CN119522104A - 稳定的人血小板裂解物组合物、其方法和用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种稳定的人血小板裂解物组合物；优选为稳定的无肝素人血小板裂解物组合物；用于获得该组合物的方法及其用途。

Description

稳定的人血小板裂解物组合物、其方法和用途

技术领域

本公开涉及稳定的人血小板裂解物组合物；用于获得所述组合物的方法及其用途。

背景技术

对标准化和安全的培养系统（包括细胞培养补充剂）的需求在全球范围内迅速增长。在这方面，人血小板裂解物（hPL）作为生物技术应用的原料/辅助材料（在研究和临床层面）引起了广泛关注。hPL由人血浆或血小板浓缩液制备而成，含有高浓度的生长因子，可增强细胞增殖，与细胞培养补充的金标准胎牛血清（FBS）相比，其性能更优越。

虽然对基础研究的要求较低，但临床细胞制造具有较高的规范性和依从性要求。细胞疗法的不断进步和临床转译需要根据GMP标准生产的无异源细胞培养基。尽管hPL是人源产品，但其更广泛的应用受到高纤维蛋白原含量的限制，该纤维蛋白原含量与细胞培养基中存在的钙结合，诱导纤维蛋白凝块的形成，因此需要向补充hPL的细胞培养基添加肝素（抗凝剂）（以防止凝结）。使用猪源肝素可实现非无异源细胞培养过程。在这种情况下，肝素补充会对产品的质量产生负面影响，因为（i）肝素可能会因与多种生长因子的相互作用而直接影响细胞生长，（ii）重组肝素（即猪试剂的替代品）在防止凝块形成（即hPL解冻时形成的小凝块）方面效率不高，和（iii）添加肝素是制备细胞培养基的额外步骤[1]。因此，为了提供对用户更加友好和质量提高的细胞培养补充剂，应从最终制剂中去除纤维蛋白原。

从hPL中去除纤维蛋白原的最有效机制是在制造过程中添加Ca²⁺（以CaCl₂的形式，终浓度为20 mM），以诱导纤维蛋白形成和随后的凝结[2]。这种方法确保了大部分纤维蛋白原以及其他凝结因子被去除（这可以通过用作细胞培养基的补充剂时没有凝结来证实），同时对所得hPL产物的生长因子的分布和含量的影响减小。

理想情况下，去除hPL中纤维蛋白原含量的方法应在最高生理温度以下进行，以保持生长因子的含量和质量，最小化或甚至避免使用动物或重组来源的试剂，使产品不含可见颗粒和少量显微镜下可见颗粒，并能够满足行业和规范标准，包括良好制造规范的标准。

文献EP2723354 [3]描述了一种用于制备hPL组合物的方法，包括以下步骤：（a）裂解血小板以提供裂解物；（b）清除细胞碎片；以及（c）通过加入金属盐如氯化钙和包含去除纤维蛋白原的含肝素血小板裂解物的组合物形成可去除的物质来去除纤维蛋白原。

文献EP3638263 [4]涉及一种用于获得混合的人血小板裂解物的方法、混合的人血小板裂解物本身及其用于治疗神经系统疾病如神经退行性疾病、神经炎症疾病、神经发育疾病和/或神经血管疾病的用途。EP3638263涉及一种用于制备热处理的混合人血小板裂解物的方法，该方法包括以下步骤：a）提供混合人血小板裂解物（pHPL），b）在分钟20至40分钟内在50℃至70℃的温度下热处理混合人血小板裂解物，以及c）使用玻璃珠和CaCl₂纯化步骤b）的热处理的混合人血小板裂解物。

文献DOI：10.1039/C9TB01764J [5]描述了一种用于获得混合血小板裂解物的方法，混合人血小板裂解物本身用于人间充质干细胞扩增/培养的培养基中。DOI: 10.1039/C9TB01764J [5]描述了一种方法，包括以下步骤：a）冷冻和解冻循环（-80℃/37℃）和离心（在20℃下以3000 x g进行30分钟，b）在24-26℃下在玻璃珠存在下用氯化钙（23 mM）活化血小板并去除纤维蛋白，以及c）离心悬浮液并在56℃下热处理上清液30分钟，然后离心分离不溶性蛋白质。

然而，文献EP3638263 [4]采用了肝素，而EP3638263 [4]和DOI：10.1039/C9TB01764J [5]采用hPL的热处理以降低纤维蛋白原含量。EP3638263 [4]和DOI：10.1039/C9TB01764J [5]未报告hPL的关键质量属性，包括微粒物质和生长因子的组成。

公开这些事实是为了说明本公开所解决的技术问题。

发明内容

本公开涉及一种用于生产无异源（xeno-free）人血小板裂解物（进一步称为XF-hPL）的方法。使用本公开中描述的方法，可以生产具有低纤维蛋白原含量、高生长因子含量和质量的hPL产品，其能够满足性能和监管要求，无论是作为用于细胞扩增或先进治疗药品生产的原材料，还是用于生产生物医药制品的原材料。

一种稳定的人血小板裂解物组合物，包含小于5 µg/ml的纤维蛋白原且PDGF-BB生长因子/纤维蛋白原含量的质量比不小于6 ng/μg。出乎意料的是，本公开的组合物避免了添加肝素的需要，因为不凝结和/或不诱导凝块形成。本公开的组合物适合作为无肝素组合物用作改良的细胞培养基。

在一个实施方式中，本公开的组合物为不含肝素的组合物。

在一个实施方式中，本公开的组合物为无异源的组合物。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包含小于4 µg/ml的纤维蛋白原；优选小于3 µg/ml的纤维蛋白原。

在一个实施方式中，PDGF-BB生长因子/纤维蛋白原含量的质量比不小于8 ng/μg；优选不小于10 ng/μg。

在一个实施方式中，生长因子可以选自由以下组成的列表：BDNF、EGF、FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β、IL-8、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF及其组合。

在一个实施方式中，每微克纤维蛋白原的生长因子（纳克）的质量比（其中生长因子选自BDNF、EGF、VEGF-A或其组合）范围为0.5-2.0 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选为1.0-1.5ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}。

在一个实施方式中，每微克纤维蛋白原的生长因子（纳克）的质量比（其中生长因子选自FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β或其组合）范围为0.05-0.5 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选为0.1-0.4 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}。

在一个实施方式中，每微克纤维蛋白原的生长因子（纳克）的质量比（其中生长因子选自PDGF-AB、PDGF-BB或其组合）范围为4-12 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选为6-8 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包含以下范围的每微克纤维蛋白原的生长因子（纳克）的比率：0.5-2.0 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}（其中生长因子为BDNF、EGF、VEGF-A）、0.05-0.5 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，（其中生长因子为FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β)、和4-12 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，（其中生长因子为PDGF-AB、PDGF-BB），优选为1.0-1.5 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，（其中生长因子为BDNF、EGF、VEGF-A）、0.1-0.4 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，（其中生长因子为FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β）、和6.0-8.0 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，（其中生长因子为PDGF-AB、PDGF-BB）。

在一个实施方式中，本公开的组合物具有透明黄色，没有通过视觉观察检测到的可见颗粒，更优选没有不溶的可见颗粒。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包括通过浊度测定法测量的小于400NTU的透明度和乳光度（opalescence degree）；优选小于350 NTU；更优选小于300 NTU。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包括通过浊度测定法测量的范围为100-350 NTU；更优选为150-200 NTU的透明度和乳光度。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包含显微镜下可见（sub-visible）颗粒，如通过流动成像显微镜（FIM）测量的，本公开组合物中尺寸至多达25 µm的显微镜下可见颗粒的数量小于2.0 x 10⁷个颗粒/mL，优选小于1.0 x 10⁷个颗粒/mL，更优选小于5.0 x 10⁶个颗粒/mL。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包含显微镜下可见颗粒，如通过流动成像显微镜（FIM）测量的，尺寸小于25 µm的颗粒的数量为5.0 x 10⁶个颗粒/mL。在另一种实施方式中，本公开的组合物中尺寸小于5 µm的颗粒的数量为3.9x10⁶个颗粒/mL。在另一个实施方式中，本公开的组合物包含数量小于1.3 x 10⁵个颗粒/mL的尺寸为5-10 µm的显微镜下可见颗粒。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包含不可检测量的纤维蛋白原β链，如使用LC-MS方法通过蛋白质组学分析测量的。

在一个实施方式中，本公开的组合物可以包括在-80℃至5℃，优选为-20℃至4℃的冷藏条件下稳定储存至多达6个月。

本公开的另一个方面涉及一种细胞培养基，其包含本公开的稳定的人血小板裂解物组合物。

本公开的另一个方面涉及一种掺入本公开的稳定的人血小板裂解物组合物的药品。

本公开的另一个方面涉及一种用于获得稳定的人血小板裂解物的方法，包括以下步骤：

-获得冷冻的人血小板单位；

-使所述人血小板单位经受解冻/冷冻循环以破坏血小板膜；

-向前一步骤中获得的混合物中加入二氧化硅和氯化钙以诱导凝块形成；

-在范围为35℃至39℃的温度下孵育样品至多达1小时至4小时；

-手动破坏凝块；

-离心样品并收集获得的上清液；

-过滤上清液以获得稳定的人血小板裂解物；优选为稳定的无肝素人血小板裂解物。

在一个实施方式中，加入0.005-0.04%（m/v）的二氧化硅和0.5-1.0%的氯化钙的组合。

本公开的另一个方面涉及通过本公开的方法获得的无肝素人血小板裂解物。

在一个实施方式中，与现有技术相比，本公开中公开的方法产生了改进的XF-hPL。也就是说，该产品透明并且无可见微粒物质，纤维蛋白原含量始终小于5 µg/mL，蛋白质组学分析无法检测到纤维蛋白原β链；最终产品在重构后不会凝结，即更容易操作；在制造或重构过程中不含肝素；并且它不含肝素替代品或任何额外的动物源组分。

在一个实施方式中，XF-hPL制剂的起始材料包括人血小板单位（hPU），包括不再可用于输血目的的hPU，储存在-80℃至-20℃下，以及在制造过程中向混合起始材料中加入以下试剂：氯化钙（水溶液，1M浓度）；以及二氧化硅（高纯度等级，含3-7%（m/m）的水）。

在一个实施方式中，本公开的稳定的人血小板裂解物组合物可以通过所公开的方法获得，并且是：

-无异源产品，没有肝素或任何其他动物源替代品；

-由于纤维蛋白原去除过程，纤维蛋白原含量非常低；

-具有与非无异源产品或其他可商购无异源产品相似或更高水平的高含量生长因子；

-具有不可检测的可见颗粒和降低水平的显微镜下可见颗粒，其小于其他可商购的无异源产品。

附图说明

以下附图提供了用于说明本公开的优选实施方式，不应被视为限制本公开的范围。

图1：用于填充XF-hPL的初级包装的代表性图片。

图2：XF-hPL最终产品质量控制结果的一个实施方式（分析参数）的图示。特征包括总蛋白质含量、渗透压、pH值、纤维蛋白原含量以及生长因子EGF（表皮生长因子）和PDGF-AB（血小板衍生的生长因子AB）的浓度。数值表示为至少三个不同批次的平均值±标准偏差。虚线表示QC面板中定义的范围。

图3：XF-hPL最终产品质量控制结果的一个实施方式（通过基于珠的多重测定法测定生长因子含量）的图示。

图4：XF-hPL最终产品质量控制结果的一个实施方式（针对样品中纤维蛋白原含量标准化的生长因子含量）的图示。

图5：XF-hPL最终产品质量控制结果的一个实施方式（产品性能）的图示。在补充了XF-hPL（5%v/v；代表性批次）或FBS（10%v/v）的培养基中培养7天的hASC和HFF-1细胞的细胞增殖，通过PicoGreen测定法进行DNA定量测量的。数值表示为至少三(3)个不同批次的平均值±标准偏差。使用Kruskal-Wallis检验然后使用Dunn多重比较检验进行统计分析。*与在补充了10%FBS的培养基中培养的hASC相比，p<0.05。

图6：在加速条件（4℃）、长期储存条件（-20℃、-80℃）和不同时间段（1个月、3个月和6个月）下产品稳定性结果的一个实施方式的图示。虚线表示QC面板中定义的范围。

图7：用于制造XF-hPL的过程的说明。

具体实施方式

本公开涉及一种稳定的人血小板裂解物组合物；优选为稳定的无肝素人血小板裂解物组合物；用于获得该组合物的方法及其用途。

在一个实施方式中，hPU经历至多达三个冻融循环（分别在-80℃和37℃下），以破坏血小板膜并释放细胞质和颗粒内容物。然后，使用血浆手动处理器将hPU转移并混合到一次性无菌容器（例如大容量无菌袋）中，并收集样品进行过程控制，包括纤维蛋白原定量（竞争性ELISA测定）和总蛋白质含量（BCA测定）。

在一个实施方式中，在对照分析后，将混合hPL分成更小的单独一次性无菌袋。

在一个实施方式中，将氯化钙和二氧化硅加入到混合hPL中以诱导凝块形成。肉眼可确认均匀凝块的形成。在另一个实施方式中，hPL溶液中氯化钙的终浓度范围为5.0 mM至10 mM，优选为6.0 mM至8.0 mM，更优选为7.5 mM；并且hPL溶液中二氧化硅的终浓度范围为0.005%至0.04%（w/v），优选为0.01%至0.03%（w/v），更优选为0.02%（w/v）。

在一个实施方式中，加入氯化钙和二氧化硅后，在35℃至39℃，优选为37℃范围的温度下孵育长达1小时至4小时，优选为2小时，更优选为1.5小时。

在一个实施方式中，凝块的材料在2℃至25℃，优选为15-23℃范围的温度下储存长达16小时至20小时的时间。

在一个实施方式中，将凝块的材料在15-25℃下在3500至5000x g，优选为4000x g下进行手动破碎和离心10-20分钟，优选为15分钟。在另一个实施方式中，收集所得上清液并合并到一次性无菌袋中；收集样品进行过程控制分析，如纤维蛋白原定量（竞争性ELISA测定）、总蛋白质含量（BCA测定）和无菌评估（BacT/Alert微生物检测系统）。

在一个实施方式中，对合并的上清液进行末端无菌过滤，优选通过过滤，更优选通过使用0.22 µm的过滤器（去除有细胞壁的细菌）和0.1 µm的过滤器（去除支原体，即没有细胞壁的细菌）。然后将无菌材料储存在-80℃至-20℃，优选为-72℃至-78℃的初级包装中（图1），直至进一步使用。

在一个实施方式中，最终产品的外观（i）在填充初级包装后和（ii）在-80℃下储存和在室温下解冻后，根据欧洲药典（Eur.Ph.）2.2.1，Clarity and degree of opalescenceof liquids（Visual method），和2.9.20，Particle contamination：Visible particles进行视觉评估。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.2.1，Clarity and degree of opalescenceof liquids（Instrument method）通过浊度测定法测量来评估最终产品的透明度和乳光度。在一个实施方式中，通过成像流动显微镜（FlowCam）评估最终产品中显微镜下可见颗粒的存在。通过提供实时高分辨率图像以及粒度、计数、形状和其他参数，该方法可以检测和表征样品中检测到的每个单独的颗粒。对代表性批次的XF-hPL和可商购的去纤维蛋白原无异源hPL参考样品（进一步称为样品A）的显微镜下可见颗粒的量进行定量。下表显示，与样品A相比，XF-hPL在所有粒度范围内的显微镜下可见颗粒数量明显较少，重点是粒度至多达25 µm的显微镜下可见颗粒。

表1示出了1 ml的本公开的样品和1 ml的样品A（即可商购的去纤维蛋白原无异源hPL参考样品）中显微镜下可见颗粒的数量

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 5.1.6，通过在BacT/Alert培养瓶中接种样品并在BacT/Alert微生物检测系统中孵育14天，通过检测最终产品样品中的需氧/厌氧生物，评估无菌性。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.6.7，使用Venor®GeM qEP试剂盒通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测最终产品的样品中的支原体污染。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.6.14，通过凝胶-凝块测定法检测最终产品样品中的内毒素污染。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.2.3，使用pH计测量最终产品样品的pH。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.2.35，使用渗透压计测量最终产品样品中的渗透压水平。

在一个实施方式中，根据Eur. Ph. 2.5.33和USP <1057>蛋白质测定，使用BCA测定法（ThermoFisher）测量最终产品样品中的总蛋白质含量。

在一个实施方式中，根据制造商的说明，通过ELISA测定法对最终产品样品中的人生长因子表皮生长因子（EGF）和血小板衍生的生长因子AB（PDGF-AB）进行定量。

在一个实施方式中，使用人脂肪来源的基质/干细胞样细胞（hASC）和人皮肤成纤维细胞系（HFF-1）评估最终产品样品作为细胞培养基补充剂与非无异源hPL和高级FBS相比的性能。使用PicoGreen试剂盒通过DNA定量在扩增7天后测量细胞增殖。

在一个实施方式中，根据制造商的说明，使用允许检测人血浆样品中的纤维蛋白原的可商购试剂盒（Abnova，代码KA0475）通过竞争性ELISA测定进行纤维蛋白原定量。简言之，该试剂盒使用预涂有对该蛋白质特异的小鼠抗体的96孔微孔板（带可拆卸条）。标准品和样品中的纤维蛋白原与夹在固定抗体和链霉亲和素-过氧化物酶（SP）偶联物中的生物素化人纤维蛋白原蛋白竞争。将所有未结合的物质洗掉，并加入过氧化物酶底物。停止显色，测量颜色强度（与纤维蛋白原浓度成比例）。

在一个实施方式中，根据制造商的说明，使用与MAGPIX Luminex设备兼容的9-Plex人ProcartaPlex复合板（ThermoFisher Scientific），通过基于珠的免疫测定，对最终产品样品中的人脑源性神经营养因子（BDNF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肝细胞生长因素（HGF）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素8（IL-8）、血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）和血管内皮生长因子A（VEGF-A）进行定量。ProcartaPlex免疫测定基于夹心ELISA的原理，使用两种高度特异性的抗体结合一种蛋白质的不同表位，以同时定量所有蛋白质靶标。与ELISA测定相反，捕获抗体（对单个靶蛋白特异）与光谱独特的珠偶联（不吸附在微孔板孔上），并且结合的蛋白质用生物素化抗体和链霉亲和素-R-藻红蛋白（RPE）进行鉴定。蛋白质特异性抗体与不同珠的偶联允许在单个孔中分析多个靶标。

在一个实施方式中，通过液相色谱-质谱（LC-MS）对最终产品样品中的蛋白质含量进行分析[6]。简言之，将样品在超纯水中稀释至终浓度为10 µg/mL，与4x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）混合至1倍的终浓度，在95℃下孵育5分钟，冷却至室温并储存在-20℃下。样品在NanoLC™ 425系统（Eksigent）上进行分析，该系统与Triple TOF™ 6600质谱仪（Sciex）和电离源（ESI DuoSpray™source）偶联。

在一个实施方式中，通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）对最终产品样品中的二氧化硅和钙进行定量。简言之，样品先用硫酸（H₂SO₄）和高氯酸（HClO₄）消化，然后用氢氟酸（HF）消化。根据二氧化硅和钙的标准曲线对消化的溶液进行定量。

在一个实施方式中，评估了从小型实验室规模（50-500 mL）到工业规模（50 L）的可扩展性，质量控制（QC）测试显示最终产品具有清晰的黄色外观（没有任何可见的颗粒或凝块），批次之间的分析参数非常一致（图2），即：

-总蛋白质含量：5.26 ± 0.52 g/dL；

-渗透压：320.5 ± 3.6 mOsm/kg；

-pH：7.83 ± 0.15；

-表皮生长因子（EGF）含量：2455 ± 302 pg/mL（基于ELISA的测定）；

-血小板衍生的生长因子AB（PDGF-AB）含量：31027 ± 9354 pg/mL（基于ELISA的测定）。

测量通过所述方法生产的所有批次的纤维蛋白原水平均小于5 µg/mL（3.05 ±1.04 µg/mL）（图2），从而证实基于二氧化硅的方法能够持续去除hPL中的纤维蛋白原，与生产规模无关。此外，最终产品中二氧化硅的残留水平（约3 ppm）与基础血浆水平相似，从而表明凝块和随后的处理（包括过滤）会去除制造过程中添加的所有二氧化硅。

在一个实施方式中，使用与MAGPIX Luminex设备兼容的9-Plex多重板，通过基于珠的多重测定法在最终产品的样品中定量总共九（9）种生长因子和细胞因子（BDNF、EGF、FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β、IL-8、PDGF-BB和VEGF-A）。使用不同的样品进行比较，即可商购的纤维蛋白原贫化的无异源hPL（样品A）和可商购的含纤维蛋白原的无异源hPL（进一步称为样品B和样品C）。在这方面，发现生长因子水平（图3）以及每微克纤维蛋白原（每个样品中）的生长因子含量（纳克）（图4）与测定中包含的参考样品相似或比其更高。重要的是，当考虑相对纤维蛋白原水平时，所提出的方法会产生更高浓度的生长因子（图4）。

在一个实施方式中，使用设备Synerg HTX和软件GEN5测定hPL样品的200 µl体积样品在410 nm波长下的吸光度。计算每个样品的光密度。

在一个实施方式中，产品表征包括采用两种不同细胞类型的性能测定，即人脂肪源性干细胞/基质样细胞（hASC）和人皮肤成纤维细胞（HFF-1）。通过测量在补充了XF-hPL（5%v/v下）的培养基中扩增的hASC或HFF-1细胞的增殖来评估产品性能，并将其与在补充了10% FBS的培养基（即，这些细胞的标准补充剂）中培养的细胞的增殖进行比较。通过定量从培养皿中的细胞中提取的DNA（使用Quant-iT™ PicoGreen™双链DNA（dsDNA）测定法）来测量细胞增殖，提取的DNA的量与培养表面中的细胞总数成正比。如图5所示，与对补充了10%FBS的培养基中扩增的细胞的检测相比，检测到在补充了5% XF-hPL的培养基中培养7天的hASC和HFF-1细胞的增殖增强。

在另一个实施方式中，蛋白质含量的详细表征提供了进一步的分析数据，以证实产品的生化特征。与化学限定的培养基相反，hPL产品的组成未被限定。随着细胞疗法制造商逐渐转向更明确的细胞疗法产品，对培养基补充剂进行更广泛和更详细的表征是非常可取的。因此，通过液相色谱-质谱（LC-MS）对XF-hPL样品进行了蛋白质组学分析[6]；使用可商购的XF-hPL（样品A）作为比较的参考。免疫球蛋白是检测到的最具代表性的蛋白质家族（N=57，包括免疫球蛋白链），其次是载脂蛋白和补体级联成员（N=12）。在所有最终产品样品中，还鉴定出细胞骨架和细胞骨架相关蛋白（如肌动蛋白、微管蛋白、细丝蛋白、踝蛋白、肌球蛋白、粘着斑蛋白）、氧和铁/铜转运蛋白（血红蛋白、血清铁传递蛋白、铜蓝蛋白）和白蛋白。感兴趣的是，虽然在参考样品中检测到纤维蛋白原α链和β链，但在XF-hPL中只检测到α链，表明最终产品中纤维蛋白原的残留水平（通过ELISA测定法定量）来自其α链。纤维蛋白原含量低，以及最终产品中没有纤维蛋白，预计将提高XF-hPL的安全性，因为纤维蛋白原和纤维蛋白与炎症调节有关[7]。

此外，数据分析允许鉴定XF-hPL中存在的蛋白质，其水平比参考样品A高得多（比率>2），包括（i）伴侣蛋白（内质网伴侣蛋白BiP、热休克蛋白HSP90-α），（ii）肌动蛋白功能调节因子（冠蛋白-1A），（iii）蛋白酶抑制剂（人源性激肽释放酶结合蛋白），（iv）免疫球蛋白（免疫球蛋白重变量3-43）和（v）整合素相关蛋白（整合素连接蛋白激酶）。

在一个实施方式中，稳定性研究表明，最终的XF-hPL产品在冷藏条件下（4℃、-20℃、-80℃）储存至多达6个月后仍能保持其特性，如图6所示。

本文的结果证实了用于生产即用型XF-hPL的新方法，该方法不使用肝素或任何动物源性替代品，这产生非常低的纤维蛋白原含量，生长因子/纤维蛋白原含量比很高，并且作为细胞培养补充剂具有优异的性能。

术语“包括”无论何时在本文件中使用都旨在表示所述特征、整数、步骤、组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组。

本公开不应以任何方式被视为仅限于所描述的实施方式，本领域普通技术人员将预见其修改的许多可能性。上述实施方式是可组合的。

以下权利要求进一步阐述了本公开的具体实施方式。

参考文献

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Claims (21)

1.一种稳定的人血小板裂解物组合物，包含小于5 µg/ml的纤维蛋白原，和不小于6ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}的PDGF-BB生长因子/纤维蛋白原含量的质量比；优选地，所述组合物为无肝素组合物和/或无异源组合物。

2.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，包含小于4 µg/ml的纤维蛋白原。

3.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，包含小于3 µg/ml的纤维蛋白原。

4.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述PDGF-BB生长因子/纤维蛋白原含量的质量比不小于8 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}。

5.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述PDGF-BB生长因子/纤维蛋白原含量的质量比不小于10 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}。

6.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，生长因子选自由以下组成的列表：BDNF、EGF、FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β、IL-8、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF及其组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，每单位质量的纤维蛋白原的生长因子的质量比范围为0.5-2.0 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选1.0-1.5ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，并且其中所述生长因子选自BDNF、EGF、VEGF-A、或其组合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，每单位质量的纤维蛋白原的生长因子的质量比范围为0.05-0.5 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选0.1-0.4ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，并且其中所述生长因子选自FGF-2、GM-CSF、HGF、IL-1β、或其组合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，每单位质量的纤维蛋白原的生长因子的质量比范围为4-12 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，优选为6-8 ng_生长因子/μg_{纤维蛋白原}，并且其中所述生长因子选自PDGF-AB、PDGF-BB、或其组合。

10.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述组合物具有透明黄色，没有通过目视观察检测到的可见颗粒。

11.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述组合物具有透明黄色，没有不溶的可见颗粒。

12.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，通过浊度测定法测量的透明度和乳光度小于400 NTU。

13.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述透明度和乳光度小于350 NTU；优选小于300 NTU。

14.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，光密度小于1。

15.根据前述权利要求所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述光密度小于0.9，优选小于0.8。

16.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，尺寸至多达25 µm的显微镜下可见颗粒的数量小于2.0 x 10⁷个颗粒/mL。

17.其中光密度小于其中显微镜下可见颗粒的数量小于1.0 x 10⁷个颗粒/mL，更优选小于5.0 x 10⁶个颗粒/mL。

18.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，使用LC-MS的蛋白质组学分析不可检测到纤维蛋白原β链的量。

19.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，其中，所述组合物在-80℃至5℃，优选在-20℃至4℃的冷藏条件下储存至多达6个月时是稳定的。

20.根据前述权利要求中任一项所述的稳定的人血小板裂解物组合物，用于医学或兽医和/或用作细胞培养补充中的原材料和/或用作生产先进治疗药品中的原材料。

21.用于获得稳定的人血小板裂解物的方法，包括以下步骤：

获得冷冻的人血小板单位；

使所述人血小板单位经受解冻/冷冻循环以破坏血小板膜；

向先前步骤中获得的混合物中加入二氧化硅和氯化钙以诱导凝块形成；

在35℃至39℃范围内的温度下孵育样品至多达1小时至4小时，优选2小时；

离心孵育的样品并收集获得的上清液；

纯化所述上清液以获得稳定的人血小板裂解物；优选为稳定的无肝素人血小板裂解物；可选地包括加入0.005-0.04%（w/v）的二氧化硅与0.5-1.0%（w/v）的氯化钙的组合。