CN119530267A - 一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法。具体为在宿主菌株中，通过CRISPR/Cas9技术实现基因敲除，或/和导入DNA片段，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；所述基因敲除，通过导入含有编码框上下游同源臂的供体DNA实现；所述DNA片段从上游到下游依次包括：上游同源臂、启动子、基因、终止子、下游同源臂；所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。本发明将细胞寿命与产物合成相关联，同时偶联代谢平衡，从而提高目标产物合成效率，为工业化补料发酵奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法。
技术背景
香紫苏醇是一种半日花烷型二萜叔醇，作为天然植物香料，广泛应用于香精香料、医药、化妆品、保健品等领域。特别是，作为名贵香料龙涎香的替代品，香紫苏醇能够用于合成香紫苏醇内酯及降龙涎香醚，具有较高的经济价值和市场应用前景(生物工程学报,2013,29(08):1185-1192)。目前，香紫苏醇的工业化生产主要依赖于植物提取，但是得率低、生长周期长，而且受地理、环境、气候等因素影响，严重阻碍了香紫苏醇的工业化生产与应用。因此，急需开发一种全新的香紫苏醇制备工艺，能够实现高效、清洁、可再生的生产过程。
微生物细胞工厂提供了一种经济和环保的方法，从可再生、廉价的原料中生产高值化学品，包括生物燃料、精细化学品和药用化学品等。近年来，随着功能基因组学、代谢工程和合成生物学的发展，酵母已成为目前一种理想的细胞工厂，广泛应用于目标产物的生物合成过程(Front.Bioeng.Biotechnol.,2020,8:594347)。因此，酵母细胞工厂有望成为香紫苏醇合成的全新技术路线。例如，在酿酒酵母中，通过甲羟戊酸途径系统优化，香紫苏醇产量提高至403mg/L(Metab.eng.2015,27,65-75)。进一步，通过全局转录调控靶点改造，产量达到750mg/L(Microb.Cell Fact.2015,14,60)。相似地，在解脂耶式酵母中，借助系统途径工程改造，结合两相发酵条件优化，在5L发酵罐中批式补料发酵，香紫苏醇产量达到12.9g/L(Green Chem.,2024,26,5202-5210)。申请人团队前期在酿酒酵母中，整合代谢模块切换、模块化途径工程以及调控靶点改造，香紫苏醇产量提高至11.4g/L(Metab.Eng.,2023,75,19-28；申请专利：202111539688.7)。
尽管目前利用传统代谢工程改造，例如途径工程、酶工程等，能够大幅度提升微生物细胞工厂合成香紫苏醇能力。但是，现有技术忽视了一个工业生产过程的关键问题，即长时间发酵过程的细胞活性以及持续生产能力。而细胞活性通常由细胞寿命，包括复制寿命和时序寿命决定(Science,2010,328,321–326)。因此，通过调控细胞寿命能够使产香紫苏醇细胞在长时间补料发酵过程维持较高活性以及高效生产能力，同时偶联途径工程优化，有望进一步突破香紫苏醇合成效率，推动其工业化应用过程。
发明内容
本发明的目标是提高目标产物香紫苏醇的合成效率，进而提出一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为
一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：在宿主菌株中，通过CRISPR/Cas9技术实现基因敲除，或/和导入DNA片段，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；
所述基因敲除，通过导入含有编码框上下游同源臂的供体DNA实现；
所述DNA片段从上游到下游依次包括：上游同源臂、启动子、基因、终止子、下游同源臂；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
通过CRISPR/Cas9技术将以下至少一种寿命调控因子基因敲除；
所述寿命调控因子基因包括Tor1,Sch9,Gpa2,Gpr1,Ras1,Ras2,Bcy1,Tpk1,Tpk3,Hxt1,Hxk2,Vhs1,Reg1,Mig1,Ppg1。
上述设计利用CRISPR/Cas9系统，将靶基因进行无缝敲除。首先，通过融合PCR方法获得donor DNA，包括500bp上游同源臂以及500bp下游同源臂；其次，构建靶向目标基因的gRNA质粒(具体方法可参考发明人前期授权专利ZL 202010428088.2)；然后，将gRNA质粒与donor DNA各500ng转化进入香紫苏醇合成酵母菌株SCX42(Metab.Eng.,2023,75,19-28)。所获得转化子提取基因组DNA用于PCR验证，验证正确的菌株进行香紫苏醇发酵。
而后将上述获得菌株进行发酵培养，发酵培养基为含有20g/L葡萄糖的基础成分培养基，30℃，220rpm培养96h，气相色谱测定香紫苏醇产量。
在进一步，通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(e)中的至少一种DNA片段导入至上述调控寿命调控因子基因所获得菌株作为的宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(e)中的至少一种：
(a)将ERG8基因导入宿主菌株基因组；
(b)将ERG19基因导入宿主菌株基因；
(c)将IDI1基因导入宿主菌株基因组；
(d)将ERG12基因导入宿主菌株基因组；
(e)将EfmvaE和EfmvaS基因同时导入宿主菌株基因组。
再进一步的说，通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(c)中的至少一种DNA片段导入宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(c)中的至少一种：
(a)将ACS1,2基因导入宿主基因组；
(b)将ALD6基因导入宿主基因；
(c)将ADH2基因导入宿主基因。
上述，(a)将ACS1,2基因导入宿主基因组的X-3位点；
(b)将ALD6基因导入宿主基因组的IX-2位点；
(c)将ADH2基因导入宿主基因组的IX-2位点；
所述(a)获得工程菌株使用强组成型启动子PTEF1，所述(b)获得工程菌株使用强组成型启动子PTEF1，所述(c)获得工程菌株使用下述任意一种启动子，启动子为强组成型启动子PTDH3、乙醇诱导型启动子PSSA1、低浓度葡萄糖响应型启动子PHXT7。
所述宿主菌株为酿酒酵母中的任一种或上述记载至少一种DNA片段所获得菌株。
再更进一步的，通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(e)中的至少一种DNA片段导入宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(e)中的至少一种：
(a)以高浓度葡萄糖响应型启动子PHXT1启动ERG9基因表达；
(b)以内源ERG9启动子PERG9启动ERG9基因表达；
(c)以移除了上游激活序列的内源ERG9启动子PERG9-ΔUAS启动ERG9基因表达；
(d)以甲硫氨酸抑制型启动子PMET3启动ERG9基因表达；
(e)将ERG9基因与蛋白降解标签蛋白CLN2融合表达。
所述宿主菌株为酿酒酵母中的任一种或上述记载至少一种DNA片段所获得菌株。
一种所述的方法构建得到的工程菌。
一种所述的工程菌的应用，所述工程菌在制备香紫苏醇中的应用。
本申请能产生的有益效果包括：
本发明调控细胞寿命与代谢途径改造以提高目标产物生物合成效率的方法，首次将细胞寿命与产物合成相关联，。在此基础上，通过协调代谢途径强度，适配内源代谢途径，与外源香紫苏醇合成途径，使产物合成最大化，推动以香紫苏醇为代表的产物工业化生产。
附图说明
图1酿酒酵母营养感知与线粒体功能相关机制图
图2寿命调控策略叠加协调提高香紫苏醇产量
图3基于寿命调控菌株协调MVA途径强度进一步提高产量
图4强化乙醇利用偶联MVA途径优化协同提高香紫苏醇产量
图5弱化ERG9策略优化促进产物批式补料发酵
图6批式补料发酵高效合成香紫苏醇
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
本发明实施例基于香紫苏醇合成菌株SCX42进行改造，该菌株报道于论文Metab.Eng.,2023,75,19-28，但并不对本发明进行特定限制，本发明提供的提高香紫苏醇合成效率的方法适用于任一种酿酒酵母菌株。
实施例1调控细胞寿命提高产物合成效率
为了探究调控细胞寿命对香紫苏醇产量的影响，选择营养感知信号途径以及线粒体自噬途径相关基因进行验证(图1，表3)。分别在菌株SCX42中，按照前文所述的基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，敲除上述基因，获得对应的工程菌株。工程菌株香紫苏醇发酵方法如下：
(1)培养基
YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉；
发酵培养基(基础成分培养基)：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 14.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，维生素(表1)、微量金属(表2)。以KOH调节初始pH为5.6，使用时根据需要选择添加20mg/L尿嘧啶和60mg/L组氨酸。
表1维生素配方表(1000×)
| 试剂 | 浓度(g/L) |
| D-生物素 | 0.05 |
| D-泛酸钙 | 1.0 |
| 硫铵 | 1.0 |
| 吡哆醇 | 1.0 |
| 烟酸 | 1.0 |
| 对氨基苯甲酸 | 0.2 |
| 肌醇 | 25.0 |
表2微量金属配方表(500×)
| 试剂 | 浓度(g/L) |
| FeSO4·7H2O | 3.0 |
| ZnSO4·7H2O | 4.5 |
| CaCl2·2H2O | 4.5 |
| MnCl2·4H2O | 1.0 |
| CoCl2·6H2O | 0.3 |
| CuSO4·5H2O | 0.3 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.4 |
| H3BO3 | 1.0 |
| KI | 0.1 |
| Na2EDTA·2H2O | 19.0 |
(2)实验流程及条件
将工程菌株于YPD平板划线活化，分别挑取单菌落于3/15mL YPD液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养16h；接种，将种子液用发酵培养基清洗2次，按初始OD600＝0.1接种于发酵培养基，装液量为20mL/100mL锥形瓶，30℃，220rpm条件下进行发酵72～96h。定点取样或者终点取样，用于生物量(以600nm处的吸光值表示)和香紫苏醇产量分析
(3)香紫苏醇合成
结果显示，与出发菌株SCX42相比(0.67g/L)，营养感知途径相关以及线粒体自噬负调控因子的缺失对香紫苏醇的产量存在不同程度的影响(表3)。因此，上述结果说明通过调控细胞寿命确实能够提高目标产物的合成效率，可以作为一种全新的代谢工程改造策略，用于高效生物合成过程以及后续产业化放大。
表3调控细胞寿命相关因子敲除对香紫苏醇产量的影响
实施例2策略叠加协同提高香紫苏醇的产量
上述结果显示，线粒体自噬负调控因子Ppg1、营养感知因子Tor1以及Ras2的敲除可以提高香紫苏醇的产量。因此，本研究按照上述记载进一步将这三种因子进行两两组合叠加，验证其能否协调提高香紫苏醇产量。结果显示，tor1Δppg1Δ和ras2Δppg1Δ的组合缺失确实能够进一步提高产量，分别高达1.3g/L和1.2g/L(图2)。
实施例3甲羟戊酸途径优化促进香紫苏醇合成
本发明中，香紫苏醇合成出发菌株SCX42，只对甲羟戊酸(MVA)途径中的关键限速基因ERG10和HMG1,2进行了强化表达(Metab.Eng.,2023,75,19-28)。但是，考虑到上述实施例调控细胞寿命显著提高了产物合成效率，可能导致香紫苏醇合成前体不足，为了使产物合成最大化，进一步通过优化了MVA途径，使其表达强度与寿命优化相协调。以实施例1中产量最高的工程菌株SZL37(tor1Δppg1Δ)为出发菌株，分别单独，或组合表达IDI1、ERG8、ERG19、ERG12、EfmvaE和EfmvaS，序列信息如表4和表5所示。分别在中性位点整合如表4所示基因。整合位点gRNA序列以及位点序列信息参见申请人课题组前期发表文章FEMSMicrobiol.Lett.,2022,369,1-5。
验证正确的菌株参照实施例1的培养条件进行发酵检测。结果如图3所示，单独过表达均对香紫苏醇产量有不同程度的提高，相比出发菌株，提高了4％～11.2％。相似地，过表达基因EfmvaE-EfmvaS也对香紫苏醇产量有轻微促进作用。上述结果说明，通过调控细胞寿命提高了香紫苏醇合成效率，从而导致了前体物质合成不足，通过协调MVA途径可以进一步提高产物产量。
表4MVA途径优化表达盒构建
| 序号 | 基因 | NCBI No. | 启动子 | 终止子 | 位点 |
| 1 | ERG8 | QHB10950.1 | PGAL1,10 | TCYC1 | VI-1 |
| 2 | ERG19 | QHB11421.1 | PGAL1,10 | TIDP1 | VI-1 |
| 3 | IDI1 | QHB12144.1 | PGAL7 | TENO2 | VI-1 |
| 4 | ERG8,IDI1 | / | PGAL1,10,PGAL7 | TCYC1,TENO2 | VI-1 |
| 5 | ERG19,IDI1 | / | PGAL1,10,PGAL7 | TIDP1,TENO2 | VI-1 |
| 6 | ERG8-ERG19 | / | PGAL1,10 | TCYC1,TIDP1 | VI-1 |
| 7 | ERG8-ERG19-IDI1 | / | PGAL1,10,PGAL7 | TCYC1,TIDP1,TENO2 | VI-1 |
| 8 | ERG12 | QHB10938.1 | PGAL2 | TENO2 | X-3 |
| 9 | EfmvaE,EfmvaS | 如表5所示 | PGAL1,10 | TIDP1,TPRM9 | VIII-1 |
表5部分基因、启动子和终止子序列
实施例4强化乙醇利用偶联MVA途径优化协同提高香紫苏醇产量
乙醇是酿酒酵母发酵主要副产物，会影响碳源利用效率，而且乙醇积累较高可能会对细胞生存产生胁迫左右，影响寿命调控因子发挥作用。因此，为了提高菌株乙醇利用能力，进一步在上述SZL37菌株(tor1Δppg1Δ)基础上，强化乙醇利用途径，包括乙醇脱氢酶(ADH2)、乙醛脱氢酶(ALD6)以及乙酰辅酶A合成酶(ACS1,2)。基因序列信息如表6和表7所示所示。整合位点gRNA序列以及位点序列信息参见申请人课题组前期发表文章FEMSMicrobiol.Lett.,2022,369,1-5。
表6乙醇利用途径优化表达盒构建
表7乙醇利用途径优化所需启动子和终止子序列
实验结果如图4所示，仅表达基因ACS1,2时，香紫苏醇产量提高了6％；在此基础上，依次表达基因ALD6和ADH2，香紫苏醇产量均有明显下降。尽管分别利用强组成型启动子PTDH3、乙醇诱导性启动子PSSA1、以及低葡萄糖浓度响应启动子PHXT7表达基因ADH2，但是香紫苏醇产量均没有进一步提高，说明在本发明构建的菌株中，是限速步骤，其余基因表达水平充足。
在此基础上，通过强化乙醇利用途径增加了乙酰辅酶A供给，可能导致MVA途径强度不足，因此，参考实施例3的结果，分别在菌株SGN01和SGN04中过表达关键基因ERG8、ERG19以及EfmvaE-EfmvaS。实验结果图图4所示，当以菌株SGN01为宿主时，过表达基因EfmvaE-EfmvaS，获得菌株SGN10其可显著提高香紫苏醇产量，达到1.7g/L，而其余基因表达无明显效果。
实施例5弱化ERG9策略优化促进产物批式补料发酵
以菌株SCX42作为出发菌株利用高葡萄糖浓度响应启动子PHXT1弱化基因ERG9，对香紫苏醇生产至关重要(Metab.Eng.,2023,75,19-28)。但是，考虑到后续补料发酵过程中，由于持续的葡萄糖补加，其弱化效果可能不稳定，而且，如果长时间控制葡萄糖为较低水平，不利于细胞生长。因此，优化不同的ERG9弱化策略，使其更利于补料发酵过程。
本发明在实施例4最佳菌株SGN10的基础上，将其原本的PHXT1-ERG9分别替换为内源启动子PERG9、移除上游激活序列的内源启动子PERG9-ΔUAS、受甲硫氨酸抑制的启动子PMET3以及与降解标签融合表达ERG9-CLN2(图5)。
(1)菌株构建
以SGN10为出发菌株，首先将内源ERG9基因启动子PERG9进行回补，并以G418作为抗性筛选(kanMX基因)。构建整合DNA片段，包含PERG9片段(上游同源臂)、片段kanMX、片段PHXT1、片段ERG9(下游同源臂)，PCR依次扩增上述DNA片段，然后利用融合PCR将上述片段进行组装，获得完整整合DNA片段PERG9-kanMX-PHXT1-ERG9，取500ng转化进入SGN10菌株中，与YPD+G418平板30℃条件进行培养筛选，获得正确转化子SGN10-kan。
在此基础上，回收kanMX抗性的同时，将采用不同启动子获得相应的donor DNA片段整合到基因组中，具体为依次构建donor DNA：PERG9-ERG9(1018bp)，PERG9-ΔUAS-ERG9(972bp)，PMET3-ERG9(1623bp)，PERG9-ERG9～CLN2(2917bp)，所有donor DNA片段均使用融合PCR技术进行扩增与组装。将靶向kanMX的gRNA质粒与上述donor DNA片段各500ng分别转化进入SGN10-kan中，与SD+His平板30℃条件进行培养筛选，获得的转化子经过PCR鉴定后，分别依次命名为SJQ01，SJQ02，SJQ03，SJQ04。为了进行补料发酵验证，将营养缺陷型基因URA3和HIS3分别进行原位回补至上述转化子(即，SGN10-kan，SJQ01，SJQ02，SJQ03，SJQ04)，分别获得菌株SGN10UH、SJQ01UH、SJQ02UH、SJQ03UH和SJQ04UH。
(2)摇瓶批式补料发酵
摇瓶批式补料发酵采用50mL发酵液/250mL锥形瓶培养体系，选取工程菌SGN10UH、SJQ01UH、SJQ02UH、SJQ03UH和SJQ04UH。批式发酵时采用基础成分培养基Delft(同实施例1)，体积为50mL，接种OD600＝0.2，pH为5.6。补料培养时采用5ⅹDelft培养基(含500g/L的葡萄糖)，待批式发酵葡萄糖消耗完即添加1mL的5ⅹDelft培养基，并且每24h用4mol/L氢氧化钾调pH到5～6。30℃，220rpm条件下发酵213h，测定生物量及香紫苏醇产量。
(3)发酵结果分析
发酵结果如图5所示，5个菌株生长情况无明显差异，最终OD600维持在30～35左右，发酵后期菌株SJQ04略高于其它菌株。测定93h、137h、161h以及213h产物香紫苏醇产量，发酵前期差异不明显，发酵后期，特别是菌株SJQ04产量明显高于最终菌株，213h时，对照菌株SGN10香紫苏醇产量为7.6g/L，而SJQ04达到9.0g/L，说明本发明通过调控寿命因子，使菌株发酵后期生长效率明显提高，同时通过MVA途径、乙醇利用途径以及ERG9弱化策略的系统优化，很好地适配了内源与外源代谢途径强度，进一步促进了产物合成，为后续工业化生产奠定了良好基础。
实施例6批式补料发酵高效合成香紫苏醇
本发明提供了一种提高香紫苏醇合成效率的方法，通过调控细胞寿命延长菌株生物合成过程细胞活性，同时偶联系统代谢工程改造，优化并适配内源途径(MVA途径、乙醇合成以及ERG9弱化)与外源香紫苏醇合成途径，为寿命延长的工程菌株提供充足前体，并减少高浓度乙醇胁迫，进一步提高了生物合成效率。
为了系统比较本发明所提出方法与策略的优势，选取出发菌株SCX42以及本发明构建的工程菌株SZL37和SJQ04，分别回补营养缺陷型基因URA3和HIS3，对应获得菌株SCX42UH、SZL37UH和SJQ04UH，进行上罐批式补料发酵。补料条件与过程与实施例5类似。发酵160h，结果如图6所示。尽管出发菌株SCX42UH生长较好，但是由于乙醇积累以及发酵后期细胞活力下降，香紫苏醇产量增长较慢，发酵终点仅积累12g/L。相比之下，调控细胞寿命菌株SZL37UH(tor1Δppg1Δ)后期能够保持更高的细胞活力和更高效的合成能力，最终香紫苏醇产量提高至15.9g/L，得率达到0.061g/g葡萄糖，较出发菌株分别提高32.5％和22％。在此基础上，由于强化了乙醇利用途径，本发明构建的工程菌株SJQ04UH发酵全程乙醇积累量明显降低，同时偶联寿命调控策略维持了后期持续的产物合成能力，香紫苏醇产量进一步提高至18.9g/L，得率达到0.071g/g葡萄糖，是目前维持报道的微生物合成香紫苏醇的最高产量，为实现香紫苏醇大规模工业化生产奠定了良好基础。
Claims (10)
1.一种提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：在宿主菌株中，通过CRISPR/Cas9技术实现基因敲除，或/和导入DNA片段，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；
所述基因敲除，通过导入含有编码框上下游同源臂的供体DNA实现；
所述DNA片段从上游到下游依次包括：上游同源臂、启动子、基因、终止子、下游同源臂；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
2.根据权利要求1所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：通过CRISPR/Cas9技术将以下至少一种寿命调控因子基因敲除；
所述寿命调控因子基因包括Tor1,Sch9,Gpa2,Gpr1,Ras1,Ras2,Bcy1,Tpk1,Tpk3,Hxt1,Hxk2,Vhs1,Reg1,Mig1,Ppg1。
3.根据权利要求1或权利要求2所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(e)中的至少一种DNA片段导入至上述调控寿命调控因子基因所获得菌株作为的宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(e)中的至少一种：
(a)将ERG8基因导入宿主菌株基因组；
(b)将ERG19基因导入宿主菌株基因；
(c)将IDI1基因导入宿主菌株基因组；
(d)将ERG12基因导入宿主菌株基因组；
(e)将EfmvaE和EfmvaS基因同时导入宿主菌株基因组。
4.根据权利要求3所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(c)中的至少一种DNA片段导入宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(c)中的至少一种：
(a)将ACS1,2基因导入宿主基因组；
(b)将ALD6基因导入宿主基因；
(c)将ADH2基因导入宿主基因。
5.根据权利要求4所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：所述(a)获得工程菌株使用强组成型启动子PTEF1，所述(b)获得工程菌株使用强组成型启动子PTEF1，所述(c)获得工程菌株使用下述任意一种启动子，启动子为强组成型启动子PTDH3、乙醇诱导型启动子PSSA1、低浓度葡萄糖响应型启动子PHXT7。
6.根据权利要求4所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：所述宿主菌株为酿酒酵母中的任一种或上述权利要求3记载至少一种DNA片段所获得菌株。
7.根据权利要求1所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：通过CRISPR/Cas9技术将(a)～(e)中的至少一种DNA片段导入宿主菌株中，调节菌株代谢途径得到相应工程菌株；而后利用所得工程菌株进行生物合成获得香紫苏醇；其中，(a)～(e)中的至少一种：
(a)以高浓度葡萄糖响应型启动子PHXT1启动ERG9基因表达；
(b)以内源ERG9启动子PERG9启动ERG9基因表达；
(c)以移除了上游激活序列的内源ERG9启动子PERG9-ΔUAS启动ERG9基因表达；
(d)以甲硫氨酸抑制型启动子PMET3启动ERG9基因表达；
(e)将ERG9基因与蛋白降解标签蛋白CLN2融合表达。
8.根据权利要求7所述提高香紫苏醇生物合成效率的方法，其特征在于：所述宿主菌株为酿酒酵母中的任一种或上述权利要求7记载至少一种DNA片段所获得菌株。
9.一种权利要求1所述的方法构建得到的工程菌。
10.一种权利要求9所述的工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在制备香紫苏醇中的应用。
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| CN (1) | CN119530267A (zh) |
-
2024
- 2024-07-22 CN CN202410981826.4A patent/CN119530267A/zh active Pending
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