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CN119585236A - 中性脂质及脂质纳米粒 - Google Patents

中性脂质及脂质纳米粒 Download PDF

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CN119585236A
CN119585236A CN202380054622.XA CN202380054622A CN119585236A CN 119585236 A CN119585236 A CN 119585236A CN 202380054622 A CN202380054622 A CN 202380054622A CN 119585236 A CN119585236 A CN 119585236A
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CN
China
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lipid
methyl
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oleoyloxy
tot
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Application number
CN202380054622.XA
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Inventor
佐藤悠介
原岛秀吉
铃木裕一
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Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
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Publication date
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Abstract

本发明提供能够抑制由磷脂酰胆碱引起的内体膜的相变抑制的中性脂质、及含有该中性脂质的脂质纳米粒。本发明涉及离子性中性脂质，其包含由通式(I)表示的化合物，式(I)中，R1为碳原子数为1～22的烃基；一分子中存在的3个R1彼此可以为同种的基团，也可以为不同种的基团；a1及a2各自独立地为0～4的整数；b1及b2为满足b1+b2＝1的0或1；R2及R3各自独立地为氢原子或碳原子数为1～3的烷基；R4为阴离子性基团。

Description

中性脂质及脂质纳米粒
技术领域
本发明涉及具备疏水性链和亲水性基团的中性脂质、及含有该中性脂质的脂质纳米粒。
本发明基于2022年7月19日在日本提出申请的日本特愿2022-115017号主张优先权，并将其内容援引于此。
背景技术
作为用于包封脂溶性药物、siRNA(short interfering RNA：短干扰RNA)、mRNA等核酸并向靶细胞递送的担载体，利用了脂质纳米粒(LNP)。例如，关于作为用于将siRNA等核酸高效地向靶细胞内递送的担载体的脂质纳米粒，报道了一种脂质纳米粒，其包含在生理性pH下为电中性、在内体等弱酸性pH环境下变化为阳离子性的pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质(专利文献1)。在血中带正电荷的脂质纳米粒与血浆蛋白发生非特异性相互作用，迅速地被网状内皮系统从血中清除。与此相对，包含pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒在血中的中性条件下不带电荷、在内体内的弱酸性条件下带正电荷，能够高效地发生内体逃逸。
作为pH敏感性阳离子性脂质，例如Jayaraman等人开发了DLin-MC3-DMA，ED50在小鼠肝脏中的因子VII(F7)敲低时达到了0.005mg siRNA/kg(非专利文献1)。本申请的发明人以往也开发了独创的pH敏感性阳离子性脂质YSK05及YSK13-C3，作为F7敲低时的ED50，分别达到了0.06、0.015mg siRNA/kg(非专利文献2～4)。本申请的发明人还开发了7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基二油酸酯(CL4H6)等具有2条烃链和1个亲水性基团的化合物作为pH敏感性阳离子性脂质(专利文献1)。
脂质纳米粒通过胞吞作用向细胞内摄入。因此，对于改善脂质纳米粒向细胞内的摄入效率而言，脂质纳米粒与内体膜的膜融合容易进行这一点是重要的。另一方面，作为内体膜的主要构成脂质的磷脂酰胆碱(PC)由于采取圆柱型，因此使脂质双层膜(平面膜)的层状(L)相稳定化，强力抑制向膜融合所必需的反六角(HII)相的转变。例如，长期以来已知，就作为脂质纳米粒中通用的构成脂质的DOPE而言，由于采取圆锥形，因此促进从层状相向反六角相的转变，而另一方面，该作用被磷脂酰胆碱大幅地抑制(非专利文献5)。
另一方面，作为内含核酸等的脂质纳米粒的制造方法，有以使用流路的醇稀释法为原理的方法。例如，报道了通过使用能够实现2液瞬间混合的三维微混合器内置微流路，能够再现性良好地制造直径30nm左右的脂质纳米粒(非专利文献6)。另外，还报道了通过使用在供原料溶液流动的微尺寸的流路中从两侧面交错地配置相对流路宽度为一定宽度的挡板(baffle)而成的单纯二维结构的流路结构体，与使用以往的三维混合器的流路结构体相比，能够形成粒径可控性高的纳米尺寸的脂质粒形成系统(专利文献2)。这些纳米粒制剂的制造方法近年来主要用于制造负载有脂溶性药物、siRNA(短干扰RNA)或mRNA等核酸的脂质纳米粒(LNP)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/230710号
专利文献2：国际公开第2018/190423号
非专利文献
非专利文献1：Jayaraman等人，Angewandte Chemie International Edition,2012,vol.51,p.8529-8533.
非专利文献2：Watanabe等人，Scientific Reports,2014,4:4750,DOI:10.1038/srep04750.
非专利文献3：Yamamoto等人，Journal of Hepatology,2016,vol.64,p.547-555.
非专利文献4：Sato等人，Molecular Therapy,2016,vol.24,p.788-795.
非专利文献5：Cullis等人，Biochimica et Biophysica Acta,1979,vol.559,p.399-420.
非专利文献6：Leung等人，Journal of Physical Chemistry C NanomaterInterfaces,2012,vol.116(34),p.18440-18450.
发明内容
发明所要解决的课题
在包含pH敏感性阳离子性脂质的脂质纳米粒向细胞内的摄入中，以脂质纳米粒中的pH敏感性阳离子性脂质与内体膜中的阴离子性脂质的相互作用为驱动力的相变是重要，但该相变被磷脂酰胆碱等中性磷脂抑制。因此，需要开发可抑制由该中性磷脂引起的相变抑制这样的脂质纳米粒的构成脂质。
本发明的目的在于提供能够抑制由磷脂酰胆碱引起的内体膜的相变抑制的中性脂质、及含有该中性脂质的脂质纳米粒。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现，使三羟基甲基氨基甲烷(CAS编号：77-86-1)(以下简称“Tris”)的3个羟基各自与烃链键合、剩余的氨基与在前端具有阳离子性部分且在末端具有阴离子性基团的亲水性基团键合而得的化合物是适合作为脂质纳米粒的构成脂质的离子性中性脂质，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的离子性中性脂质等。
[1]离子性中性脂质，其包含由下述式(I)表示的化合物：
[化学式1]
式(I)中，R1为碳原子数为1～22的烃基；一分子中存在的3个R1彼此可以为同种的基团，也可以为不同种的基团；a1及a2各自独立地为0～4的整数；b1及b2为满足b1+b2＝1的0或1；R2及R3各自独立地为氢原子或碳原子数为1～3的烷基；R4为阴离子性基团。
[2]如前述[1]所述的离子性中性脂质，其中，前述通式(I)中，R4为羧酸基、磺酸基、硫酸酯基或磷酸基。
[3]如前述[1]或[2]所述的离子性中性脂质，其中，一分子中存在的3个R1全部为相同基团。
[4]如前述[1]～[3]中任一项所述的离子性中性脂质，其中，R1为碳原子数为15～22的烃基。
[5]如前述[1]～[4]中任一项所述的离子性中性脂质，其是由下述通式(Z-9)～(Z-15)中的任一者表示的化合物：
[化学式2]
[化学式3]
[式中，R1与通式(I)相同]。
[6]如前述[1]～[5]中任一项所述的离子性中性脂质，其为(S)-4-氨基-5-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-5-氧代戊酸、2-((4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)(甲基)铵基)乙酸盐、(S)-3-氨基-4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸、N4-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-天冬酰胺、或N5-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-谷氨酰胺。
[7]离子性中性脂质，其具有Tris骨架，
在前述Tris骨架的3个氧原子上各自键合有脂肪酸残基，前述脂肪酸残基中，烃链部分的碳原子数为1～22，可以具有1个以上的不饱和键，一分子中的3个前述脂肪酸残基可以为同种的基团，也可以为2种以上的不同的基团，
在前述Tris骨架的1个氮原子上介由具有铵阳离子性基团或季铵阳离子性氮原子的2价连接基团连接有阴离子性基团。
[8]脂质纳米粒，其含有前述[1]～[7]中任一项所述的离子性中性脂质。
[9]如前述[8]所述的脂质纳米粒，其还含有固醇及聚亚烷基二醇修饰脂质。
[10]如前述[8]或[9]所述的脂质纳米粒，其还含有pKa为6.6以下的pH敏感性阳离子性脂质。
[11]如前述[8]～[10]中任一项所述的脂质纳米粒，其含有核酸。
[12]如前述[11]所述的脂质纳米粒，其中，前述核酸为siRNA、mRNA或质粒DNA。
[13]药物用组合物，其以含有前述[1]～[7]中任一项所述的离子性中性脂质的脂质纳米粒为有效成分。
[14]药物用组合物，其以含有前述[1]～[7]中任一项所述的离子性中性脂质和核酸的脂质纳米粒为有效成分。
[15]如前述[13]或[14]所述的药物用组合物，其用于基因治疗。
[16]外源基因的表达方法，其中，向受试动物(其中，不包括人)施予包封有能在靶细胞内表达的目标外源基因的前述[11]所述的脂质纳米粒，使前述外源基因在前述受试动物的靶细胞内表达。
发明效果
本发明涉及的离子性中性脂质对由磷脂酰胆碱引起的脂质双层膜的稳定化作用具有抑制性作用。因此，该离子性中性脂质作为用于向细胞内摄入的脂质纳米粒的构成脂质是合适的，特别是作为用作药物的有效成分的脂质纳米粒的构成脂质是有用的。
附图说明
[图1]是实施例8中DOPC/DOPE膜(图1的(A))及DOPC/TOT-10膜(图1的(B))的31PNMR谱图数据。
[图2]是示出实施例9中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏及脾脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图3]是示出实施例10中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图4]是示出实施例11中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的股四头肌中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图5]是示出实施例12中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的脑中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图6]是示出实施例13中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏及脾脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图7]是示出实施例14中由CL4F6、TOT-9～TOT-15或DSPC、胆固醇、和PEG-DMG制备而成的脂质纳米粒在各pH条件下的荷电率(％)的测定结果的图。
[图8]是示出实施例14中对由CL4F6、TOT-9～TOT-15或DSPC、胆固醇、和PEG-DMG制备的脂质纳米粒的溶血活性进行测定的结果的图。
[图9]是示出实施例14中使用CL4F6、ALC-0315、MC3、SM-102、CL15F6或CL15H6作为阳离子性脂质、使用TOT-15或DSPC作为离子性中性脂质制备而成的脂质纳米粒在各pH条件下的荷电率(％)的测定结果的图。
[图10]是示出实施例14中对使用CL4F6、ALC-0315、MC3、SM-102、CL15F6或CL15H6作为阳离子性脂质、使用TOT-15或DSPC作为离子性中性脂质制备而成的脂质纳米粒的溶血活性进行测定的结果的图。
[图11]是示出实施例15中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏中的FlucmRNA量进行测定的结果的图。
[图12]是示出实施例15中对施予了负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图13]是示出实施例16中对针对施予了负载有Cas9-mRNA和TTR-gRNA的TTR靶基因组编辑用脂质纳米粒的小鼠的TTR的敲低效率进行测定的结果的图。
[图14]是示出实施例17中对由CL4F6、TOT-15或DSPC、胆固醇、和PEG-DMG制备而成的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒在4℃保存时的平均粒径及包封率进行经时测定的结果的图。
[图15]是示出实施例17中对施予了刚制造后或4℃保存4周后负载有FlucmRNA的脂质纳米粒的小鼠的肝脏中的Fluc活性(RLU/mg蛋白)进行测定的结果的图。
[图16]是实施例18中对由CL4F6、TOT-15或DSPC、胆固醇、和PEG-DMG制备而成的负载有EGFPmRNA的脂质纳米粒的、肝脏中的EGFP的表达进行观察而得的显微镜图像。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行具体说明。本申请说明书中，“X1～X2(X1和X2是满足X1<X2的实数)”是指“X1以上X2以下”。另外，“CX3-X4(X3和X4是满足X3<X4的整数)”是指“碳原子数为X3以上X4以下”。
[离子性中性脂质]
本发明涉及的离子性中性脂质是使Tris的3个羟基各自与烃链键合、Tris的氨基与包含阳离子性部分的阴离子性基团键合而得的化合物。其为具备3条烃链和亲水性部分的化合物，由于其结构的相似性，与磷脂等脂质的亲和性高，适合作为脂质纳米粒的构成脂质。
作为本发明涉及的离子性中性脂质的一例，可举出在Tris骨架中的3个氧原子上各自键合有脂肪酸残基、并且在该Tris骨架中的1个氮原子上介由具有铵阳离子性基团或季铵阳离子性氮原子的连接基团连接有阴离子性基团的化合物。此处，“Tris骨架”是指，从三羟基甲基氨基甲烷的3个羟基和氨基分别各去掉1个氢原子的结构。键合于Tris骨架的3个脂肪酸残基中，烃链部分的碳原子数为1～22，也可以具有1个以上的不饱和键。另外，一分子中存在的多个脂肪酸残基可以为同种的基团，也可以为2种以上的不同的基团。作为本发明涉及的离子性中性脂质，优选一分子中存在的多个脂肪酸残基全部为同种的基团。作为与Tris骨架的1个氮原子介由2价连接基团连接的阴离子性基团，可以使用后述R4中举出的基团。作为将Tris骨架的1个氮原子与该阴离子性基团连接的2价连接基团，只要是在侧链插入有铵阳离子性基团的2价基团、或者是在构成主链的碳原子彼此之间插入有季铵阳离子性氮原子的基团，则没有特别限定，例如优选与碳原子数为1～6的亚烷基的碳原子键合的1个氢原子被铵阳离子性基团取代的基团、或者在碳原子数为1～6的亚烷基的碳原子彼此之间插入有季铵阳离子性氮原子的基团。作为铵阳离子性基团及季铵阳离子性氮原子，可以使用下文中举出的基团。
作为本发明涉及的离子性中性脂质的一例，可举出由下述通式(I)表示的化合物。
[化学式4]
通式(I)中，R1为碳原子数为1～22的烃基(C1-22烃基)。该C1-22烃基可以为直链状，也可以为支链状。作为该烃基，可以为烷基，也可以为烯基。作为该烯基，可以为具有1个不饱和键的基团，可以为具有2个不饱和键的基团，也可以为具有3个不饱和键的基团，。作为R1，优选碳原子数为15～22的烃基(C15-22烃基)。
在R1为C1-22烷基的情况下，作为该烷基，可举出：
甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基；
正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基；
正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1-甲基-2,2-二甲基丁基；
正庚基、1-甲基己基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、1-乙基戊基、1,1-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1-甲基-3,3-二甲基丁基、2-甲基-3,3-二甲基丁基；
正辛基、1-甲基庚基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、1-乙基己基、1,1-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、5,5-二甲基己基、1-甲基-4,4-二甲基戊基、2-甲基-4,4-二甲基戊基、3-甲基-4,4-二甲基戊基；
正壬基、1-甲基辛基、2-甲基辛基、3-甲基辛基、4-甲基辛基、5-甲基辛基、6-甲基辛基、7-甲基辛基、1-乙基庚基、1,1-二甲基庚基、2,2-二甲基庚基、3,3-二甲基庚基、4,4-二甲基庚基、5,5-二甲基庚基、6,6-二甲基庚基、1-甲基-5,5-二甲基己基、2-甲基-5,5-二甲基己基、3-甲基-5,5-二甲基己基、4-甲基-5,5-二甲基己基；
正癸基、1-甲基壬基、2-甲基壬基、3-甲基壬基、4-甲基壬基、5-甲基壬基、6-甲基壬基、7-甲基壬基、8-甲基壬基、1-乙基辛基、1,1-二甲基辛基、2,2-二甲基辛基、3,3-二甲基辛基、4,4-二甲基辛基、5,5-二甲基辛基、6,6-二甲基辛基、7,7-二甲基辛基、1-甲基-6,6-二甲基庚基、2-甲基-6,6-二甲基庚基、3-甲基-6,6-二甲基庚基、4-甲基-6,6-二甲基庚基、5-甲基-6,6-二甲基庚基；
正十一烷基、1-甲基癸基、2-甲基癸基、3-甲基癸基、4-甲基癸基、5-甲基癸基、6-甲基癸基、7-甲基癸基、8-甲基癸基、9-甲基癸基、1-乙基壬基、1,1-二甲基壬基、2,2-二甲基壬基、3,3-二甲基壬基、4,4-二甲基壬基、5,5-二甲基壬基、6,6-二甲基壬基、7,7-二甲基壬基、8,8-二甲基壬基、1-甲基-7,7-二甲基辛基、2-甲基-7,7-二甲基辛基、3-甲基-7,7-二甲基辛基、4-甲基-7,7-二甲基辛基、5-甲基-7,7-二甲基辛基、6-甲基-7,7-二甲基辛基；
正十二烷基、1-甲基十一烷基、2-甲基十一烷基、3-甲基十一烷基、4-甲基十一烷基、5-甲基十一烷基、6-甲基十一烷基、7-甲基十一烷基、8-甲基十一烷基、9-甲基十一烷基、10-甲基十一烷基、1-乙基癸基、1,1-二甲基癸基、2,2-二甲基癸基、3,3-二甲基癸基、4,4-二甲基癸基、5,5-二甲基癸基、6,6-二甲基癸基、7,7-二甲基癸基、8,8-二甲基癸基、9,9-二甲基癸基、1-甲基-8,8-二甲基壬基、2-甲基-8,8-二甲基壬基、3-甲基-8,8-二甲基壬基、4-甲基-8,8-二甲基壬基、5-甲基-8,8-二甲基壬基、6-甲基-8,8-二甲基壬基、7-甲基-8,8-二甲基壬基；
正十三烷基、1-甲基十二烷基、2-甲基十二烷基、3-甲基十二烷基、4-甲基十二烷基、5-甲基十二烷基、6-甲基十二烷基、7-甲基十二烷基、8-甲基十二烷基、9-甲基十二烷基、10-甲基十二烷基、11-甲基十二烷基、1-乙基十一烷基、1,1-二甲基十一烷基、2,2-二甲基十一烷基、3,3-二甲基十一烷基、4,4-二甲基十一烷基、5,5-二甲基十一烷基、6,6-二甲基十一烷基、7,7-二甲基十一烷基、8,8-二甲基十一烷基、9,9-二甲基十一烷基、10,10-二甲基十一烷基、1-甲基-9,9-二甲基癸基、2-甲基-9,9-二甲基癸基、3-甲基-9,9-二甲基癸基、4-甲基-9,9-二甲基癸基、5-甲基-9,9-二甲基癸基、6-甲基-9,9-二甲基癸基、7-甲基-9,9-二甲基癸基、8-甲基-9,9-二甲基癸基；
正十四烷基、1-甲基十三烷基、2-甲基十三烷基、3-甲基十三烷基、4-甲基十三烷基、5-甲基十三烷基、6-甲基十三烷基、7-甲基十三烷基、8-甲基十三烷基、9-甲基十三烷基、10-甲基十三烷基、11-甲基十三烷基、12-甲基十三烷基、1-乙基十二烷基、1,1-二甲基十二烷基、2,2-二甲基十二烷基、3,3-二甲基十二烷基、4,4-二甲基十二烷基、5,5-二甲基十二烷基、6,6-二甲基十二烷基、7,7-二甲基十二烷基、8,8-二甲基十二烷基、9,9-二甲基十二烷基、10,10-二甲基十二烷基、11,11-二甲基十二烷基、1-甲基-10,10-二甲基十一烷基、2-甲基-10,10-二甲基十一烷基、3-甲基-10,10-二甲基十一烷基、4-甲基-10,10-二甲基十一烷基、5-甲基-10,10-二甲基十一烷基、6-甲基-10,10-二甲基十一烷基、7-甲基-10,10-二甲基十一烷基、8-甲基-10,10-二甲基十一烷基、9-甲基-10,10-二甲基十一烷基；
正十五烷基、1-甲基十四烷基、2-甲基十四烷基、3-甲基十四烷基、4-甲基十四烷基、5-甲基十四烷基、6-甲基十四烷基、7-甲基十四烷基、8-甲基十四烷基、9-甲基十四烷基、10-甲基十四烷基、11-甲基十四烷基、12-甲基十四烷基、13-甲基十四烷基、1-乙基十三烷基、1,1-二甲基十三烷基、2,2-二甲基十三烷基、3,3-二甲基十三烷基、4,4-二甲基十三烷基、5,5-二甲基十三烷基、6,6-二甲基十三烷基、7,7-二甲基十三烷基、8,8-二甲基十三烷基、9,9-二甲基十三烷基、10,10-二甲基十三烷基、11,11-二甲基十三烷基、12,12-二甲基十三烷基、1-甲基-11,11-二甲基十二烷基、2-甲基-11,11-二甲基十二烷基、3-甲基-11,11-二甲基十二烷基、4-甲基-11,11-二甲基十二烷基、5-甲基-11,11-二甲基十二烷基、6-甲基-11,11-二甲基十二烷基、7-甲基-11,11-二甲基十二烷基、8-甲基-11,11-二甲基十二烷基、9-甲基-11,11-二甲基十二烷基、10-甲基-11,11-二甲基十二烷基；
正十六烷基、1-甲基十五烷基、2-甲基十五烷基、3-甲基十五烷基、4-甲基十五烷基、5-甲基十五烷基、6-甲基十五烷基、7-甲基十五烷基、8-甲基十五烷基、9-甲基十五烷基、10-甲基十五烷基、11-甲基十五烷基、12-甲基十五烷基、13-甲基十五烷基、14-甲基十五烷基；
正十七烷基、1-甲基十六烷基、2-甲基十六烷基、3-甲基十六烷基、4-甲基十六烷基、5-甲基十六烷基、6-甲基十六烷基、7-甲基十六烷基、8-甲基十六烷基、9-甲基十六烷基、10-甲基十六烷基、11-甲基十六烷基、12-甲基十六烷基、13-甲基十六烷基、14-甲基十六烷基、15-甲基十六烷基；
正十八烷基、1-甲基十七烷基、2-甲基十七烷基、3-甲基十七烷基、4-甲基十七烷基、5-甲基十七烷基、6-甲基十七烷基、7-甲基十七烷基、8-甲基十七烷基、9-甲基十七烷基、10-甲基十七烷基、11-甲基十七烷基、12-甲基十七烷基、13-甲基十七烷基、14-甲基十七烷基、15-甲基十七烷基、16-甲基十七烷基；
正十九烷基、1-甲基十八烷基、2-甲基十八烷基、3-甲基十八烷基、4-甲基十八烷基、5-甲基十八烷基、6-甲基十八烷基、7-甲基十八烷基、8-甲基十八烷基、9-甲基十八烷基、10-甲基十八烷基、11-甲基十八烷基、12-甲基十八烷基、13-甲基十八烷基、14-甲基十八烷基、15-甲基十八烷基、16-甲基十八烷基、17-甲基十八烷基；
正二十烷基、1-甲基十九烷基、2-甲基十九烷基、3-甲基十九烷基、4-甲基十九烷基、5-甲基十九烷基、6-甲基十九烷基、7-甲基十九烷基、8-甲基十九烷基、9-甲基十九烷基、10-甲基十九烷基、11-甲基十九烷基、12-甲基十九烷基、13-甲基十九烷基、14-甲基十九烷基、15-甲基十九烷基、16-甲基十九烷基、17-甲基十九烷基、18-甲基十九烷基；
正二十一烷基、1-甲基二十烷基、2-甲基二十烷基、3-甲基二十烷基、4-甲基二十烷基、5-甲基二十烷基、6-甲基二十烷基、7-甲基二十烷基、8-甲基二十烷基、9-甲基二十烷基、10-甲基二十烷基、11-甲基二十烷基、12-甲基二十烷基、13-甲基二十烷基、14-甲基二十烷基、15-甲基二十烷基、16-甲基二十烷基、17-甲基二十烷基、18-甲基二十烷基、19-甲基二十烷基；
正二十二烷基、1-甲基二十一烷基、2-甲基二十一烷基、3-甲基二十一烷基、4-甲基二十一烷基、5-甲基二十一烷基、6-甲基二十一烷基、7-甲基二十一烷基、8-甲基二十一烷基、9-甲基二十一烷基、10-甲基二十一烷基、11-甲基二十一烷基、12-甲基二十一烷基、13-甲基二十一烷基、14-甲基二十一烷基、15-甲基二十一烷基、16-甲基二十一烷基、17-甲基二十一烷基、18-甲基二十一烷基、19-甲基二十一烷基、20-甲基二十一烷基；等等。
在R1为C2-22烯基的情况下，作为该烯基，可举出使作为C2-22烷基举出的基团中的碳分子之间的饱和键中的1～3个为不饱和键的基团。
通式(I)中，一分子中存在的3个R1彼此可以为同种的基团，也可以为不同种的基团。作为本发明涉及的离子性中性脂质，从合成的容易性和品质稳定性的方面考虑，优选一分子中存在的3个R1全部为同种的基团。
作为本发明涉及的离子性中性脂质，R1优选为直链状的C1-22烷基或直链状的C2-22烯基，更优选为直链状的C15-22烷基或直链状的C15-22烯基。作为本发明涉及的离子性中性脂质，更优选一分子中存在的3个R1为选自由正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基、正二十一烷基、正二十二烷基、正十五烯基、正十六烯基、正十七烯基、正十八烯基、正十九烯基、正二十烯基、正二十一烯基及正二十二烯基组成的组中的同种的基团或彼此不同种的基团，进一步优选一分子中存在的3个R1全部为选自由正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基、正二十一烷基、正二十二烷基、正十五烯基、正十六烯基、正十七烯基、正十八烯基、正十九烯基、正二十烯基、正二十一烯基及正二十二烯基组成的组中的同种的基团。
通式(I)中，a1及a2各自独立地为0～4的整数。在a1为0的情况下，-(CH2)a1-意指单键。同样地，在a2为0的情况下，-(CH2)a2-意指单键。作为本发明涉及的离子性中性脂质，a1优选为0～3的整数。作为本发明涉及的离子性中性脂质，a2优选为0～3的整数，更优选为0～2的整数。作为本发明涉及的离子性中性脂质，a1+a2优选为1～6的整数，更优选为1～4的整数。
通式(I)中，b1及b2为满足b1+b2＝1的0或1。在b1为1的情况下，b2为0，在b1为0的情况下，b2为1。即，由通式(I)表示的离子性中性脂质在一分子中必须具有-NH3 +和-(N+(R2)(R3))-中的任一基团。需要说明的是，以下将-NH3 +及-(N+(R2)(R3))统称为“铵阳离子性部分”。
通式(I)中，R2及R3各自独立地为氢原子或C1-3烷基。作为该C1-3烷基，可举出甲基、乙基、正丙基或异丙基。作为本发明涉及的离子性中性脂质，优选R2及R3各自独立地为氢原子、甲基或乙基，更优选R2及R3各自独立地为氢原子或甲基，进一步优选R2为氢原子或甲基且R3为甲基。
通式(I)中，R4为阴离子性基团。作为该阴离子性基团，例如可举出羧酸基(-C(＝O)O-)、磺酸基(-S(＝O)2O-)、磷酸基(-O-P(＝O)O2-)、及硫酸酯基(-OS(＝O)O2-)等。作为本发明涉及的离子性中性脂质，优选R4为羧酸基。
作为本发明涉及的离子性中性脂质，例如可举出由下述通式(Z-9)～(Z-15)表示的化合物。通式(Z-9)～(Z-15)中，R1与通式(I)相同。
[化学式5]
[化学式6]
本发明涉及的离子性中性脂质在包含磷脂酰胆碱的脂质膜中使其稳定性降低而容易发生相变。因此，通过将本发明涉及的离子性中性脂质作为脂质纳米粒的构成脂质，能够提高脂质纳米粒在包含磷脂酰胆碱的细胞膜等中的摄入效率。虽然本发明涉及的离子性中性脂质对这样的磷脂酰胆碱的相变抑制具有抑制效果的理由尚不明确，但推测如下。
本发明涉及的离子性中性脂质从1个sp3碳延伸出3条包含R1的烃链，在该sp3碳上还连接有在末端具有阴离子性基团且在前端具备铵阳离子性部分的亲水性基团。另一方面，磷脂酰胆碱具备2条烃链和磷酸胆碱基，该磷酸胆碱基在末端具有三甲基铵基且在前端具有阴离子性的磷酸基部分。因此，本发明涉及的离子性中性脂质的亲水性基团中的铵阳离子性部分和阴离子性基团可分别与磷脂酰胆碱的磷酸胆碱基中的磷酸基部分及三甲基铵基形成离子对。通过使本发明涉及的离子性中性脂质的亲水性基团与内体膜中的磷脂酰胆碱的磷酸胆碱基形成离子对，从而使磷脂酰胆碱的表观形状变化为圆锥形，促进向反六角相等具有负曲率的非层状相转变。通过相变成该非层状相，从而促进脂质纳米粒与内体膜的膜融合，促进该脂质纳米粒向细胞内的摄入。
本发明涉及的离子性中性脂质例如能够通过使由下述通式(A)表示的化合物(以下有时称为“化合物(A)”)、由下述通式(B)表示的化合物(以下有时称为“化合物(B)”)和三羟基甲基氨基甲烷缩合而制造。
[化学式7]
通过使化合物(A)的羧酸基与Tris的羟基脱水缩合而形成酯键，进一步地，使化合物(B)的羧酸基与Tris的氨基脱水缩合而形成酰胺键，从而合成由通式(I)表示的离子性中性脂质。化合物(A)的羧酸基与Tris的羟基的脱水缩合反应通常能够在与形成羧酸与醇的酯化物时的脱水缩合反应同样的反应条件下进行。化合物(B)的羧酸基与Tris的氨基的脱水缩合反应通常能够在与形成羧酸与胺的酰胺化物时的脱水缩合反应同样的反应条件下进行。即，由通式(I)表示的离子性中性脂质能够通过以Tris为接头、利用通常的脱水缩合反应比较简便地合成。
能够通过使化合物(A)与Tris反应，进行与Tris的羟基的脱水缩合反应后，使化合物(B)与得到的酯化物反应，进行与来自Tris的氨基的脱水缩合反应，从而合成由通式(I)表示的离子性中性脂质。另外，也能够通过使化合物(B)与Tris反应，进行与Tris的氨基的脱水缩合反应后，使化合物(A)与得到的酰胺化物反应，进行与来自Tris的羟基的脱水缩合反应，从而合成由通式(I)表示的离子性中性脂质。
由通式(I)表示的离子性中性脂质例如能够通过本说明书的实施例中具体示出的方法而容易地制造。本领域技术人员能够通过参考该制造方法并适当选择原料化合物、试剂及反应条件等而容易地制造通式(I)的范围内包含的任意脂质。
[脂质纳米粒]
本发明涉及的脂质纳米粒以本发明涉及的离子性中性脂质为构成脂质。构成本发明涉及的脂质纳米粒的本发明涉及的离子性中性脂质可以仅为1种，也可以为2种以上。在构成本发明涉及的脂质纳米粒的本发明涉及的离子性中性脂质为2种以上的情况下，本发明涉及的离子性中性脂质的量是指，构成脂质纳米粒的脂质分子之中与本发明涉及的离子性中性脂质相当的脂质分子的合计量。
本发明涉及的离子性中性脂质在构成脂质纳米粒的脂质分子中所占的比例没有特别限定。例如，在本发明涉及的脂质纳米粒中，本发明涉及的离子性中性脂质的量相对构成脂质纳米粒的总脂质的量而言的比例([本发明涉及的离子性中性脂质的量(mol)]/([构成脂质纳米粒的总脂质的量(mol)])×100％)优选为1摩尔％以上，更优选为3摩尔％以上，进一步优选为5摩尔％以上。另一方面，若离子性中性脂质在构成脂质纳米粒的脂质分子中所占的比例过多，则有时用于赋予脂质纳米粒所期望的特性的其他脂质的含量过少。因此，本发明涉及的脂质纳米粒中的、本发明涉及的离子性中性脂质的量相对构成脂质纳米粒的总脂质的量而言的比例优选为90摩尔％以下，更优选为80摩尔％以下，进一步优选为70摩尔％以下。在作为用于向生物体内的靶细胞递送的担载体进行利用的脂质纳米粒的情况下，为了容易得到更高的递送效率，本发明涉及的脂质纳米粒中的、本发明涉及的离子性中性脂质的量相对构成脂质纳米粒的总脂质的量而言的比例优选为50摩尔％以下，更优选为30摩尔％以下，进一步优选为5～20摩尔％。
作为本发明涉及的脂质纳米粒的构成脂质，优选在本发明涉及的离子性中性脂质之外还含有pH敏感性阳离子性脂质。作为pH敏感性阳离子性脂质，没有特别限定，可以适当使用已知的pH敏感性阳离子性脂质、其改性化合物。作为已知的pH敏感性阳离子性脂质，例如可举出DLin-MC3-DMA等非专利文献1中记载的pH敏感性阳离子性脂质、YSK05及YSK13-C3等非专利文献2～4中记载的pH敏感性阳离子性脂质、CL4H6等专利文献1中记载的pH敏感性阳离子性脂质等。作为与本发明涉及的离子性中性脂质一同成为本发明涉及的脂质纳米粒的构成脂质的pH敏感性阳离子性脂质，优选pKa为6.6以下，更优选pKa为5.8～6.6，进一步优选pKa为6.0～6.6。
作为本发明涉及的脂质纳米粒的构成脂质之中除本发明涉及的离子性中性脂质、pH敏感性阳离子性脂质以外的脂质，通常可以使用在形成脂质体时使用的脂质。作为这样的脂质，例如可举出磷脂、固醇、糖脂、或者饱和或不饱和的脂肪酸等。它们可以使用1种或组合使用2种以上。
作为磷脂，可举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、心磷脂、缩醛磷脂、神经酰胺磷酰基甘油磷酸酯(ceramide phosphorylglycerolphosphate)、磷脂酸等甘油磷脂；鞘磷脂、神经酰胺磷酰甘油、神经酰胺磷酰乙醇胺等鞘磷脂；等等。另外，也可以使用蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂等来自天然物质的磷脂。甘油磷脂及鞘磷脂中的脂肪酸残基没有特别限定，例如可举出碳原子数为12～24的饱和或不饱和的脂肪酸残基，优选碳原子数为14～20的饱和或不饱和的脂肪酸残基。具体而言，可举出来自月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、山萮酸、木蜡酸等脂肪酸的酰基。在这些甘油脂质或鞘脂具有2个以上的脂肪酸残基的情况下，全部的脂肪酸残基可以为相同的基团，也可以为彼此不同的基团。
作为固醇，例如可举出胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、羊毛固醇、二氢羊毛固醇、24-脱氢胆固醇(desmosterol)、二氢胆固醇等来自动物的固醇；豆固醇、谷固醇、菜油固醇(campesterol)、菜籽固醇等来自植物的固醇(植物固醇)；酵母固醇、麦角固醇等来自微生物的固醇等。作为糖脂，例如可举出磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosyl glyceride)、二糖基甘油二酯(diglycosyl diglyceride)、二半乳糖基甘油二酯(digalactosyldiglyceride)、半乳糖基甘油二酯(galactosyl diglyceride)、糖基甘油二酯(glycosyldiglyceride)等甘油糖脂；半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂等鞘糖脂；等等。作为饱和或不饱和的脂肪酸，例如可举出棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等碳原子数为12～20的饱和或不饱和的脂肪酸。
作为本发明涉及的脂质纳米粒的构成脂质，在本发明涉及的离子性中性脂质之外，优选包含其他中性脂质，更优选包含磷脂或固醇，进一步优选包含固醇，更进一步优选包含胆固醇。
本发明涉及的脂质纳米粒优选含有聚亚烷基二醇修饰脂质作为脂质成分。聚亚烷基二醇为亲水性聚合物，通过使用聚亚烷基二醇修饰脂质作为脂质膜构成脂质来构建脂质纳米粒，能够用聚亚烷基二醇对脂质纳米粒的表面进行修饰。通过用聚亚烷基二醇进行表面修饰，有时能够提高脂质纳米粒的血中滞留性等稳定性。
作为聚亚烷基二醇，例如可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚己二醇等。聚亚烷基二醇的分子量例如为300～10,000左右，优选为500～10,000左右，进一步优选为1,000～5,000左右。
例如，脂质的基于聚乙二醇的修饰可以使用硬脂酰化聚乙二醇(例如，硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。其他也可以使用N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、n-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-750]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-2000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-[羰基-甲氧基聚乙二醇-5000]-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)等聚乙二醇衍生物等，聚亚烷基二醇化脂质不限定于此。
聚亚烷基二醇修饰脂质相对构成本发明涉及的脂质纳米粒的总脂质的量而言的比例只要是不损害本发明涉及的离子性中性脂质对磷脂酰胆碱的相变抑制的抑制效果的量，则没有特别限定。例如，聚亚烷基二醇修饰脂质相对构成脂质纳米粒的总脂质的量而言的比例优选设为0.5～3摩尔％。
本发明涉及的脂质纳米粒可以根据需要进行适当的表面修饰等。
本发明涉及的脂质纳米粒能够通过用亲水性聚合物等对表面进行修饰从而提高血中滞留性。有时也能够通过使用由这些修饰基团修饰的脂质作为脂质纳米粒的构成脂质从而进行表面修饰。
在制造本发明涉及的脂质纳米粒时，作为用于提高血中滞留性的脂质衍生物，例如也能够利用血型糖蛋白、神经节苷脂GM1、磷脂酰肌醇、神经节苷脂GM3、葡萄糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。另外，作为用于提高血中滞留性的亲水性聚合物，在聚亚烷基二醇之外，也可以将右旋糖酐、普鲁兰多糖、聚蔗糖(ficoll)、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、卡拉胶等用于表面修饰。
另外，为了促进本发明涉及的脂质纳米粒的核转位，例如也可以用3糖以上的低聚糖化合物对脂质纳米粒进行表面修饰。3糖以上的低聚糖化合物的种类没有特别限定，例如可以使用由3～10个左右的糖单元结合而成的低聚糖化合物，优选可以使用由3～6个左右的糖单元结合而成的低聚糖化合物。其中，可优选使用作为葡萄糖的3聚体或6聚体的低聚糖化合物，可进一步优选使用作为葡萄糖的3聚体或4聚体的低聚糖化合物。更具体而言，可以优选使用异麦芽三糖、异潘糖(isopanose)、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖等，其中，进一步优选由葡萄糖以α1-4结合而成的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖。特别优选麦芽三糖或麦芽四糖，最优选麦芽三糖。基于低聚糖化合物的脂质纳米粒的表面修饰量没有特别限定，例如，相对于总脂质的量而言为1～30摩尔％左右，优选为2～20摩尔％左右，更优选为5～10摩尔％左右。
用低聚糖化合物对脂质纳米粒进行表面修饰的方法没有特别限定，例如已知有用半乳糖、甘露糖等单糖对脂质纳米粒进行了表面修饰的脂质体(国际公开第2007/102481号)，因此可以采用该刊物中记载的表面修饰方法。将上述刊物的全部公开内容通过参考包含在本申请说明书的公开内容内。
另外，能够对本发明涉及的脂质纳米粒赋予例如温度变化敏感性功能、膜透过功能、基因表达功能、及pH敏感性功能等中的任1种或2种以上的功能。通过适当附加这些功能，能够提高脂质纳米粒在血液中的滞留性，使脂质纳米粒在靶细胞的胞吞作用之后高效地从内体逃逸，使被包封的核酸在靶细胞内更高效地表达。
本发明涉及的脂质纳米粒也可以包含选自由生育酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯或丁基化羟基甲苯等抗氧化剂、荷电物质、及膜多肽等组成的组中的1种或2种以上的物质。作为赋予正电荷的荷电物质，例如可举出硬脂胺、油胺等饱和或不饱和脂肪族胺等，作为赋予负电荷的荷电物质，例如可举出二鲸蜡基磷酸酯、胆固醇琥珀酸单酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。作为膜多肽，例如可举出膜周边多肽或膜内在多肽等。这些物质的配合量没有特别限定，可以根据目的适当选择。
就本发明涉及的脂质纳米粒的大小而言，从容易得到向生物体内的靶细胞的高递送效率的方面考虑，平均粒径优选为400nm以下，平均粒径更优选为300nm以下，平均粒径进一步优选为200nm以下，更进一步优选为150nm以下。需要说明的是，脂质纳米粒的平均粒径是指，利用动态光散射法(Dynamic light scattering：DLS)测定的数均粒径。基于动态光散射法的测定能够使用市售的DLS装置等通过常规方法进行。
本发明涉及的脂质纳米粒的多分散性指数(PDI)为0.01～0.7左右，优选为0.01～0.6左右，进一步优选为0.01～0.3左右。Zeta电位可以为-50mV～5mV的范围，优选为-10mV～5mV的范围。
本发明涉及的脂质纳米粒的形态没有特别限定，例如，作为分散于水系溶剂的形态，可举出单室脂质体(unilamelar vesicle)、多室脂质体、球状胶束、或无定形的层状结构物等。作为本发明涉及的脂质纳米粒，优选为单室脂质体、多室脂质体。
本发明涉及的脂质纳米粒优选在被脂质膜覆盖的颗粒内部中内含向靶细胞内递送的目标成分。作为本发明涉及的脂质纳米粒在颗粒内部中内含的成分，只要是能内含的大小，则没有特别限定。能够在本发明涉及的脂质纳米粒中包封核酸、糖类、肽类、低分子化合物、金属化合物等任意物质。
作为内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的成分，优选为核酸。作为核酸，可以为DNA，可以为RNA，也可以为它们的类似物或衍生物(例如，肽核酸(PNA)、硫代磷酸化DNA等)。内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的核酸可以为单链核酸，也可以为双链核酸，可以为线状，也可以为环状。
内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的核酸优选包含要在靶细胞内表达的外源基因，更优选为通过被摄入细胞内而发挥用于使外源基因在细胞内表达的功能的核酸。该外源基因可以为在靶细胞的基因组DNA中原本包含的基因，也可以为在基因组DNA中不含的基因。作为这样的核酸，可举出包含由编码待表达的目标基因的碱基序列组成的核酸的基因表达载体。该基因表达载体可以在所导入的细胞内作为染色体外基因存在，也可以通过同源重组整合到基因组DNA中。
作为内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的基因表达载体，没有特别限定，可以使用在通常的基因治疗等中使用的载体。作为内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的基因表达载体，优选为质粒载体等核酸载体。质粒载体可以保持环状、也可以在预先切断成线状的状态下包封于本发明涉及的脂质纳米粒中。基因表达载体可以基于待表达的对象基因的碱基序列信息，利用通常使用的分子生物学工具通过常规方法进行设计，可以利用已知的各种方法来制造。
内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的核酸也优选为对靶细胞内存在的靶基因的表达进行调控的功能性核酸。作为该功能性核酸，可举出反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、siRNA、微RNA、mRNA等。另外，也可以为作为使siRNA在细胞内表达的siRNA表达载体的质粒DNA(pDNA)。作为siRNA表达载体，可以由市售的siRNA表达载体来制备，另外也可以对其进行适当改性。作为内含于本发明涉及的脂质纳米粒中的核酸，特别是从对生物体内的组织的选择性良好的方面考虑，优选为mRNA或pDNA。
本发明涉及的脂质纳米粒的制造方法没有特别限定，可以采用本领域技术人员能够利用的任意方法。在一个例子中，能够通过如下方式制造：通过将全部的脂质成分溶解于氯仿等有机溶剂并进行基于蒸发器的减压干燥、基于喷雾干燥机的喷雾干燥而形成脂质膜后，将包含待包封于该脂质纳米粒中的成分(例如核酸等)的水系溶剂添加于经干燥的上述混合物，进一步利用均化器等乳化机、超声波乳化机、或高压喷射乳化机等进行乳化。另外，作为制造脂质体的方法，也能够利用熟知的方法、例如逆相蒸发法等来制造。在想要控制脂质纳米粒大小的情况下，只要使用孔径一致的膜滤器等在高压下进行挤压(挤出过滤)即可。
水系溶剂(分散介质)的组成没有特别限定，例如可举出磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水等缓冲液、生理盐水、细胞培养用培养基等。这些水系溶剂(分散介质)能够使脂质纳米粒稳定地分散，也可以进一步加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类、棉子糖、松三糖等三糖类、环糊精等多糖类、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)、丙三醇、二丙三醇、聚丙三醇、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)等。为了将分散于该水系溶剂的脂质纳米粒稳定地长期保存，从抑制聚集等物理稳定性的方面考虑，优选极力排除水系溶剂中的电解质。另外，从脂质的化学稳定性的方面考虑，优选将水系溶剂的pH设定为弱酸性至中性付近(pH3.0～8.0左右)及/或利用氮气鼓泡等除去溶解氧。
本发明涉及的脂质纳米粒也能够利用使用流路的醇稀释法来制造。该方法为将使脂质成分溶解于醇溶剂而得的溶液、和使待包含于脂质纳米粒的水溶性成分溶解于水系溶剂而得的溶液从不同的流路导入、并使它们合流来制造脂质纳米粒的方法。通过使用能够实现2液瞬间混合的三维微混合器内置微流路，能够再现性良好地制造直径30nm左右的脂质纳米粒(非专利文献6)。作为制造中使用的流路，从能够形成粒径可控性高的纳米尺寸的脂质粒形成系统的方面考虑，优选使用专利文献2中记载的那样的、在供原料溶液流动的微尺寸的流路中从两侧面交错地配置相对流路宽度为一定宽度的挡板(baffle)而成的单纯二维结构的流路结构体。作为在醇稀释法中使用的水系溶剂，可以使用前述的水系溶剂。
在对得到的脂质纳米粒的水性分散物进行冷冻干燥或喷雾干燥的情况下，若使用例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖的单糖类、乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等二糖类、棉子糖、松三糖等三糖类、环糊精等多糖类、赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)，则有时能够改善稳定性。另外，在对上述水性分散物进行冷冻的情况下，若使用例如前述的糖类、丙三醇、二丙三醇、聚丙三醇、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1,3-丁二醇等多元醇(水溶液)，则有时能够改善稳定性。
本发明涉及的脂质纳米粒作为针对靶组织的基因表达载体而发挥功能。将能在靶细胞内表达的目标外源基因包封于本发明涉及的脂质纳米粒中后，施予至受试动物，从而该外源基因在该受试动物的靶组织内表达。因此，本发明涉及的脂质纳米粒作为基因治疗中使用的药物用组合物的有效成分是有用的。
可施予本发明涉及的脂质纳米粒的动物没有特别限定，可以是人，也可以是人以外的动物。作为非人动物，可举出牛、猪、马、绵羊、山羊、猴、犬、猫、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等哺乳动物、鸡、鹌鹑、鸭等鸟类等。另外，向动物施予本发明涉及的脂质纳米粒时的施予途径没有特别限定，优选静脉施予、经肠施予、肌内施予、皮下施予、经皮施予、经鼻施予、经肺施予等非经口施予。
实施例
接下来，示出实施例来进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于以下的实施例。
<NMR(核磁共振)>
在以下的实验中，只要没有特别说明，则1H及13C NMR谱图使用JEOL公司的NMR装置(ECA500装置、ECZ400装置、或ECX400P装置)、将四甲基硅烷作为内标(0ppm)而取得。d是双重峰的缩写，t是三重峰的缩写，m是多重峰的缩写。1H NMR谱图的化学位移按相对于四甲基硅烷在低场处的σ标度、以ppm报告。
<脂质纳米粒的构成脂质>
7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-7-羟基十三烷-1,13-二基二油酸酯(CL4H6)及7-羟基7-(4-((1-甲基哌啶-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基二油酸酯(CL15H6)使用利用专利文献1中记载的方法合成的物质。7-(4-(二异丙基氨基)丁基)-13-((2-己基壬酰基)氧基)-7-羟基十三烷基2-己基癸酸酯(CL4F6)使用下述合成例1中合成的物质。7-羟基-7-(4-((1-甲基哌啶)-4-羰基)氧基)丁基)十三烷-1,13-二基双(2-己基癸酸酯)(CL15F6)使用利用国际公开第2022/071582号中记载的方法合成的物质。ALC-0315使用Ambeed公司制、DLin-MC3-DMA(MC3)使用Selleck Biotech公司制、SM-102使用Cayman Chemical公司制、胆固醇(Chol)使用SIGMA Aldrich公司制的产品。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、及甲氧基乙二醇2000修饰2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油酯(PEG-DMG)使用日油公司制的产品。
<基于31P NMR波谱法的脂质多态性评价>
脂质膜的基于31P NMR波谱法的谱图根据相的不同而不同。因此，对包含DOPC和作为评价对象的脂质的脂质膜进行基于31P NMR波谱法的分析，根据得到的谱图评价该脂质膜的相态的多态性，并就作为评价对象的脂质对DOPC膜的破坏能力进行评价。
具体而言，使将DOPC和作为评价对象的脂质(DOPE或TOT-10)以1:1(摩尔比)混合而得到的脂质(总脂质16μmol)溶解于300μL的氯仿后，用蒸馏装置(Rotovap)除去溶剂，形成脂质膜。使得到的脂质膜在60℃、500μL的PBS(-)中进行水合，作为测定用的样品。
接下来，将样品转移至NMR管，使用JEOL公司的ECA500装置，获得质子分离31P NMR谱图。收集参数包括：60°脉冲、32,768个数据点的280kHz的谱宽(在ECX 400P的情况下)、及1秒的脉冲间延迟时间。温度控制在25℃。在傅里叶变换之前，对自由感应衰减适用与50Hz的线展宽对应的指数函数的乘法。就化学位移而言，作为外标，以85％磷酸(H3PO4)为基准。
<薄层色谱法(TLC)>
在以下的实验中，只要没有特别说明，则全部反应的反应物通过使用预涂TLC板(Millipore公司制)的TLC进行监测。TLC的可视化通过UV光(254nm)、磷钼酸染色或对甲氧基苯甲醛染色而进行。反应产物利用自动化的combiflash(注册商标)Rf色谱系统(Teledyne ISCO公司制)或Selekt系统(Biotage公司制)来进行纯化。
<mRNA>
内含于脂质纳米粒的核酸之中，编码萤火虫萤光素酶(Fluc)的mRNA(CleanCapFlucmRNA、5moU)使用TriLink Biotechnologies公司制的产品。
<脂质纳米粒的制备>
在以下的实验中，只要没有特别说明，则脂质纳米粒通过使用流路的醇稀释法来制备。作为流路，使用混合器内置微流体装置“iLiNP”(Lilac Pharma公司制)。该装置的流量使用注射泵(Harvard Apparatus)进行控制。
具体而言，首先，将以规定摩尔比含有各脂质成分且总脂质浓度已调整为8mM的乙醇溶液80μL、和核酸浓度已调整为55μg/mL的乙酸缓冲液(25mM、pH4.0)240μL送液于微流路内，将从流路排出的脂质纳米粒溶液回收。将该脂质纳米粒溶液放入透析膜(MWCO 12,000-14,000，Spectrum Laboratories公司制)，将外水相设为PBS(-)(pH7.4)，于4℃进行2小时以上透析后，从透析膜回收脂质纳米粒溶液。
<脂质纳米粒的平均粒径和Zeta电位的测定>
使用利用动态光散射法的分析装置“Zetasizer Nano ZS ZEN3600”(Malvern公司制)对脂质纳米粒在PBS(-)(pH7.4)中的平均粒径(数均值)、ζ平均粒径、及多分散性指数(PdI)，以及在10mM HEPES缓冲液(pH7.4)中的Zeta电位进行测定。
<脂质纳米粒的包封率(胶囊化效率)>
对于脂质纳米粒的包封率，使用作为RNA嵌入剂的Ribogreen(life technologies公司制)对被包封的核酸(mRNA)的量进行测定而求出。
<脂质纳米粒的表观pKa的测定>
对于脂质纳米粒的表观pKa，使用对甲苯磺酸(TNS)进行测定。首先，将TNS(最终浓度：0.75μM)和脂质纳米粒(最终浓度：30μM)混合于已调整为各pH(pH3.5～9.5)的缓冲液(200mL)中。作为缓冲液，使用20mM柠檬酸缓冲液、20mM磷酸钠缓冲液、或包含130mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液。使用荧光分光光度计(VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific公司制)，在λex＝321nm、λem＝447nm的设定下，测定所制备的混合液的荧光强度。将测定值之中的最高值及最低值分别设为100％及0％荷电率，计算出显示50％荷电率的pH作为表观pKa。以阳离子性带电的离子性中性脂质的含有比率(％)使用亨德森-哈塞尔巴尔赫方程式进行计算。
<Fluc活性的测定>
首先，通过静脉注射、肌内注射或脑内注射对BALB/c小鼠(4周龄、雌性)施予包封有FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)。静脉注射、肌内注射及脑内注射的mRNA施予量(容量)分别为0.1mg/10mL/kg、1μg/50μL/小鼠、0.1μg/5μL/小鼠。从施予起6小时后，使小鼠安乐死，回收各组织(肝脏、股四头肌、脑)，用液氮冷冻，于-80℃保存。使用珠磨式细胞破碎装置(Micro Smash MS-100R，TOMY Seiko公司制)，用被动裂解缓冲液(Promega公司制)将组织匀浆化。通过离心除去组织碎片，回收上清液。该上清液中的Fluc活性依照制造商的方案、使用萤光素酶检测系统(E1500，Promega公司制)进行测定。发光使用光度计(Luminescencer-PSN，ATTO公司制)进行测定。蛋白质浓度使用市售的测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit：BCA蛋白定量试剂盒，Pierce公司制)进行确定。Fluc活性以每1mg蛋白质的相对光单位(RLU)的形式表示。
<溶血试验>
溶血试验中，向红细胞中加入脂质纳米粒，测定由红细胞的膜破坏而引起的溶血。通过使用低pH的缓冲液再现内体内的pH，从而测定由脂质纳米粒带来的膜融合能力，作为内体逃逸能力进行评价。具体而言，用pH7.4的缓冲液示意性评价血中条件，用pH6.0的缓冲液示意性评价早期内体，用pH5.0的缓冲液示意性评价晚期内体。
使用10mM苹果酸缓冲液(120mM NaCl)作为pH5.0的缓冲液，使用10mM HEPES缓冲液(120mM NaCl)作为pH6.0的缓冲液，使用10mM MES缓冲液(120mM NaCl)作为pH7.4的缓冲液。
在透明96孔板中加入总脂质浓度为0.75mM的脂质纳米粒溶液、及各pH的缓冲液，以最终脂质摩尔量成为0.781nmol至12.5nmol的方式用各pH的缓冲液稀释脂质纳米粒溶液。总液量为100μL。需要说明的是，作为阳性对照，在10μL的含有10％ TritonX-100的生理盐水溶液中加入各pH的缓冲液90μL，使总液量为100μL。另外，作为阴性对照，加入各pH的缓冲液100μL。
在这些脂质纳米粒稀释溶液中添加经相同pH的缓冲液稀释的血液溶液100μL，使每1个孔的总液量为200μL，以37℃、900rpm进行30分钟振荡。然后，对该孔板以4℃、400×g进行5分钟离心处理。从离心处理后的孔板的各孔分别取出100μL上清液，并分别添加于吸光度测定用的透明96孔板的各孔。需要说明的是，在吸光度测定用的透明96孔板的阳性对照的孔中预先添加生理盐水100μL，在阴性对照和添加有脂质纳米粒的样品的孔中预先添加0.5％ TritonX-100各100μL，使各孔的TritonX-100的最终浓度为0.25％。对每1个孔的总液量200μL的孔板使用荧光分光光度计(VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific公司制)测定545nm的吸光度，计算将阴性对照设为本底(blank)、将阳性对照设为100％时的溶血活性。
需要说明的是，血液溶液由新鲜小鼠红细胞悬液如下所述地制备。
首先，就红细胞悬液而言，使BALB/c小鼠(4周龄、雌性)安乐死，从下腔静脉采集血液，在加入了10mg/mL肝素1μL的1.5mL容量的管中加入血液1mL。将添加了肝素的血液1mL转移至50mL容量的管中，加入生理盐水9mL进行稀释。对该稀释血液以4℃、400×g进行5分钟离心处理后，除去上清液。重复进行5次该操作后，加入生理盐水10mL，得到红细胞悬液。
红细胞悬液的红细胞浓度如下所述地确定。在透明96孔板中加入10μL的含有10％TritonX-100的生理盐水溶液、和红细胞悬液或生理盐水，以使总液量成为200μL、TritonX-100最终浓度成为0.25％的方式稀释红细胞悬液。需要说明的是，以成为6.6倍至200倍之间的稀释倍率的方式稀释红细胞悬液。对加入了溶液的孔板以37℃、700rpm进行1分钟振荡，从各孔取出振荡后的溶液100μL，加入生理盐水100μL进行2倍稀释。对每1个孔的总液量为200μL的孔板使用荧光分光光度计(VarioskanLux、Thermo Fisher Scientific公司制)测定545nm的吸光度，制作标准曲线。根据该标准曲线，计算4倍稀释时的吸光度成为1.0的红细胞悬液的稀释倍率。以成为该稀释倍率的方式用各pH的缓冲液稀释红细胞悬液，制备血液溶液。
[合成例1]CL4F6的合成
[化学式8]
将利用专利文献1中记载的方法合成的7-(4-(二异丙基氨基)丁基)十三烷-1,7,13-三醇(1.0mmol)溶解于5mL的二氯甲烷，然后，加入2-己基癸酸(2.20mmol)、DMAP(N,N二甲基-4-氨基吡啶)(0.20mmol)及EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(3.0mmol)，于室温反应过夜。使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏除去后，用乙酸乙酯悬浮，通过过滤除去杂质。将滤液用0.5N氧化钠水溶液及饱和食盐水进行分液清洗。向有机层加入无水硫酸钠进行脱水。将其过滤后，使用旋转蒸发器将溶剂蒸馏除去，得到粗产物。通过将粗产物供于硅胶色谱法[洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇(连续梯度)]来进行纯化，得到CL4F6。
[实施例1]
使Tris的羟基与油酸残基缩合后，使得到的酯化物的来自Tris的氨基与N-((9H-芴-9-基甲氧基)羰基)-D-谷氨酸-5-叔丁酯水合物缩合，合成(S)-4-氨基-5-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(TOT-9)。
(1)(1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1)的合成
[化学式9]
向使Tris(10.0g、82.6mmol)分散于甲醇(75mL)和叔丁醇(75mL)的混合溶剂而得的溶液中滴加已溶解于叔丁醇(75mL)的二碳酸二叔丁酯(23.5g、107.7mmol)。将得到的反应混合物于环境温度搅拌过夜后，使该反应混合物蒸发。通过用冷EtOAc使得到的残留物沉淀来进行纯化。通过真空过滤以白色粉末的形态得到化合物1(16.7g、收率91％)。
(2)2-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-1,3-二基二油酸酯(化合物2)的合成
[化学式10]
使化合物1(2.21g、10.0mmol)溶解于无水DCM(二氯甲烷、50mL)，在得到的混合物中进一步溶解油酸(9.32g、33.0mmol)、DMAP(N,N二甲基-4-氨基吡啶)(122mg、1.0mmol)、及EDCI-HCl(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(7.67g、40.0mmol)。将得到的反应混合物于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。用EtOAc使得到的残留物悬浮，用饱和柠檬酸溶液、水进行清洗，用无水Na2SO4干燥。将该溶液过滤并蒸发滤液。将残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法(flash chromatography)进行纯化。由此，以无色油的形态得到化合物2(8.50g、收率84％)。
(3)22-氨基-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-1,3-二基二油酸酯(TOT-0)的合成
[化学式11]
使化合物2(8.50g、8.38mmol)溶解于无水DCM(44mL)，在得到的混合物中加入TFA(三氟乙酸)(5mL)及TIPS(三异丙基硅烷)(1mL)。将得到的反应混合物于环境温度搅拌3小时。用EtOAc稀释该反应混合物，用1N NaOH水溶液、水及卤水(brine)清洗有机相，用无水Na2SO4干燥。将溶液过滤并蒸发滤液。将残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色油的形态得到TOT-0(5.00g、收率65％)。
(4)(S)-4-氨基-5-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-5-氧代戊酸(TOT-9)的合成。
[化学式12]
使TOT-0(366mg、0.40mmol)溶解于乙醇(4mL)，在得到的混合物中加入N-((9H-芴-9-基甲氧基)羰基)-D-谷氨酸-5-叔丁酯水合物(170mg、0.44mmol)及DMT-MM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物)(122mg、0.44mmol)。将该反应混合物于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用EtOAc(4mL)悬浮，用0.5N NaOHaq(5mL)清洗后，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。使得到的溶液溶解于无水DCM(2.8mL)，在得到的混合物中加入TFA(0.8mL)及TIPS(0.4mL)。将该反应混合物于环境温度搅拌过夜后，用EtOAc稀释，将得到的有机相用1N NaOH水溶液、水及卤水清洗，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。在得到的溶液中加入DMF(1.8mL)和哌啶(200μL)后，于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-9(213mg、收率51％)。
[实施例2]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与4-(二甲基氨基)丁酸缩合，合成2-((4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)二甲基铵基)乙酸盐(TOT-10)。
[化学式13]
使TOT-0(366mg、0.40mmol)溶解于无水DCM(4mL)，在得到的混合物中加入4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(83.8mg、0.50mmol)、DMAP(4.9mg、0.04mmol)、TEA(83.6μL、0.60mmol)、及EDCI(115mg、0.60mmol)。将该反应混合物于35℃搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用己烷/EtOAc(1mL:1.4mL)悬浮，用0.5N NaOHaq(5mL)清洗后，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。将得到的残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用DCM和甲醇的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色油的形态得到2-(4-(二甲基氨基)丁酰胺)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-1,3-二基二油酸酯(化合物3)(341mg、收率83％)。
使化合物3(154mg、0.15mmol)溶解于无水DCM(1mL)，在得到的混合物中加入溴乙酸(41.7mg、0.30mmol)、N,N-二异丙基胺(DIPEA)(102μL、0.60mmol)。将该反应混合物在氩气氛下、于50℃搅拌2小时后，进行蒸发。将得到的残留物上样至反相色谱柱(SfaerC18、Biotage公司制)，利用使用水和2-丙醇的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-10(55.5mg、收率34％)。
[实施例3]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与3-(二甲基氨基)丙酸缩合，合成2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)二甲基铵基)乙酸盐(TOT-11)。
[化学式14]
使用3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(76.8mg、0.50mmol)代替4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐，除此以外，与实施例2的化合物3的合成同样地以无色油的形态得到2-(3-(二甲基氨基)丙烷酰胺)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-1,3-二基二油酸酯(化合物4)(245mg、收率60％)。
使化合物4(152mg、0.15mmol)溶解于无水DCM(1mL)，在得到的混合物中加入溴乙酸(31.3mg、0.225mmol)、及DIPEA(76.5μL、0.45mmol)。将该反应混合物在氩气氛下、于40℃搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物上样至反相色谱柱(SfaerC18、Biotage公司制)，利用使用水和2-丙醇的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-11(85.8mg、收率53％)。
[实施例4]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与Fmoc-N-甲基-β-丙氨酸缩合，合成2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)(甲基)铵基)乙酸盐(TOT-12)。
[化学式15]
使TOT-0(914mg、1.00mmol)溶解于乙醇(10mL)，在得到的混合物中加入Fmoc-N-甲基-β-丙氨酸(358mg、1.10mmol)及DMT-MM(304mg、1.10mmol)。将该反应混合物于40℃搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用己烷/EtOAc(1mL:11.20mL)悬浮，用0.5N NaOHaq(5mL)清洗后，卤水，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。
使粗残留物(无色油)溶解于无水DCM(4mL)，在得到的混合物中加入哌啶(1mL)。将该反应混合物于环境温度搅拌10分钟后，进行蒸发。将得到的残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用DCM和甲醇的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，得到无色粘稠的油(388mg、收率39％)。
使得到的无色油(388mg、0.388mmol)溶解于无水DCM(5mL)，在得到的混合物中加入溴乙酸(80.9mg、0.582mmol)、及DIPEA(198μL、1.16mmol)。将该反应混合物在氩气氛下、于35℃搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物上样至反相色谱柱(SfaerC18、Biotage公司制)，利用使用水和2-丙醇的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-12(152.4mg、收率37％)。
[实施例5]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与4-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-天冬酰胺酸缩合，合成(S)-3-氨基-4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(TOT-13)。
[化学式16]
使TOT-0(366mg、0.40mmol)溶解于乙醇(10mL)，在得到的混合物中加入4-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-天冬酰胺酸(173mg、0.44mmol)及DMT-MM(122mg、0.44mmol)。将该反应混合物于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用EtOAc(4mL)悬浮，用0.5NNaOHaq(5mL)清洗后，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。使残留物溶解于无水DCM(2.8mL)，加入TFA(0.8mL)及TIPS(0.4mL)后，于环境温度搅拌过夜。用EtOAc稀释所得到的反应混合物，用1N NaOH水溶液、水及卤水清洗有机相，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。将得到的残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-13(180mg、收率44％)。
[实施例6]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与1-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-天冬酰胺酸缩合，合成N4-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-天冬酰胺(TOT-14)。
[化学式17]
使TOT-0(366mg、0.40mmol)溶解于乙醇(4mL)，在得到的混合物中加入1-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-天冬酰胺酸(127)mg、0.44mmol)及DMT-MM(122mg、0.44mmol)。将该反应混合物于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用EtOAc(4mL)悬浮，用0.5NNaOHaq(5mL)清洗后，用无水Na2SO4干燥。使残留物溶解于无水DCM(2.8mL)，加入TFA(0.8mL)及TIPS(0.4mL)。用EtOAc稀释所得到的反应混合物，用1N NaOH水溶液、水及卤水清洗有机相，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液。上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-14(199mg、收率48％)。
[实施例7]
使实施例1中合成的TOT-0中的氨基与1-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-谷氨酸缩合，合成N5-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-谷氨酰胺(TOT-15)。
[化学式18]
使TOT-0(366mg、0.40mmol)溶解于乙醇(4mL)，在得到的混合物中加入1-叔丁基-N-(叔丁氧基-羰基)-L-谷氨酸(133.4mg、0.44mmol)及DMT-MM(122mg、0.44mmol)。将得到的反应混合物于环境温度搅拌过夜后，进行蒸发。将得到的残留物用EtOAc(4mL)悬浮，用0.5NNaOHaq(5mL)清洗后，用无水Na2SO4干燥。将得到的溶液过滤并蒸发滤液后，溶解于无水DCM(2.8mL)，加入TFA(0.8mL)及TIPS(0.4mL)。得到的反应混合物于环境温度搅拌过夜后，用EtOAc稀释，将有机相用1N NaOH水溶液、水及卤水清洗后，用无水Na2SO4干燥。将得到的残留物上样至正相色谱柱(SfaerSilicaHCD、Biotage公司制)，利用使用己烷和EtOAc的梯度流动相的快速色谱法进行纯化。由此，以无色粘稠的油的形态得到TOT-15(141mg、收率34％)。
[实施例8]
调查实施例2中合成的TOT-10对DOPC膜的稳定性的影响。具体而言，分别制备脂质组成为DOPC/TOT-10＝50/50(mol％)的脂质膜、和脂质组成为DOPC/DOPE＝50/50(mol％)的脂质膜，通过31P NMR波谱法获得质子分离31P NMR谱图。
图1的(A)示出DOPC/DOPE膜的31P NMR谱图，图1的(B)示出DOPC/TOT-10膜的31PNMR谱图。在DOPC/DOPE膜中，观察到来自层状相的峰(图1的(A))，与此相对，在DOPC/TOT-10膜中，未观察到来自层状相的峰而观察到来自六角相、各向同性相的峰(图1的(B))。由这些结果显示，TOT-10能降低、破坏包含磷脂酰胆碱的脂质膜的膜稳定性。
[实施例9]
使用实施例1～7中合成的TOT-9～TOT-15作为构成脂质，制备脂质纳米粒。
使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为TOT-9～TOT-15以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。另外，还使用DSPC代替TOT。
具体而言，以CL4F6/TOT/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-9～TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)。另外，使用DSPC代替TOT，除此以外，同样地进行操作，以CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1(mol％)的组成来使用，制作负载有FlucmRNA的脂质纳米粒。
接下来，对Balb/c小鼠施予所制备的各负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，测定Fluc活性(RLU/mg蛋白)。将结果示于图2。在施予了任意的脂质纳米粒的小鼠中，均在肝脏和脾脏确认到Fluc活性。由该结果确认，以TOT-9～TOT-15为构成脂质的脂质纳米粒作为以肝脏、脾脏为靶标的基因担载体是有用的。另外，全部的含有TOT的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒与含有DSPC的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒相比，肝脏中的Fluc活性高。
[实施例10]
调查了含有实施例7中合成的TOT-15和pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒的、通过静脉内注射施予的情况下的肝脏中的基因表达效率。
具体而言，以pH敏感性阳离子性脂质/TOT-15/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用pH敏感性阳离子性脂质、TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载有FlucmRNA的脂质纳米粒。使用CL4F6、CL4H6、DLin-MC3-DMA、或ALC-0315作为pH敏感性阳离子性脂质。另外，使用DSPC代替TOT，除此以外，同样地进行操作，制作pH敏感性阳离子性脂质/DSPC/chol/PEG-DM G＝50/10/40/1.5(mol％)的组成的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒。
接下来，通过静脉注射对Balb/c小鼠施予所制备的各负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，测定Fluc活性(RLU/mg蛋白)。将结果示于图3。就含有CL4F6、CL4H6、或DLin-MC3-DMA的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒而言，与同时含有DSPC的脂质纳米粒相比，含有TOT-15的脂质纳米粒在肝脏中的Fluc活性均明显更高。另外，对于含有ALC-0315的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，也观察到与同时含有DSPC的脂质纳米粒相比，含有TOT-15的脂质纳米粒在肝脏中的Fluc活性更优异的倾向。
[实施例11]
调查了含有实施例7中合成的TOT-15和pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒的、通过肌内注射施予的情况下的股四头肌中的基因表达效率。
具体而言，通过肌内注射对Balb/c小鼠施予实施例10中制备的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒之中的含有CL4F6或ALC-0315的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，测定Fluc活性(RLU/mg蛋白)。将结果示于图4。就含有CL4F6或ALC-0315的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒而言，在通过肌内注射施予的情况下，与同时含有DSPC的脂质纳米粒相比，含有TOT-15的脂质纳米粒在股四头肌中的Fluc活性也明显更高。
[实施例12]
调查了含有实施例7中合成的TOT-15和pH敏感性阳离子性脂质作为构成脂质的脂质纳米粒的、通过脑内注射施予的情况下的脑中的基因表达效率。
具体而言，通过脑内注射对Balb/c小鼠施予实施例10中制备的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒之中的含有CL4F6的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，测定Fluc活性(RLU/mg蛋白)。将结果示于图5。就含有CL4F6的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒而言，在通过脑内注射施予的情况下，与同时含有DSPC的脂质纳米粒相比，含有TOT-15的脂质纳米粒在脑中的Fluc活性也明显更高。
[实施例13]
调查了离子性中性脂质在脂质纳米粒的构成脂质中所占的比例对该脂质纳米粒向生物体内的靶细胞的递送效率的影响。使用实施例2中合成的TOT-10作为离子性中性脂质。使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为离子性中性脂质以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。另外，还使用DSPC代替TOT-10。
具体而言，以CL4F6/TOT-10/chol/PEG-DMG＝x/y/100-x-y/z(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-10、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)(LNP-1～9)。测定所制作的脂质纳米粒的平均粒径(数均值)、ζ平均粒径、PdI、及包封率。将结果示于表1。另外，使用DSPC代替TOT，除此以外，同样地进行操作，以CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1(mol％)的组成来使用，制作负载有FlucmRNA的脂质纳米粒(LNP-10)。
[表1]
接下来，对Balb/c小鼠(4周龄的雌性)施予所制备的各负载有FlucmRNA的脂质纳米粒(0.1mg RNA/kg)，回收从施予起6小时后的小鼠的肝脏及脾脏，测定Fluc活性(Fluc蛋白的表达量)(RLU/mg蛋白)(N＝1)。将结果示于图6。在肝脏中的活性与CL4F6的含量成比例地增大，在CL4F6的含量为等量的情况下，若TOT-10的含量多，则Fluc活性降低。特别是从在肝脏中的Fluc的表达效率考虑，优选TOT-10的含量为30摩尔％以下的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒，最优选TOT-10的含量为10摩尔％左右的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒。
[实施例14]
通过溶血试验调查了使用实施例1～7中合成的TOT-9～TOT-15作为构成脂质而制作的脂质纳米粒的膜破坏能力。
使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为TOT-9～TOT-15以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。另外，还使用DSPC代替TOT。
<脂质纳米粒>
具体而言，以CL4F6/TOT/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-9～TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作脂质纳米粒。另外，使用DSPC代替TOT，除此以外，同样地进行操作，以CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用，制作脂质纳米粒。测定所制作的脂质纳米粒的平均粒径(数均值)、ζ平均粒径、PdI、及各pH条件下的荷电率和表观pKa。将测定结果示于表2及图7。
[表2]
中性脂质 平均粒径[nm] 数均粒径[nm] PdI pKa
DSPC 128 67 0.21 6.12
TOT-9 157 109 0.15 6.27
TOT-10 141 73 0.28 6.39
TOT-11 131 83 0.17 6.41
TOT-12 135 86 0.18 6.34
TOT-13 125 81 0.12 6.19
TOT-14 141 76 0.23 6.24
TOT-15 119 61 0.24 6.29
针对各脂质纳米粒，进行溶血试验，测定pH5.0、6.0、及7.4条件下的溶血活性。在pH5.0的条件下，任意的脂质纳米粒均造成膜破坏，显示出同等程度的溶血活性(图8的(A))。另外，在pH7.4的条件下，任意的脂质纳米粒均未造成膜破坏(图8的(C))。在pH6.0的条件下，包含DSPC的脂质纳米粒未造成膜破坏，但包含TOT-9～TOT-15的脂质纳米粒均显示出最大30％左右的溶血活性(图8的(B))。由这些结果显示TOT-9～TOT-15促进早期内体的膜融合，表明通过该膜融合促进能力可实现对靶细胞的高递送效率。
使用CL4F6、ALC-0315、MC3、SM-102、CL15F6或CL15H6作为阳离子性脂质，使用TOT-15或DSPC作为离子性中性脂质，与前述同样地制备脂质纳米粒，测定各pH条件下的荷电率和表观pKa。将测定结果示于表3及图9。图9的(A)是使用了CL4F6、图9的(B)是使用了MC3、图9的(C)是使用了CL15F6、图9的(D)是使用了ALC-0315、图9的(E)是使用了SM-102、图9的(F)是使用了CL15H6的脂质纳米粒的结果。就包含任意的阳离子性脂质的脂质纳米粒而言，包含TOT-15的情况与包含DSPC的情况为同等程度的pKa(表3)，但在S形曲线后半部分的高pH区域中，与包含DSPC的情况(例如，在图9的(A)中的“CL4F6-DSPC”)相比，包含TOT-15的情况(例如，在图9的(A)中的“CL4F6-TOT15”)的荷电率高(图9)。
[表3]
针对各脂质纳米粒，进行溶血试验，测定pH5.0、6.0、及7.4的条件下的溶血活性。在pH5.0的条件下，无论阳离子性脂质的种类如何，包含TOT-15的脂质纳米粒和包含DSPC的脂质纳米粒均显示出同等程度的溶血活性(图10的(A))。另一方面，在pH6.0的条件下，在使用CL4F6、ALC作为阳离子性脂质的情况下，包含DSPC的脂质纳米粒不造成膜破坏，另一方面，包含TOT-15的脂质纳米粒显示出溶血活性(图10的(B))。在使用MC3、SM、CL15F6、或CL15H6作为阳离子性脂质的情况下，包含TOT-15的脂质纳米粒显示出与包含DSPC的脂质纳米粒同等以下的溶血活性(图10的(B))。在pH7.4的条件下，使用CL15F6、CL15H6的脂质纳米粒造成膜破坏，但与包含DSPC的情况相比，包含TOT-15的情况显示出更高的溶血活性(图10的(C)。
[实施例15]
将使用实施例7中合成的TOT-15的脂质纳米粒向肝脏的递送效率与使用DSPC的脂质纳米粒进行比较。使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为除TOT-15及DSPC以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。
具体而言，以CL4F6/TOT-15/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)。另外，使用DSPC代替TOT，除此以外，同样地进行操作，制作CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成的负载有FlucmRNA的脂质纳米粒。
接下来，对Balb/c小鼠(4周龄的雌性)施予所制备的各负载有FlucmRNA的脂质纳米粒(0.01mg RNA/kg)，回收从施予起0.5小时后或6小时后的小鼠的肝脏，利用qRT-PCR测定肝脏中摄入的FlucmRNA的量。将测定结果示于图11。在从施予起0.5小时后(图11的(A))和6小时后(图11的(B))中的任意中，与包含DSPC的脂质纳米粒相比，包含TOT-15的脂质纳米粒均被肝脏摄取了多达约2倍的mRNA。由这些结果确认，与包含DSPC的脂质纳米粒相比，包含TOT-15的脂质纳米粒递送更多的mRNA。
另外，测定了从施予负载有FlucmRNA的脂质纳米粒起6小时后的Fluc活性(Fluc蛋白的表达量)(RLU/mg蛋白)。将结果示于图12。在肝脏中，与包含DSPC的脂质纳米粒相比，包含TOT-15的脂质纳米粒显示出mRNA高达约6.1倍的Fluc活性。包含TOT-15的脂质纳米粒与包含DSPC的脂质纳米粒向肝脏的mRNA转移量之差比两者的Fluc活性之差小，由此认为，由包含TOT-15的脂质纳米粒带来的活性提高不仅是由向靶细胞的转移量的增加而引起的，也因为从内体的逃逸效率高。
[实施例16]
将使用实施例7中合成的TOT-15的脂质纳米粒作为用于基因组编辑的DDS担载体来使用。采用了使用DSPC的脂质纳米粒作为对照。使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为除TOT-15及DSPC以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。
具体而言，首先，用Cas9-mRNA(TriLink公司、5moU修饰)和以甲状腺素转运蛋白(transthyretin，TTR)为靶标的gRNA以质量比成为1:2的方式制备RNA溶液。与该RNA溶液一同地，以CL4F6/TOT-15/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了Cas9-mRNA和TTR-gRNA的脂质纳米粒(TTR靶基因组编辑用脂质纳米粒)。使用DSPC代替TOT-15，同样地制作脂质纳米粒(TTR靶基因组编辑用脂质纳米粒)，将其作为对照。测定所制作的脂质纳米粒的平均粒径(数均值)、ζ平均粒径、PdI、及包封率。将结果示于表4。
[表4]
离子性中性脂质 平均粒径[nm] 数均粒径[nm] 包封率[％] PdI
TOT-15 193 136 100.7 0.12
DSPC 168 61 91.1 0.18
接下来，通过尾静脉对Balb/c小鼠(4周龄的雌性)施予所制备的各TTR靶基因组编辑用脂质纳米粒(1.0mg mRNA/kg)，从施予起1周后使其安乐死，从下腔静脉采集血液。血液于室温静置1小时，以25℃、1,000×g进行15分钟离心处理，回收上清液，得到血清。使用市售的ELISA试剂盒(小鼠前白蛋白ELISA试剂盒、Aviva Systems Biology公司制)测定血清中的TTR浓度。标准曲线样品是从500ng/mL起通过梯度稀释制备250、125、62.5、31.25、15.63ng/mL的溶液各300μL。血清样品是将血清进行10,000倍稀释而得的。将100μL的标准曲线样品及血清样品加入孔板中，于25℃孵育30分钟。将孔清洗4次，将100μL的酶-抗体偶联物(Enzyme-Antibody Conjugate)加入各孔中，用铝箔对该孔板进行遮光后，于25℃孵育20分钟。再将孔清洗4次，将100μL的TMB底物溶液(Aviva Systems Biology公司制)加入各孔中，用铝箔对该孔板进行遮光后，于25℃孵育10分钟后，加入100μL的终止液(AvivaSystems Biology公司制)，使用荧光分光光度计(VarioskanLux、Thermo FisherScientific公司制)测定450nm的吸光度。
图13中示出血清中的TTR量(图13的(A))和TTR敲低效率(图13的(B))的测定结果。与包含DSPC的脂质纳米粒相比，包含TOT-15的脂质纳米粒的TTR敲低效率高约3.4倍。
[实施例17]
调查了使用实施例7中合成的TOT-15的脂质纳米粒的保存稳定性。采用了使用DSPC的脂质纳米粒作为对照。使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为除TOT-15及DSPC以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。
具体而言，以CL4F6/TOT/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)。另外，使用DSPC代替TOT-15，除此以外，同样地进行操作，以CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用，制作负载了FlucmRNA的脂质纳米粒(负载有FlucmRNA的脂质纳米粒)，于4℃保存4周。对制作的脂质纳米粒的平均粒径(数均值)、PdI、及包封率进行经时测定。将制备时的测定结果示于表5。另外，将对平均粒径(数均值)和包封率进行经时测定的结果示于图14。如图14所示，即使于4℃保存4周，对包含TOT-15的脂质纳米粒的粒径、包封率也没有影响。
[表5]
离子性中性脂质 数均粒径[nm] PdI 包封率[％]
TOT-15 58 0.23 95.1
DSPC 80 0.21 90.5
此外，对Balb/c小鼠(4周龄的雌性)施予刚制造后和保存4周后的各负载有FlucmRNA的脂质纳米粒(0.01mg RNA/kg)，回收从施予起6小时后的小鼠的肝脏，测定Fluc活性(Fluc蛋白的表达量)(RLU/mg蛋白)。将结果示于图15。如图15所示，即使于4℃保存4周，对包含TOT-15的脂质纳米粒的Flu活性也没有影响，表明该脂质纳米粒能够稳定保存至少1个月。
[实施例18]
将使用实施例7中合成的TOT-15的脂质纳米粒作为用于GFP表达的DDS担载体来使用，评价活体组织内GFP表达。采用了使用DSPC的脂质纳米粒作为对照。使用pH敏感性阳离子性脂质、胆固醇及PEG-DMG作为除TOT-15及DSPC以外的脂质。使用CL4F6作为pH敏感性阳离子性脂质。
以CL4F6/TOT/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)、50/20/30/1.5(mol％)、或50/30/20/1.5(mol％)的组成来使用CL4F6、TOT-15、胆固醇及PEG-DMG，利用醇稀释法制作负载了EGFP-mRNA(T riLink公司制、5moU修饰)的脂质纳米粒(负载有EGFPmRNA的脂质纳米粒)。使用DSPC代替TOT-15，除此以外，同样地进行操作，以CL4F6/DSPC/chol/PEG-DMG＝50/10/40/1.5(mol％)的组成来使用，制作负载了EGFP-mRNA的脂质纳米粒(负载有EGFPmRNA的脂质纳米粒)。
通过尾静脉对Balb/c小鼠(4周龄的雌性)施予各负载有EGFPmRNA的脂质纳米粒(1.00mg RNA/kg)。在组织回收10分钟前，将DyLight-649 Lycopersicon(Tomato)Lectin(DyLight 649标记番茄凝集素)以40μg/小鼠进行尾静脉施予，对血管内皮细胞进行荧光标记。从施予负载有EGFPmRNA的脂质纳米粒起24小时后进行安乐死，回收组织。对核进行染色时，将组织的一部份浸于添加有1μg/mL Hoechst33342的PBS(-)中，用冰冷却，在避光下孵育30分钟。用PBS(-)清洗染色后的组织后，通过共聚焦激光扫描显微镜进行观察。将显微镜图像示于图16。该结果可见以下趋势：随着脂质纳米粒的构成脂质中所示的TOT-15的比例的增加，肝实质细胞以外的细胞中的EGFP表达活性也提高。

Claims (16)

1.离子性中性脂质，其包含由下述式(I)表示的化合物：
[化学式1]
式(I)中，R1为碳原子数为1～22的烃基；一分子中存在的3个R1彼此可以为同种的基团，也可以为不同种的基团；a1及a2各自独立地为0～4的整数；b1及b2为满足b1+b2＝1的0或1；R2及R3各自独立地为氢原子或碳原子数为1～3的烷基；R4为阴离子性基团。
2.如权利要求1所述的离子性中性脂质，其中，所述通式(I)中，R4为羧酸基、磺酸基、硫酸酯基或磷酸基。
3.如权利要求1所述的离子性中性脂质，其中，一分子中存在的3个R1全部为相同基团。
4.如权利要求1所述的离子性中性脂质，其中，所述R1为碳原子数为15～22的烃基。
5.如权利要求1所述的离子性中性脂质，其是由下述通式(Z-9)～(Z-15)中的任一者表示的化合物：
[化学式2]
[化学式3]
式中，R1与通式(I)相同。
6.如权利要求1所述的离子性中性脂质，其为(S)-4-氨基-5-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-5-氧代戊酸、2-((4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)二甲基铵基)乙酸盐、2-((3-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-3-氧代丙基)(甲基)铵基)乙酸盐、(S)-3-氨基-4-((1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸、N4-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-天冬酰胺、或N5-(1,3-双(油酰基氧基)-2-((油酰基氧基)甲基)丙烷-2-基)-L-谷氨酰胺。
7.离子性中性脂质，其具有Tris骨架，
在所述Tris骨架的3个氧原子上各自键合有脂肪酸残基，所述脂肪酸残基中，烃链部分的碳原子数为1～22，可以具有1个以上的不饱和键，一分子中的3个所述脂肪酸残基可以为同种的基团，也可以为2种以上的不同的基团，
在所述Tris骨架的1个氮原子上介由具有铵阳离子性基团或季铵阳离子性氮原子的2价连接基团连接有阴离子性基团。
8.脂质纳米粒，其含有权利要求1～7中任一项所述的离子性中性脂质。
9.如权利要求8所述的脂质纳米粒，其还含有固醇及聚亚烷基二醇修饰脂质。
10.如权利要求8所述的脂质纳米粒，其还含有pKa为6.6以下的pH敏感性阳离子性脂质。
11.如权利要求8所述的脂质纳米粒，其含有核酸。
12.如权利要求11所述的脂质纳米粒，其中，所述核酸为siRNA、mRNA或质粒DNA。
13.药物用组合物，其以含有权利要求1～7中任一项所述的离子性中性脂质的脂质纳米粒为有效成分。
14.药物用组合物，其以含有权利要求1～7中任一项所述的离子性中性脂质和核酸的脂质纳米粒为有效成分。
15.如权利要求14所述的药物用组合物，其用于基因治疗。
16.外源基因的表达方法，其中，向受试动物(其中，不包括人)施予包封有能在靶细胞内表达的目标外源基因的权利要求11所述的脂质纳米粒，使所述外源基因在所述受试动物的靶细胞内表达。
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