CN119522232A

CN119522232A - 用于预防和治疗癌症的抗原肽

Info

Publication number: CN119522232A
Application number: CN202380040454.9A
Authority: CN
Inventors: L·谢纳; J·G·马佳赫斯; A·塔尔品; G·库拉科夫斯基; F·斯特罗齐; C·加尔
Original assignee: Enterome SA
Current assignee: Enterome SA
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2023-03-30
Publication date: 2025-02-25
Also published as: AU2023246941A1; MX2024011785A; WO2023187127A1; US20250205324A1; JP2025511086A; EP4499678A1

Abstract

本发明涉及基于抗原的免疫疗法，特别是癌症免疫疗法。特别地，本发明提供了抗原肽，其不同于人肿瘤抗原的片段，但与人肿瘤抗原片段具有氨基酸相似性。本发明还提供了包含此类抗原肽的免疫原性化合物、纳米颗粒、细胞和药物组合物和编码此类抗原肽的核酸。

Description

用于预防和治疗癌症的抗原肽

技术领域

本发明涉及癌症疗法领域，更具体地，涉及免疫治疗方法。特别地，本发明提供了可用于癌症免疫疗法的各种肽。

背景技术

癌症是全世界范围内造成死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织(WHO)的数据，仅在2012年，全球就报告了1400万例新发病例和820万例癌症相关死亡病例，预计未来二十年内新发癌症病例数将增加约70％。到目前为止，全球每年新增病例总数的60％以上发生在非洲、亚洲和中南美洲。这些地区还占世界癌症死亡人数的70％。在男性中，癌症最常见的五个部位是肺、前列腺、结直肠、胃和肝；而在女性中，这些部位是乳腺、结直肠、肺、宫颈和胃。

癌症长期以来一直通过手术、放射疗法、细胞毒性化疗和内分泌调节进行管理，通常按顺序组合使用，以达到最佳的疾病控制效果。然而，这些标准疗法的真正疗效的主要限制在于其特异性不精确，这会导致治疗过程中对正常组织造成附带损害、治愈率低和内在耐药性。

近年来，由于肿瘤和正常细胞表达谱的重大进展，癌症疗法的开发取得了巨大的飞跃，最近的研究和免疫疗法或分子靶向疗法的初步临床结果也开始改变我们对这种疾病的认识。

有前景的抗癌免疫疗法现已成为现实，宿主免疫系统可以识别肿瘤抗原的证据已引导抗癌药物的研发，这些药物现已获得美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)等监管机构的批准。各种治疗方法尤其包括：离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性转移(adoptive transfer)、癌细胞疫苗、免疫刺激细胞因子及其变体、模式识别受体(PRR)激动剂、和靶向肿瘤抗原或免疫检查点的免疫调节单克隆抗体(Galuzzi等人，Classification of current anticancer immunotherapies.Oncotarget.2014年12月30日；5(24):12472-508)。

不幸的是，相当一部分患者仍然对其中一些免疫疗法表现出内在耐药性，甚至在治疗过程中获得了耐药性。例如，据报道，使用抗CTLA-4抗体伊匹单抗(Ipilimumab)治疗不可切除或转移性黑色素瘤的三年存活率为约20％(Snyder等人，Genetic basis forclinical response to CTLA-4blockade in melanoma.N Engl J Med.2014年12月4日；371(23):2189-2199；Schadendorf等人，Pooled Analysis of Long-Term Survival DataFrom Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable orMetastatic Melanoma.J Clin Oncol.2015年6月10日；33(17):1889-94)，而据报道，使用另一种靶向PD-1的检查点抑制剂纳武单抗(Nivolumab)治疗肾细胞癌(RCC)的三年存活率为44％，治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的三年存活率为18％(McDermott等人，Survival,Durable Response,and Long-Term Safety in Patients With Previously TreatedAdvanced Renal Cell Carcinoma Receiving Nivolumab.J Clin Oncol.2015年6月20日；33(18):2013-20；Gettinger等人，Overall Survival and Long-Term Safety ofNivolumab(Anti-Programmed Death 1Antibody,BMS-936558,ONO-4538)in PatientsWith Previously Treated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.J Clin Oncol.2015年6月20日；33(18):2004-12)。因此，基本的药物耐药性对这些免疫疗法的疗效构成了一个固定的障碍。因此，显然需要一种不同的癌症治疗方法来打破这一障碍。

许多接受这些免疫疗法治疗的受试者没有反应可能与抗肿瘤免疫反应缺陷有关(如抗原呈递细胞(APC)的抗原呈递缺陷或T细胞的抗原识别缺陷)。换句话说，对免疫疗法的积极反应与免疫系统发展出能够识别人癌细胞表达的MHC I类限制性抗原的特定淋巴细胞亚群的能力相关(Kvistborg等人，Human cancer regression antigens.Curr OpinImmunol.2013年4月；25(2):284-90)。这一假设得到了数据的有力支持，数据表明，对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)过继性转移的反应与输注到患者中的CD8⁺T细胞数量直接相关(Besser等人，Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in patients withmetastatic melanoma:intent-to-treat analysis and efficacy after failure toprior immunotherapies.Clin Cancer Res.2013年9月1日；19(17):4792-800)。因此，有效的抗肿瘤反应将取决于免疫反应性肽的呈递和足够数量的“经训练”以识别这些抗原的反应性细胞的存在。

基于肿瘤抗原的疫苗接种代表了一种癌症疗法的独特方法，它引起了人们的极大兴趣，因为它可以以特定且持久的方式利用患者自身的免疫系统来识别、攻击和摧毁肿瘤。已知肿瘤细胞确实表达大量易被免疫系统识别的肽抗原。因此，基于此类抗原的疫苗提供了极大的机会，不仅可以提高患者的总体存活率，而且得益于肿瘤抗原的低毒性和低分子量，还可以监测免疫反应和制备GMP级产品。肿瘤抗原的示例尤其包括，从通常沉默的基因或过表达的基因转录的蛋白质的副产物，以及肿瘤病毒表达的蛋白质的副产物(Kvistborg等人，Human cancer regression antigens.Curr Opin Immunol.2013年4月；25(2):284-90)，以及由细胞蛋白的点突变产生的新抗原。后者特别令人感兴趣，因为它们已被证明与接受CTLA-4抑制剂治疗的患者总体存活率增加直接相关(Snyder等人，Genetic basis forclinical response to CTLA-4blockade in melanoma.N Engl J Med.2014年12月4日；371(23):2189-2199；Brown等人，Neo-antigens predicted by tumor genome meta-analysis correlate with increased patient survival.Genome Res.2014年5月；24(5):743-50)。

然而，可用于开发癌症疫苗的人肿瘤抗原数量有限。特别是，源自突变的或修饰的自身蛋白的抗原可能诱导免疫耐受和/或不期望的自身免疫副作用。

因此，本领域需要鉴定替代的癌症治疗方法，以克服该领域遇到的限制。

本发明的目的是满足上述需求。该目的通过下文所述的主题实现，特别是本发明提供的条款和所附权利要求。

发明内容

特别地，本发明特别提供以下条款：

1.抗原肽，其包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。

2.抗原肽，其包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成，其中，任选地，可以替换、缺失或添加一个或两个氨基酸残基。

3.根据条款2所述的抗原肽，其中核心序列被保留。

4.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：17-31中任一项所述的人参考肽的微生物群变体或由其组成。

5.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽由SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列组成。

6.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度为8至15个氨基酸或8至11个氨基酸，优选抗原肽的长度为9或10个氨基酸。

7.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成。

8.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成。

9.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成。

10.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度不超过30个氨基酸。

11.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度不超过25个氨基酸。

12.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度不超过20个氨基酸。

13.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度不超过15个氨基酸。

14.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度不超过11个氨基酸。

15.根据前述条款中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽不是全长(微生物群)蛋白质。

16.免疫原性化合物，其包含根据前述条款中任一项所述的抗原肽。

17.根据条款16所述的免疫原性化合物，其中所述抗原肽与载体分子连接。

18.根据条款17所述的免疫原性化合物，其中所述载体分子是载体蛋白或载体肽。

19.根据条款16-18中任一项所述的免疫原性化合物，其包含式(I)的多肽或由式(I)的多肽组成

PepNt-CORE-PepCt(I)

其中：

-“PepNt”由长度为0至500个氨基酸残基的多肽组成，位于式(I)的多肽的N末端；

-CORE由如条款1-15中任一项所定义的抗原肽组成；以及

-“PepCt”由长度为0至500个氨基酸残基的多肽组成，位于式(I)的多肽的C末端。

20.纳米颗粒，其装载有

-至少一种根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，或

-至少一种根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物；

以及，任选地，装载有佐剂。

21.细胞，其装载有根据条款1-15中任一项所述的抗原肽或根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物。

22.根据条款38所述的细胞，其中所述细胞是抗原呈递细胞，优选树突状细胞。

23.核酸，其编码根据条款1-15中任一项所述的抗原肽、如条款19所定义的式(I)的多肽、或根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物，其中所述免疫原性化合物是肽或蛋白质。

24.根据条款23所述的核酸，其中所述核酸是DNA分子或RNA分子；优选选自基因组DNA；cDNA；siRNA；rRNA；mRNA；反义DNA；反义RNA；核酶；互补RNA和/或DNA序列；具有或不具有表达元件、调节元件和/或启动子的RNA和/或DNA序列；载体；及其组合。

25.宿主细胞，其包含根据条款23或24所述的核酸。

26.根据条款25所述的宿主细胞，其中所述核酸是载体。

27.根据条款25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，优选肠道细菌细胞。

28.(细胞毒性和/或活化的)T淋巴细胞，其特异于根据条款1-15中任一项所述的抗原肽。

29.抗体，其与根据条款1-15中任一项所述的抗原肽结合。

30.T细胞受体，其与根据条款1-15中任一项所述的抗原肽结合。

31.药物组合物，其包含：

-根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，

-根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物，

-根据条款20所述的纳米颗粒，

-根据条款21或22所述的细胞，

-根据条款23或24所述的核酸，

-根据条款25-27中任一项所述的宿主细胞，

-根据条款28所述的T淋巴细胞，

-根据条款29所述的抗体，或

-根据条款30所述的T细胞受体，

以及，任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

32.根据条款31所述的药物组合物，其中所述组合物包含

(i)至少两种不同的根据条款1-15中任一项所述的抗原肽；

(ii)至少两种不同的根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物；

(iii)至少两种不同的根据条款20所述的纳米颗粒；

(iv)至少两种不同的根据条款21或22所述的核酸；或

(v)至少两种不同的根据条款28所述的细胞毒性T淋巴细胞。

33.根据条款32所述的药物组合物，其包含根据(i)-(v)中任一项所述的至少三种或四种不同的组分，优选三种或四种不同的抗原肽。

34.根据条款33项所述的药物组合物，其中所述至少三种或四种不同的活性组分涉及

-包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；和

-包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

35.根据条款31-34中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含-包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；和

-包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽，或包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

36.根据条款31-35中任一项所述的药物组合物，其还包含辅助肽，优选包含根据SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列或由其组成的肽。

37.试剂盒，其包含

-根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，

-根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物，

-根据条款20所述的纳米颗粒，

-根据条款21或22所述的细胞，

-根据条款23或24所述的核酸，

-根据条款25-27中任一项所述的宿主细胞，

-根据条款28所述的T淋巴细胞，

-根据条款29所述的抗体，

-根据条款30所述的T细胞受体，或

-根据条款31-36中任一项所述的药物组合物。

38.根据条款37所述的试剂盒，其还包含包装插页或说明书，其中指导如何使用抗原肽、免疫原性化合物、纳米颗粒、细胞、核酸、宿主细胞、细胞毒性T淋巴细胞和/或药物组合物来预防或治疗癌症。

39.根据条款37或38所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少两种不同的根据条款1-15中任一项所述的抗原肽。

40.至少两种不同的根据条款1-15中任一项所述的抗原肽的组合，用于预防或治疗癌症。

41.根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，用作药物。

42.根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，用于预防或治疗癌症。

43.根据条款1-15中任一项所述的抗原肽、

根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物、

根据条款20所述的纳米颗粒、

根据条款21或22所述的细胞、

根据条款23或24所述的核酸、

根据条款25-27中任一项所述的宿主细胞、

根据条款28所述的T淋巴细胞、

根据条款29所述的抗体、

根据条款30所述的T细胞受体、

根据条款31-36中任一项所述的药物组合物、

根据条款37-39中任一项所述的试剂盒、或

根据条款40所述的组合，

用于医疗，特别是用于预防和/或治疗癌症。

44.一种用于预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长有需要的受试者对癌症的抗肿瘤反应的方法，其包括向受试者施用

-根据条款1-15中任一项所述的抗原肽，

-根据条款16-19中任一项所述的免疫原性化合物，

-根据条款20所述的纳米颗粒，

-根据条款21或22所述的细胞，

-根据条款23或24所述的核酸，

-根据条款25-27中任一项所述的宿主细胞，

-根据条款28所述的T淋巴细胞，

-根据条款29所述的抗体，

-根据条款30所述的T细胞受体，

-根据条款31-36中任一项所述的药物组合物，

-根据条款37-39中任一项所述的试剂盒，或

-根据条款40的组合。

45.肽-MHC(pMHC)多聚体，其包含根据条款1-15中任一项所述的抗原肽。

定义

除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则本文中使用的命名法以及细胞和组织培养技术是本领域公知和常用的。

此类技术在文献中已得到充分阐明，例如Owen等人(Kuby Immunology，第7版，2013年-W.H.Freeman)和Sambrook等人(Molecular cloning:A laboratory manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,2012)。

然而，对于本说明书中不同术语的使用，以下定义更特别适用。

术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”及其变体是指包含至少两个氨基酸的肽、寡肽、多肽或蛋白质，这些氨基酸优选地彼此通过常规的肽键连接，或者可替选地通过修饰的肽键连接，例如在等排(isosteric)肽的情况下。术语“(多)肽”是指肽和/或多肽。特别地，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指通过肽键(-NHCO-)连接在一起的任何长度的氨基酸连续链。肽、多肽和蛋白质可以在体外和/或体内细胞中发挥结构和/或功能作用。术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”优选包括大小范围为2个至至少约1000个氨基酸残基的氨基酸链。术语“肽”在本文中优选包括大小小于约30个氨基酸的氨基酸链，而术语“多肽”和“蛋白质”优选包括大小为至少30个氨基酸的氨基酸链。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。优选地，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”还包括“拟肽”，其定义为含有非肽结构元件的肽类似物，这些肽能够模拟或拮抗天然母体肽的生物作用。拟肽缺乏经典肽特征，例如酶促可裂解的肽键。特别地，肽、多肽或蛋白质可以包含除了遗传密码定义的20种氨基酸以外的氨基酸，或者可以由除了遗传密码定义的20种氨基酸以外的氨基酸组成。特别地，本发明上下文中的肽、多肽或蛋白质同样可以由通过自然过程(例如翻译后成熟过程)或化学过程修饰的氨基酸组成，这些过程是本领域技术人员所公知的。此类修饰在文献中有详细说明。这些修饰可以出现在多肽的任何位置：在肽骨架中、在氨基酸链中，或甚至在羧基或氨基末端。特别地，肽或多肽可以在泛素化后支化，或可以是有或无支链的环状。这种类型的修饰可以是本领域技术人员公知的天然的或合成的翻译后过程的结果。本发明上下文中的术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”特别还包括修饰的肽、多肽和蛋白质。例如，肽、多肽或蛋白质修饰可以包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、糖基化(包括聚乙二醇化)、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(seneloylation)、硫酸化、氨基酸添加(例如精氨酸化)或泛素化。此类修饰在文献中有充分的详细说明(Proteins Structure and MolecularProperties(1993)第二版，T.E.Creighton，New York；Post-translational CovalentModifications of Proteins(1983)B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York；Seifter等人(1990)Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646和Rattan等人，(1992)Protein Synthesis:Post-translational Modifications and Aging,Ann NY Acad Sci,663:48-62)。因此，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”优选包括例如脂肽、脂蛋白、糖肽、糖蛋白等。

优选地，(多)肽或蛋白质是“经典的”(多)肽或蛋白质，其中“经典的”(多)肽或蛋白质通常由选自遗传密码定义的20种氨基酸的氨基酸组成，这些氨基酸通过正常的肽键相互连接。

如本领域所公知的，肽、多肽和蛋白质可以由核酸编码。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”在本文中可互换使用，是指天然核苷酸(例如，A、T、G、C和U)或合成核苷酸的精确连续，即形成至少两个核苷酸的链。特别地，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”是指DNA或RNA。核酸优选包括单链、双链或部分双链的DNA或RNA，优选选自基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)、核糖体DNA(rDNA)和所述DNA的转录产物，例如RNA。核酸的优选示例包括核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)；反义DNA、反义RNA；互补RNA和/或DNA序列、核酶、(互补)RNA/DNA序列(具有或不具有表达元件)、载体；小基因(mini-gene)、基因片段、调控元件、启动子及其组合。进一步优选的核酸(分子)和/或多核苷酸的示例包括，例如，重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、RNA分子(例如rRNA、mRNA或转运RNA(tRNA))，或如上所述的DNA分子。因此，优选的核酸(分子)是DNA分子或RNA分子；优选选自gDNA；cDNA；rRNA；mRNA；反义DNA；反义RNA；互补RNA和/或DNA序列；具有或不具有表达元件、调节元件和/或启动子的RNA和/或DNA序列；载体；及其组合。本领域技术人员能够确定可以编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的(多)肽和/或核酸可以通过本领域已知的任何方法制备，包括但不限于任何合成方法、任何重组方法、任何离体生成方法等，以及它们的任何组合。这些技术在上述文献中已充分阐明。

如本文所用，术语“抗原肽”是指在施用该肽的受试者中易于诱导/引发、增加、延长或维持免疫反应的肽。特别地，抗原肽是(人)肿瘤抗原(的片段/表位)的序列变体。换句话说，抗原肽优选不同于(人)肿瘤抗原(的片段/表位)，但优选与(人)肿瘤抗原(的片段/表位)具有氨基酸相似性。重要的是，抗原肽与(人)肿瘤抗原的相应(片段/表位)共有相同的核心序列。优选地，抗原肽诱导/引发、增加、延长或维持的免疫反应(也)靶向(人)肿瘤抗原的相应(片段/表位)。

如本文所用，术语“肿瘤抗原”包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。一般而言，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤蛋白”在本文中是指抗原物质，其在肿瘤细胞中产生，有时也在正常细胞中产生，并且可以在受试者中施用后引发免疫反应。在人中，已根据这些抗原的表达模式、功能或遗传来源对其进行分类，包括但不限于过表达的自身抗原(例如BIRC5)；癌睾丸(CT)抗原(例如MAGE-1)；突变抗原，也称为新抗原(例如来自p53的突变体)；组织特异性分化抗原(例如黑色素瘤抗原Melan A/MART-1)；由肿瘤病毒表达的病毒抗原(例如HPV、EBV)；癌胚抗原(例如甲胎蛋白AFP和癌胚抗原CEA)；和通用抗原(端粒酶)。

如本文所用，术语“核心序列”是指序列中间的氨基酸(也称为序列的“中心氨基酸”)，例如抗原肽和/或(参考)表位中间的氨基酸。因此，核心序列由除了两个最N末端氨基酸和两个最C末端氨基酸之外的所有氨基酸组成。例如，在九个氨基酸的肽中(例如本发明的抗原肽或(人)肿瘤抗原的相应(片段/表位))，五个中间氨基酸代表核心序列，并且改变仅可以发生在两个N末端和两个C末端氨基酸位置中的任何一个上。因此，“共有的核心序列”(或“保留的”核心序列)通常意味着仅允许在(参考)表位/序列的两个最N末端氨基酸和两个最C末端氨基酸中发生突变/差异。

如本文所用，术语“微生物群(microbiota)”是指迄今为止研究的所有多细胞生物(从植物到动物)中发现的共生微生物。特别是，发现微生物群对其宿主的免疫稳态、激素稳态和代谢稳态至关重要。微生物群包括细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒。因此，“微生物群序列变体”(或“微生物群变体”)是(人)参考序列(特别是人肿瘤抗原的表位/片段)的序列变体，其存在于微生物群中，例如存在于细菌中(例如，它可能包含在微生物群蛋白质中，例如包含在细菌蛋白质中)。优选地，本发明的抗原肽是(人B细胞肿瘤抗原的参考表位/片段的)微生物群序列变体。因此，抗原肽优选存在于(例如包含在)人微生物群表达的至少一种蛋白质中。

从解剖学上讲，微生物群存在于许多组织和生物液体中任一种之上或之内，包括皮肤、结膜、乳腺、阴道、胎盘、精液、子宫、卵泡、肺、唾液、口腔(特别是口腔粘膜)和胃肠道，特别是肠道。在本发明的上下文中，微生物群序列变体优选为胃肠道微生物群(驻留在胃肠道中的微生物)的序列变体，更优选为肠道微生物群(驻留在肠道中的微生物)的序列变体。因此，最优选的是，微生物群序列变体是(人)肠道细菌序列变体(即，驻留在(人)肠道中的细菌的序列变体)。

虽然微生物群可以在许多的多细胞生物(迄今为止研究过的所有多细胞生物，从植物到动物)之中和之上发现，但优选是在人之中和之上发现的微生物群。此类微生物群在本文中称为“人微生物群”(其中术语人特别是指微生物群的定位/驻留)。在本发明的上下文中，微生物群序列变体是人微生物群序列变体。

术语“免疫原性化合物”是指包含本发明的抗原肽的化合物。“免疫原性化合物”能够在施用该化合物的受试者中诱导/引发、增加、延长或维持针对所述抗原肽的免疫反应。在一些实施方案中，免疫原性化合物包含至少一种抗原肽，或者可替选地包含至少一种包含这种抗原肽的化合物，所述抗原肽或化合物与蛋白质(例如载体蛋白)连接。

“载体蛋白”通常是能够转运货物(例如本发明的抗原肽)的蛋白质。例如，载体蛋白可以穿过膜转运其货物。在本发明的上下文中，载体蛋白特别地(也)包含能够引发针对与其连接的抗原肽的免疫反应的肽或多肽。载体蛋白是本领域已知的。

可替选地，这种载体肽或多肽可以以免疫佐剂的形式共同施用。

优选地，如本文所述的抗原肽可以与具有免疫佐剂特性(例如提供对CD4+Th1细胞的刺激)的蛋白质/肽共同施用或与其连接，例如通过共价键或非共价键连接。虽然如本文所述的抗原肽优选与MHC I类结合，但CD4+辅助表位也可以另外用于提供有效的免疫反应。Th1辅助细胞能够通过分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)并增强DC和T细胞上共刺激信号的表达来维持有效的树突状细胞(DC)活化和特异性CTL活化(Galaine等人，Interest of Tumor-Specific CD4 T Helper 1Cells forTherapeutic Anticancer Vaccine.Vaccines(Basel).2015年6月30日；3(3):490-502)。

例如，佐剂肽/蛋白可以优选不同于本发明的抗原肽。优选地，佐剂肽/蛋白能够唤起免疫记忆或提供非特异性辅助，或可以是特异性辅助肽。文献中描述了数种用于提供非特异性T细胞辅助的辅助肽，例如破伤风辅助肽、钥孔血蓝蛋白肽或PADRE肽(Adotévi等人，Targeting antitumor CD4 helper T cells with universal tumor-reactive helperpeptides derived from telomerase for cancer vaccine.Hum VaccinImmunother.2013年5月；9(5):1073-7，Slingluff CL,The present and future ofpeptide vaccines for cancer:single or multiple,long or short,alone or incombination.Cancer J.2011年9月-10月；17(5):343-50)。因此，破伤风辅助肽、钥孔血蓝蛋白肽和PADRE肽是此类佐剂肽/蛋白的优选示例。该肽代表了辅助肽(具有免疫佐剂特性)的另一个示例，在本发明的背景下是优选的。另一个优选的示例是h-pAgT13L(Bhasin M,Singh H,Raghava GP(2003)MHCBN:a comprehensive database of MHC binding andnon-binding peptides.Bioinformatics 19:665-666)。优选的辅助肽的其他示例包括UCP2肽(例如，如以下所述：WO 2013/135553 A1或Dosset M,Godet Y,Vauchy C,BeziaudL,Lone YC,Sedlik C,Liard C,Levionnois E,Clerc B,Sandoval F,Daguindau E,Wain-Hobson S,Tartour E,Langlade-Demoyen P,Borg C,Adotévi O:Universal cancerpeptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance against telomerase anderadicates established tumor.Clin Cancer Res.2012年11月15日；18(22):6284-95.doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0896.Epub2012年10月2日)和BIRC5肽(例如，如以下所述：EP2119726 A1或Widenmeyer M,Griesemann H,S,Feyerabend S,Klein R,Attig S,Hennenlotter J,Wernet D,Kuprash DV,Sazykin AY,Pascolo S,Stenzl A,Gouttefangeas C,Rammensee HG:Promiscuous survivin peptide induces robust CD4+T-cell responses in the majority of vaccinated cancer patients.Int JCancer.2012年7月1日；131(1):140-9.doi：10.1002/ijc.26365.Epub2011年9月14日)。最优选的辅助肽是UCP2肽(氨基酸序列：KSVWSKLQSIGIRQH；SEQ ID NO：39，例如，如以下所述：WO2013/135553A1或Dosset等人，Clin Cancer Res.2012年11月15日；18(22):6284-95)。

如本文所用，术语“免疫原性组合物”是指能够引发、诱导、增加、延长或维持免疫反应的组合物，特别是当其施用于哺乳动物，尤其是当其施用于人个体时，能够引发、诱导、增加、延长或维持免疫反应的组合物。优选地，免疫原性组合物还包含一种或多种免疫佐剂物质。

“药学上可接受的赋形剂或载剂(carrier)”在本文中是指药用级化合物，其改善活性剂的递送、稳定性或生物利用度，并可以被接受其施用的受试者代谢，并且对接受其施用的受试者无毒。本发明的优选赋形剂和载剂包括药品中常用的任何赋形剂或载剂，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的赋形剂或载剂还可以包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或防腐剂。

“疫苗”在本文中是指能够刺激活生物体免疫系统的组合物，从而通过预防或通过疗法提供针对有害抗原的保护。预防性疫苗是优选的。优选地，疫苗或疫苗组合物还包含一种或多种免疫佐剂物质。

根据本文所述发明的不同方面和实施方案，“受试者”或“宿主”优选指哺乳动物，最优选指人。所述受试者可以患有癌症，被怀疑患有癌症，或有患癌症的风险。

如本文所用，术语“癌症”是指恶性肿瘤。特别地，术语“癌症”在本文中指一类疾病或疾患的任何成员，其特征是细胞不受控制地分裂，并且这些细胞能够通过侵袭直接生长到相邻组织中或通过转移植入到远端部位来侵袭其他组织。转移被定义为癌细胞通过血流或淋巴系统转运的阶段。其尤其包括食道癌、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、阑尾癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肛门癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、胸腺癌、脑癌、神经系统癌、神经胶质瘤、口腔癌、皮肤癌、血癌、淋巴瘤、眼癌、骨癌、骨髓癌、肌肉癌等。在本发明的上下文中，优选黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、结直肠癌或肾癌(例如透明细胞肾细胞癌)。

如本文所用，术语“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevent)”通常表示在疾病或病症发作之前避免或尽量减少其发作或发生，而术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”包括在疾病或病症(或疾病或病症的症状)发作之后减少、改善或治愈疾病或病症。术语“预防”包括“降低发生的可能性”或“降低复发的可能性”。

如本文所用，“有效量”或“有效剂量”是提供期望效果的量。出于治疗目的，有效量是足以产生有益或期望临床结果的量。技术人员可以很容易地确定对于给定应用的优选有效量，例如，考虑受试者的体型、年龄、体重、待预防或治疗的疾病/疾患的类型以及疾病/疾患开始后的时间量。在本发明的上下文中，就预防或治疗而言，组合物的有效量是足以诱导针对疾病/疾患的体液免疫反应和/或细胞介导免疫反应的量。

在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变化将被理解为暗示包括所述成员、整数或步骤，但不排除任何其他未说明的成员、整数或步骤。术语“由……组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中排除任何其他未说明的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由……组成”。因此，术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”以及“由……组成(consisting)”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成，也可以包括额外事物，例如，X+Y。

在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)，术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”以及类似的提及应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。本文中列举数值范围仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独值均并入说明书中，如同在本文中单独列举该值一样。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的元素。

词语“基本上”并不排除“完全”，例如，一种“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。

与数值x相关的术语“约”表示x±10％。

在整个说明书中提供了额外定义。

通过参考以下详细描述，包括本发明的优选实施方案和本文所包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

具体实施方案

尽管下面详细描述了本发明，但将理解的是，本发明不限于如本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可能会有所不同。还将理解的是，本文使用的术语并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出，但是应理解的是，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。各种描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制于仅明确描述的实施方案。本说明书应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的公开要素和/或优选要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合均应视为由本申请的说明书公开。

本发明的抗原肽

在第一方面，本发明提供一种抗原肽，其包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。

本发明还提供一种抗原肽，其包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成，其中，任选地，可以替换、缺失或添加一个或两个氨基酸残基。

本发明人已鉴定出可以用于诱导针对肿瘤细胞的特异性免疫反应的一组抗原肽。这些抗原肽与人肿瘤抗原(的片段)不同，但具有氨基酸相似性，如下表1所示。特别地，本发明的抗原肽包含在由来自人肠道的共生菌产生的多肽和蛋白质中。因此，本发明的抗原肽不是人序列，而是细菌序列。不希望受任何特定理论的束缚，发明人认为人免疫库(repertoire)中含有对细菌肽(包含在由来自肠道的共生菌产生的蛋白质中)有反应性的T细胞克隆，这些细菌肽与人肿瘤抗原的片段具有氨基酸相似性。特别地，本发明的抗原肽可以引发比相应的人肽更强的免疫反应，因为能够严格识别人肽的T细胞在成熟过程中已经因为识别自身抗原而耗竭，而对于本发明的抗原肽却并非如此。这可以阐明为什么当本文描述的抗原肽被施用于(人)个体时，这些肽能够诱导免疫反应，尤其是T细胞反应。因此，不受任何理论的束缚，发明人假设由来自肠道的共生菌产生的蛋白质能够“模拟”肿瘤抗原，可以用于触发针对肿瘤细胞的特异性免疫反应。这些发现进一步证明共生菌可以有助于肿瘤细胞的根除。

因此，本发明涉及与肿瘤抗原具有氨基酸相似性的抗原肽。如本文所用，表述“与肿瘤抗原具有氨基酸相似性”特别指(参考)人肿瘤抗原(例如CDC20或下表1中描述的其他示例性人肿瘤抗原)的片段(表位)的序列变体。

“序列变体”通常与参考序列(例如(参考)肿瘤抗原的片段)具有至少50％的序列同一性，特别是在序列的总长上具有该序列同一性。优选地，序列变体与参考序列(例如(参考)肿瘤抗原的片段)具有至少70％或75％，优选至少80％或85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，仍更优选至少96％或97％，以及特别优选至少98％或99％的序列同一性。可以按照本领域已知的方式计算序列同一性，特别是如下所述。优选地，序列变体保留参考序列的特定功能，例如其作为肿瘤表位的功能和/或其引发或维持免疫反应的能力。特别地，氨基酸序列变体具有改变的序列，其中参考序列中的一个或多个氨基酸发生突变(例如缺失或替换)，或者一个或多个氨基酸插入到参考氨基酸序列的序列中。例如，对于参考序列的每100个氨基酸而言，至少90％相同的变体序列具有不超过10个改变，即缺失、插入或替换的任何组合。

比较两个或更多个序列的同一性(相似性)的方法是本领域公知的。两个序列相同的百分比可以，例如，使用数学算法来确定。可以使用的数学算法的优选但非限制性的示例是Karlin等人(1993),PNAS USA,90:5873-5877的算法。这种算法集成在BLAST系列程序中，例如BLAST或NBLAST程序(另外参见Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215,403-410或Altschul等人(1997)，Nucleic Acids Res,25:3389-3402，可通过万维网网站NCBI主页ncbi.nlm.nih.gov访问)和FASTA(Pearson(1990),Methods Enzymol.183,63-98；Pearson和Lipman(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85,2444-2448)。可以通过这些程序鉴定与其他序列在一定程度上相同的序列。此外，还可以使用Wisconsin序列分析软件包第9.1版(Devereux等人，1984,Nucleic Acids Res.,387-395)中的程序，例如BESTFIT和GAP程序，来确定两个多核苷酸之间的百分比同一性以及两个(多)肽序列之间的百分比同一性。BESTFIT使用Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147,195-197的“局部同源性”算法，找到两个序列之间的最佳单一相似区域。

特别地，本发明的抗原肽具有的核心序列与(人)参考肿瘤抗原的表位(片段)序列的核心序列相同。此外，基于核心序列所在的人微生物群中存在的蛋白质的频率，核心序列显示出高普遍性。

因此，核心序列是本发明的抗原肽的主要特征。因此，发明人已经鉴定出了高度感兴趣且具有高普遍性的核心序列，因为这些序列存在于(参考)肿瘤抗原片段的数种序列变体中和/或相当比例的普通人群中高频出现的数种人微生物群蛋白中。优选地，在包含SEQID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽中，其中任选地，可以替换、缺失或添加一个或两个氨基酸残基，核心序列仍得以保留。

优选地，本发明的抗原肽包含根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40-42中任一项所述的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗原肽由根据SEQ ID NO：1至16和SEQID NO：40-42中任一项所述的氨基酸序列组成或基本上由其组成。

在一些实施方案中，抗原肽可以被修饰和/或可以包括非肽键(例如，如上所述)。例如，抗原肽可以在其N末端和/或C末端被修饰(例如，被标记或与载体或底物连接)。此类修饰通常取决于预期目的，并且是本领域公知的。

可以使用公知的技术制备本文公开的抗原肽。例如，可以通过重组DNA技术或化学合成，经由合成制备肽。本文公开的肽可以单独合成或作为包含两个或更多个肽(例如，两个或更多个肽、或肽和非肽)的较长多肽合成。抗原肽可以被分离，即纯化成基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，例如，至少约70％、80％或90％纯化。优选地，本发明的抗原肽是分离的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽具有与人主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如MHC I类(MHC I)分子)结合的能力；或—以延长的形式，例如长度变体—与MHC II类(MHC II)分子结合的能力。优选地，本发明的抗原肽可以与MHC I类(主要组织相容性复合物I类，MHC I)分子结合。

MHC I类分子向杀伤性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞，CTL)呈递表位。除了TCR(T细胞受体)之外，CTL也表达CD8受体。当CTL的CD8受体对接至MHC I类分子时，如果CTL的TCR适合MHC I类分子内的表位，则CTL触发细胞通过凋亡进行程序性细胞死亡。这种途径在预防和/或治疗癌症方面特别有用，因为癌细胞会直接受到攻击。在人中，有三个不同的基因位点编码MHC I类分子(人的MHC分子也称为人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。因此，MHC I类在人中包括HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*24和HLA-B*07是可以从这些位点表达的不同MHC I类等位基因的示例。例如，本发明的抗原肽可以与HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*24和HLA-B*07分子结合。在一些实施方案中，本发明的抗原肽与HLA-A*02结合。通常，长度为8-11个氨基酸的肽(表位)由MHC I呈递。

一般而言，本发明的抗原肽可以是任何长度。优选地，本发明的抗原肽的长度不超过350个氨基酸。例如，本发明的抗原肽的最大长度可以是300或250个氨基酸。更优选地，本发明的抗原肽的最大长度不超过200个氨基酸，例如，不超过190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14或13个氨基酸。特别地，本发明的抗原肽的长度优选为最多30或25个氨基酸，更优选为最多20或15个氨基酸，其中甚至更优选长度为8至15个氨基酸或8-11个氨基酸(例如8、9、10或11个氨基酸)的较小肽；并且仍更优选长度为9或10个氨基酸的肽。特别地，抗原肽不是由抗原肽所来源的来自肠道的共生菌产生的全长蛋白质。换句话说，本发明的抗原肽优选为(由人微生物群产生的)全长蛋白质的片段。

类似地，通常用作参考序列的(参考)肿瘤抗原的“片段/表位”优选包含肿瘤抗原的连续8至11个氨基酸，优选9或10个氨基酸。应理解的是，(参考)肿瘤抗原的“片段/表位”不是全长肿瘤抗原(蛋白质)。

如本文所用，(蛋白质或核酸(序列))的“片段”优选具有全长(参考)蛋白质/核酸/序列的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的最大长度。在一些实施方案中，片段的长度不超过(全长)(参考)蛋白质/核酸长度的50％。在其他实施方案中，(参考)蛋白质/核酸的片段的长度不超过(全长)(参考)蛋白质/核酸长度的20％或10％。

更一般地，本发明提供了一种抗原肽，其包含人肿瘤抗原片段的微生物群序列变体或由其组成。人肿瘤抗原可以选自CDC20、KIF2C、UBE2C、ANKRD30A、AURKA、CDH17、CEACAM5、MMP11、OR51E2和TOP2A。人(参考)肿瘤抗原的片段/表位可以选自SEQ ID NO：17-31和38中的任一项。在一些实施方案中，抗原肽包含根据SEQ ID NO：17-31和38中任一项的人参考肽的微生物群变体或由其组成。

在一些实施方案中，抗原肽诱导针对(参考)肿瘤抗原的人表位的T细胞交叉反应性。T细胞交叉反应是免疫系统的一种现象，定义为T细胞受体(TCR)识别两种或更多种肽-MHC复合物(pMHC)。

表位模拟涉及外来抗原和自身抗原之间的序列和结构相似性的概念，作为引发针对自身抗原的交叉反应性免疫反应的触发机制。有趣的是，这种表位模拟提供了一种可能的途径来绕过由于识别自身抗原的T细胞克隆耗竭而导致的人T细胞库限制。

特别地，抗原(即本发明的抗原肽)不同于自身抗原(例如肿瘤抗原的人表位)，但是与自身抗原具有序列相似性，(i)由于T细胞受体的交叉反应性而仍然可以被识别，并且(ii)预期此类抗原被在T细胞驯化(education)过程中未被耗竭的T细胞/TCR识别。因此，此类抗原能够引发强烈的免疫反应，导致具有与自身抗原潜在交叉反应性的T细胞克隆扩增。

可以通过ELlSPOT-IFNγ测定法测量T细胞受体与人(参考)肿瘤抗原表位的交叉反应性，如实施例部分所示。简而言之，可以在第0天(d0)用初次注射对HLA-A2转基因小鼠(例如，表达人HLA-A2和HLA-DR1 MHC且缺乏鼠H-2I类和II类MHC的HHDDR1小鼠和/或表达人HLA-A2和HLA-DR3 MHC的HHD DR3小鼠)进行免疫，随后例如在第14天，用本发明的抗原肽进行加强注射，或在对照组中用相应的人(参考)肽进行加强注射。此后，例如在加强注射后七天(即在第21天)，可以处死小鼠，并用本发明的抗原肽体外刺激脾细胞以评估其分泌IFN-γ的能力，如通过ELISPOT所评估的。

下表1提供了本发明的抗原肽的概述及其氨基酸序列和SEQ ID NO。表1还提供了本发明的每种抗原肽涉及的肿瘤抗原(本文中也称为“人参考肽”)的信息。SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40-42是指本发明的HLA-A*02抗原肽。

表1.本发明的HLA-A*02抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CDC20(人参考肽)的片段的序列变体，例如“SLPDRILDA”(SEQ ID NO：17)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CDC20的片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原KIF2C(人参考肽)的片段的序列变体，例如“AINPELLQL”(SEQ ID NO：18)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原KIF2C片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：40-42所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原UBE2C(人参考肽)的片段的序列变体，例如“ALYDVRTIL”(SEQ ID NO：19)、“ALYDVRTILL”(SEQ ID NO：38)、“ILLSIQSLL”(SEQID NO：20)或“RLQQELMTL”(SEQ ID NO：21)。更优选地，本发明的抗原肽是UBE2C片段(人参考肽)“ALYDVRTIL”(SEQ ID NO：19)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：3-4所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。还更优选的是，本发明的抗原肽是UBE2C片段(人参考肽)“ILLSIQSLL”(SEQ ID NO：20)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。还更优选的是，本发明的抗原肽是UBE2C片段(人参考肽)“RLQQELMTL”(SEQID NO：21)的序列变体，例如包含SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原ANKRD30A(人参考肽)的片段的序列变体，例如“AVYSEILSV”(SEQ ID NO：22)、“KILDTVHSC”(SEQ ID NO：23)或“SLDQKLFQL”(SEQ ID NO：24)。更优选地，本发明的抗原肽是ANKRD30A片段(人参考肽)“AVYSEILSV”(SEQID NO：22)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。还更优选地，本发明的抗原肽是ANKRD30A片段(人参考肽)“KILDTVHSC”(SEQ ID NO：23)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。还更优选地，本发明的抗原肽是ANKRD30A片段(人参考肽)“SLDQKLFQL”(SEQ ID NO：24)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原AURKA(人参考肽)片段的序列变体，例如“YLILEYAPL”(SEQ ID NO：25)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原AURKA片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CDH17(人参考肽)片段的序列变体，例如“LVIGIILAV”(SEQ ID NO：26)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CDH17片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CEACAM5(人参考肽)片段的序列变体，例如“YLSGANLNL”(SEQ ID NO：27)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原CEACAM5片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原MMP11片段(人参考肽)的序列变体，例如“KVWSDVTPL”(SEQ ID NO：28)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原MMP11片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原OR51E2片段(人参考肽)的序列变体，例如“AQIGIVAVV”(SEQ ID NO：29)。优选地，本发明的抗原肽是肿瘤抗原OR51E2片段的序列变体，例如包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽是肿瘤抗原TOP2A片段(人参考肽)的序列变体，例如“ILNSTTIEI”(SEQ ID NO：30)或“ALIFGQLLT”(SEQ ID NO：31)。更优选地，本发明的抗原肽是TOP2A片段(人参考肽)“ILNSTTIEI”(SEQ ID NO：30)的序列变体，例如包含SEQ IDNO：15所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。还更优选地，本发明的抗原肽是TOP2A片段(人参考肽)“ALIFGQLLT”(SEQ ID NO：31)的序列变体，例如包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

优选地，本发明的抗原肽包含SEQ ID NO：1、2和3中任一项所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗原肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗原肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗原肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成。

如本文中的实施例所示，本发明的特异性抗原肽允许引发针对其自身的强烈免疫反应，最重要的是，它们还允许引发针对与其具有氨基酸相似性的肽(这些肽包含在肿瘤抗原中)的强烈免疫反应，即便肿瘤抗原中包含的人参考肽可能是具有耐受性的。

有利地，本发明的抗原肽可以是免疫原性化合物的形式，特别是用于预防或治疗癌症。

包含本发明的抗原肽的免疫原性化合物

在另一方面，本发明还提供了包含如上所述的本发明的抗原肽的免疫原性化合物。特别地，如上所述的抗原肽的优选实施方案也适用于本发明的免疫原性化合物。

一般而言，术语“免疫原性化合物”包括包含本发明的抗原肽的所有类型的化合物。例如，本发明的抗原肽可以与载体分子连接，或者本发明的抗原肽可以包含在多肽或蛋白质中(该多肽或蛋白质可以“单独”出现，即不与任何其他化合物连接，或者包含抗原肽的多肽或蛋白质可以与载体分子连接)。

本领域技术人员熟知用于产生本发明的免疫原性化合物(例如包含与载体分子连接的式(I)的多肽或由其组成的免疫原性化合物)的载体分子的类型。特别地，载体分子的功能可以是提供细胞因子辅助(或T细胞辅助)以增强针对肿瘤抗原的免疫反应。

优选地，本发明的免疫原性化合物包含抗原肽和载体分子，特别是其中抗原肽(或包含抗原肽的多肽或蛋白质)与载体分子连接。优选的载体分子是载体蛋白或载体肽。根据优选的实施方案，如上定义的抗原肽或包含所述抗原肽的多肽/蛋白质例如通过共价键或非共价键与载体蛋白或载体肽连接。可替选地，例如，可以以免疫佐剂的形式(分开地)共同施用这种载体蛋白或载体肽(即，不是作为“免疫原性化合物”，而是作为共同施用/组合疗法，如本文下面所述)。

在一些实施方案中，可以将如本文所述的抗原肽或包含该抗原肽的多肽/蛋白质与具有免疫佐剂特性(例如，提供对CD4+Th1细胞的刺激)的蛋白质/肽共同施用，或者例如通过共价键或非共价键与该具有免疫佐剂特性的蛋白质/肽连接。虽然如本文所述的抗原肽优选与MHC I类结合，但CD4+辅助表位也可以另外用于提供有效的免疫反应。Th1辅助细胞能够通过分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)并增强DC和T细胞上共刺激信号的表达来维持有效的树突状细胞(DC)活化和特异性CTL活化(Galaine等人，Interest of Tumor-Specific CD4 T Helper 1Cells for TherapeuticAnticancer Vaccine.Vaccines(Basel).2015年6月30日；3(3):490-502)。

例如，佐剂肽/蛋白可以是唤起免疫记忆或提供非特异性辅助的非肿瘤抗原，或可以是特异性的肿瘤来源的辅助肽。文献中描述了用于提供非特异性T细胞辅助的数种辅助肽，例如破伤风辅助肽、钥孔血蓝蛋白肽或PADRE肽(Adotévi等人，Targeting antitumorCD4 helper T cells with universal tumor-reactive helper peptides derived fromtelomerase for cancer vaccine.Hum Vaccin Immunother.2013年5月；9(5):1073-7，Slingluff CL,The present and future of peptide vaccines for cancer:single ormultiple,long or short,alone or in combination.Cancer J.2011年9月-10月；17(5):343-50)。因此，破伤风辅助肽、钥孔血蓝蛋白肽和PADRE肽是此类佐剂肽/蛋白的示例。此外，佐剂肽/蛋白可以是特异性的源自肿瘤的辅助肽。特异性的源自肿瘤的辅助肽通常由MHC II类呈递，特别是由HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ呈递。特异性的源自肿瘤的辅助肽可以是共有的过表达肿瘤抗原(例如HER2、NY-ESO-1、hTERT或IL13RA2)序列的片段。此类片段的长度优选为至少10个氨基酸，更优选为至少11个氨基酸，甚至更优选为至少12个氨基酸，最优选为至少13个氨基酸。特别地，长度为13至24个氨基酸的共有的过表达肿瘤抗原(例如HER2、NY-ESO-1、hTERT)片段是优选的。优选的片段与MHC II类结合，因此可以使用例如IEDB(免疫表位数据库和分析资源；由美国国立卫生研究院健康和人服务部门下属的国家过敏和传染病研究所提供合约支持；URL：http://www.iedb.org/；http://tools.iedb.org/mhcii/)的MHC II类结合预测工具进行鉴定。优选地，佐剂肽/蛋白质是UCP2肽(氨基酸序列：KSVWSKLQSIGIRQH；SEQ ID NO：39，例如WO2013/135553A1或Dosset等人，Clin Cancer Res.2012年11月15日；18(22):6284-95中所述)。

还优选的是，本发明的免疫原性化合物是包含本发明的抗原肽的多肽或蛋白质。优选地，这种蛋白质或多肽是重组蛋白质或多肽，例如融合蛋白。术语“重组”表示其不存在于自然界中。在一些实施方案中，本发明的抗原肽可以是融合蛋白的一部分，例如与HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N末端氨基酸融合，或与抗体(例如特异于树突状细胞的抗体)融合(或融合到抗体序列中)。

优选地，本发明的免疫原性化合物包含式(I)的多肽或由其组成

PepNt-CORE-PepCt (I)

其中：

-“CORE”由如上定义的本发明的抗原肽组成；和

例如，免疫原性化合物可以包含式(Ia)或(Ib)的多肽或由其组成：

PepNt-CORE (Ia)；或

CORE-PepCt (Ib)

其中“PepNt”和“PepCt”和“CORE”如上定义。

优选地，式(I)、(Ia)或(Ib)的多肽是融合肽或融合蛋白，特别是重组融合肽或蛋白。

还优选的是，如上定义的多肽或免疫原性化合物包含9至1000个氨基酸；其中包括9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900和1000个氨基酸。因此，如果适用，可以相应地定义“PepNt”和“PepCt”的长度。

因此，如上所定义的“PepNt”和“PepCt”可以包含0至500个氨基酸残基；其中包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450和500个氨基酸残基。

优选地，抗原肽与载体分子连接，特别是与载体蛋白连接，优选通过共价键或非共价键连接。肽任选结合的载体分子可以选自许多种已知载体。用于疫苗目的的载体分子的示例包括蛋白质，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)和脂肪酸。可以与式(I)的抗原肽共价连接的载体分子的其他实施方案包括细菌毒素或类毒素(例如白喉、霍乱、大肠杆菌热不稳定或破伤风类毒素)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)外膜蛋白(欧洲专利申请号EP0372501)、合成肽(欧洲专利申请号EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(PCT申请号W093/17712)、百日咳蛋白(PCT申请号W098/58668)、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D(PCT申请号WO00/56360)和来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(国际专利申请号WO00/61761)。

此外，在根据式(I)、(Ia)或(Ib)的多肽中，“PepNt”和/或“PepCt”可以优选对应于具有免疫佐剂特性(例如提供如本文所述的CD4+Th1细胞的刺激)的蛋白质/肽。

在一些实施方案中，本发明的抗原肽(或包含所述抗原肽的多肽/蛋白质)通过接头部分与载体分子共价结合。例如，接头剂可以选自GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰基-氧基]琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯)和磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯)。

包含抗原肽的肽-MHC(pMHC)多聚体

在另一方面，本发明还提供了包含本发明的抗原肽的肽-MHC(pMHC)多聚体。

如本文所用，术语“肽-MHC多聚体”(pMHC)是指由装载有本发明的抗原肽的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白亚基组成的稳定多聚复合物。一般而言，“MHC多聚体”是MHC分子的寡聚形式。MHC分子的主要功能是与抗原结合。根据本发明，所述抗原是本发明的抗原肽。因此，“装载有”本发明的抗原肽的MHC蛋白的复合物通常意味着本发明的抗原肽与一种或多种MHC蛋白结合。本发明的“肽-MHC多聚体”(pMHC)包括但不限于肽-MHC二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体。MHC四聚体和五聚体是优选的。术语“主要组织相容性复合物”(MHC)是通用名称，旨在涵盖不同物种中描述的组织相容性抗原系统，包括人白细胞抗原(HLA)。在人中，有三个主要的不同基因位点编码MHC I类分子：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可以从这些位点表达的不同MHC I类等位基因的示例。

在本发明的一个实施方案中，pMHC多聚体是肽/MHC I类多聚体。在另一个具体实施方案中，pMHC多聚体是对应于MHC I类的HLA/肽多聚体。因此，pMHC多聚体可以是选自以下的HLA-肽多聚体：HLA-A-肽多聚体、HLA-B-肽多聚体、HLA-C-肽多聚体、HLA-E-肽多聚体、MICA-肽多聚体和MICB-肽多聚体。获得pHMC多聚体的方法在本领域中是已知的，并且例如在WO96/26962和WO01/18053中进行了描述，它们通过引用并入本文。

除了本发明的MHC分子和抗原肽之外，pMHC还可以含有其他组分，例如多聚化剂和/或标记(例如，用于可视化)。标记的示例包括但不限于荧光标记，例如荧光标记的蛋白质，例如链霉亲和素。荧光标记包括异藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)、R-藻红蛋白(R-PE)和异硫氰酸荧光素(FITC)。优选的标记是生物素。

在本发明的一个实施方案中，所述pMHC多聚体可以用于使T细胞群可视化，该T细胞群特异于如上所述的MHC I类肽复合物或对应于MHC I类的HLA/肽复合物。例如，pMHC多聚体可以是其中MHC重链被生物素化的多聚体，这允许与链霉亲和素组合为四聚体。此类pMHC四聚体对合适的TCR载体T淋巴细胞亲合力增加，因此可以用于通过免疫荧光使反应性群可视化。在本发明的另一个实施方案中，所述pMHC多聚体可以用于通过筛选(在流式细胞术中或通过免疫磁性筛选)来检测和/或分离如上所述的特异于pMHC复合物的T细胞群。

抗原肽特异性的T淋巴细胞

在另一方面，本发明还提供了特异于本发明的抗原肽的T淋巴细胞，特别是特异于本发明的抗原肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。T淋巴细胞，特别是CTL，优选为特异于本发明的抗原肽的活化(细胞毒性)T淋巴细胞。T淋巴细胞的“特异性”优选理解为T淋巴细胞与抗原肽结合，并且另外与抗原肽对应的肿瘤抗原结合。在这方面，T淋巴细胞，特别是CTL，与抗原肽及其肿瘤抗原对应物发生交叉反应，通常表现出与抗原肽具有高水平序列同一性或相似性。

本发明还提供了一种产生特异于本发明的抗原肽的(细胞毒性)T淋巴细胞(特别是特异于本发明的抗原肽的活化(细胞毒性)T淋巴细胞)的方法，该方法包括使T淋巴细胞，特别是CTL，与抗原呈递细胞或模拟抗原呈递细胞的人工构建体表面上表达的装载有抗原的人I类或II类MHC分子体外接触，其中所述抗原是本发明的抗原肽。优选的抗原呈递细胞包括树突状细胞。模拟抗原呈递细胞的人工构建体可以是，例如，本发明的肽-MHC多聚体。使T淋巴细胞，特别是CTL，与抗原呈递细胞或模拟抗原呈递细胞的人工构建体表面上表达的装载有抗原的人I类或II类MHC分子接触的步骤可以进行一段时间，使得足以以抗原特异性方式活化所述T淋巴细胞，特别是CTL。优选地，抗原肽是如上所述的优选抗原肽，例如包含SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至42中任一项(更优选地是SEQ ID NO：1、2和3中任一项)所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

本发明还涉及通过本发明的方法产生的活化T细胞，其中所述T细胞选择性地识别表达包含本发明的抗原肽的多肽和/或包含相应人参考肽的多肽的细胞。在一个具体实施方案中，所述T细胞识别表达包含本发明的抗原肽的多肽和包含相应人参考肽的多肽的细胞，尤其是如本文所述的过表达该相应TAA的肿瘤细胞。

针对本发明的抗原肽的(活化)T细胞可用于疗法。特别地，通过上述方法产生的活化T细胞选择性地识别这样的细胞，其异常表达包含SEQ ID NO：17-31和38的氨基酸序列的多肽(即肿瘤抗原)，例如包含SEQ ID NO：17、18、19和38中任一项所示的氨基酸序列的多肽。在一个具体实施方案中，异常表达包含SEQ ID NO：17-31和38的氨基酸序列的多肽的细胞是待治疗癌症中涉及的肿瘤细胞。

优选地，特异于本发明的抗原肽的本发明的T淋巴细胞可以具有(表现/表达)记忆标志物。此类记忆标志物优选为肠道记忆细胞的记忆标志物，例如CCR9、CXCR3、CD103、CX3CR1和α4β7+。

相较于使用非源自微生物群序列的肽(例如人(参考)序列和/或合成肽(例如，包括突变，例如，人工引入的突变))进行疫苗接种，使用本发明的抗原肽(源自人微生物群序列)进行疫苗接种后，特异于本发明的抗原肽的本发明的T淋巴细胞优选地被更多/更强地扩增。换句话说，相较于使用与相同参考表位相关的相应人肽或合成肽(非源自微生物群)进行疫苗接种，使用本发明的抗原肽对受试者进行疫苗接种优选地增加了特异于本发明的所述抗原肽的本发明的T淋巴细胞的数量。

在接种疫苗后，在肠道中具有所述肽(由受试者的微生物群表达)的受试者中(例如，相较于肠道中不具有所述肽(不由受试者的微生物群表达)的受试者(例如，在其粪便样本中不能检测到所述肽的受试者)，可以在该受试者的粪便样本中找到该肽)，特异于本发明的抗原肽的本发明的T淋巴细胞优选地被更多/更强和/或更快地扩增。特别地，肠道中具有所述肽(由受试者的微生物群表达)的受试者可能反应更快(T细胞扩增更快)和/或具有来自期望的类型Tc1的T细胞。

装载有抗原肽或免疫原性化合物的细胞

在另一方面，本发明还提供了装载有本发明的抗原肽或包含如上所述的本发明的抗原肽的免疫原性化合物的细胞。特别地，如上所述的抗原肽的优选实施方案也适用于本发明的这种细胞。

装载有本发明的抗原肽或本发明的免疫原性化合物的优选细胞是抗原呈递细胞(APC)，更优选树突状细胞(DC)。

APC尤其令人感兴趣，因为它们的主要功能是处理抗原并在细胞表面将其呈递至免疫系统的T细胞，从而启动和调节体内的T细胞反应。在本发明的背景下，优选APC装载有本发明的抗原肽和/或免疫原性化合物。这可以通过将APC在体外暴露于所述抗原肽和/或免疫原性化合物来实现(如Rizzo MM,Alaniz L,Mazzolini G.Ex vivo loading ofautologous dendritic cells with tumor antigens.Methods Mol Biol.2014；1139:41-4；Rolinski J,Hus I.Breaking immunotolerance of tumors:a new perspective fordendritic cell therapy.J Immunotoxicol.2014年10月；11(4):311-8所述)。

优选的本发明的APC是树突状细胞(DC)。将至少一种本发明的抗原肽或免疫原性化合物与DC组合确实可以是有利的，因为DC是最有效的APC，并且据报道在癌症患者中经常存在功能缺陷。本领域技术人员可以从健康的相容供体(即DC是HLA相关的)或从患者自身(前提是DC是有功能的(即DC是自体的))容易地获得DC，例如通过从外周血中直接分离，或源自外周血细胞(例如CD14+单核细胞或CD34+造血前体)(Figdor CG,de Vries IJ,Lesterhuis WJ,Melief CJ.Dendritic cell immunotherapy:mapping the way.NatMed.2004年5月；10(5):475-80)。DC确实可以通过其表面标志物(例如S100、p55、CD83和/或OX62)与外周血的其他细胞区分开来，因此可以使用本领域公知的细胞培养技术基于所述标志物进行分离和纯化。

本发明还涉及制备装载有本发明的抗原肽的细胞的方法，其中抗原肽装载到细胞(特别是抗原呈递细胞(或人工抗原呈递细胞))表面上表达的I类或II类MHC分子上，所述方法包括使(足量的)抗原肽与细胞(特别是抗原呈递细胞)接触的步骤。

编码抗原肽的核酸和包含核酸的宿主细胞

在另一方面，本发明还提供了编码本发明的抗原肽、如上定义的式(I)的多肽或本发明的免疫原性化合物的核酸，其中所述免疫原性化合物是肽或蛋白质。特别地，上述抗原肽的优选实施方案也适用于这种本发明的核酸。例如，甚至更优选包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成的本发明的抗原肽。例如，更优选包含SEQ ID NO：1、2、3、7、11、16中任一项所示的氨基酸序列或由其组成的本发明的抗原肽。例如，仍更优选包含SEQ ID NO：1-3中任一项所示的氨基酸序列或由其组成的本发明的抗原肽。还优选其组合，即，编码不同的本发明的抗原肽的核酸。

核酸优选包含单链、双链或部分双链核酸，优选选自DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。核酸的非限制性示例包括gDNA、cDNA、RNA、反义DNA、反义RNA、具有或不具有表达元件的互补RNA/DNA序列、小基因、基因片段、调节元件、启动子及其组合。核酸的进一步示例包括重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、RNA分子(例如rRNA、mRNA或tRNA)或上述DNA分子。因此，核酸(分子)优选是DNA分子或RNA分子；优选选自gDNA；cDNA；rRNA；mRNA；反义DNA；反义RNA；互补RNA和/或DNA序列；具有或不具有表达元件、调节元件和/或启动子的RNA和/或DNA序列；载体；及其组合。

在治疗、诊断、试剂和生物测定领域中，非常令人感兴趣的是，能够将核酸(例如，核糖核酸(RNA))递送到细胞内(无论是体外、体内、原位还是离体)以引起核酸的细胞内翻译并产生感兴趣的编码肽。非整合性多核苷酸的递送和功能尤其重要。因此，优选不整合到宿主染色体中的核酸，例如mRNA。通常，可以优化核酸(例如mRNA)以表达本发明的抗原肽，例如通过本领域已知的方法来进行，例如密码子优化。此外，可以修饰核酸，例如，以增强其稳定性、延长其寿命和/或增加本发明的抗原肽的表达。因此，优选编码本发明的抗原肽的经优化或修饰的mRNA(mmRNA)。mmRNA与野生型mRNA的区别在于其功能和/或结构设计特征，用于最佳递送mRNA和/或用于最佳表达本发明的抗原肽(例如WO 2013/151672A2、WO 2013/101690 A1、WO2013/052523A所述，其通过引用并入本文)。通常，核酸可以“裸露”递送或与载体(例如，阳离子载体)相关联。阳离子载体(带正电)通常容易与带负电的核酸相关联。载体可以是包括例如聚合物、蛋白质、脂质和纳米颗粒的任何种类中的任一种。阳离子脂质和纳米颗粒(特别是脂质纳米颗粒，LNP)优选用于核酸递送。因此，本发明还提供了与载体(例如，脂质，特别是阳离子脂质或LNP)相关联的如本文所述的核酸。

在一些实施方案中，核酸分子可以是载体。在本发明的上下文中使用的术语“载体”是指核酸分子，优选是指人工核酸分子，即自然界中不存在的核酸分子。在本发明的上下文中的载体适用于并入或容纳期望的核酸序列。此类载体可以是储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便地储存核酸分子的载体。因此，载体可以包含对应于例如期望的本发明的抗原肽的序列。表达载体可以用于产生表达产物，例如RNA(例如mRNA)或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含载体序列段转录所需的序列，例如启动子序列。克隆载体通常是含有克隆位点的载体，其可以用于将核酸序列并入载体中。克隆载体可以是，例如，质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如，病毒载体。本发明的上下文中的载体可以是，例如，RNA载体或DNA载体。优选地，载体是DNA分子。例如，本申请意义上的载体包含克隆位点、选择标志物(例如抗生素抗性因子)和适合载体增殖的序列(例如复制起点)。优选地，本申请的上下文中的载体是质粒载体。优选地，本申请的上下文中的载体是表达载体。表达载体通常能够表达编码序列，特别是本发明的抗原肽、如上定义的式(I)的多肽或本发明的免疫原性化合物。优选的载体是用于在细菌细胞中表达的载体。更优选地，载体可用于在所谓的“活细菌疫苗载体”中表达，其中活细菌细胞(例如细菌或细菌孢子，例如，内生孢子、外生孢子或微生物孢囊)可以用作疫苗。其优选的示例在da Silva等人，Live bacteria vaccine vectors:anoverview；Braz J Microbiol.2015年3月4日；45(4):1117-29中描述。

编码本发明抗原肽的核酸可以是裸露核酸的形式，也可以是克隆到质粒或病毒载体中的核酸(Tregoning和Kinnear，Using Plasmids as DNA Vaccines for InfectiousDiseases.Microbiol Spectr.2014年12月；2(6).doi:10.1128/microbiolspec.PLAS-0028-2014)，后者是特别优选的。合适的本发明的病毒载体的示例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒载体。本领域技术人员可以使用本领域的标准重组技术将核酸克隆到质粒或病毒载体中。

在另一方面，本发明还提供了包含本发明的核酸(特别是上述表达载体)的宿主细胞。还优选其组合，即，包含不同的本发明的核酸(例如编码不同的本发明的抗原肽)的宿主细胞。

优选地，宿主细胞中包含的核酸优选为载体。优选地，宿主细胞为细菌细胞。这种宿主细胞可以优选用于产生本发明的抗原肽或本发明的免疫原性化合物。此外，这种宿主细胞还可以是疫苗中的活性组分。优选地，宿主细胞为细菌细胞，更优选为肠道细菌细胞。术语“肠道细菌细胞”是指驻留在(人)肠道中的细菌。这种细菌宿主细胞可以用作“活细菌疫苗载体”，其中活细菌细胞(例如细菌或细菌孢子，例如，内孢子、外孢子或微生物孢囊)可以用作疫苗。其优选的示例在da Silva等人，Live bacteria vaccine vectors:anoverview；Braz J Microbiol.2015年3月4日；45(4):1117-29中描述。细菌细胞(例如细菌或细菌孢子，例如，内生孢子、外生孢子或微生物孢囊)，特别是(整个)肠道细菌物种，可以是有利的，因为它们具有引发比它们含有的(多)肽或核酸更大的免疫反应的潜力。可替选地，本发明的细菌细胞(特别是肠道细菌)可以是益生菌(即活肠道细菌)的形式，由于它可以提供健康益处，因此可以用作食品添加剂。这些细菌细胞可以例如冻干成颗粒、药丸或胶囊，或直接与乳制品混合食用。

在一些实施方案中，宿主细胞可以是抗原呈递细胞和树突状细胞，特别是如上所述。在一些实施方案中，抗原呈递细胞包含上述本发明的表达载体，特别是能够表达或表达含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：40至42或变体氨基酸序列的所述肽的表达载体。

本发明还涉及一种产生本发明的肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，并从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。

包含抗原肽或免疫原性化合物的纳米颗粒

在另一方面，本发明还提供了一种包含以下的纳米颗粒，特别是装载有以下的纳米颗粒，

-至少一种本发明的抗原肽，或

-至少一种本发明的免疫原性化合物；

以及，任选地，装载有佐剂。

特别地，上述抗原肽的优选实施方案也适用于这种本发明的纳米颗粒。

纳米颗粒，特别是用作疫苗的纳米颗粒，是本领域已知的，并且例如在Shao等人，Nanoparticle-based immunotherapy for cancer,ACS Nano 2015,9(1):16-30；Zhao等人，Nanoparticle vaccines,Vaccine 2014,32(3):327-37；和Gregory等人，Vaccinedelivery using nanoparticles,Front Cell Infect Microbiol.2013,3:13,doi:10.3389/fcimb.2013.00013.eCollection 2013,Review中进行了描述。特别地，纳米颗粒用于递送抗原肽(或包含抗原肽的免疫原性化合物/多肽/蛋白质/核酸)，以及还可以任选地充当佐剂。抗原肽(包含抗原肽的免疫原性化合物/多肽/蛋白质/核酸)通常被封装在纳米颗粒内或连接/结合到(装饰到)纳米颗粒的表面(“包衣”)。与传统方法相比，纳米颗粒可以保护有效载荷(抗原/佐剂)免受周围生物环境的影响，增加半衰期，最大限度地降低全身毒性，促进向APC的递送，或者甚至直接触发TAA特异性T细胞的活化。优选地，纳米颗粒的尺寸(直径)不超过300nm，更优选地不超过200nm，最优选地不超过100nm。此类纳米颗粒充分地避免被吞噬细胞摄取，在循环中具有高结构完整性和长循环时间，能够在肿瘤生长部位积累，并能够穿透深入肿瘤团块。

纳米颗粒的示例包括聚合物纳米颗粒，例如聚(乙二醇)(PEG)和聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)；无机纳米颗粒，例如金纳米颗粒、氧化铁珠、氧化铁氧化锌纳米颗粒、碳纳米管和介孔二氧化硅纳米颗粒；脂质体，例如阳离子脂质体；免疫刺激复合物(ISCOM)；病毒样颗粒(VLP)；和自组装蛋白质。

聚合物纳米颗粒是基于/包含聚合物的纳米颗粒，所述聚合物例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚(D,L-乳酸-共乙醇酸)(PLGA)、聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)、聚(乙二醇)(PEG)和聚苯乙烯。聚合物纳米颗粒可以包封(entrap)抗原(例如，抗原肽或包含其的(多)肽)或与抗原(例如，抗原肽或包含其的(多)肽)结合/偶联。聚合物纳米颗粒可以用于递送，例如递送至某些细胞，或通过其缓慢的生物降解速率来维持抗原释放。例如，g-PGA纳米颗粒可以用于封装疏水性抗原。聚苯乙烯纳米颗粒可以与多种抗原偶联，因为可以用各种官能团对它们进行表面修饰。聚合物(例如聚(L-乳酸)(PLA)、PLGA、PEG和天然聚合物(例如多糖))也可以用于合成水凝胶纳米颗粒，这是一种纳米级亲水性三维聚合物网络。纳米凝胶具有良好的特性，包括灵活的网格尺寸、用于多价偶联的大表面积、高含水量和高抗原装载能力。因此，优选的纳米颗粒是纳米凝胶，例如壳聚糖纳米凝胶。优选的聚合物纳米颗粒是基于/包含PEG和PLGA的纳米颗粒。

无机纳米颗粒是基于/包含无机物质的纳米颗粒，此类纳米颗粒的示例包括金纳米颗粒、氧化铁珠、氧化铁氧化锌纳米颗粒、碳纳米颗粒(例如，碳纳米管)和介孔二氧化硅纳米颗粒。无机纳米颗粒提供刚性结构和可控合成。例如，金纳米颗粒可以很容易地制成不同形状，例如球体、棒状、立方体。无机纳米颗粒可以被表面修饰，例如用碳水化合物进行表面修饰。碳纳米颗粒提供良好的生物相容性，可以制成例如纳米管或(介孔)球体。例如，可以将本发明的抗原肽(或包含其的(多)肽)的多个拷贝偶联到碳纳米颗粒(例如碳纳米管)上。对于口服施用，介孔碳纳米颗粒是优选的。二氧化硅基纳米颗粒(SiNP)也是优选的。SiNP具有生物相容性，在选择性肿瘤靶向和疫苗递送方面表现出优异的特性。SiNP表面上丰富的硅烷醇基团可以用于进一步修饰以引入额外的功能，例如细胞识别、特定生物分子的吸收、改善与细胞的相互作用以及增强细胞摄取。介孔二氧化硅纳米颗粒是特别优选的。

脂质体通常由磷脂形成，例如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。一般而言，阳离子脂质体是优选的。脂质体是自组装的，具有磷脂双层壳和水性核心。脂质体可以生成为单层囊泡(具有单个磷脂双层)或多层囊泡(具有由水层隔开的数个同心磷脂壳)。因此，抗原可以封装在核心中或在不同的层/壳之间。优选的脂质体系统是那些获准供人使用的脂质体系统，例如V和

免疫刺激复合物(ISCOM)是约40nm(直径)的笼样颗粒，是含有胶体皂苷(colloidal saponin)的胶束，例如由皂苷佐剂Quil-A、胆固醇、磷脂和(多)肽抗原(例如抗原肽或包含其的多肽)制成。这些球形颗粒可以通过非极性相互作用来存留(trap)抗原。已经描述了两种类型的ISCOM，它们都由胆固醇、磷脂(通常是磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱)和皂苷(例如Quil-A)组成。

病毒样颗粒(VLP)是由生物相容性衣壳蛋白自组装形成的自组装纳米颗粒。由于天然优化的纳米颗粒尺寸和重复的结构顺序，VLP可以诱导强效免疫反应。VLP可以源自各种病毒，尺寸范围从20nm到800nm，通常在20-150nm范围内。可以通过将这些肽/蛋白质融合到颗粒中或通过表达多种抗原来工程改造VLP，以表达额外的肽或蛋白质。此外，抗原可以化学偶联到病毒表面以产生生物偶联VLP。

自组装蛋白质的示例包括铁蛋白和主要穹窿(vault)蛋白(MVP)。铁蛋白是一种可以自组装成近球形10nm结构的蛋白质。96个MVP单元可以自组装成桶形穹窿纳米颗粒，尺寸约为40nm宽和70nm长。与最小相互作用结构域基因融合的抗原与MVP混合后，可以通过自组装过程包装在穹窿纳米颗粒内。因此，抗原(例如本发明的抗原肽或包含其的多肽)可以与自组装蛋白或其片段/结构域(例如MVP的最小相互作用结构域)融合。因此，本发明还提供了包含自组装蛋白(或其片段/结构域)和本发明的抗原肽的融合蛋白。

一般而言，纳米颗粒(NP)的优选示例包括氧化铁珠、聚苯乙烯微球、聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)NP、氧化铁-氧化锌NP、阳离子化明胶NP、普朗尼克(pluronic)稳定化的聚(硫化丙烯)(PPS)NP、PLGA NP、(阳离子)脂质体、(pH响应性)聚合物胶束、PLGA、癌细胞膜包被的PLGA、脂质-磷酸钙(LCP)NP、脂质体-鱼精蛋白-透明质酸(LPH)NP、聚苯乙烯乳胶珠、磁珠、铁-葡聚糖颗粒和量子点纳米晶体。

优选地，纳米颗粒还包含佐剂，例如toll样受体(TLR)激动剂。因此，抗原肽(包含抗原肽的免疫原性化合物/多肽/蛋白质/核酸)可以与佐剂一起递送，例如递送至抗原呈递细胞(APC)，例如树突状细胞(DC)。佐剂可以被纳米颗粒封装或结合/偶联到纳米颗粒的表面，优选与抗原肽类似。

特别优选的佐剂是聚肌苷酸:聚胞苷酸(也称为“聚I:C”)和/或其衍生物聚-ICLC。聚I:C是一种错配的双链RNA，其中一条链是肌苷酸聚合物，另一条链是胞苷酸聚合物。聚I:C是一种已知与toll样受体3(TLR3)相互作用的免疫刺激剂。聚I:C在结构上类似于双链RNA，后者是TLR3的“天然”刺激物。因此，聚I:C可以被视为双链RNA的合成类似物。聚-ICLC是羧甲基纤维素、聚肌苷酸-聚胞苷酸和聚-L-赖氨酸双链RNA的合成复合物。与聚I:C类似，聚-ICLC也是TLR3的配体。聚I:C和聚-ICLC通常会刺激细胞毒性细胞因子的释放。聚-ICLC的优选示例是

与抗原肽结合的抗体

在另一方面，本发明提供了针对(即结合)本发明的抗原肽或本发明的所述肽与MHC的复合物的抗体。

如本文所用，术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和基因工程改造抗体(变体或突变抗体)，只要保留本发明的特征性特性(即与抗原肽结合)即可。在一些实施方案中，抗体是哺乳动物抗体，例如鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或人抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗体通常包含重链上的(至少)三个互补决定区(CDR)和轻链上的(至少)三个CDR。一般而言，互补决定区(CDR)是重链可变结构域和轻链可变结构域中存在的高变区。通常，抗体的重链和连接的轻链的CDR共同形成抗原受体。通常，三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在可变结构域中非连续排列。由于抗原受体通常由两个可变结构域组成(在两个不同的多肽链上，即重链和轻链：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL))，每个抗原受体通常有六个CDR(重链：CDRH1、CDRH2和CDRH3；轻链：CDRL1、CDRL2和CDRL3)。例如，经典IgG抗体分子通常具有两个抗原受体，因此含有十二个CDR。重链和/或轻链上的CDR可以由框架区隔开，其中框架区(FR)是可变结构域中比CDR“可变”性小的区域。例如，可变区(或每个可变区分别)可以由四个框架区组成，由三个CDR隔开，此外抗体可以含有一个或多个恒定区。在一些实施方案中，抗体包含Fc区。

例如，可以通过用本发明的抗原肽(或本发明的免疫原性化合物或纳米颗粒)对哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或人)进行免疫来获得抗体。可以从人的(分离的)样本(例如，血液样本)中分离人抗体。

因此，本发明还涉及用本发明的抗原肽(或免疫原性化合物或纳米颗粒)对非人动物进行免疫的方法，所述方法包括以下步骤：

-使用本发明的抗原肽(或免疫原性化合物或纳米颗粒)接触(免疫)非人动物，

优选使用根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至42中任一项的抗原肽(或包含这种抗原肽的免疫原性化合物或纳米颗粒)。

如本文所用，“免疫”应理解为非治疗性质的，因为它涉及在所述非人动物中产生抗体。

非人动物通常适合产生抗体。优选地，非人动物是非人哺乳动物，更优选地是选自山羊和啮齿动物(例如小鼠、大鼠和兔)的动物。

本发明还涉及一种产生识别本发明的抗原肽的(多克隆)抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

-从之前已使用本发明的抗原肽(或免疫原性化合物或纳米颗粒)接触(免疫)的非人动物中分离识别所述抗原肽的(多克隆)抗体，

优选使用根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至42中任一项的抗原肽(或包含这种抗原肽的免疫原性化合物或纳米颗粒)进行接触(免疫)。

本发明还涉及一种分离细胞的方法，所述细胞产生识别本发明的抗原肽的抗体，所述方法包括以下步骤：

-从之前已使用本发明的JNK抑制剂接触(免疫)的非人动物中分离细胞，所述细胞产生识别所述抗原肽的所述抗体，

优选使用根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至42中任一项的抗原肽(或包含这种抗原肽的免疫原性化合物或纳米颗粒)进行接触(免疫)，以及

任选地使得所述细胞永生化。

本发明还涉及一种产生识别本发明的抗原肽的(单克隆)抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

-从产生所述抗体的细胞的细胞培养上清液中，分离识别本发明的抗原肽的抗体，

更优选识别根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至42中任一项的抗原肽的抗体，

所述细胞任选地被永生化。

本领域技术人员将理解，本文公开的免疫非人动物的方法和产生(多克隆)抗体的方法可以连续进行。类似地，免疫非人动物的方法、分离产生抗体的细胞的方法和产生(单克隆)抗体的方法可以组合。

在另一方面，本发明涉及一种抗体，其可用本发明的产生多克隆抗体或单克隆抗体的方法产生(和/或已用该方法产生)，其中该抗体识别至少一种本发明的抗原肽，优选是根据SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项的抗原肽。在一些实施方案中，所述抗体在较小程度上不识别(结合)相应的人肽。

本发明还涉及根据上述分离细胞的方法分离的细胞，所述细胞产生识别本发明的抗原肽的抗体，其中该细胞产生优选识别本发明的抗原肽的抗体，优选是根据SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项的抗原肽。

测试(单克隆和/或多克隆)抗体的结合亲和力的方法是本领域公知的。其中一种可能性是通过使用本发明的抗原肽作为靶肽，通过ELISA方法来表征抗体的结合亲和力。

与抗原肽结合的T细胞受体

本发明还涉及T细胞受体(TCR)，特别是可溶性TCR(sTCR)和克隆TCR，其可以被工程改造到自体或同种异体T细胞中，以及制造这些的方法，以及NK细胞或带有所述TCR或与所述TCR交叉反应的其他细胞。

如本文所用，“T细胞受体”(TCR)是T细胞(T淋巴细胞)表面的蛋白复合物，其负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原肽。

为了获得具有与本发明的抗原肽结合的T细胞受体的T细胞，例如，可以筛选哺乳动物(例如人)的(分离的)样本(例如，血液样本)，以筛选其是否与本发明的抗原肽(例如根据SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项的肽)结合。因此，抗原肽可以用作靶肽。

本发明的另一个方面是提供一种产生识别特定肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体(sTCR)的方法。此类可溶性T细胞受体可以由特定T细胞克隆产生，并且可以通过针对互补决定区的诱变来增加其亲和力。出于选择T细胞受体的目的，可以使用噬菌体展示(US2010/0113300，Liddy N等人，Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing.Nat Med 2012年6月；18(6):980-987)。出于在噬菌体展示期间使T细胞受体稳定以及在实际用作药物的情况下，可以例如通过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或通过二聚化结构域来连接α和β链(参见Boulter J M等人，Stable,soluble T-cell receptor molecules forcrystallization and therapeutics.Protein Eng 2003年9月；16(9):707-711.；Card KF等人，A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity.Cancer Immunol Immunother2004年4月；53(4):345-357；和Willcox B E等人，Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligandbinding.Protein Sci 1999年11月；8(11):2418-2423)。T细胞受体可以与毒素、药物、细胞因子(参见，例如，US2013/0115191)、募集效应细胞的结构域(例如抗CD3结构域)等连接，以便在靶细胞上执行特定功能。此外，它可以在用于过继性转移的T细胞中表达。更多信息可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO 2012/056407A1中描述。另外的产生方法在WO 2013/057586A1中公开。

药物组合物

在另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含以下中的至少一种：

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

以及，任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

特别地，上述抗原肽的优选实施方案也适用于这种本发明的药物组合物。

还优选其组合，即，包含不同的本发明的抗原肽的药物组合物。例如，药物组合物可以包含

-至少两种不同的如本文所述的本发明的抗原肽，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的细胞，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的核酸，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的宿主细胞，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-至少两种不同的如本文所述的本发明的抗体，和/或

-至少两种不同的如本文所述的本发明的T细胞受体。

因此，药物组合物可以包含(本发明的药物组合物的)至少“两种不同的组分”，优选三种、四种或五种不同的组分。一般而言，如本文所用，表述“不同的组分”是指

(1)第一组分，例如如本文所述的本发明的抗原肽、如本文所述的本发明的免疫原性化合物、如本文所述的本发明的纳米颗粒、如本文所述的本发明的细胞、如本文所述的本发明的核酸、如本文所述的本发明的宿主细胞、如本文所述的本发明的T淋巴细胞、如本文所述的本发明的抗体和/或如本文所述的本发明的T细胞受体；以及

(2)至少一种其他组分(其不同于第一组分；而在多于两种不同组分的情况下，每种组分彼此不同)，例如不同的如本文所述的本发明的抗原肽、不同的如本文所述的本发明的免疫原性化合物、不同的如本文所述的本发明的纳米颗粒、不同的如本文所述的本发明的细胞、不同的如本文所述的本发明的核酸、不同的如本文所述的本发明的宿主细胞、不同的如本文所述的本发明的T淋巴细胞、不同的如本文所述的本发明的抗体和/或不同的如本文所述的本发明的T细胞受体；或任何形式(“裸露的”、作为如本文所述的免疫原性化合物、如本文所述的纳米颗粒、如本文所述的(宿主)细胞或如本文所述的核酸)的一种或多种人肿瘤抗原(片段)。

“不同的组分”优选是在待预防和/或治疗的疾病(癌症)的背景下的活性组分(如上所述)。换句话说，每种不同的组分也可以用于预防和/或治疗所述癌症，特别是如果单独施用(而不是如本文所述组合施用)——尽管组合(即组合施用)通常会增强其预防和/或治疗效果(例如免疫反应)，优选以协同的方式施用。

优选地，“不同的组分”是相同类型的(例如，不同的抗原肽、不同的免疫原性化合物、不同的纳米颗粒、不同的核酸、不同的(宿主)细胞、不同的T细胞受体、不同的抗体或不同的T淋巴细胞)，并且彼此之间的区别仅在于它们涉及不同的如本文所述的本发明的抗原肽。

优选地，组合物可以包含至少三种、四种或五种不同的活性组分，它们优选是相同类型的，但不同之处(仅)在于它们各自涉及不同的抗原肽。

更优选地，组合物可以包含至少三种、四种或五种不同的活性组分，它们优选是相同类型的，但不同之处(仅)在于它们各自涉及不同的抗原肽，其中

-第一组分涉及包含人肿瘤抗原CDC20片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第二组分涉及包含人肿瘤抗原KIF2C片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；和

-(不同的)第三组分涉及包含人肿瘤抗原UBE2C片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽。

优选地，这种组合物还可以包含

-(不同的)第四组分，其涉及包含人肿瘤抗原BIRC5片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；和/或

-(不同的)第五组分，其涉及包含人肿瘤抗原FOXM1片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽。

下表2提供了可用于与(上述)本发明的肽组合的额外肽的列表。SEQ ID NO：32至34也指HLA-A*02抗原肽。

表2.可用于与本发明的抗原肽组合使的额外HLA-A*02抗原肽。

应理解的是，可以以相同的形式(即作为抗原肽、免疫原性化合物、纳米颗粒、装载有肽的细胞、核酸、宿主细胞、T淋巴细胞、如本文所述用于本发明的抗原肽的抗体或T细胞受体)提供这些用于与本发明的抗原肽组合的额外抗原肽。

因此，药物组合物优选包含

-第一组分，其涉及包含SEQ ID NO：17的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第二组分，其涉及包含SEQ ID NO：18的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第三组分，其涉及包含SEQ ID NO：19的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-任选地，(不同的)第四组分，其涉及包含SEQ ID NO：35的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；和

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含SEQ ID NO：36的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽。

更优选地，药物组合物优选包含

-第一组分，其涉及包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第二组分，其涉及包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第三组分，其涉及包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-任选地，(不同的)第四组分，其涉及包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽，和

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

甚至更优选地，药物组合物优选包含

-包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-任选地，包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽，和

-任选地，包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

应理解的是，药物组合物还可以含有——代替上述优选的抗原肽组合——本发明的免疫原性化合物的各自组合、本发明的纳米颗粒的各自组合、本发明的核酸的各自组合等，如上所述。

优选地，药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

本发明的药物组合物可以是适合于本发明的目的的任何形式。例如，所述组合物可以是适合于肠外、肠内或局部施用的形式，例如液体悬浮剂、固体剂型(颗粒、丸剂、胶囊或片剂)或糊剂或凝胶。本领域技术人员可以选择用于预期目的的合适的组合物形式。

本发明的组合物还可以包含其他活性剂，例如可以增强抗原肽或免疫原性化合物的效果的活性剂。可替选地，组合物可以不包含任何其他活性剂(即，除了本发明的抗原肽、本发明的免疫原性化合物、本发明的纳米颗粒、本发明的细胞、本发明的核酸和/或本发明的宿主细胞之外)。

本文定义的药物组合物优选为免疫原性组合物，即能够诱导、增加、延长或维持免疫反应的组合物。这可以通过所述组合物中包含的本发明的抗原肽或本发明的免疫原性化合物来实现。优选地，药物组合物还包含一种或多种免疫佐剂物质。药物组合物，特别是免疫原性组合物，在本说明书中也可以称为“疫苗组合物”。

优选地，药物组合物还包含至少一种免疫刺激剂，特别是为了增加、增强、延长或维持由抗原肽介导的免疫反应。优选的本发明的免疫刺激剂包括但不限于免疫佐剂、抗原呈递细胞及其组合。优选地，免疫刺激剂是免疫佐剂或抗原呈递细胞(APC)。

优选地，免疫刺激剂是免疫佐剂。一些免疫佐剂能够促进和延长抗原和免疫系统之间相互作用的时间，而另一些免疫佐剂能够募集和活化天然免疫细胞，从而诱导适应性反应。属于前一类的佐剂包括但不限于矿物化合物，例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物；以及油基乳剂，例如石蜡油、淀粉油、弗氏完全/不完全佐剂(FCA/FIA)、皂苷(例如，来自植物皂皮树(Quillaja)、大豆、美远志(Polygala senega))。属于后一类的佐剂包括但不限于免疫刺激复合物(ISCOM)，例如细胞因子(例如GM-CSF；白细胞介素，例如IL-1、IL-2、IL6、IL8或IL12；肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNFα或TNFβ；干扰素IFN，例如IFNα、IFNβ、IFNγ或IFNδ等)；toll样受体(TLR)的配体，例如咪喹莫特、瑞喹莫特或MPL；外泌体，例如源自树突状细胞(DC)或肿瘤细胞的外泌体；细菌产物，例如热休克蛋白(HSP，例如gp96、hsp90、hsp70、钙网蛋白、hsp110、hsp170)、病原体相关分子模式(PAMP)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、胞壁酰二肽(MDP)；多糖(PLS)，例如多糖-K。

更优选地，免疫佐剂是具有免疫佐剂特性(例如提供对CD4+Th1细胞的刺激)的蛋白质/肽，如本文所述(“辅助”肽)。这可以是唤起免疫记忆或提供非特异性辅助的非肿瘤抗原，也可以是特定的肿瘤来源的辅助肽，例如破伤风辅助肽、钥孔血蓝蛋白肽或PADRE肽。另一个示例是特定的肿瘤来源的辅助肽，其可以由MHC II(特别是由HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ)呈递，例如共有过表达肿瘤抗原的片段，例如HER2、NY-ESO-1、hTERT或IL13RA2。在一些实施方案中，免疫佐剂可以是HHD-DR3肽或h-pAg T13L(Bhasin M,Singh H,Raghava GP(2003)MHCBN:a comprehensive database of MHC binding and non-bindingpeptides.Bioinformatics 19:665-666)。优选地，辅助肽是UCP2肽(SEQ ID NO：39)。

优选地，药物组合物包含至少两种不同的本发明的抗原肽和一种辅助肽，优选UCP2肽(SEQ ID NO：39)。

优选地，药物组合物包含本发明的第一抗原肽，其包含人肿瘤抗原CDC20的片段的序列变体或由其组成；本发明的第二抗原肽，其包含人肿瘤抗原KIF2C的片段的序列变体或由其组成；本发明的第三抗原肽，其包含人肿瘤抗原UBE2C的片段的序列变体或由其组成；本发明的第四抗原肽，其包含人肿瘤抗原BIRC5的片段的序列变体或由其组成；本发明的第五抗原肽，其包含人肿瘤抗原FOXM1的片段的序列变体或由其组成；以及辅助肽。

更优选地，药物组合物包含第一抗原肽，其包含CDC20片段(人参考肽)“SLPDRILDA”(SEQ ID NO：17)的序列变体或由其组成，例如包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；第二抗原肽，其包含KIF2C片段(人参考肽)“AINPELLQL”(SEQ IDNO：18)的序列变体或由其组成，例如包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；第三抗原肽，其包含UBE2C片段(人参考肽)“ALYDVRTIL”(SEQ ID NO：19)的序列变体或由其组成，例如包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；第四抗原肽，其包含BIRC5片段(人参考肽)“LTLGEFLKL”(SEQ ID NO：35)的序列变体或由其组成，例如包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；第五抗原肽，其包含FOXM1片段(人参考肽)“LMDLSTTPL”(SEQ ID NO：36)的序列变体或由其组成，例如包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；以及辅助肽，优选UCP2肽(SEQ ID NO：39)。

甚至更优选地，药物组合物包含五种不同的抗原肽，其中抗原肽包含SEQ ID NO：1、2、3、32和33所示的氨基酸序列或由其组成。此外，药物组合物还可以包含SEQ ID NO：39所示的UCP2肽。

在一些实施方案中，药物组合物不包含另外的抗原肽(除了上述抗原肽之外)。

在一些实施方案中，药物组合物包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(也称为“聚I:C”)和/或其衍生物聚-ICLC(作为免疫佐剂)。聚I:C是一种错配的双链RNA，其中一条链是肌苷酸聚合物，另一条链是胞苷酸聚合物。聚I:C是一种已知与toll样受体3(TLR3)相互作用的免疫刺激剂。聚I:C在结构上类似于双链RNA，后者是TLR3的“天然”刺激物。因此，聚I:C可以被视为双链RNA的合成类似物。聚-ICLC是羧甲基纤维素、聚肌苷酸-聚胞苷酸和聚-L-赖氨酸双链RNA的合成复合物。与聚I:C类似，聚-ICLC也是TLR3的配体。聚I:C和聚-ICLC通常会刺激细胞毒性细胞因子的释放。聚-ICLC的优选示例是

更优选地，药物组合物包含Montanide，例如Montanide ISA 51VG和/或MontanideISA 720VG。当这些佐剂与水基抗原介质混合时，会形成稳定的油包水乳剂。Montanide ISA51VG基于甘露醇单油酸酯表面活性剂和矿物油的混合物，而Montanide ISA 720VG使用非矿物油(Aucouturier J,Dupuis L,Deville S,Ascarateil S,Ganne V.Montanide ISA720and 51:a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for humanvaccines.Expert Rev Vaccines.2002年6月；1(1):111-8；Ascarateil S,Puget A,KoziolM-E.Safety data of Montanide ISA 51VG and Montanide ISA 720VG,two adjuvantsdedicated to human therapeutic vaccines.Journal for Immunotherapy ofCancer.2015；3(Suppl 2):P428.doi:10.1186/2051-1426-3-S2-P428)。

在一些实施方案中，药物组合物还可以包含至少一种抗癌治疗剂。在另一方面，本发明涉及本发明的药物组合物与至少一种抗癌治疗剂的组合。药物组合物可以包含抗癌治疗剂(作为组合制剂)；或者本发明的药物组合物和抗癌治疗剂可以以分开的方式提供，例如作为成套试剂盒。因此，本发明的药物组合物和抗癌治疗剂可以同时、分开或顺序施用。换句话说，本发明提出了本发明的药物组合物和至少一种抗癌治疗剂的组合用途，用于同时、分开或顺序施用。

因此，所述治疗剂优选能够预防和/或治疗与本发明的抗原肽用于的癌症类型相同的癌症。优选地，抗癌治疗剂选自抗体、CAR-T细胞、肿瘤细胞裂解物、化疗剂、放射治疗剂、免疫检查点调节剂及其组合。

抗体在癌症疗法中特别有利，因为它们可以与癌细胞表面的特定抗原结合，从而将疗法导向肿瘤(即这些被称为肿瘤靶向抗体)，或阻断癌症中失调的免疫检查点(即这些在本文中被称为免疫调节抗体)。后一类抗体的目的是抑制癌症免疫抵抗，尤其会观察到这种免疫抵抗是针对特异于肿瘤抗原的T细胞。事实上，正如本领域所公知的，在正常生理条件下，免疫检查点对于维持自身耐受性(即预防自身免疫)至关重要，并在免疫系统对病原体感染作出反应时保护组织免受损害。然而，在癌症中，免疫检查点表达可能失调，这是免疫抵抗的重要机制。尤其是在黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌和胰腺癌中观察到对于PD-L1检查点的抵抗(Konishi等人，B7-H1 expression on non-small cell lungcancer cells and its relationship with tumor-infiltrating lymphocytes andtheir PD-1expression.Clin Cancer Res.2004年8月1日；10(15):5094-100；Ghebeh等人，The B7-H1(PD-L1)Tlymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancerpatients with infiltrating ductal carcinoma:correlation with important high-risk prognostic factors.Neoplasia.2006年3月；8(3):190-8；Hino等人，Tumor cellexpression of programmed cell death-1ligand 1is a prognostic factor formalignant melanoma.Cancer.2010年4月1日；116(7):1757-66)。免疫检查点的其他示例包括但不限于PD-L2、PD-1、CD80、CD86、CTLA-4、B7H3、B7H4、PVR、TIGIT、GAL9、LAG-3、GITR、CD137、TIM3、VISTA、VISTA-R(Pico de等人，Checkpoint blockade for cancertherapy:revitalizing a suppressed immune system.Trends Mol Med.2015年8月；21(8):482-91；Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer.2012年3月22日；12(4):252-64)。

抗体通常以裸露的单克隆抗体(即非偶联)的形式或与其他分子偶联用于上述目的，所述其他分子可以是对细胞有毒的或放射性的。

用于癌症免疫疗法的公知的单克隆肿瘤靶向抗体的示例包括但不限于阿仑单抗(alemtuzumab)(慢性淋巴细胞白血病)、贝伐单抗(bevacizumab)(结直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、肾癌)、维布妥昔单抗(brentuximab/vedotin)(淋巴瘤)、blinatumumab(急性淋巴细胞白血病)、卡妥索单抗(catumaxomab)(EPCAM+癌症中的恶性腹水)、西妥昔单抗(cetuximab)(头颈癌、结直肠癌)、地诺单抗(denosumab)(乳腺癌、前列腺癌和骨癌)、吉妥珠单抗/奥唑米星(Gemtuzumab/ozogamicin)(急性髓性白血病)、替伊莫单抗(ibritumomab/tiuxetan)(非霍奇金淋巴瘤)、帕尼单抗(panitumumab)(结直肠癌)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(乳腺癌)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)(慢性淋巴细胞白血病)、奥法木单抗(ofatumumab)(慢性淋巴细胞白血病)、伊匹单抗(ipilimumab)(黑色素瘤)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(胃癌和胃食管癌)、利妥昔单抗(rituximab)(慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗(siltuximab)(多中心Catsleman病)、托西莫单抗(tositumomab)(非霍奇金淋巴瘤)和曲妥珠单抗(trastuzumab)(乳腺癌、胃癌和胃食管癌)；而免疫调节抗体的示例包括但不限于：伊匹单抗(黑色素瘤)，其阻断CTLA4依赖性免疫检查点；纳武单抗(nivolumab)(黑色素瘤、肺癌)和派姆单抗(prembrolizubmab)(黑色素瘤)，两者均阻断PDCD1依赖性免疫检查点；以及MPDL3280A、MEDI4736、MEDI0680和MSB0010718C，其均阻断PD-L1依赖性免疫检查点(Sharma和Allison，The future ofimmune checkpoint therapy.Science.2015年4月3日；348(6230):56-61)。

用于癌症免疫疗法的其他抗体描述见于Buqué等人，Trial Watch:Immunomodulatory monoclonal antibodies for oncologicalindications.Oncoimmunology.2015年3月2日；4(4):e1008814.eCollection 2015年4月；Redman等人，Mechanisms of action of therapeutic antibodies for cancer.MolImmunol.2015年10月；67(2Pt A):28-45；Simpson和Caballero，Monoclonal antibodiesfor the therapy of cancer MC Proc.2014；8(Suppl 4):O6以及抗体协会网站(欧盟或美国已批准或正在审查的治疗性单克隆抗体列表，可在以下网页链接获取：http://www.antibodysociety.org/news/approved_mabs.php)。

使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过继性细胞免疫疗法已经改变了B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗前景，尤其是对于侵袭性B细胞淋巴瘤。例如，CD19靶向的CAR T细胞代表了先前经过至少两线(line)疗法的难治性DLBCL患者的新标准疗法。两种CAR T细胞产品阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel，axi-cel)(KTE-019)(YESCARTA^TM)和替基仑赛(tisagenlecleucel)(CTL019)(KYMRIAH^TM)已获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准，用于治疗经过两线疗法的难治性DLBCL。第三种产品利基迈仑赛(lisocabtagenemaraleucel，liso-cel)(JCAR017)目前正在临床试验中进行评价。其他CAR T细胞包括CD20-CAR-T细胞。

肿瘤细胞裂解物也可以与本发明的抗原肽组合。肿瘤细胞确实能够通过呈递内源性肽-MHC复合物以及通过宿主的树突状细胞(DC)来启动(prime)免疫反应，树突状细胞可以处理和呈递由所述裂解物递送的抗原。由此可以增加可诱导免疫反应的抗原范围。可以通过用热休克和/或化学处理来处理肿瘤细胞，从而容易地获得肿瘤细胞裂解物，并且可以是自体的(即从患者中分离的)或同种异体的(即从另一个受试者中分离的)。

标准化疗药物和放射治疗剂无需在此进一步描述，因为它们已在文献中进行了详细描述，尤其是由Baskar等人(Baskar等人，Cancer and radiation therapy:currentadvances and future directions.Int J Med Sci.2012；9(3):193-9)，Paci等人(Paci等人，Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part 1--cytotoxics.Eur J Cancer.2014年8月；50(12):2010-9)和Widmer等人(Widmer等人，Review of therapeutic drug monitoring of anticancer drugs part two--targetedtherapies.Eur J Cancer.2014年8月；50(12):2020-36)描述。此类药物和试剂的清单也可在cancer.gov网站(http://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs)上获得。

优选地，与本文定义的抗原肽组合的免疫检查点调节剂是选自以下的一种或多种免疫检查点分子的活化剂或抑制剂：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、GITR、TNFR和/或FasR/DcR3；或其一种或多种配体的活化剂或抑制剂。

更优选地，免疫检查点调节剂是(共)刺激性检查点分子的活化剂或抑制性检查点分子的抑制剂或它们的组合。因此，免疫检查点调节剂更优选为(i)CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS的活化剂或(ii)A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PDL-1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或FasR/DcR3的抑制剂。

甚至更优选地，免疫检查点调节剂是抑制性检查点分子的抑制剂(但优选不是刺激性检查点分子的抑制剂)。因此，免疫检查点调节剂甚至更优选为A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PDL-1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或DcR3或其配体的抑制剂。

优选地，用于与本文定义的抗原肽组合的检查点调节剂可以选自CTLA-4通路或PD-1通路的已知的调节剂。更优选地，免疫检查点调节剂为CTLA-4、PD-L1、PD-L2或PD-1的抑制剂；甚至更优选为PD-1通路的抑制剂。

本领域普通技术人员能够为本发明的目的选择合适的免疫抗癌治疗剂。例如，如果希望预防或治疗黑色素瘤，可以优选使用来自黑色素瘤细胞的裂解物和/或抗体伊匹单抗，以及合适的抗原肽。可以通过以下方式选择合适的抗原肽：(i)选择针对某种类型癌症的本领域已知的合适的肿瘤抗原以及(ii)为所选择的肿瘤抗原选择合适的本发明的抗原肽，如上所述，例如表1中所述。

抗癌治疗剂还可以与本发明的组合物组合施用，可以同时、分开或顺序施用。如果组合物和治疗剂以分开或顺序的方式施用，则可以以不同的药物形式施用。

因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的组合物和至少一种上述抗癌治疗剂，作为用于同时、分开或顺序施用的组合制剂。换句话说，本发明提出了本发明的组合物和至少一种上述抗癌治疗剂的组合用途，用于同时、分开或顺序施用。

成套试剂盒

在另一方面，本发明还提供了成套试剂盒(本文也称为“试剂盒”)，其包含以下中的至少一项：

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，

-如本文所述的本发明的T细胞受体，和/或

-如本文所述的本发明的药物组合物。

特别地，上述抗原肽的优选实施方案也适用于这种本发明的试剂盒。

还优选其组合，即，包含不同的本发明的抗原肽的试剂盒。特别地，本发明的成套试剂盒可以包含多于一种上述组分，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的组分。例如，本发明的成套试剂盒可以包含至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的免疫原性化合物、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的抗原肽、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的纳米颗粒、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的细胞、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的核酸、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的宿主细胞、至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)不同的药物组合物等。优选地，上述成套试剂盒中包含的此类不同组分在本发明的抗原肽方面不同，例如一种组分涉及第一抗原肽，一种组分涉及第二抗原肽(不同于该第一抗原肽)。例如，试剂盒可以包含至少两种不同的本发明的免疫原性化合物。例如，试剂盒可以包含至少两种不同的本发明的抗原肽。例如，试剂盒可以包含至少两种不同的本发明的纳米颗粒。例如，试剂盒可以包含至少两种不同的本发明的核酸。例如，试剂盒可以包含至少两种不同的本发明的细胞毒性T淋巴细胞。

试剂盒中包含的本发明的组分(例如抗原肽)的优选组合对应于上述药物组合物中包含的本发明的组分(例如抗原肽)的优选组合。

因此，本发明提供了一种试剂盒，其包含至少两种、优选三种、更优选四种或五种不同的如本文所述的抗原肽(或上述免疫原性化合物、纳米颗粒、核酸、细胞等，其在抗原肽方面不同)，以及任选地包含辅助肽(例如SEQ ID NO：39的UCP2肽)和/或佐剂(例如MONTANIDE ISA 51)。

优选地，试剂盒包含不同的抗原肽(以肽的形式或以上述任何其他形式)，包括(i)至少一种本发明的抗原肽，例如如表1所示；以及(ii)至少一种上述额外的抗原肽，例如如上表2所示。

在一些实施方案中，试剂盒包含

-第一组分，其涉及包含人肿瘤抗原CDC20片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第二组分，其涉及包含人肿瘤抗原KIF2C片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-(不同的)第三组分，其涉及包含人肿瘤抗原UBE2C片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；

-任选地，(不同的)第四组分，其涉及包含人肿瘤抗原BIRC5片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽；和

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含人肿瘤抗原FOXM1片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽。

优选地，试剂盒包含

更优选地，试剂盒包含

应当理解的是，试剂盒还可以含有——代替上述优选的抗原肽组合——本发明的免疫原性化合物的各自组合、本发明的纳米颗粒的各自组合、本发明的核酸的各自组合等，如上所述。

优选地，试剂盒还包含SEQ ID NO：39的UCP2辅助肽。

在一些实施方案中，除了上述任何组分之外，试剂盒还包含上述抗癌治疗剂。

因此，所述治疗剂优选能够预防和/或治疗与本发明的抗原肽所针对的癌症类型相同的癌症。优选地，抗癌治疗剂选自上述抗体、上述CAR-T细胞、上述肿瘤细胞裂解物、上述化疗剂、上述放射治疗剂、上述免疫检查点调节剂及其组合。

成套试剂盒的各个组分可以包装在一个或多个容器中。上述组分可以以冻干或干燥形式提供或溶解在合适的缓冲液中。试剂盒还可以包含另外的试剂，包括例如防腐剂、生长培养基和/或用于储存和/或复溶上述组分的缓冲液、洗涤液等。

不同的抗原肽(或上述免疫原性化合物、纳米颗粒、核酸、细胞等，其在抗原肽方面不同)可以包含在相同或不同的容器中。例如，试剂盒可以包含(单个)容器，其含有如本文所述的第一抗原肽和如本文所述的第二抗原肽。所述(单个)容器还可以另外包含辅助肽，例如UCP2。任选地，包含在(单个)容器中的第一抗原肽和第二抗原肽(以及任选地，辅助肽)可以一起配制，例如配制在注射用水和/或二甲基亚砜(DMSO)中。此外，试剂盒还可以包含另一个容器(不同于包含抗原肽的容器)，该容器包含佐剂，例如MONTANIDE ISA 51。

任选地，试剂盒还可以包含注射用水小瓶和/或小瓶适配器。还可以包含无菌针头，例如用于在获得乳剂后对患者进行疫苗接种。试剂盒还可以包含一个或多个注射器。

此外，本发明的成套试剂盒可以任选地含有使用说明。因此，优选地，试剂盒包含包装插页或说明书，其中有通过使用本发明的免疫原性化合物、本发明的抗原肽、本发明的纳米颗粒、本发明的细胞、本发明的核酸、本发明的宿主细胞、本发明的药物组合物等来预防或治疗癌症的指导，如上所述。

此外，本发明还提供了用于治疗、预防和/或稳定癌症的疫苗接种试剂盒，其包含如本文所述的药物组合物或如本文所述的疫苗以及所述药物组合物或所述疫苗在预防和/或治疗癌症中的使用说明。

医学治疗和用途

如上所述，本发明的抗原肽(以上述多种不同形式)可以特别用于预防或治疗目的(作为药物)，尤其是用于触发针对特定肿瘤抗原/蛋白质的特定免疫反应，例如用于预防或治疗癌症，例如在有需要的患者中使用。

鉴于此，本发明提供

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒，

用于医疗，特别是用于预防和/或治疗增生性疾病，优选用于预防和/或治疗癌症。

此外，本发明还提供了一种用于预防(减少发生)和/或治疗癌症或启动、增强或延长(有需要的)受试者的抗肿瘤反应的方法，所述方法包括向受试者施用(有效量的)

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒。

特别地，上述抗原肽的优选实施方案也适用于本发明的在预防和/或治疗癌症中的用途。癌症的非限制性示例包括结直肠癌、肺癌、前列腺癌和/或乳腺癌。

此外，本发明提供了一种在受试者中引发或改善依赖于CD8⁺细胞毒性T细胞的针对一个或多个表位的免疫反应的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用以下任一项：

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒。

可以通过评价炎症反应、促炎细胞因子反应来确定依赖于CD8⁺反应的免疫反应，包括相对于施用本发明的化合物之前的水平，IFN-γ、TNF-α和IL-2mRNA或蛋白质中的一种或多种的表达增加。还可以通过施用本发明的化合物后，抗原特异性T细胞的频率或绝对数量的增加来测量，通过HLA-肽多聚体染色、ELISPOT测定和迟发型超敏反应测试来测量。还可以通过依赖于抗原特异性T辅助细胞的抗原特异性血清抗体的增加来间接测量。

本发明还提供了一种在受试者中引发或改善针对一种或多种抗原或抗原表位的免疫反应的方法，所述免疫反应受到多种MHC I类分子的限制，其中所述方法包括向所述受试者施用以下任一项：

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒。

可以通过评价细胞因子反应来确定在受试者中引发或改善针对如本文所述的多个表位的免疫反应的方法，该反应受到多种MHC I类分子的限制，所述方法包括在体外用与抗原呈递细胞上离散的(discrete)MHC I类分子结合的单个肽刺激T细胞后，与施用本发明的化合物前的水平相比，IFN-γ、TNF-α和IL-2的mRNA或蛋白中的一种或多种的表达增加。还可以通过使用表达MHC I类分子的抗原呈递细胞或通过使用MHC I类阻断抗体来验证对MHC I类分子的限制。还可以通过施用本发明的化合物后，抗原特异性T细胞的频率或绝对数量的增加来测量，通过HLA-肽多聚体染色使用与MHC I类分子组装的多聚体来测量。

本发明更具体地涉及如上定义的组合物，用作免疫疗法的疫苗。此外，

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒

可以用作疫苗，特别是用于(癌症)免疫疗法。

在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指提供先天和/或适应性免疫的(生物)制剂，通常针对特定疾病，优选是癌症。因此，疫苗特别支持待治疗受试者的免疫系统的先天和/或适应性免疫反应。例如，本发明的抗原肽通常导致或支持待治疗患者的适应性免疫反应。

在本发明的上下文中，疫苗(组合物)可以诱导针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，因此优选用于预防或治疗癌症。

因此，在优选的实施方案中，本发明涉及如上定义的组合物，用于预防和/或治疗有需要的受试者的癌症。更优选地，本发明涉及本发明的组合物在制备用于在有需要的受试者中预防或治疗癌症的药物中的用途。换句话说，本发明涉及一种在有需要的受试者中预防或治疗癌症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的组合物施用于所述受试者。

优选地，有待通过以下任一项预防和/或治疗的癌症

-如本文所述的本发明的抗原肽，

-如本文所述的本发明的免疫原性化合物，

-如本文所述的本发明的纳米颗粒，

-如本文所述的本发明的细胞，

-如本文所述的本发明的核酸，

-如本文所述的本发明的宿主细胞，

-如本文所述的本发明的T淋巴细胞，

-如本文所述的本发明的抗体，和/或

-如本文所述的本发明的T细胞受体，

-如本文所述的本发明的药物组合物，或

-如本文所述的本发明的试剂盒，

涉及如本文所述的抗原肽的(参考)肿瘤抗原。即，可以通过以下方式选择合适的抗原肽：(i)选择针对某种类型癌症的本领域已知的合适的肿瘤抗原以及(ii)为所选择的肿瘤抗原选择合适的本发明的抗原肽，如上所述，例如表1中所述(以及任选地，此外还有表2)。本领域技术人员将容易地理解，可以基于待预防或治疗的癌症的性质和/或所述癌症中涉及的人基因/人肿瘤抗原来选择本发明的抗原肽。

特别优选用于预防或治疗癌症的是本发明的肽(单独或组合的)，其选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：42。更优选的是选自SEQ ID NO：1至SEQID NO：16和SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：42(参见表1)的肽(单独或组合的)，任选地与选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：34(参见表2)的至少一种肽组合，以及它们在结直肠癌、肺癌、前列腺癌和/或乳腺癌的免疫疗法中的用途。

因此，本发明的另一个方面涉及根据SEQ ID NO：1至16和SEQ ID NO：40至SEQ IDNO：42中任一项的至少一种肽的用途，用于(优选组合地)治疗增殖性疾病，所述增殖性疾病选自结直肠癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌。

因此，本发明的另一个方面涉及本发明的肽的用途，用于(优选组合地)治疗增殖性疾病，特别是癌症，例如选自结直肠癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌。

如上所述，在本发明的药物组合物和试剂盒的上下文中，优选上述条款的组合，即，不同的本发明的抗原肽优选用于预防和/或治疗癌症。优选地，可以使用多于一种的上述组分，用于预防和/或治疗癌症。例如，至少两种不同的抗原肽、至少两种不同的免疫原性化合物、至少两种不同的纳米颗粒、至少两种不同的细胞、至少两种不同的核酸、至少两种不同的宿主细胞、至少两种不同的药物组合物等可以用于预防和/或治疗癌症。优选地，用于预防和/或治疗癌症的此类不同组分在本发明的抗原肽方面不同，例如，一种组分涉及第一抗原肽，一种组分涉及第二抗原肽(不同于该第一抗原肽)，如上所述，例如在药物组合物或试剂盒的上下文中。

因此，本发明还提供了至少两种不同的本发明的抗原肽的组合，用于预防或治疗癌症。

对于预防或治疗癌症，例如结直肠癌、肺癌、前列腺癌和/或乳腺癌，上述抗原肽的组合(在药物组合物或试剂盒的上下文中)是优选的。

在一些实施方案中，

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含人肿瘤抗原FOXM1片段的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽

可以(组合，即同时或连续)施用，用于预防和/或治疗癌症。

优选地，

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含SEQ ID NO：36的(微生物群)序列变体或由其组成的抗原肽

(组合，即同时或连续)施用，用于预防和/或治疗癌症。

更优选地，

-任选地，(不同的)第四组分，其涉及包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽，以及

-任选地，(不同的)第五组分，其涉及包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽

(组合，即同时或连续)施用，用于预防和/或治疗癌症。

施用方法是本领域技术人员公知的。关于本发明的组合物，它可以直接施用至受试者中，施用至受影响的器官中(即局部施用)或全身施用(即肠内或肠胃外施用)，或者甚至可以离体应用于源自受试者的细胞或人细胞系，然后再施用至受试者，或者甚至可以在体外用于选择源自受试者的免疫细胞亚群，然后再重新施用至所述受试者。肠内施用包括口服施用和直肠施用，以及经由胃饲管、十二指肠饲管或胃造瘘术施用，而肠胃外施用尤其包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、动脉内注射、皮内注射、骨内注射、脑内注射和鞘内注射。施用方法将通常取决于组合物中存在的抗原肽和/或免疫原性化合物、待治疗的癌症类型以及在所述组合物中可能含有的其他活性剂。例如，如果免疫原性化合物是如上定义的核酸，则施用优选是肌内注射或皮内注射，如果所述核酸克隆到病毒载体中，则口服/鼻腔施用是特别优选的。可替选地，如果抗原肽和/或免疫原性化合物为上述定义的(多)肽，或者如果其装载在如本文所述的纳米颗粒之中/之上，则施用优选是肌内、皮内或口服施用。以及，仍可替选地，如果抗原肽和/或免疫原性化合物以上述定义的肠道细菌的形式递送，尤其如果肠道细菌是益生菌的形式，则施用优选是口服施用。

本发明的抗原肽、免疫原性化合物和核酸还可以进一步被封装，以便将其施用至有需要的受试者。例如，这些可以被封装到肽纳米载体中(如果免疫原性化合物是核酸或(多)肽，则优选此方式)，封装到病毒体中(如果免疫原性化合物是核酸或(多)肽，则优选此方式)，或封装到基于脂质的载体系统(如脂质体-聚阳离子-DNA复合物)中(如果免疫原是核酸或(多)肽，则优选此方式)(Trovato M,De Berardinis P.Novel antigen deliverysystems.World J Virol.2015年8月12日；4(3):156-68；Saade F,PetrovskyN.Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines.Expert Rev Vaccines.2012年2月；11(2):189-209；Li等人，Peptide Vaccine:Progress and Challenges.Vaccines(Basel).2014年7月2日；2(3):515-36)。

组合物也可以多次施用，以达到期望的效果。在一个优选的实施方案中，所述组合物重复施用至少两次，优选多于两次。这可以在较长的一段时间内进行，例如每周、每隔一周、每月、每年、或者甚至在第一次施用后的数年内进行，以确保适当地对受试者进行免疫。

本发明还涉及一种杀伤或减少患者的靶细胞数量的方法，所述靶细胞异常表达包含本发明的抗原肽或相应的人参考肽的多肽，所述方法包括向患者施用有效数量的本发明产生的T细胞。

本发明还涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、活化的T淋巴细胞、T细胞受体或本发明的抗体或其他肽结合分子和/或肽-MHC结合分子的用途，用作药物或用于制备药物。优选地，药物具有针对癌症的活性。

在一些实施方案中，所述药物用于细胞疗法、疫苗或基于可溶性TCR或抗体的蛋白质。

附图说明

下面将给出附图的简要说明。附图旨在更详细地说明本发明。然而，它们并不旨在以任何方式限制本发明的主题。

图1：显示了在实施例1中抗原肽CDC20-B1(ENT204_B1)与相应的人CDC20表位CDC20-H1(ENT204-H)相比的体外亲和力。

图2：显示了在实施例1中抗原肽KIF2C-B1(ENT207_B1)与相应的人KIF2C表位KIF2C-H1(ENT207-H)相比的体外亲和力。

图3：显示了在实施例1中抗原肽UBE2C-B1(ENT168_B1)与相应的人UBE2C表位UBE2C-H1(ENT168-H)以及另一个人UBE2C表位UBE2C-H11(ENT168-HL)相比的体外亲和力。

图4：显示了在实施例1中抗原肽ANKRD30A-B1(ENT169_B1)与相应的人ANKRD30A表位ANKRD30A-H1(ENT169-H)相比的体外亲和力。

图5：显示了在实施例1中抗原肽CDH17-B1(ENT176_B1)与相应的人CDH17表位CDH17-H1(ENT176-H)相比的体外亲和力。

图6：显示了在实施例1中抗原肽TOP2A-B2(ENT205_B1)与相应的人TOP2A表位TOP2A-H2(ENT205-H)相比的体外亲和力。

图7：显示了在实施例2中使用抗原肽CDC20-B1(ENT204_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与人相应肽CDC20-H1(ENT204-H)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图8：显示了在实施例2中使用抗原肽KIF2C-B1(ENT207_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与人相应肽KIF2C-H1(ENT207-H)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图9：显示了在实施例2中使用抗原肽UBE2C-B1(ENT168_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与与人相应肽UBE2C-H1(ENT168-H)和另一个人UBE2C表位UBE2C-H11(ENT168-HL)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图10：显示了在实施例2中使用抗原肽ANKRD30A-B1(ENT169_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与人相应肽ANKRD30A-H1(ENT169-H)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图11：显示了在实施例2中使用抗原肽CDH17-B1(ENT176_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与人相应肽CDH17-H1(ENT176-H)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图12：显示了在实施例2中使用抗原肽TOP2A-B2(ENT205_B1)进行疫苗接种的HHDDR1 HLA-A2转基因小鼠的ELISPOT结果(如图所示)，以及与人相应肽TOP2A-H2(ENT205-H)的交叉反应。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。

图13：显示了在实施例3中在来自健康供体(HLA-A2阳性)的外周血中检测到的CDC20-B1、KIF2C-B1和UBE2C-B1肽特异性CD8+T细胞。

图14：显示了在实施例1中抗原肽KIF2C-B11(ENT207_B2)与相应的人KIF2C表位KIF2C-H1(ENT207-H)相比的体外亲和力。

图15：显示了在实施例1中抗原肽KIF2C-B12(ENT207_B3)与相应的人KIF2C表位KIF2C-H1(ENT207-H)相比的体外亲和力。

图16：显示了在实施例1中抗原肽KIF2C-B13(ENT207_B4)与相应的人KIF2C表位KIF2C-H1(ENT207-H)相比的体外亲和力。

图17：显示了在实施例1中抗原肽UBE2C-B11(ENT168_B2)与相应的人UBE2C表位UBE2C-H1(ENT168-H)相比的体外亲和力。

图18：显示了在实施例3中体外扩增的CDC20-B1、KIF2C-B1和UBE2C-B1肽特异性人T细胞克隆在源自微生物群的肽刺激下的细胞毒性能力。CDC20-B1、KI2C-B1和UBE2C-B1肽特异性T细胞具有杀伤装载有细菌肽或人肽的T2细胞的能力。

实施例

在下面，将展示说明本发明的各种实施方案和方面的具体实施例。然而，本发明的范围不应受到本文所描述的具体实施方案的限制。下面给出的制备和实施例是为了使本领域技术人员能够更清楚地理解并实践本发明。然而，本发明的范围不受示例实施方案的限制，这些实施方案仅旨在作为本发明的单个方面的说明，并且功能等同的方法在本发明的范围内。事实上，除了本文所描述的那些修改以外，对于本领域技术人员，本发明的各种修改将从前述描述、附图和下面的实施例中容易地变得显而易见。所有此类修改均落入所附权利要求的范围。

实施例1：抗原肽对HLA-A*0201等位基因具有优越的亲和力。

接下来，体外确定各种选择的抗原肽和相应的人肿瘤抗原片段(人参考肽)对HLA-A*0201等位基因的结合亲和力。即，将序列SEQ ID NO：1的抗原肽(“SLPDRILTV”；本文中也称为CDC20-B1)与源自CDC20的相应参考人肽(“SLPDRILDA”；SEQ ID NO：17，本文中也称为CDC20-H1)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：2的抗原肽(“ALNPELLAL”；本文中也称为KIF2C-B1)与源自KIF2C的相应参考人肽(“AINPELLQL”；SEQ ID NO：18，本文中也称为KIF2C-H1)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：3的抗原肽(“FLAFVPLQL”；在本文中也称为UBE2C-B1)与源自UBE2C的相应参考人肽(“ALYDVRTIL”；SEQ ID NO：19，在本文中也称为UBE2C-H1；和“ALYDVRTILL”，SEQ ID NO：38，在本文中也称为UBE2C-H11)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：4的抗原肽(“YLAFVPLAL”；本文中也称为UBE2C-B11)与源自UBE2C的相应参考人肽(“ALYDVRTIL”；SEQ ID NO：19，本文中也称为UBE2C-H1)进行比较。此外，将序列SEQID NO：5的抗原肽(“SLLSIQSYV”；本文中也称为UBE2C-B2)与源自UBE2C的相应参考人肽(“ILLSIQSLL”，SEQ ID NO：20，本文中也称为UBE2C-H2)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：6的抗原肽(“YLQQELMNL”；本文中也称为UBE2C-B3)与源自UBE2C的相应参考人肽(“RLQQELMTL”，SEQ ID NO：21，本文中也称为UBE2C-H3)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：7的抗原肽(“ALYSEILTV”；本文中也称为ANKRD30A-B1)与源自ANKRD30A的相应参考人肽(“AVYSEILSV”，SEQ ID NO：22，本文中也称为ANKRD30A-H1)进行比较。此外，将序列SEQ IDNO：8的抗原肽(“LILDTVHSL”；本文中也称为ANKRD30A-B2)与源自ANKRD30A的相应参考人肽(“KILDTVHSC”，SEQ ID NO：23，本文中也称为ANKRD30A-H2)进行比较。此外，将序列SEQ IDNO：9的抗原肽(“TLDQKLFMV”；本文中也称为ANKRD30A-B3)与源自ANKRD30A的相应参考人肽(“SLDQKLFQL”，SEQ ID NO：24，本文中也称为ANKRD30A-H3)进行比较。此外，将序列SEQ IDNO：10的抗原肽(“YLILEYATV”；本文中也称为AURKA-B1)与源自AURKA的相应参考人肽(“YLILEYAPL”，SEQ ID NO：25，本文中也称为AURKA-H1)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：11的抗原肽(“KIIGIILAV”；本文中也称为CDH17-B1)与源自CDH17的相应参考人肽(“LVIGIILAV”，SEQ ID NO：26，本文中也称为CDH17-H1)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：12的抗原肽(“YLSGANLFV”；本文中也称为CEACAM5-B1)与源自CEACAM5的相应参考人肽(“YLSGANLNL”，SEQ ID NO：27，本文中也称为CEACAM5-H1)进行比较。此外，将序列SEQ IDNO：13的抗原肽(“IVWSDVTYV”；本文中也称为MMP11-B1)与源自MMP11的相应参考人肽(“KVWSDVTPL”，SEQ ID NO：28，本文中也称为MMP11-H1)进行比较。此外，将序列SEQ ID NO：14的抗原肽(“AVIGIVAAV”；本文中也称为OR51E2-B1)与源自OR51E2的相应参考人肽(“AQIGIVAVV”，SEQ ID NO：29，本文中也称为OR51E2-H1)进行比较。此外，将序列SEQ IDNO：16的抗原肽(“ALIFGQLLL”；本文也称为TOP2A-B2)与源自TOP2A的相应参考人肽(“ALIFGQLLT”，SEQ ID NO：31，本文也称为TOP2A-H2)进行比较。

A.材料和方法

A1.测量肽对T2细胞系的亲和力。

实验方案类似于针对HLA-A*0201呈递的肽进行了验证的方案(Tourdot等人，Ageneral strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides:implication in the identification of cryptic tumorepitopes.Eur J Immunol.2000年12月；30(12):3411-21)。使用人肿瘤细胞T2实现肽的亲和力测量，肿瘤细胞T2表达HLA-A*0201分子，但是TAP1/2阴性的，不能呈递内源性肽。

T2细胞(每孔5×10⁴个细胞)在补充有100ng/μl 2微球蛋白的无血清培养基(TexMacs)中孵育，其中肽浓度从100μM降低至0.1μM(4个点：100μM、10μM、1μM、0.1μM)，37℃孵育16小时。然后将细胞清洗两次，用与PE偶联的抗HLA-A2抗体(克隆REA517，Miltenyi)标记。

通过FACS(Macsquant分析仪10或Macsquant分析仪16-Miltenyi)实现分析。

对于每种肽浓度，将与感兴趣的肽相关联的标记的几何平均值减去背景噪音，并将其报告为对于浓度为100μM的参考肽HIV pol 589-597获得的HLA-A*0202标记的几何平均值的百分比。然后按如下方式确定相对亲和力：

相对亲和力＝诱导20％ HLA-A*0201表达的每种肽的浓度/诱导20％ HLA-A*0201表达的参考肽的浓度。

A2.肽的溶解

每种肽在溶解时都会考虑其氨基酸组成。对于不包含任何半胱氨酸、赖氨酸或色氨酸的肽，DMSO的添加量最高可达总体积的10％。其他肽在水或NH₄OH中重悬。

B.结果

下表3显示了对于不同浓度的每种肽获得的T2细胞的平均相对荧光强度值(数据已归一化至HIV肽的平均荧光，即100的值等于观察到的与HIV肽的最佳结合)：

表3.

下表4总结了每种测试肽诱导20％ HLA-A2表达所需的浓度和体外结合亲和力(*归一化至在相同实验期间诱导20％ HLA-A2表达的肽的HIV-pol浓度)。

表4.

此外，图1-图6和图14-图17显示所选示例的结果，即抗原肽CDC20-B1与相应的人CDC20片段CDC20-H1相比(图1)，抗原肽KIF2C-B1与相应的人KIF2C片段KIF2C-H1相比(图2)，抗原肽KIF2C-B11与相应的人KIF2C片段KIF2C-H1相比(图14)，抗原肽KIF2C-B12与相应的人KIF2C片段KIF2C-H1相比(图15)，抗原肽KIF2C-B13与相应的人KIF2C片段KIF2C-H1相比(图16)，抗原肽UBE2C-B1与相应的人UBE2C片段UBE2C-H1以及与另一个人UBE2C表位UBE2C-H11相比(图3)，抗原肽UBE2C-B11与相应的人UBE2C片段UBE2C-H1相比(图17)，抗原肽ANKRD30A-B1与相应的人ANKRD30A片段ANKRD30A-H1相比(图4)，抗原肽CDH17-B1与相应的人CDH17片段CDH17-H1相比(图5)，抗原肽TOP2A-B2与相应的人TOP2A片段TOP2A-H2相比(图6)。

总之，结果表明，本发明的抗原肽对HLA-A*0201表现出至少与相应的人肿瘤抗原片段相似的结合亲和力。在大多数情况下，观察到的本发明的抗原肽的结合亲和力比相应的人表位的结合亲和力更强。不受任何理论的束缚，假设本发明的抗原肽的这种强结合亲和力反映了它们引起免疫反应的能力(即它们的免疫原性)。

实施例2：UBE2C-B1(ENT_168-B1)、ANKRD30A-B1(ENT_169-B1)、CDH17-B1(ENT_ 176-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)、TOP2A-B2(ENT_205-B1)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)在HLA- A2转基因小鼠中的免疫原性以及与相应人肽的交叉反应性。

A.材料和方法

A.1小鼠模型

简而言之，将HLA-A2 HHD-DR1人源化小鼠(C57BL/6JB2mtm1UncIAb-/-Tg(HLA-DRA,HLA-DRB1*0101)#GjhTg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe)随机分配(基于小鼠性别和年龄)到实验组，其中每组用特定疫苗接种肽(vacc-pAg)与常见辅助肽(h-pAg UCP2；序列：KSVWSKLQSIGIRQH；SEQ ID NO：39)组合进行免疫(如下表6所示)。

表6.实验组组成。h-pAg：“辅助”肽；vacc-pAg：疫苗接种肽。加强注射的次数在括号中表示。

肽提供如下：

·vacc-pAg：UBE2C-B1、ANKRD30A-B1、CDH17-B1、CDC20-B1、TOP2A-B2和KIF2C-B1均以4mM浓度产生并提供；

·h-pAg：UCP2以10mg/mL浓度重悬于纯蒸馏水中

在注射的每一天以及对于每组，均新鲜制备待注射的肽制剂(乳剂)。使用2mL鲁尔锁注射器(4606701V，B BRAUN)和鲁尔锁母-母适配器(B.Braun，5206634)制备用于10只动物的混合物：将注射器1中的500μL肽混合物使用注射器2中含有的500μLMontanide ISA 51VG(Seppic)进行乳化。首先通过将注射器1中含有的肽混合物以非常低的速度推入注射器2(含有Montanide)来进行乳化过程。然后将混合物从一个注射器转移到另一个注射器，在6个循环中以非常低的速度进行(一个循环对应于从一个注射器到另一个注射器的一次传递)，然后以尽可能快的很高速度进行1分钟。每种乳液都过量制备以补偿注射时的死体积(dead volume)。

动物在第0天(d0)用初次注射进行免疫，在第14天用加强注射进行免疫。每只小鼠在颈部松弛的皮肤上通过皮下注射100μL油基乳剂，其含有：

·30nmol的vacc-pAg和30或100μg的UCP2辅助肽，溶于50μL专用终溶剂

·Montanide ISA 51VG(Seppic)，以1:1(v:v)比例添加(每只小鼠50μL)。

A.2分析

加强注射后七天(即第21天)，对动物实施安乐死并采集脾脏。通过机械破碎器官，然后进行70μm过滤和红细胞裂解，来制备脾细胞。

细胞悬浮液进一步用于ELISPOT-IFN测定(表5)。细胞在200μL完全T细胞培养基中培养。实验条件(一式两份重复)如下：在存在各种pAg(10μM)或仅存在培养基的情况下培养时，每孔总细胞数为2x10⁵个；在存在阳性对照PMA/离子霉素(PMA：Sigma P8139：终浓度为0.1μM；离子霉素：Sigma I0634：终浓度为1μM)的情况下培养时，总细胞数为2x10⁴个。按照制造商的说明(进行测定前孵育时间约为12-48小时)评估培养物分泌IFN的能力(小鼠IFN-ELISpotPLUS试剂盒，Mabtech 3321-4APT-10)。用于再刺激的肽如表7所示。

表7.ELISPOT-IFNγ测定的设置。

在iSpot Fluorospot读取系统(AID)上对斑点进行计数。使用Prism-9软件(GraphPad Software Inc.)进行数据绘图和统计分析。

B.结果

在实验开始日，所有小鼠为8至15周龄。研究中使用了雄性和雌性。动物分组饲养，最多每笼6只。在处死时，通过流式细胞术分析脾脏T细胞群，显示绝大多数属于CD4+T细胞亚群。

在铺板并用合适的刺激物孵育后，对产生IFNγ的细胞进行显示和计数。数据以每1×10⁶个总T细胞的斑点数提供。接下来使用个体平均值(从一式两份重复中获得)绘制组平均值。使用非配对非参数检验(MannWhitney)进行统计分析，用于比较(与不相关肽条件进行比较)(**：p<0.01；*：p<0.05)。

总体而言，使用本发明的抗原肽(CDC20-B1、KIF2C-B1、UBE2C-B1、ANKRD30A-B1、CDH17-B1和TOP2A-B2)进行疫苗接种，在HHDDR1小鼠的ELISPOT-IFNγ测定中诱导了显著的T细胞反应(图7-图12)。

结果(图7)显示，使用CDC20-B1对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到CDC20-B1或人相应肽CDC20-H1攻击后能够强烈反应。因此，CDC20-B1具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽产生有效的免疫反应。

结果(图8)显示，使用KIF2C-B1对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到KIF2C-B1或人相应肽KIF2C-H1攻击后能够强烈反应。因此，KIF2C-B1具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽产生有效的免疫反应。

结果(图9)显示，使用UBE2C-B1对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到UBE2C-B1或人相应肽UBE2C-H1或另一个人UBE2C表位UBE2C-H11攻击后能够强烈反应。因此，UBE2C-B1具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽和另一个人UBE2C表位UBE2C-H11产生有效的免疫反应。

结果(图10)显示，使用ANKRD30A-B1对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到ANKRD30A-B1或人相应肽ANKRD30A-H1攻击后能够强烈反应。因此，ANKRD30A-B1具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽产生有效的免疫反应。

结果(图11)显示，使用CDH17-B1对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到CDH17-B1或人相应肽CDH17-H1攻击后能够强烈反应。因此，CDH17-B1具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽产生有效的免疫反应。

结果(图12)显示，使用TOP2A-B2对HHD-DR1小鼠进行免疫允许诱导T细胞在受到TOP2A-B2或人相应肽TOP2A-H2攻击后能够强烈反应。因此，TOP2A-B2具有很强的免疫原性，能够针对相应的人肽产生有效的免疫反应。

总之，实施例2中描述的在HHDDR1小鼠中进行的这些免疫原性研究表明，本发明的6种抗原肽CDC20-B1、KIF2C-B1、UBE2C-B1、ANKRD30A-B1、CDH17-B1和TOP2A-B2诱导了强烈的免疫反应。在HHDDR1小鼠中证明了针对CDC20-H1、KIF2C-B2、UBE2C-B1、ANKRD30A-B1、CDH17-B1和TOP2A-B2产生的T细胞与相应的人肽的交叉反应性。

因此，这些结果提供了实验证据，表明基于抗原的免疫疗法能够提高体内的T细胞反应，并且本发明的抗原肽对于此目的特别有效。

实施例3：UBE2C-B1(ENT_168-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)、KIF2C-B1(ENT_207- B1)特异性CD8人T细胞的离体细胞毒性效应。

多项研究支持存在针对微生物肽的特异性T细胞库的观点。据预期，针对肽的微生物特异性T细胞数量较少，但足以通过疫苗攻击重新活化。

为了鉴定和功能性表征人中的循环UBE2C-B1(ENT_168-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)特异性T细胞，已经开发出一种体外扩增方案，以检测特异于每种抗原肽的T细胞并研究其细胞毒性能力。

3.1人中的抗原肽特异性CD8 T细胞的鉴定

体外扩增方法和特异性pMHC多聚体已用于鉴定UBE2C-B1(ENT_168-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)特异性T细胞。对于所有细菌肽及其相应的人对应物均生成了pMHC多聚体。收集了来自数名HLA-A*02健康供体(最多13名供体)的PBMC，在CD137和CD8选择后得到富集，并使用装载有EO4010肽的T2细胞进行多轮体外扩增，以增加特异性T细胞克隆的数量。使用荧光多聚体进行细胞术分析，在富集的CD8 T细胞群上检测OMP肽特异性CD8 T细胞。

图13示例性说明了使用一名HLA-A2健康供体获得的结果。对于此供体，细胞扩增允许检测到UBE2C-B1(ENT_168-B1)特异性细胞(7.58％)、CDC20-B1(ENT_204-B1)特异性细胞(7.46％)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)特异性细胞(0.63％)。

总之，这些结果表明健康HLA-A2供体的血液中存在能够识别源自微生物群的肽的CD8 T细胞。

3.2抗原肽特异性CD8 T细胞毒性功能

使用上述扩增的CD8+T细胞在不同比例的靶细胞和效应细胞存在下进行细胞毒性测定，以评估其细胞毒性能力，使用流式细胞术读数。靶细胞是装载有细菌肽或人对应肽的T2细胞系。作为阴性对照，使用未装载的T2细胞和装载有不相关肽的T2细胞。如图18所示，体外扩增的抗原肽特异性人T细胞克隆具有杀伤装载有所有细菌肽UBE2C-B1(ENT_168-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)的T2细胞的能力。更重要的是，体外扩增的UBE2C-B1(ENT_168-B1)、CDC20-B1(ENT_204-B1)和KIF2C-B1(ENT_207-B1)特异性人T细胞克隆能够杀伤装载有人UBEC2、CDC20和KIF2C肽的T2细胞。

总体而言，这些结果表明健康志愿者中存在能够识别微生物肽并杀伤具有微生物肽和人对应物的靶标的T细胞克隆。这些数据尤其令人鼓舞，因为在健康供体中已经获得了T细胞克隆，因此我们可以预期，在暴露于用本发明的抗原肽进行的免疫的患者中，可以有效地扩增特异性T细胞克隆。

Claims

1.一种抗原肽，其包含SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列或由其组成，其中任选地，可以替换、缺失或添加一个或两个氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的抗原肽，其中所述抗原肽由SEQ ID NO：1-16和SEQ ID NO：40-42中任一项所示的氨基酸序列组成。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽的长度为8至15个氨基酸或8至11个氨基酸，优选所述抗原肽的长度为9或10个氨基酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原肽，其中所述抗原肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成。

7.一种免疫原性化合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗原肽。

8.一种核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的抗原肽或权利要求7所述的免疫原性化合物，其中所述免疫原性化合物是肽或蛋白质。

9.一种药物组合物，其包含

-权利要求1-6中任一项所述的抗原肽，

-权利要求7所述的免疫原性化合物，或

-权利要求8所述的核酸，

以及，任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物包含

(i)至少两种不同的如权利要求1-6中任一项所述的抗原肽；

(ii)至少两种不同的如权利要求7所述的免疫原性化合物；或

(iii)至少两种不同的如权利要求8所述的核酸。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中不同的组分涉及

-包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；

-包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；和

-包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含

-包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或由其组成的抗原肽；和

13.根据权利要求9-12中任一项所述的药物组合物，其还包含辅助肽，优选是包含根据SEQ ID NO：39所述的氨基酸序列或由其组成的肽。

14.权利要求1-6中任一项所述的抗原肽、

权利要求7所述的免疫原性化合物、

权利要求8所述的核酸、或

权利要求9所述的药物组合物

用于医疗，特别是用于预防和/或治疗癌症。

15.一种肽-MHC(pMHC)多聚体，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗原肽。