CN119585432A

CN119585432A - 一种靶向AGT基因表达的siRNA及其缀合物和用途

Info

Publication number: CN119585432A
Application number: CN202480003456.5A
Authority: CN
Inventors: 刘兆贵; 万金桥; 王钊; 周洁华
Original assignee: Chengdu Xianderivative Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Xianderivative Technology Co ltd
Priority date: 2023-08-22
Filing date: 2024-08-19
Publication date: 2025-03-07
Also published as: WO2024227458A2; WO2024227458A3

Abstract

提供了一种抑制AGT基因表达的siRNA及其缀合物，其包含正义链和反义链。提供的siRNA、siRNA缀合物和药物组合物具有良好的稳定性、出色的AGT基因抑制活性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性。

Description

一种靶向AGT基因表达的siRNA及其缀合物和用途

技术领域

本发明涉及一种抑制血管紧张素原(AGT)基因表达的siRNA及其缀合物、药物组合物，以及其在预防和/或治疗血压异常相关疾病中的用途。

背景技术

血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)是人体内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的重要组成部分，整个RAS则在动物血压的调控中起到关键作用。AGT在肝脏中合成并且分泌，再由酶肾素(Renin，REN)作用下产生血管紧张素I,再由血管紧张素转移酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)的作用下转化为血管紧张素II，大部分血管紧张素II能够与I型血管紧张素II受体结合，导致血管收缩，引发血压升高，这种分子还刺激激素阿尔多酮的产生，这触发了Na⁺离子和水的肾脏吸收，从而导致血量增加，进一步引发血压升高。

高血压是一种严重的疾病，会显著加剧罹患心脏、大脑、肾脏疾病以及其他疾病的风险，据世界卫生组织发布的数据，全世界估计有12.8亿30-79岁成年人患有高血压，只有42％的高血压患者得到诊断和治疗，21％的高血压患者的血压得到了有效的控制，高血压是世界各地过早死亡的一个主要原因。同时据柳叶刀杂志报告(Lancet 2019；394:1145–58)，2017年我国高血压死亡人数达254万人，居所有危害因素致死人数的第一位。

目前临床用于高血压治疗的一线药物分为五大类：血管紧张素酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、二氢吡啶类钙通道阻滞剂以及利尿剂。这五类降压药物的降压机制完全不同，根据患者的年龄、高血压程度、相关临床并发症的风险程度，普通患者会采用其中一种进行治疗，如果一种方式疗效欠佳，会采用两种甚至三种方式联合治疗。对于高危患者，会直接采用两种甚至三种方式联合治疗。如果三种方式联合治疗都无法有效控制血压，则被称为难治性高血压，难治性高血压是高血压治疗中的一个常见的问题，也是一个棘手的问题。开发有效，安全、稳定和长效降压药具有较大临床价值。

本申请提供了一种靶向AGT的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)制剂，能够通过特异的与AGT的mRNA结合,破坏AGT mRNA的正常翻译模板功能，从而阻止其翻译AGT蛋白质，从源头上抑制RAS途径，用于治疗/预防由于RAS途径导致的相关疾病，如高血压，也包括顽固性高血压和不可控高血压。

相比传统药物，siRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点；此外，还需要尝试在进一步提高活性的同时，避免引发脱靶效应、免疫刺激、细胞毒性等副作用。因此，开发出更多在血液中稳定、具有良好体内生物活性、细胞毒性较低且能够长效抑制AGT基因表达的候选siRNA成为迫切需要解决的问题；同时，利用上述抑制AGT基因表达的候选siRNA开发出能够有效预防和/或治疗高血压相关疾病的药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。

发明内容

本发明提供了一种用于抑制AGT基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。

所述至少部分互补是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列差异不多于4个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列差异不多于3个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列差异不多于2个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列差异不多于1个核苷酸；在本发明的一些实施方案中，所述反义链为SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过2个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过1个核苷酸的错配；在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链完全互补。

优选地，所述正义链与所述反义链具有至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸互补。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为19～25个核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19～23个核苷酸；所述正义链长度为19～21个核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为23个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为22个核苷酸，所述正义链长度为20个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为19个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19个核苷酸，所述正义链长度为19个核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA包含一个或多个单链核苷酸突出端。例如1、2、3或4个核苷酸的突出端。在本发明的一些实施方案中，突出端可以在正义链、反义链或者其任何组合上。在本发明的一些实施方案中，突出端存在于siRNA反义链或正义链的5’末端、3’末端或者两个末端上。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链3’末端具有2个核苷酸的突出端。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA具有平末端。在本发明的一些实施方案中，所述siRNA具有至少一个平末端，位于反义链的5’末端(或正义链的3’末端)。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA具有两个平末端。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的核苷酸序列(5'→3')选自双链体1～双链体107：

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA至少含有一个修饰核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸或核苷酸类似物。

在本发明的一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、2’-烯丙基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、吗啉代核苷酸、锁定核苷酸(LNA)、解锁核苷酸(UNA)、苏糖核苷酸(TNA)或甘油核苷酸(GNA)，但本发明不限于此。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第3、7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、3、4、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、5、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、7、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第2位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、14、16、18、20、22位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16位为2’-氟核苷酸，第7位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第6位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第4位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第5位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第7位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11、15位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，第6位为甘油核苷酸(GNA)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、5、7、12位为2’-脱氧核苷酸，第14位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。在本发明的一些实施方式中，所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其它位点为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、5、7、12位为2’-脱氧核苷酸，第6、8、9、10、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。在本发明的一些实施方式中，所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其它位点为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第5、7、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第7、9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为19个核苷酸，其中反义链5’端的第2、4、6、8、10、12、14、16、18位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第14为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第22位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为23个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第23位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为21个核苷酸，其中正义链5’端的第9、10、11位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第21位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第22位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第6、8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、8、9、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第6、8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在3-10个位置(例如，5’端的第2，14，16位、第2，5，14，16位、第2，4，6，14，16位、第2，6，10，14，16位、第2，6，12，14，16位、第2，5，10，14，16位、第2，3，12，14，16位、第2，9，12，14，16位、第2，6，8，9，14，16位、第2，3，5，12，14，16位、第2，8，9，12，14，16位、第2，7，9，12，14，16位、第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)具有2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，任选地在1个位置(优选为5’端的第1位)具有苏糖核苷酸，任选地在1个位置(优选为5’端的第6位)为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸缀合物。

在本发明的一些实施方案中，述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2、6、14、16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5，12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，任选地在5’端的第1位具有苏糖核苷酸，或者任选地在5’端的第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2，4，6，14，16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5，12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第20位为苏糖核苷，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16为2’-氟核苷酸，第21位为苏糖核苷，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在3-10个位置(例如，5’端的第2，14，16位、第2，5，14，16位、第2、6、14、16位、第2，4，6，14，16位、第2，6，10，14，16位、第2，6，12，14，16位、第2，5，10，14，16位、第2，3，12，14，16位、第2，9，12，14，16位、第2，6，8，9，14，16位、第2，3，5，12，14，16位、第2，8，9，12，14，16位、第2，7，9，12，14，16位、第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)具有2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2、6、14、16位、或者第2，4，6，14，16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5， 12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，任选地在5’端的第1位具有苏糖核苷酸，或者任选地在5’端的第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；进一步优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2、6、14、16位、或者第2，4，6，14，16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5，12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；进一步优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)；

进一步优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:116所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；

进一步优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸分别为：胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)；

更优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

进一步优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸分别为：胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)；

更优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:104所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸为磷酸基团被硫代磷酸酯基团修饰的核苷酸。即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。

在本发明的一些实施方式中，所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含0、1个或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。

在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、正义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间，至少有一个为硫代磷酸酯基连接；优选为至少有四个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，至少有六个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，八个均为硫代磷酸酯基连接。

在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。

在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。

在本发明的一些实施方案中，反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。

在本发明的一些实施方式中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、正义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间均为硫代磷酸酯基连接。

在本发明一些实施方案中，正义链可包括一个或多个封端残基或部分，称为“封端残基”。“封端残基”是可以掺入siRNA的核苷酸序列的一个或多个末端的非核苷酸化合物或其他部分。在本发明一些实施方案中，封端残基存在于正义链的5'末端、3'末端或5'末端和3'末端两者处。

在本发明一些实施方案中，添加反向脱碱基残基(iab或者invAb)作为封端残基。可参见F.Czauderna,Nucleic Acids Res.,2003,31(11),2705-16。在本发明一些实施方案中，正义链的5'端和/或3'端可以包含多于一个反向脱碱基脱氧核糖部分作为封端残基。

在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab或者invAb)添加到正义链的3'端。在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab或者invAb)添加到正义链的5'端。在本发明一些实施方案中，可在递送载体部分与siRNA正义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基。在本发明一些实施方案中，在siRNA正义链的一个或多个末端处或附近包含一个或多个反向脱碱基残基。所述反向脱碱基残基(iab或者invAb)选自以下结构：

其中，X＝O或者S。

在本发明一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(iab或者invAb)添加到正义链的5'端。在本发明一些实施方案中，可在递送载体部分与siRNA正义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基。

反向脱碱基残基可以经由磷酸酯、硫代磷酸酯或其他核苷间键联连接。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链5’端第一个核苷酸选自如下结构：

其中，Basse为碱基A、U、G、C、T或其它核苷酸碱基。

在本发明的一些实施方案中，所述反义链5’端第一个核苷酸为(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述siRNA至少含有一个碱基修饰的核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸的碱基选自如下结构：

在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸位于siRNA反义链的第5、6、7、8位。

在本发明的一些实施方案中，所述碱基修饰的核苷酸位于siRNA中的单链核苷酸突出端。

优选地，所述siRNA反义链含有2个核苷酸的突出端，所述碱基修饰的核苷酸为siRNA反义链突出端的第1个核苷酸。

优选地，所述siRNA反义链含有2个核苷酸的突出端，所述碱基修饰的核苷酸为siRNA反义链突出端的第2个核苷酸。

本发明还提供了上述siRNA与缀合分子缀合而得的siRNA缀合物。

在本发明中，如无特别说明，“缀合”是指两个或多个化学部分之间通过共价连接的方式彼此连接；“缀合物”是指各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物；“siRNA缀合物”是指一个或多个化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。此处需要说明的是，各个化学部分可以直接连接至siRNA上，也可以通过接头连接至siRNA上。

在本发明的一些实施方式中，递送载体通过共价键形成缀合分子连接至siRNA。

在本发明的一些实施方式中，递送载体通过共价键形成缀合分子，独立或者同时连接至siRNA正义链的3’端或者5’端。

在本发明的一些实施方式中，本发明的siRNA与药学上可接受的缀合分子可以缀合得到siRNA缀合物。在本发明的一些实施方式中，所述siRNA共价缀合至所述缀合分子。为降低缀合对siRNA活性可能带来的影响，siRNA与缀合分子的缀合位点可以在siRNA正义链的3’端或5’端，也可在反义链的5’端。在一些实施方式中，siRNA与缀合分子的缀合位点还可以在siRNA的内部序列中。

在本发明中,“递送载体”是指通过与siRNA共价连接并通过影响寡核苷酸的靶向性、活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性的化学部分，siRNA与一个或者多个递送载体的缀合可以改善siRNA的药理学性质。在一些实施例中，递送载体部分是通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、新陈代谢、排泄、渗透性或细胞摄入来修饰或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，递送载体可将寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，递送载体部分可以用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如，脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。

所述药学上可接受的递送载体可以是siRNA给药领域常规使用的递送载体，例如但不限于以下递送载体或其衍生物中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；或肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体含有N-乙酰半乳糖胺基团。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体直接连接至siRNA正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，所述递送载体直接连接至siRNA正义链的5’末端。本发明的一些实施方式中，所述递送载体通过接头连接至siRNA正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，所述递送载体通过接头连接至siRNA正义链的5’末端。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体含有N-乙酰半乳糖胺，通过共价键连接至siRNA正义链的3’端。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体部分为GalNAc(L96)，具有如下结构：

在本发明的一些实施方式中，GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的3’末端。

在本发明的一些实施方式中，GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的5’末端。

在本发明的一些实施方式中，GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab或者invAb)。

在本发明的一些实施方式中，GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的5’末端的反向脱碱基残基(iab或者invAb)。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体部分为Ser(GN)，具有如下结构：

在本发明的一些实施方式中，Ser(GN)连接至siRNA正义链的3’末端。在本发明的一些实施方式中，Ser(GN)连接至siRNA正义链的5’末端。

在本发明的一些实施方式中，Ser(GN)同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端。

在本发明的一些实施方式中，所述递送载体部分为LP-GalNAc(连接在正义链5’-末端)，具有如下结构：

在本发明的一些实施方式中,所述递送载体部分为XY-GalNAc(连接在正义链3-’末端)，具有如下结构：

或者

在本发明的一些实施方式中，其他使用的递送载体部分的结构(连接在正义链5’-末端)如下所示：

在本发明的一些实施方式中，其他使用的递送载体部分的结构(连接在正义链3’-末端)如下所示：

任选地，上述递送载体部分连接至siRNA正义链的3’末端，或者连接至siRNA正义链的5’末端，或者连接至siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)，或者连接至siRNA正义链的5’末端的反向脱碱基残基(iab)，或者上述递送载体部分中的一个或多个同时连接至siRNA正义链的3’末端、siRNA正义链的5’末端、siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)、siRNA正义链的5’末端的反向脱碱基残基(iab)；优选地，递送载体部分GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)，递送载体部分Ser(GN)同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端，递送载体部分LP-GalNAc连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分XY-GalNAc连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(Ser2)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的5’末端或者同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser3)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser4)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A1GN)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A2GN)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A3GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(A4GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(A5GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(NAG25)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(NAG37)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser1)和GalNAc(Ser2)同时分别连接至siRNA正义链的3’末端和siRNA正义链的5’末端或者同时分别连接至siRNA正义链的5’末端和siRNA正义链的3’末端；

优选地，递送载体部分选自以下：连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(L96)，连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(A1GN)，连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(A2GN)，连接至siRNA正义链的5’末端的GalNAc(A3GN)，连接至siRNA正义链的5’末端的GalNAc(A4GN)，同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端的GalNAc(Ser2)。

对于下文所列出的siRNA缀合物选自缀合物1～缀合物1668以及阳性对照PC c，其中各个缀合物的正义链以及反义链在修饰之前所对应的基础序列分别对应于上文列出的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200以及这里列出的SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:351中之一。

其中，C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；I表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为m6A表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为X表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为B表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为

在本发明的一些实施方式中，所述siRNA缀合物选自缀合物1～缀合物1668

本发明还提供了一种药物组合物，包含任一上述的siRNA和/或任一上述的siRNA缀合物和药学上可接受的载体。

在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物含有1种如第一方面所述的siRNA。在本公开的另一些实施方式中，所述药物组合物含有至少2种如第一方面所述的siRNA(例如但不限于2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)作为活性成分。优选地，所述至少2种如第一方面所述的siRNA各自靶向AGT基因中的不同靶序列，由此可期望针对不同靶序列同时发挥作用而带来协同效果。此处，所谓的“不同靶序列”是指靶序列之间不存在重叠、或靶序列之间重叠的连续核苷酸个数少于5个(例如重叠的连续核苷酸个数为4个、3个、2个、1个、0个)。在此情况下，所述至少2种如第一方面所述的siRNA可以以任意不同比例存在。优选地，所述至少2种如第一方面所述的siRNA彼此之间可以以1:100～100:1的摩尔比存在；更优选地，所述至少2种如第一方面所述的siRNA彼此之间可以以1:10～10:1、1:5～5:1或1:2～2:1的摩尔比存在。在本发明的一些实施方式中，所述至少2种如第一方面所述的siRNA以相同的摩尔比存在。

本发明还提供了任一上述的siRNA和/或任一上述的siRNA缀合物和/或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与AGT基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。

进一步地，所述病理状况或疾病为与血压异常相关的疾病。

本发明提供的siRNA、siRNA缀合物和药物组合物具有良好的稳定性、出色的AGT基因抑制活性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性，并且能够显著降低血压水平。

在本发明中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；小写字母m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；小写字母f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟核苷酸；小写字母d表示与该标识d右侧相邻的一个核苷酸为2’-脱氧核苷酸；gn表示表示与该标识gn右侧相邻的一个核苷酸为甘油核苷酸(GNA)；tn表示表示与该标识tn右侧相邻的一个核苷酸为苏糖核苷酸(TNA)；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间(或核苷酸与递送载体部分之间)为硫代磷酸酯基连接；eVP表示与其右侧相邻的一个核苷酸是(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸,例如，当碱基为U时，eVPmU结构为iab表示反向脱碱基残基；GalNAc(L96)是指该处缀合有递送载体部分GalNAc(L96)。Ser(GN)是指该处缀合有递送载体部分Ser(GN)。

在本发明中，如无特别说明，大写字母I表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为m6A表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为大写字母X表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为大写字母B表示碱基修饰核苷酸的碱基组成，碱基为

在本发明中，如无特别说明，术语“互补”是指第一序列的寡核苷酸在一定条件下和第二序列的寡核苷酸杂交并形成双链结构的能力。“至少部分互补”是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。另外在两个寡核苷酸设计成杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，这类突出端不应当视作错配。在本发明中，就满足以上杂交能力的要求时，“互补”序列还可以包括或完全形成自非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对包括但不局限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein(胡格斯腾)碱基配对。对应地，在本发明中，如无特别说明，“错配”是指在siRNA双链体分子中，对应位置的碱基并未以互补的形式配对存在。

在本发明中，如无特别说明，“核苷酸序列的差异”是指相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸的碱基种类发生了改变。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为A时，在相同或相对应位置处的核苷酸碱基改变为U、C、G或dT、dC、dG等的情况下，认为该位置处存在核苷酸序列的差异。此处需要说明的是，在相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸仅在是否存在修饰或修饰类型方面存在区别的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。

在本发明中，如无特别说明，术语“药学上可接受的”是指载体、运载体、稀释剂、辅料和/或其所形成的盐/酯/水合物等通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

在本发明中，如无特别说明，术语“抑制”是指由于siRNA介导的靶基因的mRNA降解而使靶基因表达得以下调(down-regulation)的情况。所述“下调”是指相对于无siRNA处理时，靶基因表达水平下降5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上或甚至100％的情况。其中，靶基因表达水平下降100％是指无可检测水平的靶基因表达。

在本发明中，所述siRNA还可根据需要含有修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸不会导致所述siRNA抑制AGT基因表达的功能明显削弱或丧失。目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括例如骨架修饰(如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(Watts,J.K.,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008.13(19-20):p.842-55)。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1显示本发明的缀合物的合成路线的示意图。

图2显示本发明的缀合物合成的工艺流程

图3、图4显示供试品缀合物100的MS。

图5显示供试品缀合物100的1H-NMR。

图6显示供试品缀合物100的13C-NMR。

图7显示供试品缀合物100的31P-NMR。

图8显示供试品缀合物100的19F-NMR。

图9显示供试品缀合物100的解链温度(Tm)测试。

具体实施方式

本领域技术人员知晓的是，通过本领域的常规siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成)可以得到本发明所述的siRNA，其中，固相合成和液相合成均已有商业化订制服务。本领域技术人员也清楚知晓，通过使用具有相应修饰的核苷酸单体可以将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法是本领域技术人员所熟知的，市场上也有商业化的单体供应。

实施例1：siRNA合成

对于本发明的siRNA序列的正义链和反义链以及修饰双链体的正义链和反义链，使用固相载体开始链合成。

以缀合物100作为示例，说明本申请的缀合物的制备过程。

使用GalNAc(L96)修饰的固相载体作为正义链合成的起始循环，使用通用固相载体(Primer support 5G unylinker 350)作为反义链的起始循环(图1)。

GalNAc(L96)修饰的固相载体(L96-PS)结构如下：

Primer support 5G unylinker 350载体结构如下：

●代表PS聚苯乙烯(polystyrene)固相载体

使用YB-192S合成仪，采用亚磷酰胺三酯固相合成法，以固相载体为起始，按照3’-5’方向依次连接核苷单体，进行合成规模为0.2umol的序列合成。

工艺流程见图2。

工艺描述：Oligo合成是以PS固相载体为起始，使用3'-0-(2-氰乙基)亚磷酰胺/4,4'二甲氧基三苯甲基(二甲氧基三苯甲基，DMT)基团保护的方法，在以PS固相载体上组装寡核苷酸链。每个合成循环都包括5'-羟基脱保护、偶联、盖帽封端和氧化(硫代)。每个偶联反应都是通过活化适当的亚磷酰胺单体并与载体固定的受保护的核苷酸或寡核苷酸的游离5'-羟基反应来进行的。按照序列信息循环合成得到相应的粗寡核苷酸单链PS-Oligo，粗寡核苷酸单链从固相载体上裂解下来，并脱除相关保护基团。然后经过制备色谱纯化，超滤脱盐，退火，冷冻干燥步骤得到终产物。

(1)合成程序

包括如下单元：

1)脱保护(De-blocking)：5’-OH端带有DMT基团(二对甲氧三苯甲基)保护的核糖核苷酸，在合成的第一步使用三氯乙酸(TCA)将DMT保护基团从固相载体和核糖核苷酸上脱除，以便裸露核糖核苷酸的5’-OH偶联新的碱基。

2)偶联(Coupling)：核苷酸单体与活化试剂混合，与合成柱中PS-Oligo进行反应，活化试剂提供一个质子给3’-磷酸上二异丙酰胺的N原子，形成亚磷酰胺四唑活性中间体。亚磷酰胺四唑与PS-Oligo接触时，与其5’-羟基发生亲核反应，发生偶联并脱掉四唑，延伸一个核苷酸。

3)盖帽封端(Capping)：由于偶联效率无法达到100％，为了防止未偶联成功的PS-Oligo继续进入下一步的偶联，使用Cap试剂将PS-Oligo的5’-羟基盖帽封端。

4)氧化(Oxidation)或者硫代：偶联反应后核苷酸通过亚磷酯键(三价磷)与PS载体上的寡核苷酸相连，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，通过氧化试剂将此处三价磷氧化为五价磷。硫代是指通过硫代试剂在弱碱性条件下，将亚磷酯键的三价磷反应形成磷硫键。

5)VP保护基脱除以及氨解

将合成结束的PS-oligo从合成柱中转移至离心管中，按照体积比3:2:100＝TMS-I:吡啶:DCM比例配制脱除试剂，将脱除试剂加入至离心管中反应30min。配制TEA/乙腈＝1:1溶液，加入2-巯基乙醇(终浓度2M)，混合均匀后，加入至反应中终止反应。除去上清，5min ×2次进行洗涤PS-oligo。洗涤结束后加入氨解液(2-巯基乙醇(2M)/28％氨水)进行氨解10h。氨解结束后真空离心除去氨水并进行纯化。

对于本发明的其他的siRNA序列的正义链和反义链以及修饰双链体的正义链和反义链，采用类似的方法制备。

(2)纯化

氨解稀释后的样品采用阴离子柱交换色谱进行纯化，液相系统采用高效液相色谱，色谱条件如下。

色谱柱：PS-15Q10*250mm

流速：4ml/min

检测波长：260nm

离子柱制备纯化梯度程序：

流动相：A相：10mM NaOH溶液(PH＝10)B相：10mM NaOH溶液(PH＝10)+2MNaCl

制备后样品进行质谱确认以及纯度确认。

(3)超滤

纯化后得到的样品，加入4ml PBS溶解，转移至1K超滤管中，以5000r/min转速离心45min，然后使用Nanodrop检测离心管内液体是否存在样品，若于260nm波长条件下检测含有样品则说明超滤膜破损，需更换超滤管，重新超滤；若260nm波长条件下检测不含有样品，补加4ml RNase水再次超滤。超滤3次，每次45min。

(4)退火

正义链和反义链超滤结束后，分别以3mg/ml的浓度稀释样品，按照1：1的摩尔比混合正义链和反义链。水浴锅加热至90℃，将按比例混合后的正义链和反义链放置水浴锅内，退火30min。关闭水浴锅，自然降至室温16h。取样10μL进行HPLC检测。

代表性测试方法-LC-MS(缀合物100为例)

1)仪器型号：Waters Xevo G2-XS Qtof

2)测试条件

离子源：ESI负离子源

扫描范围：100～2000Da

碰撞能：15-25EV、25-50EV

3)供试品缀合物100的谱图如附图3和图4所示

4)谱图解析

供试品缀合物100经过变性IP·RP-LC检测时，将互补配对的双链解开成单链(正义链和反义链)，再通过串联质谱法对正/反义链母离子进行气相碎裂后，使用软件CONFIRM Sequence分析所有检测到的碎片离子并进行解析。本实验分别采用15-25eV和25-50eV两个能量对母离子进行碎裂，得到覆盖率为100％的结果，即供试品的序列与理论序列一致，确认结果如下表所示。

缀合物100正义链的序列确认

缀合物100反义链的序列确认

缀合物100的核磁共振(NMR)测试

1)仪器型号：Bruker AVANCE III 600M NMR

2)检测方法：称取95.0mg样品溶于重水(D2O)中，转移至核磁管中进行测试

3)谱图解析

从1H-NMR(图5)中可以得出芳杂环、核糖、甲基、胺基、亚甲基、糖环以及醇羟基氢的出峰位置。0.95ppm～2.5ppm这一系列峰是未与酰胺直接相连的亚甲基氢，3.17ppm～3.20ppm是与酰胺相邻的亚甲基氢，3.4ppm～4.6ppm是糖环上的次甲基氢、2'-位甲基和醚键亚甲基氢，5.1ppm～6.5ppm是糖环1'-位次甲基、嘧啶碱基芳环和5'-乙烯基氢，7.1ppm～8.2ppm是嘌呤碱基芳环的氢。

13C-NMR(图6)谱图显示了分子中羰基、芳杂环、糖环、醚键亚甲基、亚甲基、甲基对应碳的出峰位置。170ppm～180ppm是羰基碳、150ppm～165ppm为芳杂环(碱基)和乙烯基相应的碳、95ppm～100ppm是核糖1'-位次甲基、70ppm～95ppm是核糖亚甲基和次甲基碳、55ppm～70ppm是甲氧基和醚键亚甲基碳以及20ppm～40ppm是乙酰基α-位甲基碳。

以上结果表明，在1H-NMR和13C-NMR中显示了芳杂环(碱基)、乙烯基、糖环、环外甲氧基，亚甲基、醚键亚甲基、乙酰基，与目标分子结构一致。

31P-NMR(图7)谱图中显示了三种磷酸官能团的信号：硫代磷酸二酯(P＝S)化学位移为54.5ppm～57.5ppm、磷酸二酯(P＝O)化学位移在-0.97ppm～-1.5ppm和5'-乙烯基磷酸化学位移9.16ppm，P＝O键和P＝S键比例约为5：1，信息与目标分子一致。

从19F-NMR(图8)谱图中出峰位置在-199ppm～-201ppm，与糖环2'-位F位置相符。

由上述分析可知，NMR信号与目标分子一致。

缀合物100的解链温度(Tm)测试：

1)仪器型号：Cary 3500

52)测试条件

扫描波长：260nm

温度扫描范围：25℃～90℃

升温速率：3℃/min

3)供试品缀合物100谱图如附图9所示

104)谱图解析

软件系统根据供试品缀合物100升温曲线，由Savitzky-Golay算法计算出Tm为66.0℃。

缀合物合成后LC-MS检测

其中，PC c为阳性对照，已知具有AGT基因抑制效果，其结构如下：

正义链：mG*mU*mCmAmUmCfCmAfCfAfAmUmGmAmGmAmGmUmAmCmAGalNAc(L96)(修饰前的基础序列对应于SEQ ID NO:251)

反义链：mU*fG*mUmAmCgnTmCmUmCmAmUmUmGfUmGfGmAmUmGmAmC*mG*mA(修饰前的基础序列对应于SEQ ID NO:348)

实施例2：体外活性检测

细胞培养和转染

细胞培养：将Hep3B细胞(ATCC)在37℃，5％ CO₂的环境中使用MEM完全培养基(Gibco，添加10％ FBS)培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用12孔板，每孔加入2.0×10⁵个Hep3B细胞及1.0mL MEM完全培养基(Gibco，添加10％ FBS)，在37℃，5％ CO₂的环境中培养16-24h后进行转染。

细胞转染：按每孔48.5μL opti-MEM加入1.5μL lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)，再加入50μL siRNA进行混合，添加至PCR管中且室温孵育5分钟，最后将该siRNA混合物添加至上述细胞中，继续培养24h后进行RNA提取。单剂量实验以10nM和0.1nM或者0.1nM和0.01nM siRNA双链体浓度进行。IC₅₀测试实验以10nM、1.0nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM、0.0001nM和0.00001nM siRNA双链体浓度进行，应用GraphPad Prism软件的log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters)拟合方式计算化合物的IC50。

RNA提取

使用total RNA分离试剂盒(omega公司，cat:R6834-02)：收集细胞，1％ PBS清洗，然后加入400μL裂解液(含2％β-巯基乙醇)裂解细胞，后续步骤按照该RNA分离试剂盒说明书进行，最后加入30μL无RNA酶水，静置2分钟后14000g离心2分钟收集RNA即可。

cDNA合成

使用全式金的gDNA去除cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国Cat#AE311-03)进行cDNA合成。每个样品添加1μg总RNA，使用梯度热循环仪(LongGene，A600)按照说明书的步骤进行cDNA合成。

实时荧光定量PCR

将合成好的cDNA和混合母液(包含引物、qPCR预混液和超纯水)添加到384孔板(博康美华Cat#PC-0040-9U)中，使最终实时荧光定量PCR体系中含靶基因(AGT)或内参基因(GADPH)上下游引物各0.25μM、1×SYBR Green预混液(Applied Biosystem Cat#A25742)。

使用ΔΔCt测定法在ABIQuantStudio^TM6实时荧光PCR系统中进行实时荧光PCR。每种双链体进行3-4次独立的转染测试，每次转染进行一式3-4份测定。

人/食蟹猴猴肝原代细胞

自由摄取：复苏冻存的人或者食蟹猴肝原代细胞，进行活细胞计数，调整合适的密度(6×10⁵个/mL)。将10μL的10×的化合物加入到胶原包被的细胞培养板中，每孔分90μL(5.4×10⁴/well)的细胞悬液到96孔胶原包被的板子中。细胞板放在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养48小时。单剂量实验以10nM和0.1nM siRNA双链体浓度进行，IC₅₀测试实验以10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.041nM、0.014nM和0.0046nM siRNA双链体浓度进行，应用GraphPad Prism软件的log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters)拟合方式计算化合物的IC50。

cDNA合成：自由摄取48小时后，去除培养基并裂解细胞用于RNA提取。根据试剂盒说明书使用96Kit(QIAGEN-74182)提取总RNA。随后根据说明书使用FastKing RT Kit(With gDNase)(Tiangen-KR116-02)合成cDNA。

实时荧光定量PCR：将合成好的cDNA和混合母液(包含引物、qPCR预混液和超纯水)添加到384孔板中，使最终实时荧光定量PCR体系中含靶基因(AGT)或内参基因(GADPH)上下游引物各0.25μM、探针0.125μM、1×Universal Probe Master预混液(Roche，货号04914058001)。

部分siRNA缀合物的体外活性测试结果如表1至表5所示。其中，使用已知具有AGT基因抑制效果的PC c作为阳性对照。

表1.单剂量Hep3B细胞活性

表2.单剂量人肝原代细胞活性

表3.Hep3B细胞转染IC₅₀测试结果

表4.PCH细胞自由摄取IC₅₀测试结果

表5.PHH细胞自由摄取IC₅₀测试结果

实施例3：Tritosome稳定性

待测siRNA置于大鼠tritosome中混匀(5μM)，37℃分别孵育为24h，48h。孵育完成后,加入1/3样品体积的酚氯仿(碧云天,Cat:#p1011),涡旋混匀后,静止5min再12000rpm离心30min,取最上层水相于新的离心管中,加入1/10体积的3MNaAC(solarbio,Cat:#A1070),混匀,再加入2.5倍体积的预冷无水乙醇和1μL糖原(碧云天,CAT:#0812)混匀,-20℃放置2min.12000rpm离心30min,弃上清,晾干后,加入RNAse-free水溶解,取溶解后样品与甲酰胺上样缓冲液混合,使用10％的PAGE胶进行核酸电泳检测。电泳完成后使用GelRed(碧云天，Cat：#D0140)对PAGE胶染色30min，最后使用凝胶成像仪(Bio-Rad)对PAGE胶进行成像，并使用Image Lab软件进行灰度定量分析。通过灰度定量的结果显示缀合物100的大鼠Tritosome稳定性相比于临床分子PC c具有一定优势。

实施例4：细胞毒性测试

细胞培养：将Hep3B细胞(ATCC)在37℃，5％ CO₂的环境中使用MEM完全培养基(Gibco，添加10％ FBS)培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用24孔板，每孔加入0.5×10⁵个Hep3B细胞及0.5mL MEM完全培养基(Gibco，添加10％ FBS)，在37℃，5％ CO₂的环境中培养16-24h后进行转染。

细胞转染：按每孔24.25μL opt-MEM加入0.75μL lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)，再加入25μL siRNA进行混合，添加至PCR管中且室温孵育5分钟，最后将该siRNA混合物添加至上述细胞中，继续培养48或者96h后进行细胞毒性检测。该实验以10nM和1nM siRNA双链体浓度进行。

细胞毒性测试:

使用CCK-8试剂盒(碧云天,CAT:#C0040)进行细胞毒性测试,细胞转染48/96h后,去除培养基,每孔加入500ul对应完全培养基(含10％CCK-8),避光37℃孵育30min-60min,使用酶标仪(Tecan cat:#spark 20M)检测样本OD值,使用波长450nm参比波长620nm。检测结果显示缀合物100、缀合物102、缀合物106的细胞毒性与临床PC c分子类似，均无明显的毒性。

实施例5：siRNA免疫原性测试

将购买的3个不同捐献者的hPBMC细胞(上海赛笠生物科技有限公司，XFB-HP050A)离心后使用RPMI-1640细胞培养基(含10％FBS和1％ Penicillin-streptomycin solution)重悬，混合后于5％ CO2，37℃培养箱过夜培养。将待测化合物稀释至20× 工作液，3000和Opti-Mem以1.5:23.5的比例配制成混合液，涡旋后使用。将配制的20×工作液和3000混合液以1:1的比例混合于96孔V底板中。弃掉过夜培养的培养基并使用RPMI-1640细胞培养基(含10％FBS和1％Penicillin-streptomycin solution)重悬hPBMC细胞，细胞计数后将细胞稀释至转染所需密度，并加入96孔板。最终细胞板中细胞数为2.0×105个/孔，总体积为200μL。将细胞板继续放到5％ CO2，37℃恒温培养箱中培养24h。

hPBMC细胞转染24h后取细胞上清，使用ProcartaPlex Mix&Match 3-plex Kit检测hPBMC上清中IFN alpha、IL-6和TNF alpha的含量。并计算测试化合物各个因子变化的fold change，其中待测siRNA、nake siRNA和ployIC的fold change＝检测到的因子浓度/转染试剂孔因子浓度；GS9688的fold change＝检测到的因子浓度/DMSO孔因子浓度。检测结果显示缀合物100、缀合物102、缀合物161、缀合物162和缀合物163在hPBMC中无明显的免疫激活。

实施例6：siRNA种子区脱靶能力评估

针对siRNA序列分别构建用于检测在靶活性和种子区脱靶活性序列。在靶检测序列为与待检siRNA完全匹配的序列，种子区脱靶检测为与待检siRNA反义链种子区(5’末端2-8)完全匹配，其他位置序列完全不匹配。每个psiCHECK质粒中分别插入5个在靶或者种子区脱靶检测序列。

293T细胞以20000细胞/孔接种到96孔板中；利用lipofectamine 2000，待测siRNA分别和25ng构建的在靶或者种子区脱靶psiCHECK质粒进行共转染。37℃，5％ CO2的环境中培养24h后，使用Dual-Glo luciferase assay system(Promega，E2920)进行双荧光素酶报告测定荧光值。以单独转染psiCHECK质粒无siRNA分子做为对照组，每种双链体进行3-4次独立的转染测试，每条siRNA转染浓度为50nM，10nM，2.0nM，0.4nM，0.08nM，0.016nM，0.0032nM。通过测量Renilla荧光素酶归一化到组成型表达的萤火虫荧光素酶水平来确定靶标抑制效果，并计算siRNA的在靶或者种子区脱靶活性IC50。通过种子区脱靶活性IC50/在靶活性IC50之间的比值评估该siRNA种子区脱靶风险。测试结果显示缀合物100、缀合物102和缀合物161由于种子区导致的脱靶风险低于临床分子PC c。

实施例7：hAGT小鼠体内活性检测

6-8周龄雄性hAGT人源化小鼠(江苏集萃提供，T054372)。分组给药前小鼠不禁食，采血分离血清，用于ELISA(abcam#)检测hAGT。根据hAGT水平将小鼠随机分为4组，每组6只，定义为day0。Day1分别皮下注射PBS、PC c、缀合物100、缀合物102、缀合物106，药物剂量为1.0mpk。给药后day8，day15，day22，day29，day36，day43，day50采血分离血清，用于ELISA检测hAGT。每个时间点各组血清蛋白浓度与该时间点的PBS组血清蛋白浓度进行对比。不同缀合物的检测结果如表6所示，候选化合物在hAGT小鼠体内对血清hAGT蛋白的抑制优于临床分子PC c。

表6.不同siRNA修饰双链体给药前后hAGT蛋白表达变化

*该数值为hAGT蛋白含量与PBS对照组相比的相对表达量

表7.不同递送载体缀合修饰siRNA双链体给药前后hAGT蛋白表达变化

*该数值为hAGT蛋白含量与PBS对照组相比的相对表达量

实施例8：普通食蟹猴体内活性检测

本次实验根据体重、体温、血压、心电图、血清AGT水平、血液学、血生化筛选12只3-6岁雄性食蟹猴(体重2.5-6.0kg)，分成4组，每组3只食蟹猴。每只动物皮下注射3.0mpk供试缀合物分子。

食蟹猴禁食12h后于给药前(day 0)和给药后每周固定时间进行采血，全血样品置于离心管不加抗凝剂冰盒中凝血30分钟，2～8℃离心力约1800×g离心10分钟，分离血清，-80℃以下保存。

血清中的AGT蛋白水平通过AGT ELISA检测试剂盒(IBL，27412)进行测定。各个检测点的AGT蛋白含量与该只食蟹猴给药前(day 0)血清的AGT蛋白含量进行比较，计算供试缀合物在不同时间点对食蟹猴血清AGT含量的抑制，如表8所示，候选化合物在3.0mpk剂量下候选化合物对食蟹猴血清AGT的蛋白抑制超过90％，与临床分子PC c专利(WO_2019222166_A1)报告的结果无明显区别。

表8.不同缀合物给药后食蟹猴血清AGT蛋白抑制效果

Claims

一种用于抑制AGT基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中任一所示的核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17～30个核苷酸；所述正义链长度为17～30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述反义链长度为19～27个核苷酸；所述正义链长度为19～25个核苷酸。
根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述反义链与SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222至SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235至SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252至SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:293至SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:343至SEQ ID NO:346中所示的任一核苷酸序列差异不多于4个核苷酸。
根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配。
根据权利要求1-4所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列选自双链体1～双链体107。
根据权利要求1-5任一项所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA至少含有一个修饰核苷酸。
根据权利要求6所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
根据权利要求7所述的siRNA，其特征在于：所述修饰的核苷酸选自2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、2’-烯丙基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、吗啉代核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、苏糖核苷酸或甘油核苷酸。
根据权利要求1-8任一项所述的siRNA，其特征在于：所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含0、1个或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。
根据权利要求1-9任一项所述的siRNA，其特征在于：所述反义链5’端第一个核苷酸是(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
根据权利要求1-10任一项所述的siRNA，其特征在于：所述siRNA至少含有一个碱基修饰的核苷酸。
根据权利要求1-11任一项所述的siRNA，其特征在于：

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在3-10个位置(例如，5’端的第2，14，16位、第2，5，14，16位、第2、6、14、16位、第2，4，6，14，16位、第2，6，10，14，16位、第2，6，12，14，16位、第2，5，10，14，16位、第2，3，12，14，16位、第2，9，12，14，16位、第2，6，8，9，14，16位、第2，3， 5，12，14，16位、第2，8，9，12，14，16位、第2，7，9，12，14，16位、第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)具有2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，任选地在1个位置(优选为5’端的第1位)具有苏糖核苷酸，任选地在1个位置(优选为5’端的第6位)为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸缀合物；

优选地，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2、6、14、16位、或者第2，4，6，14，16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5，12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，

所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，任选地在5’端的第1位具有苏糖核苷酸，或者任选地在5’端的第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；进一步优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)；

更优选地，所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链在以下位置具有2’-氟核苷酸：5’端的第2，14，16位、或者第2，5，14，16位、或者第2、6、14、16位、或者第2，4，6，14，16位、或者第2，6，10，14，16位、或者第2，6，12，14，16位、或者第2，5，10，14，16位、或者第2，3，12，14，16位、或者第2，9，12，14，16位、或者第2，6，8，9，14，16位、或者第2，3，5，12，14，16位、或者第2，8，9，12，14，16位、或者第2，7，9，12，14，16位、或者第2，4，6，8，10，14，16，18，20位、或者第2，4，5，6，8，10，12，14，16，18位)，其余位置为2’-甲氧基核苷酸，所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，第6位为2’-脱氧核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；进一步优选地，所述第6位的2’-脱氧核苷酸为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)；

进一步优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
根据权利要求1-11任一项所述的siRNA，其特征在于：

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:116所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
根据权利要求1-11任一项所述的siRNA，其特征在于：

所述siRNA的反义链长度为22个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为20个核苷酸，其中正义链5’端的第8、9、10位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；

进一步优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸分别为：胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)；

更优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
根据权利要求1-11任一项所述的siRNA，其特征在于：

所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第2、6、14、16位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，第1位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；或者

所述siRNA的反义链长度为21个核苷酸，其中反义链5’端的第14位为2’-氟核苷酸，第2、5、7位为2’-脱氧核苷酸，第12位为苏糖核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；所述siRNA的正义链长度为19个核苷酸，其中正义链5’端的第7、8、9位为2’-氟核苷酸，其余位置为2’-甲氧基核苷酸；

优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸独立地选自：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dG)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dC)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)；

进一步优选地，所述第2、5、7位的2’-脱氧核苷酸分别为：胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dT)、尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(dU)和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dA)；

更优选地，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO:104所示的核苷酸序列，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
根据权利要求12-15任一项所述的siRNA，其特征在于：所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含0、1个或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。
根据权利要求12-16任一项所述的siRNA，其特征在于：所述反义链5’端第一个核苷酸是(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
根据权利要求12-17任一项所述的siRNA，其特征在于：正义链的3'端和/或5'端分别连接有反向脱碱基残基(iab)，优选正义链的3'端和5'端分别连接有反向脱碱基残基(iab)。
权利要求1-18任一项所述的siRNA与缀合分子缀合而得的siRNA缀合物。
根据权利要求19所述的siRNA缀合物，其特征在于：递送载体部分通过共价键形成缀合分子，独立或者同时连接至siRNA正义链的3’端或者5’端。
根据权利要求20所述的siRNA缀合物，其特征在于：递送载体部分选自以下：

GalNAc(L96)或者Ser(GN)，或者GalNAc(Ser1)、GalNAc(Ser2)、GalNAc(Ser3)、GalNAc(Ser4)，或者LP-GalNAc、XY-GalNAc、GalNAc(A1GN)、GalNAc(A2GN)、GalNAc(A3GN)、GalNAc(A4GN)、GalNAc(A5GN)、GAlNAc(NAG25)、GAlNAc(NAG37)，

其中，

GalNAc(L96)具有如下结构：

Ser(GN)具有如下结构：

GalNAc(Ser1)、GalNAc(Ser2)、GalNAc(Ser3)、GalNAc(Ser4)分别具有如下结构：

LP-GalNAc具有如下结构：

XY-GalNAc具有如下结构：或者

GalNAc(A1GN)、GalNAc(A2GN)、GalNAc(A3GN)、GalNAc(A4GN)、GalNAc(A5GN)、GAlNAc(NAG25)、GAlNAc(NAG37)分别具有如下结构：

任选地，上述递送载体部分连接至siRNA正义链的3’末端，或者连接至siRNA正义链的5’末端，或者连接至siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)，或者连接至siRNA正义链的5’末端的反向脱碱基残基(iab)，或者上述递送载体部分中的一个或多个同时连接至siRNA正义链的3’末端、siRNA正义链的5’末端、siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)、siRNA正义链的5’末端的反向脱碱基残基(iab)；优选地，递送载体部分GalNAc(L96)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的3’末端的反向脱碱基残基(iab)，递送载体部分Ser(GN)同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端，递送载体部分LP-GalNAc连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分XY-GalNAc连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(Ser2)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的5’末端或者同时连接至siRNA 正义链的3’末端和5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser3)连接至siRNA正义链的3’末端或者连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser4)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A1GN)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A2GN)连接至siRNA正义链的3’末端，递送载体部分GalNAc(A3GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(A4GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(A5GN)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(NAG25)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(NAG37)连接至siRNA正义链的5’末端，递送载体部分GalNAc(Ser1)和GalNAc(Ser2)同时分别连接至siRNA正义链的3’末端和siRNA正义链的5’末端或者同时分别连接至siRNA正义链的5’末端和siRNA正义链的3’末端；

优选地，递送载体部分选自以下：连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(L96)，连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(A1GN)，连接至siRNA正义链的3’末端的GalNAc(A2GN)，连接至siRNA正义链的5’末端的GalNAc(A3GN)，连接至siRNA正义链的5’末端的GalNAc(A4GN)，同时连接至siRNA正义链的3’末端和5’末端的GalNAc(Ser2)。
根据权利要求19-21任一项所述的siRNA缀合物，其特征在于：所述siRNA缀合物选自缀合物1～缀合物1613以及缀合物1617～缀合物1658。
一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含权利要求1-18中任一项所述的siRNA和/或如权利要求19-22任一项所述的siRNA缀合物和药学上可接受的载体。
权利要求1-18任一所述的siRNA和/或如权利要求19-22任一项所述的siRNA缀合物和/或权利要求23所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与AGT基因过表达相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
根据权利要求24所述的用途，其特征在于：所述病理状况或疾病为与血压异常相关的疾病。