CN119524822A - 一种质谱流式细胞仪的新型悬浮阵列条形码微球制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于质谱流式细胞仪的新型悬浮阵列条形码微球的制备方法，涉及纳米生物技术领域。通过链霉亲和素‑生物素特异性偶联技术，将多种金属纳米颗粒（如金、银、铂及稀土金属纳米颗粒等）可控负载到磁性微球表面，从而制备在质谱流式细胞仪中具有高分辨率和高特异性的质谱编码磁性微球。该方法通过调控金属纳米颗粒的种类和负载浓度，显著扩展悬浮阵列的编码容量，可支持超过上百万种条形码的生成，突破悬浮阵列条形码容量上限。本发明制备的条形码微球具备高通量、高分辨率及高特异性等特点，为复杂生物标志物的高通量筛选及精准医学中的多组分分析提供了创新的技术支撑，具有广泛的临床应用前景。

Description

一种质谱流式细胞仪的新型悬浮阵列条形码微球制备方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，特别是一种用于质谱流式细胞仪的悬浮阵列微球编码方法。通过金属纳米颗粒在磁性微球表面的可控负载实现质谱编码，所得条形码磁性微球在临床分析等高通量检测领域具有广泛的应用前景。

背景技术

悬浮阵列是一种高效的微量化多功能分析平台，具有高检测密度和高通量的优势，广泛应用于基因组学、蛋白质组学等领域。悬浮阵列的核心技术在于通过编码微载体结合多重信号检测平台，实现高选择性的信号解码。然而，传统光学编码策略受限于发光团光谱重叠和能量转移等问题，条形码容量突破困难（目前已报道的条形码容量上限制约为1000种）。近年来，基于无机金属元素的质谱编码手段因其在质谱仪（ICP-TOF-MS）中高分辨率和高选择性的特性，成为悬浮阵列研究的新方向。质谱流式细胞仪能够利用元素周期表中超过34种金属元素作为编码标签，极大提高了编码选择的灵活性和多样性。然而，现有基于金属离子掺杂的微球编码方法受到微球体积限制，条形码种类数仍然有限。因此，开发突破性编码技术，提升悬浮阵列的条形码容量，对于满足日益复杂的生物标志物筛选需求和高通量检测具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种基于链霉亲和素-生物素特异性偶联的金属纳米颗粒负载技术，用于制备质谱流式细胞仪的悬浮阵列条形码磁性微球。通过调控金属纳米颗粒的负载浓度和种类，本方法可以使用元素周期表中所能合成金属纳米颗粒的所有金属元素，理论上可构建容量超过上百万种条形码微球的质谱流式编码库，显著扩展悬浮阵列的编码容量，为多组分生物标志物的高通量筛选和精准诊断提供新的编码技术支撑。

本发明提供的一种质谱流式细胞仪的悬浮阵列条形码微球制备方法，其步骤如下：

（1）金属纳米颗粒合成及功能化修饰：制备金（AuNPs）、银（AgNPs）、铂（PtNPs）及稀土金属纳米颗粒并进行表面修饰；

（2）磁性微球的生物素化和链霉亲和素化改性：优化磁性微球表面特性，提升与金属纳米颗粒的结合效率；

（3）链霉亲和素-生物素特异性结合实现负载编码：通过控制金属纳米颗粒的种类与负载浓度，制备生物功能化条形码磁性微球；

（4）编码磁性微球的生物分析应用：利用编码微球实现多组分生物标志物的高通量检测。

该方法通过多金属纳米颗粒的灵活组合和可控负载，实现了条形码编码的显著扩展，具有高通量、高分辨率、高特异性等优势。

附图说明

图1：金属纳米颗粒负载磁性微球的编码原理；

图2：AuNPs和AgNPs负载磁性微球的编码通道表征及质谱信号分布；

图3：稀土金属纳米颗粒负载磁性微球的TEM表征及编码示意；

图4：AuNPs与AgNPs双重负载的编码示意及信号分布；

图5：金属纳米颗粒的层次负载编码结果；

图6：编码磁性微球在9种抗原标志物高通量免疫分析中的应用结果。

具体实施例

下面将借助实施例更加详细地说明本发明，具体内容如下。本发明的分析方法并不限于下述实施例。

AuNPs、AgNPs、PtNPs及稀土金属纳米颗粒的合成：

（1）AuNPs的合成：将 HAuCl₄（0.01%，w/v）与超纯水在三颈烧瓶中剧烈磁性搅拌混合并保持沸腾10分钟；加入适量体积的柠檬酸钠溶液还原剂实现对HAuCl₄的还原，制备出目标粒径的AuNPs；持续加热回流约20分钟后，将溶液缓慢搅拌冷却至室温，新制的15 nmAuNPs 经聚醚砜（PES）过滤后，储存在4℃下备用；

（2）AgNPs的合成：（A）将柠檬酸盐（约0.2%，w/v）水溶液在70℃的三颈烧瓶中保持搅拌15分钟；（B）制备种子溶液，加入1.7 mL 1%（w/v）AgNO₃和140.3 μL 1% KBH₄并将溶液在70℃下保存约1小时，冷却后，取出备用；（C）在三颈烧瓶中加入75 mL超纯水与2 mL 1%柠檬酸盐溶液，加热至沸腾并回流15分钟。进一步加入10 mL起始种子与1.7 mL 1%（w/v）AgNO₃，保持沸腾回流1小时后，冷却，取出备用；（D）通过循环步骤（E）制备了使用所需的34 nmAgNPs。新制的AgNPs 经聚醚砜（PES）过滤后，储存在4℃下备用；

（3）PtNPs的合成：（A）在三颈烧瓶中加入适量 H₂PtCl₆，超纯水，加热至沸腾并回流1分钟，依次加入柠檬酸盐溶液和硼酸钾溶液进行还原；（B）10分钟后，冷却至室温，取出种子溶液并备用；（C）在三颈烧瓶中加入适量超纯水、PtNPs种子液、1% H₂PtCl₆和柠檬酸与抗坏血酸混合溶液，在搅拌下缓慢升温至沸腾，保持回流15分钟；（D）冷却至室温后取出PtNPs，储存在4℃下备用；

（4）稀土金属纳米颗粒的合成：以合成NaYF₄纳米颗粒为代表：（A）将适量1 mmol氯化钇水合物与甲醇溶液在三颈烧瓶中混合均匀，随后加入适量90%油酸和90% 1-十八烯，在室温下搅拌均匀；（B）通入氩气（Ar），排走体系中的空气，形成绝氧环境；（C）通过加热套将混合溶液在搅拌下缓慢升温至170℃，待溶剂全部挥发后，将温度稳定在约160℃并稳定60分钟；（D）关闭加热，将溶液温度缓慢降至50℃，期间保持Ar氛围；（E）缓慢加入4 mmol氟化铵、2.5 mmol氢氧化钠的甲醇混合液，保持搅拌；（F）缓慢升温至160℃并保持30分钟，期间保持Ar氛围不断，直至无明显沉淀；（G）以10℃/分钟的速度迅速升温到约305℃并在该温度下保持90分钟，期间保持Ar氛围不断；（H）关闭加热，将温度缓慢降至室温，期间保持Ar氛围不断；（I）待溶液降至室温后，将产品倒出至离心管中；（J）溶液离心10分钟，将 NaYF₄纳米颗粒完全沉淀至管底，弃去上清液，加入环己烷重溶；（K）溶液离心10分钟，将 NaYF₄纳米颗粒完全沉淀至管底，弃去上清液，加入环己烷重溶；（L）将纯化步骤再重复2~3次，以保证对NaYF₄纳米颗粒的有效洗涤；（M）最后一次将NaYF₄纳米颗粒沉淀至管底并弃去上清后，加入适量环己烷对沉淀进行重溶和浓缩，将样品转移至棕色玻璃瓶中，放于室温下储存。对其他七种稀土纳米颗粒的合成步骤与上述NaYF₄纳米颗粒的合成步骤类似。

AuNPs、AgNPs及稀土金属纳米颗粒的生物功能化：

（1）AuNPs的链霉亲和素功能化：取1 mL新制的AuNPs，加入适量硼酸缓冲（pH 9.0）将溶液的pH调至弱碱性（pH约在8.4左右）；吹打加入20 μg链霉亲和素，在室温下缓慢振荡孵育1小时；进一步加入含BSA的PBS溶液对AuNPs表面未占据位点进行封闭；链霉亲和素功能化的AuNPs探针通过9000 rpm转速的冷冻离心，将底部的链霉亲和素修饰AuNPs胶体最终重溶于含1% BSA的PBS缓冲液中进行分散至1 mL，并在4℃环境下储存备用；

（2）AgNPs的链霉亲和素功能化：取1 mL新制的AgNPs，通过适当转速的冷冻离心，去除悬浮液，将底部AgNPs胶体最终重溶于0.01 M硼酸缓冲的超纯水溶液中；在移液枪的吹打下加入 20 μg 链霉亲和素，在室温下缓慢振荡孵育1小时；进一步加入含BSA的PBS溶液对AgNPs表面未占据位点进行封闭；链霉亲和素功能化的 AgNPs探针通过适当转速的冷冻离心，将底部胶体最终重溶于含BSA的PBS缓冲液中进行分散至1 mL，并在4℃环境下储存备用；

（3）稀土金属纳米颗粒的生物素功能化：取一个当量的（4-氨基-1-羟基丁烷-1,1-二基）二磷酸于1 mL离心管中，在弱碱性缓冲溶液中溶解，之后加入两个当量Biotin-PEG₄-NHS ester进行偶联，首先制备出生物素-二磷酸偶联剂（linker）；将linker溶液吹打加入新称取的10 mg稀土纳米颗粒中，在常温条件下孵育过夜；将生物素功能化的稀土纳米颗粒探针通过适当转速的冷冻离心并纯化，将底部胶体最终重溶于MES缓冲溶液中。

磁性微球表面的生物素化和链霉亲和素化改性：

（1）磁性微球表面的生物素化改性用于链霉亲和素功能化金属纳米颗粒的表面负载：

对粒径为1 μm的羧基磁性微球表面生物素化改性方案如下：在200 μL离心管中加入200 μg 1 μm的磁性微球；磁性微球表面的羧基用150 mg/mL EDC与25 mg/mL sulfo-NHS在pH 6.5的弱酸条件下活化；用MES缓冲溶液溶解的10% BSA与活化后的磁性微球充分混合，在室温下偶联12小时；BSA标记的磁性微球用10% BSA封闭30分钟，最后用0.01 M的硼酸缓冲超纯水溶液清洗三次备用；在移液枪的吹打下加入适量 Biotin-PEG4-NHS ester，对磁性微球上 BSA 中的氨基进行生物素化改性，在室温下缓慢振荡孵育6小时；使用含1%BSA的PBS溶液对生物素化改性后的1 μm磁性微球进行四次洗涤，之后再使用含0.01%吐温20的PBS溶液（0.01% PBST）对生物素化改性后的1 μm磁性微球进行四次洗涤，重溶于PBS溶液中备用；

对粒径为2.8 μm的氨基化磁性微球表面生物素化改性方案如下：在200 μL离心管中加入200 μg 2.8 μm的磁性微球；在移液枪的吹打下加入适量Biotin-PEG4-NHS ester，对磁性微球上的氨基基团进行生物素化改性，在室温下缓慢振荡孵育6小时；使用含1% BSA的PBS溶液对生物素化改性后的2.8 μm磁性微球进行四次洗涤，之后再使用含0.01%吐温20的PBS溶液（0.01% PBST）对生物素化改性后的2.8 μm磁性微球进行四次洗涤，重溶于PBS溶液中备用；

对粒径为4.5 μm的M-450 环氧树脂化磁性微球表面生物素化改性方案如下：在200 μL离心管中加入400 μg 4.5 μm的磁性微球；在移液枪的吹打下加入适量0.01 M硼酸超纯水溶液溶解的10% BSA，将 BSA偶联至4.5 μm磁性微球表面，这一过程在室温下缓慢振荡孵育12小时；使用含1% BSA的PBS溶液对BSA功能化的4.5 μm磁性微球进行四次洗涤，之后再使用0.01 M硼酸超纯水溶液进行四次洗涤备用；在移液枪的吹打下加入适量 Biotin-PEG4-NHS ester，对磁性微球上 BSA 中的氨基进行生物素化改性，在室温下缓慢振荡孵育6小时；使用含1% BSA的PBS溶液对生物素化改性后的4.5 μm磁性微球进行四次洗涤，之后再使用含0.01%吐温20的PBS溶液（0.01% PBST）对生物素化改性后的4.5 μm磁性微球进行四次洗涤，重溶于PBS溶液中备用；

（2）磁性微球表面的链霉亲和素化改性用于生物素功能化金属纳米颗粒的表面负载：

对粒径为1 μm的羧基磁性微球表面的链霉亲和素化改性方案如下：在200 μL离心管中加入200 μg 1 μm的磁性微球；磁性微球表面的羧基用150 mg/mL EDC与25 mg/mLsulfo-NHS在pH 6.5的弱酸条件下活化；用MES缓冲溶液溶解的20 μg链霉亲和素与活化后的磁性微球充分混合，在室温下偶联12小时；用5 μg链霉亲和素对磁性微球封闭1小时，最后用MES缓冲溶液清洗三次，完成对1 μm磁性微球的链霉亲和素化；

粒径为2.8 μm的链霉亲和素化磁性微球直接从商用途径购买；

对粒径为4.5 μm的M-450 环氧树脂化磁性微球表面链霉亲和素化改性方案如下：在200 μL离心管中加入400 μg 4.5 μm的磁性微球；在移液枪的吹打下加入适量0.01 M硼酸超纯水溶液溶解的 40 μg链霉亲和素，在室温下缓慢振荡孵育12小时；用5 μg链霉亲和素对磁性微球封闭1小时，最后用MES缓冲溶液清洗三 次，完成对4.5 μm磁性微球的链霉亲和素化；

使用链霉亲和功能化AuNPs或AgNPs在生物素化磁性微球表面实现负载编码：

（1）用移液枪吸取适量的生物素化磁性微球溶液于200 μL离心管中，用PBS 缓冲溶液洗涤两次，加入适量的链霉亲和素化AuNPs，在37℃振荡下孵育1小时，实现AuNPs在磁性微球表面的可控负载。通过控制AuNPs的负载浓度，可以实现在不同粒径的生物素化磁性微球表面分别制备出不同负载量的条形码磁性微球。使用含1% BSA的MES溶液对纳米颗粒编码后的磁性微球进行四次洗涤，之后再使用含0.01%吐温20的MES溶液进行四次洗涤，最后将制备出的条形码微球重溶于含1% BSA的MES溶液中备用；

（2）使用AgNPs在生物素化磁性微球表面进行负载编码的方案与 AuNPs方案类似。通过控制AgNPs在磁性微球表面的负载浓度，可以实现在不同粒径的生物素化磁性微球表面分别制备出不同负载量的条形码磁性微球。使用含1% BSA的MES溶液对纳米颗粒编码后的磁性微球进行四次洗涤，之后再使用含0.01%吐温20的MES溶液进行四次洗涤，最后将制备出的条形码微球重溶于含1% BSA的MES溶液中备用。

使用生物素功能化稀土纳米颗粒（所合成的NaYF₄、LaF₃、NaSmF₄、NaEuF₄、NaTbF₄、NaDyF₄、NaHoF₄、NaTmF₄）在链霉亲和素化磁性微球表面进行负载编码:

用移液枪吸取适量的链霉亲和素化磁性微球溶液于200 μL离心管中，用 MES 缓冲溶液洗涤三次，加入适量的生物素功能化化稀土纳米颗粒，在 37℃振荡下孵育1小时。通过控制负载浓度，方法可实现稀土纳米颗粒对磁性微球的负载编码。稀土纳米颗粒编码的磁性微球用含0.01%吐温20的MES缓冲溶液洗涤4次，并加入适量链霉亲和素对磁性微球表面的生物素进行封闭，并最终重溶于含1% BSA的PBS溶液中备用。

质谱流式新型编码微球在多组分免疫分析中的应用：

为了进一步验证金属纳米颗粒编码微球的实际应用效果，开展基于质谱流式的悬浮阵列微球多组分免疫分析；

首先制备抗体功能化的AuNPs/AgNPs两种金属纳米颗粒编码微球用于免疫分析时抗原的捕获：

用移液枪吸取适量表面富有链霉亲和素的金属纳米颗粒编码磁性微球溶液于200μL离心管中，加入生物素化鼠抗人单克隆捕获抗体，在37℃振荡下孵育1小时，完成对编码磁性微球的抗体功能化，重溶于含1% BSA的PBS溶液备用；

其次制备抗体功能化的PtNPs探针用于信号的输出：

取 1 mL 预先离心纯化的 PtNPs，加入适量硼酸缓冲（pH 9.0）将溶液的 pH 调至弱碱性（pH约在8.4左右）；加入适量的鼠抗人单克隆报告抗体混匀，在25℃环境下孵育通过静电吸附的手段偶联过夜；报告抗体功能化的PtNPs探针通过 9000 rpm转速的冷冻离心，去除悬浮液，最终将底部的胶体溶液重溶并混合于含 1% BSA的 PBS缓冲液中进行分散，并在4℃环境下储存备用。

利用抗体功能化条形码微球与抗体功能化PtNPs探针实现高通量多组分免疫分析：

分别准备 9 个批次的200 μL离心管，分别对应9个种类的抗原标志物分析。对于单个批次的离心管，用移液枪吸取适量抗体功能化的编码磁性微球于离心管中，加入适量标准浓度的抗原溶液，并加入抗体功能化的PtNPs探针，在37℃振荡下孵育2小时，完成编码磁性微球对抗原和PtNPs 探针的特异性识别和捕获。免疫反应后，编码磁性微球通过磁铁溶液进行分离，用含0.01%吐温20的PBS洗液对编码磁性微球洗涤8次以去除多于未结合的PtNPs探针；将9个批次的免疫反应同时进行并洗涤完成后，分别吸取适量9个批次中的9种免疫后的编码磁性微球于一个4 mL的离心管中，加入适量超纯水，将9种编码微球的混合溶液进行稀释，以满足质谱流式细胞仪的进样浓度和检测需求，通过气动进样装置将样品送入ICP-TOF-MS中，实现对样品中多种条形码微球信号的同时检测，利用⁵⁷Fe⁺和⁵⁴Fe⁺的信号定位磁性微球，利用微球表面负载的¹⁹⁷Au⁺和¹⁹⁴Pt⁺信号区分出不同的条形码微球，利用不同条形码微球表面捕获的¹⁹⁴Pt⁺信号构建对相应抗原标准浓度直接的线性关系，实现对9种抗原标志物代谢水平的同时分析。

实例1、基于质谱流式细胞仪的金属纳米颗粒编码行为与条形码微球制备效果：

一个理想的基于质谱流式细胞仪悬浮阵列技术的条形码微球库建立取决于两个基本前提：第一，条形码单元（本专利中编码所使用的金属纳米颗粒编码单元）自身必须具有高分辨率，无相互干扰，以实现广泛的条形码编译；其次，基于这些高分辨编码单元所编译的条形码也必须具有高分辨率；如图1所示，展示了本发明专利所呈现的基于链霉亲和素-生物素结合驱动的金属纳米颗粒表面负载实现对质谱流式细胞仪条形码微球制备的原理和过程；

为验证本专利中基于金属纳米颗粒负载编码制备的条形码磁性微球的信号分辨率，用质谱流式细胞仪对制备的条形码微球进行检测。从ICP-TOF-MS宽扫的6-280 m/z离子全谱中同时采集⁵⁴Fe⁺、⁵⁷Fe⁺、⁸⁹Y⁺、¹³⁹La⁺、¹⁵²Sm⁺、¹⁵³Eu⁺、¹⁵⁹Tb⁺、¹⁶⁴Dy⁺、¹⁶⁵Ho⁺、¹⁶⁹Tm⁺、¹⁰⁷Ag⁺、¹⁹⁷Au⁺信号分别实现磁性微球准确定位，条形码的精准区分。如图2（a）所示，所用于条形码微球定位的上述12种金属离子在ICP-TOF-MS中的信号峰彼此分辨率优异，并无谱峰重叠或干扰的情况，满足上述第一前提；

以粒径为14 nm的AuNPs（AuNPs形貌和最大吸收波长表征如图2（b）所示）对磁性微球表面的负载编码为例，通过对条形码微球的解码，如图2（c）所示，分别在三种粒径磁性微球表面共制备出9个信号分辨的条形码通道（取名#101，#102，#103；#201，#202，#203；#301，#302，#303；其中第一位数字代表磁性微球的粒径，“1”为1 μm磁性微球，“2”为2.8 μm磁性微球，“3”为4.5 μm磁性微球；第二位代表AgNPs的负载量相对大小，“1”为低浓度负载，“2”为中浓度负载，“3”为高浓度负载），第三位代表AuNPs的负载量相对大小，“1”为低浓度负载，“2”为中浓度负载，“3”为高浓度负载）。通道的信号分布优异，无相互重叠的情况，满足上述第二前提；

以粒径为34 nm的AgNPs（AgNPs形貌和最大吸收波长表征如图2（d）所示）对磁性微球表面的负载编码为例，通过对条形码微球的解码，如图2（e）所示，分别在三种粒径磁性微球表面共制备出9个信号分辨的条形码通道，通道的信号分布优异，无相互重叠的情况；

为进一步验证该负载编码策略的通用性，探究了8种稀土纳米颗粒在磁性微球表面的负载编码效果。以8种稀土纳米颗粒（8种稀土纳米颗粒的形貌如图3的TEM表征所示）对磁性微球表面的负载编码，通过对条形码微球的解码，如图3所示，分别各在三种粒径磁性微球表面共制备出8个信号分辨的条形码通道，8种稀土纳米颗粒总共编码制备出64种条形码通道，通道的信号分布优异，无相互重叠的情况；

除开上述所探究的单种纳米颗粒在磁性微球表面的负载编码情况（如图4（c）所示），进一步探索了AuNPs和AgNPs两种金属纳米颗粒在磁性微球表面的双重负载编码效果。如图4（a）和（b）所示，分别对名称为#213和#231两种AuNPs-AgNPs双重负载编码的磁性微球进行TEM和STEM元素表征。从数据结果看出，#213和#231两种条形码磁性微球的Fe元素含量相同，Au和Ag元素的分布和含量随着AuNPs和AgNPs的相对负载量比例的差异而具有显著的区别。通过整合AuNPs和AgNPs在三种粒径磁性微球表面的负载编码，总共制备了11种条形码微球，其信号分布如图4（d）所示；其中图4（e）为三种粒径磁性微球的⁵⁴Fe⁺、⁵⁷Fe⁺信号分布；图4（f）为#111，#131，#113的¹⁰⁷Ag⁺、¹⁹⁷Au⁺信号分布；图4（g）为#211，#231，#213，#222的¹⁰⁷Ag⁺、¹⁹⁷Au⁺信号分布；图4（h）为#311，#331，#313，#322的¹⁰⁷Ag⁺、¹⁹⁷Au⁺信号分布；

除开上述所探究的金属纳米颗粒在磁性微球表面进行单层的负载，还探索了金属纳米颗粒在磁性微球表面的层次负载实现对于编码数量突破的可能。以AuNPs的层次负载为例，如图5（a）所示，首先以最大负载量负载一层链霉亲和素功能化的AuNPs在磁性微球表面，接着负载一层生物素功能化的AuNPs，再负载一层链霉亲和素功能化的AuNPs，实现金属纳米颗粒在磁性微球表面的往复层次负载。由于层次负载引入了更多数量的AuNPs，其通过总共负载三层的AuNPs之后，如图5（b）所示，顺利制备出了一种新的条形码磁性微球#204；同理，通过总共负载三层的AgNPs之后，如图5（c）所示，顺利制备出了一种能新的条形码磁性微球#240，完成条形码微球种类的进一步扩增。

实例2、基于质谱流式细胞仪条形码微球的悬浮阵列多组分免疫分析应用：

专利研究了所制备的金属纳米颗粒编码磁性微球在多种癌症蛋白标志物检测中的应用。如图6（a）所示，捕获抗体功能化的金属纳米颗粒编码磁性微球在均匀溶液中会分别基于抗原-抗体识别原理捕获相应的抗原标志物和对应的报告抗体功能化PtNPs探针；所形成的三明治夹芯结构微球通过磁分离与未结合的PtNPs探针分离，经过8轮磁性微球的清晰，并进行适当倍数的稀释，通过单颗粒进样系统（如图6（b）所示）引入ICP-TOF-MS中进行高通量检测。在多组分检测时，如图6（c）所示，分别利用⁵⁴Fe⁺、⁵⁷Fe⁺信号实现对磁性微球的定位（图6（d1）），利用¹⁰⁷Ag⁺、¹⁹⁷Au⁺信号实现对条形码的解码（图6（d2）），绘制癌症标志物的不同浓度下¹⁹⁴Pt⁺信号的信号分布数据，并根据求算平均值（图6（d3）），结合分布平均值构建与抗原浓度之间的线性关系（图6（d4）），求解未知样品的浓度。如图6（e）和（f）所示，所构建的金属纳米颗粒编码磁性微球的悬浮阵列多组分免疫分析策略对9种抗原标志物的检测呈现良好的线性关系（如图7所示）。还开展了9种捕获抗体功能化PtNPs探针在混合抗原标志物样品中的选择性研究，如图6（g）所示，单种PtNPs只识别和结合相应的抗原标志物而产生显著差异的⁹⁴Pt⁺信号值，选择性优异，无明显交叉干扰产生，验证了该质谱流式悬浮阵列的可行性。

Claims (4)

1.一种质谱流式细胞仪的新型悬浮阵列条形码微球制备方法，其特征在于：以粒径为1~5 μm不等的微球为编码对象，以粒径为10~100 nm不等的金属纳米颗粒为编码单元，通过微球表面功能基团与金属纳米颗粒表面功能基团之间的特异性结合，实现金属纳米颗粒在微球表面的可控负载；通过调控同种金属纳米颗粒、不同种金属纳米颗粒在微球表面的相对负载浓度和负载比例，制备出能够在质谱流式细胞仪中产生信号区分、分辨率良好的条形码微球；通过在金属纳米颗粒编码的磁性微球表面修饰上用于生物分析的活性分子，如抗体、核酸、多肽等，可以构建针对相应种类生物标志物的悬浮阵列高通量检测技术。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所使用的质谱流式细胞仪微球编码对象不限于磁性微球，也可以是粒径为1~5 μm不等的聚苯乙烯微球、二氧化硅微球等，能为金属纳米颗粒的负载提供一定负载面积。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所使用的编码单元不限于专利所述的10种金属纳米颗粒，应为所有元素周期表中可以制备成为粒径10~100 nm不等的金属纳米颗粒，因为通过其他种类金属纳米颗粒在微球表面的负载制备用于质谱流式细胞仪的条形码微球是可以预见的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：微球与金属纳米颗粒之间负载所使用的手段不限于链霉亲和素-生物素之间的特异性结合，应为所有可以实现金属纳米颗粒与微球之间负载可以利用的化学、生物偶联手段；所使用的解码平台为质谱流式细胞仪，其也被称为电感耦合等离子体飞行时间质谱（ICP-TOF-MS）。