CN119591709A

CN119591709A - 一种抗cd25抗体及其应用

Info

Publication number: CN119591709A
Application number: CN202311158915.0A
Authority: CN
Inventors: 朴锦华; 高翔; 王国永; 曹欢; 周家杰; 朱笑婷; 刘玉姣; 谭伟; 魏婷婷; 张秋磊; 张维
Original assignee: Leto Laboratories Co Ltd
Current assignee: Leto Laboratories Co Ltd
Priority date: 2023-09-08
Filing date: 2023-09-08
Publication date: 2025-03-11

Abstract

本发明提供了一种抗CD25抗体及其应用。所述抗体包含如下互补决定区CDR‑H1，其含有SED ID NO:1‑9任一项所示的氨基酸序列；CDR‑H2，其含有SEQ ID NO:10‑23任一项所示的氨基酸序列；CDR‑H3，其含有SEQ ID NO:24‑32、SEQ ID NO:54‑55任一项所示的氨基酸序列；CDR‑L1，其含有SEQ ID NO:33‑39任一项所示的氨基酸序列；CDR‑L2，其含有SEQ ID NO:40‑45、SEQ ID NO:56‑57任一项所示的氨基酸序列；CDR‑L3，其含有SEQ ID NO:46‑53任一项所示的氨基酸序列。所述抗体不影响CD25结合IL‑2的抗体，特异性清除调节性T细胞Treg，以达到治疗肿瘤的目的。

Description

一种抗CD25抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及一种抗CD25抗体及其应用。

背景技术

调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是一类具有显著免疫抑制作用的T细胞亚群，大约占外周血的1％-2％，由Sakaguchi等人于1995发现，以表达Foxp3、CD25和CD4等为细胞表型特征。Treg是属于Th1,Th2,Th17之外的一类增殖能力较低的CD4+T细胞亚群，在免疫稳态和诱导免疫耐受以及炎症反应趋于慢性、促进肿瘤进展中都发挥着重要作用。

Treg对免疫稳态的调控至关重要。在肿瘤微环境中存在大量的Treg细胞，目前认为其是帮助肿瘤细胞逃避机体免疫监视的“罪魁祸首”之一。在许多恶性疾病如肺、胰腺和乳腺癌等已经发现Treg细胞明显增高。Treg被认为是肿瘤免疫治疗的重要治疗靶点。通过Treg在已形成的肿瘤中的浸润，对效应性T细胞(Teff)和Treg细胞的比例进行调节逃脱免疫监视，被认为是肿瘤免疫治疗的关键因素。通过调节Teff调节效应细胞和Treg的比例进行肿瘤治疗，成为肿瘤免疫治疗的可行性方案。

CD25是Treg细胞表面的标志性蛋白之一，又称IL-2的alpha受体。IL-2是Treg和效应T细胞生存所必需的细胞因子。与效应T细胞相比，Treg主要通过由α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)亚单位组成的更高亲和力受体结合IL-2。此外，Tregs比效应T细胞具有更高的CD25表达。这使得Treg在利用肿瘤微环境(TME)中有限的IL-2方面具有竞争优势。同时，Treg还分泌免疫抑制分子(包括免疫抑制细胞因子)抑制抗肿瘤免疫。Treg产生TGF-β、IL-10和IL-35导致免疫抑制。因此，CD25是清除Treg的理想靶标蛋白。

目前上市抗CD25单抗类药物达利珠单抗(daclizumab)，用于一种自身免疫病多发性硬化症(MS)的治疗。2002年获批上市的巴利昔单抗(舒莱)是一种人/鼠嵌合的单克隆抗体，可定向拮抗IL-2的受体α链(CD25)，阻断T细胞与IL-2结合，抑制Teff细胞的增殖。适应症为预防肾移植术后的早期急性器官排斥。2019年上市的，三生国健的人源化抗CD25单克隆抗体注射液健尼哌，特异性作用于激活的T细胞IL2受体α链，通过与CD25结合，拮抗IL-2与受体结合所介导的T细胞增殖，适应症为预防肾移植引起的急性排斥反应。传统的CD25抗体药物在结合CD25的同时，还阻断了CD25同IL-2的结合，因此，传统CD25抗体的抗肿瘤活性很弱。

最近，英国伦敦大学以CD25作为靶标进行肿瘤免疫治疗的研究发现，利用特殊改造的抗小鼠CD25抗体，可以在不阻断IL-2/CD25结合的前体下，特异性清除Treg细胞。该团队研究得出，抗肿瘤的CD25抗体药物需要选择性消耗Treg但不影响Teff可更好的发挥抑制肿瘤的作用。研究成果转让给罗氏，抗CD25单抗RG6292正处于临床评估阶段(NCT04158583)。

CD25除了在T细胞表面有表达，活化的B细胞、一些胸腺细胞上也有表达，因免疫系统的复杂性，抗肿瘤药物需要平衡多种免疫细胞的活性，因此研发新一代的CD25抗体药物具有很高的临床需求和商业价值。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种抗CD25抗体及其应用。其解决了现有技术中存在的CD25抗体抗肿瘤活性较弱的问题。

本发明第一方面，提供一种抗CD25抗体，包含如下互补决定区：

CDR-H1，其含有SED ID NO:1-9任一项所示的氨基酸序列；

CDR-H2，其含有SEQ ID NO:10-23任一项所示的氨基酸序列；

CDR-H3，其含有SEQ ID NO:24-32、SEQ ID NO:54-55任一项所示的氨基酸序列；

CDR-L1，其含有SEQ ID NO:33-39任一项所示的氨基酸序列；

CDR-L2，其含有SEQ ID NO:40-45、SEQ ID NO:56-57任一项所示的氨基酸序列；

CDR-L3，其含有SEQ ID NO:46-53任一项所示的氨基酸序列。

进一步地，包含如下互补决定区：

(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(2)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(3)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L3；

(4)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；

(5)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(6)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；

(7)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(8)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L3；

(9)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3；

(10)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(11)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:514的氨基酸序列的CDR-L3；

(12)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(13)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(14)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-L3；

(15)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-L3；

(16)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L3；

(17)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(18)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；

(19)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3。

在一个具体实施方式中，可以包含在本发明提供的抗CD25抗体中的6个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的组合示于表1、2中：

表1-1 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列

表1-2 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列

表2-1 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3序列

表2-2 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3序列

	LCDR1	SEQ ID NO	LCDR2	SEQ ID NO	LCDR3	SEQ ID NO
							133L2	KASQSVSNDVA	34	GASNRYT	56	QQDYNSPYT	47
133L3	KASQSVSNDVA	34	GASNRYT	56	QQDYNSPYT	47
							134L2	RSSQSIVHSNGNTYLE	36	KVSNRFS	42	FQGSHFPYA	48
134L3	RSSQSIVHSNGDTYLE	35	KVSNRFS	42	FQGSHFPYA	48
							163L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYNFPPT	46
163L2	RASENIYYSLA	33	NANSLAD	57	KQAYNFPPT	46
							161L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYNFPPT	46
162L1	RSSQSIVHSNGNTYLE	36	KVSNRFS	42	FQGSHFPYA	48
							167L1	RASESVDTYGKSFMH	37	RASNLQS	43	QQSNENPRT	49
174L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYNFPPT	46
							177L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYKFPPT	50
189L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYNFPPT	46
							191L1	RASENIYYSLA	33	NANSLED	40	KQAYNFPPT	46
195L1	QATQDIVKNLN	39	YATELAE	45	LQFYEFPLT	52
							202L1	KASQSVSNDVA	34	YASNRYT	41	QQDYWSPWT	53

进一步地，包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包括SEQ ID NO:58-73所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包括SEQ IDNO:74-86、88-89所示的氨基酸序列；

或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:90-92、94-102、104、106、108-118所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包括SEQ ID NO:119122、125-133所示的氨基酸序列；

优选地，包括如下的重链可变区和轻链可变区：

(1)SEQ ID NO:58所示的重链可变区、SEQ ID NO:74所示的轻链可变区；

(2)SEQ ID NO:59所示的重链可变区、SEQ ID NO:75所示的轻链可变区；

(3)SEQ ID NO:60所示的重链可变区、SEQ ID NO:76所示的轻链可变区；

(4)SEQ ID NO:61所示的重链可变区、SEQ ID NO:77所示的轻链可变区；

(5)SEQ ID NO:62所示的重链可变区、SEQ ID NO:78所示的轻链可变区；

(6)SEQ ID NO:63所示的重链可变区、SEQ ID NO:79所示的轻链可变区；

(7)SEQ ID NO:64所示的重链可变区、SEQ ID NO:80所示的轻链可变区；

(8)SEQ ID NO:65所示的重链可变区、SEQ ID NO:81所示的轻链可变区；

(9)SEQ ID NO:66所示的重链可变区、SEQ ID NO:82所示的轻链可变区；

(10)SEQ ID NO:67所示的重链可变区、SEQ ID NO:83所示的轻链可变区；

(11)SEQ ID NO:68所示的重链可变区、SEQ ID NO:84所示的轻链可变区；

(12)SEQ ID NO:69所示的重链可变区、SEQ ID NO:85所示的轻链可变区；

(13)SEQ ID NO:70所示的重链可变区、SEQ ID NO:86所示的轻链可变区；

(14)SEQ ID NO:71所示的重链可变区、SEQ ID NO:78所示的轻链可变区；

(15)SEQ ID NO:72所示的重链可变区、SEQ ID NO:88所示的轻链可变区；

(16)SEQ ID NO:73所示的重链可变区、SEQ ID NO:89所示的轻链可变区；

(17)SEQ ID NO:90所示的重链可变区、SEQ ID NO:119所示的轻链可变区；

(18)SEQ ID NO:91所示的重链可变区、SEQ ID NO:120所示的轻链可变区；

(19)SEQ ID NO:92所示的重链可变区、SEQ ID NO:121所示的轻链可变区；

(20)SEQ ID NO:92所示的重链可变区、SEQ ID NO:122所示的轻链可变区；

(21)SEQ ID NO:94所示的重链可变区、SEQ ID NO:121所示的轻链可变区；

(22)SEQ ID NO:95所示的重链可变区、SEQ ID NO:121所示的轻链可变区；

(23)SEQ ID NO:96所示的重链可变区、SEQ ID NO:125所示的轻链可变区；

(24)SEQ ID NO:97所示的重链可变区、SEQ ID NO:126所示的轻链可变区；

(25)SEQ ID NO:98所示的重链可变区、SEQ ID NO:127所示的轻链可变区；

(26)SEQ ID NO:99所示的重链可变区、SEQ ID NO:128所示的轻链可变区；

(27)SEQ ID NO:100所示的重链可变区、SEQ ID NO:129所示的轻链可变区；

(28)SEQ ID NO:101所示的重链可变区、SEQ ID NO:130所示的轻链可变区；

(29)SEQ ID NO:102所示的重链可变区、SEQ ID NO:131所示的轻链可变区；

(30)SEQ ID NO:102所示的重链可变区、SEQ ID NO:132所示的轻链可变区；

(31)SEQ ID NO:104所示的重链可变区、SEQ ID NO:131所示的轻链可变区；

(32)SEQ ID NO:104所示的重链可变区、SEQ ID NO:132所示的轻链可变区；

(33)SEQ ID NO:106所示的重链可变区、SEQ ID NO:131所示的轻链可变区；

(34)SEQ ID NO:106所示的重链可变区、SEQ ID NO:132所示的轻链可变区；

(35)SEQ ID NO:108所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(36)SEQ ID NO:109所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(37)SEQ ID NO:110所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(38)SEQ ID NO:111所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(39)SEQ ID NO:112所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(40)SEQ ID NO:113所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(41)SEQ ID NO:114所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(42)SEQ ID NO:115所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(43)SEQ ID NO:116所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(44)SEQ ID NO:117所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区；

(45)SEQ ID NO:118所示的重链可变区、SEQ ID NO:133所示的轻链可变区。

在一个具体实施方式中，可以包含在本发明提供的抗CD25抗体中的重链可变区和轻链可变区的组合示于表3、4中：

表3-1重链可变区

表3-2轻链可变区

表4-1重链可变区

表4-2轻链可变区

进一步地，所述抗体选自单克隆抗体、特异性结合人CD25的抗体片段，包含特异性结合人CD25抗体片段的融合蛋白；

优选地，所述抗体为scFv；

优选地，所述抗体为鼠源抗体或人源化抗体；

优选地，所述抗体不影响CD25同IL-2结合。

在本发明中，所述抗体可以指衍生自抗CD25抗体并保留所述抗体的抗原(CD25)结合亲和力的片段。在一实施方式中，抗体片段可以是包含上述抗CD25抗体的6个CDR的多肽，例如可以是scFv、scFv-Fc、scFv-Cκ(κ恒定区)、scFv-Cλ(λ恒定区)、Fab，但不限于此。

本发明第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的抗CD25抗体。

本发明第三方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含上述核酸分子。

在本发明一实施方式中，所述重组载体可以分别(例如，在两个单独的载体中)或全部一起(例如，在一个载体中)包含编码轻链可变区或轻链的核酸分子和编码重链可变区或重链的核酸分子。所述重组载体可以用作表达载体。

本发明第四方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含上述核酸分子或重组载体。

本发明第五方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述抗CD25抗体、核酸分子、重组载体；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明中，所述药学上可接受的载体可以是选自通常用于抗体制剂的任何载体。例如，药学上可接受的载体可以是选自乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等中的一种或多种，但不限于此。所述药物组合物还可以包含选自常用于制造药物组合物的稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味增强剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等中的一种或多种。

所述药物组合物或所述抗体可以药学有效量口服或肠胃外施用。肠胃外施用可以是静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用或病灶内局部施用。由于蛋白质或肽在口服施用时被消化，因此用于口服施用的组合物中的活性成分可以被包衣或配制成防止在胃中消化。另外，所述抗体或所述组合物可以使用能够将活性成分递送至靶细胞的任选装置来施用。

所述药物组合物可以配制成在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳化溶液、提取物、粉末、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且还可以包含用于配制的分散剂或稳定剂。

本发明第六方面，提供所述的抗CD25抗体、所述的核酸分子、所述的重组载体在制备药物中的应用，所述药物包括如下(1)-(6)任一种功效：

(1)治疗或预防癌症；

(2)特异性清除Treg细胞；

(3)激活抗肿瘤免疫；

(4)清除免疫抑制因子；

(5)调节效应性T细胞和Treg细胞的比例；

(6)不会阻断IL-2信号传导，能够诱导ADCC效应。

本发明第七方面，提供一种制备抗CD25抗体的方法，所述方法包括培养上述的重组细胞。

本发明的技术原理为：

本发明通过使用人CD25蛋白免疫小鼠，得到抗人CD25抗体，并通过筛选，获得不影响CD25结合IL-2的抗体，然后通过Fc部分的ADCC效应，特异性清除调节性T细胞Treg，以达到治疗肿瘤的目的。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过使用人CD25蛋白免疫小鼠的方法，通过多次筛选，得到了能够不影响CD25同IL-2结合的抗CD25抗体，并在后期的药效实验中一些抗CD25抗体表现出相对RG6292更强的药效。

附图说明

图1为本发明实施例1中Phage展示抗CD25抗体与CD25结合ELISA效果图，其中，抗CD25抗体编号为105、133、134、161、162、163、167、174、177、181、183、189、191、195、202；

图2为本发明实施例5中10μg/mL抗CD25抗体与KARPASS和SUDHL-1细胞结合平均荧光强度图，其中，抗CD25抗体编号为105、131、133、134、161、162、163、167、174、177、181、183、189、191、195、202；

图3为本发明实施例5中抗CD25抗体与KARPASS和SU-DHL-1细胞结合平均荧光强度，其中，抗CD25抗体编号为133nH6L2、133nH6L3、133nH7L2、133nH7L3、133nH9L2、133nH9L3、RG6292；

图4为本发明实施例5中抗CD25抗体与KARPASS和SU-DHL-1细胞结合平均荧光强度，其中，抗CD25抗体编号为163nH1L2、163H4L1、163H5L1、134H3L2、134H4L2、134H9L2、134H12L2、134H13L2、134H14L2、134H16L2、134H19L2、134H21L2、134H24L2、134H29L2、RG6292；

图5为本发明实施例5中抗CD25抗体与KARPASS和SU-DHL-1细胞结合平均荧光强度，其中，抗CD25抗体编号为161H1L1、162H1L1、163nH1L1、167H1L1、174H1L1、177H1L1、189H1L1、195H1L1、202H1L1、RG6292；

图6为本发明实施例6中CD25抗体清除人外周血单个核细胞(hPBMC)中Treg％的变化情况图；

图7为本发明实施例6中CD25抗体清除人外周血单个核细胞(hPBMC)中Treg的实验中，Treg细胞绝对计数；

图8为本发明实施例7中133nH9L和134H24L2、RG6292这3株抗体对人PBMC免疫重建的Karpas299/NCG-hIL15小鼠动物模型进行药效实验结束后脾脏和血液中Treg％情况图；

图9为本发明实施例8中133nH9L和134H24L2、RG6292等3株抗体对MC38/B-hIL2RA人源化小鼠动物模型进行药效实验结束后脾脏和血液中的Treg％情况。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

技术术语

术语“抗体”可以指与特定抗原特异性结合的蛋白质，并且可以是通过免疫系统中的抗原刺激产生的蛋白质，或通过化学合成或重组产生而产生的蛋白质，没有具体限制。抗体可以是非天然存在的，例如，通过重组或合成产生而产生的。抗体可以是动物抗体(例如小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

术语“重链”可以指涵盖全长重链及其片段，其中所述全长重链可以包含可变区VH(包括足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)，三个恒定区CH1、CH2和CH3，以及铰链。

术语“轻链”可以指在涵盖全长轻链及其片段，其中所述全长轻链可以包含可变区VL(包括足以提供对抗原的特异性的氨基酸序列)，和恒定区CL。

术语“互补决定区(CDR)”可以指在抗体的可变区中赋予抗原结合特异性的部分，并且可以指在免疫球蛋白的重链或轻链的高可变区中发现的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包括三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3；以及CDRL1、CDRL2和CDRL3)。所述CDR可以提供在抗体与其抗原或抗原表位的结合中起重要作用的接触残基。

术语“scFv”是指由抗体重链可变区和轻链可变区通过15-20个氨基酸的短肽连接而成，不含Fc片段。

抗CD25抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且例如是单克隆抗体。可以使用本领域广为人知的方法，例如使用噬菌体展示技术来制备单克隆抗体。或者，抗CD25抗体可以通过常规方法以小鼠来源的单克隆抗体的形式构建。

实施例1免疫建库和筛选

1、动物免疫

本发明采购商品化的CD25(ACRO Lot#ILA-H52H9)对Balb/C小鼠进行免疫，每2周进行一次加强免。经4-5次免疫后，取尾静脉血检测抗CD25抗体的血清效价。根据效价检测情况，选择免疫效果最佳的小鼠收集脾脏细胞。

2、建库

从免疫后的小鼠中收集脾细胞，并从中分离出脾脏B细胞。使用Trizol(Thermofisher,Cat.No.15596018)提取RNA后，使用反转录试剂盒(Thermofisher,Cat.No.11756500)参照说明书进行RT-PCR，得到总cDNA。

第一轮PCR以cDNA为模板,用小鼠抗体的简并引物分别扩增抗体的重链片段和轻链片段。第二轮进行重叠PCR，将重链片段混合液和轻链片段混合液进行混合，加入正向引物和反向引物，用PCR的方式进行重轻链片段拼接，得到两端带有酶切位点的单链抗体ScFv片段。将噬菌体展示载体pcomb3X和ScFv片段用SfiI(NEB)进行消化,并进行DNA片段回收，并将回收产物按照适当比例混合，用T4连接酶连接。制备TG1电击感受态，将连接产物通过电穿孔的方式电转到TG1感受态中得到抗体库的原始库。

将原始抗体库在含有100ug/ml氨苄的2YT培养基当中进行培养，当OD值达到0.8时加入M13K07 37℃静置30分钟。然后离心,沉淀用2YT-AK(100μg/mL Amp,20μg/mL Kana)培养基重悬，30℃，220转/min过夜培养。将过夜培养物进行离心，收集上清液加入1/4体积的PEG/NaCl进行沉淀。使用离心机12000rpm离心20分钟，弃掉上清收集沉淀，沉淀用PBS重悬，用0.22微米过滤器过滤除菌得到噬菌体展示抗体库。

3、筛选

使用直接包被的方法进行孔板筛选。96孔板中用0.1M pH9.6的碳酸氢钠缓冲液包被CD25蛋白10μg/mL，投入噬菌体展示抗体库与CD25结合，用0.1M Glycine pH2.2的Buffer进行洗脱。经过4轮筛选，与CD25结合的噬菌体展示克隆得到富集。

筛选结束后，从第4轮筛选产物中随机挑取400个单克隆进行噬菌体展示。37度包被CD25抗原1μg/mL，时长1小时。PBS洗3次后加入100uL待检测噬菌体37度结合1小时。用0.1％PBST洗涤3次，加入HRP标记鼠抗M13抗体37度结合1小时。用0.1％PBST洗涤3次后加入四甲基联苯胺(TMB，Biolegend，421101)显色，1M HCl终止显色，酶标仪读取450nm吸光值。将阳性克隆进行测序，得到抗体序列。图1为Phage展示单克隆抗体105、133、134、161、162、163、167、174、177、181、183、189、191、195、202与CD25结合ELISA效果图。

实施例2抗体基因的合成、表达和纯化

1、抗体基因的合成

本发明委托苏州金唯智生物科技有限公司进行阳性抗体的基因合成，得到带有完整恒定区的重链和轻链抗体基因。按照《分子克隆实验指南》提到的操作方法，转化DH10B、菌液培养用于瞬时表达质粒制备。按照《Qiagen Mini-prep Kit》和《Qiagen EndofreeMaxi-prep Kit》提到的操作方法，进行表达所用质粒的制备。按照瞬时表达标准操作流程进行表达。具体地，准备好所需体积、细胞密度调整至2.0-2.5E6/ml的Expi293细胞悬液，质粒和转染试剂PEI按照一定比例混合并常温放置10分钟，然后将混合液加入到调整好的细胞悬液中，在115rpm，37℃，5％ CO₂的摇床中培养进行培养。24小时后加入50×KT-Feed至终浓度为1×，继续在摇床中培养5天-7天后，8500rpm离心15min收集细胞上清，然后进行纯化。

2、纯化

纯化过程包括Protein A亲和层析、超滤浓缩换液两步纯化。具体为：离心好的细胞培养上清液加入4M氯化钠溶液到0.2M氯化钠终浓度，用1M三(羟甲基)氨基甲烷调pH至7.5；用2×PBS pH 7.4平衡AT Protein A Diamond(博格隆公司)填料，上样后用平衡缓冲液冲洗至基线稳定,以去除大部分非特异性结合的杂质(如：宿主蛋白、宿主DNA等)；然后先将1M三(羟甲基)氨基甲烷pH8.0加到要收集样品的管里，10mL样品加1mL 1M三(羟甲基)氨基甲烷pH8.0；最后用100mM甘氨酸、25mM L-精氨酸、10mM氯化钠pH3.2洗脱,并收集洗脱蛋白，最终样品用30kDa的超滤浓缩管换液至1×PBS,pH7.4缓冲液中。

实施例3亲和力检测

使用Biacore 8K进行抗体亲和力检测。选择PROAsensor捕获待测抗体，将CD25纯化蛋白作为分析物进行亲和力测试。将待检抗体稀释至1-2μg/mL，Buffer为0.02％PBST,流速为10μL/min,捕获时间为60S。将纯化的CD25重组蛋白从200nm开始进行梯度，并设置零浓度。待测抗体和CD25的结合时间为150-200S,解离时间为400-1000S，流速为30uL/min。检测结果如表5所示。

表5CD25抗体结合Human CD25亲和力抗体亲和力

由此可见，抗体的亲和力在10^-7～10^-10范围内。表明抗体具有高的亲和力。

实施例4抗体的竞争实验

利用Fortebio Red 96E检测抗体与CD25的结合表位是否与IL-2存在竞争关系。实验步骤如下，第一步:活化PROA芯片；第二步：用PBST 0.02％Tween20|0.1％BSA将待测抗体稀释至10μg/mL，利用PROA Sensor捕获待测CD25抗体，结合时间120S-180S；第三步：结合200nM的CD25，结合时间一般定为120-180S；第四步：结合200nM CD25和200nM IL-2的混合物,结合时间为120-180S。每个克隆需要设置对照，因此会有3个对照组，简易表示如下：

第一组检测组：PROAsensor捕获待测抗体+结合CD25+结合CD25/IL-2mix

第二组对照组1：PROAsensor捕获待测抗体+结合CD25+结合CD25

第三组对照组2：PROAsensor结合缓冲液+结合CD25+结合CD25

第四组对照组3：PROAsensor结合缓冲液+结合CD25+结合CD25/IL-2mix。

检测结果如表6所示。

表6抗体竞争性实验结果

以上结果表明，抗体与CD25的结合表位是非竞争表位，与IL-2不存在竞争关系。

实施例5抗CD25抗体与高表达CD25细胞的结合实验

利用流式细胞术检测抗CD25抗体与表达CD25的淋巴瘤细胞系SU-DHL-1和KARPAS-299的结合情况。在对数生长期收集细胞，使用含2％FBS的PBS重悬细胞，在96孔板中每孔加入10⁵细胞(50μL)，之后加入不同浓度的抗CD25抗体，使其终浓度为0到10μg/mL，并设置空白对照。室温孵育1小时，加入1μg/mL FITC标记山羊抗小鼠Fc二(Invetrogen,406001)，室温孵育30分钟。使用流式细胞分析仪(Cytek，NL-3000)检测抗体的结合情况，进行测试的抗CD25抗体均可结合在细胞SU-DHL-1和KARPAS-299表面。结果如图2、图3、图4、图5所示。

实施例6CD25抗体清除人外周血单个核细胞(hPBMC)中Treg细胞

复苏hPBMC，使用PBS清洗，调整细胞数至2×10⁶cell/mL，1.5mL/孔铺于6孔板中。待测样品稀释到起始浓度8mg/mL，然后进行2倍系列稀释共计4个浓度，1.5mL/孔加入铺好的细胞中，将hPBMC与待测样品在37℃，5％ CO₂培养箱中共孵育7天。

每个样品取1.5×10⁶的细胞，300g离心5min弃上清，加入1mL staining buffer(BD，货号：554656)，300g离心5min弃上清。使用100μL staining buffer重悬细胞，每管加入APC-H7 mouse Anti-human CD3(BD，货号：560176)、BV650 mouse Anti-human CD4(BD，货号：563875)、BV605 mouse Anti-humanCD8(BD，货号：564116)、BB515 mouse Anti-humanCD56(BD，货号：564488)、PE Mouse anti-human CD127(BD，货号：557938)、APC mouseAnti-human CD25(BD，货号：555434)抗体。混匀，4℃避光孵育30min，加入1mL stainingbuffer，300g离心5min弃上清。每管加入400μL staining buffer重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，使用Flowjo[v10.8]进行数据分析，Graphpad Prism[v9.0]进行作图。结果如图6、图7所示。

由结果可知，相对于NTC，所有待测样品Treg百分比以及绝对计数均不同程度的下调。

实施例7抗CD25抗体动物药效实验

为了进一步验证抗CD25抗体在动物模型上的抗肿瘤效果，本发明选取了筛选得到的两株抗CD25抗体进行了动物实验。在该实验中，于肿瘤接种前一天，将来自健康成人供者的PBMC(人外周血单个核细胞)分别接种于实验小鼠体内，细胞接种量为6.5×10⁶/鼠，接种当天，将属于人间变性大细胞淋巴瘤的KARPAS-299肿瘤细胞接种于NCG-hIL15雌性小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司)右侧背部皮下，细胞接种量为5×10⁶/鼠。在肿瘤生长至78mm³左右时分组给药，共4组，包括阴性对照组1组和RG6292治疗组及抗体治疗组两组，每组6只动物。给药剂量为20mg/kg，每周给药两次，给药两周，腹腔注射给药。

1、考察动物体重、肿瘤体积

每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量并用电子天平称量小鼠体重，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：肿瘤体积TV(mm³)＝0.5×长径(mm)×短径(mm)²。肿瘤生长抑制率TGI_TV％＝(1－T/C)×100％，T/C＝治疗组RTV/对照组RTV。

实验结束时，动物安乐死，计算肿瘤生长抑制率。具体数据见表7。

表7第15天肿瘤抑制率(％)

抗体名称	第15天肿瘤抑制率(％)
		RG6292-human IgG1	35.90
133nH9L2-human IgG1	45.73
		13424L2-human IgG1	20.76

在该动物药效实验中，所有抗体均表现出良好的抗人间变性大细胞淋巴瘤的活性，其中133-human IgG1抗体在第15天时，相对对照组的肿瘤生长抑制率达到45.73％。在此次实验中，动物体重增长正常，未观察到药物相关的毒副作用。

2、检测实验小鼠的脾脏和外周血

实验结束后，分别取小鼠的脾脏和外周血，将每组6只小鼠脾脏和外周血混合后进行后续实验。将脾脏研磨成单细胞悬液，每组取600μL至15mL离心管中，300g离心5min弃上清。外周血每组取600μL至15mL离心管中。随后每管加入1800μL RBC lysis buffer(CWBIO，货号：CW0613S)，4℃孵育15min后，300g离心5min弃上清。每管加入1200μL RBC lysisbuffer，4℃孵育15min后，300g离心5min弃上清。每管加入2mL PBS,300g离心5min弃上清，重复一次，最终加入2mL PBS重悬。

每管分别取2×10⁶的细胞至流式管中，300g离心5min弃上清。使用100μLstaining buffer重悬细胞，每管加入FITC Anti-Human CD45(Tonbo，货号：35-0459-T100)、violetFluor^TM450Anti-Human CD3(Tonbo，货号：75-0038-T100)、redFluor^TM710Anti-Human CD4(Tonbo，货号：80-0048-T100)、Brilliant Violet650^TManti-human CD127(Biolegend，货号：351326)、PE Anti-Human CD25(Tonbo，货号：50-0259-T100)抗体。混匀，室温避光孵育30min，每管加入2mL staining buffer，300g离心5min弃上清。每管加入400μLstaining buffer重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，使用Flowjo[v10.8]进行数据分析，Graphpad Prism[v9.0]进行作图。结果如图8所示。

由结果可知，133nH9L和134H24L2、RG6292等3株抗体对人PBMC免疫重建的Karpas299/NCG-hIL15小鼠动物模型的药效实验后，脾脏和血液中的Treg％均不同程度的下调。

实施例8抗CD25抗体动物药效实验

本发明选取了筛选得到的2株抗CD25抗体和一株对照进行了动物药效实验。在该实验中，将属于小鼠结肠癌的MC38肿瘤细胞接种于B-hIL2RA雌性小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)右侧背部皮下，细胞接种量为1×10⁶/鼠。在肿瘤生长至81mm³左右时分组给药，共5组，包括阴性对照组1组和RG6292治疗组及抗体治疗组三组，每组6只动物。给药剂量为5mg/kg，每周给药两次，给药两周，腹腔注射给药。2周后分别取小鼠的脾脏和外周血，将每组6只小鼠脾脏和外周血混合后进行后续实验。将脾脏研磨成单细胞悬液，每组取600μL至15mL离心管中，300g离心5min弃上清。外周血每组取600μL至15mL离心管中。随后每管加入1800μL RBC lysis buffer(CWBIO，货号：CW0613S)，4℃孵育15min后，300g离心5min弃上清。每管加入1200μL RBC lysis buffer，4℃孵育15min后，300g离心5min弃上清。每管加入2mL PBS,300g离心5min弃上清，重复一次，最终加入2mL PBS重悬。

每管分别取2×10⁶的细胞至流式管中，300g离心5min弃上清。使用100μLstaining buffer重悬细胞，每管加入FITC Anti-Mouse CD45(Tonbo，货号：35-0451-U100)、violetFluor^TM500Anti-Mouse CD3(Tonbo，货号：85-0032-U100)、APC-Cyanine7Anti-Mouse CD4(Tonbo，货号：25-0042-U100)、PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD127(Tonbo，货号：65-1271-U100)、PE Anti-Mouse CD25(Tonbo，货号：50-0251-U100)抗体。混匀，室温避光孵育30min，每管加入2mL staining buffer，300g离心5min弃上清。每管加入400μLstaining buffer重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，使用Flowjo[v10.8]进行数据分析，Graphpad Prism[v9.0]进行作图。结果如图9所示。

由结果可知，133nH9L和134H24L2、RG6292等3株抗体对MC38/B-hIL2RA人源化小鼠动物模型的药效实验后，脾脏和血液中的Treg％均不同程度的下调。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种抗CD25抗体，其特征在于：包含如下互补决定区：

CDR-H1，其含有SED ID NO:1-9任一项所示的氨基酸序列；

CDR-H2，其含有SEQ ID NO:10-23任一项所示的氨基酸序列；

CDR-L1，其含有SEQ ID NO:33-39任一项所示的氨基酸序列；

CDR-L3，其含有SEQ ID NO:46-53任一项所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的一种抗CD25抗体，其特征在于：包含如下互补决定区：

3.如权利要求2所述的一种抗CD25抗体，其特征在于：包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包括SEQ ID NO:58-73所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包括SEQID NO:74-86、88-89所示的氨基酸序列；

或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:90-92、94-102、104、106、108-118所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包括SEQ ID NO:119-122、125-133所示的氨基酸序列；

优选地，包括如下的重链可变区和轻链可变区：

4.如权利要求1所述的一种抗CD25抗体，其特征在于：所述抗体选自单克隆抗体、特异性结合人CD25的抗体片段，包含特异性结合人CD25抗体片段的融合蛋白；

优选地，所述抗体为scFv；

优选地，所述抗体为鼠源抗体或人源化抗体；

优选地，所述抗体不影响CD25同IL-2结合。

5.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的抗CD25抗体。

6.一种重组载体，其特征在于：包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组细胞，其特征在于：包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的重组载体。

8.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的抗CD25抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组载体；

优选地，还包括药学上可接受的载体。

9.权利要求1-4任一项所述的抗CD25抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组载体在制备药物中的应用，所述药物包括如下(1)-(6)任一种功效：