CN119546748A

CN119546748A - 细胞移植用纤维蛋白凝胶片

Info

Publication number: CN119546748A
Application number: CN202380053547.5A
Authority: CN
Inventors: 杉山洋章; 上野光; 吉原彬文
Original assignee: Qianzhihe Treatment Co
Current assignee: Qianzhihe Treatment Co
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2023-07-13
Publication date: 2025-02-28
Also published as: WO2024014497A1; AU2023307842A1; JPWO2024014497A1; EP4556555A1; AU2023307842A2; IL318270A; KR20250036837A

Abstract

本发明的目的在于提供在具有前所未有的更大尺寸的同时，细胞均匀分散内包而成的细胞移植用纤维蛋白凝胶片及其制造方法，提供细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成，具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸，且具有1mm以下的厚度的细胞移植用纤维蛋白凝胶片及其制造方法。

Description

细胞移植用纤维蛋白凝胶片

技术领域

本发明涉及细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成，并且具有前所未有的大尺寸的细胞移植用纤维蛋白凝胶片，及其制造方法。

发明背景

从诱导性多能干细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞诱导而来的功能性分化细胞被期望作为移植再生医疗的细胞供给源。如今、开发了将这样的功能性分化细胞内包在生物降解性凝胶中而成的各种构造体，并且利用其的细胞移植治疗的研究正在推进。

例如，非专利文献1中，公开了将内包在纤维蛋白凝胶中的胰岛细胞夹在7mm×7mm的大小的Vicryl(注册商标)网(mesh)之间形成的片状构造体，记载了将该构造体移植到作为受体的糖尿病模型大鼠的预先进行了血管生成处理的部位。

非专利文献2中，公开了将内包在包含聚乙烯醇(PVA)的水凝胶中的胰岛细胞夹在20mm×15mm的大小的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)网之间形成的片状构造体，记载了将该构造体移植到作为受体的糖尿病模型大鼠。

专利文献1中，公开了将内包在包含PVA的水凝胶中的胰岛细胞夹在直径15mm的圆形PET网之间形成的片状构造体，记载了将该构造体移植到作为受体的糖尿病模型小鼠。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2018/155622

非专利文献

非专利文献1：Hirotake Komatsu等人、Transplant International 2020；33：806-818.

非专利文献2：Meirigeng Qi等人、Biomaterials.2004Dec；25(27)：5885-92.

发明内容

发明要解决的课题

另一方面，以往报道的功能性分化细胞内包在生物降解性凝胶中而成的片状构造体的目的是用于移植到糖尿病模型动物(大鼠、小鼠)，其尺寸以人等大型哺乳动物为对象时存在尺寸不够的情况，并且存在搭载的细胞数也不足的情况。因此，本领域迫切希望开发具有可用于人等的更大尺寸，并且包含更多细胞的上述构造体。

为解决该问题，本发明者等在尝试用纤维蛋白凝胶制备具有更大尺寸的上述构造体时，发现在试图将用于制作更大尺寸而调配的大量的纤维蛋白凝胶铺展至所需尺寸并成型成片状时，在充分铺展之前就发生凝胶化(固化)，从而难以成型成所需尺寸。另外，在试图将该大量的纤维蛋白凝胶连续注入来成型为具有所需尺寸的片状时，发现溶液中的细胞发生沉淀、从连续注入开始到结束，细胞的含量逐渐减少、结果只能制作出细胞密度不均匀的上述构造体。细胞密度的不均匀存在可能降低治疗效率、并对移植的细胞的长期植入产生影响的隐患，因此不优选。

因此本发明旨在解决本发明人等发现的上述问题，目的在于提供在具有前所未有的大尺寸的同时，均匀分散内包更多细胞而成的片状纤维蛋白凝胶构造体(即，纤维蛋白凝胶片)。

解决课题的方法

本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现在纤维蛋白凝胶的形成中，通过调整纤维蛋白原和凝血酶的配混量和/或凝胶化(固化)时的温度，可以调整形成的纤维蛋白凝胶的凝胶化(固化)速度，能够根据需要铺展成型具有所需的大尺寸的纤维蛋白凝胶片。

另外，在纤维蛋白凝胶的形成中，通过向悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中添加生物降解性粒子并悬浮，或者通过添加生物降解性凝胶化剂并溶解、能够在该纤维蛋白原溶液中抑制细胞沉淀，使细胞维持在均匀分散悬浮的状态、通过将其凝胶化(固化)，即使在通过连续注入进行成型时，也能够得到细胞密度均匀的纤维蛋白凝胶片。

本发明是基于这些新认知的发明，包含以下发明。

[1]一种细胞移植用纤维蛋白凝胶片，其由细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成，其具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、并且具有1mm以下的厚度。

[2]根据[1]的纤维蛋白凝胶片，其中细胞以超过1.5×10⁶个/cm²的量内包。

[3]根据[1]或[2]的纤维蛋白凝胶片，其中细胞为球状体形态。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其中所述细胞为源自iPS细胞的胰岛细胞。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步包含生物降解性凝胶化剂。

[6]根据[5]所述的纤维蛋白凝胶片，其包含0.2～2w/v％的量的生物降解性凝胶化剂。

[7]根据[5]或[6]所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性凝胶化剂为胶原蛋白。

[8]根据[1]～[4]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步内包生物降解性粒子。

[9]根据[8]所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性粒子的尺寸能够通过开口100μm～1000μm。

[10]根据[8]或[9]所述的纤维蛋白凝胶片，其中包含10～30w/v％的量的生物降解性粒子。

[11]根据[8]～[10]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性粒子为明胶凝胶粒子。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步具有载体。

[13]一种制造方法，其为将细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成的具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、并且具有1mm以下的厚度的细胞移植用纤维蛋白凝胶片的制造方法，

该方法包括使悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液与凝血酶作用，而成型为具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、并且具有1mm以下的厚度的片状并使其凝胶化的工序。

[14]根据[13]所述的制造方法，其中所述细胞以纤维蛋白凝胶片中成为超过1.5×10⁶个/cm²的量悬浮在纤维蛋白原溶液中。

[15]根据[13]或[14]所述的制造方法，其中所述细胞为球状体的形态。

[16]根据[13]～[15]中任一项所述的制造方法，其中细胞为源自iPS细胞的胰岛细胞。

[17]根据[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液进一步包含生物降解性凝胶化剂。

[18]根据[17]所述的制造方法，其中悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液以0.2～2w/v％的量包含生物降解性凝胶化剂。

[19]根据[17]或[18]所述的制造方法，其中生物降解性凝胶化剂为胶原蛋白。

[20]根据[17]～[19]中任一项所述的制造方法，其中通过在载体上涂布来成型为片状。

[21]根据[20]所述的制造方法，其中通过生物打印来在载体上涂布。

[22]根据[20]或[21]所述的制造方法，其中载体包含凝血酶。

[23]根据[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液进一步包含生物降解性粒子。

[24]根据[23]所述的制造方法，其中生物降解性粒子的尺寸能够通过开口100μm～1000μm。

[25]根据[23]或[24]所述的制造方法，其中悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液以10～30w/v％的量包含生物降解性粒子。

[26]根据[23]～[25]中任一项所述的制造方法，其中生物降解性粒子为明胶凝胶粒子。

[27]根据[23]～[26]中任一项所述的制造方法，其中通过在载体上涂布来成型为片状。

[28]根据[27]所述的制造方法，其中通过生物打印来在载体上涂布。

[29]根据[27]或[28]所述的制造方法，其中载体包含凝血酶。

[30]根据[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中凝血酶以相对于纤维蛋白原1mg成为0.4U以下的配混比的量作用。

[31]根据[30]所述的制造方法，其中在2～8℃冷却下成型为片状。

[32]根据[30]或[31]所述的制造方法，该方法进一步包含使载体与纤维蛋白凝胶片一体化的工序。

[33]一种细胞移植用纤维蛋白凝胶片的层叠体，其由多个根据[1]～[12]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片层叠而成。

[1a]一种在细胞移植治疗方法中使用的纤维蛋白凝胶片，其由细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成，所述纤维蛋白凝胶片具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、并且具有1mm以下的厚度。

[2a]根据[1a]所述的纤维蛋白凝胶片，其中细胞以超过1.5×10⁶个/cm²的量内包。

[3a]根据[1a]或[2a]所述的纤维蛋白凝胶片，其中细胞为球状体形态。

[4a]根据[1a]～[3a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其中细胞为源自iPS细胞的胰岛细胞。

[5a]根据[1a]～[4a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步包含生物降解性凝胶化剂。

[6a]根据[5a]所述的纤维蛋白凝胶片，其以0.2～2w/v％的量包含生物降解性凝胶化剂。

[7a]根据[5a]或[6a]所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性凝胶化剂为胶原蛋白。

[8a]根据[1a]～[4a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步内包生物降解性粒子。

[9a]根据[8a]所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性粒子的尺寸能够通过开口100μm～1000μm。

[10a]根据[8a]或[9a]所述的纤维蛋白凝胶片，其中以10～30w/v％的量包含生物降解性粒子。

[11a]根据[8a]～[10a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其中生物降解性粒子为明胶凝胶粒子。

[12a]根据[1a]～[10a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片，其进一步具有载体。

[33a]一种在细胞移植治疗方法中使用的纤维蛋白凝胶片的层叠体，其由多个[1a]～[12a]中任一项所述的纤维蛋白凝胶片层叠而成。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的2022年7月14日提交的日本专利申请2022-113546号的说明书和/或附图所记载的内容。

本说明书中引用的所有刊物、专利以及专利申请直接作为参考并入本说明书中。

发明效果

根据本发明，能够提供在具有前所未有的大尺寸的同时，内包更多的均匀分散的细胞而成的纤维蛋白凝胶片及其制造方法。

附图说明

【图1】图1为示出(A)内包iPIC的纤维蛋白凝胶块，和(B)内包iPIC的纤维蛋白凝胶片的外观的照片图。比例尺：10mm。

【图2】图2为示出通过ELISA法经时测定皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白凝胶块、或内包iPIC的纤维蛋白凝胶片的裸大鼠的血中人c-肽浓度的分析结果的图表。

【图3】图3为示出在皮下移植了(A)内包iPIC的纤维蛋白凝胶块、或(B)内包iPIC的纤维蛋白凝胶片的裸大鼠中、移植10天后和6周后移植部位的组织学分析结果的照片图。比例尺：1mm。

【图4】图4为示出凝血酶浓度和纤维蛋白凝胶的凝胶化时间的关系的分析结果的图表。

【图5】图5为示出使用冷却的金属制模具的方法制造的大动物·人尺寸的内包iPIC的纤维蛋白凝胶片的外观(A)以及示出用相差显微镜观察该片的1～4位置的结果(B)的照片图。

【图6】图6为示出悬浮在(A)纤维蛋白原溶液和(B)纤维蛋白原+明胶微球溶液中，静置给定时间后的iPIC的状态的照片图。(A)中的箭头示出iPIC的沉淀。

【图7】图7为示出通过ELISA法经时测定内包iPIC的纤维蛋白凝胶片、或皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片的裸大鼠中血中人c-肽浓度的分析结果的图表。

【图8】图8为示出通过移液管手工操作和用3D打印机制作的大动物·人尺寸的内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片的外观和截面的照片图(A)以及对各片的亮度分布进行图像解析算出标准差的结果(B)，以及示出用3D打印机制作的该纤维蛋白+明胶微球凝胶片的任意的4处(1～4)中包含的细胞数的测定结果的图表(C)。

【图9】图9为示出从注射器排出的纤维蛋白原+胶原蛋白溶液中的细胞数(浓度)的测量结果的图表。

【图10】图10为示出通过ELISA法测定在皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片、或内包iPIC的纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片的裸大鼠中的血中人c-肽浓度的分析结果的图表。

【图11】图11为示出用3D打印机制作的大动物·人尺寸的内包iPIC的纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片的任意的6处(1～6)中包含的细胞数的测定结果的图表。

具体实施方式

1.术语

以下，对本说明书中所记载的术语进行说明。

本说明书中，“约”表示相对于基准值分别在正或负25％、20％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内波动的值。优选地，“约”这样的术语表示相对于基准值分别在正或负15％、10％、5％或1％的范围。

本说明书中，“包括/包含(comprise(s)或comprising)～”意指包括/包含与该语句接续的要素，但不限于此。因此，虽然暗示了包括/包含与该语句接续的要素，但并未暗示排除其它任意要素。

本说明书中，“由～组成(consist(s)of或consisting of)”意指包含且限于与该语句接续的所有要素。因此，“由～组成”这一语句表示所列举的要素是必要或必须的，实质上不存在其它要素。

本说明书中，不“使用饲养细胞”意指基本上不包含饲养细胞、不使用通过培养饲养细胞从而进行了预处理的培养基等。因此，培养基中不包含由饲养细胞分泌的生长因子及细胞因子等物质。

另外，“饲养细胞”或“饲养者”意指与其它种类的细胞共同培养、赋予能够支撑该细胞并使其生长的环境的细胞。饲养细胞可以是与它们所支撑的细胞相同来源，也可以是不同来源。例如，作为人细胞的饲养者，可以使用人皮肤成纤维细胞或人胚胎干细胞，也可以使用小鼠胚胎成纤维细胞的初代培养物及永生小鼠胚胎成纤维细胞。饲养细胞可以通过放射线照射或丝裂霉素C处理等失活。

本说明书中，“粘附”是指细胞附着于容器，例如细胞在适当的培养基的存在下附着于灭菌塑料(或包覆后的塑料)细胞培养皿或烧瓶。细胞之中，也有不粘附于细胞培养容器就无法在培养物中维持或生长的细胞。而非粘附性细胞不粘附于容器仍能在培养物中维持、增殖。

本说明书中，“培养”是指在活体外环境中维持细胞，并使其生长和/或分化。“进行培养”意指在组织或体外，例如在细胞培养皿或烧瓶中使细胞延续、增殖和/或分化。培养包括二维培养(平面培养)、三维培养(悬浮培养)。

本说明书中，“进行纯化(purify)”及“纯化(purification)”是指去除细胞的组合物等组合物中的杂质，使特定的构成成分变得纯净；“纯化后的(purified)”，在用于对细胞的组合物进行说明时，是指杂质的量与纯化前的细胞的组合物中的该构成成分的比例相比减少，特定的构成成分的纯度提高的细胞的组合物。例如，可以对与靶细胞型相关的细胞的组合物等组合物进行纯化，因此，与纯化前的细胞的组合物内存在的靶细胞的比例相比靶细胞型的比例增加。也可以通过本技术领域公知的细胞选择及筛选方法使与靶细胞型相关的细胞的组合物纯化。也可以通过本说明书中记载的特定的筛选或选择流程对细胞的组合物进行纯化。在本发明的特定实施方式中，通过对靶细胞的组合物进行纯化的方法，使靶细胞的组合物的纯度变成至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，或者是可变成无法检出杂质(包含夹杂细胞)的程度。

本说明书中，“增殖因子”为促使特定细胞的分化和/或增殖的内源性蛋白质。作为“增殖因子”，可举出例如：表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、运铁蛋白、各种白细胞介素(例如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(例如粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、各种干扰素(例如IFN-γ等)以及对干细胞有效的其它细胞因子例如干细胞因子(SCF)和促红细胞生成素(Epo)。

本说明书中，“ROCK抑制剂”意指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase)的物质，也可以是抑制ROCK I和ROCK II中任一者的物质。ROCK抑制剂只要具有上述功能就没有特别限定，可举出例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(本说明书中，有时也称为Y27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚烯(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-甲酰胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺(GSK429286A)。ROCK抑制剂不限于以上这些，也可以将ROCK的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与ROCK结合的抗体、显性负ROCK突变体等用作ROCK抑制剂，其可商购或可根据公知的方法合成。

本说明书中，“GSK3β抑制剂”是指对GSK3β(糖原合酶激酶3β)具有抑制活性的物质。GSK3(糖原合酶激酶3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，参与有关糖原的产生或凋亡、干细胞的维持等许多信号传导路径。GSK3存在α和β两种同工型。本发明中使用的“GSK3β抑制剂”只要具有GSK3β抑制活性就没有特别限定，也可以是与GSK3β抑制活性组合并兼具GSK3α抑制活性的物质。

作为GSK3β抑制剂，例示了CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2－基)氨基]乙基]氨基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]-氨基]乙基]氨基]尼古丁腈)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)，SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)，TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合体、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、锂等。GSK3β不限于以上这些，也可以将GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与GSK3β结合的抗体、显性负GSK3β突变体等用作GSK3β抑制剂，其可商购或可根据公知的方法合成。

本说明书中的“血清替代物”可举出例如：KnockOut^TM Serum Replacement(KSR:Thermo Fisher Scientific)，StemSure(注册商标)Serum Replacement(Wako)、B-27补充剂、N2补充剂、白蛋白(例如，富脂质白蛋白)、胰岛素、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体物、痕量元素(例如锌、硒(例如，亚硒酸钠))、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或它们的混合物(例如，ITS-G)。作为血清替代物，优选B-27补充剂、KSR、StemSure(注册商标)Serum Replacement、ITS-G。将血清替代物添加到培养基中时，其在培养基中的浓度按重量计为0.01％-10％、优选按重量计为0.1％-2％。在本发明中，优选使用“血清替代物”来代替血清。

本说明书中，“具有CDK8/19抑制活性的因子”或“CDK8/19抑制剂”意指具有CDK8/19抑制活性的所有物质。相对于同为CDK家族的其它蛋白质，CDK8对于细胞增殖来说是非必需的，CDK8的抑制在通常条件下没有太大的效果。CDK19与CDK8类似，CDK8的抑制通常伴随着CDK19的抑制。“具有CDK8/19抑制活性的因子”可以使用以往公知的因子，这样的CDK8/19抑制剂可以从专利文献或非专利文献中找到。例如US 2012/0071477、WO 2015/159937、WO2015/159938、WO 2013/116786、WO 2014/0038958、WO 2014/134169、JP 2015/506376、US2015/0274726、US2016/0000787、WO 2016/009076、WO 2016/0016951、WO 2016/018511、WO 2016/100782及WO 2016/182904中记载的化合物中，具有CDK8/19抑制活性的化合物或其盐可以用作本发明中的“具有CDK8/19抑制活性的因子。例如，本发明中、(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸二乙基酯、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺酰基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(吗啉基甲基)苯基)丙烯酰胺或其盐可作为“具有CDK8/19抑制活性的因子”来使用。具有CDK8/19抑制活性的因子不限于以上这些，也可以将CDK8/19的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与CDK8/19结合的抗体、显性负CDK8/19突变体等用作具有CDK8/19抑制活性的因子，其可商购或可根据公知的方法合成。

2.细胞移植用纤维蛋白凝胶片

本发明涉及细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成的细胞移植用纤维蛋白凝胶片(以下有时也仅写作“本发明的纤维蛋白凝胶片”)。

本发明的纤维蛋白凝胶片的特征在于具有以往的细胞移植用纤维蛋白凝胶片未能实现的尺寸，片的一个面(即，片的主表面中的任意一个面、也称为片的单面)的表面积为2.25cm²以上、优选为4cm²以上、更优选为9cm²以上、进一步优选为16cm²以上、更进一步优选为25cm²以上、尤其优选为36cm²以上、尤其更优选为49cm²以上、尤其进一步优选为64cm²以上、尤其更进一步优选为81cm²以上、特别优选为100cm²以上，其上限没有特别限定、可以根据移植部位的大小、形状适当选择，但例如可具有400cm²以下的尺寸。

本发明的纤维蛋白凝胶片中的上述表面积的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示，例如，本发明的纤维蛋白凝胶片的上述表面积可以为从2.25cm²以上～400cm²以下、优选为4cm²以上～400cm²以下、更优选为9cm²以上～400cm²以下、进一步优选16cm²以上～400cm²以下、更进一步优选25cm²以上～400cm²以下、尤其优选36cm²以上～400cm²以下、尤其更优选49cm²以上～400cm²以下、尤其进一步优选64cm²以上～400cm²以下、尤其更进一步优选81cm²以上～400cm²以下、特别优选100cm²以上～400cm²以下的范围中适当选择的尺寸。

本发明的纤维蛋白凝胶片的上述一个面的形状没有特别限定，可以根据移植部位的大小、形状适当选择，例如可列举多角形(例如，三角形、四角形、五角形、六角形、八角形等)圆角多角形、圆形、椭圆形等，但不限于这些。

例如，本发明的纤维蛋白凝胶片具有四角形时，其大小为纵向长度为15mm以上、优选为20mm以上、更优选为30mm以上、进一步优选为40mm以上、更进一步优选为50mm以上、尤其优选为60mm以上、尤其更优选为70mm以上、尤其进一步优选为80mm以上、尤其更进一步优选为90mm以上、特别优选为100mm以上，其上限没有特别限定，例如可以为200mm以下。另外，本发明的纤维蛋白凝胶片的横向长度为15mm以上、优选为20mm以上、更优选为30mm以上、进一步优选为40mm以上、更进一步优选为50mm以上、尤其优选为60mm以上、尤其更优选为70mm以上、尤其进一步优选为80mm以上、尤其更进一步优选为90mm以上、特别优选为100mm以上，其上限没有特别限定，例如可以为200mm以下。

该纵向长度以及横向长度的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示、例如，本发明的纤维蛋白凝胶片的大小可以为从(纵向长度×横向长度(也可以是横向长度×纵向长度))、15mm以上～200mm以下×15mm以上～200mm以下、优选20mm以上～200mm以下×20mm以上～200mm以下、更优选30mm以上～200mm以下×30mm以上～200mm以下、进一步优选40mm以上～200mm以下×40mm以上～200mm以下、更进一步优选50mm以上～200mm以下×50mm以上～200mm以下、尤其优选60mm以上～200mm以下×60mm以上～200mm以下、尤其更优选70mm以上～200mm以下×70mm以上～200mm以下、尤其进一步优选80mm以上～200mm以下×80mm以上～200mm以下、尤其更进一步优选90mm以上～200mm以下×90mm以上～200mm以下、特别优选100mm以上～200mm以下×100mm以上～200mm以下的范围中适当选择的大小。例如，本发明的纤维蛋白凝胶片的大小可列举(纵向长度×横向长度(也可以是横向长度×纵向长度))、15mm以上×15mm以上、优选为20mm×20mm、20mm×30mm、或者30mm×30mm、更优选为40mm×40mm、40mm×50mm、50mm×50mm、40mm×60mm、或者60mm×60mm、进一步优选为70mm×70mm、80mm×80mm、90mm×90mm、100mm×100mm、或者200mm×200mm等，但不限于这些。

本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度可以根据内包的细胞的大小、量，移植部位的大小等因素适当设定，优选为1mm以下。通过使本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度为1mm以下，能够高效地向内包在纤维蛋白凝胶片中的细胞供给营养、氧气等，并且在移植后，能够实现纤维蛋白凝胶的迅速分解，因此优选。本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度例如可以为1mm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、或400μm以下，其下限没有特别限定，例如可以为100μm以上、200μm以上、或300μm以上。另外，本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度的范围可以用分别选自上述上限以及上限数值中的2个数值表示、例如，本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度可以为100μm以上～1mm以下、100μm～800μm以下、200μm～600μm以下、或300μm以上～400μm以下，可以从这些范围适当选择作为厚度。例如，本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度为约400μm。需要说明的是，本发明的纤维蛋白凝胶片的厚度不需要整片均匀，只要最厚处在上述范围内即可。

在本说明书中，细胞“均匀分散内包”是指播种的细胞不局限于本发明的纤维蛋白凝胶片的任意部位，而是广泛分布地包含在该纤维蛋白凝胶片中。细胞不必全部包埋在纤维蛋白凝胶片中，但对于播种在纤维蛋白凝胶表面而粘附培养的细胞培养物而言，由于细胞仅局限地存在于纤维蛋白凝胶片的表面，因此其与细胞“分散内包”的方案不同。更具体而言，在本说明书中，细胞“均匀分散内包”是指，本发明的纤维蛋白凝胶片的任意多处(例如，2处、4处、或6处等)的给定范围中包含的各细胞数(细胞密度)的偏差小，优选该各细胞数的值在它们的平均值的±20％以内、优选±15％以内、更优选±10％以内的范围内。另外，在本说明书中，细胞“均匀分散内包”是指播种的细胞之间的位置关系，例如，在纤维蛋白凝胶的表面或内部播种的细胞培养増殖、播种的细胞中不同来源的细胞群相互接触/结合，由于细胞没有分散在播种的细胞之间，因此这不符合细胞“均匀分散内包”的状态。作为这样的播种的细胞之间接触/结合的状态，例如可列举在纤维蛋白凝胶的表面/内部播种·培养而形成的细胞培养物(例如，细胞片等)，这样的方案并不意欲包含在本发明中。另一方面，只要不是这样的播种的细胞之间接触/结合的状态，则并不意欲排除播种的细胞的形态为例如细胞彼此组装·凝集化而成的细胞块或细胞集合体状态、即球状体形态，或播种的细胞发生増殖等。

在本发明中，“细胞”是指用于移植到有需要的患者体内进行细胞治疗的细胞，可根据患者的症状适当选择，例如可列举与构成表皮、神经、大脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰腺、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏、血液等(但不限于这些)器官、组织的细胞及其祖细胞具有相同或相似的功能的细胞。对于“细胞”，可以任意一种单独使用，也可以将不同的细胞组合使用。本发明的纤维蛋白凝胶薄片中细胞的形态没有特别限制，可以是相互分离的细胞(单细胞状态)，可以以细胞彼此组装·凝集化而成的细胞块或细胞集合体状态、即球状体形态存在，也可以是悬浮培养的细胞。作为球状体形态的细胞可列举胰岛细胞、肝细胞和心肌细胞，但不限于这些。

本发明中的“细胞”可以是从生物体采集的细胞，也可以是培养细胞，还可以是将这些细胞冻融的细胞。优选地，本发明中的“细胞”是从多能干细胞分化诱导而得到的源自多能干细胞的细胞。

本说明书中，“多能(pluripotency)”意指能够分化为各种具有不同形态或功能的组织或细胞，且能够分化为三胚层的任一层的细胞的能力。“多能(pluripotency)”不能够分化为胚盘，因此从不具有形成个体的能力的角度来看，区别于能够分化为包括胚盘的生物体所有组织的“全能(totipotency)”。

本说明书中，“多潜能(multipotency)”意指能够分化为多个有限数量的层的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞为多潜能(multipotent)，而非多能(pluripotent)。

本说明书中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及潜在地具有与其同样的分化多能、即分化为生物体各种组织(内胚层、中胚层、外胚层全部)的能力的细胞。可举出“诱导性多能干细胞”(本说明书中，也被称为“iPS细胞”)作为具有与ES细胞同样的分化多能的细胞。优选地，在本发明中，多能干细胞是人多能干细胞。

如果是小鼠ES细胞作为“ES细胞”，可利用由inGenious公司、理化学研究所(理研)等建立的各种小鼠ES细胞株；如果是人ES细胞作为“ES细胞”，可利用由美国国立卫生研究院(NIH)、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如，可以利用NIH的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等；WiCell Research Institute的H1株、H9株；理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等作为ES细胞株。

“诱导性多能干细胞”是指通过将特定的因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞内进行重编程而得到的细胞。目前，有各式各样的“诱导性多能干细胞”，除了山中等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子导入小鼠成纤维细胞内而建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)之外，还可以使用：将同样的四因子导入人成纤维细胞内而建立的源自人细胞的iPS细胞(Takahashi K，YamanakaS.，等人，Cell，(2007)131：861-872.)、在导入上述四因子后，以Nanog的表达作为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.，以及Yamanaka，S.(2007).Nature448，313-317.)、通过不包含c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M，Yamanaka S.，等人，Nature Biotechnology，(2008)26，101-106)、通过无病毒法导入六因子而建立的iPS细胞(Okita K等人，Nat.Methods 2011May；8(5)：409-12，Okita K等人，Stem Cells.31(3)：458-66.)。此外，还可以使用：Thomson等人制作的、导入了OCT3/4、SOX2、NANOG及LIN28四因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.，Thomson JA.等人，Science(2007)318：1917-1920.)、Daley等人制作的诱导性多能干细胞(Park IH，Daley GQ.等人，Nature(2007)451：141-146)、樱田等人制作的诱导性多能干细胞(日本特开第2008-307007号)等。

此外，也可以使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.，Ding S.等人，Cell StemCell，(2008)Vol 3，Issue 5，568-574；Kim JB.，Scholer HR.等人，Nature，(2008)454，646-650；Huangfu D.，Melton，DA.等人，Nature Biotechnology，(2008)26，No7，795-797)、或者专利(例如，日本特开第2008-307007号、日本特开第2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO 2007/069666、WO 2008/118220、WO 2008/124133、WO 2008/151058、WO2009/006930、WO 2009/006997、WO 2009/007852)中记载的所属领域公知的诱导性多能干细胞中的任一种。

可以使用NIH、理化学研究所(理研)、京都大学等建立的各种iPS细胞株作为诱导性多能细胞株。例如，如果是人iPS细胞株，可举出：理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大学的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。

作为在本发明中可使用的源自多能干细胞的细胞，可列举源自iPS细胞的胰岛细胞(以下有时也写作“iPIC”)，但不限于此。iPIC包括胰岛素产生细胞和/或胰岛β细胞。胰岛素产生细胞是由胰岛素和NK6同源框1(NKX6.1)中的至少一种标记的表达进行表征的细胞。胰岛β细胞是比胰岛素产生细胞成熟的细胞，可由MAFA、UCN3和IAPP中的至少一种标记的表达进行表征。“标记”意指“标记蛋白质”、“标记基因”等通过规定的细胞型而特异性地表达的细胞抗原或其基因。优选地，标记为细胞表面标记，此时，可以实施生存细胞的浓缩、分离和/或检出。标记可以是阳性选择标记或阴性选择标记。

标记蛋白质的检出可以利用对该标记蛋白质具有特异性的抗体进行免疫学分析，例如ELISA、免疫染色、流式细胞术来进行。标记基因的检测可以利用所属领域公知的核酸扩增方法和/或核酸检测方法，例如RT-PCR、微阵列、生物芯片等来进行。本说明书中，标记蛋白质为“阳性”意指通过流式细胞术检出为阳性，“阴性”意指通过流式细胞术为检出限界以下。此外，本说明书中，标记基因为“阳性”意指通过RT-PCR被检出，“阴性”意指通过RT-PCR为检出限界以下。

“表达(expression)”定义为由细胞内的启动子所驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

iPIC可以从多能干细胞按照公知方法(WO2009/012428，WO2016/021734，StemCellResearch(2015)14、185-197))进行分化诱导而得到。即，可以利用以下的分化诱导工序而得到iPIC：

步骤1)由多能干细胞分化诱导成定形内胚层细胞；

步骤2)由定形内胚层细胞分化诱导成胃肠道细胞；

步骤3)由胃肠道细胞分化诱导成后前肠细胞；

步骤4)由后前肠细胞分化诱导成胰腺前体细胞；

步骤5)由胰腺前体细胞分化诱导成内分泌前体细胞；以及

步骤6)由内分泌前体细胞分化诱导成iPIC。

以下，对各步骤进行说明，但各细胞的分化诱导不限于这些方法。

步骤1)分化成定形内胚层细胞

首先，使多能干细胞分化成定形内胚层细胞。由多能干细胞诱导出定形内胚层的方法是公知的，也可以使用这些方法中的任一种。优选地，将多能干细胞在包含激活素A的培养基中进行培养，更优选在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中进行培养，以使其分化成定形内胚层细胞。培养开始时的细胞数量没有特别限定，为22000个细胞/cm²～150000个细胞/cm²、优选为22000个细胞/cm²～100000个细胞/cm²、更优选为22000个细胞/cm²～80000个细胞/cm²。培养时间为1至4天、优选为1至3天、特别优选为3天。

培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。

作为本步骤中使用的培养基，可以使用：RPMI 1640培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM/F12培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、改良的MEM/1％B-27/PenisilinStreptomycin培养基、MCDB131/20mM Glucose/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX^TM/抗坏血酸/Penisilin Streptomycin培养基等培养哺乳动物细胞所使用的基础培养基。

培养基中激活素A的浓度通常为30ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL、更优选为70ng/mL～120ng/mL、特别优选为约100ng/mL。

在另一方案中，激活素A可以低用量包含在培养基中，例如5ng/mL～100ng/mL、优选5ng/mL～50ng/mL、更优选5ng/mL～10ng/mL。

在又另一方案中，激活素A在培养基中的浓度为约0.1～100ng/mL、优选为约1～50ng/mL、更优选为约3～10ng/mL。

培养基中GSK3β抑制剂的浓度根据所使用的GSK3β抑制剂的种类适当设定，例如，在将CHIR99021用作GSK3β抑制剂时的浓度通常为2μM～5μM、优选为2μM～4μM、特别优选为约3μM。

培养基中ROCK抑制剂的浓度根据所使用的ROCK抑制剂的种类适当设定，例如，在将Y27632用作ROCK抑制剂时的浓度通常为5μM～20μM、优选为5μM～15μM、特别优选为约10μM。

可以进一步将胰岛素添加到培养基中。胰岛素可以0.01μM～20μM、优选0.1μM～10μM、更优选0.5μM～5μM的量包含在培养基中。培养基中胰岛素浓度可以是添加的B-27补充剂中所包含的胰岛素的浓度，但不限于此。

在特定的方案中，在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中培养1天后、在以仅包含激活素A的培养基每天交换培养基的同时进一步培养2天。或者，可通过在低用量的激活素A的存在下，将多能干细胞在包含0.01μM～20μM胰岛素的培养基中进行第1培养，然后在不含胰岛素的培养基中进行第2培养而制造。

步骤2)分化成胃肠道细胞

将步骤1)中得到的定形内胚层细胞进一步在包含增殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胃肠道细胞。培养时间为2至8天、优选为约4天。

培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。除了増殖因子，血清替代物、维生素、抗生素等也可以适当地添加到培养基中。

作为増殖因子，优选EGF、KGF、FGF10、更优选EGF和/或KGF、进一步优选KGF。

培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF作为增殖因子时的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100ng/mL、特别优选为约50ng/mL。

步骤3)分化成后前肠细胞

将步骤2)中得到的胃肠道细胞进一步在包含增殖因子、环巴胺、头蛋白等的培养基中进行培养，分化诱导成后前肠细胞。培养时间为1至5天、优选为约2天左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。

培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。

培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF作为增殖因子时的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100ng/mL、特别优选为约50n g/mL。

培养基中环巴胺的浓度没有特别限定，但通常为0.5μM-1.5μM、优选0.3μM-1.0μM，特别优选约0.5μM。

培养基中头蛋白的浓度没有特别限定，但通常为10ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL，特别优选为约100ng/mL。

步骤4)分化成胰腺前体细胞

将步骤3)中得到的后前肠细胞进一步在包含具有CDK8/19抑制活性的因子的培养基中进行培养，优选在包含具有CDK8/19抑制活性的因子和增殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胰腺前体细胞。培养时间为2至10天、优选为约5天左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。

在二维培养的情况下，根据先前的报道(Toyoda等人，Stem Cell Research(2015)14，185-197)，将步骤3)中得到的后前肠细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液进行处理，通过移液使其分散于该液中并得到细胞分散液，将得到的分散液进行离心分离，将回收的细胞再悬浮于少量的新鲜培养基中，将此细胞悬浮液再接种到步骤4)的新的培养基中。

可以使用前述各种化合物或其盐作为具有CDK8/19抑制活性的因子，根据所使用的化合物或其盐适当确定添加至培养基的量，通常为约0.00001μM～5μM、优选为0.00001μM～1μM。培养基中具有CDK8/19抑制活性的因子的浓度优选对CDK8/19的抑制活性达到50％及以上的浓度。

作为増殖因子，优选EGF、KGF、FGF10、更优选KGF和/或EGF、进一步优选KGF及EGF。

培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF及EGF作为增殖因子时，EGF的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100n g/mL、特别优选为约50ng/mL；KGF的浓度通常为10ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL、特别优选为约100ng/mL。

步骤4)中的培养的第一天可以在ROCK抑制剂的存在下进行，此后可以在不含ROCK抑制剂的培养基中进行培养。

此外，培养基中还可以包含蛋白激酶C(PKC)活化剂。可使用PDBu(PKC activatorII)、TPB(PKC activator V)等作为PKC活化剂，但不限于此。PKC活化剂的浓度以约0.1ng/mL～100ng/mL、优选约1ng/mL～50ng/mL、更优选约3ng/mL～10ng/mL进行添加。

此外，可以将二甲亚砜和/或激活素(1ng/mL～50ng/mL)添加到培养基中。

在任一步骤中，除了上述成分外，还可以将血清替代物(例如，B-27补充剂、ITS-G)添加到培养基中。此外，根据需要，也可以添加氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(产品名称)、非必需氨基酸、维生素、尼古丁酰胺、抗生素(例如，抗生素-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic)、青霉素、链霉素或它们的混合物)、抗菌剂(例如，两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。当将抗生素添加到培养基中时，其在培养基中的浓度按重量计通常为0.01％～20％，优选按重量计为0.1％～10％。培养可以通过二维培养或三维培养进行。

此外，在细胞培养是二维培养的情况下，不使用饲养细胞，通过粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、OptiCell(产品名称)(Nunc公司)等细胞培养片等培养容器。优选对培养容器进行用于提高与细胞的粘附性(亲水性)的表面处理，或将胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶(例如，BD基质胶(日本贝克顿迪金森公司)、玻连蛋白等用于细胞粘附的基质涂覆其上。优选将涂覆有I型胶原蛋白、基质胶、纤连蛋白、玻连蛋白或聚-D-赖氨酸等的培养容器作为培养容器、更优选将涂覆有基质胶或聚-D-赖氨酸的培养容器作为培养容器。

可以利用作为公知的表面标记的糖蛋白2(GP2)等进一步对步骤4)中得到的胰腺前体细胞进行纯化。可以通过本身已为公知的方法进行上述纯化，例如，使用固定有抗GP2抗体的珠子。

步骤5)分化成内分泌前体细胞

将步骤4)中得到的胰腺前体细胞进一步在包含増殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成内分泌前体细胞。培养可以通过二维培养或三维培养进行。在二维培养的情况下，将步骤4)中得到的胰腺前体细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液进行处理，通过移液使其分散于该液中并得到细胞分散液，将得到的分散液进行离心分离，将回收的细胞再悬浮于少量的新鲜培养基中，将此细胞悬浮液再接种到步骤5)的新的培养基中。培养时间为2至3天、优选为约2天。

培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将SANT1、视黄酸、ALK5抑制剂II、T3、LDN添加到培养基中，进一步地，可以将Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等适量添加到培养基中。

培养不使用饲养细胞，通过非粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞的粘附性的表面处理。

可以利用作为公知的表面标记的糖蛋白2(GP2)等进一步对步骤5)中得到的内分泌前体细胞进行纯化。可以通过本身已为公知的方法进行上述纯化，例如，使用固定有抗GP2抗体的珠子。

步骤6)分化成iPIC

将步骤5)中得到的内分泌前体细胞进一步在包含増殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胰岛素阳性细胞。培养时间为10至30天，优选为约10至20天。

培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-secretase抑制剂XX、γ-secretase抑制剂RO、N-半胱氨酸、AXL抑制剂、抗坏血酸添加到培养基中，进一步，可以将Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等适量添加到培养基中。例如，可以将ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO及抗坏血酸添加到培养基中，或者将T3、ALK5抑制剂II、ZnSO₄、肝素、N-乙酰半胱氨酸、Trolox及R428添加到培养基中。

培养可以通过二维培养或三维培养进行。培养不使用饲养细胞。在三维培养的情况下，通过非粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞的粘附性的表面处理。

培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。

本发明的纤维蛋白凝胶片的特征在于具有以往的细胞移植用纤维蛋白凝胶片未能实现的较多细胞数(高密度的细胞数)，其以每1cm²中超过1.5×10⁶个、优选2×10⁶个以上、更优选2.5×10⁶个以上、进一步优选3×10⁶个以上、更进一步优选4.5×10⁶个以上、尤其优选5×10⁶个以上的量包含细胞，其上限没有特别限定，例如，可以为10×10⁶个以下、优选7×10⁶个以下。本发明的纤维蛋白凝胶片中内包的细胞数的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示、例如，本发明的纤维蛋白凝胶片中可以以超过1.5×10⁶个～10×10⁶个以下/cm²、优选2×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、更优选2.5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、进一步优选3×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、更进一步优选4.5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、尤其优选5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²的范围中适当选择的量包含细胞。

上述iPIC通常以具有100μm～200μm左右大小的细胞块的状态存在，本发明的纤维蛋白凝胶片中以细胞块的个数计以每1cm²超过3000个、优选为4000个以上、更优选为5000个以上、进一步优选为6000个以上、更进一步优选为9000个以上、尤其优选为10000个以上的量包含iPIC、其上限没有特别限定，例如可以为20000个以下、优选14000个以下。本发明的纤维蛋白凝胶片中内包的iPIC(细胞块)的个数的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示，例如，本发明的纤维蛋白凝胶片中可以以超过3000个～20000个以下/cm²、优选4000个以上～20000个以下/cm²、更优选5000个以上～20000个以下/cm²、进一步优选6000个以上～20000个以下/cm²、更进一步优选9000个以上～20000个以下/cm²、尤其优选10000个以上～20000个以下/cm²的范围中适当选择的量包含iPIC(细胞块)。

本发明的纤维蛋白凝胶片、纤维蛋白凝胶可以在适当的溶剂(例如，水、生理盐水等)中通过使纤维蛋白原和凝血酶作用而形成。纤维蛋白凝胶的形成中所用的纤维蛋白原以及凝血酶的量以及两者的混合方法可以基于下文详述的本发明的纤维蛋白凝胶片的制造方法适当决定。

在一个方案中，本发明的纤维蛋白凝胶片进一步内包具有粒子状形态的生物降解性材料(以下有时也写作“生物降解性粒子”)。

本发明中的“生物降解性粒子”通过在下文详述的本发明的纤维蛋白凝胶片的制造方法中和细胞一起添加到纤维蛋白原溶液中、使其悬浮，在该溶液中抑制细胞的沉淀，维持细胞的分散，由此，可以在最终得到的纤维蛋白凝胶片中使细胞分散内包。

作为构成“生物降解性粒子”的生物降解性材料，只要是在生物体内能够通过水解等而分解的物质即可，没有特别限定，例如，可以由选自聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物)(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)(PEVA)、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺、聚羟基丁酸、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚富马酸丙烯酯、聚丙烯酸、聚e-己内酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果胶酸、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、肝素、甲壳素、壳聚糖、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、海藻酸、海藻酸酯、胶原蛋白、纤维素、丝素蛋白、角蛋白、明胶、血纤维蛋白、普鲁兰多糖、层粘连蛋白、结冷胶、硅胶、氨甲酸乙酯、弹性蛋白等及其变形以及它们的组合，优选地，生物降解性粒子由选自明胶、胶原蛋白、透明质酸、羧甲基纤维素、PLA、PGA、PLGA等及其变形以及它们的组合组成的组的凝胶状的生物降解性材料构成。

“生物降解性粒子”的形态只要是在上述溶液中能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散的形态即可，可以具有块状、珠状、颗粒状、片状和凝胶状等任意形态、可以为实心或多孔性。“生物降解性粒子”的形态优选为立体形状，例如可列举球体、四面体、六面体等多面体、圆柱、棱柱、圆锥、圆台、棱锥、棱锥台、圆环体、圆盘体、椭圆体及其变形立体等，但不限于这些。

“生物降解性粒子”的尺寸只要在上述溶液中能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的尺寸即可，可以为能够通过开口为100μm～1000μm、优选100μm～800μm、更优选150μm～400μm、进一步优选200μm左右的尺寸。

在本发明的一个方案中，生物降解性粒子为明胶凝胶，具有能够通过开口200μm的球体形状。

本发明的纤维蛋白凝胶片中包含的生物降解性粒子的量只要是在上述纤维蛋白原溶液中能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的量即可，例如，上述纤维蛋白原溶液中可以以10～30w/v％、优选15～25w/v％、更优选18～22w/v％、进一步优选20w/v％的量包含生物降解性粒子。

需要说明的是，本发明的纤维蛋白凝胶片中、生物降解性粒子可以维持其形态以及形状，或者其一部分或全部可以与纤维蛋白凝胶一体化。

在另一个方案中，本发明的纤维蛋白凝胶片进一步包含生物降解性凝胶化剂。

在本发明中，“生物降解性凝胶化剂”在下文详述的本发明的纤维蛋白凝胶片的制造方法中和细胞一起添加到纤维蛋白原溶液中，赋予该溶液粘性，从而能够在该溶液中抑制细胞的沉淀，维持细胞的分散、由此，可以在最终得到的纤维蛋白凝胶片中使细胞分散内包。

作为“生物降解性凝胶化剂”，只要是作为在生物体内能够通过水解等分解的物质的同时，赋予上述溶液能够抑制细胞的沉淀，维持细胞的分散的粘度，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的生物降解性凝胶化剂即可，没有特别限定，例如，可以使用前述的生物降解性材料(但纤维蛋白除外)。优选地，生物降解性凝胶化剂可以使用选自胶原蛋白、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸肝素蛋白多糖、羧甲基纤维素、海藻酸、纤维素、丝蛋白、角蛋白、明胶、葡聚糖、PEG等及其变形以及它们的组合的生物降解性材料。

本发明的纤维蛋白凝胶片中包含的生物降解性凝胶化剂的量只要是在上述纤维蛋白原溶液中能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的量即可，例如，上述纤维蛋白原溶液中可以以0.2～2w/v％、优选0.4～1.5w/v％、更优选0.5～1w/v％、进一步优选0.75w/v％的量包含生物降解性凝胶化剂。

另外，本发明的纤维蛋白凝胶片可以进一步具有载体。载体在本发明的纤维蛋白凝胶片的制造时和/或使用时支撑该纤维蛋白凝胶片的同时，能够有助于提高该纤维蛋白凝胶片的操作性。载体由前述的生物降解性材料或非生物降解性材料，例如由聚酯(PEs)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、尼龙、丝(不限于这些)构成，具有能够支撑本发明的纤维蛋白凝胶片的任意形状(例如，片状、网状、盘状、机织布状、无纺布状等)。载体可以粘接在本发明的纤维蛋白凝胶片的表面，或者其一部分或全部可以固定在本发明的纤维蛋白凝胶片中。

在本发明的一个方案中，本发明的纤维蛋白凝胶片具有由聚酯或聚乳酸乙醇酸共聚物构成的具有网状形状的载体。

本发明的纤维蛋白凝胶片也可以以多个该纤维蛋白凝胶片层叠而成的层叠体的形态提供。可以是各纤维蛋白凝胶片全部内包相同细胞的层叠体，也可以是一部分或全部为分别内包不同的细胞的纤维蛋白凝胶片的组合构成的层叠体。

3.本发明的纤维蛋白凝胶片的制造方法

本发明还涉及上述本发明的纤维蛋白凝胶片的制造方法(以下有时也写作“本发明方法”)，该方法包括使悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液与凝血酶作用，而成型·凝胶化(固化)为具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸，并具有1mm以下的厚度的片状的工序。纤维蛋白凝胶可以通过在适当的溶剂(例如，水、生理盐水等)中使纤维蛋白原和凝血酶混合并凝胶化(固化)而得到。

纤维蛋白原溶液中细胞均匀分散而悬浮，其细胞量可基于成型后的纤维蛋白凝胶片而决定，即使得纤维蛋白凝胶片每1cm²超过1.5×10⁶个、优选2×10⁶个以上、更优选2.5×10⁶个以上、进一步优选3×10⁶个以上、更进一步优选4.5×10⁶个以上、尤其优选5×10⁶个以上的量而悬浮，其上限没有特别限定，例如使其为10×10⁶个以下、优选为7×10⁶个以下的量而悬浮。纤维蛋白原溶液中悬浮的细胞数的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示、例如，纤维蛋白原溶液中的细胞可以以纤维蛋白凝胶片中超过1.5×10⁶个～10×10⁶个以下/cm²、优选2×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、更优选2.5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、进一步优选3×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、更进一步优选4.5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²、尤其优选5×10⁶个以上～10×10⁶个以下/cm²的范围中适当选择的量悬浮。

本发明方法的一个实施方式中，细胞为iPIC的情况下，纤维蛋白原溶液中的iPIC以细胞块的个数计为使得纤维蛋白凝胶片每1cm²超过3000个、优选为4000个以上、更优选为5000个以上、进一步优选为6000个以上、更进一步优选为9000个以上、尤其优选为10000个以上的量而悬浮，其上限没有特别限定，例如使其为20000个以下、优选为14000个以下的量而悬浮。纤维蛋白原溶液中悬浮的iPIC(细胞块)的个数的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示、例如，纤维蛋白原溶液中可以以使得纤维蛋白凝胶片中超过3000个～20000个以下/cm²、优选为4000个以上～20000个以下/cm²、更优选为5000个以上～20000个以下/cm²、进一步优选为6000个以上～20000个以下/cm²、更进一步优选为9000个以上～20000个以下/cm²、尤其优选为10000个以上～20000个以下/cm²的范围中适当选择的量悬浮iPIC(细胞块)。

成型为纤维蛋白凝胶片时，片的一个面(即，片的主表面中的任意一个面、或者也称为片的单面)的表面积为2.25cm²以上、优选为4cm²以上、更优选为9cm²以上、进一步优选为16cm²以上、更进一步优选为25cm²以上、尤其优选为36cm²以上、尤其更优选为49cm²以上、尤其进一步优选为64cm²以上、尤其更进一步优选为81cm²以上、特别优选为100cm²以上，其上限没有特别限定、可根据移植部位的大小、形状适当选择，例如可以为400cm²以下的尺寸。

成型而得到的纤维蛋白凝胶片中上述表面积的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示，例如，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的上述表面积可以为2.25cm²以上～400cm²以下、优选4cm²以上～400cm²以下、更优选9cm²以上～400cm²以下、进一步优选16cm²以上～400cm²以下、更进一步优选25cm²以上～400cm²以下、尤其优选36cm²以上～400cm²以下、尤其更优选49cm²以上～400cm²以下、尤其进一步优选64cm²以上～400cm²以下、尤其更进一步优选81cm²以上～400cm²以下、特别优选100cm²以上～400cm²以下的范围中适当选择的大小。

通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的上述一个面的形状没有特别限定，可以根据移植部位的大小、形状适当选择，例如可列举多角形(例如，三角形、四角形、五角形、六角形、八角形等)圆角多角形、圆形、椭圆形等，但不限于这些。

通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片具有四角形的情况下，纵向长度为15mm以上、优选为20mm以上、更优选为30mm以上、进一步优选为40mm以上、更进一步优选为50mm以上、尤其优选为60mm以上、尤其更优选为70mm以上、尤其进一步优选为80mm以上、尤其更进一步优选为90mm以上、特别优选为100mm以上，其上限没有特别限定，例如可以为200mm以下，另外，横向长度为15mm以上、优选为20mm以上、更优选为30mm以上、进一步优选为40mm以上、更进一步优选为50mm以上、尤其优选为60mm以上、尤其更优选为70mm以上、尤其进一步优选为80mm以上、尤其更进一步优选为90mm以上、特别优选为100mm以上，其上限没有特别限定，例如可以为200mm以下。

该纵向长度以及横向长度的范围可以用分别选自上述下限以及上限数值中的2个数值表示、例如，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的大小(纵向长度×横向长度(也可以是横向长度×纵向长度))可以为15mm以上～200mm以下×15mm以上～200mm以下、优选为20mm以上～200mm以下×20mm以上～200mm以下、更优选为30mm以上～200mm以下×30mm以上～200mm以下、进一步优选为40mm以上～200mm以下×40mm以上～200mm以下、更进一步优选为50mm以上～200mm以下×50mm以上～200mm以下、尤其优选为60mm以上～200mm以下×60mm以上～200mm以下、尤其更优选为70mm以上～200mm以下×70mm以上～200mm以下、尤其进一步优选为80mm以上～200mm以下×80mm以上～200mm以下、尤其更进一步优选为90mm以上～200mm以下×90mm以上～200mm以下、特别优选为100mm以上～200mm以下×100mm以上～200mm以下的范围中适当选择的大小。例如，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的大小(纵向长度×横向长度(也可以是横向长度×纵向长度))可列举15mm以上×15mm以上、优选为20mm×20mm、20mm×30mm、或者30mm×30mm、更优选为40mm×40mm、40mm×50mm、50mm×50mm、40mm×60mm、或者60mm×60mm、进一步优选为70mm×70mm、80mm×80mm、90mm×90mm、100mm×100mm、或者200mm×200mm等，但不限于这些。

通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度可以根据内包的细胞的大小、量，移植部位的大小等因素适当设定，优选为1mm以下。通过使通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度为1mm以下，能够高效地向内包在纤维蛋白凝胶片中的细胞供给营养、氧气等，并且在移植后，能够实现纤维蛋白凝胶的迅速分解，因此优选。通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度例如可以为1mm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、或400μm以下，其下限没有特别限定，例如可以为100μm以上、200μm以上、或300μm以上。另外，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度的范围可以用分别选自上述上限以及上限数值中的2个数值表示，例如，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度可以为100μm以上～1mm以下、100μm～800μm以下、200μm～600μm以下，或300μm以上～400μm以下，可以为在这些范围中适当选择的厚度。例如，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度可以为约400μm。需要说明的是，通过成型而得到的纤维蛋白凝胶片的厚度不需要整片均匀，只要最厚处在上述范围内即可。

本发明方法的一个方案中，通过调整纤维蛋白原和凝血酶的配混量和/或成型时的温度，可以调整形成的纤维蛋白凝胶的凝胶化(固化)速度，从而能够铺展成型具有所需尺寸的纤维蛋白凝胶片。

本方案中的纤维蛋白原溶液以5～150mg/mL、优选10～80mg/mL、更优选20mg/mL的量包含纤维蛋白原，相对于每1mg纤维蛋白原，凝血酶为0.4U以下、优选为0.3U以下或者0.25U以下、更优选为0.2U以下或者0.15U以下、进一步优选为0.1U以下或者0.08U以下，其下限没有特别限定，以成为0.04U以上配混比的量使其作用。纤维蛋白原和/或凝血酶的配混量多于上述范围的情况下，凝胶化(固化)快速进行，存在难以或无法铺展成型成具有所需尺寸的片状的情况。另一方面，纤维蛋白原和/或凝血酶的配混量少于上述范围的情况下，无法充分凝胶化(固化)，存在难以或无法成型成具有所需尺寸的片状的情况。凝血酶可以以任意形态作用于纤维蛋白原，可以直接添加到纤维蛋白原溶液中，也可以事先用适当的溶剂(例如水、生理盐水等)溶解制成凝血酶溶液之后再与纤维蛋白原溶液混合。

将与凝血酶作用的纤维蛋白原溶液成型为具有所需尺寸和厚度的片状的方法可以使用任意方法，例如，可以使用聚合物片的制造领域中现有公知的任意的成型方法(例如，模具成型、挤出成型、压延成型、吹塑成型等)中的一个或多个的组合来进行，优选通过模具成型进行。在本方案中，与凝血酶作用的纤维蛋白原溶液可以按压铺展成具有所需尺寸和厚度的片状，可以容易地实施模具成型，即，将该纤维蛋白原溶液注入到具有所需尺寸和厚度的片状模具中，根据需要利用刮刀、镘刀等按压铺展成型。

与凝血酶作用的纤维蛋白原溶液的成型在冷却下进行。通过将该纤维蛋白凝胶溶液放置在冷却下，能够抑制凝胶化(固化)的速度，成型为具有所需的尺寸和厚度的片状，更具体而言，能够铺展成型为片状。冷却温度只要是能够使该纤维蛋白凝胶溶液成型为具有所需的尺寸和厚度的片状的温度即可，没有特别限定，例如为2～8℃、优选为2～6℃、更优选为4℃。冷却只要能够使该纤维蛋白凝胶溶液冷却即可，可以冷却该纤维蛋白凝胶溶液，或者也可以冷却与该纤维蛋白凝胶溶液相接触的成型手段(例如，模具等)。

根据需要，在成型的纤维蛋白凝胶溶液凝胶化(固化)之前，也可以使上述载体与纤维蛋白凝胶片一体化。该载体可以粘接在该纤维蛋白凝胶溶液的表面，或者也可以使其一部分或全部浸渍在该纤维蛋白凝胶溶液中。通过将其凝胶化(固化)，可以得到一体化地具有该载体的纤维蛋白凝胶片。

在本发明方法的另外的方案中，可以通过进一步向悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中添加、悬浮“生物降解性粒子”，或者通过添加、溶解“生物降解性凝胶化剂”，可以抑制该纤维蛋白原溶液中的细胞沉淀，使该纤维蛋白原溶液中的细胞维持在均匀分散悬浮的状态，从而能够制造细胞分散内包的纤维蛋白凝胶片。

“生物降解性粒子”可以使用如上定义者，在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的量添加、悬浮，例如，在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以10～30w/v％、优选15～25w/v％、更优选18～22w/v％、进一步优选20w/v％的量添加、悬浮生物降解性粒子。本方案的一个实施方式中、生物降解性粒子为明胶凝胶粒子，具有能够通过开口200μm的球体形状，在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以20w/v％的量添加、悬浮。

“生物降解性凝胶化剂”可以使用如上定义者，在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以能够抑制细胞的沉淀并维持细胞的分散，并且不妨碍本发明的纤维蛋白凝胶片的形成的量添加、悬浮，例如，在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以0.2～2w/v％、优选0.4～1.5w/v％、更优选为0.5～1w/v％、进一步优选0.75w/v％的量添加、溶解生物降解性凝胶化剂。本方案的一个实施方式中、生物降解性凝胶化剂为胶原蛋白、在悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液中以0.75w/v％的量添加、溶解。

本方案中的纤维蛋白原溶液可以以5～150mg/mL、优选20～100mg/mL、更优选80mg/mL的包含纤维蛋白原。凝血酶只要以足以使纤维蛋白原溶液凝胶化(固化)的量作用即可，例如，以相对于纤维蛋白原1mg为0.5～5U、优选1～4U、更优选1.5～3.5U的量作用。凝血酶可以以任意形态作用于纤维蛋白原，可以通过向纤维蛋白原溶液中直接添加，通过预先溶解在适当的溶剂(例如水、生理盐水等)中溶解制成凝血酶溶液之后向纤维蛋白原溶液中添加，通过在下文详述的“基材”中包含凝血酶，或者它们中的多个的组合而作用。在基材中包含凝血酶的情况下，通过将纤维蛋白原溶液涂布在基材上，可以使纤维蛋白原和凝血酶混合。

将悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液成型为具有所需尺寸和厚度的片状的方法可以使用任意方法，例如，可以通过将该纤维蛋白凝胶溶液涂布到适当的基材，利用聚合物片的制造领域中现有公知的任意的成型方法(例如，模具成型、挤出成型、压延成型、吹塑成型等)的一个或多个的组合进行，优选为通过涂布到适当的基材。在本方案中，能够将悬浮的细胞维持均匀分散，因此不仅是在将悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液一次注入时，在将悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液连续注入(从注入开始到结束花费时间进行)时也能容易地成型为细胞均匀分散的片状。

“基材”只要在其表面具有能够形成片的平面即可没有特别限定，优选可利用上述载体作为基材。将悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液涂布到基材可以通过任意方法进行，例如注入、刮刀、镘刀、喷涂、生物打印机(2D或者3D打印机)等中的一种或多种，可以使用手动和/或机械进行，优选使用生物打印机以机械方式进行。

通过本发明的方法制造的本发明的纤维蛋白凝胶片可以在细胞培养用培养基，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、MEM培养基、CMRL培养基等(不限于这些)、缓冲液，例如磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Hanker’s平衡盐溶液(HBSS)等(不限于这些)、等渗液，例如生理盐水等(不限于这些)中保存到其使用时。

4.本发明的纤维蛋白凝胶片的用途

本发明的纤维蛋白凝胶片根据分散内包的上述细胞，具有与构成例如，表皮、神经、脑、脊髓、食道、胃、小肠、大肠、膀胱、尿道、肺、甲状腺、胰脏、肝脏、肌肉、骨骼、心脏、血管、脾脏、肾脏、血液等(不限于这些)器官或组织的细胞或其祖细胞同等或类似的功能，可以用作用于增强或维持这些器官或组织的功能或者用于辅助或补充由于疾病或障碍等原因降低或消失的这些器官或组织的功能的细胞疗法，用于移植到有需要的患者。

作为本发明的一个实施方式，在本发明的纤维蛋白凝胶片包含源自多能干细胞的iPIC的情况下，本发明的纤维蛋白凝胶片可以通过iPIC所分泌的胰岛素或胰高血糖素的作用而改善和/或维持移植到的患者的血糖值(葡萄糖)水平，从而将血糖值控制在正常值。因此，包含iPIC的本发明的纤维蛋白凝胶片可用于有需要改善和/或维持血糖值水平的疾病、障碍、或症状的治疗或预防。作为这样的疾病、障碍、或症状，可列举糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病)、空腹时及食后葡萄糖浓度的变调、低血糖症(例如，糖尿病患者中的通过胰岛素投与的低血糖症)等，但不限于这些。需要说明的是，“治疗”是指疾病、障碍、或症状治疗、治愈、防止或宽解的改善，或、疾病、障碍、或症状的进行速度的减低。另外，“预防”是指使疾病、障碍或症状的发病的可能性、危险性降低，或使疾病、障碍、或症状的发病延迟。

本发明的纤维蛋白凝胶片的移植对象为有需要进行细胞治疗的患者，例如可列举小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴、人类等哺乳动物(不限于这些)，优选为大型哺乳动物，特别优选为人类。

本发明的纤维蛋白凝胶片在移植后纤维蛋白凝胶迅速分解，内包的细胞能够迅速与宿主的组织接触，能够接受氧气、营养等。因此，本发明的纤维蛋白凝胶片能够移植到缺乏血管的组织(例如皮下等)，另外，在移植时不需要事先进行血管生成处理，其不是必须的。

本发明的纤维蛋白凝胶片根据患者的症状、移植部位的大小，可以移植一个或多个片，另外，本发明的纤维蛋白凝胶片由于厚度薄，因此根据需要，也可以层叠多个片进行移植。

以下，通过实施例说明本发明，然而本发明不受这些实施例所限定。

【实施例】

·iPIC的制造

iPIC按照上述工序1)-6)、已报导者(StemCellResearch(2015)14、185-197；NatureBiotechnology2014；32：1121-1133)，从人iPS细胞(Ff-I14-s04株)分化诱导制备得到。

将由人iPS细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞，与分化因子(SANT1、视黄酸、T3、LDN、Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF2)一起，在包含ALK5iII(10μM)的分化诱导培养基(改良的MEM/1％B-27/Penisilin Streptomycin培养基)中培养2天，分化诱导成内分泌前体细胞。

接着，与分化因子(T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO、FGF受体1抑制剂PD-166866)一起，在包含ALK5iII(10μM)的分化诱导培养基(改良的MEM/1％B-27/PenisilinStreptomycin培养基)中培养7天后，与T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO、N-乙酰半胱氨酸、AXL抑制剂R428、抗坏血酸、ROCK抑制剂、ZnSO4、肝素、Trolox一起，在包含ALK5iII(10μM)的分化诱导培养基(MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/PenisilinStreptomycin培养基)中培养4天，分化诱导成iPIC。

得到的iPIC具有500个左右的细胞凝集而成的凝集块(球状体)(直径约150μm)形态。

实施例1：移植形状的评价

＜方法＞

·纤维蛋白凝胶块的制作

将iPIC3x10⁶个细胞(以凝集块计约6000个)分装到1.5mL试管中离心分离之后，除去培养基，添加纤维蛋白原溶液(80mg/mL)25μL，悬浮。之后添加凝血酶溶液(125U/mL)25μL，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的纤维蛋白凝胶块(直径约5mm)。

·纤维蛋白凝胶片的制作

将iPIC3x10⁶个细胞分装到1.5mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加纤维蛋白原溶液(80mg/mL)25μL，悬浮。将悬浮有iPIC的纤维蛋白原溶液薄涂在含浸有凝血酶溶液(125U/mL)12.5μL的聚酯制网(开口率69％、10x10mm)上之后，将凝血酶溶液25μL整体涂布，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的薄层纤维蛋白凝胶片。

·体内评价

将内包iPIC的纤维蛋白凝胶块、内包iPIC的纤维蛋白凝胶片移植到麻醉下的裸大鼠的皮下。移植后，从尾静脉采血分离血浆，通过ELISA法测定了人c-肽浓度。

＜结果＞

图1中示出纤维蛋白凝胶块和纤维蛋白凝胶片的外观。二者中iPIC均保持在凝胶内，未观察到细胞的泄漏。

图2中示出皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白凝胶块、或内包iPIC的纤维蛋白凝胶片的裸大鼠的血中人c-肽浓度的经时测定结果，另外，图3中示出了移植10天后和6周后各移植部位的组织学分析结果。

图2结果显示与以块状移植相比，以片状移植内包iPIC的纤维蛋白凝胶者显示出更高的血中人c-肽浓度值。

另外，从图3示出的移植10天后的组织学分析结果，观察到块状的情况下仅有周边部分的纤维蛋白凝胶发生分解，该部分的iPIC与宿主组织接触，但大部分的纤维蛋白凝胶依然残存，其中观察到未与宿主组织接触的iPIC。另一方面，片状的情况下几乎全部的纤维蛋白凝胶都迅速分解，移植的iPIC与宿主组织接触。

移植6周后，虽然块状移植的凝胶也全部分解，但以片状移植者显示出更高的血中人c-肽浓度值。因此，即使是在使用生物降解性材料的凝胶的情况下，在移植初期凝胶迅速分解，移植细胞与宿主接触，供应上氧气、营养等对于移植细胞的生存是重要的，这表明对之后的长期药效可能产生影响，显示出以薄层片状进行移植的有用性。

实施例2：大动物·人尺寸纤维蛋白凝胶片的制作(制造方法1＿使用冷却的金属制的模具的方法)

＜方法＞

·凝胶化时间的评价

制备纤维蛋白原溶液(40mg/mL)和凝血酶溶液(31U/mL，15.6U/mL，10.4U/mL，5.2U/mL，3.1U/mL)，在1.5mL试管内分别加入440μL，移液1～2次混合后，按照以下标准评价了凝胶化的状态，分析了凝血酶浓度和凝胶化时间的关系。

凝胶化状态的评价标准：

〇：能够在试管内进行移液操作

△：虽然能够进行移液操作，但一部分发生了凝胶化

×：全部发生凝胶化，无法进行移液操作

·大动物·人尺寸纤维蛋白凝胶片的制作

将iPIC45x10⁶个细胞分装到15mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加纤维蛋白原溶液(40mg/mL)360μL，悬浮。之后添加凝血酶溶液(15.6U/mL)360μL后，迅速铺展在预先冷却到4℃的金属制的模具(40x60x0.4mm)上，再放上聚酯制网(开口率69％、尺寸40x10mm)，在室温静置6分钟使其凝胶化。

＜结果＞

分析凝血酶浓度和凝胶化时间的关系，结果发现随着凝血酶浓度降低，凝胶化时间延迟，显示如果为15.6U/mL以下的浓度，则能够确保成型为40x60x0.4mm大小的纤维蛋白凝胶片所需的时间(图4)。

通过将纤维蛋白原溶液(40mg/mL)和凝血酶溶液(15.6U/mL)迅速铺展在金属制的模具上，能够制作可用于大动物·人的40x60x0.4mm尺寸的纤维蛋白凝胶片(图5)。此外，用相差显微镜确认得到的纤维蛋白凝胶片，结果确认到内包的iPIC在任意位置都均匀分散(图5(B)中的iPIC观察为黒色的粒状)。

实施例3大动物·人尺寸纤维蛋白凝胶片的制作(制造方法2-1＿纤维蛋白+明胶微球凝胶片)

＜方法＞

·细胞分散性保持的确认

使用生理盐水将明胶溶解至2w/v％、在4℃冰箱内冷却使其凝胶化后，通过使明胶凝胶通过开口200μm的网，制作了约200μm的明胶凝胶微球(以下写作“明胶微球”)。将明胶微球以20w/v％悬浮在纤维蛋白原溶液(40mg/mL)中，制备了纤维蛋白原+明胶微球溶液。将iPIC悬浮在纤维蛋白原溶液(40mg/mL)以及纤维蛋白原+明胶微球溶液中后静置，通过有无形成沉淀来评价细胞的分散状态的保持。

·体内试验

将iPIC3x10⁶个细胞分装到1.5mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加如上述制备的纤维蛋白原+明胶微球溶液25μL，悬浮。将纤维蛋白原+明胶微球溶液薄涂在含浸有凝血酶溶液(62.5U/mL)12.5μL的聚酯制网(开口率69％、尺寸10x10mm)上之后，将凝血酶溶液25μL整体涂布，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的薄层纤维蛋白+明胶微球凝胶片。

将实施例1所述的内包iPIC的纤维蛋白凝胶片，以及上述内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片移植到麻醉下的裸大鼠的皮下。移植后，从尾静脉采血分离血浆，通过ELISA法测定了人c-肽浓度。

·大动物·人尺寸的制作

将iPIC75x10⁶个细胞分装到15mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加纤维蛋白原+明胶微球溶液600μL，悬浮。将悬浮有iPIC的纤维蛋白原+明胶微球溶液用移液管或3D打印机分别薄涂在含浸有凝血酶溶液(62.5U/mL)300μL的聚酯制网(开口率69％、尺寸40x60mm)以及乙醇酸/乳酸聚酯(90/10、聚(乙交酯-共-L-丙交酯)、尺寸40x60mm)网上，将凝血酶溶液600μL整体涂布，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的薄层的纤维蛋白+明胶微球凝胶片。

＜结果＞

图6中示出纤维蛋白原溶液和纤维蛋白原+明胶微球溶液中悬浮静置的iPIC的状态。在纤维蛋白原溶液(图6(A))中静置10分后确认到iPIC沉淀(箭头)。另一方面，纤维蛋白原+明胶微球溶液(图6(B))中静置30分后也维持了iPIC的分散状态。

另外，制造的内包iPIC的薄层纤维蛋白+明胶微球凝胶片中，iPIC保持在凝胶片内，未观察到细胞的泄漏。

图7示出了皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白凝胶片，或内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片的裸大鼠的血中人c-肽浓度的经时测定结果。该纤维蛋白凝胶片和纤维蛋白+明胶微球凝胶片未观察到血中人c-肽量的显著差异，显示即使在片中使用明胶微球，也不会对iPIC的人c-肽分泌产生负面影响。

图8示出通过移液管手工操作和用3D打印机制作的大动物·人尺寸的内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片。用任一方法都能够制作大动物·人尺寸的该纤维蛋白+明胶微球凝胶片，iPIC保持在凝胶内，未观察到细胞的泄漏(图8(A))。

将通过移液管手工操作和用3D打印机制作的大动物·人尺寸的内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片的亮度分布用图像解析计算出标准差，结果分别为19.437和15.630(图8(B))。这一结果显示用3D打印机制作的能更均匀地涂布纤维蛋白+明胶微球凝胶。此外，在用3D打印机制作的该纤维蛋白+明胶微球凝胶片中的任意的4处挖出直径12mm的圆形，测定其中内包的细胞数，结果确认到几乎相同水平的细胞数(图8(C))。这一结果显示通过使用3D打印机，能够制作细胞均匀分布内包的纤维蛋白+明胶微球凝胶片制作可能。

实施例4：大动物·人尺寸纤维蛋白凝胶片的制作(制造方法2-2＿纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片)

＜方法＞

·细胞分散性保持的确认

将纤维蛋白原溶液(80mg/mL)和胶原蛋白溶液(3w/v％)以3：1的比率混合，制备了纤维蛋白原+胶原蛋白溶液。将iPIC悬浮在纤维蛋白原+胶原蛋白溶液中之后，填充在了注射器内。将注射器筒尖向下地垂直保持，静置0、10、20、30分后分装一定量的排出液，通过测量细胞数(浓度)来评价纤维蛋白原+胶原蛋白溶液的细胞分散性保持性能。

·体内试验

将纤维蛋白原溶液(80mg/mL)和胶原蛋白溶液(3w/v％)以3：1的比率混合，制备了纤维蛋白原+胶原蛋白溶液。将iPIC3x10⁶个细胞分装到1.5mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加纤维蛋白原+胶原蛋白溶液25μL，悬浮。将悬浮有iPIC的纤维蛋白原+胶原蛋白溶液薄涂在含浸有凝血酶溶液(125U/mL)12.5μL的乙醇酸/乳酸聚酯(90/10、聚(乙交酯-共-L-丙交酯))网上之后，将凝血酶溶液25μL整体涂布，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的薄层纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片。

将实施例3的“体内试验”所述的内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片，以及上述内包iPIC的纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片移植到麻醉下的裸大鼠的皮下。移植后，从尾静脉采血分离血浆，通过ELISA法测定了人c-肽浓度。

·大动物·人尺寸的制作

将iPIC75x10⁶个细胞分装到15mL试管中离心分离后，除去培养基上清，添加纤维蛋白原+胶原蛋白溶液600μL，悬浮。将悬浮有iPIC的纤维蛋白原+胶原蛋白溶液用3D打印机薄涂在含浸有凝血酶溶液(125U/mL)300μL的聚(乙交酯-共-L-丙交酯)、尺寸40x60mm)网上之后，将凝血酶溶液600μL整体涂布，静置5分钟使其凝胶化，制作了内包iPIC的薄层纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片。

＜结果＞

图9中示出从注射器排出的纤维蛋白原+胶原蛋白溶液中细胞数(浓度)的测量结果。显示出无论静置时间长短，排出液中的细胞浓度几乎保持不变，即使将注射器垂直保持，iPIC也没有沉淀，排出了几乎恒定数量的细胞。因此，显示出通过使用纤维蛋白原+胶原蛋白溶液，能够维持细胞的分散状态。

另外，在制造的内包iPIC的薄层纤维蛋白原+胶原蛋白片中，iPIC保持在凝胶片内保持，未观察到细胞的泄漏。

图10中示出了皮下移植了内包iPIC的纤维蛋白+明胶微球凝胶片，或内包iPIC的纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片的裸大鼠的血中人c-肽浓度的经时测定结果。该纤维蛋白+明胶微球凝胶片和纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片未观察到血中人c-肽量的显著差异，显示两者具有同等的性能。

可以使用3D打印机制作大动物·人尺寸的该纤维蛋白+胶原蛋白片，iPIC保持在凝胶内，未观察到细胞泄漏。在制作的大动物·人尺寸的该纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片中的任意的6处挖出直径12mm的圆形，测定其中内包的细胞数，结果确认到几乎相同水平的细胞数(图11)。这一结果显示使用纤维蛋白原+胶原蛋白溶液使iPIC悬浮，使用3D打印机进行涂布，能够制作细胞均匀分布内包的纤维蛋白+胶原蛋白凝胶片。

Claims

1.一种细胞移植用纤维蛋白凝胶片，其由细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成，所述纤维蛋白凝胶片进一步包含0.2～2w/v％的量的胶原蛋白、和/或10～30w/v％的量的能够通过100μm～1000μm的明胶凝胶粒子。

2.根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片，其具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、且具有1mm以下的厚度。

3.根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片，其中所述细胞以超过1.5×10⁶个/cm²的量内包。

4.根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片，其中所述细胞为球状体形态。

5.根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片，其中所述细胞为源自iPS细胞的胰岛细胞。

6.根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片，其还具有载体。

7.一种制造方法，其为将细胞均匀分散内包在纤维蛋白凝胶片中而成的细胞移植用纤维蛋白凝胶片的制造方法，

该方法包括使悬浮有所述细胞的纤维蛋白原溶液与凝血酶作用，而成型为片状并使其凝胶化的工序，

其中，悬浮有所述细胞的纤维蛋白原溶液还包含0.2～2w/v％的量的胶原蛋白、和/或10～30w/v％的量的能够通过100μm～1000μm的明胶凝胶粒子。

8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，所述使其凝胶化的工序为使悬浮有细胞的纤维蛋白原溶液与凝血酶作用，而成型为具有一个面的表面积为2.25cm²以上的尺寸、且具有1mm以下的厚度的片状并使其凝胶化。

9.根据权利要求7所述的制造方法，其中所述细胞以纤维蛋白凝胶片中成为超过1.5×10⁶个/cm²的量悬浮在纤维蛋白原溶液中。

10.根据权利要求7所述的制造方法，其中所述细胞为球状体的形态。

11.根据权利要求7所述的制造方法，其中所述细胞为源自iPS细胞的胰岛细胞。

12.根据权利要求7所述的制造方法，其中通过在载体上涂布来成型为片状。

13.根据权利要求12所述的制造方法，其中通过生物打印来在载体上涂布。

14.根据权利要求12所述的制造方法，其中载体包含凝血酶。

15.一种细胞移植用纤维蛋白凝胶片的层叠体，其由多个根据权利要求1所述的纤维蛋白凝胶片层叠而成。