CN119604306A

CN119604306A - 用干扰素-γ抗体治疗白癜风的方法

Info

Publication number: CN119604306A
Application number: CN202380056267.XA
Authority: CN
Inventors: 陈泓恺; 钟沛翰; 顾正仑; 黄昭瑜
Original assignee: An Lixi Rongshengyi Hong Kong Co ltd
Current assignee: An Lixi Rongshengyi Hong Kong Co ltd
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2023-06-02
Publication date: 2025-03-11
Also published as: EP4531919A1; WO2023235830A1; JP2025518805A

Abstract

本发明提供了使用特异性结合IFN‑γ的抗体治疗白癜风的方法。

Description

用干扰素-γ抗体治疗白癜风的方法

技术领域

本公开通常涉及用于治疗白癜风的方法，特别是使用结合干扰素-γ(IFN-γ)的抗体的方法。

背景技术

白癜风是T细胞介导的炎性皮肤病症，其逐渐破坏皮肤中的黑色素细胞，导致表皮黑色素细胞损失、斑片状毁容性色素脱失和使患者管理复杂化的不可预测的临床过程。IFN-γ及其标志性细胞因子(包括CXCL9、CXCL10和颗粒酶B(GzmB))在白癜风患者的皮肤病变中表达最高，并且是白癜风患者中促进自身反应性细胞毒性T细胞募集的关键细胞因子。IFN-γ通过降低黑色素细胞的活力、诱导细胞凋亡和/或下调黑色素生成而直接作用于黑色素细胞。IFN-γ可能通过在T细胞激活期间激活免疫受体(CXCR3)表达来刺激免疫细胞，并刺激CXCL9/CXCL10表达。因此，降低IFN-γ表达将减少T细胞运输至炎性病变位点。

IFN-γ是宿主免疫系统的关键调节剂并且在许多疾病中促成自身免疫病理学。除了充当趋化因子募集T细胞的诱导物之外，先前的报告显示IFN-γ信号传导在麻风病模型中维持皮肤色素沉着稳态。很少研究IFN-γ对白癜风中黑色素细胞的直接病理作用。关于细胞因子对黑素细胞发挥关键的细胞毒性作用的研究存在结果相互矛盾。诱导的细胞死亡、氧化应激和黑色素生成损伤在白癜风的发病机理中是关键的。白癜风中细胞死亡途径的大多数研究限于细胞凋亡。最近的进展导致许多新的调节的细胞死亡途径的发现，包括坏死性凋亡、细胞焦亡和铁死亡，它们可能是白癜风中黑色素细胞损失的原因。

发明内容

与本领域中关于IFN-γ和白癜风的理解相反，本公开提供用于治疗的方法和组合物，其基于能够阻断IFN-γ活性的抗体可用于治疗白癜风的惊人发现。不受理论的束缚，提出白癜风皮肤病变中高度表达的细胞因子引起对黑色素细胞的直接毒性。离体黑色素细胞研究支持了IFN-γ自身在黑色素细胞损失、增加的氧化应激和黑色素生成破坏中的直接作用。在白癜风患者中，提出IFN-γ信号传导导致黑色素细胞损失、增加的氧化应激和黑色素生成破坏。因此，本公开提供了治疗方法，其中白癜风患者被施用IFN-γ抗体，其中所述抗体中和IFN-γ信号传导的作用，并因此通过氧化应激相关的铁死亡细胞死亡来调节细胞死亡，其在白癜风中可引发自身免疫。此外，体内毒理学结果表明施用抗IFN-γ抗体是安全的且没有副作用，因此可用作治疗白癜风的更安全和潜在更有效的选择。

在一些实施方式中，本发明提供一种治疗白癜风的方法，其包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，所述IFN-γ抗体调节IFN-γ的生物功能。在一些实施方式中，所述IFN-γ抗体中和IFN-γ。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体抑制、降低和/或完全阻断IFN-γ的信号传导活性；任选地，其中所述IFN-γ抗体抑制、降低和/或完全阻断原人IFN-γ、成熟人IFN-γ或截短的人IFN-γ的IFN-γ信号传导活性。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体减少以下的一种或多种：IFN-γ-依赖性细胞因子产生；IFN-γ依赖性T细胞功能障碍，IFN-γ依赖性免疫耐受和IFN-γ依赖性炎症。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体降低黑色素细胞中IFN-γ、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11的表达。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

VH区，其具有选自SEQ ID NO:120或123的CDR-H1氨基酸序列，选自SEQ ID NO:121或124的CDR-H2氨基酸序列和选自SEQ ID NO:122或125的CDR-H3氨基酸序列；以及

VL区，其包含选自SEQ ID NO:132或135的CDR-L1氨基酸序列，选自SEQ ID NO:133或136的CDR-L2氨基酸序列和选自SEQ ID NO:134或137的CDR-L3氨基酸序列。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

(a)VH区，其具有SEQ ID NO:120的CDR-H1氨基酸序列，SEQ ID NO:121的CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO:122的CDR-H3氨基酸序列，和VL区，其包含SEQ ID NO:132的CDR-L1氨基酸序列，SEQ ID NO:133的CDR-L2氨基酸序列和SEQ ID NO:134的CDR-L3氨基酸序列；

(b)VH区，其具有SEQ ID NO:123的CDR-H1氨基酸序列，SEQ ID NO:124的CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO:125的CDR-H3氨基酸序列，和VL区，其包含SEQ ID NO:135的CDR-L1氨基酸序列，SEQ ID NO:136的CDR-L2氨基酸序列和SEQ ID NO:137的CDR-L3氨基酸序列；或

(c)VH区，其具有SEQ ID NO:123的CDR-H1氨基酸序列，SEQ ID NO:124的CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO:125的CDR-H3氨基酸序列，和VL区，其包含SEQ ID NO:132的CDR-L1氨基酸序列，SEQ ID NO:133的CDR-L2氨基酸序列和SEQ ID NO:134的CDR-L3氨基酸序列。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

VH区，其具有选自SEQ ID NO:120或123的CDR-H1氨基酸序列，选自SEQ ID NO:121或124的CDR-H2氨基酸序列和选自SEQ ID NO:122或125的CDR-H3氨基酸序列；以及VL区，其包含选自SEQ ID NO:132或135的CDR-L1氨基酸序列，选自SEQ ID NO:133或136的CDR-L2氨基酸序列和选自SEQ ID NO:134或137的CDR-L3氨基酸序列；以及

VH区，其包含与SEQ ID NO:109、110、164或165具有至少90％同一性的氨基酸序列；和VL区，其包含与SEQ ID NO:113或114具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL区。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

(a)SEQ ID NO:109的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:113的VL区氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:110的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:114的VL区氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO:109的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:114的VL区氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO:110的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:113的VL区氨基酸序列；

(e)SEQ ID NO:164的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:113的VL区氨基酸序列；或

(f)SEQ ID NO:165的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:113的VL区氨基酸序列。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

与SEQ ID NO:183、185、187或189具有至少90％同一性的重链氨基酸序列，以及

与SEQ ID NO:184或186具有至少90％同一性的轻链氨基酸序列。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体包含：

(a)SEQ ID NO:183的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:184的轻链氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:185的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:186的轻链氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO:183的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:186的轻链氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO:185的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:184的轻链氨基酸序列；

(e)SEQ ID NO:187的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:184的轻链氨基酸序列；或

(f)SEQ ID NO:189的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:184的轻链氨基酸序列。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体的所述VH区还包含选自N76A和N76Q的氨基酸取代。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB或BA。在所述方法的一些实施方式中，2A6Q在体内毒理学测定中不诱导感染或药物诱导的副作用。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链抗体。

在所述方法的一些实施方式中，通过选自下组的至少一种方式向所述受试者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。

在所述方法的一些实施方式中，所述有需要的受试者是患有白癜风的患者。

在所述方法的一些实施方式中，所述组合物以每天多于一次、每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次施用于所述受试者。

在所述方法的一些实施方式中，其还包括施用至少一种另外的治疗剂。

在所述方法的一些实施方式中，所述另外的治疗剂在施用所述组合物之前、施用所述组合物之后和/或与所述组合物同时施用于所述有需要的受试者。

在所述方法的一些实施方式中，其中所述IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合人类IFN-γ；任选地，其中通过对人IFN-γ的平衡解离常数(K_D)测量结合亲和力。在一些实施方式中，所述IFN-γ抗体还以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合恒河猴/食蟹猴IFN-γ，任选地，其中通过对人IFN-γ的平衡解离常数(K_D)测量结合亲和力。

在所述方法的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体使SEB刺激的人类PBMC的IL-2产生提高至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍或至少2.20倍。

在一些实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物用于在有需要的受试者中治疗白癜风的用途。

在一些实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物用于制备在有需要的受试者中治疗白癜风的药物的用途。

在所述用途的一些实施方式中，所述组合物与至少一种另外的治疗剂一起使用。

在所述用途的一些实施方式中，所述组合物通过选自下组的至少一种方式施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。

在所述用途的一些实施方式中，所述组合物用于每天多于一次、每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次使用。

在所述用途的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链抗体。

在所述用途的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。

在一些实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体，其用于在有需要的受试者中治疗白癜风。

在组合物的一些实施方式中，所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。

附图说明

图1显示了白癜风患者和健康对照中成对皮肤间质液分析物的电化学发光和趋化因子组表达分析，其具有高灵敏度中尺度电化学发光多重组(MSD)。IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11在白癜风患者的皮肤病变中高度表达。(*p<0.05，ns：不明显，Ctrl：健康对照)

图2A显示了IFN-γ剂量依赖性地降低黑色素细胞的活力。将各种浓度的重组人IFN-γ加入到人原代黑色素细胞中。将细胞在37℃下再培养72小时，并使用Celltiter-Glo测定细胞活力。引起黑色素细胞活力50％抑制的IFN-γ的计算IC₅₀为8.114ng/mL。

图2B显示了EI-001(即2A6Q)对IFN-γ的中和恢复细胞活力。将各种浓度的EI-001添加到用30ng/mL重组人IFN-γ培养的黑色素细胞中。将细胞在37℃下再培养72小时，并使用Celltiter Glo分析荧光素酶活性。EI-001的计算EC₅₀为5.214ng/mL。

图2C示出了在第2天和第7天用IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11处理后黑色素细胞的细胞活力。A.个体效应：10ng/mL和100ng/mL的IFN-γ均破坏黑色素细胞B的细胞活力，而CXCL9、CXCL10未破坏，CXCL11也没有。B.协同效应：用IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11处理的黑色素细胞未对黑色素细胞中的细胞死亡表现出协同效应。C.细胞形态变化：IFN-γ在处理的7天内诱导原代黑色素细胞中黑色素细胞的形态变化，而IFN-α则没有。处理剂量：2A6Q(10μg/mL)、IFN-γ(10或100ng/mL)、CXCL9(10ng/mL)、CXCL10(10ng/mL)、CXCL11(10ng/mL)。(*p<0.01，**p<0.0001；ns：不明显)

图3A显示了在人原代黑色素细胞中IFN-γ对黑色素生成的影响。将各种浓度的EI-001添加到用20ng/mL重组人IFN-γ培养的黑色素细胞中。将细胞在37℃下再培养7天，并分析黑色素含量。引起黑色素细胞黑色素生成50％抑制的IFN-γ的计算IC₅₀为0.392ng/mL。

图3B显示了通过EI-001的IFN-γ的中和恢复黑色素细胞的黑色素生成。将各种浓度的EI-001添加到用20ng/mL重组人IFN-γ培养的人原代黑色素细胞中。将细胞在37℃下再培养7天，并使用470nm处的吸光度测定黑色素含量。恢复黑色素细胞黑色素生成的50％抑制的IFN-γ的计算EC₅₀为129.1ng/mL。

图3C显示了IFN-γ破坏黑色素细胞中的黑色素产生。A.IFN-γ诱导原代黑色素细胞中黑色素调节剂(MITF，MLANA，TYRP1，DCTT，TYR，TRPM1)的下调。(IFN-γ100ng/mL 24小时v.s对照)B.用流式细胞仪观察到IFN-γ影响黑色素含量分泌。C.IFN-γ引起原代黑色素细胞中MITF表达的降低。用IFN-γ(10或100ng/mL)处理8小时和24小时的黑色素细胞中MITF的免疫印迹。β-肌动蛋白用作对照。(*p<0.05；ns：不明显)

图4显示了EI-001抑制CD4+和CD8+T细胞上的CXCR3表达。EI-001对来自3个个体供体的CD4+(A、C和E)和CD8+(B、D和F)T细胞上CXCR3表达的抑制能力。

图5显示了IFN-γ诱导早期细胞凋亡。A.使用膜联蛋白V-7AAD的流式细胞术显示IFN-γ显著上调膜联蛋白V而未上调7AAD。B.IFN-γ以剂量依赖方式诱导如由膜联蛋白V表达的早期细胞凋亡，并且2A6Q挽救凋亡。(48小时的IFN-γv.s 2A6Q 10μg/mL)。(IFN-γ(10或100ng/mL)，*p<0.0001；ns：不明显)

图6显示了IFN-γ诱导黑色素细胞中的氧化应激和脂质过氧化。A.IFN-γ诱导细胞内ROS。B.IFN-γ在黑色素细胞中诱导脂质过氧化。C.IFN-γ诱导原代黑色素细胞中的铁死亡调节剂(SLC7A11，SLC3A2，铁蛋白，GPX4，TFR1)下调。(IFN-γ100ng/mL 24小时v.s对照)。D.用IFN-γ处理2天的黑色素细胞中SLC7A11和SLC3A2的免疫印迹。GADPH用作装载对照。(IFN-γ(10或100ng/mL)，*p<0.05，**p<0.0001；ns：不明显)

图7显示了人单克隆抗IFN-γ抗体(2A6Q)挽救对黑色素细胞的IFN-γ毒性。A.细胞死亡抑制剂不能恢复IFN-γ诱导的细胞死亡。ROS清除剂(NAC)、坏死性凋亡抑制剂(NEC-1)、细胞焦亡抑制剂(VX-765)、细胞凋亡抑制剂(QVDOPH)。B.铁死亡抑制剂在处理的第7天挽救黑色素细胞的细胞活力。C.在处理的第2天和第7天，2A6Q以时间依赖性方式挽救黑色素细胞的细胞活力。D.用IFN-γ、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11处理，在处理的第2天和第7天，2A6Q以时间依赖性方式挽救黑色素细胞的细胞活力。处理剂量：2A6Q(10μg/mL)、IFN-γ(10ng/mL)、CXCL9(10ng/mL)、CXCL10(10ng/mL)、CXCL11(10ng/mL)。(*p<0.05，**p<0.001)。

具体实施方式

本公开提供了治疗方法和相关组合物，其基于能够阻断IFN-γ的信号传导活性的抗体可用于治疗白癜风的惊人发现。因此，本公开提供治疗白癜风的方法，其中有需要的患者被施用IFN-γ抗体。所述方法和组合物中可使用的IFN-γ抗体能够降低、抑制和/或阻断IFN-γ信号传导活性。如下文更详细描述的，因此治疗方法和相关组合物能够刺激和/或以其他方式恢复正常的免疫功能，其可有效治疗有需要的受试者的白癜风。

术语和技术

对于本文的描述和所附权利要求，单数形式“一”和“一个”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多于一种蛋白质，并且提及“一种化合物”是指多于一种化合物。“包括”，“包含”，“含有”，“包含着”和“含有着”的使用是可互换的并且不旨在是限制性的。还应当理解，当在各种实施方式的描述使用术语“包括”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由…组成”或“由…组成”替代地描述实施方式。

在提供数值的范围的情况下，除非上下文另外明确规定，否则应理解，在所述范围的上限与下限之间的数值的每一个介于中间的整数、和数值的每一介于中间的整数的十分之一以及在所述范围内的任何其它所陈述或介于中间的数值均涵盖在本发明内，除非上下文另外明确规定。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也被包括在本发明内，在所述范围内受到任何特别排除的限制。当所述范围包括一个或两个这些限制时，排除(i)一个或(ii)两个所包括的限制的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”，“5至20”，“25至50”，“1至10”等。

通常，如本文所用，命名法和本文所述的技术和方法包括本领域普通技术人员熟知和常用的那些，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2ndEd.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(hereinafter“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel etal.,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.(supplemented through 2011)(hereinafter“Ausubel”)；Antibody Engineering,Vols.1and 2,R.Kontermann andS.Dubel,eds.,Springer-Verlag,Berlin and Heidelberg(2010)；MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols,V.Ossipow and N.Fischer,eds.,2nd Ed.,HumanaPress(2014)；Therapeutic Antibodies:From Bench to Clinic,Z.An,ed.,J.Wiley&Sons,Hoboken,N.J.(2009)；以及Phage Display,Tim Clackson and Henry B.Lowman,eds.,Oxford University Press,United Kingdom(2004)中描述的那些常用的技术和方法。

本公开中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文献均出于所有目的通过引用方式整体并入本文中，其引用程度如同各单独出版物、专利、专利申请或其它文献个别地指示出于所有目的通过引用方式并入本文中。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方式，而不旨在限制。出于解释本公开的目的，以下对术语的描述将适用，并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语将包括复数形式，反之亦然。

如本文所用，“IFN-γ”，“IFN-g”或“干扰素-γ”是指二聚可溶性细胞因子，干扰素γ的各种形式，其为II型干扰素类别的成员，包括但不限于来自灵长类(例如人类、恒河猴和食蟹猴)、啮齿类的天然存在的IFN-γ，IFN-γ的各种翻译前和翻译后形式(例如原人IFN-γ、成熟人IFN-γ或截短的人IFN-γ)和IFN-γ的重组形式。

如本文所用，“白癜风”是指引起皮肤斑块失去色素或颜色的慢性自身免疫病症。当黑色素细胞被侵袭和破坏时会引发白癜风发，导致皮肤变成乳白色。白癜风的原因尚不清楚，但可能与免疫系统改变、遗传因素、应激或阳光暴露有关。

如本文所用，“抗体”是指包含一条或多条与特定抗原特异性结合或发生免疫性反应的多肽链的分子。本公开的示例性抗体包括天然抗体、全抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性(或杂缀合物)抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、抗原结合抗体片段(例如Fab’，F(ab’)₂，Fab，Fv，rIgG和scFv片段)、抗体融合体和合成抗体(或抗体模拟物)。

“IFN-γ抗体”，“抗IFN-γ抗体”或“结合IFN-γ的抗体”是指以足够亲和力结合IFN-γ的抗体，使得所述抗体可用作靶向IFN-γ的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方式中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，IFN-γ抗体与不相关非IFN-γ抗原的结合程度小于抗体与IFN-γ的结合的约10％。在一些实施方式中，结合IFN-γ的抗体具有＜1μM、＜100nM、＜10nM、＜1nM、＜0.1nM、＜0.01nM或＜0.01nM(例如10^-8M或更小，例如10^-8M到10^- ¹³M，例如10^-9M到10^-13M)的解离常数(Kd)。PCT申请PCT/CN2018/085836和PCT/US2019/024663的说明书通过引用整体并入本文。

“全长抗体”，“完整抗体”或“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。

“抗体片段”或“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其能够结合与全长抗体所结合的抗原相同的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；二聚抗体；线性抗体；单链抗体分子(如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的几种进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域被分别称为α、δ、ε、γ和μ。

“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如Kindt et al.,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91)。单个VH或VL结构域可可以足够赋予抗原结合特异性。此外，可使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库(参见，例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991))。

如本文所用，“高变区”或“HVR”是指在序列中高可变的和/后形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的各个区域。通常，天然抗体包含具有六个HVR的四条链：重链可变结构域中的三个，VH(H1，H2，H3)，和轻链可变结构域中的三个，VL(L1，L2，L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。示例性的高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。除非另有说明，本文根据KabaT等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)对可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)进行编号。

如本文所用，“互补决定区”或“CDR”是指可变结构域的高变区内的区域，其具有最高序列变异性和/或参与抗原识别的区域。通常，天然抗体包含具有六个CDR的四条链：重链可变结构域中的三个，VH(H1，H2，H3)，和轻链可变结构域中的三个，VL(L1，L2，L3)。示例性的CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34，L2的氨基酸残基50-56，L3的氨基酸残基89-97，H1的氨基酸残基31-35，H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102(KabaT等，同上)。除VH中的CDR-H1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。

“框架”或“FR”是指高变区(HVR)残基以外的可变区残基。可变区的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。可见，HVR和FR序列通常以下列序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

“天然抗体”是指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是大约150道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-到C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N-到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。基于抗体的恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可被支配为两种类型(称为κ(κ)和λ(λ))中的一种。

如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，可能的变体抗体除外(例如，变体抗体，其包含天然发生的或或在单克隆抗体产生期间产生的突变，并且通常以少量存在)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，术语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，其中包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、本文描述的用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。

“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。

“人源化抗体”是指包含来自非人HVR的氨基酸序列和来自人FR的氨基酸序列的嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化抗体将基本上包含至少一个且通常两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的FTVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些FTVR，且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。

如本文所用，“分离的抗体”旨在表示基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合IFN-γ的分离的抗体基本上不含特异性结合除IFN-γ以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合IFN-γ的分离抗体可具有与其它抗原(例如来自其它物种的IFN-γ分子)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。

如本文所用，“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于其他哺乳动物物种(例如小鼠)的CDR序列已经嫁接至人框架序列上的抗体。

“人单克隆抗体”是指展现出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，所述B细胞具有与无限增殖化细胞融合的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。

如本文所用，“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从转基因或转染色体的人类免疫球蛋白基因动物(如小鼠)中分离的抗体或由此制备的杂交瘤，(b)从转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，这类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然是来源于人种系VH和VL序列并与其相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合配对的成员(例如抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由平衡解离常数(K_D)表示。亲和力可通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示范性实施例。

“特异性结合”或“与…特异性结合”是指抗体与抗原以不超过约1×10^-7M的亲和力值结合。

“疗法(treatment)”，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变在接受治疗的受试者中的病症的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。期望的治疗结果可包括但不限于预防病症的发生或复发、缓解症状、减轻病症的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低进展速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。例如，HBV感染的治疗可包括向受试者施用治疗有效量的包含IFN-γ抗体的药物制剂以预防、延迟HBV感染的发展、减缓HBV感染的进展或根除HBV感染。

“药物组合物”或“组合物”或“制剂”是指允许活性成分的生物活性有效的形式的制剂，并且其不含对施用制剂的受试者有毒的另外的组分。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对其所施用的受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，“治疗有效量”是指活性成分或药物(例如药物组合物)达到所需治疗或预防结果(例如治疗或预防受试者的疾病，病症或病状)的量。在白癜风受试者的情况下，治疗剂的治疗有效量是在一定程度上减少、预防、抑制和/或缓解与白癜风相关的一种或多种症状的量。对于白癜风的治疗性治疗，体内功效可例如通过评估症状的持续时间、严重性和/或复发、响应率(RR)、响应持续时间和/或生活质量来测量。

“受试者”是指哺乳动物，其包括但不限于灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、兔和驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)。

本文提及的“有需要的受试者”包括患有白癜风的患者。

使用IFN-γ抗体治疗白癜风的方法

本发明提供治疗白癜风的方法，其包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物。下文更详细地描述并且实施例举例说明用于治疗方法的各种IFN-γ抗体组合物和施用方式。此外，还包括施用另外的治疗剂的治疗方法进一步描述于下文中并在实施例中举例说明。

IFN-γ是二聚可溶性细胞因子，其是II型干扰素类的成员。IFN-γ是一种重要的免疫刺激和免疫调节分子，其功能是作为巨噬细胞的激活剂和II类主要组织相容性复合物(MHC)分子表达的诱导剂。IFN-γ主要由自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT)细胞作为先天免疫应答的一部分产生，并且一旦发生抗原特异性免疫，由CD4 Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。IFN-γ的异常表达与许多自身炎症和自身免疫疾病有关。IFN-γ在免疫系统中的重要性被认为至少部分源于抑制病毒复制的能力。人类、灵长类和其它哺乳动物形式的IFN-γ的氨基酸和核苷酸序列和注释是公众可获得的。参见例如，UniProt词条编号P01579的人IFN-γ的完整氨基酸序列。人IFN-γ的氨基酸序列公开为所附序列表的SEQ ID NO:166。

通常，可用于治疗白癜风的方法中的IFN-γ抗体具有降低、抑制和/或阻断(部分或完全)IFN-γ信号传导活性的功能特性。在一些实施方式中，用于本公开的方法中的IFN-γ抗体能够调节IFN-γ的生物功能、中和IFN-γ或减少IFN-γ与其受体的结合。在一些实施方式中，IFN-γ抗体可降低、抑制和/或阻断原人IFN-γ、成熟人IFN-γ或截短的人IFN-γ的信号传导活性，和/或原人IFN-γ、成熟人IFN-γ或截短的人IFN-γ结合其受体的能力；从而减少IFN-γ-依赖性细胞因子产生、IFN-γ依赖性T细胞功能障碍，IFN-γ依赖性免疫耐受和/或IFN-γ依赖性炎症。

用于本公开的方法中的示例性IFN-γ抗体可包括例如调节IFN-γ的至少一种生物学功能或活性的IFN-γ拮抗剂或抑制剂。IFN-γ的生物功能或活性包括例如结合IFN-γ受体(IFN-γ-R)、调节(例如增强)细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)II类表达、调节(例如减少或抑制)细胞增殖和/或调节免疫反应。

在一些实施方式中，用于本公开的方法中的IFN-γ抗体完全或部分抑制IFN-γ信号传导活性。在一些实施方式中，IFN-γ抗体通过部分或完全阻断IFN-γ与IFN-γ受体的结合来完全或部分抑制IFN-γ信号传导活性。然而，预期IFN-γ抗体还可通过不涉及直接抑制IFN-γ与IFN-γ受体结合的机制来完全或部分抑制IFN-γ信号传导。

在一些实施方式中，用于本公开的方法和组合物中的IFN-γ抗体可以各种熟知的免疫球蛋白特征(例如CDR、HVR、FR、V_H和V_L结构域)的氨基酸序列和编码核苷酸序列来描述。下表1提供了用于本公开的方法中的示例性IFN-γ抗体(包括本文别处描述为“2A6”、“2B6”、“2A6_Q”(或“2A6Q”)和“2A6_A”(或“2A6A”)的IFN-γ抗体)的序列和序列标识符的概述。所述序列包含于所附序列表中。

表1：IFN-γ抗体序列

此外，用于本公开的方法和组合物中的IFN-γ抗体包括本领域中已知的特异性结合IFN-γ并且中和、抑制、降低和/或以其它方式阻断IFN-γ信号传导活性的任何抗体。本领域已知的示例性抗体包括以下IFN-γ抗体：AMG-811(描述于例如美国专利第7,335,743B2号中)，NI-0501(描述于例如美国专利第7,700,098B2号)，HuZAF(描述于例如美国专利第6,329,511B1号)。美国专利第7,335,743B2号、7,700,098B2号和第6,329,511B1号中每一个的公开内容均以引用方式整体并入本文中。

通常，可用于本公开的治疗方法中的IFN-γ抗体展现与IFN-γ的高亲和力结合。在一些实施方式中，本文提供的抗IFN-γ抗体具有＜100nM、＜10nM、＜1nM、＜0.1nM、＜0.01nM或＜0.01nM(例如10^-8M或更小，例如10^-8M到10^-13M，例如10^-9M到10^-13M)的结合IFN-γ的解离常数(Kd)。

此外，可用于本公开的方法中的抗IFN-γ抗体包括能够高亲和力结合人类IFN-γ、食蟹猴IFN-γ的抗体，且在一些实施方式中，高亲和力结合人类IFN-γ和食蟹猴IFN-γ。更具体地，在一些实施方式中，可用于本公开的方法中的IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合人类IFN-γ。在一些实施方式中，本公开的抗IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合食蟹猴IFN-γ。在一些实施方式中，本公开的抗IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合人类IFN-γ和食蟹猴IFN-γ。

通常，IFN-γ抗体的结合亲和力可使用多种试验中的任一种测定且以多种定量值表示。可用于测定抗体亲和力的特异性IFN-γ结合试验公开于本文实施例中。此外，抗原结合试验是本领域已知的并且可以在本文中使用，其包括但不限于使用技术的任何直接或竞争性结合测定，所述技术例如，蛋白质印迹(western blot)、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“三明治”免疫测定、基于表面等离子体共振的测定(如WO2005/012359中所述的BIAcore测定)、免疫沉淀测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。

在一些实施方式中，可用于本公开的方法中的抗IFN-γ抗体降低、抑制和/或完全阻断IFN-γ与其同源受体IFN-γ-R的结合，并由此调节IFN-γ介导的免疫调节和/或免疫信号传导。IFN-γ抗体抑制由IFN-γ结合介导的这些免疫调节和免疫信号传导途径的能力可使用已知的基于细胞的试验(包括本公开的实施例中所述的各种基于细胞的测定)进行体外检测。

因此，在一些实施方式中，可用于本公开的方法中的IFN-γ抗体的特征在于使由葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人类PBMC中的可测量免疫反应提高至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍或至少2.20倍的能力。例如，在一些实施方式中，IFN-γ抗体使SEB刺激的人类PBMC的IL-2产生和/或细胞增殖提高至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍或至少2.20倍。下文和实施例中进一步描述可用于本公开的方法中的示范性IFN-γ抗体的另外的功能特性。

如上所述，预期可用于本公开的治疗白癜风的方法中的IFN-γ抗体可包括包含特异性结合IFN-γ或与IFN-γ发生免疫性反应的一条或多条多肽链的任何免疫球蛋白。可见，可用于本公开的方法中的IFN-γ抗体包括天然抗体、全抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性(或杂缀合物)抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、抗原结合抗体片段(例如Fab’，F(ab’)₂，Fab，Fv，rIgG和scFv片段)、抗体融合体和合成抗体(或抗体模拟物)。

在本发明的一些实施方式中，IFN-γ抗体是包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其中包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

在根据本公开的一些实施方式中，IFN-γ抗体可以是免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链抗体。具体地，IFN-γ抗体可以是人蛋白或人源化结合蛋白。

在本公开的一些实施方式中，IFN-γ抗体是“抗原结合片段”，例如，双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。在这类实施方式中，抗原结合片段能够结合亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合的相同IFN-γ抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包含一个或多个来自特定人抗体的CDR，所述CDR移植到来自一种或多种不同人抗体的构架区。

在上述抗原结合片段中，具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)的结构的Fab具有一个抗原结合位点。Fab’与Fab的不同之处在于，Fab’具有铰链区，其在重链CH1结构域的C-末端具有包含至少一个半胱氨酸残基。当Fab’铰链区的半胱氨酸残基通过二硫键连接时产生F(ab’)₂。

Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，产生Fv片段的重组技术是本领域熟知的。“单链Fv抗体”或“scFv”指由直接或通过肽接头序列彼此连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程化抗体。双链Fv可以具有其中重链可变区通过非共价键与轻链可变区连接的结构，单链Fv通常可以形成如双链Fv中的二聚体结构，其中重链可变区通过肽接头与轻链可变区共价结合，或者重链和轻链可变区在其C-末端彼此直接连接。接头可以是包括1至100或2至50个任何氨基酸的肽接头，其合适的序列是本领域已知的。

可以使用蛋白酶获得抗原结合片段(例如，可以用木瓜蛋白酶消化全抗体以获得Fab片段，可以用胃蛋白酶消化以获得F(ab’)₂片段)，或者可以通过基因重组技术制备。

在本公开的方法的一些实施方式中，IFN-γ抗体可为多特异性抗体，例如双特异性抗体。在一些实施方式中，多特异性抗体是具有至少两个不同结合位点的单克隆抗体，每个结合位点对不同抗原具有结合特异性，其中至少一个特异性结合IFN-γ。在一些实施方式中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含对IFN-γ具有特异性和对介导免疫调节和/或免疫信号传导的另一种抗原具有特异性。在双特异性抗体的一些实施方式中，另一种特异性是针对抗原，所述抗原是选自以下的免疫检查点分子PD1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD200、CD200R、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226和VISTA。在抗IFN-γ双特异性抗体的一些实施方式中，抗体对其具有特异性的其它抗原选自PD1、PD-L1和CTLA-4。

制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见例如Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker et al.,EMBOJ.10:3655(1991))。“Knob-in-hole”工程也可用于产生可用于本公开的抗IFN-γ抗体的双特异性抗体。用于Knob-in-hole工程的技术在本领域中是已知的，并且被描述于例如美国专利第5,731,168号。

在一些实施方式中，可用于本公开的方法中的IFN-γ抗体可用改变以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点来进行抗体糖基化位点的添加或缺失。例如，本公开提供的示例性IFN-γ抗体2A6_A和2A6_Q，它们的序列经修饰以去除V_H区第76位的N连接糖基化位点。

还预期可以改变与Fc区连接的糖类(carbohydrate)。通常，由哺乳动物细胞产生的天然抗体包含通过N-连接与Fc区的CH2结构域的约第297位(“N297”)的天冬酰胺连接的支链双触角寡糖(参见，例如Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997))。寡糖可包括各种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中与GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方式中，抗体Fc区的寡糖的修饰可产生具有某些改进特性的变体。在一些实施方式中，本发明的IFN-γ抗体可以是亲本抗体的变体，其中所述变体包含缺乏与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的糖类结构。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以为约1％至约80％、约1％至约65％、约5％至约65％、或约20％至约40％。岩藻糖的量可以通过计算相对于连接至Asn 297的所有糖类结构(例如，复合物、混合和高甘露糖结构)的总和，在N297处的糖链内的岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱法所测量(参见例如，WO2008/077546)。N297是指Fc区中约第297位(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中较小的序列变化，N297也可位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即第294位和第300位之间。

在一些实施方式中，岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如美国专利公开号US2003/0157108或US2004/0093621。“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体及其相关制备方法的实例公开于例如，US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。

可用于产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Led 3CHO细胞(参见例如Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/015710和WO2004/056312)，以及敲除细胞系，例如例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。

在一些实施方式中，可用于本公开的方法中的IFN-γ抗体可在Fc区中包含一个或一个以上氨基酸修饰(即Fc区变体)。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸残基位置处包含氨基酸取代的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。下文描述了本领域已知的多种可用于本公开的抗IFNγ抗体的Fc区变体。

在一些实施方式中，预期IFN-γ抗体是具有改变的效应子功能的Fc区变体。在一些实施方式中，具有改变的效应功能的抗体具有亲本抗体的一些(但不是全部)效应功能、降低的效应功能或不具有效应功能(例如无效应子)。对于效应功能是不必要的或有害的(例如ADCC)和/或抗体的体内半衰期是重要的某些应用，无效应子Fc区变体是更期望的。具有降低的效应功能或无效应子的Fc区变体抗体可在一个或多个以下Fc区位置包含氨基酸取代：238、265、269、270、297、327和329。(参见，例如，美国专利第6,737,056号)。这类Fc区变体可以包括在265、269、270、297和327位置中的两个或更多个处的氨基酸取代。这类Fc区变体还可以包括将残基265和297替换为丙氨酸(参见例如美国专利第7,332,581号)。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种治疗白癜风的方法，其包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物。

因此，示例性的基于细胞的模型研究支持IFN-γ抗体可中和与白癜风发病相关的基于细胞的途径的机制。也就是说，本发明表明IFN-γ抗体可用于提供治疗白癜风的改进方法。

施用IFN-γ抗体组合物的方式

根据治疗方法向有需要的受试者施用包含IFN-γ抗体的组合物或制剂，提供了保护受试者免受白癜风和/或治疗白癜风的治疗作用。

在本公开的治疗方法的一些实施方式中，包含IFN-γ抗体的IFN-γ抗体组合物或制剂通过全身性递送药物或递送到所需靶组织的任何施用方式施用于受试者。全身性施用通常是指将抗体在不同于直接进入所需靶位点、组织或器官的位点向受试者施用，从而使抗体或其制剂进入受试者的循环系统，并因此经历代谢和其它类似过程的任何模式。

因此，可用于本公开的白癜风治疗方法的施用模式可包括但不限于注射、输注、滴注和吸入。通过注射施用可包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。

在根据本公开的方法的一个实施方式中，其中所述IFN-γ抗体可通过选自下组的至少一种方式向所述有需要的受试者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。在一个实施方式中，IFN-γ抗体可静脉内施用于有需要的受试者。

在一些实施方式中，IFN-γ抗体的制剂是经配制以保护抗体免于在肠道中失活。因此，治疗方法可包括制剂的口服给药。

在一些实施方式中，本发明提供一种包含IFN-γ抗体的组合物或制剂作为用于治疗白癜风的药物的用途。此外，在一些实施方式中，本发明还提供包含IFN-γ抗体的组合物或制剂在制造或制备用于治疗白癜风的药物中的用途。在另一个实施方式中，所述药物用于治疗白癜风的方法中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的所述药物。在某些实施方式中，所述药物还包含有效量的至少一种另外的治疗剂或疗法。

在另一个实施方式中，药物用于治疗受试者的白癜风，包括向受试者施用有效量的所述药物以治疗白癜风。

对于白癜风的治疗，本公开的组合物和制剂中所包含的IFN-γ抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于以下因素，其中包括疾病的严重程度和病程，抗体是出于预防或治疗目的施用，施用于患者的先前疗法，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。

通常，可用于本公开的方法的治疗方案可由有需要的受试者的医务人员决定。当包含在本文所述的组合物和制剂中时，本公开的IFN-γ抗体可适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。本文考虑的各种给药方案，包括但不限于在各种时间点单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。

在所述方法的一些实施方式中，包含IFN-γ抗体的组合物以每天多于一次、每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次施用于所述受试者。

根据白癜风的类型和严重程度，本公开的制剂中约1μg/kg至15mg/kg的IFN-γ抗体是施用于人类受试者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用还是通过连续输注。通常，抗体的施用剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。在一些实施方式中，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。

剂量施用可以维持几天或更长时间，这取决于受试者的状况，例如，施用可以持续至白癜风得到充分治疗，如通过本领域已知的方法确定。在一些实施方式中，可以施用初始的较高负荷剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。可以通过常规技术和测定来监测剂量施用的治疗效果的进展。

可见，在本发明的方法的一些实施方式中，IFN-γ抗体的施用包括约1mg/kg到约100mg/kg的每日剂量。在一些实施方式中，IFN-γ抗体的剂量包括至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg或至少约30mg/kg的每日剂量。

与另外的治疗剂的组合疗法

在根据本发明的一个实施方式中，所述方法还可包括施用至少一种另外的治疗剂的步骤。例如，可将另外的治疗剂与IFN-γ抗体组合物组合施用于有需要的受试者—例如与IFN-γ抗体组合物同时施用；在施用IFN-γ抗体组合物之前；或在施用IFN-γ抗体组合物之后。在一些实施方式中，另外的治疗剂可包括白癜风的另外的疗法或与白癜风相关的疾病或病症的治疗。预期在组合治疗方法中，通过施用IFN-γ抗体组合物与另外的治疗剂的组合，可以提高该治疗剂的功效。不受理论束缚，据信，在施用治疗有效量的IFN-γ抗体组合物和任选的另外的治疗剂之后，与白癜风相关的免疫反应可在有需要的受试者中降低或改善，甚至达到不可检测的水平。此外，降低或改善的免疫应答可包括进一步调节免疫系统活性的抗体或细胞因子的降低。

在一个实施方式中，进行包含施用至少一种另外的治疗剂的方法，其中所述另外的治疗剂为IFN-γ拮抗剂。如本文别处所述，可用于组合治疗方法的IFN-γ拮抗剂可包括降低用于治疗已患有白癜风的受试者的治疗剂的IFN-γ的至少一种生物活性的水平的IFN-γ拮抗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂选自第二IFN-γ中和抗体、IFN-γ受体拮抗剂和IFN-γ或IFN-γ受体的小分子抑制剂。

在本发明的其它实施方式中，另外的治疗剂可以选自下组：治疗剂；成像剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉松弛剂；麻醉剂；非甾体抗炎药(NSAID)；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗银屑病药；皮质类固醇；合成代谢类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗抑郁药；抗精神病药；兴奋剂；哮喘药物；β激动剂；吸入的类固醇；肾上腺素或其类似物；细胞因子；和细胞因子拮抗剂；免疫调节剂。

实施例

在以下代表性实施例中说明了本公开的各种特征和实施方式，这些代表性实施例旨在说明而非限制。本领域技术人员将容易理解，具体的实施例仅仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更充分地描述的。本申请中描述的每个实施例和特征应被理解为可与包含在其中的每个实施例互换和组合。

实施例1：IFN-γ抗体

A.重组IFN-γ抗体产生

在标准条件下，在含有FreeStyle^TM 293表达培养基(Gibco，12338018)的250mL烧瓶中以1×10⁶个细胞的浓度培养FreeStyle^TM 293-F细胞(Thermo Scientific，R79007)。通过使用作为转染试剂的平均分子量为25kDa的线性聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences,Warrington,Pa)和总共88μg的质粒DNA进行指数生长的FreeStyle^TM 293-F细胞(1.5-2×10⁶个细胞)的瞬时转染。转染后，细胞培养3天，收获培养基。将培养基以3000rpm离心10分钟以去除FreeStyle^TM 293-F细胞碎片，然后收集所得上清液并通过0.45μm过滤器过滤。

B.重组抗体纯化

随后用Protein A Sepharose Fast Flow珠(GE Healthcare,17-1279-01)纯化上述获得的所得上清液以获得重组抗体。简言之，将80μL的Protein A Sepharose Fast Flow珠加入80mL上清液，并均匀等分到两个50mL管中，将其在4℃下旋转孵育24小时。然后，将试管以3000rpm离心10分钟，然后去除所得上清液，用PBS平衡珠。用0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱平衡的珠，并将洗脱液收集在含有1M Tris(pH8.0)的管中，并用PBS缓冲液透析，以分别获得单克隆抗体，其中包括2A6、2B6、2A6A、2A6Q和BA抗INF-γmAb。

为清楚起见，各个单克隆抗体的VH链和VL链上的CDR被概括于表2中。根据Kabat(Wu,T.T.和Kabat,E.A.,1970J.Exp.Med.132:211-250)和IMGT系统(Lefranc M.-P.等，1999Nucleic Acids Research,27,209-212)通过序列注释和通过基于互联网的序列分析，如在例如www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html和www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast中所述的。在下表2中，CDR中的“K”表示基于Kabat系统，CDR中的“I”表示基于IMGT系统，表2

实施例2：IFN-γ、CXCL9、CXCL10和CXCL11在白癜风患者的皮肤病变中高度表达

为了了解可能的致病途径，我们首先对白癜风患者和健康对照的皮肤病变进行细胞因子分析。我们基于先前的队列选择IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL13、IL15、IL17A和IL18。

材料和方法：使用用于细胞因子组研究的高灵敏度Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光试验来测量皮肤吸水疱间质液分析物中的IFN-γCXCL9、CXCL10、CXCL11、IL13、IL15、IL17A、IL18。在MS2400成像仪(MSD)上分析MSD板。(Dabitao等，2011)MSD的样品体积要求远小于具有较高灵敏度的常规ELISA，使得能够在单个水疱间质液分析物中研究更多的细胞因子。(Hwang等，2019)。根据制造商的说明书进行MSD试验。所有标准品和样品以一式三份的方式测量。本研究中来自同一患者的一些细胞因子组结果已被用于白癜风活性和严重程度的临床生物标志物研究(CY Ng，2022)。

结果：如图1所示，从32名白癜风患者收集来自病变(V-L)和非病变(V-NL)皮肤的成对水疱间质液，收集10名健康志愿者(对照，Ctrl)，并通过经由MSD免疫测定法选定的一组细胞因子进行分析。白癜风患者的平均年龄为44.58±15.81岁，健康对照者为42.82±8.69岁。健康者和白癜风患者的男性和女性比例为1：1。白癜风的BSA为12％(±13.1％)，VES评分为9.02(±9.822)。IFN-γ及其下游细胞因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在白癜风患者中的表达高于健康对照。通过比较，没有观察到IL-15、IL-17A和IL-18细胞因子的显著变化。

实施例3：IFN-γ直接影响黑色素细胞的细胞活力和细胞形态变化

进行功能研究以探索细胞因子IFN-γ、CXCL9、CXCL10和CXCL11的高表达对黑色素细胞的致病作用。

材料和方法：为了检测人原代黑色素细胞(HEMn-DP)细胞活力的IFN-γ抑制的剂量依赖性，在37℃下，以10,000个细胞/孔的浓度在100μL测定培养基(补充有1x HMGS，10ng/mL PMA加青霉素-链霉素的M254)中将HEMn-DP细胞接种到96孔板中持续5小时。接种后，加入100μL IFN-γ的连续稀释液，然后在37℃下孵育72小时。然后，使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)根据制造商的说明书测量细胞增殖。使用iD3多模式读数器(MolecularDevices)测量发光，并利用GraphPad Prism7使用非线性回归曲线拟合分析数据。

为了测定2A6Q(即EI-001)的效能，如先前所述的接种HEMn-DP细胞，且在100μL测定培养基中与各种浓度的EI-001预孵育IFN-γ25分钟。孵育后，将EI-001混合物加入到每个孔中(最终IFN-γ浓度为30ng/mL)，并将黑色素细胞在37℃下再培养72小时，并使用Celltiter Glo通过荧光素酶活性测定黑色素细胞的细胞增殖。

为了测定用IFN-γ、CXCL9、CXCL10、CXCL11处理后黑色素细胞的细胞活力，在第2天和第7天，收集细胞并接种到96孔板中。粘附后，用IFN-γ(0、10、100ng/mL)和不同的化合物处理细胞：2A6Q、CXCL9、CXCL10、CXCL11、ROS清除剂(NAC)、坏死性凋亡抑制剂(NEC-1)、细胞焦亡抑制剂(VX-765)、细胞凋亡抑制剂(QVD-OPH)、铁死亡抑制剂(利普司他汀-1(Liproxstaitin-1)、铁抑素-1(Ferrostatin-1)、DFO)。使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒(Promega)根据制造商的方案测量细胞活力。使用光度计(iD3Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices))测量最终反应产物的吸光度。计算后，对照细胞的活力为100％，所有其它细胞相对于对照细胞标准化并表示为相对细胞活力(％)。处理剂量：N-乙酰半胱氨酸(NAC；0.05mM，1mM)、坏死抑制素-1(NEC-1；20μM，2μM)、Belnacasan(VX-765；50μg/mL，5μg/mL)、喹啉-Val Asp-二氟苯氧甲基酮(QVD-OPH；10μM，2μM)、利普司他汀-1(Liproxstaitin-1)(10μM，5μM，1μM，0.05μM)、铁抑素-1(Ferrostatin-1)(5μM，1μM)、去铁胺(DFO，10μM,5μM,1μM,0.05μM)、2A6Q(10μg/mL)、CXCL9(10ng/mL，10pg/mL)、CXCL10(10ng/mL，10pg/mL)、CXCL11(10ng/mL，10pg/mL)。

结果：如图2A所示，黑色素细胞的IFN-γ剂量依赖性降低的活力。将各种浓度的重组人IFN-γ添加至人原代黑色素细胞中。引起黑色素细胞活力50％抑制的IFN-γ的计算IC₅₀为8.114ng/mL。如图2B中所示，EI-001中和了IFN-γ的增殖抑制作用并且恢复细胞活力。EI-001的计算EC₅₀为5.214ng/mL。

如图2C所示，IFN-γ在处理的第7天显著降低黑色素细胞的细胞活力，而CXCL9、CXCL10或CXCL11则没有。随后研究IFN-γ、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11对黑色素细胞的细胞活力的协同作用。具体地，已经显示CXCL10增强黑色素细胞中IFN-γ介导的细胞毒性。有趣的是，在这些细胞因子之间没有发现协同效应。因此，IFN-γ本身是黑色素细胞活力的最关键的细胞因子。IFN-γ直接影响黑色素细胞的细胞活力和细胞形态变化。

I型IFN和IFN-γ通过JAK/STAT途径共享重叠但不相同的途径。在细胞形态测定中，发现IFN-γ有助于黑色素细胞的形态改变，伴有树突状的损失和黑色素细胞细胞质的膨胀，而IFN-α则没有，IFN-γ的作用是剂量依赖性的且浓度低至1ng/mL，而IFN-α则不是。

实施例4：IFN-γ破坏黑色素细胞黑色素生成

为了研究IFN-γ对黑色素生成的影响，用100ng/mL的IFN-γ与配对对照处理黑色素细胞以用于转录组分析。

材料和方法：为了检测IFN-γ对HEMn-DP细胞黑色素生成的抑制的剂量依赖性，将HEMn-DP细胞以200,000个细胞/孔的浓度接种到具有IFN-γ的连续稀释液的1mL测定培养基(补充有1x HMGS，10ng/mL PMA加青霉素-链霉素的M254)中的24孔板中，然后在37℃下孵育7天。在第3天和第5天用具有连续滴定浓度的IFN-γ的新鲜培养基替换细胞测定培养基。在第7天，首先将细胞用PBS洗涤两次，在250μL的1N NaOH/10％D MSO溶液中裂解，然后在80℃孵育1小时。裂解后，将各裂解物转移到96孔板中，然后在470nM下测量黑色素的吸光度。用通过CellTiter-Glo试剂盒测量的每个样品的细胞活力标准化相对黑色素量，并使用GraphPad Prism7使用非线性回归曲线拟合分析数据。为了测定EI-001的效能，如先前所述的接种HEMn-DP细胞，且在1mL测定培养基中用指定量的EI-001预孵育IFN-γ25分钟。孵育后，将混合物加入各个孔中(最终IFN-γ浓度为20ng/mL)。如前所述测定黑色素细胞的黑色素含量。

用RNA纯化试剂盒(Zymo Research,r2050)从黑色素细胞提取总RNA。从原代黑色素细胞和黑色素细胞细胞系(Gibco)中提取RNA样品后，将样品送至Biotools Co.,LtdTaiwan进行RNA测序。通过Agilent Technologies 2100Bio-analyzer利用大于8的RNA完整性值来检测RNA质量。在rRNA耗尽(Epicenter)、RNA片段化和文库制备(Illumina)后，用Illumina NovaSeq6000测序仪对构建的文库进行150bp配对末端测序。通过HISAT2软件将每个样品的结果与GRCh38基因组比对，并通过Biotools Co.,Ltd Taiwan进行分析。

将细胞在PBS中洗涤，并在具有蛋白酶抑制剂和苯甲烷磺酰氟(PMSF；Sigma-Aldrich,P7626)的RIPA裂解缓冲液中裂解。将总细胞裂解物超声处理并在4℃、13000rpm离心30min。使用Bradford测定定量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离总细胞裂解物并转移到PVDF膜上。将膜在室温下用TBST中的5％ BSA或5％牛奶封闭1小时，并在4℃下与一抗孵育过夜，并在室温下与HRP-缀合的二抗孵育1小时。通过Thermo ibright1500可视化蛋白质。一抗如下：抗人SLC7A11(CST，12691)，抗人SLC3A2(CST，13180)，抗IRF1(CST，8478)，抗MITF(CST，12590)和抗GAPDH(Abcam，ab8245)。

结果：如图3A所示，黑色素细胞的IFN-γ剂量依赖性降低的黑色素生成。引起黑色素细胞黑色素生成50％抑制的IFN-γ的计算IC₅₀为0.392ng/mL。如图3B所示，EI-001中和了IFN-γ的黑色素生成抑制作用并且恢复黑色素细胞的黑色素生成。恢复黑色素细胞黑色素生成的50％抑制的IFN-γ的计算EC₅₀为129.1ng/mL。如图3C所示，IFN-γ诱导原代黑色素细胞中黑色素调节剂(MITF、MLANA、TYRP1、DCTT、TYR、TRPM1)的下调。为了进一步证实该发现，在用不同剂量的IFN-γ处理后8小时和24小时，在黑色素细胞中进行MITF(黑色素生成的关键调节剂)的免疫印迹。结果显示，在处理24小时时，IFN-γ剂量依赖性地下调黑色素细胞中的MITF的表达。此外，分光光度计进一步证实IFN-γ处理以剂量依赖性方式降低黑色素含量，其可通过添加2A6Q挽救。

实施例5：EI-001抑制CD4+和CD8+T细胞上的CXCR3表达

本实施例说明在T细胞激活期间，IFN-γ中和抗体EI-001(2A6Q)抑制CD4+和CD8+T细胞上的CXCR3表达。

材料和方法：使用Ficoll-Paque密度梯度离心从全血分离来自健康成年供体的PBMC。将PBMC在加湿的37℃培养箱中在RPMI-1640培养基中孵育24小时，该RPMI-1640培养基补充有5％人血清和标准抗生素，2-ME和HEPES。然后将PBMC以1×10⁶个细胞/孔和1mL新鲜培养基/孔接种在24孔板中，并通过将细胞与人T细胞TransAct(1：200)混合来刺激。然后加入结果中所示的抗体并充分混合。培养2天后，收集PBMC，用PBS洗涤3次，重悬于培养基中，并与指定的抗体再培养2天。

如所要求的处理PBMC(见上文)，然后收获用于流式细胞术抗体染色，使用抗人CD4、抗人CD8、抗人CD56和抗人CXCR3抗体在冰上在黑暗中染色30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤PBMC两次，用Attune NxT流式细胞仪通过流式细胞术测定CXCR3的表达。使用Flow Jo软件进行流式细胞术数据分析。

结果：如图4所示，为了理解EI-001在T细胞上的CXCR3表达中的抑制能力，在PBMC的激活期间将EI-001(2A6Q)添加到培养基中。通过流式细胞术测定CD4+T细胞和CD8+T细胞上CXCR3的表达。EI-001抑制CD4+T细胞上CXCR3表达的IC₅₀为0.279-1.313μg/mL，抑制CD8+T细胞上CXCR3表达的IC₅₀为1.029-6.941μg/mL(图4)。此数据支持以下结论：EI-001(2A6Q)对IFN-γ的中和在T激活期间抑制CD4和CD8+T细胞上的CXCR3表达。

实施例6：IFN-γ诱导黑色素细胞中的早期细胞凋亡

本实施例说明IFN-γ诱导黑色素细胞中的早期细胞凋亡，其可被2A6Q挽救。

材料和方法：用膜联蛋白V(BD，550474)和7AAD(1mg/mL，Sigma A9400-1MG)检测黑色素细胞的细胞凋亡。分离细胞并用含有膜联蛋白V和7AAD的100mL的结合缓冲液(BD，556454)在室温下黑暗中重悬15分钟。在分析之前，将细胞加入到300mL结合缓冲液中并立即在流式细胞仪(Verse BD)上分析。

结果：图5描绘IFN-γ+以剂量依赖性方式诱导黑色素细胞中的早期细胞凋亡，如膜联蛋白V所证实的，并且2A6Q能够逆转细胞凋亡。然而，泛半胱天冬酶(pan-caspase)抑制剂不能挽救黑色素细胞中IFN-γ诱导的细胞死亡，这表明除了诱导细胞凋亡以外，还有其它替代途径促成黑色素细胞中的细胞损失。(图7A)

实施例7：在黑色素细胞中IFN-γ增加ROS脂质过氧化并诱导铁死亡细胞死亡

据报道，IFN-γ在黑色素瘤癌症免疫治疗期间引起铁死亡和脂质过氧化，有助于在癌症免疫治疗期间在黑色素瘤肿瘤中释放损伤相关分子模式(DAMP)。还没有对正常黑色素细胞进行类似的研究。

材料和方法：对于细胞内ROS测量，将黑色素细胞用PBS洗涤并与20μM CM-H2DCFDA(Invitrogen)在37℃下在黑暗中孵育30min。将细胞用PBS重悬并在488nm的激发波长和530nm的发射波长下用流式细胞术检测；用FlowJo分析数据。

为了检测脂质过氧化，将黑色素细胞接种在6孔板中，第二天用IFN-γ处理。用PBS洗涤黑色素细胞，并用含有5μM BODIPY 581/591C11(Invitrogen,D3861)的Hanks平衡盐溶液(HBSS，Gibco)孵育，并在组织培养箱中在37℃下孵育15分钟。用新鲜的HBSS重悬细胞并用流式细胞仪检测；用FlowJo分析数据。

结果：如图6A中所示，通过20μM CMH2DCFDA测量，在第7天，在10ng/mL和100ng/mLIFN-γ中，IFN-γ显著升高细胞内ROS。此外，在第6天用IFN-γ处理的黑色素细胞中，脂质过氧化水平以剂量依赖性方式增加(图6B)。针对铁死亡标志物的黑色素细胞转录组学表达的RNA测序分析显示，在与IFN-γ孵育24小时后，SLC7A11、SLC3A2、铁蛋白、GPX4和TFR1下调。(图6C)。在与IFN-γ孵育48小时后的SLC7A11的免疫印迹也显示IFN-γ剂量依赖性地下调黑色素细胞中SLC7A11的表达，这表明铁死亡过程。(图6D)

实施例8：人抗IFN-γ单克隆抗体(2A6Q)逆转黑色素细胞死亡和黑色素细胞的黑色素生成

黑色素细胞丢失是白癜风的标志；因此，我们旨在解决ROS清除剂和其他抗-死亡分子的效果以挽救IFN-γ介导的黑色素细胞损失。

结果：如图7所示，将N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为ROS清除剂提供给培养基，但未发现NAC的挽救效果。有趣的是，2A6Q逆转IFN-γ诱导的黑色素细胞中的ROS。为了研究诱导的黑色素细胞死亡而不是凋亡，用坏死性凋亡抑制剂(NEC-1)、细胞焦亡抑制剂(VX-765)、细胞凋亡抑制剂(QVD-OPH，泛半胱天冬酶抑制剂)和2A6Q在利用IFN-γ的黑色素细胞中重复细胞活力研究，持续7天。(图7A)。利用铁死亡抑制剂铁抑素-1(Ferrostatin-1)、DFO和利普司他汀-1(Liproxstaitin-1)研究黑色素细胞中IFN-γ诱导的铁死亡。结果表明，1μM的利普司他汀-1(Liproxstaitin-1)可部分挽救IFN-γ诱导的黑色素细胞损失。相比之下，2A6Q的挽救效果比所有其它细胞死亡抑制剂更显著。此外，2A6Q还逆转了MITF的下调和黑色素含量的降低(图3C)，早期细胞凋亡(图5B)，细胞氧化应激(图6A)，脂质过氧化(图6B)，并逆转了黑色素细胞中SLC7A11所证实的铁死亡。(图6D)。

实施例9：与NI-0501相比，2A6Q在所有剂量水平下是良好耐受的并且几乎不显示副作用

本实施例说明，当在EI001重复静脉内输注4周后评估潜在毒性时，IFN-γ中和抗体EI-001(2A6Q)是良好耐受的，并且相比于另一种抗-IFN-γ抗体(NI-0501)显示更好的副作用概况。

材料和方法：将总共40只食蟹猴(20只雌性和20只雄性)分成4组，其中5只动物/性别/组，并且通过30分钟静脉内输注施用10mL/kg体积的EI-001(2A6Q)(10、30和100mg/kg)或载体(制剂缓冲液)，每周一次，总共5次剂量，接着6周恢复期。计划在主要阶段结束时(第30天)和恢复阶段结束时(第72天)对所有动物进行尸检。在研究期间，评价了以下参数：临床观察、眼科、体重、食物消耗、体温(直肠温度)、临床病理学(血液学、凝血、血浆化学、淋巴细胞免疫表型和尿液分析)、大体病理学、器官重量和组织病理学。同时进行毒代动力学、免疫原性、局部刺激评估、心血管(ECG、体表温度、血压)、呼吸和中枢神经系统安全性药理学评估。在给药前，第一次和第四次给药后立即、1小时、4小时、8小时、24小时、72小时、120小时和168小时，在给药前和第三次给药后立即收集毒代动力学样品。在给药前第1、15、22天和第57、71天收集免疫原性样品。

结果：如表3所示，经过EI-001(2A6Q)处理的所有动物存活至其计划的尸检。本研究中未发现EI-001(2A6Q)在临床观察、眼科、体重、食物消耗、局部刺激、体温(直肠温度)、安全性药理学评价(心血管参数、呼吸和中枢神经系统)、临床病理学(血液学、凝血、血浆化学和尿液分析)、淋巴细胞免疫表型、大体病理学或器官重量方面的相关变化。此外，在显微镜水平上仅观察到与EI-001(2A6Q)施用相关的变化。相比于使用抗IFN-γ抗体NI-0501的在先毒理学研究(NDA/BLA Multi-Disciplinary Review and Evaluation applicationnumber:761107；www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2018/761107Orig1s000MultidisciplineR.pdf)，用EI-001(2A6Q)处理没有增加被处理的猴子的死亡率或感染易感性。此外，用EI-001(2A6Q)治疗没有诱导可观察到的感染症状。这些发现表明EI-001(2A6Q)不诱导任何感染迹象。总体结果表明EI-001(2A6Q)处理可以是中和IFN-γ的更安全和潜在更有效的方法。因此，EI-001(2A6Q)在治疗由IFN-γ诱导的疾病如白癜风中具有更好的治疗效果。

综上，我们证实了阻断细胞凋亡、坏死性凋亡、铁死亡和ROS产生的单一药物不能保护黑色素细胞免受IFN-γ介导的细胞毒性。这些观察结果表明IFN-γ的细胞毒性作用是通过多种途径介导的。与阻断选定的细胞死亡途径相反，我们的体外研究结果支持2A6Q通过中断IFN-γ信号传导在IFN-γ诱导的细胞死亡、氧化应激和黑色素细胞功能丧失的挽救效果，这是白癜风的潜在治疗选择。此外，体内毒理学结果显示EI-001(2A6Q)治疗不引起任重大的药物不良事件。因此，EI-001(2A6Q)可以是用于白癜风的安全且有前景的治疗策略。

虽然为了清楚和理解的目的，已经通过实施例和说明的方式相当详细地描述了本发明的前述公开内容，但是包括本文所述的实施例、描述和实施方式的本公开内容是为了说明的目的，其旨在是示例性的且不应解释为限制本公开内容。本领域技术人员将清楚的是，可以对本文描述的实施例、描述和实施方式进行各种修改或改变，并且这些修改或改变将被包括在本公开和所附权利要求的精神和范围内。此外，本领域技术人员将认识到与本文所述的那些方法和程序相当的许多方法和程序。所有这些等同物应理解为在本公开的范围内并由所附权利要求覆盖。本发明的其它实施例在下面的权利要求中阐述。

Claims

1.一种治疗白癜风的方法，其包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFN-γ抗体调节IFN-γ的生物功能。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFN-γ抗体中和IFN-γ。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFN-γ抗体抑制、降低和/或完全阻断IFN-γ的信号传导活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述IFN-γ抗体降低原人IFN-γ、成熟人IFN-γ或截短的人IFN-γ的IFN-γ信号传导活性。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFN-γ抗体减少以下的一种或多种：IFN-γ-依赖性细胞因子产生；IFN-γ依赖性T细胞功能障碍，IFN-γ依赖性免疫耐受和IFN-γ依赖性炎症。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述IFN-γ抗体降低黑色素细胞中IFN-γ、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11的表达。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体使SEB刺激的人类PBMC的IL-2产生和/或细胞增殖提高至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍或至少2.20倍。

9.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

10.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

11.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

(a)VH区，其包含与SEQ ID NO:109、110、164或165具有至少90％同一性的氨基酸序列；以及

(b)VL区，其包含与SEQ ID NO:113或114具有至少90％同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

13.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:183、185、187或189具有至少90％同一性的重链氨基酸序列；以及

(b)与SEQ ID NO:184或186具有至少90％同一性的轻链氨基酸序列。

14.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体包含：

15.根据权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体的所述VH区还包含选自N76A和N76Q的氨基酸取代。

16.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。

17.根据权利要求17所述的方法，其中在体内毒理学测定中，感染或药物诱导的副作用不是由2A6Q诱导的。

18.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体是免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链抗体。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中通过选自下组的至少一种方式向所述受试者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者是患有白癜风的患者。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述组合物以每天多于一次、每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次施用于所述受试者。

22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其还包括施用至少一种另外的治疗剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述另外的治疗剂在施用所述组合物之前、施用所述组合物之后和/或与所述组合物同时施用于所述有需要的受试者。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合人类IFN-γ。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合恒河猴IFN-γ或食蟹猴IFN-γ。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述IFN-γ抗体以1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、1×10^-10M或更小或者1×10^-11M或更小的结合亲和力结合人类IFN-γ和食蟹猴IFN-γ。

27.一种包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物用于在有需要的受试者中治疗白癜风的用途。

28.一种包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体的组合物用于制备在有需要的受试者中治疗白癜风的药物的用途。

29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述组合物与至少一种另外的治疗剂一起使用。

30.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述组合物通过选自下组的至少一种方式施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。

31.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述组合物用于每天多于一次、每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次使用。

32.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述IFN-γ抗体是免疫球蛋白分子、Fv、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)或单链抗体。

33.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。

34.一种组合物，其包含治疗有效量的IFN-γ抗体和药学上可接受的载体，其用于在有需要的受试者中治疗白癜风。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述IFN-γ抗体是选自由2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI-0501和芳妥珠单抗组成的组的抗体。