CN119585617A - 镍纹蛋白样蛋白(metrnl)作为（血液）生物标志物用于诊断多囊卵巢综合征 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于通过确定受试者的样品中镍纹蛋白样蛋白(METRNL)的量或浓度来评定所述受试者是否患有多囊卵巢综合征(PCOS)或处于发展PCOS的风险的方法，选择供进行PCOS的疗法的患者的方法，用于监测PCOS进展或用于监测对治疗的应答的方法，以及用于评定患有疑似PCOS的受试者的计算机实现方法。

Description

镍纹蛋白样蛋白(METRNL)作为(血液)生物标志物用于诊断多 囊卵巢综合征

本发明涉及评定受试者是否罹患多囊卵巢综合征(Polycystic OvarianSyndrome,PCOS)或处于发展PCOS的风险的方法，涉及选择供进行疗法的受试者的方法，以及涉及监测罹患PCOS或正在针对PCOS进行治疗的受试者的方法，该方法通过确定受试者的样品中的镍纹蛋白样蛋白(METRNL)的量或浓度，以及将经确定的量或浓度与参考进行比较来进行。进一步，本发明涉及一种评定罹患疑似PCOS的受试者的计算机实现方法，该方法通过确定受试者的样品中METRNL的量或浓度，任选地通过确定第二生物标志物和/或附加诊断准则的量或浓度以及将METRNL、任选地第二生物标志物和/或任选地诊断标准的存在的量或浓度与参考进行比较来进行。

背景技术

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种异质性妇科疾病，其由雄激素过多和卵巢功能障碍的体征组合定义。PCOS患者可能具有一系列临床表现，该临床表现可以属于生殖型和/或代谢型。生殖表现包括不规律月经周期、不孕、妊娠并发症和多毛症，而代谢表现包括肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病前期、2型糖尿病和心血管因素。这些临床表现还与焦虑和抑郁等心理障碍有关(Escobar-Morreale,H.F.2018；International evidence-basedguideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome2018)。

这些症状并不是PCOS特有的，并且通常患者只有在更长时间的不孕症评定后才被诊断出来。对于PCOS的最终诊断，应排除其他病症或疾病，诸如妊娠、非典型肾上腺增生(non-classical adrenal hyperplasia,NCAH)、先天性肾上腺增生、雄激素分泌性肿瘤、库欣综合征、甲状腺疾病，或高催乳素血症(Escobar-Morreale HF.Polycystic ovarysyndrome:definition,aetiology,diagnosis and treatment.Nat RevEndocrinol.2018；14(5):270-284；Teede HJ,Misso ML,Costello MF等人InternationalPCOS Network.Recommendations from the international evidence-based guidelinefor the assessment and management of polycystic ovary syndrome.HumReprod.2018；33(9):1602-1618)。可用于排除其他疾病的诊断测试，例如：

·17α-羟孕酮(17-OHP)以排除NCAH(Nordenstrom and Falhammar

2018)

·催乳素以排除高催乳素血症

·皮质醇以排除患有库欣综合征的患者

·促甲状腺激素(TSH)以排除甲状腺疾患

PCOS可以是由遗传、表观遗传和环境因素(诸如遗传特征)共同引起的。

尽管PCOS是女性中最常见的内分泌疾病之一，影响10％的育龄女性，但高达70％的受影响女性仍未得到诊断(March WA,Moore VM,Willson KJ等人The prevalenceofpolycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrastingdiagnostic criteria.Hum Reprod.2010；25(2):544-51)。

最广泛使用的PCOS诊断标准是所谓的鹿特丹标准。如果适用以下至少2条标准，则表明PCOS：(i)不规律周期(月经过少)和排卵功能障碍(稀发-无排卵(oligo-anovulation)，OA)，(ii)临床和/或生化高雄激素血症(hyperandrogenism,HA)和(iii)多囊卵巢形态(polycystic ovarian morphology,PCOM)(PCOS Consensus Workshop Group,Fertil Steril 2004；81:19–25)。第一个标准被定义为周期长度少于21天或多于35天或少于每年8个周期的月经周期。高雄激素血症的临床和/或生化体征，其中临床高雄激素血症被定义为多毛症(过度和男性型毛发生长)和/或痤疮，生化高雄激素血症被定义为相较于健康对照，游离雄激素水平较高。临床高雄激素血症也被定义为改良的Ferriman-Gallwey评分>8。生化高雄激素血症可以使用游离睾酮或游离雄激素指数(free androgen index,FAI)进行评定，该游离雄激素指数可以通过测量总睾酮和性激素结合球蛋白(sex hormonebinding globuline,SHBG)来计算。通常根据“PCOS2018国际循证临床指南”使用频带宽度包括8MHz的阴道内超声换能器来确定PCOM。PCOM的阈值被认为是在任一卵巢：确保不存在黄体、囊肿或优势卵泡，每个卵巢的卵泡数量>20和/或卵巢体积≥10ml。如果使用较旧的超声技术，PCOM的阈值可以是任一卵巢的卵巢体积≥10ml或卵泡计数>12。

另一种检测PCOM的方法是测量受试者体内的抗苗勒管激素(AMH)。AMH是一种糖蛋白激素，其表达对胎儿发育期间特定时间的性别分化至关重要。此外，生长卵泡的颗粒细胞产生的AMH通常与卵巢内窦状卵泡的数量相关。因此，血清AMH水平可以是由经阴道超声确定的窦卵泡计数量/数量(AFC)的替代生物标志物。一些研究已经表明血清AMH是PCOM的生化标志物。在一些研究中，提出了PCOS女性中PCOM的AMH阈值(Nicholas等人2014；Pigny等人2016；Dietz de Loos等人，Fertil Steril，2021)。然而，根据“Internationalevidence-based guideline for the assessment and management of polycysticovary syndrome2018”，血清AMH水平不应作为检测PCOM或诊断PCOS的替代方法。

进一步用于检测PCOS的方法是3项PCOS标准系统(Indran等人，2018)。在该系统中，如果存在三分之二的项目，则建议进行PCOS的诊断：(i)月经稀发(定义为平均月经周期长度>35天)；(ii)AMH高于阈值；(iii)高雄激素血症被定义为睾酮高于阈值和/或存在多毛症(mFG评分≥5)。或者，建议将AMH与高雄激素血症和月经稀发(Sahmay等人，2014)或与SHBG(Calzada等人，2019)进行组合。

用于检测PCOS的另一种方法是测量其他激素，例如黄体生成素(luteinizinghormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)。然而，LH:FSH比率对PCOS的诊断效用似乎很低，因为只有一小部分患有PCOS的女性具有显著升高的LH:FSH比率(Cho等人，2005)。实际上，在被诊断患有PCOS的女性中发现了广泛的LH:FSH比率(Malini和George 2018)。

考虑多个诊断测试结果和临床检查结果的必要性需要特定的专业知识，这使得不太专业的医生(诸如全科医师)在临床常规中诊断PCOS相当困难。例如，通过经阴道超声确定PCOM需要足够的超声设备和医生对超声图像的主观分析。此外，结果也可以取决于用于PCOM评定的特定超声设备。因此，基于鹿特丹标准的PCOS诊断始终包括至少一项主观的、依赖于设备和操作员且容易出错的测量。

为了评估生化高雄激素血症，所测量的雄激素必须有一个确定的正常范围。睾酮是测量到的最丰富的雄激素，无论是其总量、结合还是游离形式。测量游离睾酮的做法有其局限性。使用放射免疫测定法直接测量游离睾酮是高度不准确的，并且不能反映真实值。测定具有高的测定内和测定间变异性。可替代地，通过使用萃取和色谱法或气相(gaschromatography-mass spectrometry,GC-MS)或液相(liquid chromatography-massspectrometry,LC-MS)色谱-质谱法测量总睾酮浓度，将获得更高程度的准确度，特别是对于临床研究而言。测量血清睾酮的诊断性能可以通过伴随测量SHBG来增强，使得根据总睾酮和SHBG水平计算游离T浓度只需要求解二次方程(Azziz R,Carmina E,Dewailly D等人Task Force on the Phenotype of the Polycystic Ovary Syndrome of The AndrogenExcess and PCOS Society.The Androgen Excess and PCOS Society criteria for thepolycystic ovary syndrome:the complete task force report.Fertil Steril.2009；91(2):456-88)。HA的定义可能因种族而异。用于诊断PCOS女性多毛症的mFG评分>8可能并不适用于所有种族的诊断。相较于白种人，东亚女性的多毛症患病率较低，并且已经提出了>5的评分来定义中国女性的多毛症。也有迹象表明血液中的雄激素水平在种族之间不同，其中日本人群雄激素升高的患病率较低，并且睾酮仅被推荐作为此人群中PCOS诊断的补充因素(Huang Z,YongEL.Ethnic differences:Is there an Asian phenotype forpolycystic ovarian syndrome？Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol.2016；37:46-55；Kubota T.Update in polycystic ovary syndrome:new criteria ofdiagnosis andtreatment in Japan.ReprodMedBiol.2013；12(3):71-77)。

罹患PCOS的患者可以分为四种不同的表型，该四种不同的表型命名为A、B、C或D(Neven ACH,Laven J,Teede HJ,Boyle JA.A Summary on Polycystic Ovary Syndrome:Diagnostic Criteria,Prevalence,Clinical Manifestations,and ManagementAccording to the Latest International Guidelines.Semin Reprod Med.2018Jan；36(1):5-12)。表型A是表现出高雄激素血症、排卵功能障碍和/或不规律周期和多囊卵巢形态的患者的特征。表型B的特征是高雄激素血症、排卵功能障碍和/或不规律周期。表型C的特征是高雄激素血症和多囊卵巢形态。表型D的特征是排卵功能障碍和/或不规律周期和多囊卵巢形态。

目前，没有特定的PCOS药物可用。治疗以症状为定向并适应个人需求。治疗方法针对高雄激素血症、不规律周期和/或排卵功能障碍和相关的代谢紊乱，诸如糖尿病。2018年多囊卵巢综合征评定和管理的国际循证临床指南提供了支持临床决策和患者管理的信息。

不一致的诊断标准、可变的提供者知识和缺乏共识给PCOS女性的诊断和护理带来了特殊的挑战。这些因素助长了包括诊断不足和诊断过度两者的不准确诊断。这种不利的诊断经历加剧了受影响女性的病况，并限制了及时干预以最大限度地减少相关合并症的机会，尤其是在从儿科护理到成人护理的过渡期间(Witchel SF,Teede HJ,AS.Curtailing PCOS.Pediatr Res.2020；87(2):353-361)。进一步，及时诊断对于预防受影响女性的进一步代谢并发症(例如2型糖尿病)至关重要。

在最大规模的PCOS诊断经历研究中，许多女性报告了诊断延迟和信息不足。三分之一或更多的女性在确诊前报告了>2年(33.6％)和>3年(47.1％)医疗保健专业人员。很少有人对她们的诊断经历(35.2％)或她们收到的信息(15.6％)感到满意。在早期诊断、教育和支持方面的这些差距显然是改善患者体验的机会(Gibson-Helm M,Teede H,Dunaif A,Dokras A.Delayed Diagnosis and a Lack ofInformation Associated WithDissatisfaction in Women With Polycystic Ovary Syndrome.J Clin EndocrinolMetab.2017；102(2):604-612)。

PCOS诊断中特别令人感兴趣的领域是年轻女性，即25岁以下、优选地20岁以下的青少年和年轻女性，此时正常青春期发育的特征与成人诊断标准重叠。这使得诊断具有争议和挑战性。用于诊断PCOS的许多表现可能会随着时间的推移而演变，并在月经初潮后的最初几年内发生变化。正常的青春期生理变化(诸如不规律月经周期、痤疮和PCOM)与成人PCOS的诊断标准重叠。在青春期和年轻成年女性中，当同时满足OA和HA标准时，诊断为PCOS。不建议在月经初潮后<8岁的青少年中进行盆腔超声检查，因为此生命阶段多卵泡卵巢的发生率很高(AS,Witchel SF,Hoeger KM,Oberfield SE,Vogiatzi MG,Misso M,Garad R,Dabadghao P,Teede H.Adolescent polycystic ovary syndrome according tothe international evidence-based guideline.BMC Med.2020；18(1):72)。对青少年中不规律月经周期的评定可能是困难的。在青春期，月经周期通常不规律。在月经初潮后的最初几年，下丘脑-垂体-卵巢轴的不成熟通常会导致无排卵，并且周期可能会有些长。然而，90％的周期将在21-45天的范围内，尽管可能会出现少于20天的短周期和多于45天的长周期。到月经初潮后的第三年，60-80％的月经周期长度为21-34天，这是成年人的典型情况。年轻女孩及其看护人(例如父母或监护人)经常难以评定正常月经周期或出血模式的构成。患者及其看护人可能不熟悉什么是正常的，并且患者可能不会告知其看护人月经不规律或月经未来的情况。此外，患者通常不愿意与看护人讨论此话题(ACOG Committee OpinionNo.651:Menstruation in Girls and Adolescents:Using the Menstrual Cycle as aVital Sign.Obstet Gynecol.2015；126(6):e143-e146)。因此，特别是对于这组患者，建立可靠的生物标志物作为诊断PCOS或识别处于发展PCOS的风险的患者的辅助是极其重要的。延迟诊断青少年和年轻女性通常是由于不愿意诊断因青春期而处于风险的青少年以及担心诊断过度或诊断不足。这可能会导致长期并发症，诸如肥胖和胰岛素抵抗，以及焦虑或抑郁。最新的青少年和年轻女性PCOS诊断指南已经将稀发-无排卵、不规律月经周期和高雄激素血症定义为提高此患者群体诊断准确性的标准(AS,Witchel SF,Hoeger KM等人Adolescent polycystic ovary syndrome according to the international evidence-based guideline.BMC Med.2020；18(1):72)。该指南还建议每隔3年重新评估一次诊断，并改变生活方式，以尽量减少与PCOS相关的症状和合并症，诸如焦虑和抑郁。

到目前为止，还没有可用的通用生物标志物(无论是单独使用还是与上述症状或如先前描述的激素水平组合使用)来评定受试者是否罹患PCOS或处于发展PCOS的风险，和/或确定罹患PCOS的受试者对疗法的应答，和/或监测受试者的PCOS进展，和/或监测罹患PCOS的受试者对治疗的应答。

因此，建立用于诊断年轻女性和青少年中的PCOS的更好的诊断测定的需求尚未得到满足。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种评定患者是否罹患PCOS或处于发展PCOS的风险的方法，该方法包括；

(a)确定该患者的样品中的METRNL的量或浓度，以及

(b)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

在第二方面，本发明涉及一种选择供进行PCOS的疗法的患者的方法，该方法包括：

(c)确定受试者的样品中METRNL的量或浓度，以及

(d)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

在第三方面，本发明涉及一种用于监测受试者的PCOS进展或用于监测罹患PCOS的受试者对治疗的应答的方法，所述方法包括：

(e)确定该受试者的第一样品中METRNL的水平，

(f)确定该受试者的已经在该第一样品之后获得的第二样品中METRNL的水平，以及

(g)将该第一样品中的METRNL的该水平与该第二样品中的METRNL的该水平进行比较，以及

(h)基于步骤c)的结果，监测罹患PCOS或正在针对PCOS进行治疗的该受试者的进展。

在第四方面，本发明涉及一种评定罹患疑似PCOS的受试者的计算机实现方法，该计算机实现方法包括以下步骤：

(a)接收针对该受试者的样品中第一生物标志物的量或浓度的值，所述第一生物标志物为METRNL，

(b)任选地，接收针对该受试者的样品中第二生物标志物的量或浓度的值，

(c)任选地，接收针对至少一个附加诊断标准的存在或不存在的值，该至少一个附加诊断准则选自由稀发-无排卵、高雄激素血症和多囊卵巢形态组成的组；

(d)将步骤(a)至(b)的针对该量或浓度的该值与针对该生物标志物的参考以及针对该至少一个附加诊断准则的存在或不存在的该值进行比较并且/或者基于该生物标志物的该量或浓度以及该值来计算用于评定患有疑似PCOS的该受试者的评分；以及

(e)基于在步骤(d)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。

附图说明

图1.镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线分析。使用Olink邻位延伸技术获得的结果。

图2.PCOS病例(仅表型A)与对照的血清镍纹蛋白样蛋白。使用Olink邻位延伸技术获得的结果。

图3.当所有表型组合(表型A-D)时，PCOS病例的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线分析。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图4.当所有表型组合时(表型A-D)，对照与PCOS病例的血清镍纹蛋白样蛋白(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得的结果。

图5.相较于对照，PCOS表型A-D的ROC曲线。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图6.健康对照和PCOS表型A-D的血清镍纹蛋白样蛋白(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图7.当所有表型A-D组合时，年轻PCOS病例(年龄≤25岁)的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线分析。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图8.年轻对照与年轻PCOS病例(年龄≤25岁)组合表型A-D的血清镍纹蛋白样蛋白浓度(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图9.按表型A-D划分的年轻PCOS病例(年龄≤25岁)与年轻健康对照(年龄≤25岁)的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图10.年轻健康对照(年龄≤25岁)和PCOS表型A-D(年龄≤25岁)的血清镍纹蛋白样蛋白浓度(pg/mL)。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图11.当所有表型组合(表型A-D)时，PCOS病例的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线分析。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图12.当所有表型组合时(表型A-D)，对照与PCOS病例的血清镍纹蛋白样蛋白浓度(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图13.相较于对照，PCOS表型A-D的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图14.健康对照和PCOS表型A-D的血清镍纹蛋白样蛋白(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图15.相较于对照，不同PCOS年龄组(15-20,20-25,25-45)的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

图16.健康对照和PCOS年龄组(15-20,20-25,25-45)的血清镍纹蛋白样蛋白(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图17.当所有表型A-D组合时，年轻PCOS病例(年龄15-25岁)的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线分析。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图18.年轻对照与年轻PCOS病例(年龄15-25岁)组合表型A-D的血清镍纹蛋白样蛋白(pg/mL)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图19.按表型A-D划分的年轻PCOS病例(年龄15-25岁)与年轻健康对照(年龄15-25岁)的镍纹蛋白样蛋白的ROC曲线。使用ELISA免疫测定法获得结果。

图20.年轻健康对照(年龄15-25岁)和PCOS表型A-D(年龄15-25岁)的血清镍纹蛋白样蛋白浓度(pg/mL)。通过ELISA免疫测定法获得的结果。

具体实施方式

本发明的发明人已经将镍纹蛋白样蛋白(METRNL)确定为可靠的生物标志物，用于诊断受试者中的PCOS、用于确定受试者是否处于发展PCOS的风险、用于选择供进行疗法的罹患PCOS的患者，或用于监测罹患PCOS的受试者的PCOS进展，或监测罹患PCOS的受试者对疗法的应答。METRNL可以单独使用或与至少一个附加标准(诸如高雄激素血症、稀发-无排卵、PCOM或不规律周期)组合使用，用于诊断、风险评定和/或监测患者对疗法的应答。进一步，相较于对照水平的METRNL水平的确定可用于监测所述受试者对治疗的应答和/或监测PCOS进展。

我们首次证明，相较于对照，在罹患PCOS的女性的样品、优选地生物体液样品中测量的METRNL值减少，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。进一步，我们首次证明，在罹患PCOS的任何表型A至D的女性的样品、优选地生物体液样品中测量的METRNL值减少，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。本发明提供的方案是检测样品、优选地生物体液样品中的镍纹蛋白样蛋白的免疫测定法，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。此免疫测定法还可与其他临床和/或生化特征(诸如稀发-无排卵和/或不规律周期、高雄激素血症或PCOM)相结合，用于诊断罹患PCOS的女性。进一步，测量METRNL值可用于监测所述患者中PCOS的进展和监测对疗法的应答。我们还证明，样品、优选地生物体液样品中的METRNL值的测量特别适合于诊断年龄25岁以下、特别是年龄20岁以下、特别是15岁至年龄25岁以下、特别是15岁至年龄20岁以下的青少年或年轻女性的PCOS，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清，单独或与如上所述的附加诊断准则组合。

对于PCOS的可靠诊断的准确测试的医疗需求尚未得到满足。样品、优选地生物体液样品中的METRNL的测量具有可靠的基于生物液体的测试的优点，该测试识别出罹患PCOS的女性，这是目前不可能的，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。样品、优选地生物体液样品中的METRNL的测量也可以可靠地用于年龄25岁以下、特别是年龄20岁以下、特别是15岁至年龄25岁以下、特别是15岁至年龄20岁以下的青少年受试者和年轻女性以进行PCOS的诊断，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。由于上述原因，青少年患者的PCOS诊断是困难的，并且因此，我们首次为青少年和年轻女性人群的PCOS诊断提供了准确的测试。此外，样品、优选地生物体液样品中的METRNL的测量具有确定患者是否对疗法有应答的优点，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。患者的样品、优选地生物体液样品中的METRNL的测量的另一个优点是监测PCOS的进展，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清。此外，我们附上一种计算机实现方法，该计算机实现方法用于评定罹患PCOS的受试者，通过测量样品、优选地生物体液样品中的METRNL水平来进行，该生物体液样品优选地为血液、血浆、血清、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，并且其中该生物体液样品更优选地为血液、血浆或血清，并且任选地，利用进一步标准，诸如针对稀发-无排卵和/或不规律周期、高雄激素血症和/或多囊卵巢形态的值或利用进一步生物标志物或激素，用于基于上述数据的比较和/或计算来评定所述受试者。

如上所述，罹患PCOS的患者可能表现出两种类型的特征——生殖类型或代谢类型。PCOS的代谢类型包括肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病前期、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)和心血管因素。可以使用术语“表型的”代替“生殖的”。术语“生殖的”(或“表型的”)描述已知指示PCOS的女性表型的任何特征。例如，这些生殖特征包括多囊卵巢形态(PCOM)和/或临床高雄激素血症，诸如痤疮、皮脂溢、脱发和/或多毛症。优选地，这些生殖特征包括多囊卵巢形态(PCOM)和/或临床高雄激素血症，更优选地痤疮、皮脂溢、脱发、声音低沉和/或多毛症。临床高雄激素血症的这些生殖特征可以简单地通过询问女性来诊断，或者在对女性身体进行短暂的身体检查后变得明显。通常，参考群体不表现任何或不超过这些已知指示PCOS的表型特征中的一个。

镍纹蛋白样蛋白(METRNL)是一种激素(28KDa分泌蛋白)，分别在运动和寒冷暴露后在骨骼肌和脂肪组织中诱导产生。METRNL在循环或脂肪组织中的表达增加导致白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)的“褐变”。在小鼠中腹膜内注射Metrnl-Fc蛋白7天诱导显著的体重减轻、O2消耗和葡萄糖耐量增加。Metrnl在体外对白色脂肪细胞的产热没有直接影响，这表明非脂肪细胞类型参与了米色脂肪的诱导。Metrnl似乎相当刺激几种免疫细胞亚型进入脂肪组织并激活它们的促热作用。METRNL处理的小鼠在WAT中的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞数量增加，并且与替代性巨噬细胞激活相关的基因表达增加(Rao RR,Long JZ,White JP等人Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adiposeinteractions to increase beige fat thermogenesis.Cell.2014Jun 5；157(6):1279-1291)。METRNL与先天免疫和可能的获得性免疫有关。在活化的单核细胞(M2极化的巨噬细胞)、皮肤和粘膜组织中识别到METRNL的高表达。在皮肤中，METRNL由静息成纤维细胞和IFNγ处理的角质形成细胞表达。在包括银屑病的几种人类皮肤病中描述了METRNL的过表达。METRNL在人类类风湿性关节炎的滑膜中也上调(Ushach I,Burkhardt AM,Martinez C等人METEORIN-LIKE is a cytokine associated with barrier tissues and alternativelyactivated macrophages.Clin Immunol.2015Feb；156(2):119-27)。最近，Baht及其同事描述了METRNL通过巨噬细胞增生和表型转换在协调骨骼肌修复中的作用。结果表明，响应于局部损伤，METRNL将主要由巨噬细胞分泌。此外，METRNL通过诱导胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的STAT3依赖性自分泌/旁分泌机制促进抗炎功能，从而激活肌肉祖细胞以帮助肌生成。最后，METRNL已经被证明是肌肉再生的关键调节剂，直接作用于免疫细胞，以促进抗炎/促再生环境和肌生成(Baht GS,Bareja A,Lee DE等人Meteorin-like facilitates skeletal muscle repair through aStat3/IGF-1mechanism.NatMetab.2020Mar；2(3):278-289.勘误于：Nat Metab.2020Aug；2(8):794)。有趣的是，METRNL被认为是一种在神经发育中具有治疗潜力的神经营养因子。METRNL确实能够穿过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)，并且血脑屏障功能障碍的增加导致脑脊液METRNL浓度的增加(BerghoffM,A,Rajendran R等人Evidence ofaMuscle–Brain Axis by Quantification oftheNeurotrophic Myokine METRNL(Meteorin-LikeProtein)in Human Cerebrospinal Fluid and Serum.Journal of ClinicalMedicine.2021；10(15):3271)。

已经研究了血清METRNL水平与2型糖尿病(type 2diabetes,T2DM)的关联性，产生了相互矛盾的结果(Lee JH,Kang YE,Kim JM等人Serum Meteorin-like protein levelsdecreased in patients newly diagnosed with type 2diabetes.Diabetes Res ClinPract.2018Jan；135:7-10；Chung HS,Hwang SY,Choi JH等人Implicationsofcirculating Meteorin-like(Metrnl)level in human subjects with type2diabetes.Diabetes Res Clin Pract.2018Feb；136:100-107；Wang K,Li F等人SerumLevels of Meteorin-Like(Metrnl)Are Increased in Patients with Newly DiagnosedType 2Diabetes Mellitus and Are Associated with Insulin Resistance.Med SciMonit.2019Mar 31；25:2337-2343；El-Ashmawy HM,Selim FO,Hosny TAM,AlmassryHN.Association oflow serum Meteorin like(Metrnl)concentrations with worseningof glucose tolerance,impaired endothelial function andatherosclerosis.Diabetes Res Clin Pract.2019Apr；150:57-63；Wang C,Pan Y,Song J等人Serum Metrnl Level is Correlated with Insulin Resistance,But Not withβ-Cell Function in Type 2Diabetics.Med Sci Monit.2019Nov 25；25:8968-8974；FernsGA,Fekri K,Shahini Shams Abadi M等人A meta-analysis of the relationshipbetween serums metrnl-like protein/subfatin and risk of type 2diabetesmellitus and coronary artery disease.Arch Physiol Biochem.2021May 5:1-7；Lappas M.Maternal obesity and gestational diabetes decrease Metrnlconcentrations in cord plasma.J Matern Fetal Neonatal Med.2021Sep；34(18):2991-2995)。相较于对照组，T2DM和冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)患者表现出较低的血清METRNL水平。另外，METRNL在CAD患者中展示出与IL-6和TNF-α呈负相关，并且也在T2DM患者中展示出与BMI、胰岛素抵抗、IL-6和TNF-α呈负相关(Dadmanesh M,Aghajani H,Fadaei R,Ghorban K.Lower serum levels of Meteorin-like/Subfatin inpatients with coronary artery disease and type 2diabetes mellitus arenegatively associated with insulin resistance and inflammatory cytokines.PLoSOne.2018Sep 13；13(9):e0204180)。此外，针对CAD患者的病例对照研究证明，血清METRNL与CAD的存在和严重程度显著相关(Liu ZX,Ji HH,Yao MP等人SerumMetrnl isassociatedwith the presence and severity of coronary artery disease.J CellMol Med.2019Jan；23(1):271-280)。相较于正常体重对照，接受减肥手术的肥胖患者表现出减少的METRLN循环水平以及葡萄糖和脂质稳态改善(Pellitero S,Piquer-Garcia I,Ferrer-Curriu G等人Opposite changes in meteorin-like and oncostatin m levelsare associated with metabolic improvements after bariatric surgery.Int J Obes(Lond).2018Apr；42(4):919-922)。最近，两项研究调查了相较于对照，PCOS患者的METRNL循环水平。Fouani等人的研究是对PCOS复发性妊娠丢失(PCOS-RPL(PCOS-recurrentpregnancy loss),n＝60)和不孕PCOS(n＝60)患者以及60名健康对照的队列进行的。女性年龄为20至40岁(对照的平均年龄：30.02±4.60；PCOS病例的平均年龄：29.88±4.22)。作者发现，当相较于对照时，PCOS患者的血清METRNL水平较低。此外，在对照中，血清METRNL与BMI、脂联素和同型半胱氨酸相关，并且在PCOS组和亚组中与FBG、空腹胰岛素和HOMA-IR呈负相关。此外，它与对照，以及PCOS组和亚组中的hs-CRP呈负相关(Fouani FZ,Fadaei R,Moradi N等人Circulating levels of Meteorin-like protein in polycystic ovarysyndrome:A case-control study.PLoS One.2020Apr24；15(4):e0231943)。Deniz等人测量了30例PCOS病例和30例健康对照的血浆样品中的METRNL(subfatin)和白脂素水平(对照的平均年龄：28.22±2.6；PCOS病例的平均年龄：27.14±3.21)。虽然相较于健康对照，PCOS女性的白脂素水平显著较高，但相较于对照，METRNL水平显著较低，这与Fouani等人证明的结果一致。在PCOS亚组中，白脂素和METRNL水平两者均显示出与HOMA-IR显著相关(DenizR,Yavuzkir S,Ugur K等人Subfatin and asprosin,two new metabolic players ofpolycystic ovary syndrome.J Obstet Gynaecol.2021Feb；41(2):279-284.doi:10.1080/01443615.2020.1758926)。

在炎症性肠病(InflammatoryBowel Disease,IBD)患者中，METRNL的血清水平减少，并与TNF-α、IL-6和BMI水平呈负相关(Gholamrezayi A,Mohamadinarab M,Rahbarinejad P等人Characterization ofthe serum levels of Meteorin-like inpatients with inflammatory bowel disease and its association withinflammatory cytokines.Lipids Health Dis.2020Oct 30；19(1):230)。与其他关于代谢和炎症性疾病的研究一致，在骨关节炎患者中，相较于非骨关节炎受试者，血清METRNL较低，而滑液METRNL较高(Sobieh BH,Kassem DH,Zakaria ZM,El-Mesallamy HO.Potentialemerging roles of the novel adipokines adipolin/CTRP12 and meteorin-like/METRNL in obesity-osteoarthritis interplay.Cytokine.2021Feb；138:155368)。

本发明的第一方面涉及一种评定受试者是否罹患PCOS或处于发展PCOS的风险的方法，该方法包括：

(a)确定受试者的样品中METRNL的量或浓度，以及

(b)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

患者的样品中的METRNL的量或浓度减少指示患者中PCOS的存在或风险或发展。特别地，如果患者的样品中的METRNL的量或浓度高于参考或参考样品中的METRNL的量或浓度，则患者的样品中的METRNL的量或浓度指示患者中存在PCOS或具有发展PCOS的风险。特别地，与在未罹患PCOS或处于发展PCOS的风险的个体的相同生物体液样品中相比，在评定为存在PCOS或具有发展PCOS的风险的患者的生物体液样品中可检测到较高量或浓度的METRNL。特别地，METRNL的量或浓度减少50％或更多，指示PCOS的存在或具有发展PCOS的风险。特别地，METRNL的量或浓度减少100％或更多，指示PCOS的存在或具有发展PCOS的风险。特别地，METRNL的量或浓度减少150％或更多，指示PCOS的存在或具有发展PCOS的风险。特别地，METRNL的量或浓度减少200％或更多，指示PCOS的存在或具有发展PCOS的风险。

在实施例中，生物体液样品是全血、血清、血浆、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，优选地，生物体液样品是血清或全血。在实施例中，样品是体外样品，即，其将在体外进行分析并且不会被移回体内。

在特定实施例中，患者是实验动物、家畜或灵长类动物。在特定实施方案中，患者是人类患者。在特定实施例中，患者是人类女性患者。在特定实施例中，患者是小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于25岁、优选地小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。

在实施例中，PCOS是从由代谢性或表型PCOS组成的组中评定的。在进一步的实施例中，PCOS是从由表型A、表型B、表型C和表型DPCOS组成的组中评定的。

在实施例中，本发明的第一方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定METRNL的量或浓度。在实施例中，确定患者样品中METRNL的量或浓度的步骤a)包括进行免疫测定法。在实施例中，免疫测定法以直接或间接形式进行。在实施例中，此类免疫测定法选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、酶免疫测定法(enzymeimmunoassay,EIA)、放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)，或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定法。

在特定实施例中，确定患者的样品中的METRNL的量或浓度的步骤a)包括以下步骤：

i)将患者的样品和与METRNL特异性地结合的一种或多种抗体一起孵育，从而在抗体与METRNL之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中的METRNL的量或浓度。

在特定实施例中，在步骤i)中，将样品与两种与METRNL特异性地结合的抗体一起孵育。如对本领域技术人员显而易见的，可以按任意需要的次序使样品接触第一和第二抗体，例如首先接触第一抗体并且然后接触第二抗体，或者首先接触第二抗体并且然后接触第一抗体，或者同时接触第一和第二抗体，并且在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物。如本领域技术人员将容易理解的，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适当或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗METRNL抗体和METRNL抗原/分析物的复合物(＝抗METRNL复合物)，或者形成二级复合物或夹心复合物，其包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和第二抗METRNL抗体(＝第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物)。

对抗METRNL抗体/METRNL复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。对第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。本领域技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记，并且其中第一抗METRNL抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在特定实施例中，第二抗体用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记。

在第二方面，本发明涉及一种选择供进行PCOS的疗法的患者的方法，该方法包括：

(c)确定受试者的样品中METRNL的量或浓度，以及

(d)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

在实施例中，如果确定患者的样品中的METRNL的量减少，则选择该患者进行PCOS的疗法。特别地，如果METRNL的量高于参考或参考样品中METRNL的量，则选择该患者进行PCOS的疗法。特别地，如果评定供进行PCOS的疗法的患者的生物体液样品中METRNL的量高于未罹患PCOS或处于发展PCOS的风险或未经选择供进行PCOS的疗法的个体的相同生物体液样品中的量，则选择该患者进行PCOS的疗法。特别地，如果METRNL的量减少50％或更多，则选择患者进行PCOS的疗法。特别地，如果METRNL的量减少100％或更多，则选择患者进行PCOS的疗法。特别地，如果METRNL的量减少150％或更多，则选择患者进行PCOS的疗法。特别地，如果METRNL的量减少200％或更多，则选择患者进行PCOS的疗法。

特别地，选择患者进行PCOS的基于药物的疗法或改变生活方式以控制代谢症状。在实施例中，PCOS的基于药物的疗法选自由以下组成的组：用于调节经期的药物，特别是口服避孕药或孕激素疗法，用于预防或控制糖尿病，特别是2型糖尿病的药物，用于预防或控制高胆固醇的药物，增加生育能力的激素或药物，去除多余毛发的药物、激素或程序，控制痤疮的药物或程序。

在实施例中，生物体液样品是全血、血清、血浆、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，优选地，生物体液样品是血清或全血。在实施例中，样品是体外样品，即，其将在体外进行分析并且不会被移回体内。

在特定实施例中，患者是实验动物、家畜或灵长类动物。在特定实施方案中，患者是人类患者。在特定实施例中，患者是人类女性患者。在特定实施例中，患者是小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于25岁、优选地小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。

在实施例中，本发明的第二方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定METRNL的量。在实施例中，确定患者的样品中的METRNL的量的步骤a)包括执行免疫测定。在实施例中，免疫测定法以直接或间接形式进行。在实施例中，此类免疫测定法选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、酶免疫测定法(enzyme immunoassay,EIA)、放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)，或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定法。

在特定实施例中，确定患者的样品中METRNL的量的步骤a)包括以下步骤：

i)将患者的样品和与METRNL特异性地结合的一种或多种抗体一起孵育，从而在抗体与METRNL之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中METRNL的量。

在特定实施例中，在步骤i)中，将样品与两种与METRNL特异性地结合的抗体一起孵育。如对本领域技术人员显而易见的，可以按任意需要的次序使样品接触第一和第二抗体，例如首先接触第一抗体并且然后接触第二抗体，或者首先接触第二抗体并且然后接触第一抗体，或者同时接触第一和第二抗体，并且在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物。如本领域技术人员将容易理解的，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适当或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗METRNL抗体和METRNL抗原/分析物的复合物(＝抗METRNL复合物)，或者形成二级复合物或夹心复合物，其包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和第二抗METRNL抗体(＝第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物)。

对抗METRNL抗体/METRNL复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。对第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。本领域技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记，并且其中第一抗METRNL抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在特定实施例中，第二抗体用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记。

此外，本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包含用于PCOS的诊断的试剂。试剂盒的试剂可以包含抗体或抗体片段。优选地，抗体或抗体片段识别METRNL的表位或抗原。试剂盒可以进一步含有识别其他生物标志物的其他试剂。因此，试剂盒可以包含至少两种试剂的组合。试剂盒可以特异性地测量METRNL和任何其他感兴趣的生物标志物的量或浓度。根据本发明，生物标志物还可以包含激素，诸如抗苗勒氏管激素AMH。试剂盒可以用于任何诊断测定。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定METRNL的量。在实施例中，确定患者的样品中的METRNL的量的步骤a)包括执行免疫测定。在实施例中，免疫测定法以直接或间接形式进行。在实施例中，此类免疫测定法选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定法。

在第三方面，本发明涉及一种用于监测受试者的PCOS进展或用于监测罹患PCOS的受试者对治疗的应答的方法，所述方法包括：

(a)确定该受试者的第一样品中METRNL的水平，

(b)确定该受试者的已经在该第一样品之后获得的第二样品中METRNL的水平，以及

(c)将该第一样品中的METRNL的该水平与该第二样品中的METRNL的该水平进行比较，以及

(d)基于步骤c)的结果，监测罹患PCOS或正在针对PCOS进行治疗的该受试者的进展。

在实施例中，监测罹患PCOS的受试者的PCOS进展以确定在患者的样品中METRNL的量或浓度是否随着时间的推移而变化。特别地，监测PCOS进展以确定METRNL的量或浓度是随着时间的推移而增加、减少还是不变。在实施例中，如果确定受试者的样品中METRNL的量或浓度减少，则监测PCOS进展。

在实施例中，监测正在针对PCOS进行治疗的受试者以确定受试者的样品中METRNL的量或浓度是否变化。特别地，监测正在针对PCOS进行治疗的受试者以确定METRNL的量或浓度是增加、减少还是不变。特别地，监测正在针对PCOS进行治疗的受试者以确定METRNL的量或浓度是由于所应用的疗法而增加、减少还是不变。在实施例中，正在针对PCOS进行治疗的受试者中METRNL的量或浓度降低指示疗法有效。在实施例中，正在针对PCOS进行治疗的受试者的样品中METRNL的量或浓度未改变或降低指示持续性PCOS。特别地，如果METRNL的量或浓度降低到50％或更多，则对PCOS的治疗无效。特别地，如果METRNL的量或浓度降低到100％或更多，则对PCOS的治疗无效。特别地，如果METRNL的量或浓度降低到150％或更多，则对PCOS的治疗无效。特别地，如果METRNL的量或浓度降低到200％或更多，则对PCOS的治疗无效。

在特定实施例中，如果确定正在针对PCOS进行治疗的受试者的样品中METRNL的量或浓度不变或降低，则调整疗法。

在实施例中，在不同时间点对受试者进行几次监测。在实施例中，在数周、数月或数年的时间范围内对受试者进行几次监测。在特定实施例中，一个月一次或一年一次监测患者。在实施例中，在PCOS诊断之后一个月一次或一年一次监测罹患PCOS的受试者。在实施例中，在进行疗法之后监测正在针对PCOS进行治疗的受试者一次。特别地，一个月一次或一年一次监测正在针对PCOS进行治疗的受试者以确定治疗的功效。

在实施例中，PCOS的疗法选自由PCOS的基于药物的疗法和生活方式改变组成的组以控制代谢症状。在实施例中，PCOS的基于药物的疗法选自由以下组成的组：用于调节经期的药物，特别是口服避孕药或孕激素疗法，用于预防或控制糖尿病，特别是2型糖尿病的药物，用于预防或控制高胆固醇的药物，增加生育能力的激素或药物，去除多余毛发的药物、激素或程序，控制痤疮的药物或程序。

在实施例中，生物体液样品是全血、血清、血浆、毛细血管血、间质液、腹膜液或月经液，优选地，生物体液样品是血清或全血。在实施例中，样品是体外样品，即，其将在体外进行分析并且不会被移回体内。

在特定实施例中，患者是实验动物、家畜或灵长类动物。在特定实施方案中，患者是人类患者。在特定实施例中，患者是人类女性患者。在特定实施例中，患者是小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于25岁、特别是小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于25岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。在特定实施例中，患者是15岁至小于20岁，并且在月经初潮后三年的女性人类患者。

在实施例中，本发明的第二方法是体外方法。

在实施例中，使用抗体，特别是使用单克隆抗体确定METRNL的量或浓度。在实施例中，确定患者样品中METRNL的量或浓度的步骤a)包括进行免疫测定法。在实施例中，免疫测定法以直接或间接形式进行。在实施例中，此类免疫测定法选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、酶免疫测定法(enzymeimmunoassay,EIA)、放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)，或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光检测的免疫测定法。

在特定实施例中，确定患者的样品中的METRNL的量或浓度的步骤a)包括以下步骤：

i)将患者的样品和与METRNL特异性地结合的一种或多种抗体一起孵育，从而在抗体与METRNL之间产生复合物，以及

ii)量化步骤i)中形成的复合物，从而量化患者的样品中的METRNL的量或浓度。

在特定实施例中，在步骤i)中，将样品与两种与METRNL特异性地结合的抗体一起孵育。如对本领域技术人员显而易见的，可以按任意需要的次序使样品接触第一和第二抗体，例如首先接触第一抗体并且然后接触第二抗体，或者首先接触第二抗体并且然后接触第一抗体，或者同时接触第一和第二抗体，并且在充分的时间和条件下接触，以形成第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物。如本领域技术人员将容易理解的，这仅仅是用于设定形成以下复合物的适当或充分的时间和条件的常规实验，即形成特异性抗METRNL抗体和METRNL抗原/分析物的复合物(＝抗METRNL复合物)，或者形成二级复合物或夹心复合物，其包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和第二抗METRNL抗体(＝第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物)。

对抗METRNL抗体/METRNL复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。对第一抗METRNL抗体/METRNL/第二抗METRNL抗体复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。本领域技术人员充分熟悉所述方式/方法。

在某些实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记。

在一个实施例中，将形成包括针对METRNL的第一抗体、METRNL(分析物)和针对METRNL的第二抗体的夹心，其中第二抗体被可检测地标记，并且其中第一抗METRNL抗体能够结合固相或与固相结合。

在实施例中，第二抗体被直接或间接可检测地标记。在特定实施例中，第二抗体用发光染料，特别是化学发光染料或电化学发光染料可检测地标记。

在第四方面，本发明涉及一种评定罹患疑似PCOS的受试者的计算机实现方法，该计算机实现方法包括以下步骤：

(a)接收针对该受试者的样品中第一生物标志物的量或浓度的值，所述第一生物标志物为METRNL，

(b)任选地，接收针对该受试者的样品中第二生物标志物的量或浓度的值，

(c)任选地，接收针对至少一个附加诊断标准的存在或不存在的值，该至少一个附加诊断准则选自由稀发-无排卵、高雄激素血症和多囊卵巢形态组成的组；

(d)将步骤(a)至(b)的针对该量或浓度的该值与针对该生物标志物的参考以及针对该至少一个附加诊断准则的存在或不存在的该值进行比较并且/或者基于该生物标志物的该量或浓度以及该值来计算用于评定患有疑似PCOS的该受试者的评分；以及

(e)基于在步骤(d)中进行的比较和/或计算来评定所述受试者。

在实施例中，评定罹患疑似PCOS的受试者的计算机实现方法包括基本上由前述步骤组成的方法或包括进一步步骤的方法。此外，本发明方法优选地是离体方法，且更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定其他标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。

如本文所使用，术语“计算机实现”意为该方法以自动化方式在数据处理单元上执行，该数据处理单元通常包括在计算机或类似的数据处理装置中。数据处理单元应接收生物标志物的量的值。此类值可以是量、相对量或反映如本文别处详细描述的量的任何其他计算值。因此，应当理解，上述方法不需要确定生物标志物的量，而是使用已经预定的量的值。

原则上，本发明还设想了一种计算机程序、计算机程序产品或具有有形嵌入所述计算机程序的计算机可读存储介质，其中该计算机程序包括指令，该指令当在数据处理装置或计算机上运行时执行本发明的上述方法。

具体地，本公开进一步涵盖：

-计算机或计算机网络，其包括至少一个处理器，其中处理器被适配成进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，

-计算机可加载数据结构，其被适配成当在计算机上执行数据结构时，进行根据本说明书中所描述的实施例之一的方法，

-计算机脚本，其中该计算机程序适配成当在计算机上执行该程序时，进行根据本说明书中所述的实施例中的一者的方法，

-计算机程序，其包括程序装置，该程序装置用于当在计算机上或在计算机网络上执行该计算机程序时，进行根据本说明书中所描述的实施例中的一者的方法，

-计算机程序，该计算机程序包括根据前述实施方案的程序装置，

其中该程序装置存储在计算机可读的存储介质上，

-存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适配成在已被加载到计算机或计算机网络的主存储装置和/或工作存储装置之后，进行根据本说明书中所述的实施例中的一者的方法，

-计算机程序产品，该计算机程序产品具有程序代码工具，其中程序代码工具可以存储或被存储在存储介质上，以用于在计算机上或在计算机网络上执行程序代码工具的情况下，进行根据本说明书中所述的实施例中的一者的方法，

-数据流信号，通常是加密的，包括本文别处定义的参数的数据，

以及

-数据流信号，通常是加密的，包括由本发明的方法提供的评定。

定义：

在本发明的试剂盒的上下文中，术语“试剂”描述了添加到允许显示样品中特定组分的量或浓度的样品中的物质或化合物。

在本发明的试剂盒的上下文中，术语“特异性测量”是指检测明确定义的分子的准确量或浓度。对于特定的测量，从雌性获得的样品可以在适于形成结合剂标志物-复合物的条件下与试剂一起孵育。这样的条件不需要指定，因为这样的合适的孵育条件是本领域技术人员熟知的。

在本发明的试剂盒的上下文中，术语“试剂”可以描述蛋白质分子(诸如抗体)、核酸分子(诸如任何形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))或另一种生化、有机或无机物质，它可以与样品中待特异性测量的分子相互作用。

进一步地，该试剂可以连接到可检测的报道部分或标记，诸如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等，诸如可用于免疫测定分析的荧光标志物。任何报道部分或标记都可以与根据本发明第二方面的试剂盒的试剂一起使用，只要其信号可以与洗涤后保留在支持物上的结合剂的量直接相关或成比例。然后可以使用适于特定可检测报道部分或标记的方法来确定保持与固体支持物结合的任选的第二结合剂的量。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影膺象方法通常是合适的。可使用多种偶联技术制备抗体-酶缀合物(综述参见，例如，Scouten,W.H.,Methods in Enzymology 135:30-65,1987)。光谱法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。生物素可使用亲和素或链霉亲和素检测，与不同的报道基团(通常是放射性基团或荧光基团或酶)偶联。酶报道基团通常可以通过添加底物(通常持续特定时间)来检测，然后对反应产物进行光谱、分光光度或其他分析。使用本领域技术人员熟知的技术，可以使用标准和标准添加物来确定样品中抗原的水平。

试剂还可以是另外能够连接到用于色谱法的柱的基质以进行纯化和/或进一步分析(诸如质谱法分析)的物质。此外，试剂可以连接到测试条。

优选地，试剂是抗体。用于测量在从上述雌性获得的样品中待特异性测量的分子中的一个的量或浓度的合适抗体是本领域技术人员熟知的。

优选地，该试剂可用于电化学发光-免疫测定，更优选地，该试剂是可用于电化学发光-免疫测定的抗体。

此外，该试剂盒可包含多于一种试剂(诸如两种不同的试剂、三种不同的试剂、四种不同的试剂或更多种不同的试剂)，优选两种不同的试剂以与样品中被特异性测量的一种分子相互作用。例如，如果在电化学发光-免疫测定中测量被特异性测量的分子，则该试剂盒可以包含与待测量的相同分子结合的两种不同抗体。优选地，与相同分子结合的两种不同抗体不竞争在该分子处的结合位点，而是在不同位置处结合此分子。进一步地，两种抗体都可以连接到不同的可检测报道部分或标记上。

该试剂盒可以进一步包含缓冲剂和/或盐以调节pH以及反应并且测量条件。此外，该试剂盒可包含稳定剂，例如以在特定测量(i)FT的量或浓度或(ii)TT的量或浓度和SHBG的量或浓度期间支持试剂和/或激素的稳定性的稳定剂；AMH的量或浓度；以及指示PCOS的一种或多种另外的激素的量或浓度。合适的缓冲液、盐和稳定剂是本领域技术人员熟知的。此外，可以将叠氮化钠添加到试剂盒的所有液体溶液(诸如试剂或缓冲液)中。

该试剂盒还可以包括从雌性采集血液样品所需的所有设备(诸如用于血液样品的容器、针头以及连接容器和针头的装置)。优选地，该试剂盒可以包括注射器。

一般而言，医生或医生的助手可以从雌性身上采集血液。随后，血液可以被送到实验室，在实验室使用在指定分析仪上的试剂盒测量样品，并将数据发送给医生。然而，该试剂盒也可以由医生或医生的助手自己使用。该试剂盒可以在医生的门诊、固定治疗或家庭访问期间应用。

试剂盒的所有组件都可以单独包装在单个容器中。然而，也可以将试剂盒的两种或更多种组件一起包装在一个或多个容器中。

该试剂盒可以进一步包括标记，例如该标记包括有关如何使用该试剂盒的说明或描述该试剂盒的内容。然而，此信息也可以以任何其他形式(诸如在存储介质(诸如CD-ROM或U盘)上)提供。

词语“包括(comprise)”以及“包括(comprises)”和“包括(comprising)”等变体应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。

浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为说明，数值范围“150mg至600mg”应解释为不仅包括明确列举的值150mg至600mg，而且包括所指示范围内的单独值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值，诸如150、160、170、180、190、580、590、600mg和子范围，诸如从150至200、150至250、250至300、350至600等。此相同原则适用于仅引用一个数值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。

当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。

如本文所用，术语“指标”是指状况的标志或信号或用于监测状况。这种“状况”是指细胞、组织或器官的生物学状态或指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是分子(包括但不限于肽、蛋白质和核酸)的存在或不存在，或者可以是这种分子在细胞、组织、器官或个体中的表达水平或模式的变化。指标可以是个体中的疾病的发作、发展或存在或这种疾病进一步进展的标志。指标也可以是针对个体处于发展疾病的风险的标志。

在本发明的上下文中，术语“生物标志物”是指生物系统内的物质，其用作所述系统的生物学状态的指标。在本领域中，术语“生物标志物”有时也适用于检测所述内源性物质(例如抗体、核酸探针等、成像系统)的手段。在本发明的上下文中，术语“生物标志物”应仅适用于物质，而不适用于检测手段。因此，生物标志物可以是活的生物体中存在的任何种类的分子，诸如核酸(DNA、mRNA、miRNA、rRNA等)、蛋白质(细胞表面受体、质蛋白等)、代谢物或激素(血糖、胰岛素、雌性激素等)，另一种分子的某种修饰的分子特征(例如蛋白质上的糖部分或磷酰基残基，基因组DNA上的甲基残基)，或者已被生物体内化的物质或这种物质的代谢物。

本文提及的生物标志物可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测的方法通常包括量化样品中生物标志物的水平的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫测定，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在Elecsys^TM分析仪上可用)、CBA(例如在Roche-Hitachi^TM分析仪上可用的酶钴结合测定)和乳胶凝集测定(例如在Roche-Hitachi^TM分析仪上可用)。

术语“无排卵”通常描述卵巢在雌性月经周期中根本不释放任何卵母细胞的情况。如果在一年内至少一个雌性月经周期、优选至少三个雌性月经周期、更优选至少六个雌性月经周期以及最优选至少九个雌性月经周期的持续时间内没有卵母细胞释放，则可以确定被评定患有PCOS风险的女性患有无排卵。进一步地，如果至少6个月、优选至少9个月、更优选至少1年的持续时间内没有卵母细胞释放，则可以确定被评定患有PCOS风险的雌性患有无排卵。

疾病的“症状”是指罹患这种疾病的组织、器官或生物体可注意到的疾病，并且包括但不限于组织、器官或个体的疼痛、虚弱、压痛、紧张、僵硬和痉挛。PCOS的典型症状包括但不限于稀发-无排卵、不规律周期、高雄激素血症、多囊卵巢形态、不孕、2型糖尿病、超重和其他代谢状况以及心理困扰。疾病的“征兆”或“信号”包括但不限于变化或改变，诸如生物标志物或分子标志物等特定指标的存在、不存在、增加或升高、减少或下降，或症状的发展、存在，或恶化。疼痛的症状包括但不限于一种令人不快的感觉，这种感觉可能表现为持续性或不同程度的灼痛、悸动、瘙痒或刺痛。

术语“疾病”和“疾患”在本文中可互换使用，其是指异常状况，尤其是异常医学状况，诸如患病或损伤，其中组织、器官或个体不再能够有效地履行其功能。通常，但不一定，疾病与指示此类疾病存在的特定症状或征兆相关。因此，此类症状或征兆的存在可以指示罹患疾病的组织、器官或个体。这些症状或征兆的改变可能预示着这种疾病的进展。疾病进展的典型特征是这些症状或征兆的增加或减少，这可能表明疾病的“恶化”或“好转”。疾病的“恶化”以组织、器官或生物体有效履行其功能的能力下降为特征，而疾病的“好转”通常以组织、器官或个体有效履行其功能的能力增强为特征。有疾病“发展风险”的组织、器官或个体处于健康状态，但显示出发生疾病的可能性。通常，发展出疾病的风险与这种疾病的早期或微弱的征兆或症状相关联。在这种情况下，仍然可以通过治疗来预防疾病的发作。疾病的实例包括但不限于炎症性疾病、感染性疾病、皮肤病、内分泌疾病、肠道疾病、神经系统性疾患、关节疾病、遗传性疾患、自身免疫疾病、创伤性疾病和各种类型的癌症。

术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用，其是指动物，优选地指哺乳动物，并且更通常地指人。患者优选地为人类女性。需要诊断PCOS。

术语“样品”或“目标样品”在本文中可互换使用，其是指组织、器官或个体的一部分或切片，通常小于这种组织、器官或个体，旨在代表整个组织、器官或个体。在分析时，样品提供关于组织状态或者器官或个体的健康或患病状态的信息。样品的实例包括但不限于液体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、尿液、唾液和淋巴液；或固体样品，诸如组织提取物、软骨、骨头、滑膜和结缔组织。样品的分析可以在视觉或化学基础上完成。视觉分析包括但不限于组织、器官或个体的显微成像或射线照相扫描，以允许对样品进行形态学评估。化学分析包括但不限于检测特定指标的存在或不存在或其量、浓度或水平的改变。样品为体外样品，其将在体外进行分析并且不会被移回体内。

如本文所用，术语“量”涵盖了本文提及的生物标志物的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度以及与其相关或可从其得出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所涵盖的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性地结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测量的应答量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用，术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物的量与本说明书别处指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品中生物标志物的测量或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测量的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与合适的参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评定比较的结果，即以合适的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测量的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与合适的参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评定比较的结果，即以合适的输出格式自动提供所需的评定。

表述“将确定的量或浓度与参考进行比较”无论如何仅用于进一步说明对本领域技术人员显而易见的内容。在对照样品中建立参考浓度。

如本文所用，术语“参考样品”或“对照样品”是指以与感兴趣样品基本上相同的方式对其进行分析并且将其信息与感兴趣样品的信息进行比较的样品。因此，参考样品提供一种标准，用于评估从目标样品获得的信息。对照样品可源自健康或正常的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可指示疾病发展的风险或者这种疾病或疾患的存在或进一步进展。对照样品可源自异常或患病的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可指示疾病发展的风险降低或者这种疾病或疾患不存在或好转。参考样品也可源自与目标样品相同的组织、器官或个体，但已在较早的时间点被获取。较早获取的参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可指示疾病的进展，即疾病随时间推移而好转或恶化。

对照样品可以是内部或外部对照样品。使用内部对照样品，即在测试样品中以及取自同一受试者的一个或多个其他样品中评定(多个)标志物水平，以确定所述(多个)标志物的(多个)水平是否有任何变化。对于外部对照样品，将源自个体的样品中的标志物的存在或量与其在已知罹患给定病症或已知处于患给定病症风险的个体或已知没有给定病症的个体(即“正常个体”)中的存在或量进行比较。

本领域技术人员将理解，此类外部对照样品可获自单个个体或可获自年龄匹配且无混杂疾病的参考群体。通常，使用来自适当参考群体的100个特征良好的个体的样品来建立“参考值”。然而，也可以选择由20、30、50、200、500或1000个个体组成的参考群体。健康个体代表用于建立对照值的优选的参考群体。

例如，可将患者样品中的标志物浓度与已知与某种疾病的具体病程相关联的浓度进行比较。通常样品的标志物浓度与诊断直接或间接相关，并且标志物浓度例如用于确定个体是否处于患某种疾病的风险。可替代地，在判断疾病进展的风险中或在对患者的随访中，可将样品的标志物浓度例如与已知与以下相关联的标志物浓度进行比较：对某种疾病的疗法的应答、某种疾病的诊断、某种疾病的严重程度的评定、针对某种疾病选择适当的药物的指导。根据预期的诊断用途，选择适当的对照样品并在其中建立标志物的对照或参考值。如本领域技术人员也清楚的，在对照样品中建立的绝对标志物值将取决于所使用的测定法。

如本文所用，术语“评定”是指评定患者是否罹患PCOS或处于发展PCOS的风险。因此，如本文所用，评定包括通过确定患者的样品中METRNL的量或浓度，以及将经确定的量或浓度与参考进行比较来诊断PCOS，预测发展PCOS的风险，选择PCOS的疗法，监测罹患PCOS或正在针对PCOS进行治疗的患者。

如本领域技术人员将理解的，尽管根据本发明做出的评定是优选的，但可能不会对100％的被研究的受试者都是正确的。该术语通常要求能够正确地评定统计上显著部分的受试者。本领域技术人员可使用各种众所周知的统计评估工具(例如，确定置信区间、确定p值、学生t检验、曼-惠特尼检验等)毫不费力地确定一部分是否具有统计学意义。详细信息可以参见Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983。通常设想的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。p值通常为0.2、0.1、0.05。

术语“降低的”或“减少的”指标水平、量和/或浓度是指样品中这种指标的水平、量和/或浓度与参考或参考样品相比降低。

术语“升高的”或“增加的”指标水平、量和/或浓度是指样品中这种指标的水平、量和/或浓度与参考或参考样品相比较高。例如，与在未罹患给定疾病的个体的相同体液样品中相比，在罹患所述疾病的一个个体的体液样品中可检出较高量或浓度的蛋白质具有升高的水平。

术语“测量(measurement)”、“测量(measuring)”或“确定”优选地包括定性、半定量或定量的测量。

如本文所用，术语“免疫球蛋白(Ig)”是指赋予免疫球蛋白超家族的糖蛋白的免疫力。“表面免疫球蛋白”通过其跨膜区附着至效应细胞的膜，并且涵盖的分子诸如但不限于B细胞受体、T细胞受体、I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白、β-2微球蛋白(约2M)、CD3、CD4和CDS。

通常，如本文所用，术语“抗体”是指分泌型免疫球蛋白，其缺乏跨膜区，并且因此可释放到血流和体腔中。人类抗体基于它们所拥有的重链被分为不同的同种型。有五种类型的人类Ig重链，由希腊字母表示：α、γ、δ、ε和μ。存在的重链类型定义了抗体的类别，即这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中，各自发挥不同的作用，并且引导针对不同类型的抗原做出适当的免疫应答。不同的重链在大小和组成上不同；并且可以包含大约450个氨基酸(Janeway等人(2001)Immunobiology,Garland Science)。IgA存在于粘膜区域，例如肠道、呼吸道和泌尿生殖道，以及唾液、眼泪和母乳中，防止病原体定植(Underdown&Schiff(1986)Annu.Rev.Immunol.4:389-417)。IgD主要作为未暴露于抗原的B细胞上的抗原受体起作用，并且参与激活嗜碱性粒细胞和肥大细胞以产生抗微生物因子(Geisberger等人(2006)Immunology 118:429-437；Chen等人(2009)Nat.Immunol.10:889-898)。IgE经由与过敏原结合，触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺，从而参与过敏反应。IgE还参与防止寄生虫(Pier等人(2004)Immunology,Infection,and Immunity,ASM Press)。IgG提供了针对入侵病原体的大部分基于抗体的免疫，并且是唯一能够穿过胎盘为胎儿提供被动免疫的抗体同种型(Pier等人(2004)Immunology,Infection,and Immunity,ASM Press)。在人类中，有四种不同的IgG亚类(IgGl、2、3和4)，按照它们在血清中的丰度顺序命名，其中IgGl的丰度最高(约66％)，其次是IgG2(约23％)、IgG3(约7％)和IgG(约4％)。不同IgG类别的生物学特性由相应铰链区的结构决定。IgM以单体形式和分泌型五聚体形式在B细胞表面表达，具有非常高的亲合力。在产生足够的IgG之前，IgM在B细胞介导的(体液)免疫的早期分期参与消除病原体(Geisberger等人(2006)Immunology 118:429-437)。抗体不仅以单体形式存在，而且已知形成两个Ig单元的二聚体(例如IgA)、四个Ig单元的四聚体(例如硬骨鱼的IgM)或五个Ig单元的五聚体(例如哺乳动物IgM)。抗体通常由四条多肽链组成，包括两条相同的重链和两条相同的轻链，它们经由二硫键连接并类似于“Y”形大分子。每条链包含许多免疫球蛋白结构域，其中一些是恒定结构域，而另一些是可变结构域。免疫球蛋白结构域由2层夹心结构组成，其中7到9条反平行的链排列成两个片。通常，抗体的重链包含四个Ig结构域，其中三个是恒定(CH结构域：CHI、CH2、CH3)结构域，并且其中之一是可变结构域(VH)。轻链通常包含一个恒定Ig结构域(CL)和一个可变Ig结构域(VL)。举例而言，人IgG重链从N末端到C末端按VwCH1-CH2-CH3(也称为VwCyl-Cy2-Cy3)顺序由连接的四个Ig结构域组成，而人IgG轻链从N末端到C末端按VL-CL的顺序由连接的两个免疫球蛋白结构域组成，是κ型或λ型(VK-CK或VA.-CA.)。举例而言，人IgG的恒定链包含447个氨基酸。在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白中氨基酸位置的编号是“EU索引”的编号，如在以下文献中：Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.,和Foeller,C.,(1991)Sequences ofproteins of immunological interest,5^thed.U.S.Department of Health and HumanService,National Institutes of Health,Bethesda,MD。“如Kabat中的EU索引”是指人类IgG lEU抗体的残基编号。因此，IgG上下文中的CH结构域如下：“CHI”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置118-220；“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置237-340；并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的氨基酸位置341-447。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指呈其基本上完整形式的抗体而不是如下文定义的抗体片段。该术语特别是指具有包含Fc区的重链的抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab片段”(也称为“Fab部分”或“Fab区”)，每个抗原结合片段都具有单个抗原结合位点，以及一个残留的“Fe片段”(也称为“Fe部分”或“Fe区”)，其名称反映了其易于结晶的能力。人IgG Fe区的晶体结构已经确定(Deisenhofer(1981)Biochemistry 20:2361-2370)。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fe区由两个相同的蛋白质片段组成，所述两个相同的蛋白质片段源自抗体的两条重链的CH2和CH3结构域；在IgM和IgE同种型中，Fe区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH2-4)。此外，较小的免疫球蛋白分子天然存在或已被人工构造。术语“Fab'片段”是指另外包括Ig分子铰链区的Fab片段，而“F(ab')2片段”应理解为包括以化学方式联接的或经由二硫键连接的两个Fab'片段。虽然“单域抗体(sdAb)”(Desmyter等人(1996)Nat.StructureBiol.3:803-811)和“纳米抗体”仅包括单个VH结构域，但“单链Fv(scFv)”片段包括经由短接头肽与轻链可变结构域接合的重链可变结构域(Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879-5883)。二价单链可变片段(di-scFv)可以通过连接两个scFv(scFvA-scFvB)来工程化。这可通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链，从而产生“串联scFv”(VHA-VLA-VHB-VLB)来实现。另一种可能性是创建带有接头的scFv，该接头对于两个可变区而言太短而无法折叠在一起，从而迫使scFv二聚化。通常使用长度为5个残基的接头来产生这些二聚体。这种类型被称为“双体抗体”。VH和VL结构域之间还更短的接头(一个或两个氨基酸)引致形成单特异性三聚体，即所谓的“三体抗体(triabodies)”或“三体抗体(tribadies)”。双特异性双体抗体是通过表达为分别具有VHA-VLB和VHB-VLA或VLA-VHB和VLB-VHA排列的链而形成的。单链双体抗体(scDb)包括VHA-VLB和VHB-VLA片段，它们通过12-20个氨基酸，优选地14个氨基酸的连接基肽(P)联接(VHA-VLB-P-VHB-VLA)。“双特异性T细胞衔接物(BiTE)”是融合蛋白，由不同抗体的两个scFv组成，其中一个scFv经由CD3受体与T细胞结合，并且另一个经由肿瘤特异性分子与肿瘤细胞结合(Kufer等人(2004)Trends Biotechnol.22:238-244)。双亲和力重靶向分子(“DART”分子)是通过C末端二硫键而另外稳定的双体抗体。

因此，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段；双体抗体；sdAb、纳米抗体、scFv、di-scFv、串联scFv、三体抗体、双体抗体、scDb、BiTE和DART。

术语“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括但不限于基于表面等离子共振的测定(例如PCT申请公开号WO2005/012359中描述的BIAcore测定)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；和竞争测定(例如RIA)。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常快速结合抗原并且倾向于保持更长的结合时间。测量结合亲和力的各种方法是本领域中已知的，其中任何一种方法均可用于本发明的目的。

“夹心免疫测定法”广泛用于检测目标分析物。在这种测定中，分析物被“夹在”第一抗体和第二抗体之间。通常，夹心测定要求捕获和检测抗体结合至目标分析物上的不同的非覆盖型表位。通过适当的方式测量这种夹心复合物并由此对分析物进行定量。在典型的夹心型测定中，结合到固相载体或能结合到固相的第一抗体以及被可检测地标记的第二抗体各自与分析物结合于不同的非覆盖型表位。第一分析物特异性结合剂(例如抗体)共价或被动结合到固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。该固相支持体的形式可以是小管、磁珠、微孔板托盘或其他适合于进行免疫测定法的任何表面。结合方法为本领域所公知，通常由交联共价结合或物理吸附组成，在制备测试样品时洗涤聚合物-抗体复合物。然后将待测样品的等分部分添加到固相复合物并在合适的条件下(例如，从室温到40℃，诸如在25℃和37℃之间，包括端值)孵育足够长的一段时间(例如2-40分钟或过夜(如果更方便的话))，以允许第一或捕获抗体和对应的抗原之间的结合。该孵育期结束之后，可洗涤固相，其包括第一抗体或捕获抗体以及与其相结合的抗原，并用结合于该抗原上另一个表位的二级抗体或标记的抗体进行孵育。第二抗体连接到报告物分子，该分子用于指示第二抗体与第一抗体-目标抗原复合物之间的结合。

极为通用的其他夹心测定法方式包括使用结合对的第一配偶体包被的固相载体，例如顺磁性链霉亲和素包被的微粒。将此类微粒与以下物质混合并孵育：与结合对的第二配偶体结合的分析物特异性结合剂(例如生物素化的抗体)；疑似包括或包括分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体结合到所述分析物特异性结合剂；以及被可检测地标记的第二分析物特异性结合剂。如对本领域技术人员显而易见的那样，所述组分在适当条件下孵育足够长的一段时间，以使标记的抗体(通过分析物)、与结合对的第二配偶体(结合)的分析物特异性结合剂以及结合对的第一配偶体与固相微粒相结合。视情况而定，所述测定可包含一个或多个洗涤步骤。

术语“可检测地标记的”涵盖了可直接或间接检出的标记。

可直接检出的标记提供可检测信号或它们与第二标记相互作用以修正第一或第二标记提供的可检测信号，例如发生FRET(荧光共振能量转移)。标记诸如荧光染料及发光(包括化学发光和电化学发光)染料(Briggs等人"Synthesis of FunctionalisedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测的信号并且通常适用于标记。在一个实施方案中，“可检测地标记的”指提供或诱导提供可检测信号的标记，即分别指荧光标记、发光标记(例如化学发光标记或电化学发光标记)、放射性标记或基于金属螯合物的标记。

大量的可用标记(也称为染料)通常可分为以下类别，全部类别的总体及其每一个类别均表示如本公开所述的实施例：

(a)荧光染料

荧光染料例如由以下描述：Briggs等人"Synthesis of FunctionalizedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)。

荧光标记或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型标记，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺(Lissamine)；花青；藻红蛋白；得克萨斯红(Texas Red)；及其类似物。使用本文所公开的技术，可将荧光标记缀合至目标分子所包含的醛基。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/MolecularProbes(Eugene,Oregon,USA)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)购得的这类荧光染料和试剂。

(b)发光染料

发光染料或标记还可进一步划分为以下子类别：化学发光染料和电化学发光染料。

不同类别的化学发光标记包括鲁米诺、吖啶类化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶的标记(详细综述见Dodeigne C.等人，Talanta 51(2000)415-439)。

用作电化学发光标记的主要相关性标记分别是钌基和铱基电化学发光复合物。已经证明，电化学发光(ECL)作为高灵敏度和选择性方法在分析应用中非常有用。该方法使化学发光分析的分析优势(无背景光信号)和通过采用电极电位更方便地控制反应相结合。通常，钌复合物，尤其是与TPA(三丙胺)在液相或液固界面再生的[Ru(Bpy)3]2+(在约620nm处释放光子)被用作ECL标记。

电化学发光(electrochemiluminescent,ECL)测定法提供了灵敏、精确地检测目标分析物的存在和浓度的方法。所述技术采用的是可在适当化学环境下发生电化学地氧化或还原时被诱导发光的标记或其他反应物。这种电化学发光由施加在工作电极上的电压在特定时间并且以特定方式触发。标记所发出的光经测定后，可指示分析物的存在性或数量。为了更全面地描述这类ECL技术，本文引用了以下文献：美国专利号5,221,605、美国专利号5,591,581、美国专利号5,597,910、PCT公布的申请WO90/05296、PCT公布的申请WO92/14139、PCT公布的申请WO90/05301、PCT公布的申请WO96/24690、PCT公布的申请US95/03190、PCT申请US97/16942、PCT公布的申请US96/06763、PCT公布的申请WO95/08644、PCT公布的申请WO96/06946、PCT公布的申请WO96/33411、PCT公布的申请WO87/06706、PCT公布的申请WO96/39534、PCT公布的申请WO96/41175、PCT公布的申请WO96/40978、PCT/US97/03653以及美国专利申请08/437,348(美国专利号5,679,519)。还引用了Knight等人1994年发表的ECL分析应用回顾(Analyst,1994,119:879-890)以及该文章所引用的文献。在一个实施方案中，使用电化学发光标记实施根据本说明所述的方法。

最近，对铱基ECL标记也已有描述(WO2012107419)。

(c)放射性标记使用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。

(d)金属螯合物的配合物适合用作成像和治疗目的的标记，这是本领域所公知的(US2010/0111861；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,461；Hnatowich等人，J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares等人，Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等人，Bioconjugate Chem.1(1990)59-65；Meares等人，J.Cancer(1990)，增刊10:21-26；Izard等人，Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula等人，Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等人，J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera等人，J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人，Cancer Res.50(1990)4221-4226；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等人，Cancer Res.61(2001)4474-4482；Mitchell等人，J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等人，Bioconjugate Chem.10(1999)103-111；Miederer等人，J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo等人，ClinicalCancer Research 4(1998)2483-90；Blend等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363；Nikula等人，J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等人，J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。

实例

本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。

实例1：由Olink开发的邻位延伸测定(PEA)技术确定的生物标志物METRNL在PCOS(表型A)女性和对照中的诊断性能

作为测量的一部分，对来自人类女性的88份血清样品进行了分析。病例组包括来自根据鹿特丹标准诊断为PCOS(表型A)的患者的51份样品。对照组包括来自无PCOS的健康女性的37份样品。分析物的浓度使用Olink开发的邻位延伸测定(Proximity ExtensionAssay,PEA)技术来确定。简而言之，与独特的、部分互补的寡核苷酸偶联的一对匹配的抗体针对每个生物标志物。然后定量通过定量实时PCR来进行。

在根据制造商的方案对选定面板的每一者进行样品稀释后，Olink方案由三个核心步骤组成：1.孵化，2.延伸和扩增，3.检测。将1μl每份样品与3μl孵育混合物在96孔板中混合。除了用DNA寡核苷酸标记的92个抗体对之外，孵育混合物还含有设计用于监测Olink方案的三个主要步骤的内部对照(2个孵育对照、1个延伸对照和1个检测对照)。作为外部对照，板中包括3个阳性对照(板间对照)和3个阴性对照以及2个样品对照(合并血浆样品)。将样品在+4℃下孵育过夜。在此步骤中，抗体对与样品中的相应蛋白质结合。孵育完成后，将96μl延伸混合物加入到样品中。将板置于热循环仪中进行杂交，并通过DNA聚合酶进行延伸(50℃20min，95℃5min(95℃ 30s,54℃ 1min,60℃ 1min)x17，10℃保持)。通过PCR扩增DNA条形码。最后，每个DNA条形码的量通过微流控qPCR进行定量。根据制造商的说明使用96.96Dynamic Array^TM集成体液回路(Integrated Fluidic Circuit,IFC)。将7.2μl的检测混合物加入到2.8μl的每份样品中，其中5μl转移到已灌注的96.96Dynamic Array IFC左侧入口中。将5μl引物溶液转移至已灌注的96.96Dynamic Array IFC右侧入口中。根据制造商的说明将芯片加载到Fluidigm IFC Controller HX中。根据制造商的说明在FluidigmBiomarkTM Reader中运行Olink Protein Expression 96×96Program(50℃120s，70℃1800s，25℃600s，95℃300s(95℃ 15s,60℃ 60s)x 35；具有以下设置：application-GeneExpression；passive Reference-ROX；assay-Single probe；probes-FAM-MGB)。使用以下方程将从qPCR获得的Ct值转换为称为标准化蛋白质表达(NPX(Normalized ProteineXpression)，log2标度上的相对定量单位)的任意单位：

延伸控制：

Ct_分析物–Ct_延伸控制＝dCt_分析物

板间控制：

dCt_分析物–dCt_板间控制＝ddCt_分析物

根据校正因子进行调整：

校正因子–ddCt_分析物＝NPX_分析物

使用OlinkNPX Manager软件实现质量控制和标准化。

生成受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线(图1)。模型性能通过查看曲线下面积(AUC)来确定。最好可能的AUC为1，而最低可能的为0.5。ROC曲线分析显示AUC为0.972(95％CI 0.944-1.0，图1)，证明METRNL对PCOS具有高诊断准确性。使用ROC分析区分具有完全显现的表型A的PCOS女性(病例)和健康对照受试者的METRNL的诊断性能如表1所示，该表描述了ROC曲线分析的AUC和相关的95％置信区间。结果是使用Olink邻位延伸技术获得的。

表1

提供Olink PEA技术获得的数据用于生成健康对照和PCOS病例的箱线图。箱体包括中位数(中间四分位数)、四分位距(其代表该组评分的中间50％)、上四分位数(低于上四分位数的75％的评分)和下四分位数(低于下四分位数的25％的评分)。须线代表四分位距1.5倍的值。相较于健康对照，PCOS女性的血清METRNL浓度减少(图2)。

实例2：通过ELISA技术确定的生物标志物METRNL在PCOS女性(表型A、B、C和D)和对照中的诊断性能

性能验证已经在85例病例(来自PCOS女性的血清样品)和46例对照(来自健康女性的血清样品)的样品集合中进行。

分析物的浓度通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)来确定。病例组由根据鹿特丹标准诊断为PCOS的患者(26例表型A、19例表型B、20例表型C和20例表型D)组成。对照组包括没有PCOS的健康女性。

人类血清中METRNL的浓度使用来自R&D Systems的Human METRNL ELISA试剂盒(目录号：DY7867-05)来确定。该试剂盒是一种设计用于检测和定量细胞培养上清液、血浆和血清中的人类METRNL水平的固相夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)。

将捕获抗体在不含载体蛋白的PBS中稀释至工作浓度。将96孔微孔板与每孔100μL的稀释捕获抗体一起孵育。将板密封并在室温下孵育过夜。将板用每次每孔400μL WashBuffer洗涤3次。最后一次洗涤后，完全去除Wash Buffer，通过向每个孔中加入300μLRegent Diluent来封闭板，并将板在室温下孵育至少1小时。将板用每次每孔400μL WashBuffer洗涤3次，并备用。样品以4倍稀释进行测量。将所有试剂置于室温后，加入100μL的每份样品和标准品。样品和标准品一式两份进行测量。在室温下孵育2小时期间，存在的任何METRNL都与微量滴定板上的固定捕获抗体结合。在洗涤步骤(3x 400μL)期间，将未结合的物质从板中去除，然后将稀释在Reagent Diluent中的100μL抗METRNL DetectionAntibody加入到孔中。在2小时孵育和另一个洗涤步骤(3x 400μL)以去除任何未结合的检测抗体后，将100μL制备的链霉亲和素-HRP溶液加入到板中。随后在室温下孵育20分钟并进行洗涤步骤(3x 400μL)，避免直接暴露于光照。最后一次洗涤后，将100μL SubstrateSolution加入到板中。将板在室温下孵育20分钟，避免直接暴露于光照。在孵育期间，底物变成蓝色。显色与初始步骤中结合的METRNL的量成比例。通过添加50μL Stop Solution来停止显色，孔中溶液的颜色从蓝色变为黄色，并且用酶标仪在450nm处测量颜色强度以进行检测并在540或570nm处测量颜色强度以进行背景扣除。此扣除将校正板中的光学缺陷。为了产生校准曲线，将随试剂盒提供的冻干重组METRNL重新溶解并在Reagent Diluent中稀释。该测定法的校准范围为15.6pg/mL至1000pg/mL。使用重组METRNL在Reagent Diluent中的2倍连续稀释获得七点标准曲线。使用四参数逻辑(4-PL，牛顿/拉夫森)曲线拟合来拟合校准曲线。

生成受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线(图3)。模型性能通过查看曲线下面积(AUC)来确定。最好可能的AUC为1，而最低可能的为0.5。当所有表型(表型A-D)组合时，PCOS病例的METRNL的ROC曲线分析显示AUC为0.94(95％CI 0.89-0.99)，证实了METRNL对PCOS的高诊断准确性(图3)。使用ROC分析区分PCOS女性(病例、PCOS表型A-D)和健康对照受试者的METRNL的诊断性能如表2所示，该表描述了ROC曲线分析的AUC和相关的95％置信区间。使用ELISA免疫测定法获得结果。

表2

当所有表型(表型A-D)组合时，通过ELISA免疫测定法获得的数据用于生成对照和PCOS病例的箱线图。相较于健康对照，PCOS女性的血清METRNL浓度(pg/mL)减少(图4)。

表3显示了METRNL区分当按不同的表型A、B、C和D分开时的PCOS女性与健康对照受试者的诊断性能。使用ELISA免疫测定法获得结果。表中报告了每种表型的AUC。

表3

标志物

表型A

表型B

表型C

表型D

N(样品量)

样品类型

METRNL

0.9

0.93

0.99

0.95

131

血清

按不同表型分开的PCOS病例与健康对照的METRNL的ROC曲线分析显示，表型A至D的AUC分别为0.9(95％CI 0.78-1)、0.93(95％CI 0.84-1)、0.99(95％CI 0.97-1)和0.95(95％CI 0.86-1)(图5)。结果证实了METRNL对PCOS的高诊断准确性。相较于健康对照，所有不同PCOS表型(表型A-D)的血清METRNL浓度(pg/mL)均显示出减少的水平(图6，使用ELISA免疫测定法获得的结果)。

表4显示了当所有表型(表型A-D)组合时，METRNL在年轻女性(年龄≤25岁)中区分PCOS年轻女性与年轻健康对照受试者的诊断性能。使用ELISA测定法获得结果。

表4

当所有表型组合(表型A-D)时，年轻PCOS病例(年龄≤25岁)的METRNL的ROC曲线分析显示AUC为0.93，证实了针对25岁或更年轻的女性在区分PCOS病例与对照中的高的诊断准确性(95％CI 0.83-1.00，图7)。当仅将年轻女性包括在分析中(年龄≤25岁)时，PCOS病例(所有表型A-D组合)相较于年轻对照(年龄≤25岁，图8)显示出减少的血清METRNL浓度(pg/mL)。

已经评估了METRNL区分当按不同表型A、B、C和D分开时的PCOS年轻女性(年龄≤25岁)与年轻健康对照受试者(年龄≤25岁)的诊断性能，并且结果报告在表5中(PCOS表型与对照的AUC)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

表5

标志物

表型A

表型B

表型C

表型D

N(样品量)

样品类型

METRNL

0.93

0.67

1.00

1.00

30

血清

年轻PCOS病例(年龄≤25岁，表型A-D)的METRNL的ROC曲线分析表明，每种表型的AUC分别为0.93(95％CI 0.78-1)、0.67(95％CI 0.01-1)、1.00(95％CI 1-1)、1.00(95％CI1-1)，证实了METRNL在年龄25岁或更年轻的女性亚组中对PCOS的高诊断准确性(图9)。相较于年轻健康对照(年龄≤25岁，图10)的METRNL浓度，所有不同PCOS表型(表型A-D，年龄≤25岁)的METRNL浓度均减少。

实例3：不同年龄组中通过ELISA技术确定的生物标志物METRNL在PCOS女性(表型A、B、C和D)和对照中的诊断性能

性能验证已经在240例病例(来自PCOS女性的血清样品)和48例对照(来自健康女性的血清样品)的额外样品集合中进行。

分析物的浓度通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)来确定。病例组由根据鹿特丹标准诊断为PCOS的患者(155例表型A、5例表型B、8例表型C和72例表型D)组成，属于三个不同年龄组：15-20(n＝70)、20-25(n＝99)、25-40(n＝71)。对照组包括没有PCOS的健康女性。

人类血清中METRNL的浓度使用来自R&D Systems的Human METRNL ELISA试剂盒(目录号：DY7867-05)，如实例2中所述。

生成受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线(图11)。模型性能通过查看曲线下面积(AUC)来确定。当所有表型(表型A-D)组合时，PCOS病例的METRNL的ROC曲线分析显示AUC为0.91(95％CI 0.88-0.95)，证实了METRNL对PCOS的高诊断准确性(图11)。

使用ROC分析区分PCOS女性(病例、PCOS表型A-D)和健康对照受试者的METRNL的诊断性能如表6所示，该表描述了ROC曲线分析的AUC和相关的95％置信区间。使用ELISA免疫测定法获得结果。

表6

标志物	AUC(曲线下面积)	95％CI(置信区间)	N(样品量)	样品类型
					METRNL	0.91	(0.88-0.95)	288	血清

当所有表型(表型A-D)组合时，通过ELISA免疫测定法获得的数据用于生成对照和PCOS病例的箱线图。相较于健康对照，PCOS女性的血清METRNL浓度(pg/mL)减少(图12)。

表7显示了METRNL区分当按不同的表型A、B、C和D分开时的PCOS女性与健康对照受试者的诊断性能。使用ELISA免疫测定法获得结果。表中报告了每种表型的AUC。

表7

标志物

表型A

表型B

表型C

表型D

N(样品量)

样品类型

METRNL

0.91

1.00

1.00

0.90

288

血清

按不同表型分开的PCOS病例与健康对照的METRNL的ROC曲线分析显示，表型A至D的AUC分别为0.91(95％CI 0.87-0.95)、1.00(95％CI 1.00-1.00)、1.00(95％CI 1.00-1.00)和0.90(95％CI 0.84-0.97)(图13)。结果证实了METRNL对PCOS的高诊断准确性。

相较于健康对照，所有不同PCOS表型(表型A-D)的血清METRNL浓度(pg/mL)均显示出减少的水平(图14，使用ELISA免疫测定法获得的结果)。

表8显示了当所有表型(表型A-D)组合时，METRNL在不同年龄组(15岁≤年龄<20岁、20岁≤年龄<25岁、25岁≤年龄<40岁)中区分PCOS女性与健康对照受试者的诊断性能。使用ELISA测定法获得结果。

表8

按不同年龄组分开的PCOS病例与健康对照的METRNL的ROC曲线分析显示，15-20岁、20-25岁、25-40岁年龄组的AUC分别为0.88(95％CI 0.80-0.95)、0.91(95％CI 0.86-0.96)和0.96(95％CI 0.91-1.00)(图15)。结果证实了METRNL在所有不同年龄组对PCOS的高诊断准确性。

在所有不同年龄组中均证实，相较于对照，PCOS女性的血清METRNL浓度(pg/mL)减少(图16)。

考虑到缺乏诊断PCOS的可靠生物标志物，尤其是在年轻女性(年龄<25岁)中，因此对≥15岁和<25岁的年龄组进行了单独分析。

表9显示了当所有表型(表型A-D)组合时，METRNL在年轻女性(15岁≤年龄<25岁)中区分PCOS年轻女性与年轻健康对照受试者的诊断性能。使用ELISA测定法获得结果。

表9

当所有表型组合(表型A-D)时，年轻PCOS病例(15岁≤年龄<25岁)的METRNL的ROC曲线分析显示AUC为0.90，证实了针对15-25岁女性在区分PCOS病例与对照中的高诊断准确性(95％CI 0.85-0.94，图17)。当仅将年轻女性包括在分析中(15岁≤年龄<25岁)时，PCOS病例(所有表型A-D组合)相较于年轻对照(15岁≤年龄<25岁，图18)显示出减少的血清METRNL浓度(pg/mL)。

已经评估了METRNL区分当按不同表型A、B、C和D分开时的PCOS年轻女性(15岁≤年龄<25岁)与年轻健康对照受试者(15岁≤年龄<25岁)的诊断性能，并且结果报告在表10中(PCOS表型与对照的AUC)。使用ELISA免疫测定法获得结果。

表10

年轻PCOS病例(15岁≤年龄<25岁，表型A-D)的METRNL的ROC曲线分析表明，每种表型的AUC分别为0.89(95％CI 0.83-0.95)、1.00(95％CI 1.00-1.00)、1.00(95％CI 1.00-1.00)、0.89(95％CI 0.81-0.97)，证实了METRNL在年龄15-25岁的女性亚组中对PCOS的高诊断准确性(图19)。相较于年轻健康对照(15岁≤年龄<25岁，图20)的METRNL浓度，所有不同PCOS表型(表型A-D，15岁≤年龄<25岁)的METRNL浓度均减少。

Claims (14)

1.一种评定受试者是否患有多囊卵巢综合征(PCOS)或处于发展PCOS的风险的方法，所述方法包括

a)确定所述受试者的样品中METRNL的量或浓度，以及

b)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

2.一种选择供进行PCOS的疗法的患者的方法，所述方法包括：

a)确定受试者的样品中METRNL的量或浓度，以及

b)将经确定的量或浓度与参考进行比较。

3.一种用于监测患有PCOS的受试者的PCOS进展或用于监测患有PCOS的受试者对治疗的应答的方法，所述方法包括

a)确定所述受试者的第一样品中METRNL的水平，

b)确定所述受试者的已经在所述第一样品之后获得的第二样品中METRNL的水平，以及

c)将所述第一样品中METRNL的所述水平与所述第二样品中METRNL的所述水平进行比较，以及

d)基于步骤c)的结果，监测罹患PCOS或正在针对PCOS进行治疗的所述受试者的进展。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述受试者的所述样品中METRNL的减少的量或浓度指示所述受试者中存在PCOS。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中PCOS选自由根据鹿特丹量表的表型A的PCOS、表型B的PCOS、表型C的PCOS和表型D的PCOS组成的组。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中检测到表型A的PCOS。

8.根据权利要求1至6所述的方法，其中检测到表型B的PCOS。

9.根据权利要求1至6所述的方法，其中检测到表型C的PCOS。

10.根据权利要求1至6所述的方法，其中检测到表型D的PCOS。

11.根据权利要求1至10所述的方法，其中PCOS是在青少年或年轻女性中检测到的。

12.根据权利要求1至11所述的方法，其中患者罹患以下症状中的一种或多种：稀发-无排卵和/或不规律周期、高雄激素血症以及多囊卵巢形态。

13.一种用于评定患有疑似PCOS的受试者的计算机实现方法，所述计算机实现方法包括以下步骤：

a)接收针对所述受试者的样品中第一生物标志物的量或浓度的值，所述第一生物标志物为METRNL，

b)任选地，接收针对所述受试者的样品中第二生物标志物的量或浓度的值，

c)任选地，接收针对至少一个附加诊断准则的存在或不存在的值，所述至少一个附加诊断准则选自由稀发-无排卵和/或不规律周期、高雄激素血症以及多囊卵巢形态组成的组；

d)将步骤(a)至(b)的针对所述量或浓度的所述值与针对所述生物标志物的参考以及针对所述至少一个附加诊断准则的存在或不存在的所述值进行比较并且/或者基于所述生物标志物的所述量或浓度以及所述值来计算用于评定患有疑似PCOS的所述受试者的评分；以及

e)基于在步骤(d)中进行的所述比较和/或所述计算来评定所述受试者。

14.根据权利要求13所述的计算机实现方法，其中相较于标准参考，METRNL的所述量或浓度减少。