平与曲线进行比较，以确定受试者患有与每个复合物相关的疾病的可能性。这些操作可针对与不同疾病相关的复合物和与特定分析物相关的复合物进行。在分析物的情况下，可以事先生成与测试样品中存在的不同分析物相关信号水平的曲线，该曲线可用于确定生物样品中存在分析物的可能性。

图9显示的是受体操作特征曲线(ROC)分析，该曲线用于区分与所示四种抗原(即RNP、Ro52、Ro60和SSB)混合物的抗原反应性。比较了两种形式，在第一种形式中，抗原都与单个珠子偶联，而在第二种形式中，每个抗原作为同质群体与不同的珠子偶联。显示了两种不同的制剂52和53，分别对两种形式进行了比较。两种制剂的灵敏度在Y轴上绘制，相对于特异性在X轴上绘制。图中显示两种形式的特异性和灵敏度相当。

图10是条形图，显示了单个抗原的反应性相对于包含在含有RNP、Ro52、Ro60和SSB的固体支持物(珠子)上的相同抗原的反应性/信号的比较。这说明，与单个支持物偶联的抗原的反应性与仅有一种抗原与珠子偶联的抗原的反应性在同一数量级内。值得注意的是，可以通过包括更多的抗体表面密度来提高反应活性/信号。

图11是显示一项临床研究结果的图，该研究使用一个固体支持物上的十种抗原以及使用一种经FDA(食品与药物管理局)批准的设备(这里是系统，它是Inova公司的一种数字多分析物检测系统)对生物样品进行疾病筛查。图中涉及两种技术的假阳性率和真阳性率。使用固体支持物上的十种抗原绘制的曲线60与使用FDA批准的设备绘制的曲线61相似。如文本框64所示，两种测定具有相似的灵敏度和特异性，其中灵敏度表示准确确定患有某种疾病的受试者的百分比，特异性表示鉴定患有该疾病的受试者的百分比。

图12是显示了使用十种抗原筛查疾病的临床研究结果如何与使用先前技术和数千个样品获得的检测结果的比较的图。先前技术包括在S.A.的Quanta系统上进行的测定。该图将假阳性率与真阳性率联系起来。曲线64显示，使用一个固体支持物上的十种抗原得出的结果与使用先前技术得出的结果有90％以上的一致性。阳性、阴性和总体一致值显示于文本框65。

图13是显示了使用一个固体支持物上的十种抗原筛查疾病的临床研究结果以及如何将这些结果与使用先前技术和数千个样品获得的检测结果进行比较的图。该图将假阳性率与真阳性率联系起来。先前的技术包括在Quanta系统、Nova数字IFA阅读器和系统上进行的测定。曲线71来自Quanta系统，曲线72来自系统；曲线73来自Nova阅读器，曲线74来自本文所述的在一个固体支持物上使用十种抗原进行的测定。如图所示，曲线74来自本文所述的在一个固体支持物上使用十种抗原的测定，其灵敏度75接近90％，与系统的灵敏度相当。请注意，与每条曲线相关的阴影(如76)对应于数据的95％置信度。曲线之间阴影的重叠表明，本文所述的在一个固体支持物上使用十种抗原的测定的准确度与先前技术的准确度相当。

本文所述的示例测定可在与多分析物检测系统(如系统或上述系统)一起使用的盒和/或试剂盒中实施。在示例实施方式中，两个或更多的固体支持物(例如，两个、三个、四个、五个、六个等)，每个都直接地或通过使用载体或载体和接头间接地附着了两个或更多抗原的组合，混合在一起，然后装入管中，管可以是盒的一部分。其余反应按照方案进行。

在一个示例方案中，抗原附着在带有独特标记或签名的顺磁颗粒上，并与稀释的患者样品(可以是血液或唾液等体液)一起孵育。在37℃孵育9.5分钟后，清洗颗粒并再孵育9.5分钟。然后，在37℃用与藻红蛋白(PE)缀合的抗人IgG对颗粒进行孵育，以标记结合的自身抗体。经过最后一次洗涤循环后，使用数字成像仪捕捉颗粒上的中值荧光强度(MFI)，并对捕捉到的检测结果进行分析，以提取每种分析物的有意义信息。也可使用间接免疫荧光测定(IFA)进行检测。

盒式系统包括附着在单个固体支持物上的多种抗原，与在单个固体支持物上使用一种抗原的技术相比，可以使用更少的固体支持物。这可能会减少固体支持物的数量，从而减少实现相同检测次数所需的盒数量。然而，多种类型的抗原可以捕获更多类型的靶抗体，从而允许对检测样品进行全面分析。此外，通过选择每个固体支持物的抗原类型和比例，相对于每个固体支持物使用一种抗原的技术，测试灵敏度可以得到提高。

在一些实施方式中，如本文所述的单个盒可包括一个或多个(如四个)含有上述抗原组1至4的固体支持物。在一些实施方式中，单个盒(如本文所述的盒)可包括一个或多个(如四个)含有上述抗原组5至8的固体支持物。在一些实施方式中，单个盒(如本文所述的盒)可包括两个或更多个(如四个)含有上述抗原组5至12的固体支持物。

目前，作为ANA相关风湿性疾病诊断的一部分，检测ANA的最常用技术是HEp-2 IIF测试，该测试的灵敏度较高，但特异性较低。基于固相微珠的系统的灵敏度可能低于此类系统。根据以往的研究，这种固相测定的灵敏度为约75％，具体取决于队列的组成。在这种情况下，75％的灵敏度意味着，在已知患有某种疾病的一组测试受试者中，检测某种疾病的测定能鉴定75％的测试受试者患有该疾病。在每个固体支持物中加入多种抗原有可能将测定灵敏度提高约10％。在每个固体支持物中加入多种抗原还可提高测定性能，尤其是在系统性硬化症和肌炎的情况下。

因此，本文所述的示例测定可扩展等多分析物检测系统的功能，使这些系统在检测ANA方面提供的检测结果与HEp-2细胞上的IIF相当。

在诊断检测中处理检测结果的软件，如本文、系统和/或上述流程50所描述的软件，可被配置为组合多个结果(来自多个抗原)，以提供新的指示或更准确的指示。此类软件可实施机器学习算法，以提供这些新的指示或更准确的指示。

本文还描述了用于检测、诊断和/或监测疾病或病症的试剂盒的示例实施方式。示例试剂盒可包括一种或多种本文所述的示例固体支持物-抗原复合物。例如，试剂盒可包括用于检测第一种疾病的固体支持物-抗原复合物、用于检测不同于第一种疾病的第二种疾病的固体支持物-抗原复合物、用于检测不同于第一种和第二种疾病的第三种疾病的固体支持物-抗原复合物等。例如，试剂盒可包括用于检测多种不同分析物的固体支持物-抗原复合物。试剂盒既可以包括检测一种或多种不同疾病的固体支持物-抗原复合物，也可以包括检测一种或多种不同分析物的固体支持物-抗原复合物。

本文所述试剂盒的示例可包括抗X抗体特异性检测探针。检测探针可包括抗原，如本文所述的抗原或抗体特异性结合多肽。因此，在某些示例中，抗X抗体特异性检测探针可包括例如抗原X片段、抗原X:抗-X抗体复合物结合剂、抗X抗体结合剂或Ig结合剂或蛋白质。抗体特异性结合多肽的示例包括任何能特异性识别抗体的多肽及其功能片段。抗体特异性结合多肽的示例包括IgG结合蛋白、受体、嵌合受体以及通过随机或组合文库筛选鉴定出的结合多肽。

IgG结合蛋白的示例包括蛋白A和蛋白G。抗体特异性结合多肽可以通过化学合成或从天然来源中纯化，也可以重组制成。本文所述的抗体特异性结合多肽可以是哺乳动物，包括小鼠、兔、山羊、鸡、驴等。

在提到与靶标如抗体结合时，检测探针可以直接与靶标结合，也可以间接与靶标结合。例如，直接结合剂包括能特异性识别抗原X：抗X抗体复合物的抗体或其他抗体特异性结合多肽，以及能特异性结合抗X抗体的抗体或其他抗体特异性结合多肽。检测探针可使用抗Ig或其他能与Ig结合的抗体特异性结合多肽对靶标产生特异性。这种抗体和抗体特异性结合多肽可以通过例如以下方法对抗X抗体产生特异性：用抗原X捕捉抗X抗体，并在加入抗Ig或其他能结合Ig的抗体特异性结合多肽之前洗去非抗X Ig。为实现与靶标的特异性结合而分离或分隔这种结合复合物的其他构型，可用作使检测探针特异于靶标的间接机制。因此，"抗X抗体特异性检测探针"可包括例如抗原X、抗原X：抗X抗体复合物结合剂、抗X抗体结合剂和Ig结合剂。

检测探针可包括标记或报告标签。例如，标记或报告标签包括一个或多个分子，它们经配置以产生指示检测探针与之结合的抗X抗体的检测信号。标记或报告标签可以通过非共价或共价交联等方式附着或缀合到检测探针上。报告标签与检测探针的非共价和共价固定可通过例如Dennler et al,“Antibody conjugates:from heterogeneouspopulations to defined reagents,”

Antibodies,4:197-224(2015)中所述的技术进行。标记或报告标签会产生各种信号，具体取决于报告标签的类型。

示例试剂盒可以包括固体支持物，其示例已在本文中描述。试剂盒还可包括对照品。示例对照包括阳性或阴性标准，用于与抗X抗体的存在或数量未知的受测样品进行比较。试剂盒可包括阳性对照。在一些实施方式中，阳性对照包括含有可检测量的抗X抗体或其功能片段或水平高于阈值的样品。在一些实施方式中，阳性对照可从抗X抗体水平高于阈值的患病受试者中获得。替代性地或额外地，阳性对照还可包含特异于抗原的抗体或其功能片段。抗体或其功能片段可选自单克隆或多克隆抗体。在其他实施方式中，试剂盒可以包括阴性对照。阴性对照可包括不含可检测到的抗X抗体或其功能片段或水平低于阈值的样品。在一些实施方式中，阴性对照可以从健康对照个体中获得，也可以在体外合成。例如，阴性对照可以包括水或缓冲液。

示例试剂盒可包括载体，其示例已在本文中描述。示例试剂盒可包括接头，其示例已在本文中描述。

例如，试剂盒可包括一种或多种辅助试剂。示例辅助试剂包括对实施测定或组合物有用的物质、混合物、材料或成分。示例辅助试剂包括共轭试剂、缓冲液、说明书、仪器等。

在一些实施方式中，试剂盒可以包括试剂，试剂盒中使用的试剂可以包括本领域已知的任何缀合试剂，包括共价和非共价缀合试剂。共价缀合试剂可包括任何可用于将多肽共价固定在表面上的化学试剂或生物试剂。共价缀合试剂可包括羧基-胺反应基团，如碳化二亚胺，如EDC或DCC；胺反应基团，如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚胺酯；巯基反应交联剂，如马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；羰基反应性交联剂如肼或烷氧基胺；光反应性交联剂如芳基叠氮化物或二嗪；或化学选择性连接基团如施陶丁格反应对。非共价固定试剂可包括任何可用于将多肽非共价固定在表面上的化学或生物试剂，如亲和标签如生物素或捕获试剂如链霉亲和素或抗标签抗体，如抗-His6或抗-Myc抗体。

示例试剂可包括缀合试剂的组合。此类组合包括例如EDC和NHS，可用于将蛋白质固定在表面上，如羧化葡聚糖基质(如BIAcore^TMCM5芯片或葡聚糖基珠子上)。缀合试剂组合可以作为预混合试剂组合储存，也可以将组合中的一种或多种缀合试剂与其他缀合试剂分开储存。

在一些实施方式中，试剂盒中使用的试剂可以包括包被缓冲液。包被缓冲液可包括碳酸钠-氢氧化钠或磷酸盐。在一些实施方式中，包被缓冲液可以是0.1M NaHCCb(例如，约pH 9.6)。

在一些实施方式中，试剂可以包括洗涤缓冲液。洗涤缓冲液可以包括基于三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液，如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。洗涤缓冲液可以包含洗涤剂，如离子或非离子洗涤剂。在一些实施方式中，洗涤缓冲液可以是pH值为约7.4的PBS缓冲液，包括浓度为约0.05％的20。

在一些实施方式中，试剂可以包括稀释缓冲液。试剂盒中可以包含本领域已知的任何稀释缓冲液。稀释缓冲液的示例包括蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)和洗涤剂，如20。在一些实施方式中，稀释缓冲液可以是pH值为约7.4的PBS，包括约1％ BSA的BSA和约0.05％的20。

在一些实施方式中，试剂可以包括检测或测定缓冲液。本领域已知的任何检测或测定缓冲液都可以包含在试剂盒中。

检测或测定缓冲液可以是比色检测或测定缓冲液、荧光检测或测定缓冲液或化学发光检测或测定缓冲液。比色检测或测定缓冲液包括但不限于PNPP(对硝基苯磷酸酯)、ABTS(2,2’-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或OPD(邻苯二胺)。荧光检测或测定缓冲液包括QuantaBlu^TM或QuantaRed^TM(ThermoWaltham，MA)。化学发光检测或测定缓冲液可包括鲁米诺或萤光素。检测或测定缓冲液还可包括触发器如H₂O₂和示踪剂如异鲁米诺-缀合物。

在一些实施方式中，试剂可包括用于校准或测试的溶液。在一些实施方式中，试剂可以包括终止液。试剂盒中可以包含本领域已知的任何终止液。示例终止液终止或延迟检测试剂和相应测定信号的进一步发展。终止液可包括低pH缓冲液(如甘氨酸缓冲液，pH值为2.0)、离液剂(如氯化胍、十二烷基硫酸钠(SDS))或还原剂(如二硫苏糖醇、b-mecaptoethanol)等。

在一些实施方式中，试剂可以包括清洁试剂。清洁试剂可以包括本领域已知的任何清洁试剂。在一些实施方式中，清洁试剂可以是自动测定系统制造商推荐的清洁试剂。

在一些实施方式中，本文所述类型的试剂盒可用于在检测仪器，如本文所述的检测仪器或系统上进行测定。在一些实施方式中，检测仪器被配置为检测和测量标记。为此，检测仪器可配置为检测或测量荧光、发光、化学发光或吸光、反射、透射、双折射或折射率。在一些实施方式中，检测仪器可以采用共焦和非共焦显微镜、微孔板阅读器、流式细胞仪等。

在一些实施方式中，试剂盒可包括适用于收集生物样品的组件，如下所述。组件可包括收集管、柱、注射器、针头等。

在一些实施方式中，试剂盒可以包括试剂盒组件的使用说明。说明书可以是任何形式，可以在试剂盒内，也可以在试剂盒外。说明书提供了有关方案和分析技术的详细信息。

试剂盒中的成分可以处于不同的物理状态。例如，部分或全部成分可以是冻干的，也可以是在水溶液中的或冷冻的。这些成分可包括待附着到本文所述固体支持物上的两种或更多种抗原、固体支持物、检测探针和辅助试剂。

试剂盒可根据特定的测定技术定制。例如，在一些实施方式中，试剂盒可以是FIA试剂盒、CIA试剂盒、RIA试剂盒、多重免疫测定试剂盒、蛋白质/肽阵列免疫测定试剂盒、SPRIA试剂盒、IIF试剂盒、ELISA、基于颗粒的多分析物技术(PMAT试剂盒)或点印迹试剂盒。在一些实施方式中，ELISA试剂盒可包括洗涤缓冲液、样品稀释液、二抗-酶缀合物、检测试剂和终止液。在一些实施方式中，点印迹试剂盒可包括洗涤缓冲液、样品稀释液、二抗-酶缀合物、检测试剂和终止液。在一些实施方式中，CIA试剂盒可包括洗涤缓冲液、样品稀释液、示踪剂(如异鲁米诺-缀合物)和触发器(如H₂O₂)。在一些实施方式中，多重试剂盒可包括洗涤缓冲液、样品稀释液和二抗-酶缀合物。在一些实施方式中，试剂盒可根据Luminex平台定制，例如包括珠。

试剂盒可用于诊断疾病，如但不限于CTD或自身免疫性疾病，通过提供一种机制来检测与抗原X结合的抗X抗体。可以使用试剂盒通过本文公开的任何技术来检测抗X抗体。抗原X：抗X抗体复合物或其抗原片段可以具有一比一或一比一以上的抗X抗体的化学计量。在一些实施方式中，复合物中每个抗原X可以有一个抗-X抗体；在一些实施方式中，复合物中每个抗原X可以有两个抗-X抗体；在一些实施方式中，复合物中每个抗原X可以有两个以上的抗-X抗体。用于测量两种抗原的结合化学计量的技术是本领域中众所周知的，并且包括例如等温滴定量热法(ITC)和超速离心法。

在一些实施方式中，抗原X:抗X抗体复合物或其抗原片段可以包括多个具有相同化学计量的复合物。例如，多个复合物中的所有复合物对每个抗原X具有一个抗X抗体。在一些实施方式中，抗原X:抗-X抗体复合物或其抗原片段可以是多个具有不同化学计量学的复合物。例如，多个复合物中的一些复合物可以每个抗原X具有一个抗X抗体，而多个复合物中的另一些复合物可以每个抗原X具有一个以上的抗X抗体。

在一些实施方式中，抗原X可以高亲和力与抗X抗体结合。在一些实施方式中，抗X抗体结合位点由抗X抗体的结合可以具有超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过8倍、超过10倍、超过15倍、超过20倍、超过25倍、超过50倍、超过100倍、超过300倍、超过1000倍、超过3000倍、超过10000倍、超过30000倍或超过100000倍的更高结合亲和力。

抗原X：抗X抗体复合物较低的解离常数(KDS)或各抗X抗体和抗原X较高的结合常数(KAS)都证明了更高的结合亲和力。在一些实施方式中，X：抗-X抗体复合物的解离常数(KDS)可以小于1mM(毫摩尔)、小于300nM(纳摩尔)、小于100nM、小于30nM、小于10nM、小于3nM、小于1nM、小于300pM、小于100pM、小于30pM、小于10pM、小于3pM或小于1pM。测量抗体与抗原结合亲和力的技术是已知的，包括ELISA、等温滴定量热法(ITC)和表面等离子体共振(SPR)。

与健康对照组相比，受试者中存在抗X抗体的增加可指示存在疾病或发展疾病的风险。因此，抗X抗体与抗原X的可测量增加可用于诊断与抗X抗体相关的疾病。下面提供了用于抗X抗体水平与对照(如预定基线)的检测和比较的示例技术。

在一些实施方式中，检测抗X抗体的水平。在一些实施方式中，可以使用本文所述的组合物和技术形成抗原X：抗X抗体复合物，并检测复合物中的抗X抗体。

在一些实施方式中，与健康对照个体相比，抗X抗体水平升高的检测指示受试者患有与抗X抗体相关的疾病。在一些实施方式中，使用本文所述的支持物抗原复合物和技术诊断出抗X抗体相关疾病后，可根据与抗X抗体相关疾病的发病或存在相关的各种症状进一步证实抗X抗体相关疾病的存在。例如，与系统性硬化症和肌炎相关的临床症状。

在一些实施方式中，与健康对照个体相比，抗X抗体水平升高的检测指示受试者有风险出现与抗X抗体相关疾病的临床症状。在一些实施方式中，受试者可能会在确定抗X抗体水平升高后的不到3个月、不到6个月、不到9个月、不到12个月、不到18个月、不到2年、不到3年、不到4年、不到5年、不到6年、不到7年、不到8年、不到9年、不到10年、不到12年、不到14年或不到16年内有风险出现与抗X抗体相关疾病的临床症状。

在一些实施方式中，与健康对照个体相比，抗X抗体水平升高的存在指示受试者在确定抗X抗体升高后的5年内出现与抗X抗体相关疾病的临床症状的可能性超过5％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过60％、超过70％或超过80％或超过90％。在一些实施方式中，抗X抗体水平升高的存在可指示，与健康对照个体相比，受试者在确定抗X抗体水平升高后5年内出现与抗X抗体相关疾病的临床症状的可能性超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过6倍、超过7倍、超过8倍、超过9倍或超过10倍。

术语"受试者"、"有机体"、"个体"或"患者"作为同义词并且可以互换使用，可以指脊椎哺乳动物。举例来说，本公开的受试者可以包括健康受试者、无症状受试者和患病受试者。

受试者可以是"疑似患有与抗X抗体相关的疾病"，如通过存在本领域已知的某些风险因素来确定。示例风险因素包括例如遗传易感性、个人疾病史、生活方式因素、环境因素、诊断指标等。

有风险患有或发展抗X抗体相关疾病的受试者可能有发展抗X抗体相关疾病的遗传倾向，或有抗X抗体相关疾病或其他自身免疫性疾病的家族史。受试者可能暴露于某些生活方式因素(如吸烟)或环境因素中，从而促进抗X抗体相关疾病的发展。受试者可表现出抗X抗体相关疾病的临床疾病表现。受试者可以是正在接受临床检查以诊断抗X抗体相关疾病或评估抗X抗体相关疾病发展风险的患者。

在一些实施方式中，受试者在其体液(如血液)或组织中可以具有抗X抗体。在一些实施方式中，与正常健康受试者相比，受试者在其体液或组织中可以具有升高的抗X抗体。在一些实施方式中，与正常健康受试者相比，受试者在其体液或组织中不会具有升高的抗X抗体。

在一些实施方式中，受试者可以是未接受治疗者。在一些实施方式中，受试者可以正在接受抗X抗体相关疾病的治疗(如药物治疗)。在一些实施方式中，受试者可以处于缓解期。在一些实施方式中，缓解可以是药物诱导的。在一些实施方式中，缓解可以是无药缓解。

在一些实施方式中，受试者可以是抗X抗体相关疾病的动物模型。在一些实施方式中，动物模型可以是与抗X抗体相关疾病的小鼠、兔子或灵长类动物模型。在一些实施方式中，动物模型可以涉及通过用抗原X免疫或接种动物来诱导抗X抗体反应。

受试者可以是"对与疾病相关的已知抗X抗体血清阴性"，即在血液检测中未能检测出与疾病相关的已知抗X抗体。

在一些实施方式中，与疾病相关的已知抗X抗体可以是抗线粒体抗体(AMA)、ANA、抗多核点(MND)自身抗体、抗核体(NB)自身抗体、抗己糖激酶1(HK1)抗体和抗KLHL12抗体。

在一些实施方式中，受试者可以是无症状的。无症状受试者包括基本上没有风险或仅有低风险发展抗-X抗体相关疾病的健康受试者(例如，无症状患者在接下来的五年期间发展抗-X抗体相关疾病的概率小于10％、小于5％、小于3％或小于1％)。无症状受试者还包括发展抗-X抗体相关疾病风险较高的健康受试者(例如，无症状患者在接下来的五年期间发展抗-X抗体相关疾病的概率大于50％、大于70％、大于90％或大于95％)。无症状受试者还包括患病受试者，这些受试者可以显示出与抗X抗体相关疾病的轻微早期诊断指标，但在其他方面没有疾病或不适。

应当注意的是，术语"健康对照个体"、"健康受试者"及其语法等同物可以互换使用，它们指的是不具有超过基线或已知或确定的标准值的增加的抗X抗体水平的受试者，这些受试者代表了没有与抗X抗体相关疾病的受试者。

在一些实施方式中，健康受试者可能从未患过某种疾病。在一些实施方式中，健康受试者以前可能患病。在一些实施方式中，健康受试者可以接受常规体检。在一些实施方式中，健康受试者可以是临床试验等对照组的成员。在一些实施方式中，健康受试者可能有感染疾病的风险，这如通过存在本领域众所周知的某些风险因素决定的。这些风险因素包括但不限于遗传易感性、个人疾病史、家族疾病史、生活方式因素、环境因素、诊断指标等。

确定或定义受试者为未患与抗X抗体相关疾病的受试者的基线或标准是参考区间。在诊断或健康相关领域，参考区间是在参考受试者(其可以是健康对照个体)中观察到的数值范围，以特定的百分位数表示。参考区间可以是本领域技术人员确定的任何数值范围。参见CLSI,“How to define and determine reference intervals in the clinicallaboratory:approved guideline,”C28:A2(2000)。

在一些情况下，参考区间可以严格或不那么严格，这取决于所测量的特定分析物或所研究的疾病。在一些实施方式中，参考区间可以设置为第95个百分位数。为了提高特异性和降低灵敏度，例如提高严格性，可以使用更高的截止值，如第96个百分位数或第97个百分位数或第98个百分位数或第99个百分位数。

如果相对于健康对照受试者的抗X抗体水平，抗X抗体水平至少高于第95个百分位数，则可认为受试者的抗X抗体增高。在其他实施方式中，如果抗X抗体水平高于第96个、第97个、第98个或第99个百分位数，则可认为受试者中的抗X抗体增高。如果受试者的抗X抗体水平达到或超过所公开的任何参考区间，则认为该受试者患有与抗X抗体相关的疾病。

在一些实施方式中，抗X抗体的存在可以基于信号与健康受试者中的背景的比较。在一些实施方式中，抗X抗体的存在可相对于在健康受试者群体中观察到的平均或中位抗X抗体水平而增加或减少。在一些实施方式中，健康受试者体内可能不存在抗X抗体。在一些实施方式中，抗X抗体水平的检测不超过用于确定抗X抗体水平的相应检测方法的噪声。在一些实施方式中，如果抗X抗体水平的检测超过用于确定抗X抗体水平的相应测定的噪声，则可认为样品中存在抗X抗体。在一些实施方式中，如果抗X抗体检测测定中的信号比噪声(如对照样品的平均或平均信号)高出至少两个标准差，则可认为样品中的抗X抗体增加了。在一些实施方式中，如果抗X抗体的水平超过了预定的阈值水平，就可以认为样品中存在抗X抗体。抗X抗体阈值水平可由熟练技工(如临床医师)根据各种因素确定，如临床试验的具体目标或某种抗X抗体水平的诊断和预后意义或用于与抗X抗体相关疾病而不涉及抗X抗体水平的检测的另一种诊断测试的结果。

抗-X抗体可在从受试者获取的各种不同生物样品中检测到。示例“生物样品"包括来自有机体体内的任何可用于分析或诊断的标本。例如，生物样品可包括液体样品，如全血、血浆、血清、滑膜液、羊水、痰液、胸腔积液、腹腔积液、中心脊髓液、尿液、胆汁、唾液或眼泪。生物样品还可包括固体组织样品，如肝脏活检样品、骨髓样品、口腔样品或其他固体或半固体细胞聚集样品。就本公开而言，从受试者处获得的生物样品可以是含有或怀疑含有自身抗体的任何样品，也包括可以检测到抗X抗体的受试者的任何材料。

生物样品可以是或包括例如全血、血清、血浆或痰液。在一些实施方式中，本公开的生物样品可以是组织活检，如肝脏活检。肝脏活检组织的长度可以小于10毫米、小于11毫米、小于12毫米、小于13毫米、小于14毫米、小于15毫米、小于16毫米、小于17毫米、小于18毫米、小于19毫米、小于20毫米、小于21毫米、小于22毫米、小于21毫米、小于23毫米、小于24毫米或小于25毫米。除了本文公开的长度外，肝脏活检还可包括至少4个肝门三联体、至少5个肝门三联体、至少6个肝门三联体、至少7个肝门三联体、至少8个肝门三联体、至少9个肝门三联体、至少10个肝门三联体或至少11个肝门三联体。

生物样品可以从任何含有或怀疑含有抗X抗体的受试者获取。生物样品也可以从不具有或疑似不具有抗X抗体的任何受试者身上获取。因此，在一些实施方式中，生物样品可以从有症状的受试者、无症状的受试者和抗X抗体阴性的受试者获取。在一些实施方式中，生物样品可以从哺乳动物获取。

生物样品可以立即采集和处理，也可以采集、冷冻并后续处理。生物样品还可以包括来自本文所述受试者之一的多个样品。在一些实施方式中，可以在超过12小时、超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过10天、超过14天、、超过3周、超过1个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过9个月、超过12个月、超过18个月、超过24个月、超过30个月、超过3年月、超过4年或超过5年的时间内定期收集多个生物样品。

在一些实施方式中，本文所述的示例技术可通过将生物样品与1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个本文所述的支持物-抗原复合物接触来执行。两种或更多种抗原可与本文所述的单一固体支持物结合。

检测结合的抗X抗体的存在可包括将抗X抗体与抗X抗体特异性检测探针(如抗原)接触，并检测抗体与检测探针的特异性结合。

报告标签可用于检测抗体。报告标签的功能是产生用于检测生物标志物的信号。在一些实施方式中，报告标签包括配体或微粒。在一些实施方式中，配体是生物素。在一些实施方式中，微粒包括纳米粒子。报告标签可例如通过非共价或共价交联附着到本文使用的任何检测探针上。报告标签可包括本文所述类型的标记。例如，标记可包括荧光团、酶、化学发光部分、放射性部分、有机染料、小分子、多肽或其功能片段。在一些实施方式中，标记包括荧光标记。在一些实施方式中，荧光标记是PE、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在一些实施方式中，标记与本公开的检测探针缀合，如上所述。

如本文所述，可通过检测结合的抗-X抗体的存在在受试者中确定与抗-X抗体相关的疾病。检测、测量和/或量化由本公开的标记产生的信号的技术是本领域众所周知的，包括荧光、发光、化学发光或吸光、反射、透射、双折射或折射率的检测。光学技术包括成像技术(如共焦和非共焦显微镜)和非成像技术(如微孔板阅读器)。在一些实施方式中，检测生物样品中抗X抗体的技术可包括生物样品中荧光、比色或吸光信号的可视化、定量或两者兼而有之。

所描述的不同实施方式的要素可组合成前面未具体阐述的其他实施方式。前面描述的系统中可以不包含要素而不会对其运行或整个系统的运行产生不利影响。此外，还可将各种独立要素组合成一个或多个单独要素，以执行本说明书中描述的功能。

本说明书中未具体描述的其他实施方式也属于以下权利要求的范围。

Claims (20)

1.复合物，其包含：

固体支持物；以及

附着在所述固体支持物上的至少两种不同类型的抗原。

2.权利要求1的复合物，其还包含：

载体，其附着到所述固体支持物上；

其中所述不同类型的抗原中的至少一种附着在所述载体上，所述不同类型的抗原中的至少一种通过所述载体附着在所述固体支持物上。

3.权利要求2的复合物，其还包含：

接头，以将所述不同类型的抗原中的至少一种附着到所述载体上。

4.权利要求3的复合物，其中所述接头包含聚乙二醇(PEG)间隔物或生物素。

5.权利要求2的复合物，其中所述载体包含链霉亲和素、聚合蛋白质、聚合链霉亲和素与生物素、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)间隔物附着物或己二酸二酰肼(ADH)中的至少一种。

6.权利要求1的复合物，其还包含：

多个载体，每个载体都附着到所述固体支持物上；

其中所述不同类型的抗原的每种分别附着在多个载体中的一个载体上，所述不同类型的抗原的每种通过多个载体中的一个载体附着在所述固体支持物上。

7.权利要求1的复合物，其还包含：

载体，其附着到所述固体支持物上；

其中所述不同类型的抗原的每种附着在所述载体上，所述不同类型的抗原的每种通过所述载体附着在所述固体支持物上。

8.权利要求1的复合物，其中至少两种不同类型的抗原包含受试者疾病或病症的标志物组。

9.权利要求1的复合物，其中所述不同类型的抗原的至少一种是附着在所述固体支持物上的细胞提取物的一部分。

10.权利要求1的复合物，其中所述不同类型的抗原中的第一种包含纯化的抗原，并且所述不同类型的抗原中的第二种是细胞提取物的一部分。

11.权利要求1的复合物，其中所述至少两种不同类型的抗原包含以下中的至少两种：Scl-70、着丝粒、dsDNA、Ro52、Ro60、SS-B、Ribo-P、DFS-70、EJ、Sp100、Gp210、肌动蛋白、AMA-M2、AMA-M2/MIT3、TIF1-γ、NXP-2、SAE、PL-7、PL-12、OJ、HMGCR、SRP、Mi-2、MDA-5、RNA螺旋酶、Ki/SL、Sm/RNP、SS-A、PM/Scl、RNA Pol III、Th/To、纤维蛋白、Sm、Ku、Jo-1、RNP、BICD2、HK、KL、LC1、LKM-1、SLA、SS-A/Ro52、Scl-70、Ku、着丝粒蛋白、U11/U12 RNP、己糖激酶-1或Kelch-12。

12.权利要求1的复合物，其中所述不同类型的抗原的至少一种与抗核抗体(ANA)结合。

13.权利要求1的复合物，其还包含：

与所述固体支持物缔合的标记，所述标记与使用所述至少两种不同的抗原可检测的疾病、病症或分析物相关。

14.试剂盒，其包含

第一固体支持物，其包含附着其上的第一抗原，所述第一抗原包含至少两种不同类型的抗原；以及

第二固体支持物，其包含附着其上的至少一种第二抗原，所述至少一种第二抗原与第一抗原不同；

其中所述第一抗原或所述至少一种第二抗原中的一种或多种包含纯化的抗原或是细胞提取物的一部分。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述第一固体支持物第一标记，所述第二固体支持物第二标记，所述第一标记与所述第二标记不同。

16.权利要求14的试剂盒，其中所述第一抗原包含第一种疾病或病症的标志物，所述第一标记与所述第一种疾病或病症相关；以及

其中所述至少一种第二抗原包含第二种疾病或病症的标志物，所述第二标记与所述第二种疾病或病症相关。

17.权利要求14的试剂盒，其中所述第一抗原包括第一标记，所述第一标记响应于与相应抗体的结合而产生信号；以及

其中所述至少一种第二抗原包含至少一种第二标记，所述至少一种第二标记响应于与至少一种相应抗体的结合而产生信号；

其中所述第一标记和所述至少一种第二标记属于同一类型或不同类型。

18.方法，其包括：

将来自受试者的生物样品与复合物接触，所述复合物包含：

固体支持物；以及

附着在所述固体支持物上的至少两种不同类型的抗原；以及检测所述生物样品中与所述复合物结合的抗体的存在，其中与所述复合物结合的所述抗体的存在指示疾病。

19.权利要求18的方法，其还包括：

基于所述固体支持物上的标记检测所述固体支持物，所述标记与所述疾病相关；

其中检测包括检测来自所述至少两种不同类型的抗原上的标记的信号。

20.权利要求18的方法，其中所述复合物是与所述生物样品接触的多个复合物之一，所述多个复合物中的每个具有与不同疾病相关的不同构型，所述多个复合物中的每个包含：

各自的固体支持物；以及

附着在所述各自的固体支持物上的一种或多种抗原。