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CN119497720A - 将寡核苷酸递送至细胞的转铁蛋白受体结合分子缀合物 - Google Patents

将寡核苷酸递送至细胞的转铁蛋白受体结合分子缀合物 Download PDF

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CN119497720A
CN119497720A CN202380051383.2A CN202380051383A CN119497720A CN 119497720 A CN119497720 A CN 119497720A CN 202380051383 A CN202380051383 A CN 202380051383A CN 119497720 A CN119497720 A CN 119497720A
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罗伯特·C·威尔斯
莎拉·L·德沃斯
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Denali Therapeutics Inc
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Abstract

本文提供了缀合物，所述缀合物包含：与转铁蛋白受体结合的抗TfR抗体抗原结合结构域以及寡核苷酸。所述缀合物可用于将寡核苷酸递送至表达所述转铁蛋白受体的细胞。将所述寡核苷酸递送至细胞可用于调节所述细胞中靶基因或序列的表达。

Description

将寡核苷酸递送至细胞的转铁蛋白受体结合分子缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年7月1日提交的美国临时申请号63/357,959的权益，该申请以引用方式并入本文。
序列表
写在文件DNL-041-01-WO_SeqListing.txt中的序列表大小为177千字节，创建于2023年6月30日，并且据此以引用方式并入。
技术领域
本文公开的主题涉及与靶细胞上的转铁蛋白受体结合并调节该细胞中靶基因或序列的表达的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物及其使用方法。
背景技术
基于核酸的分子诸如反义寡核苷酸或RNAi剂的体内递送通常需要特异性靶向以到达某些组织或细胞类型。特别地，递送至非肝组织仍然是障碍并且限制了此类疗法的使用。寡核苷酸向中枢神经系统(CNS)的递送由于血脑屏障(BBB)而引起明显的问题。将寡核苷酸递送至CNS的一种手段是鞘内递送。然而，鞘内递送是侵入性的，具有较高的副作用风险，并且经常导致不均匀分布。
转铁蛋白受体可靶向用于癌症诊断和治疗的递送。这种II型跨膜糖蛋白负责细胞铁转运并且在许多正常细胞类型的表面上以低水平发现。
所需要的是可靶向转铁蛋白受体以经由转铁蛋白受体将货物递送至细胞的治疗模式。
发明内容
描述了将寡核苷酸递送至CNS或表达转铁蛋白受体(TfR)的细胞的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，该TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含：与抗TfR抗体抗原结合结构域连接的寡核苷酸。该抗TfR抗体抗原结合结构域可以是但不限于抗体、单链抗体、Fab、F(ab′)2、单链Fab、(scFab)、Fv片段、单链可变片段(scFv)、二价scFv、仅重链抗体可变结构域(纳米抗体，例如VHH或vNAR)或纳米抗体。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含scFv或由其组成。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含Fab或由其组成。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含scFab或由其组成。抗TfR抗体抗原结合结构域可来自任何已知的特异性结合TfR的抗体。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:12-14的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:15-17的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:21-23的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:24-26的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:114-116的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:117-119的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:126-128的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:129-131的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:134-136的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:137-139的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:154-156的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:157-159的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:161-163的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:164-166的序列的CDR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域特异性结合人TfR。在一些实施方案中，TfR结合区结合TfR的顶端结构域。寡核苷酸可直接或间接与抗TfR抗体抗原结合结构域连接。对于间接附接，寡核苷酸可经由化学接头和/或肽与抗TfR抗体抗原结合结构域连接。该肽可以是但不限于Fc多肽和Fc二聚体或白蛋白。寡核苷酸可以是但不限于反义寡核苷酸(ASO)或RNA干扰寡核苷酸。抗TfR抗体抗原结合结构域可具有促进寡核苷酸缀合的取代或修饰。肽(例如，Fc多肽、Fc二聚体或白蛋白)，如果存在的话，可具有促进寡核苷酸缀合的取代或修饰。
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含与抗TfR Fab或scFab连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含与单体抗TfR Fab或scFab(单Fab)连接的寡核苷酸。单Fab指示TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含单个Fab或scFab(即，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物不含第二抗体抗原结合结构域)。在一些实施方案中，单Fab与Fc多肽或Fc二聚体连接。在一些实施方案中，单Fab与Fc多肽或Fc二聚体连接，其中寡核苷酸与Fc多肽、Fc二聚体连接。Fc多肽、Fc二聚体、Fab或scFab可具有促进寡核苷酸缀合的取代或修饰。
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F任选地存在或不存在，并且如果存在的话，包含肽、Fc多肽、Fc二聚体或白蛋白；
L任选地存在或不存在，并且如果存在的话，是连接基团；
P′任选地存在或不存在，并且如果存在的话，包含抗TfR抗体抗原结合结构域、非结合Fab、非结合可变区(NBVR)、或不特异性结合转铁蛋白的抗体结合结构域；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
P-F-P′可被称为TfR结合剂。在一些实施方案中，P-F-P′包含抗TfR抗体。在一些实施方案中，P-F包含单价抗TfR抗体。如果P′存在并且F包含Fc二聚体，则P或P的重链组分可与Fc二聚体的一个Fc多肽形成单一多肽链，并且P′或P′的重链组分可与Fc二聚体的另一Fc多肽形成单一多肽链。如果n大于或等于2，则对于每个(L-(O)y)，y独立地大于或等于1(例如，1、2、3或4)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，P是抗TfR Fab或scFab，F是Fc二聚体，并且P′不存在。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，P是抗TfR Fab或scFab，F是Fc二聚体，并且P′是非结合Fab或NBVR。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，P是抗TfR scFv、VHH或纳米抗体，F是Fc二聚体，并且P′不存在。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，P是抗TfR、scFv、VHH或纳米抗体，F是Fc二聚体，并且P′是非结合Fab或NBVR。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，P是抗TfR scFv、VHH或纳米抗体，F是白蛋白，并且P′不存在。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含：
蛋白质，该蛋白质包含：
抗体Fc恒定结构域二聚体，
特异性结合转铁蛋白受体(TfR)的第一Fab，和
共价缀合的修饰；以及，
在修饰位点处缀合的寡核苷酸。
抗体Fc恒定结构域二聚体包含第一Fc多肽和第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:12-14的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:15-17的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:21-23的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQID NO:24-26的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:114-116的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:117-119的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:126-128的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:129-131的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:134-139的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:137-139的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:154-156的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:157-159的序列的CDR。在一些实施方案中，第一Fab包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域包含具有SEQ ID NO:161-163的序列的CDR，该VL结构域包含具有SEQ ID NO:164-166的序列的CDR。第一Fab可与第一Fc多肽或第二Fc多肽连接以形成Fab-Fc融合体。在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物还包含第二Fab。第二Fab可以是但不限于特异性结合TfR的Fab、非结合Fab或非结合可变区(NBVR)。第二Fab可与第一Fc多肽或第二Fc多肽连接以形成Fab-Fc。在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含第二Fab，其中第一Fab与第一Fc多肽连接并且第二Fab与第二Fc多肽连接。在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含第二Fab，其中第一Fab与第二Fc多肽连接并且第二Fab与第一Fc多肽连接。在一些实施方案中，寡核苷酸经由接头“L”与抗体缀合。
在某些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含抗体-寡核苷酸缀合物，该抗体-寡核苷酸缀合物包含：
结合转铁蛋白受体(TfR)的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:12-14、21-23、114-116、126-128、134-136、154-156，或161-163的重链CDR和SEQ ID NO:15-17、24-26、117-119、129-131、137-139、157-159、或164-166的轻链CDR；以及
与该抗体的恒定结构域上的半胱氨酸修饰缀合的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸经由接头“L”与抗体缀合。
在某些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含抗体-寡核苷酸缀合物，该抗体-寡核苷酸缀合物包含：
结合转铁蛋白受体(TfR)的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:12-14、21-23、114-116、126-128、134-136、154-156，或161-163的重链CDR和SEQ ID NO:15-17、24-26、117-119、129-131、137-139、157-159、或164-166的轻链CDR；以及
与该抗体的恒定结构域上的半胱氨酸修饰缀合的寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物具有以下结构：
在某些实施方案中，本文所述的主题涉及一种调节患者的肌细胞或CNS细胞中靶基因表达的方法，该方法包括向患者施用如本文所述的缀合物或包含该缀合物的药物组合物。
本文充分描述了这些和其他实施方案。
附图简述
图1说明了对于TfR-单Fab缀合物在单次给药后24小时在CNS即皮层、脊髓中的huIgG、完整药物、完整药物％和总ASO。
图2A说明了对于TfR-单Fab缀合物在多剂量研究中在最后一次给药后72小时在CNS即皮层、脊髓中的huIgG和完整药物。
图2B说明了对于TfR单Fab缀合物在多剂量研究中在最后一次给药后72小时在CNS即皮层、脊髓中的总ASO和Malat1敲低。
图3说明了对于TfR单Fab缀合物在单次给药后24小时在外周中的huIgG、完整药物、完整药物％和总ASO。
图4说明了对于TfR单Fab缀合物在多剂量研究中在最后一次给药后72小时的huIgG、完整药物和总ASO。
图5说明了对于TfR单Fab缀合物在多剂量研究中在最后一次给药后72小时的Malat1。
图6说明了对于抗TfR二价抗体缀合物在CNS和外周中的Malat1敲低。
图7说明了TfR-单Fab:ASO缀合物的血浆清除率。
图8说明了TfR-单Fab:ASO缀合物在脑、脊髓和外周组织中的huIgG浓度。
图9说明了TfR-单Fab:ASO缀合物在脑、脊髓和外周组织中的ASO浓度。未缀合的ASO对于每个组织是第一条(对于脑和SC不可见)。TfR-单Fab对于每个组织是中间条。TfR-单Fab 2对于每个组织是第三条。
图10说明了Tfr白蛋白:ASO缀合物在72小时时脑中的ASO浓度。
图11说明了Tfr白蛋白:ASO缀合物在72小时时肾和肝中的ASO浓度。
图12说明了Tfr白蛋白:ASO缀合物的血浆清除率。
图13说明了具有以下的示例性TfR结合剂-寡核苷酸缀合物：(a)抗TfR Fab/非结合Fab抗体(左上)，(b)抗TfR单Fab抗体(右上)，和(c)抗TfR scFv-白蛋白(下)。(a)、(b)和(c)被示出为附接有ASO。(c)被示出为具有任选的6×His标签。
具体实施方式
I.简介
由遗传异常或蛋白质积累增加引起的障碍的寡核苷酸疗法正成为调节基因表达以治疗该障碍的日益流行的方法。将寡核苷酸递送至细胞仍然是一种挑战。本文公开了利用转铁蛋白受体将寡核苷酸递送至靶细胞的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
在某些实施方案中，所述TfR结合剂-寡核苷酸缀合物能够穿过血脑屏障(BBB)。通常，BBB代表将全身性施用的寡核苷酸递送至CNS内的相关作用位点的挑战。鞘内(IT)递送(其中药物被直接施用到脑脊液(CSF)空间中)能够绕过BBB。然而，该方法的一个限制是这些寡核苷酸疗法经由IT方法直接递送至CSF不能实现在CNS中的有效分布。
在某些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物能够将缀合的寡核苷酸递送至CNS或表达转铁蛋白受体的细胞。该细胞可以是但不限于肌细胞或癌细胞。肌细胞可以是但不限于骨骼肌细胞或心肌细胞。
本文描述了TfR结合剂-寡核苷酸缀合物及其使用方法。在一些实施方案中，TfR结合剂包含单价抗体(单Fab；即，具有单个抗TfR抗体抗原结合结构域的抗体，例如，单个Fab臂或scFv)。在一些实施方案中，TfR结合剂包含双特异性二价抗体(即，具有单个抗TfR抗体抗原结合结构域和单个非结合Fab或NBVR的抗体)。在一些实施方案中，TfR结合剂包含与白蛋白连接的抗-TfR scFab、svFc、VHH、vNAR或纳米抗体。在一些实施方案中，TfR结合剂包含二价抗TfR抗体(例如，抗TfR(Fab)2)。在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含与抗TfR抗体共价连接的寡核苷酸。
在某些实施方案中，寡核苷酸在抗体、Fc多肽或Fc二聚体的恒定结构域上的半胱氨酸修饰处缀合。
用于形成TfR结合剂的抗TfR抗体抗原结合结构域可衍生自已知对转铁蛋白受体具有亲和力的抗体。衍生自指示抗TfR抗体抗原结合结构域包含抗体和抗体的抗原结合片段、或具有抗体的CDR序列的抗原结合区。可用于缀合寡核苷酸的抗体或蛋白质分子的实例包括WO2014/033074、WO2016/081640和WO2020/132584中描述的那些，这些文献中的每一者全文以引用方式并入本文。
寡核苷酸也可被称为通过TfR结合剂-寡核苷酸缀合物递送至靶细胞的货物。寡核苷酸可以是但不限于反义寡核苷酸(“ASO”)或RNAi剂(例如，siRNA或shRNA)。
在进一步的实施方案中，本文提供了治疗方法和使用如本文所述的缀合物将寡核苷酸(例如，ASO或RNAi剂)靶向至转铁蛋白受体表达细胞，例如将寡核苷酸递送至该细胞的方法。
II.定义
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容明确地另有指示。
如本文所用，术语“约”和“大约”，当用于修饰在数值或范围中指定的量时，表示数值以及与本领域技术人员已知的值的合理偏差，例如±20％、±10％或±5％在所述值的预期含义内。
术语“非靶向Fab片段”指不经由其重链或轻链可变结构域特异性结合抗原或者不经由其重链或轻链可变结构域特异性结合在给定哺乳动物中表达的抗原或在此类哺乳动物内的特定组织中表达的抗原的Fab片段，该哺乳动物诸如灵长类动物，例如人和非人灵长类动物，或啮齿类动物，例如小鼠。
“转铁蛋白受体”或“TfR”是指转铁蛋白受体蛋白1。人转铁蛋白受体1多肽序列如SEQ ID NO:2所示。来自其他物种的转铁蛋白受体蛋白1序列也是已知的(例如，黑猩猩，登录号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；犬，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；和鸡，NP_990587.1)。术语“转铁蛋白受体”还涵盖由转铁蛋白受体蛋白1染色体基因座处的基因编码的示例性参考序列(例如，人序列)的等位基因变体。全长转铁蛋白受体蛋白包括短的N末端胞内区、跨膜区和大的胞外结构域。细胞外结构域特征在于三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋结构域和顶端结构域。顶端结构域包含人TfR的残基189-383。人转铁蛋白受体1的顶端结构域序列如SEQ ID NO:3所示。
术语“恒定区”是指轻链恒定区结构域多肽(CL)以及来自重链的CH1、CH2和CH3结构域多肽。
术语“CH1结构域”、“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。在IgG抗体的上下文中，CH3结构域多肽是指根据EU编号方案编号的从约位置341至约位置447的氨基酸片段，CH2结构域多肽是指根据EU编号方案编号的从约位置231至约位置340的氨基酸片段，并且CH1结构域多肽是指根据EU编号方案编号的从约位置118至约位置215的氨基酸片段。CH1、CH2和CH3结构域多肽也可由IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案进行编号，其中根据IMGT科学图表编号(IMGT网站)，CH1结构域编号为1-98，CH2结构域编号为1-110，并且CH3结构域编号为1-107。CH2和CH3结构域是免疫球蛋白的Fc多肽的一部分。在IgG抗体的上下文中，Fc多肽是指如根据EU编号方案编号的约位置231至约位置447的氨基酸片段。
术语“可变区”指轻链可变区结构域多肽(VL)和重链可变区结构域多肽(VH)。VL含有三个互补决定区(CDR)区域，即CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，并且VH含有三个互补决定区，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。CDR区一起形成结合抗原的抗体结合位点。
术语“Fc多肽”是指天然存在的免疫球蛋白重链多肽的C末端区域，其特征在于作为结构域的Ig折叠。Fc多肽通常含有至少包括CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列，并且可含有铰链区的至少一部分。说明性铰链区序列或其部分如SEQ ID NO:4-6所示。
“Fc多肽二聚体”是指两个Fc多肽的二聚体。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体能够结合Fc受体(例如，FcγR)。在Fc多肽二聚体中，两个Fc多肽通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化。在一些实施方案中，两个Fc多肽还可经由在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键而二聚化。Fc多肽二聚体可以是异二聚体或同二聚体。Fc多肽二聚体可包含两个野生型Fc多肽、野生型Fc多肽和经修饰的Fc多肽、或两个经修饰的Fc多肽。对于包含两个经修饰的Fc多肽的Fc多肽二聚体，两个经修饰的Fc多肽可相同或不同。
抗体抗原结合结构域包含免疫球蛋白的抗原结合结构域或具有与免疫球蛋白的抗原结合结构域相似的结构的肽。免疫球蛋白可以是但不限于IgG、IgM、IgE、IgA、IgD或重链抗体。抗体抗原结合结构域可以是但不限于Fab、scFab、Fv片段、scFv或仅重链抗体可变结构域(纳米抗体，例如VHH或vNAR)。
术语“CL结构域”是指轻链的免疫球蛋白恒定结构域。在IgG抗体的上下文中，κCL结构域多肽是指如根据EU编号方案编号的约位置108至约位置214的氨基酸区段。另选地，κ和λCL结构域可由IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案进行编号，其中根据IMGT科学图表编号(IMGT网站)，κCL结构域编号为1-107，并且λCL结构域编号为1-106。
术语“Fab”或“Fab片段”指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。术语“Fab”是指由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)(一起为抗体轻链)以及重链可变区(VH)和重链CH1恒定区(一起为抗体Fd片段)组成的单价抗原结合片段。Fab或Fab片段可含有或可不含有抗体铰链区的全部或部分。
术语“单链Fab”或“scFab”是指由Fab组成的抗原结合片段，其中Fd片段和轻链经由肽接头连接在一起。接头可将Fd片段的N末端与轻链的C末端连接，或将轻链的N末端与Fd片段的C末端连接。
术语“Fv片段”是指由一起形成抗原结合位点的VH和VL组成的抗原结合片段。
术语“单链可变片段”或“scFv”指由经由肽接头连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成的抗原结合片段。接头可将VH的N末端与VL的C末端连接，或将VL的N末端与VH的C末端连接。scFv缺乏恒定区。经修饰的scFv和修饰scFv以结合靶蛋白的方法描述于WO2022/258841(其以引用方式并入本文)中。
术语“纳米抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。衍生自骆驼重链抗体的纳米抗体可被称为“VHH”片段。衍生自软骨鱼重链抗体的纳米抗体可被称为“vNAR”。经修饰的VHH片段和修饰VHH片段以结合靶蛋白(包括TfR)的方法描述于WO 2020/056327、WO 2022/103769和WO 2023/023166(其各自以引用方式并入本文)中。
术语“非靶向Fab片段”或“NTF”是指不经由其重链或轻链可变结构域特异性结合天然存在的人抗原或者不经由其重链或轻链可变结构域特异性结合在给定哺乳动物中或在此类哺乳动物内的特定组织中表达的天然存在的抗原的Fab片段，该哺乳动物诸如灵长类动物，例如人和非人灵长类动物，或啮齿类动物，例如小鼠。在某些实施方案中，在本文所述的Fab-Fc融合体或Fab-Fc二聚体融合体中使用的Fab不经由其重链或轻链可变结构域特异性结合转铁蛋白。非靶向Fab片段的非限制性实例包括(a)RSV(帕利珠单抗)Fab片段，其在小鼠和非人灵长类动物中是非靶向的，和(b)针对二硝基苯基半抗原(DNP)的Fab片段(参见Leahy,PNAS 3661-3665,1988)。
关于CH3或CH2结构域的术语“野生型”、“天然的”和“天然存在的”是指具有天然存在的序列的结构域。
如本文所用，关于突变多肽或突变多核苷酸的术语“突变体”可与“变体”互换使用。关于给定野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指天然细胞中不存在的变体或突变结构域，其通过天然CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽的遗传修饰产生，例如使用基因工程技术或诱变技术。“变体”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任何结构域。突变可包括取代、插入和缺失。
术语“修饰位点”是指多肽内相对于对应野生型多肽(例如，野生型CL、CH1、CH2或CH3结构域)包含突变或变体的特定位置。在某些实施方案中，突变或变体是非天然存在的。修饰位点可包括例如插入或取代。术语“取代”是指用另一个氨基酸替换一个氨基酸的改变。例如，“半胱氨酸取代”或“半胱氨酸修饰”是指用半胱氨酸置换氨基酸。修饰可用符号XnumberY表示，其中X表示亲本多肽中由数字表示的位置处的氨基酸，Y表示替换氨基酸X的取代氨基酸。例如，S239C表示位置239处的丝氨酸被半胱氨酸替换。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。
天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)以及它们的组合。
氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。
术语“多肽”和“肽”可互换使用，是指单链中氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L和D氨基酸的混合物。
术语“蛋白质”是指单链多肽或单链多肽的二聚体(即两个)或多聚体(即三个或更多个)。二聚体或多聚体的单链多肽可通过共价键例如二硫键或非共价相互作用连接。
术语“保守取代”、“保守突变”或“保守修饰的变体”是指导致氨基酸被可归类为具有相似特征的另一氨基酸取代的改变。以这种方式定义的保守氨基酸组的类别的实例可包括：“带电荷/极性基团”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳族基团”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)和(组氨酸或H)；以及“脂族基团”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每个组中，也可鉴定亚组。例如，带电荷或极性氨基酸组可被细分为亚组，包括：包含Lys、Arg和His的“带正电荷的亚组”；包含Glu和Asp的“带负电荷的亚组”；以及包含Asn和Gln的“极性亚组”。在另一实例中，芳族或环状基团可被细分为亚组，包括：包含Pro、His和Trp的“氮环亚组”；以及包含Phe和Tyr的“苯基亚组”。在另一个进一步的实例中，脂族基团可被细分为亚组，例如，包含Val、Leu、Gly和Ala的“脂族非极性亚组”；以及包含Met、Ser、Thr和Cys的“脂族弱极性亚组”。保守突变类别的实例包括上述亚组中氨基酸的氨基酸取代，诸如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，使得可保持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可保持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可保持游离的-OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，使得可保持游离的-NH2。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代天然存在的疏水性氨基酸，例如在活性位点，以保持疏水性。
在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基，例如，至少60％同一性、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更大，当使用一种序列比较算法或通过人工比对和目视检查测量时，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性比较和比对时，所述百分比的氨基酸残基在指定区域上是相同的。
为了进行多肽的序列比较，通常一个氨基酸序列充当参考序列，与候选序列进行比较。可以使用本领域技术人员可用的各种方法，例如，目视比对或使用公开可用的软件使用已知的实现最大比对的算法来执行比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最大比对的参数可由本领域技术人员确定。出于本申请的目的，为了进行多肽序列的序列比较，使用BLASTP算法标准蛋白BLAST，以默认参数比对两个蛋白序列。
术语“对应于”、“参考…进行确定”或“参考…进行编号”当用于鉴定多肽或蛋白质序列中给定氨基酸残基的上下文中时，是指当给定氨基酸序列与指定参考序列最大程度比对并比较时该参考序列的残基位置。因此，例如，当与SEQ ID NO:1最佳比对时，多肽中的氨基酸残基与SEQ ID NO:1中的氨基酸比对时，该残基“对应于”SEQ ID NO:1中来自氨基酸114-220的区域中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不必与参考序列的长度相同。
“结合亲和力”是指两个分子之间的非共价相互作用的强度，例如多肽/蛋白质上的单个结合位点和其结合的靶标，例如转铁蛋白受体。因此，例如，该术语可指多肽/蛋白质与其靶标之间的1:1相互作用，除非另有说明或从上下文清楚可见。结合亲和力可通过测量平衡解离常数(KD)来定量，平衡解离常数是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。KD可以通过测量复合物形成和解离的动力学进行确定，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排除测定诸如以及BioLayer干涉法(例如，使用平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括形式结合亲和力，诸如反映多肽/蛋白质与其靶标之间的1:1相互作用的那些，还包括计算KD的可反映亲合结合的表观亲和力。
短语“特异性结合”或“选择性结合”靶标，例如转铁蛋白受体，是指这样的结合反应，其中蛋白质以比其结合结构上不同的靶标(例如，不在转铁蛋白受体家族中的靶标)更大的亲和力、更大的亲合力和/或更长的持续时间结合靶标。在典型的实施方案中，当在相同的亲和力测定条件下测定时，与不相关的靶标相比，蛋白质对转铁蛋白受体具有至少5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更高的亲和力。在一些实施例中，蛋白质可专门结合人转铁蛋白受体。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，其由含有糖部分、磷酸酯和核碱基的单体(核苷酸)组成。除非特别限定，该术语涵盖经修饰的和未修饰的核酸两者。
术语“核碱基”是指可与糖部分连接以形成核苷的含氮化合物，而核苷又是核苷酸的组分。核碱基形成碱基对和彼此堆叠的能力直接导致长链螺旋结构，诸如核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核碱基可以是天然存在的(即，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U))或经修饰的。
术语“核苷”是指包含核碱基和糖部分的化合物(例如，脱氧核糖或核糖、或其修饰变体)。术语核苷包括经修饰的和未修饰的核苷。
术语“核苷酸”是指包含核碱基、糖部分和一个或多个磷酸酯基团的化合物。术语核苷酸包括经修饰的和未修饰的核苷酸。
术语“核苷间键”是指寡核苷酸中两个核苷之间的共价键。核苷可经由天然(即磷酸二酯(PO)键)或经修饰的键连接。
术语“化学修饰”、“修饰”或“经修饰的”可指与其天然存在的对应物相比化合物中的化学变化。例如，核碱基、糖部分或核苷间键可被化学修饰。蛋白质或多肽中的氨基酸可被修饰。修饰可以是对现有氨基酸的修饰或一个氨基酸被另一个氨基酸取代。一个氨基酸对另一个氨基酸的修饰的实例包括但不限于半胱氨酸修饰，其中一个位置处的天然存在的氨基酸被半胱氨酸取代(即半胱氨酸修饰)。
术语“核苷酸序列”和“核酸序列”和“核酸链”是指DNA或RNA的聚合物中的碱基序列(嘌呤和/或嘧啶或其合成衍生物)，其可以是单链或双链的，任选地含有能够掺入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸，和/或主链修饰(例如，经修饰的寡聚物)。术语“寡聚体”、“寡核苷酸”和“寡聚物”可互换使用并且是指嘌呤和/或嘧啶的此类序列。例如，寡核苷酸可包含长度小于约例如约200个核苷酸(例如，小于约100或50个核苷酸)的经化学修饰或未修饰的核酸分子(RNA或DNA)。寡核苷酸可以例如是单链DNA或RNA(例如，ASO)；双链DNA或RNA(例如，小干扰RNA(siRNA))，包括具有发夹环的双链DNA或RNA；或DNA/RNA杂合体。在一个实施方案中，寡核苷酸具有约5至约60个核苷酸、或约10至约50个核苷酸范围内的长度。在另一个实施方案中，寡核苷酸具有约5至约30个核苷酸或约15至约30个核苷酸范围内的长度。在另一个实施方案中，寡核苷酸具有约18至约24个核苷酸范围内的长度。
术语“经修饰的寡聚体”、“经修饰的寡核苷酸”或“经修饰的寡聚物”可类似地互换使用，并且是指含有合成的、非天然的或改变的碱基、糖和/或主链修饰的此类序列。
本文所述的寡核苷酸可使用本领域已知的标准固相或液相合成技术来合成。在某些实施方案中，寡核苷酸使用自动合成仪使用固相亚磷酰胺化学(美国专利号6,773,885)来合成。核酸的化学合成允许产生各种形式的核酸，其具有经修饰的键、嵌合组合物以及跨核酸全长在选择的位置附接的非标准碱基或修饰基团。
如本文所用，术语“互补”是指两个核酸之间的互补碱基配对的广义概念，这两个核酸相对于彼此以反义位置排列。当两个分子中的核苷酸位置被通常能够彼此碱基配对的核苷酸占据时，则认为核酸在该位置彼此互补。因此，当每个分子中至少约50％、至少约60％或至少约80％的对应位置被通常彼此碱基配对的核苷酸(例如，A:T(RNA的A:U)和G:C核苷酸对)占据时，两个核酸基本上彼此互补。
在两个或更多个核苷酸序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的核苷酸，例如，至少60％同一性、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更大，当使用一种序列比较算法或通过人工比对和目视检查测量时，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性比较和比对时，所述百分比的氨基酸残基在指定区域上是相同的。
对于寡核苷酸的序列比较(例如，以确定同一性或互补性)，通常一个核苷酸序列充当参考序列，与候选序列进行比较。可以使用本领域技术人员可用的各种方法，例如，目视比对或使用公开可用的软件使用已知的实现最大比对的算法来执行比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最大比对的参数可由本领域技术人员确定。
如本文所用，“杂交(hybridize或hybridization)”意指互补核苷酸序列(例如，反义化合物及其靶核酸；或者反义链和有义链之间)的配对。如本文所用，“特异性杂交”是指参考核酸与一种核酸分子杂交的能力，其亲和力大于与另一种核酸分子杂交的亲和力。
“表达”是指内源基因、异源基因或核酸片段或转基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，表达可指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积累。表达也可指蛋白质的产生。
术语“基因”是指包含产生多肽或前体所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。
短语“调节靶基因或序列的表达”意指靶基因或序列的表达的改变(例如，增加或减少)(例如，经由靶标的降解或翻译抑制)。例如，它包括抑制、减少或降低靶基因或序列的表达。这也包括可变剪接的改变，其可导致特定剪接变体的绝对或相对量的改变。
术语“卤代基”是氟、氯、溴或碘。烷基、烷氧基等表示直链和支链基团；但提及单个基团诸如丙基仅包括直链基团，特别提及支链异构体诸如异丙基。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C1-6意指一至六个碳)。实例包括(C1-C6)烷基、(C2-C6)烷基和(C3-C6)烷基。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基以及更高级的同系物和异构体。
术语“烷氧基”是指经由氧原子(“氧基”)附接到分子的其余部分的烷基基团。
术语“烷硫基”是指经由硫基团附接到分子的其余部分的烷基基团。
术语“烷氧基羰基”是指基团(烷基)-O-C(＝O)-，其中术语烷基具有本文所定义的含义。
术语“烷酰氧基”是指基团(烷基)-C(＝O)-O-，其中术语烷基具有本文所定义的含义。
术语“芳氧基”是指经由氧原子附接到分子的其余部分的芳基(芳基-O-)。
术语“杂芳氧基”是指经由氧原子附接到分子的其余部分的杂芳基(杂芳基-O-)。
如本文所用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
术语“环烷基”是指具有3至6个碳原子的饱和或部分不饱和(非芳族)全碳环(即，(C3-C6)碳环)。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“芳基”是指单个全碳芳族环或多个稠合的全碳环体系，其中至少一个环是芳族的。例如，在某些实施方案中，芳基基团具有6至20个碳原子、6至14个碳原子、6至12个碳原子或6至10个碳原子。芳基包括苯基。芳基还包括具有约9至20个碳原子的多个稠合碳环体系(例如，包含2、3或4个环的环体系)，其中至少一个环是芳族的，并且其中其他环可以是芳族的或非芳族的(即，环烷基)。当化合价要求允许时，多稠环体系的环可经由稠合、螺和桥键彼此连接。应当理解，如上定义的多稠环体系的附接点可在环体系的任何位置处，包括环的芳族或碳环部分。芳基基团的非限制性实例包括但不限于苯基、茚基、茚满基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基等。
术语“杂环”是指在环中具有至少一个除碳以外的原子的单个饱和或部分不饱和环，其中该原子选自由氧、氮和硫组成的组；该术语还包括具有至少一个此类饱和或部分不饱和环的多稠环体系，该多稠环体系将在下面进一步描述。因此，该术语包括在环中具有约1至6个碳原子和约1至3个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的单个饱和或部分不饱和环(例如，3、4、5、6或7元环)。硫和氮原子也可以它们的氧化形式存在。示例性杂环包括但不限于氮杂环丁烷基、四氢呋喃基和哌啶基。术语“杂环”还包括多稠环体系(例如，包含2、3或4个环的环体系)，其中单个杂环(如上所定义)可与选自环烷基、芳基和杂环的一个或多个基团稠合以形成该多稠环体系。当化合价要求允许时，多稠环体系的环可经由稠合、螺和桥键彼此连接。应当理解，多稠环体系的各个环可相对于彼此以任何顺序连接。还应理解，多稠环体系(如上文关于杂环所定义)的附接点可在多稠环体系的任何位置处，包括环的杂环、芳基和碳环部分。在一个实施方案中，术语杂环包括3-12元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-7元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括4-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至3个杂原子的3-12元单环或双环杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至2个杂原子的3-6元单环杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括包含1至2个杂原子的4-6元单环杂环。示例性杂环包括但不限于氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、高哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、四氢呋喃基、二氢噁唑基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、1,2,3,4-四氢喹啉基、苯并噁嗪基、二氢噁唑基、色满基、1,2-二氢吡啶基、2,3-二氢苯并呋喃基、1,3-苯并二噁唑基、1,4-苯并二噁烷基、螺[环丙烷-1,1′-异吲哚啉基]-3′-酮、异吲哚啉基-1-酮、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚基、咪唑烷-2-酮、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑啉酮、乙内酰脲、二氧戊环、邻苯二甲酰亚胺、1,4-二噁烷和
在一个实施方案中，杂环可以是二价的，即在杂环(-杂环-)的两个位置处附接到分子的其余部分或连接基团。在一个实施方案中，杂环被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)和羧基。
如本文所用，与化学结构中的键相交的波浪线表示波浪键在化学结构中与分子的其余部分相交的键的附接点。
如可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、牛、猪、马和其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，患者是人。
本文使用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得希望的药理作用和/或生理作用。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可指在损伤、疾病或病症的治疗或改善中成功的任何指征，包括任何客观或主观参数，诸如减轻、缓解、改善患者存活，增加存活时间或存活率，减少症状，或使损伤、疾病或病症对患者更可耐受，减慢退化或衰退的速率，或改善患者的身体或精神健康。另外，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”可指靶基因表达的调节，诸如基因敲低或基因敲除。例如，与对照中的表达相比，靶基因或序列的表达被抑制或降低例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数。治疗效果可与未接受治疗的个体或个体库比较，或者与治疗之前或在治疗期间不同时间的同一患者比较。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生物学或药理学上相容以用于人或动物的非活性药物成分，诸如但不限于缓冲剂、载剂或防腐剂。
药剂的“治疗量”或“治疗有效量”是治疗、缓解、减轻或降低受试者疾病症状严重程度的药剂的量。药剂的“治疗量”或“治疗有效量”可改善患者存活，增加存活时间或存活率，减轻症状，使损伤、疾病或病症更可耐受，减慢退化或衰退的速率，或改善患者的身体或精神健康。
术语“施用”是指将药剂、化合物或组合物递送至所需生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，本文所述的蛋白质静脉内施用。
III.TFR结合剂-寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F任选地存在或不存在，并且如果存在的话，包含肽、Fc多肽、Fc二聚体或白蛋白；
L任选地存在或不存在，并且如果存在的话，是连接基团；
P′任选地存在或不存在，并且如果存在的话，包含抗TfR抗体抗原结合结构域或非结合Fab或非结合可变区(NBVR)；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
P-F-P′(任选地，如果P′或F和P′不存在，则P-F或P)可称为TfR结合剂。在一些实施方案中，P-F-P′包含抗TfR抗体。抗体可以是二价抗体(具有两个各自特异性结合TfR的Fab臂)或双特异性抗体(具有特异性结合TfR的第一Fab臂和不特异性结合TfR的第二Fab臂)。如果P′存在并且F包含Fc二聚体，则P或P的重链组分可与Fc二聚体的一个Fc多肽形成单一多肽链，并且P′或P′的重链组分可与Fc二聚体的另一Fc多肽形成单一多肽链。如果n大于或等于2，则对于每个(L-(O)y)，y独立地大于或等于1(例如，1、2、3或4)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，TfR结合剂(P、P′(如果存在)和/或F(如果存在))包含促进寡核苷酸O任选地经由接头L的共价缀合的至少一个取代或修饰。
A.单价抗TfR(单Fab)抗体-寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
P-F-(L-(O)y)n
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F包含Fc多肽或Fc二聚体；
L是连接基团；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)；
其中TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含单个抗TfR抗体抗原结合结构域并且不包含任何附加的抗体抗原结合结构域、非结合Fab或NBVR(例如，如图13所示)。在一些实施方案中，P包含抗TfR Fab。在一些实施方案中，P包含抗TfR scFv。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含抗TfR VHH、vNAR或纳米抗体。抗TfR抗体抗原结合结构域可来自已知特异性结合TfR的任何抗TfR抗体。在一些实施方案中，F包含Fc二聚体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，TfR结合剂(P和/或F)包含促进寡核苷酸O任选地经由接头L的共价缀合的至少一个取代或修饰。寡核苷酸可与P或F连接。如果寡核苷酸连接到F并且F是Fc二聚体，它可与连接到P的Fc多肽或不连接到P的Fc多肽连接。
B.抗TfR/非结合Fab抗体-寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F包含Fc二聚体；
L是连接基团；
P′包含非结合Fab或NBVR；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些实施方案中，P包含抗TfR Fab(例如，如图13所示)。在一些实施方案中，P包含抗TfR scFv。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含抗TfR VHH、vNAR或纳米抗体。抗TfR抗体抗原结合结构域可来自已知特异性结合TfR的任何抗TfR抗体。在一些实施方案中，非结合Fab或NVBR可以是本文所述的非结合Fab或NVBR中的任一种。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，TfR结合剂(P、P′和/或F)包含促进寡核苷酸O任选地经由接头L的共价缀合的至少一个取代或修饰。寡核苷酸可与P、F或P′连接。如果寡核苷酸连接到F(Fc二聚体)，它可与连接到P的Fc多肽或连接到P′的Fc多肽连接。
C.抗TfR scFv-白蛋白-寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
P-F-(L-(O)y)n
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F包含白蛋白；
L是连接基团；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)；
在一些实施方案中，P包含抗TfR scFv(例如，如图13所示)。在一些实施方案中，P包含抗TfR Fab。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含抗TfR VHH、vNAR或纳米抗体。抗TfR抗体抗原结合结构域可来自已知特异性结合TfR的任何抗TfR抗体。在一些实施方案中，白蛋白是白人蛋白。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，TfR结合剂(P和/或F)包含促进寡核苷酸O任选地经由接头L的共价缀合的至少一个取代或修饰。
D.二价抗TfR抗体(抗TfR(Fab)2)-寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含以下或由以下组成：
其中，
P包含第一抗TfR抗体抗原结合结构域，
F包含Fc二聚体；
L是连接基团；
P′包含第二抗TfR抗体抗原结合结构域；
O是寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
在一些实施方案中，P和P′包含抗TfR Fab。在一些实施方案中，P和P′包含抗TfRscFv。在一些实施方案中，P包含抗TfR Fab并且P′包含抗TfR scFv。在一些实施方案中，P包含抗TfR scFv并且P′包含抗TfR Fab。在一些实施方案中，第一抗TfR抗体抗原结合结构域和/或第二抗TfR抗体抗原结合结构域包含抗TfR VHH、vNAR或纳米抗体。抗TfR抗体抗原结合结构域可来自已知特异性结合TfR的任何抗TfR抗体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，寡核苷酸包含ASO。在一些实施方案中，TfR结合剂(P、P′和/或F)包含促进寡核苷酸O任选地经由接头L的共价缀合的至少一个取代或修饰。
IV.寡核苷酸
如本文所述，一种或多种寡核苷酸(例如，ASO或RNAi剂)可任选地通过接头“L”连接到本文所述的TfR结合剂，以形成TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
尽管寡核苷酸的长度可变化，但在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为约10至约60个核苷酸，或长度为约10至约30个核苷酸，或长度为约18至约30个核苷酸，或长度为约15至约25个核苷酸，或长度为约16至约20个核苷酸。此外，如下所述，寡核苷酸可包含某些化学修饰，诸如经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基、经修饰的糖或它们的组合。在某些实施方案中，一个或多个寡核苷酸连接(即，通过连接基团“L”)到TfR结合剂。在某些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸连接到TfR结合剂(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个或更多个)。在某些实施方案中，一个寡核苷酸与TfR结合剂连接。在某些实施方案中，两个寡核苷酸与TfR结合剂连接。在某些实施方案中，四个寡核苷酸与TfR结合剂连接。
在某些实施方案中，1个寡核苷酸附接到单个连接基团(L)。在某些实施方案中，2个寡核苷酸附接到单个连接基团(L)。例如，寡核苷酸可彼此串联连接。在某些实施方案中，L附接在第一寡核苷酸的5′端并且第二寡核苷酸连接到第一寡核苷酸的3′端。在某些实施方案中，寡核苷酸可经由核酸接头或非寡核苷酸可切割接头连接。
在其他实施方案中，连接基团为支链连接基团，并且2个或更多个寡核苷酸分别附接到单个连接基团(L)(即，y是2或更大)。
当两个或更多个寡核苷酸附接到TfR结合剂时，寡核苷酸可相同或不同。在某些实施方案中，寡核苷酸是相同的。
ASO
在一个实施方案中，每个寡核苷酸独立地为ASO。术语“反义寡核苷酸(ASO)”是指与所选择的靶多核苷酸序列(例如，mRNA)互补或部分互补的DNA样或RNA样分子的单链(例如，经修饰的核苷酸诸如本文所述的那些)。通过与互补靶序列结合，ASO可通过多种机制改变或调节基因表达，包括例如通过改变剪接(外显子排除或外显子包含)；通过募集RNase H导致靶标降解；通过翻译抑制；以及通过小RNA抑制。
通常，ASO的长度范围为约10至30个碱基对(bp),但可更长或更短。例如，在某些实施方案中，ASO的长度为约10至约60个核苷酸，或长度为约10至约50个核苷酸，或长度为约10至约40个核苷酸。在某些实施方案中，ASO的长度为约10至30个核苷酸，或长度为约12至30个核苷酸，或长度为约14至约30个核苷酸，或长度为约15至约30个核苷酸，或长度为约16至约30个核苷酸，或长度为约17至约30个核苷酸，或长度为约18至约30个核苷酸，或长度为约18至约28个核苷酸，或长度为约18至26个核苷酸，或长度为约18至约24个核苷酸，或长度为约15至约25个核苷酸，或长度为约16至约20个核苷酸。在某些实施方案中，ASO的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
对给定靶序列特异的反义寡核苷酸序列的选择是基于对所选择的靶序列的分析和许多因素的确定，包括二级结构、Tm、结合能和相对稳定性。另外，反义寡核苷酸可基于它们相对不能形成将减少或阻止与宿主细胞中靶mRNA的特异性结合的二聚体、发夹或其他二级结构来选择。mRNA的靶区域包括在AUG翻译起始密码子处或附近的那些区域和与mRNA的5′区域基本上互补的那些序列。二级结构分析和靶位点选择考虑可使用本领域已知的软件和算法进行，例如使用第4版OLIGO引物分析软件(Molecular Biology Insights)和/或BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul等人,Nucleic Acids Res.1997,25(17):3389-402)。
RNAi剂
在某些其他实施方案中，每个寡核苷酸独立地为RNAi剂(例如，siRNA或shRNA)。术语“RNA干扰(RNAi)剂”是指可以序列特异性方式(例如，经由Dicer/RISC)抑制靶基因或序列(例如，mRNA、tRNA或病毒RNA)表达的RNA剂或可被切割成RNA剂的分子。RNAi剂可以是单链或双链的。如果RNAi剂是单链的，则它可包括5′修饰，诸如一个或多个磷酸酯基团或磷酸酯基团的一个或多个类似物。在一个实施方案中，RNAi剂是双链的并且包含有义链和反义链(例如，短干扰RNA(siRNA))。
RNAi剂通常包括与靶基因具有足够同源性的区域，并且具有足够的长度，使得RNAi剂可介导靶基因的下调。RNAi剂与靶序列之间的互补性应足以使RNAi剂或其切割产物能够指导序列特异性沉默。在某些实施方案中，RNAi剂是或包含与靶RNA至少部分互补的区域。在某些其他实施方案中，RNAi剂是或包含与靶RNA完全互补的区域。
在一些实施方案中，RNAi剂在分子的一端或两端包含未配对区域。例如，双链RNAi剂可使其链与悬端配对，例如5′和/或3′悬端，诸如1-3个核苷酸的悬端。在某些实施方案中，RNAi剂将在每个端处包含长度为1、2、3或4个核苷酸的未配对悬端。悬端可以是一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。
RNAi剂内的双链体区的长度可变化，但通常长度范围在约5至约30个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区长度在约15-60、或约15-50、或约15-40、或约15-30、或约15-25、或约19-25个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区长度在约20-24或约21-23个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个核苷酸。
如本文所用，“单链RNAi剂”或“ssRNAi剂”由单个分子组成。它可包括通过链内配对形成的双链体区，例如它可以是或包括发夹或盘柄结构。单链RNAi剂关于靶分子可以是反义的。单链RNAi剂可足够长，使得它可进入RISC并参与RISC介导的靶mRNA的切割。在某些实施方案中，单链RNAi剂的长度为至少10、15、20、25、30、35、40或50个核苷酸。在某些实施方案中，其长度小于200、100、80或60个核苷酸。
小发夹RNA(shRNA)剂通常具有长度小于200、100或50的双链体区。在某些实施方案中，双链体区的长度范围为约15-60、或约15-50、或约15-40、或约15-30、或约15-25、或约19-25个核苷酸。在某些实施方案中，双链体区的长度为在17-23、或约19-23、或约20-23、或约21-23、或约19-21个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区的长度为至少约17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对。发夹可具有单链悬端或末端未配对区。在某些实施方案中，悬端的长度为2-3个核苷酸。在一些实施方案中，悬端在发夹的有义侧，并且在一些实施方案中在发夹的反义侧上。
如本文所用，“双链RNAi剂”或“dsRNAi剂”包括多于一条链，其中链间杂交可在分子内形成双链体区(例如，有义链与反义链之间的杂交)。在某些实施方案中，RNAi剂足够大，使得它可被内源分子(诸如Dicer)切割以产生更小的分子。
在某些实施方案中，RNAi剂是包含有义链和反义链的siRNA分子。
如本文所用，术语“反义链”是指与靶多核苷酸(例如靶mRNA)充分互补的RNAi剂的链。在某些实施方案中，双链RNAi剂的反义链的长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60个核苷酸。在某些实施方案中，双链RNAi剂的反义链长度小于约200、100或50个核苷酸。在某些实施方案中，反义链的长度范围为约17至25个核苷酸、或约19至23个核苷酸、或约19至21个核苷酸。
如本文所用，术语“有义链”是指RNAi剂的与反义链充分互补的链。在某些实施方案中，双链RNAi剂的有义链的长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60个核苷酸。在某些实施方案中，双链RNAi剂的有义链的长度小于约200、100或50个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度范围为约17至25个核苷酸、或约19至23个核苷酸、或约19至21个核苷酸。
在某些实施方案中，双链RNAi剂的双链部分的长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60个核苷酸。在某些实施方案中，双链RNAi剂的有义链的长度小于约200、100或50个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度范围为约17至25个核苷酸、或约19至23个核苷酸、或约19至21个核苷酸。
在某些实施方案中，可选择有义链和反义链，使得dsRNAi剂在分子的一端或两端包含未配对区。因此，dsRNAi剂可含有有义和反义链，配对以含有悬端，例如长度在1、2、3或4个核苷酸之间的5′和/或3′悬端。悬端可以是一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。在某些实施方案中，dsRNAi剂包含至少一个3′悬端。在某些实施方案中，dsRNAi剂的两端包含3′悬端(例如，长度为2个核苷酸)。
dsRNAi剂内的双链体区的长度可变化，但通常长度范围在约5至约30个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区的长度为约5-60、或约15-60、或约15-50、或约15-40、或约15-30、或约15-25、或约19-25个核苷酸。在某些实施方案中，双链体区的长度为在17-23、或约19-23、或约20-23、或约21-23、或约19-21个核苷酸之间。在某些实施方案中，双链体区的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个核苷酸。
产生RNAi剂(诸如siRNA和shRNA)的方法是本领域已知的并且可容易地适用于产生靶向任何多核苷酸序列的RNAi剂。在某些实施方案中，RNAi剂是化学合成的。例如，寡核苷酸可使用多种技术来合成，诸如在Usman等人,J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987)；Scaringe等人,Nucl.Acids Res.,18:5433(1990)；Wincott等人,Nucl.Acids Res.,23:2677-2684(1995)；以及Wincott等人,Methods Mol.Bio.,74:59(1997)中所述的那些。
说明性寡核苷酸修饰
在某些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可包含至少一个核酸修饰，诸如选自由经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基、经修饰的糖以及它们的组合组成的组的那些。此类修饰可用于改变药代动力学(提高的核酸酶抗性导致更长的半衰期)、药效学(对靶RNA的优异亲和力)或内吞摄取。然而，许多修饰排除了RNase H的切割，这是许多ASO的期望作用机制。因此，某些RNase H ASO可被设计成嵌合体，其中不同的碱基是不同化学物质的混合物，或被设计成缺口体(gapmer)，其中一些修饰被放置在“翼”上而不是中心碱基上。相反，对于旨在改变mRNA剪接或翻译的RNAi剂和ASO，关于RNase H的考虑是不必要的。
因此，本文所述的寡核苷酸可包含一个或多个核酸修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或40个或更多个修饰。
在某些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含一个或多个核苷酸修饰(例如，对核碱基或糖部分的修饰)。在某些实施方案中，寡核苷酸中存在的25％或更多的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸中存在的50％或更多的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸中存在的75％或更多的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸中100％的核苷酸被修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核碱基修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含对糖部分的一个或多个修饰(例如，呋喃糖基在2′-位、3′-位、4′-位和/或5′-位处包含取代基)。在某些实施方案中，经取代的糖部分包括双环糖部分。
在某些实施方案中，核酸修饰与寡核苷酸被包括在一种模式中。在某些实施方案中，寡核苷酸是缺口体。缺口体寡核苷酸的修饰模式通常具有式5′-Xa-Ya-Za-3′，其中Xa和Za作为缺口区Ya周围的侧翼区。在某些实施方案中，Ya区是一段连续的核苷酸，例如至少6个DNA核苷酸的区域，其能够募集RNAse，例如RNAse H。在某些实施方案中，Ya区为至少8个DNA核苷酸。在某些实施方案中，Ya区为约9至约15个DNA核苷酸。在某些实施方案中，Ya区为约11至约13个DNA核苷酸。在某些实施方案中，Ya区为10、11、12或13个DNA核苷酸。在某些实施方案中，缺口体结合靶核酸，此时RNAse被募集，然后可切割靶核酸。在某些实施方案中，Ya区在5′和3′两侧为区域Xa和Za，它们包含高亲和力的经修饰的核苷酸，例如在Xa和Za中的每一者中包含一至六个经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，Ya区在5′和3′两侧为区域Xa和Za，其中Xa和Za包含具有经修饰的糖的经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，Xa和Za中的每个核苷酸包含具有糖修饰的经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸可以是但不限于2-MOE修饰的核苷酸、双环核苷酸、LNA核苷酸或cET修饰的核苷酸。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸存在于寡核苷酸的5′和3′区域中，而某些经修饰的核苷酸和/或经修饰的键可以或可以不存在于分子的中心部分中。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸存在于寡核苷酸的5′和3′区域中，并且某些经修饰的核苷酸不存在于分子的中心部分中(例如，LNA残基不存在于中心部分中)；然而，中心区域可含有经修饰的键，诸如PS键。在某些实施方案中，Xa和Za各自独立地为约3至约6个核苷酸长。在某些实施方案中，Xa和Za各自独立地为3、4或5个核苷酸长。在某些实施方案中，Xa和Za各自包含3个经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，3个经修饰的核苷酸在Xa和Za的每一者中串联排列。
经修饰的核苷/核苷酸是本领域已知的，并且包括但不限于2′-O甲基(2′OMe)残基、2′O-甲氧基乙基(MOE)残基、受限核酸残基(例如，S-cEt、R-cEt、S-cMOE和R-cMOE)、肽核酸(PNA)残基、锁定核酸(LNA)残基和5-甲基胞苷残基(甲基化胞嘧啶残基)(还参见，Scoles等人,Neurol Genet 2019年4月,5(2)e323)。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个MOE残基。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个OMe残基或F残基(例如，2′-F或2′OMe)。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个受限残基(例如，S-cEt、R-cEt、S-cMOE和R-cMOE)和/或LNA残基。当核酸具有在核糖糖分子的2′-氧和4′-碳之间形成的亚甲基桥连接时，它们被认为是“锁定的”。在某些实施方案中，寡核苷酸是吗啉代(即，包含对糖部分的某些修饰)。在某些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含一个或多个LNA残基和一个或多个5-甲基胞苷残基。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含对核苷间主链的一个或多个修饰(即，天然磷酸二酯(PO)键被修饰)。在某些实施方案中，进行此类修饰以例如降低核酸酶活性。因此，在某些实施方案中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个经修饰的核苷间键。在某些实施方案中，25％或更多的核苷间键被修饰。在某些实施方案中，50％或更多的核苷间键被修饰。在某些实施方案中，75％或更多的核苷间键被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸中100％的核苷间键被修饰。
主链修饰是本领域已知的并且包括但不限于硫代磷酸酯(PS)键、手性硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键、甲磺酰基氨基磷酸酯键和二氨基磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、氨基烷基磷酸三酯键、磷酸三酯键、硫代磷酸酯键、膦酸酯键、甲基膦酸酯键、烷基膦酸酯键、3′-亚烷基膦酸酯键、手性膦酸酯键、3′-氨基氨基磷酸酯键、氨基烷基氨基磷酸酯键、次膦酸酯键、硫羰烷基膦酸酯键、硫羰氨基磷酸酯键、硫羰烷基磷酸三酯键、硼烷磷酸酯键、吗啉代键和肽核酸(PNA)键。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个)核苷间键被硫代磷酸酯(PS)键替换。在某些实施方案中，寡核苷酸包含经修饰和未修饰的键的混合物。在一个核苷间键处的修饰可独立于在另一个核苷间键处的修饰。在某些实施方案中，MAPT ASO中的每个核苷间键是经修饰的键。在某些实施方案中，MAPT ASO中的每个核苷间键是PS键。在一些实施方案中，LPA ASO中的每个核苷间键是硫代磷酸酯或甲磺酰基氨基磷酸酯。在某些其他实施方案中，寡核苷酸中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个)核苷间键被二氨基磷酸酯键替换。在某些实施方案中，寡核苷酸是二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)。
在某些实施方案中，核苷间键关于手性中心(Rp和Sp)是立体无规的。在某些其他实施方案中，寡核苷酸中的Rp和Sp构型在特定构型中被优化。
在某些实施方案中，寡核苷酸为包含LNA和PS修饰的缺口体。例如，在某些实施方案中，寡核苷酸为具有式5′-Xa-Ya-Za-3′的修饰模式的缺口体，其中Xa和Za作为缺口区Ya周围的侧翼区，其中Xa和Za各自包含3个LNA修饰的核苷酸(例如，3个连续的LNA修饰的核苷酸)，并且其中缺口区Ya包含PS键。在一些实施方案中，反义寡核苷酸中的每个核苷酸间键包含PS键。在某些实施方案中，寡核苷酸还包含一个或多个5′-甲基胞苷残基。在某些实施方案中，缺口区Ya不包含LNA残基。
V.连接基团
在一些实施方案中，寡核苷酸经由接头“L”缀合到TfR结合剂(例如，抗TfR抗体抗原结合结构域或抗TfR抗体)。在某些实施方案中，L是将每个寡核苷酸接合到TfR结合剂的连接基团。连接基团可以是适于将寡核苷酸接合到蛋白质或多肽诸如抗体的任何基团。
连接基团可附接到TfR结合剂的任何区域(例如，附接到N末端区域，附接到C末端区域，或附接到蛋白质内的氨基酸，诸如半胱氨酸残基或谷氨酰胺残基)，只要寡核苷酸不阻止TfR结合剂与TfR的结合。类似地，连接基团可附接到寡核苷酸的任何区域(例如，5′端、3′端或附接到分子内的核酸残基)，只要TfR结合剂不干扰寡核苷酸的功能性(例如，与靶核酸的互补结合)。例如，接头可通过位于整个寡核苷酸中的任何数量的合成上可行的点附接到寡核苷酸，诸如在寡核苷酸的3′或5′末端残基处；在糖部分处；在碱基部分处；或在位于主链内的残基处。
在某些实施方案中，接头在寡核苷酸的5′末端残基处附接到寡核苷酸。在某些实施方案中，接头在寡核苷酸的3′末端残基处附接到寡核苷酸。在某些实施方案中，接头在寡核苷酸内的残基处附接到寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是双链RNAi分子，其中接头附接到有义链(例如，在5′或3′末端残基处)。在某些实施方案中，寡核苷酸是双链RNAi分子，其中接头附接到反义链(例如，在5′或3′末端残基处)。在某些实施方案中，寡核苷酸是siRNA，其中接头附接到有义链的3′末端。在某些实施方案中，siRNA的有义链的3′末端用C6胺修饰。
在某些实施方案中，连接基团包含至少一个间隔区。在某些实施方案中，间隔区是亲水性间隔区。在某些实施方案中，亲水性间隔区是聚乙二醇(PEG)。
连接基团可以是同双官能接头或异双官能接头。
在一些实施方案中，连接基团为可切割的(例如，核酸酶可切割接头、酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人,CancerRes.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020))。在某些实施方案中，连接基团包含一个或多个核苷酸(例如，1、2、3或更多个)或一个或多个核苷(例如，1、2、3或更多个)。在某些实施方案中，连接基团的一个或多个核苷酸或一个或多个核苷是未修饰的。在某些实施方案中，连接基团包含一个或多个具有未修饰的碱基、未修饰的糖基和/或未修饰的磷酸酯基团的核苷酸。在某些实施方案中，连接基团包含一个或多个具有未修饰的碱基和/或未修饰的糖基的核苷。在某些实施方案中，连接基团包含TCA(胸腺嘧啶-胞嘧啶-腺嘌呤)三核苷酸。在某些实施方案中，TCA在T位用C6胺修饰。在某些实施方案中，连接基团不包含TCA。
在某些实施方案中，连接基团为酶可切割的。在某些实施方案中，连接基团可被存在于中枢神经系统(CNS)或肌中的酶切割。在某些实施方案中，可切割连接基团适用于包含ASO的缀合物(例如，使ASO能够从缀合物的其余部分解离以转运至核内)。在某些实施方案中，可切割连接基团为可切割的二肽接头。在某些实施方案中，可切割二肽接头为缬氨酸-瓜氨酸可切割连接基团或缬氨酸-丙氨酸可切割接头。
在某些实施方案中，可切割连接基团为酸可切割接头。在某些实施方案中，酸可切割接头为碳酸酯接头或腙接头。
在某些实施方案中，可切割连接基团包含一个或多个PEG间隔区。
在某些实施方案中，可切割连接基团为二硫化物，诸如SPDP(琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)或lys-缀合的酸可切割酰肼。
在某些实施方案中，连接基团为不可切割的连接基团。在某些实施方案中，连接基团为共价连接基团。在某些实施方案中，共价连接基团衍生自3-芳基丙腈(APN)或丙烯酰胺。在某些实施方案中，共价连接基团包括基团-CH2CH2C(＝O)-。在某些实施方案中，共价连接基团包括以下基团：
在某些实施方案中，共价连接基团可衍生自卤代乙酰胺，例如溴代乙酰胺、氯代乙酰胺、碘代乙酰胺。
在某些实施方案中，连接基团包括具有式–(CH2)6-NH-的C6胺基团。
在某些实施方案中，连接基团可衍生自马来酰亚胺。例如，在某些实施方案中，连接基团包括以下基团：
在某些实施方案中，连接基团可在标记*的化合价处附接到P(例如，附接到P内的修饰位点的硫原子)。
在某些实施方案中，马来酰亚胺是经修饰的马来酰亚胺。在某些实施方案中，经修饰的马来酰亚胺为烷基-、芳基-、环烷基-或环外-马来酰亚胺。
在某些实施方案中，连接基团为自水解连接基团。
示例性连接基团的某些具体的非限制性实施方案(缩写为接头实施方案LE1-LE42)描述如下。
在接头实施方案LE1中，连接基团具有约20道尔顿至约5,000道尔顿的分子量。在接头实施方案LE2中，连接基团具有约20道尔顿至约1,000道尔顿的分子量。在接头实施方案LE3中，连接基团具有约20道尔顿至约200道尔顿的分子量。
在接头实施方案LE4中，连接基团具有约5埃至约60埃的长度。在接头实施方案LE5中，连接基团将寡核苷酸与式(I)的TfR结合剂隔开约5埃至约40埃(包括端值)的长度。
在接头实施方案LE6中，连接基团为具有2至25个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子任选地被(-O-)、(-NH-)、(-S-)、氨基酸、腙(-C(R′)＝N＝N(R′)-)、核苷酸、或3-12元二价杂环替换，其中该链和任何3-12元二价杂环任选地被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、腙(＝N＝N(R′)-)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基；其中每个R′独立地为H或(C1-C6)烷基。
在接头实施方案LE7中，连接基团为具有2-25个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子任选地被(-O-)、(-NH-)或3-12元二价杂环替换，其中该链和任何3-12元二价杂环任选地被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在接头实施方案LE8中，连接基团为具有2-10个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子任选地被(-O-)、(-NH-)、(-S-)、氨基酸、腙(-C(R′)＝N＝N(R′)-)、核苷酸或3-12元二价杂环替换，其中该链和任何3-12元二价杂环任选地被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、腙(＝N＝N(R′)-)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基；其中每个R′独立地为H或(C1-C6)烷基。
在接头实施方案LE9中，连接基团为具有2-10个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子任选地被(-O-)、(-NH-)或3-12元二价杂环替换，其中该链和任何3-12元二价杂环任选地被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在接头实施方案LE10中，连接基团为具有2-25个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中该链任选地在碳上被一个或多个(例如，1、2、3或4个)选自以下的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在接头实施方案LE11中，连接基团为具有2-10个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中该链任选地在碳上被一个或多个(例如1、2、3或4个)选自以下的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在接头实施方案LE12中，连接基团为具有2至10个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链。
在接头实施方案LE13中，连接基团为具有2至10个碳原子的二价、支链或非支链、饱和烃链。
在接头实施方案LE14中，连接基团为具有2至10个碳原子的二价、非支链、饱和烃链。
在接头实施方案LE15中，连接基团为具有2至25个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个二硫键。
在接头实施方案LE16中，连接基团为具有2至25个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个链中或附加到链的碳原子上的腙基团。
在接头实施方案LE17中，连接基团为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个链中的氨基酸。
在接头实施方案LE18中，连接基团为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和链，其中在链中包含链中的二肽。
在接头实施方案LE19中，连接基团为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和链，其中在链中包含链中的二肽缬氨酸-瓜氨酸。
在接头实施方案LE20中，连接基团在链中包含一个或多个核苷酸。
在接头实施方案LE21中，连接基团在链中包含两个或更多个核苷酸。
在接头实施方案LE22中，连接基团在链中包含三核苷酸基团。
在接头实施方案LE23中，至少一个连接基团附接到两个或更多个寡核苷酸(例如，对于式(I)的化合物，对于(L-(O)y)，y大于或等于2)。
在接头实施方案LE24中，仅一个连接基团附接到两个或更多个寡核苷酸(例如，对于式(I)的化合物，对于单个(L-(O)y)，一个y大于或等于2)。
在接头实施方案LE24b中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物含有附接到两个或更多个寡核苷酸的单个连接基团(例如，对于式(I)的化合物，n＝1并且y大于或等于2)。
在接头实施方案LE25中，至少两个连接基团附接到两个或更多个寡核苷酸(例如，对于式(I)的化合物，n大于或等于2，并且对于至少两个(L-(O)y)，y大于或等于2)。
在接头实施方案LE26中，至少两个连接基团附接到两个寡核苷酸(例如，对于式(I)的化合物，n大于或等于2，并且对于至少两个(L-(O)y)，y＝2)。
在接头实施方案LE27中，连接基团通过寡核苷酸的磷酸酯附接到寡核苷酸(例如，与5′末端残基缔合)。
在接头实施方案LE28中，连接基团通过寡核苷酸的硫代磷酸酯附接到寡核苷酸(例如，与5′末端残基缔合)。
在接头实施方案LE29中，连接基团包含聚乙烯氧基链。在本发明的另一个实施方案中，聚乙烯氧基链包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复乙烯氧基单元。
在接头实施方案LE30中，连接基团包含5元二价杂环。
在接头实施方案LE31中，连接基团具有以下结构：
其中L′为具有2至25个碳原子的二价、支链或非支链、饱和或不饱和烃链，其中一个或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子任选地被(-O-)、(-NH-)、(-S-)、氨基酸、腙(-C(R′)＝N＝N(R′)-)、核苷酸或3-12元二价杂环替换，其中该链和任何3-12元二价杂环任选地被一个或多个(例如，1、2、3或4个)独立地选自由以下项组成的组的取代基取代：(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤代基、羟基、氧代(＝O)、腙(-NH-N＝C(R′)-)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基；其中每个R′独立地为H或(C1-C6)烷基；并且其中在式(I)中标记*的化合价附接到P并且标记**的化合价附接到O。在另一个实施方案中，L′为具有2至25个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价支链或非支链饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个二硫键。在另一个实施方案中，L′为具有2至25个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价支链或非支链饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个链中或附加到链的碳原子上的腙基团。在另一个实施方案中，L′为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价支链或非支链饱和或不饱和链，其中在链中包含一个或多个链中的氨基酸。在另一个实施方案中，L′为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价支链或非支链饱和或不饱和链，其中在链中包含链中的二肽。在另一个实施方案中，L′为具有2至35个选自碳、氧、氮和硫的原子的二价支链或非支链饱和或不饱和链，其中在链中包含链中的二肽缬氨酸-瓜氨酸。在另一个实施方案中，L′包含一个或多个核苷酸。在另一个实施方案中，L′包含两个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，L′包含三核苷酸基团。在另一个实施方案中，L′包含一个或多个具有未修饰的碱基、未修饰的糖基团和/或未修饰的磷酸酯基团的核苷酸。
在接头实施方案LE32中，L′具有以下结构：
其中t为1、2、3、4、5、6、7或8；z为0、1、2、3、4、5、6、7或8；并且R1、R2和R3各自独立地为核苷酸。
在接头实施方案LE33中，L′具有以下结构：
在接头实施方案LE34中，连接基团具有以下结构：
其中t为1、2、3、4、5、6、7或8；并且z为0、1、2、3、4、5、6、7或8。
在接头实施方案LE35中，连接基团具有以下结构：
其中t为1、2、3、4、5、6、7或8；并且z为0、1、2、3、4、5、6、7或8，其中在式(I)中标记*的化合价附接到P，标记**的化合价附接到O。在某些实施方案中，标记**的化合价通过寡核苷酸的磷酸酯附接到O(例如，与5′末端残基缔合)。
在接头实施方案LE36中，连接基团具有以下结构：
在接头实施方案LE37中，连接基团具有以下结构：
其中在式(I)中标记*的化合价附接到P并且标记**的化合价附接到O。在某些实施方案中，标记**的化合价通过寡核苷酸的磷酸酯附接到O(例如，与5′末端残基缔合)。因此，在实施方案中，接头结构中的A基团可在处共价结合到-O-PO3，其本身共价结合到寡核苷酸。
在接头实施方案LE38中，连接基团具有以下结构：
在接头实施方案LE39中，接头为肽接头或由蛋白质、肽或氨基酸形成。例如，在某些实施方案中，连接基团为由蛋白质形成的二价基团。在另一个实施方案中，连接基团为由肽形成的二价基团。在另一个实施方案中，连接基团为由氨基酸形成的二价基团。
在接头实施方案LE40中，连接基团可被构造成使得它允许寡核苷酸和TfR结合剂相对于彼此旋转；和/或对蛋白酶的消化具有抗性。在一些实施方案中，连接基团可以是柔性接头，例如含有氨基酸诸如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等。此类连接基团使用已知参数设计。例如，连接基团可具有重复，诸如Gly-Ser重复。
在接头实施方案LE41中，连接基团具有或包含选自由以下项组成的组的式：
其中，
每个A独立地为(C1-C15)烷基；
每个D为–(CH2-CH2-O)m-；并且
每个m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24。
在接头实施方案LE42中，连接基团具有或包含选自由以下项组成的组的式：
在各种实施方案中，缀合物可使用公知的化学交联试剂和方案来生成。例如，存在大量本领域技术人员已知的并且可用于使蛋白质与感兴趣的药剂交联的化学交联剂。例如，交联剂是异双官能交联剂，其可用于以逐步方式连接分子。异双官能交联剂提供了设计用于缀合蛋白质的更特异性偶联方法的能力，从而减少不需要的副反应诸如同型蛋白聚合物的发生。本领域已知多种异双官能交联剂，包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺氧羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的那些交联剂可作为N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物获得，其通常具有更大的水溶性。另外，在连接链中具有二硫键的那些交联剂可作为烷基衍生物合成，以减少体内接头切割的量。除了异双官能交联剂之外，还存在许多其他交联剂，包括同双官能和光反应性交联剂。双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)和庚二亚氨酸二甲酯.2HCl(DMP)是有用的同双官能交联剂的实例，并且双-[B-(4-叠氮水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚胺基-6(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)是有用的光反应性交联剂的实例。
VI.抗TFR抗体抗原结合结构域
适用于所述TfR结合剂-寡核苷酸缀合物的抗TfR抗体抗原结合结构域可以是衍生自已知特异性结合TfR的抗体的抗TfR抗体抗原结合结构域。抗TfR抗体抗原结合结构域可衍生自但不限于以下文献中描述的抗体或蛋白质分子中的任一种：US20130028891、US2018282408、US20190092870、US2020071413、US20210138083、WO2014/033074、WO2015/101588、WO2016/081640、WO2016/208695、WO2018/124121、WO2018/210898、WO2020/132584、WO2021/076546、WO2021/205358、WO2022/101633、WO2022/103769、WO2022/221505、Candelaria等人(Front.Immunol.12 2021年3月17日,2021)以及Weber等人(Cell Reports22:149-162,2018)，它们中的每一者全文以引用方式并入本文。抗TfR抗体抗原结合结构域可包含抗体、Fab(包括F(ab′)2)、scFab、Fv片段、scFv、VHH、vNAR或纳米抗体。
在一些实施方案中，TfR结合剂包含具有至少一个特异性结合TfR的可变结构域或抗原结合位点的抗体。在一些实施方案中，TfR结合剂包含具有特异性结合TfR的单个可变结构域或抗原结合位点的抗体。在一些实施方案中，TfR结合剂包含具有特异性结合TfR的单个可变结构域或抗原结合位点的抗体(是单价的，即其中TfR-结合剂不包含任何附加的抗体抗原结合结构域、非结合Fab或NBVR(抗TfR单Fab))。在一些实施方案中，TfR结合剂包含具有特异性结合TfR的第一可变结构域或抗原结合位点和包含非结合Fab或NBVR的第二可变结构域或抗原结合位点的双特异性二价抗体。在一些实施方案中，TfR结合剂包含与白蛋白(例如，人白蛋白)连接的抗TfR抗体结合结构域(例如，抗TfR Fab、scFv、VHH、vNAR或纳米抗体)。在一些实施方案中，TfR结合剂包含具有第一抗TfR抗体抗原结合结构域(例如，Fab或scFv)和第二抗TfR抗体抗原结合结构域(例如，Fab或scFv)的抗TfR抗体。
包含特异性结合TfR的Fab的说明性蛋白质
特异性结合TfR的示例性Fab包括SEQ ID NO:10、19、102、104、110、122、132或143的重链可变区和SEQ ID NO:9、18、103、105、111、123、133或144的轻链可变区。除非上下文另有说明，否则对特异性结合TfR的Fab的提及应被理解为是指小鼠、嵌合、贴面化、人源化和修饰形式中的任一种。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQID NO:9的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQID NO:102的重链可变区和SEQ ID NO:103的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:104的重链可变区和SEQ ID NO:105的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:110的重链可变区和SEQ ID NO:111的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:122的重链可变区和SEQ IDNO:123的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:132的重链可变区和SEQ ID NO:133的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQID NO:143的重链可变区和SEQ ID NO:144的轻链可变区。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQ IDNO:9的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQID NO:102的重链可变区和SEQ ID NO:103的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:104的重链可变区和SEQ ID NO:105的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:110的重链可变区和SEQ ID NO:111的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:122的重链可变区和SEQ ID NO:123的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:132的重链可变区和SEQ ID NO:133的轻链可变区组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:143的重链可变区和SEQ ID NO:144的轻链可变区组成。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:10的重链CH1和可变区以及含有SEQ ID NO:9的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:19的重链CH1和可变区以及含有SEQ ID NO:18的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:102的重链和含有SEQ ID NO:103的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:104的重链和含有SEQ ID NO:105的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:110的重链和含有SEQ ID NO:111的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:122的重链和含有SEQ IDNO:123的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:132的重链和含有SEQ ID NO:133的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有SEQ ID NO:143的重链和含有SEQ ID NO:144的轻链。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:10的重链CH1和可变区以及SEQ ID NO:9的轻链组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:19的重链CH1和可变区以及SEQ ID NO:18的轻链组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ IDNO:104和SEQ ID NO:105组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:122和SEQID NO:123组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab由SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144组成。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含SEQ ID NO:10和9、19和18、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:114、115、116、117、118和119的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130和131的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:134、135、136、137、138和139的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQ ID NO:154、155、156、157、158和159的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含分别具有SEQID NO:161、162、163、164、165和166的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含含有与SEQ ID NO:9、18、103、105、111、123、133或144的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO:10、19、102、104、110、122、132或143的VH和CH1区氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链，并且含有SEQ ID NO:9和10、18和19、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的Fab包含与SEQ ID NO:9和10、18和19、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的可变区相差少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的轻链和重链可变区。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ IDNO:104和SEQ ID NO:105。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:110和SEQ IDNO:111。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:21、22、23、24、25和16的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有SEQ ID NO102和103的CDR序列。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:114、115、116、117、118和119的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130和131的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:134、135、136、137、138和139的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133组成。
在一些实施方案中，Fab-Fc融合体包含与SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:147、148、149、150、151和152的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，Fab-Fc融合体由SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144组成。
ScFab可通过使用本领域已知的方法形成包含所述Fab中的任一者的重链和轻链的融合蛋白来制备。
包含特异性结合TfR的scFv的说明性蛋白质
特异性结合TfR的示例性scFv包括SEQ ID NO:10、19、102、104、110、122、132或143的重链可变区和SEQ ID NO:9、18、103、105、111、123、133或144的轻链可变区。除非上下文另有说明，否则对特异性结合TfR的scFv的提及应被理解为是指小鼠、嵌合、贴面化、人源化和修饰形式中的任一种。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQID NO:9的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:102的重链可变区和SEQ ID NO:103的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:104的重链可变区和SEQ ID NO:105的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:110的重链可变区和SEQ ID NO:111的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:122的重链可变区和SEQ ID NO:123的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ IDNO:132的重链可变区和SEQ ID NO:133的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:143的重链可变区和SEQ ID NO:144的轻链可变区。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:106。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:107。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:171。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:153。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:160。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:112和113。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQID NO:124和125。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:145和146。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv由SEQ ID NO:106组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv由SEQ ID NO:107组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv由SEQ ID NO:171组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv由SEQ ID NO:153组成。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv由SEQ ID NO:160组成。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含SEQ ID NO:10和9、19和18、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:114、115、116、117、118和119的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130和131的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:134、135、136、137、138和139的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:154、155、156、157、158和159的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含分别具有SEQ ID NO:161、162、163、164、165和166的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:106、107或171的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有SEQ ID NO:102和103的CDR序列。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:154、155、156、157、158和159的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:160的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:161、162、163、164、165和166的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:112的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:113的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:114、115、116、117、118和119的序列(即，SEQ ID NO:110和111的CDR序列)的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:124的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:125的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130和131的序列(即，SEQ ID NO:120和121的CDR序列)的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:145的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:146的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，并且含有分别具有SEQ ID NO:147、148、149、150、151和152的序列(即，SEQ ID NO:140和142的CDR序列)的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的scFv包含与SEQ ID NO:9和10、18和19、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的可变区相差少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的轻链和重链可变区。
包含特异性结合TfR的抗体的说明性蛋白质
特异性结合TfR的示例性抗体包括SEQ ID NO:10、19、102、104、110、122、132或143的重链可变区和SEQ ID NO:9、18、103、105、111、123、133或144的轻链可变区。除非上下文另有说明，否则对特异性结合TfR的抗体的提及应被理解为是指小鼠、嵌合、贴面化、人源化和修饰形式中的任一种。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQID NO:9的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:18的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:102的重链可变区和SEQ ID NO:103的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:104的重链可变区和SEQ ID NO:105的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:110的重链可变区和SEQ ID NO:111的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:122的重链可变区和SEQ ID NO:123的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ IDNO:132的重链可变区和SEQ ID NO:133的轻链可变区。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:143的重链可变区和SEQ ID NO:144的轻链可变区。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:10的重链CH1和可变区以及包含SEQ ID NO:9的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:19的重链CH1和可变区以及包含SEQ ID NO:18的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:102的重链和含有SEQ ID NO:103的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:104的重链和含有SEQ ID NO:105的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:110的重链和含有SEQ ID NO:111的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:122的重链和含有SEQ ID NO:123的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:132的重链和含有SEQ ID NO:133的轻链。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含含有SEQ ID NO:143的重链和含有SEQ ID NO:144的轻链。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含SEQ ID NO:10和9、19和18、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16和17的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:21、22、23、24、25和26的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:114、115、116、117、118和119的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130和131的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:134、135、136、137、138和139的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:154、155、156、157、158和159的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含分别具有SEQ ID NO:161、162、163、164、165和166的序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含：含有与SEQ ID NO:10、19、102、104、110、122、132或143的VH和CH1区氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链；含有与SEQ ID NO:9、18、103、105、111、123、133或144的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链，并且含有分别为SEQ IDNO:10和9、19和18、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含：含有与SEQ ID NO:10至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的第一重链；含有与SEQ ID NO:11至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的第二重链；含有与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链，并且含有SEQ ID NO:10和9的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含：含有与SEQ ID NO:19至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链；含有与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链，并且含有SEQ ID NO:19和18的CDR序列。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含：含有与SEQ ID NO:108至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链；含有与SEQ ID NO:109的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链，并且含有SEQ ID NO:108和109的CDR序列(即，SEQ ID NO114-119)。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含：含有与SEQ ID NO:120至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链；含有与SEQ ID NO:121的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链，并且含有SEQ ID NO:120和121的CDR序列(即，SEQ ID NO126-131)。
特异性结合TfR的所述抗体中的任一者可具有一个或多个修饰以增加血清稳定性、调节效应子功能、影响糖基化、降低人体内的免疫原性、促进异二聚化和/或促进寡核苷酸的缀合。
特异性结合TfR的所述抗体中的任一者可具有包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列的Fc多肽：SEQ ID NO:27-34、79-90和92-98。Fc多肽可被修饰以增加血清稳定性、调节效应子功能、影响糖基化、降低人体内的免疫原性、促进异二聚化和/或促进寡核苷酸的缀合。
在一些实施方案中，特异性结合TfR的抗体包含与SEQ ID NO:9和10、18和19、102和103、104和105、110和111、122和123、132和133、或143和144的可变区相差少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的轻链和重链可变区。
附加的示例性抗TfR抗体抗原结合结构域包括但不限于：17H10抗TfR Fab或scFv；17H10.1抗TfRFab或scFv；JC-141抗TfR抗体；JC-141抗TfRFab；JC-141抗TfR scFv；具有JR-141抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2016208695)；JC-171抗TfR抗体；JC-171抗TfR Fab；JC-171抗TfR scFv；具有JR-171抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2018124121)；“脑穿梭物”(BS)抗TfR Fab；具有BS抗TfR Fab的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2018210898、WO2015101588和WO2014033074)；13E4v2ii抗TfR抗体；13E4v2ii抗TfR Fab；13E4v2ii抗TfR scFv；具有13E4v2ii抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2020132584)；TfR12抗TfR scFv；具有TfR12抗TfR scFv的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2021/205358)；TfR13抗TfR scFv；具有Tfr13抗TfR scFv的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗TfR抗体、Fab、scFab、Fv片段或scFv(WO2021/205358)(序列示于表1中)。
附加的抗TfR抗体描述于WO2021/205358中，并且本发明的抗TfR抗体抗原结合结构域可包括具有本文所述的TfR1、TfR2、TfR3、TfR4、TfR5、TfR6、TfR7、TfR8、TfR9、TfR10、TfR11、TfR12、TfR13、TfR14、TfR15、TfR16、TfR17、TfR18、TfR19、TfR20、TfR21、TfR22、TfR23、TfR24、TfR25、TfR26、TfR27、TfR28、TfR29、TfR30、TfR31、TfR32、TfR33、TfR34、TfR35、TfR36、TfR37和TfR38中任一者的CDR或可变区的任何抗体抗原结合结构域。
表1.包含抗体抗原结合结构域的示例性TfR-结合区。
附加的抗TfR抗体是本领域已知的和/或可从各种商业来源获得。在一些实施方案中，抗TfR抗体或抗TfR抗体的TfR结合片段结合TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，抗TfR抗体或抗TfR抗体的TfR结合片段与TfR的结合不抑制转铁蛋白与TfR的结合。示例性抗TfR抗体包括但不限于B3/25、RBC4、7579、E2.3、A27.15、D65.30、D2C、ch128.1Av、ch128.1/IgG3、ch128.1/IgG1、hu128.1(Candel aria等人Front.Immunol.12(2021年3月17日),2021)、Ri7、8D3(Weber等人Cell Reports 22:149-162,2018)。示例性抗TfR抗体也描述于以下美国专利公布中：US2018282408A1、US2020071413A1、US20210138083A1、US20190092870A1和US20130028891(其每一者以引用方式并入本文)。
示例性抗TfR vNAR描述于WO 2022/103769中。
含有抗TfR抗体抗原结合结构域的脑穿梭物描述于WO 2014/033074和WO 2015/101588(其各自以引用方式并入本文)中。
在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约1000nM(例如，约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约75nM、约100nM、约150nM、约200nM、约250nM、约300nM、约400nM、约500nM、约750nM或约1000nM)的亲和力结合TfR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约500nM的亲和力结合人TfR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约100nM(例如，约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM或约100nM)的亲和力结合TfR。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约1000nM(例如，约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约75nM、约100nM、约150nM、约200nM、约250nM、约300nM、约400nM、约500nM、约750nM或约1000nM)的亲和力结合人TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约500nM的亲和力结合人TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以约1nM至约100nM(例如，约1nM、约2nM、约5nM、约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM或约100nM)的亲和力结合人TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域以小于1nM的亲和力结合TfR或TfR的顶端结构域。
包含非靶向Fab片段的说明性蛋白质
在一些实施方案中，TfR结合剂包含非结合Fab或NBVR。
在一些实施方案中，非结合Fab或其部分包含非结合可变区(NBVR)。NBVR包含轻链可变区和重链可变区，并且不特异性结合受试者中天然存在的表位。在一些实施方案中，NBVR不特异性结合在给定哺乳动物、哺乳动物组织或哺乳动物细胞类型中表达的抗原。抗原可以是哺乳动物抗原或在哺乳动物中发现的抗原，诸如来自感染性生物体诸如病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原。哺乳动物可以是但不限于非人灵长类动物、人或啮齿类动物(例如，小鼠)。NBVR可以是但不限于scFv。
抗体与抗原的特异性结合意指至少106M-1的亲和力。特异性结合在量值上可检测地更高并且可与发生于至少一个不相关靶标的非特异性结合区分开。非特异性结合通常是范德华力的结果。非结合并不意味着NBVR不以任何亲和力结合任何抗原。相反，在一些实施方案中，NBVR不表现出特异性结合(a)哺乳动物细胞、哺乳动物组织或哺乳动物中的任何蛋白质或表位；(b)哺乳动物细胞或哺乳动物组织上的任何表面可及蛋白质或表位；或(c)哺乳动物组织或哺乳动物中的任何血清可及蛋白质或表位。
NBVR可以是scFv或Fab的一部分。Fab可含有或可不含有抗体铰链区的全部或部分。NBVR可通过重组DNA技术、通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离、或通过化学肽合成来产生。在一些实施方案中，NBVR是非结合Fab的一部分，其包含轻链和重链，其中该轻链包含VL区和轻链恒定区(CL)，该重链包含VH区和重链CH1恒定区。
示例性NBVR包括NBVR1或NBVR2。除非上下文另有说明，否则对NBVR1或NBVR2的提及应被理解为是指NBVR1或NBVR2的小鼠、嵌合、贴面化、人源化和修饰形式中的任一种。
示例性NTF包括NBVR1或NBVR2。除非上下文另有说明，否则对NBVR1或NBVR2的提及应被理解为是指NBVR1或NBVR2的小鼠、嵌合、贴面化、人源化和修饰形式中的任一种。
NBVR1的轻链和重链可变区的序列分别被指定为SEQ ID NO:35和36。NBVR1的轻链和重链序列分别被指定为SEQ ID NO:37和38。
在一些实施方案中，NBVR包含NBVR1的CDR序列。NBVR1的轻链的CDR(L1、L2和L3)分别被指定为SEQ ID NO:39、41和43。NBVR1的重链的CDR(H1、H2和H3)分别被指定为SEQ IDNO:45、47和49。在一些实施方案中，NBVR包含NBVR1的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列以及包含SEQ ID NO:50的CDR-H2序列。
在一些实施方案中，NBVR包含含有SEQ ID NO:37或52的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:38、53、54、55、56、57、58或59的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，NBVR包含含有与SEQ ID NO:35、37或51的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO:36、38、53、54、55、56、57、58或59的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链，并且含有NBVR1的CDR序列并保持NBVR1的非结合特性。
在一些实施方案中，NBVR包含与NBVR1轻链和重链可变区相差少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的轻链和重链可变区。还包括具有如任何常规定义(但优选地Kabat)所定义的与NBVR1或NBVR2的对应CDR 90％、95％、99％或100％相同的1、2、3、4、5或6个CDR的NBVR。
NBVR2的轻链和重链可变区的序列分别被指定为SEQ ID NO:53和60。NBVR2的轻链和重链序列分别被指定为SEQ ID NO:53和61。
在一些实施方案中，NBVR包含NBVR2的CDR序列。NBVR2的轻链的CDR(L1、L2和L3)分别被指定为SEQ ID NO:40、42和44。NBVR2的重链的CDR(H1、H2和H3)分别被指定为SEQ IDNO:46、48和49。在一些实施方案中，NBVR包含NBVR2的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列以及包含SEQ ID NO:50的CDR-H2序列。
在一些实施方案中，NBVR包含含有与SEQ ID NO:62、63或64的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO:60、61、65、66、67、68、69、70或71的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的重链，并且含有NBVR2的CDR序列并保持NBVR2的非结合特性。
在一些实施方案中，NBVR包含与NBVR2轻链和重链可变区相差少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的轻链和重链可变区。还包括具有如任何常规定义(但优选地Kabat)所定义的与NBVR1或NBVR2的对应CDR 90％、95％、99％或100％相同的1、2、3、4、5或6个CDR的NBVR。
在一些实施方案中，NBVR包含具有一些或所有(例如，3、4、5和6个)完全或基本上来自NBVR1或NBVR2的CDR的轻链和重链可变区。此类NBVR可包括重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区具有至少两个、并且通常所有三个完全或基本上来自NBVR1或NBVR2的重链可变区的CDR，该轻链可变区具有至少两个、并且通常所有三个完全或基本上来自NBVR1或NBVR2的轻链可变区的CDR。当CDR含有不超过4、3、2或1个取代、插入或缺失时，其基本上来自对应的NBVR1或NBVR2 CDR，除了CDR-H2(当由Kabat定义时)可具有不超过6、5、4、3、2或1个取代、插入或缺失。此类抗体可与所述NBVR1或NBVR2轻链和重链氨基酸序列中的任一者具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性并保持其功能特性，和/或与NBVR1或NBVR2不同。在一些实施方案中，NBVR不表现出特异性结合(a)哺乳动物细胞、哺乳动物组织或哺乳动物中天然存在的任何蛋白质或表位；(b)天然存在的哺乳动物细胞或哺乳动物组织上的任何表面可及蛋白质或表位；或(c)天然存在的哺乳动物组织或哺乳动物中的任何血清可及蛋白质或表位。
在一些实施方案中，编码NBVR轻链的核酸包含编码SEQ ID NO:35、37、52、62、63或64的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码NBVR重链的核酸包含编码SEQ IDNO:36、38、53、54、55、56、57、58、59、60、61、65、66、67、68、69、70或71的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码NBVR轻链的核酸包含与SEQ ID NO:72或73的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码NBVR重链的核酸包含与SEQ ID NO:74或75的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％同一性的核苷酸序列。
描述了含有编码所述NBVR中的任一种的重链和轻链的核酸的细胞。在一些实施方案中，该细胞含有编码包含SEQ ID NO:35、37或52的氨基酸序列的NBVR轻链的核酸，以及编码包含SEQ ID NO:36、38、53、54、55、56、57、58或59的氨基酸序列的NBVR重链的核酸。在一些实施方案中，该细胞含有编码包含SEQ ID NO:62、63或64的氨基酸序列的NBVR轻链的核酸，以及编码包含SEQ ID NO:60、61、65、66、67、68、69、70或71的氨基酸序列的NBVR重链的核酸。该细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，非结合Fab是RSV(帕利珠单抗)Fab片段(轻链包含SEQ ID NO:101)，其在小鼠和非人灵长类动物中是非靶向的。
抗TfR抗体，其中一个Fab臂被移除或被非结合Fab或NBVR替换。
人源化抗体抗原结合结构域
所述抗TfR抗体抗原结合结构域、非结合Fab、NBVR或本文所述的抗体中的任一种可以是人源化的。人源化抗体抗原结合结构域可在以下一者或多者中被人源化：轻链可变结构域、重链可变结构域、轻链恒定结构域和重链恒定(CH1)结构域。人源化抗体抗原结合结构域是基因工程化抗体抗原结合结构域，其中来自非人“供体”抗体的CDR被移植到人“受体”抗体重链和/或轻链可变区、轻链恒定区和/或重链CH1区序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；以及Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体序列(例如，来自以下一者或多者的序列：CH1区、CH2区、CH3区、重链可变区、轻链恒定区或轻链可变区)、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。因此，人源化抗体抗原结合结构域为具有至少三个、四个、五个或所有完全或基本上来自供体抗体和完全或基本上来自人抗体可变区框架序列和/或恒定区序列的CDR的抗体抗原结合结构域。类似地，人源化重链具有至少一个、两个和通常所有三个完全或基本上来自供体抗体重链的CDR，以及如果存在，基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区序列。类似地，人源化轻链具有至少一个、两个和通常所有三个完全或基本上来自供体抗体轻链的CDR，以及如果存在，基本上来自人轻链可变区框架和恒定区的轻链可变区框架序列和轻链恒定区序列。当相应的CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如任何常规定义所定义，但优选地由Kabat定义)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的对应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat定义的对应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。
在一些实施方案中，Fab是嵌合Fab。嵌合Fab包含非人轻链和/或重链可变区和人重链(CH1)和/或轻链恒定区。
在一些实施方案中，Fab是贴面化Fab。贴面化Fab包含部分人源化的轻链和/或重链可变区以及人重链(CH1)和/或轻链恒定区。
VII.Fc多肽或Fc二聚体
在一些实施方案中，TfR结合剂包含Fc多肽或Fc二聚体。Fc多肽或Fc二聚体可包含一个或多个突变或取代以增加血清稳定性、调节效应子功能、影响糖基化、降低人体内的免疫原性、促进异二聚化(例如，杵和臼突变)和/或促进寡核苷酸的缀合。
在一些实施方案中，如本文所述的Fc多肽与对应的野生型Fc多肽(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
Fc多肽中的一者或两者可各自包含独立选择的修饰(例如，突变)，或者Fc多肽中的一者或两者可以是野生型Fc多肽，例如人IgG1 Fc多肽。在一些实施方案中，如本文所述的Fc多肽与对应的野生型Fc多肽(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。可引入到一种或两种Fc多肽中的突变的非限制性实例包括某些突变，例如以提供多肽的杵和臼异二聚化、调节效应子功能、延长血清半衰期、影响糖基化和/或降低人体内的免疫原性。
用于异二聚化的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，Fc二聚体的Fc多肽包括促进异二聚体形成和阻碍同二聚体形成的突变。这些修饰是有用的，例如，当期望二聚体中只有一种Fc多肽具有TfR结合位点(即单价TfR结合剂)时。
在一些实施方案中，存在于Fc二聚体中的多肽可包括杵和臼突变以促进异二聚体形成。通常，该方法包括在一种多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在另一多肽的界面中引入对应的空穴(“臼”)。突起通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建。与突起大小相同或相似的补偿性空穴通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链而在第二多肽的界面中产生。
杵臼方法通常包括在一种Fc多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在另一Fc多肽的界面中引入对应的空穴(“臼”)，使得突起可被定位在空穴中以促进异二聚体形成并因此阻碍同二聚体形成。突起通过用较大的侧链(例如，Tyr或Trp)替换来自一种Fc多肽的界面的小氨基酸侧链来构建。与突起大小相同或相似的补偿性空穴通过用较小的氨基酸侧链(例如，Ala或Thr)替换大的氨基酸侧链而在另一Fc多肽的界面中产生。在一些实施方案中，此类附加的突变位于Fc多肽中对多肽与TfR的结合不具有负面影响的位置。
在用于二聚化的杵和臼方法的一个说明性实施方案中，Fc多肽中的一者的位置366包含Trp代替天然Thr。二聚体中的另一Fc多肽在位置407具有Val代替天然Tyr。另一Fc多肽还可包含这样的取代，其中位置366处的天然Thr被Ser取代，并且位置368处的天然Leu被Ala取代。因此，Fc多肽中的一者具有T366W杵突变，并且另一Fc多肽具有Y407V臼突变，其通常伴随T366S和L368A臼突变。如上所述，所有位置均按照EU编号进行编号。在某些实施方案中，第一Fc多肽包含根据EU编号的T366S、L368A和Y407V取代，并且第二Fc多肽进一步包含根据EU编号的T366W取代。
在一些实施方案中，存在于Fc多肽二聚体中的一种或两种Fc多肽还可被工程化以含有用于异二聚化的其他修饰，例如，在CH3-CH3界面内天然带电的接触残基的静电工程化或疏水贴片修饰。
用于调节效应子功能的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的一种或两种Fc多肽可包含降低效应子功能的修饰，即，在与介导效应子功能的效应细胞上表达的Fc受体结合时诱导某些生物功能的能力降低。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。抗体效应功能的实例包括但不限于C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调，以及B细胞活化。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的一种或两种Fc多肽可包含降低或消除效应子功能的修饰。降低效应子功能的说明性Fc多肽突变包括但不限于CH2结构域中例如根据EU编号方案在位置234和235处和/或在位置329处的取代。例如，在一些实施方案中，两种Fc多肽包含在位置234和235处的Ala残基(本文也称为“LALA”)。在一些实施方案中，两种Fc多肽包含在位置329处的Gly残基(本文也称为“P329G”或“PG”)或在位置329处的Ser残基(本文也称为“P329S”或“PS”)。在一些实施方案中，两种Fc多肽包含在位置234和235处的Ala残基和在位置329处的Gly残基(本文也称为“LALA PG”)。在一些实施方案中，两种Fc多肽包含在位置234和235处的Ala残基和在位置329处的Ser残基(本文也称为“LALAPS”)。
调节效应子功能的附加Fc多肽突变包括但不限于以下：位置329可具有突变，其中Pro被Gly、Ala、Ser、或Arg或足够大以破坏在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的Trp残基Trp87和Trp110之间形成的Fc/Fcγ受体界面的氨基酸残基取代。附加的说明性取代包括根据EU编号方案的S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。也可存在多个取代，例如，根据EU编号方案，人IgG1的L234A、L235A和P329G；人IgG4的S228P和L235E；人IgG1的L234A和G237A；人IgG1的L234A、L235A和G237A；人IgG2的V234A和G237A；人IgG4的L235A、G237A和E318A；以及人IgG4的S228P和L236E。
用于延长血清半衰期的Fc多肽修饰
在一些实施方案中，可将增强血清半衰期的修饰引入本文所述的任何Fc多肽中。例如，在一些实施方案中，Fc多肽二聚体中的两种Fc多肽可包含根据EU编号方案编号的M428L和N434S取代(也称为LS取代)。另选地，Fc多肽二聚体中的两种Fc多肽可具有N434S或N434A取代。另选地，Fc多肽二聚体中的两种Fc多肽可具有M428L取代。在其他实施方案中，Fc多肽二聚体中的两种Fc多肽可包含M252Y、S254T和T256E取代。
去除C末端赖氨酸残基的Fc多肽
在一些实施方案中，Fc多肽中的一者或两者可除去其C末端赖氨酸(例如，根据EU编号，Fc多肽的位置447处的Lys残基)。C末端赖氨酸残基跨许多物种在免疫球蛋白中是高度保守的，并且可在蛋白质产生期间通过细胞机制完全或部分去除。在一些实施方案中，Fc多肽中C末端赖氨酸的去除可改善蛋白质的稳定性。
示例性Fc多肽提供于SEQ ID NO:76-100中。
用于经由连接基团缀合的工程化抗TfR抗体变体
如本文所述，TfR结合抗体(或其他TfR结合剂—例如，单价抗TfR抗体、抗TfR/非结合Fab双特异性抗体或抗TfR/NBVR双特异性抗体—如本文所述)可通过连接基团“L”连接到寡核苷酸。在一个方面，抗体包含一个或多个氨基酸残基(例如，存在于抗体中的可及位点处的氨基酸残基)，其可用于将抗体附接到L。例如，在一个方面，抗体包含一个或多个半胱氨酸残基(例如，存在于抗体中的可及位点处的半胱氨酸残基)。在某些实施方案中，抗体通过抗体的半胱氨酸残基(例如，通过半胱氨酸残基的硫原子)附接到L。在一些实施方案中，半胱氨酸是半胱氨酸修饰，其中存在于抗体中的可及位点处的除半胱氨酸以外的氨基酸残基被修饰成半胱氨酸。在其他实施方案中，抗体包含一个或多个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，抗体通过谷氨酰胺残基(例如，通过谷氨酰胺残基侧链中的酰胺键)附接到L。
在其他方面，可能期望产生具有一个或多个修饰位点的工程化抗体。这些修饰位点可用于促进TfR结合剂与每个L的附接。例如，TfR结合剂可在修饰位点处附接到每个L。在其他实施方案中，修饰位点可使得L能够附接到位于修饰位点附近(例如，在修饰位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内，诸如在修饰位点的2或3个氨基酸内)的氨基酸残基。在具体实施方案中，此类修饰位点是发生在抗体的可及位点处的取代残基。在某些实施方案中，本文所述的抗TfR抗体(例如，单价抗TfR抗体、抗TfR/非结合Fab双特异性抗体或抗TfR/NBVR双特异性抗体)包含一个或多个修饰位点(例如，一个或多个氨基酸取代，诸如半胱氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代)。在某些实施方案中，抗体包含至少或恰好1、2、3、4、5、6、7或8个修饰位点。在某些实施方案中，抗体包含1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个修饰位点。在某些实施方案中，抗体包含2至4个修饰位点。
在某些实施方案中，抗体内的修饰位点是氨基酸取代或插入。在某些实施方案中，抗体包含Fc二聚体(或者是Fc二聚体的蛋白质)。在某些实施方案中，Fc多肽可以是Fab-Fc融合体或Fab-Fc二聚体融合体的一部分，并且修饰位点可在结合TfR的Fab-Fc多肽中和/或在已与结合TfR的Fab-Fc多肽形成二聚体的Fab-Fc多肽中。
在某些实施方案中，修饰位点存在于CL结构域中。在某些实施方案中，修饰位点存在于CH1结构域中。在某些实施方案中，修饰位点存在于CH2结构域中。在某些实施方案中，修饰位点存在于CH3结构域中。
在某些实施方案中，修饰位点是氨基酸取代。在某些实施方案中，修饰位点是半胱氨酸、甘氨酸或丙氨酸取代。
在某些实施方案中，修饰位点是半胱氨酸取代。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可及位点处，并可用于经由连接基团(L)将抗体缀合至寡核苷酸，以产生如本文所述的缀合物。在某些实施方案中，抗体含有Fc多肽或Fc多肽二聚体并且包括选自由S239C、S442C、A330C和T289C组成的组的半胱氨酸取代，其中位置和取代根据EU编号。在其他实施方案中，Fc多肽接合到CH1结构域并包含A114C取代。在其他实施方案中，抗体包含Fab-Fc融合体，并且轻链包含K149C取代。
在其他方面，修饰位点是丙氨酸或甘氨酸取代。此类经修饰的氨基酸可促进L在附近氨基酸(诸如谷氨酰胺残基)处与抗体的酶促缀合(例如，使用细菌转谷氨酰胺酶(BTG))。例如，在某些实施方案中，丙氨酸/甘氨酸取代是N297A或N297G，其中位置和取代根据EU编号。这些取代消除了位置297处的糖基化，糖基化将阻碍接头在位置Q295处与抗体的酶促缀合(即，接头通过谷氨酰胺侧链中的酰胺键附接到抗体)。因此，在某些实施方案中，修饰位点是N297A或N297G，并且抗体在Q295处附接到L(例如，通过酶促缀合)。
在某些实施方案中，Fc多肽的N末端包括铰链区的一部分(例如，DKTHTCP(SEQ IDNO:4)或DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5))。
在一些实施方案中，TfR-结合剂寡核苷酸缀合物包含Fc多肽或Fc二聚体。Fc二聚体包含第一Fc多肽和第二Fc多肽。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含一个或多个氨基酸取代(例如，1个或多个半胱氨酸取代)。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含选自由以下项组成的组的一个或多个取代：重链中的S239C、S442C、A330C、T289C、N297A和N297G(根据EU编号)，轻链中的K149C(根据EU编号)，以及重链中A114C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含S239C。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含S442C。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含A330C。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含T289C。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含N297A。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含N297G。在某些实施方案中，Fc多肽或第一Fc多肽包含S239C和A330C。
在某些实施方案中，(Fc二聚体的)第二Fc多肽包含一个或多个氨基取代(例如，1个或更多个半胱氨酸取代)。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含选自由以下项组成的组的一个或多个取代：重链中的S239C、S442C、A330C、T289C、N297A和N297G(根据EU编号)，轻链中的K149C(根据EU编号)，以及重链中A114C(根据Kabat编号)。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含S239C。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含S442C。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含A330C。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含T289C。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含N297A。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含N297G。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含S239C和A330C。在某些实施方案中，第二Fc多肽包含A114C。
在某些实施方案中，Fc多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的序列。
在某些实施方案中，Fc二聚体的第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含一个或多个氨基酸取代(例如，1个或多个半胱氨酸取代)。在某些实施方案中，该一个或多个取代是：根据EU编号的S239C、S442C、A330C、T289C、N297A和/或N297G，以及/或者根据Kabat编号的A114C。在某些实施方案中，该一个或多个取代是：S239C、S442C、A330C、A114C和/或T289C。在某些实施方案中，该一个或多个取代是：S239C、S442C、A114C和/或T289C。在某些实施方案中，该一个或多个取代是：N297A和/或N297G。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含促进寡核苷酸的缀合的一个氨基酸取代(例如，1个半胱氨酸取代)。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含在S239C处的半胱氨酸取代。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含两个氨基酸取代(例如，2个半胱氨酸取代)。在某些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自包含在S239C和A330C处的半胱氨酸取代。
包含一个或多个修饰位点(例如，半胱氨酸取代)的Fc多肽或其二聚体可用于如本文所述的缀合物中。
在一些实施方案中，抗TfR抗体抗原结合结构域包含Fab或scFab，其该中Fab或scFab包含在轻链上的K149C取代(根据EU编号)或在重链上的A114C取代(根据Kabat编号)。
在某些实施方案中，1个或多个寡核苷酸附接到连接基团(L)。在某些实施方案中，2个或多个寡核苷酸附接到连接基团(L)。在某些实施方案中，1个寡核苷酸附接到连接基团(L)。在某些实施方案中，2个寡核苷酸附接到连接基团(L)。
VIII.白蛋白
对于包含白蛋白的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，白蛋白可以是人白蛋白或来自另一种哺乳动物物种的白蛋白，诸如但不限于小鼠白蛋白或非人灵长类动物白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人白蛋白(SEQ ID NO:167；UNIPROT登录号P0276，GenBank：AAA98797.1，NCBANP_000468.1，基因ID：213，mRNANM_000477.7)。寡核苷酸可连接到白蛋白，任选地经由连接基团连接到白蛋白中表面可及的游离半胱氨酸(例如，小鼠前白蛋白原的C58(SEQ ID NO:167和168的位置34(方框)))。白蛋白可被修饰以含有一个或多个氨基酸取代，诸如半胱氨酸取代，以促进与寡核苷酸的缀合。
在一些实施方案中，TfR结合剂-寡核苷酸缀合物包含与白蛋白融合的抗TfRscFv。与白蛋白融合的抗TfR scFv可作为单多肽链融合蛋白提供。抗TfR scFv可与白蛋白的氨基或羧基末端融合。在一些实施方案中，抗TfR scFv与白蛋白的氨基末端融合。融合部分可含有scFc与白蛋白之间的连接肽。连接肽可以是但不限于GGGS(甘氨酸)3-丝氨酸)肽。示例性抗TfR scFv-白蛋白融合蛋白在SEQ ID NO:169和170中提供，其含有分别与小鼠和人白蛋白融合的17H10抗TfR scFv。抗TfR scFv-白蛋白融合蛋白还可含有促进纯化的肽，诸如表位标签或多组氨酸标签(例如，His6)。表位标签或多组氨酸可位于融合蛋白的氨基末端或羧基末端处。
表2.
IX.核酸、载体和宿主细胞
本文所述的TfR结合剂可使用重组方法制备。因此，包含编码本文所述的TfR结合剂中的任一者或其部分的序列的分离的核酸可使用本领域可用的方法容易地产生。核酸被引入其中并且可用于复制编码多肽的核酸和/或表达多肽的宿主细胞也是本领域可用的。宿主细胞可以是但不限于原核细胞或真核细胞。真核细胞是但不限于酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，人细胞)。
编码TfR结合剂或其部分的核酸可以是DNA、RNA、cDNA、mRNA、单链、双链、线性或环状的。
TfR结合剂可包含两种或更多种(例如，三种)多肽，每种多肽可由单独的核酸序列编码。分离的核酸序列可存在于相同的质粒或载体、或不同的质粒或载体上。如果存在于相同的质粒或载体上，分离的核酸序列可从单个启动子或不同的启动子表达。从单个启动子表达编码单独多肽的核酸的方法是本领域已知的，包括但不限于使用2A元件和内部核糖体进入位点。
可在质粒或载体中提供编码TfR结合剂或其部分的核酸。质粒或载体可用于复制核酸或促进核酸的表达。质粒或载体可以是但不限于病毒载体、噬菌粒、酵母染色体载体或非附加型哺乳动物载体。
在一些实施方案中，编码TfR结合剂或其部分的核酸与表达构建体中的一个或多个调节序列可操作地连接。表达构建体可适于在产生双转运体的系统中表达多肽。此类系统可以是但不限于哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母细胞表达系统或细菌细胞表达系统。
用于产生重组多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞诸如大肠杆菌中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pETC衍生的质粒。pcDNAI/amp、pcDNAEneo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。另选地，病毒的衍生物诸如牛乳头瘤病毒(BPV-l)或爱泼斯坦-巴尔病毒(pREP衍生的pHEBo和p205)可用于多肽在真核细胞中的瞬时表达。在一些实施方案中，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(诸如pVLl392、pVLl393和pVL94l)、pAcUW衍生的载体(诸如pAcUWl)和pBlueBac衍生的载体。附加的表达系统包括腺病毒、腺相关病毒和其他病毒表达系统。
用于表达TfR结合剂或其部分的表达载体、或含有核酸的质粒或载体可被转化、转染或转导到宿主细胞中。宿主细胞可以是但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、原核细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO细胞、YO细胞、HEK293细胞、COS细胞、Vero细胞或HeLa细胞。含有表达载体的宿主细胞可在合适的条件下培养以允许TfR结合剂或其部分的表达。
可通过培养包含一种或多种编码TfR结合剂的核酸的宿主细胞、表达TfR结合剂并从培养物中分离表达的TfR结合剂来制备TfR结合剂。
X.使用方法
本文所述的缀合物可用于多种目的，包括治疗适应症。
在一些实施方案中，缀合物用于将寡核苷酸(例如，ASO或RNAi剂)递送至表达转铁蛋白受体的靶细胞类型。在一些实施方案中，缀合物可用于转运寡核苷酸(例如，ASO或RNAi剂)穿过内皮(例如，血脑屏障)以被脑吸收。
例如，某些实施方案提供了用于寡核苷酸(例如，ASO或RNAi剂)跨内皮的转胞吞作用的方法，该方法包括使内皮(例如，血脑屏障(BBB))与如本文所述的缀合物接触。因此，某些实施方案提供了转运寡核苷酸穿过有需要的受试者的BBB的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的缀合物。在某些实施方案中，提供了在转运寡核苷酸穿过有需要的受试者的BBB中使用的如本文所述的缀合物。在某些实施方案中，提供了在将寡核苷酸转运至有需要的受试者的肌细胞中使用的如本文所述的缀合物。
某些实施方案还提供了在有需要的受试者中调节靶基因或序列表达的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的缀合物。在一些实施方案中，提供了在调节靶基因表达中使用的如本文所述的缀合物。
在某些实施方案中，靶基因或序列在受试者脑中的细胞中表达。在某些实施方案中，靶基因或序列在表达TfR的细胞中表达。在某些实施方案中，靶基因或序列在肌细胞诸如骨骼肌细胞或心肌细胞中表达。
在某些实施方案中，靶基因表达的调节是基因敲低或基因敲除。因此，在某些实施方案中，与对照(例如，未施用缀合物的受试者)中的表达相比，靶基因或序列的表达被抑制或降低例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
将如本文所述的缀合物以治疗有效量或剂量施用于受试者。然而，剂量可根据几个因素而变化，包括所选择的施用途径、组合物的制剂、患者反应、病况的严重程度、受试者的体重和处方医师的判断。剂量可以根据个体患者的需要随时间增加或减少。
在各种实施方案中，如本文所述的缀合物胃肠外施用。在一些实施方案中，缀合物静脉内施用。静脉内施用可通过输注进行，例如，在约10至约30分钟的时段内，或在至少1小时、2小时或3小时的时段内。在一些实施方案中，缀合物以静脉内推注施用。也可以使用输注和推注施用的组合。
在一些肠胃外实施方案中，缀合物经腹膜内、皮下、皮内或肌内施用。在一些实施方案中，缀合物经皮内或肌内施用。在一些实施方案中，缀合物经鞘内施用，诸如通过硬膜外施用，或经脑室内施用。
在其他实施方案中，如本文所述的缀合物可口服施用、通过肺部施用、鼻内施用、眼内施用或通过局部施用。也可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及具有雾化剂的制剂。
XI.药物组合物和试剂盒
在另一方面，提供了包含如本文所述的缀合物的药物组合物和试剂盒。
药物组合物
制备用于如本文所述使用的制剂的指导可在本领域技术人员已知的许多药物制备和制剂手册中找到。
在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的缀合物并且还包含一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂。在某些实施方案中，组合物包含多种如本文所述的缀合物，它们可以是相同的或不同的(例如，不同缀合物的混合物)。在某些实施方案中，组合物中寡核苷酸与蛋白质的比率为约1:1至约4:1。在某些实施方案中，组合物中寡核苷酸与蛋白质的比率为约1:1至约2:1。在某些实施方案中，组合物中寡核苷酸与蛋白质的比率为约1.23。在某些实施方案中，组合物中寡核苷酸与蛋白质的比率为约2:1至约3:1。在某些实施方案中，组合物中寡核苷酸与蛋白质的比率为约2.5。
如本文所用，术语药学上可接受的载剂包括生理学上相容的并且优选地不干扰或以其他方式抑制活性剂的活性的任何溶剂、分散介质或包衣。各种药学上可接受的赋形剂是众所周知的。在一些实施方案中，载剂适于静脉内、鞘内、脑室内、肌内、口服、腹膜内、透皮、局部或皮下施用。药学上可接受的载剂可含有一种或多种生理学上可接受的化合物，其作用是例如稳定组合物或增加或减少缀合物的吸收。生理学上可接受的化合物可包括，例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；减少活性剂清除或水解的组合物；或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。其他药学上可接受的载剂及其制剂也是本领域可用的。
本文所述的药物组合物可以本领域技术人员已知的方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、乳化、包封、包埋或冻干工艺。以下方法和赋形剂仅是示例性的并且决不是限制性的。
对于口服施用，如本文所述的缀合物可通过将其与本领域众所周知的药学上可接受的载剂组合来配制。此类载剂使得化合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、乳剂、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于待治疗的患者口服摄入。用于口服使用的药物制备剂可通过将缀合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在添加合适的助剂后加工颗粒的混合物以获得片剂或糖衣丸芯来获得。合适的赋形剂包括，例如，填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐诸如藻酸钠。
如上所公开的，如本文所述的缀合物可被配制用于通过注射(例如，通过推注注射或连续输注)进行肠胃外施用。对于注射，缀合物可通过如下方式被配制成制备剂：将它们溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其他类似油、合成的脂族酸甘油酯、高级脂族酸的酯或丙二醇)中；并且如果需要，与常规添加剂诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起使用。在一些实施方案中，缀合物可被配制在水溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，并添加防腐剂。组合物可采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
通常，用于体内施用的药物组合物是无菌的。灭菌可根据本领域已知的方法完成，例如热灭菌、蒸汽灭菌、无菌过滤或辐射。
如本文所述的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可根据所设想的具体用途而变化。适当剂量或施用途径的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。合适的剂量也在上文描述。
试剂盒
在一些实施方案中，提供了包括如本文所述的缀合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒用于调节靶基因或序列(例如，在脑或中枢神经系统(CNS)中表达的靶基因)的表达。在一些实施方案中，试剂盒用于调节靶基因的表达。
在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种附加的治疗剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括如本文所述的缀合物并且还包含一种或多种附加的治疗剂。在一些实施方案中，试剂盒还包括含有用于实施本文所述的方法的指导(即方案)的说明材料(例如，使用试剂盒穿过血脑屏障施用组合物的说明)。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们并不限于此。这里考虑了能够存储此类说明并将它们传送给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带(cartridge)、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)等等。这样的介质可包括提供这样的说明材料的互联网站的网址。
表3.非正式序列列表
实施例
将通过具体实施例进一步详细描述主题。提供以下实施例仅用于说明目的，并不意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可被改变或修改以产生基本上相同结果的各种非关键参数。已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但可能存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。
实施例1：单Fab和二价抗体缀合物
对于单Fab和二价抗体，将重链载体与对应的轻链载体以1:1:2的杵:臼:轻链比率共转染到Expi293细胞中。通过将上清液加载到蛋白A柱上从条件培养基中纯化表达的蛋白质。将柱用10倍柱体积的PBS(pH 7.4)洗涤。用50mM柠檬酸钠(pH 3.0，含150mM NaCl)洗脱蛋白质，并立即用200mM精氨酸、137mM琥珀酸(pH 5.0)中和。使用200mM精氨酸、137mM琥珀酸(pH 5.0)作为运行缓冲液，通过尺寸排阻色谱法(SEC)(GE Superdex200)进一步纯化蛋白质。纯化的蛋白质通过完整质量LC/MS确认，并且通过SDS-PAGE和分析型HPLC-SEC确认纯度>95％。经由biacore测试了与人和食蟹猴TfR顶端结构域的结合。
表4.
分子 HC1 HC2 LC1 LC2
TfR-单Fab SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:101
TfR-单Fab 2 SEQ ID NO:173 SEQ ID NO:174 SEQ ID NO:18 N/A
二价抗TfR抗体 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:9
以上生成的单Fab和二价抗体含有用于缀合的半胱氨酸修饰，并且首先使用还原试剂(例如，TCEP)还原。还原后，去除剩余的还原剂(通过例如透析纯化)并用氧化剂(例如，dHAA)再氧化抗体。还生成了包含连接基团的ASO，随后是还原和氧化步骤。然后将还原和氧化的接头-ASO与单Fab和二价抗体上的游离半胱氨酸缀合。纯化所得缀合物以去除不需要的和未缀合的产物，并通过LC/MS和SEC确定纯度。
本文所用的靶向MALAT1的示例性ASO序列是：
5′-Gks mCksAksTdsTds mCdsTdsAdsAdsTdsAdsGds mCdsAksGks mCk-3′(SEQ ID NO:8；小鼠MALAT1)。缩写是指如下组分：d：DNA；k：LNA；mC：5-甲基胞苷(甲基化胞嘧啶)；s：硫代磷酸酯主链(PS)。将ASO用5′C6胺修饰。靶向MALAT1的另一个示例性ASO序列是SEQ ID NO:172(食蟹猴MALAT1)
本文所用的示例性连接基团如下所示，其中该连接基团附接到单Fab或二价抗体内的半胱氨酸残基的硫原子，并且通过与ASO的5′末端残基缔合的磷酸酯附接到ASO：
实施例2：使用TfR单Fab缀合物的体内药代动力学和Malat1敲除。
将以上制备的单价TfR Fab缀合物(“TfR单Fab”)在施用前在无菌盐水中稀释。作为对照，包括盐水、未缀合的ASO和RSV-ASO组。
在单剂量研究中，根据下表4中的组(n＝4)，对2月龄TfRms/hu雌性小鼠静脉内施用剂量。单次给药后24小时收集组织。特别地，收获脑、脊髓和外周器官(肾、肺、肝和四头肌)。单次给药后24小时也收集末梢血。
在多剂量研究中，根据表5中的组(n＝6)，在第1天、第7天和第14天对2月龄TfRms/hu雌性小鼠静脉内施用剂量。在30分钟、4小时、24小时、48小时、72小时和1周采集血浆。最后一次给药后72小时收集组织。特别地，收获脑、脊髓和外周器官(肾、肺、肝和四头肌)。最后一次给药后72小时也收集末梢血。
表5
组 详述 剂量(mg/kg)
1 阴性对照：盐水
2 阴性对照：裸ASO(未缀合的ASO) 1
3 阴性对照：RSV-ASO 25
8 单Fab 25
根据下述方法测量完整药物和总ASO。
huIgG测定
使用通用电化学发光免疫测定(ECLIA)测量小鼠血浆和组织裂解物中人源化抗体的定量。简而言之，在MSD GOLD 96孔链霉亲和素包被的微量滴定板(Meso ScaleDiscovery,Rockville,MD)的孔中，将在测定稀释液中制备的工作浓度的生物素化山羊抗人IgG多克隆一抗(Southern Biotech,Birmingham,AL)温育约1小时。在该温育和板洗涤步骤之后，将制备的测试样品(进行样品预稀释，适当时)和相关标准物添加到测定板中并允许温育约1小时。在测试样品温育和板洗涤步骤之后，将在测定稀释液中工作浓度的钌化(SULFO-TAG)山羊抗人IgG二抗(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)添加到测定板中并温育约1小时。板洗涤后，然后添加1x MSD读取缓冲液T(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)以生成电化学发光(ECL)测定信号，然后以ECL单位(ECLU)表示。所有测定反应步骤在环境温度下在板振荡器(适当时)上振荡进行；并且所有测试样品在测定板中分析之前以1:20的测定MRD进行预稀释。随后通过反向计算测定校准(CS)曲线将测定中生成的样品ECLU信号处理成浓度。将测定CS曲线用加权四参数非线性逻辑回归拟合，用于计算未知/测试样品的浓度。
完整药物测定
使用基于杂交的电化学发光免疫测定(ECLIA)测量小鼠血浆和组织裂解物中完整药物(与反义寡核苷酸(ASO)缀合的抗TfR抗体)的定量。简而言之，将定制的生物素化反义探针(由Integrated DNA Technologies,Coralville,IA合成)以工作浓度与制备的测试样品(进行样品预稀释，适当时)和相关标准物在TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris-HCL)中温育，并在适当的温度下杂交45分钟。温育后，将杂交产物添加到MSD GOLD 96孔链霉亲和素包被的微量滴定板(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)的孔中并温育约30分钟。在杂交产物温育和板洗涤步骤之后，将在测定稀释液中工作浓度的钌标记的(SULFO-TAG)山羊抗人IgG二抗(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)添加到测定板中并温育约1小时。板洗涤后，然后添加1x MSD读取缓冲液T(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)以生成电化学发光(ECL)测定信号，然后以ECL单位(ECLU)表示。所有测定反应步骤在环境温度下在板振荡器(适当时)上振荡进行；并且所有测试样品在测定板中分析之前以1:20的测定MRD进行预稀释。随后通过反向计算测定校准(CS)曲线将测定中生成的样品ECLU信号处理成浓度。将测定CS曲线用加权四参数非线性逻辑回归拟合，用于计算未知/测试样品的浓度。
总ASO测定
使用基于杂交的电化学发光免疫测定(ECLIA)测量小鼠血浆和组织匀浆中总ASO(以缀合和游离形式)的定量。简而言之，将定制的生物素化和地高辛配基缀合的反义探针(由Integrated DNATechnologies,Coralville,IA合成)以工作浓度与制备的测试样品(适当时，进行样品预稀释)和相关标准物在TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris-HCL)中合并。将在TE缓冲液中制备的样品以1:1混合添加到含有工作浓度的重组蛋白酶K酶(ThermoFisher,Waltham,MA)的1x SSC缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中。然后将杂交/酶混合物在热循环仪中消化、变性、退火并冷却。杂交产物温育后，将样品添加到MSDGOLD 96孔链霉亲和素包被的微量滴定板(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)的孔中并孵育约30分钟。在温育和板洗涤步骤之后，将在测定稀释夜中工作浓度的钌标记的(SULFO-TAG)绵羊抗地高辛配基抗体(Novus Biologicals,Littleton,CO)添加到板中并温育约30分钟。板洗涤后，然后添加1x MSD读取缓冲液T(Meso Scale Discovery,Rockville,MD)以生成电化学发光(ECL)测定信号，然后以ECL单位(ECLU)表示。所有测定反应步骤在环境温度下在板振荡器(适当时)上振荡进行；并且所有测试样品在测定板中分析之前以1:20的测定MRD进行预稀释。随后通过反向计算测定校准(CS)曲线将测定中生成的样品ECLU信号处理成浓度。将测定CS曲线用加权四参数非线性逻辑回归拟合，用于计算未知/测试样品的浓度。
Malat 1表达分析
如下测量脑、脊髓、肝、心脏、四头肌、隔膜和坐骨神经中的Malat1表达。在Trizol中用珠匀浆器匀浆<50mg的组织块，用于大量RNA分离。将匀化的组织用氯仿温育3-5分钟以允许离心后的相分离。然后将水相用异丙醇温育10分钟以允许RNA沉淀，随后用75％乙醇洗涤并重悬于无核酸酶的水中。然后使用Express One-Step Superscript试剂盒通过qPCR测量Malat1的表达，并归一化为管家基因Gapdh的表达。
结果示于图1至图5中。与裸ASO和RSV-ASO对照相比，用TfR单Fab缀合物观察到完整药物和总ASO向CNS的递送增加(图1和图2)。与对照相比，在单剂量和多剂量研究两者中也观察到CNS中Malat1敲低的增加(图2)。在外周组织中也观察到Malat1敲低(图5)。在单剂量研究中，给药后24小时，肝是ASO的汇集处(图3)。在多剂量研究中，在最后一次给药后72小时观察到ASO在肝脏和肾脏中的累积(图4)。
实施例3：使用抗TfR二价抗体缀合物的体内Malat1敲低。
将如实施例1中制备的缀合至Malat1 ASO的二价抗TfR抗体在无菌盐水中稀释，并以每周50mg/kg的剂量静脉内施用于TfRms/hu敲入小鼠，持续4周。向TfRms/hu小鼠的两个对照组静脉内给药无菌盐水或未缀合的ASO。第四次给药后三天，收集组织并冷冻用于分子和生化分析。组织包括脑、脊髓、肝、心脏、四头肌、隔膜和坐骨神经。
如上所述测量脑、脊髓、肝、心脏、四头肌、膈肌和坐骨神经中的Malat1表达。
结果示于图6中。在CNS中观察到一些Malat1敲低，并且在外周中观察到更高的Malat1敲低。
实施例4：使用TfR单Fab缀合物的体内药代动力学和生物分布
在实施例1中生成了两种TfR-单Fab缀合物(TfR单Fab和TfR单Fab 2)，并在施用前在无菌盐水中稀释。TfR单Fab缀合物具有TfR结合臂和非结合RSV臂并缀合至小鼠MALAT1(SEQ ID NO:8)(抗TfR/非结合Fab抗体-寡核苷酸)，并且TfR-单Fab 2缀合物具有TfR结合臂(第二臂不存在；单Fab)并缀合至cyno MALAT1(SEQ ID NO:172)。施用未缀合的ASO作为对照。向两月龄TfR ms/hu雌性小鼠静脉内给予裸ASO(0.9mg/kg(mpk))、TfR-单Fab缀合物(25mpk)或TfR-单Fab 2缀合物(17.2mpk)的剂量。单次给药后24小时收集以下组织：脑、脊髓、肾、隔膜、肝和四头肌。单次给药后15分钟、4小时和24小时也收集血浆。
根据以上实施例2中描述的方法测量总ASO和总huIgG。结果示于图7至图9中。两种TfR-单Fab缀合物分子显示出在血浆中相似的药代动力学特征(图7)和在整个身体中相似的生物分布模式(图8)。与0.9mpk剂量后从循环中快速清除且在脑或脊髓中未检测到的未缀合ASO相比，摩尔当量量的两种TfR-单Fab分子实现了稳健的CNS ASO摄取(图9)。此外，两种TfR-单Fab分子导致隔膜、四头肌和肝中的ASO更多，但肾脏中的ASO显著减少(图9)。
实施例5：TfR-白蛋白-ASO构建
TfR-白蛋白-ASO分子通过将结合TfR的scFv经由接头与小鼠血清白蛋白融合而生成。还使用实施例1中所示的接头和小鼠MALAT1(SEQ ID NO:8)生成接头-ASO。(SEQ ID NO:168的)位置34处的半胱氨酸用于缀合目的。对于接头-ASO与TfR-白蛋白的生物缀合，首先使用TCEP(30摩尔当量)还原TfR-白蛋白。然后将接头-ASO与TfR-白蛋白上的游离半胱氨酸(1.2摩尔当量)缀合。通过阳离子交换色谱(流动相A：20mM乙酸钠，pH 5；流动相B1：20mm乙酸钠，1M NaCl，pH 5)纯化所得缀合物以去除不需要的和未缀合的产物，并通过LC/MS和分析型SEC确定纯度。
实施例6：使用TfR-白蛋白-ASO缀合物的体内药代动力学和生物分布
将以上制备的TfR-白蛋白-ASO分子在施用前在无菌盐水中稀释。作为对照，也给药未缀合的ASO。
向4-8月龄的TfRms/hu雌性小鼠静脉内施用剂量。TfR-白蛋白-ASO以9.5mg/kg(n＝2)给药。未缀合的ASO(“裸ASO”)以1.37mg/kg(n＝3)给药。在给药后15分钟(仅未缀合的ASO)、4小时、24小时采集血浆。给药后72小时收集包括脑、肝和肾的组织以及终末血浆。如实施例2中所述测量ASO浓度。
结果示于图10至图12中。与裸ASO相比，用TfR-白蛋白-ASO缀合物观察到ASO向脑的递送增加(图10)。肝和肾是裸ASO的汇集处，TfR-白蛋白-ASO缀合物降低了这些器官中的ASO浓度(图11)。在血浆中，两种分子之间的清除率相似，但TfR-白蛋白-ASO缀合物的清除率略微加快(图12)。
受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，本发明所属领域的技术人员将想到本文阐述的主题的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定的术语，但它们仅在一般性和描述性意义上使用，而不是为了限制的目的。

Claims (54)

1.一种TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含：
其中，
P包含抗TfR抗体抗原结合结构域，
F存在或不存在，并且如果存在的话，包含肽、Fc多肽、Fc二聚体或白蛋白；
L存在或不存在，并且如果存在的话，包含连接基团；
P′存在或不存在，并且如果存在的话，包含抗TfR抗体抗原结合结构域或非结合Fab或非结合可变区(NBVR)；
O包含寡核苷酸；
y是大于或等于1的整数(例如，1、2、3或4)；并且
n是大于或等于1的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
2.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
F是Fc二聚体；并且
P′不存在。
3.如权利要求2所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
P是抗TfR Fab、单链Fab(scFab)或单链可变片段(scFv)；
4.如权利要求3所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
P是抗TfR Fab或scFab。
5.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F是Fc二聚体；并且
P′是非结合Fab或NBVR。
6.如权利要求5所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是抗TfR Fab、单链Fab(scFab)或单链可变片段(scFv)；
7.如权利要求6所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是抗TfR Fab或scFab。
8.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F是白蛋白；并且
P′不存在。
9.如权利要求8所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是scFv或纳米抗体。
10.如权利要求9所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是scFv。
11.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F是Fc二聚体；并且
P′是抗TfR抗体抗原结合结构域。
12.如权利要求11所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P-F-P′包含抗体。
13.如权利要求12所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述抗体包括二价抗TfR抗体或双特异性抗体。
14.如权利要求11所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
P是抗TfR Fab、单链Fab(scFab)、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。
15.如权利要求14所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
P是抗TfR Fab或scFab。
16.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中
P是已知特异性结合TfR的第一Fab；并且
F是Fc二聚体，
其中P-F包含用于共价缀合的修饰；并且，其中O在所述修饰的位点处与P-F缀合。
17.如权利要求16所述的缀合物，所述缀合物还包含为非靶向Fab或不结合TfR的第二Fab。
18.如权利要求1-17中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO:12，
CDR-H2包含SEQ ID NO:13，
CDR-H3包含SEQ ID NO:14，
CDR-L1包含SEQ ID NO:15，
CDR-L2包含SEQ ID NO:16，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:17；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO:21，CDR-H2包含SEQ ID NO:22，
CDR-H3包含SEQ ID NO:23，
CDR-L1包含SEQ ID NO:24，CDR-L2包含SEQ ID NO:25，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:26；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO:114，CDR-H2包含SEQ ID NO:115，
CDR-H3包含SEQ ID NO:116，
CDR-L1包含SEQ ID NO:117，CDR-L2包含SEQ ID NO:118，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:119；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO:126，CDR-H2包含SEQ ID NO:127，
CDR-H3包含SEQ ID NO:128，
CDR-L1包含SEQ ID NO:129，CDR-L2包含SEQ ID NO:130，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:131；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO:134，
CDR-H2包含SEQ ID NO:135，
CDR-H3包含SEQ ID NO:136，
CDR-L1包含SEQ ID NO:137，CDR-L2包含SEQ ID NO:138，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:139；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO:154，
CDR-H2包含SEQ ID NO:155，
CDR-H3包含SEQ ID NO:156，
CDR-L1包含SEQ ID NO:157，CDR-L2包含SEQ ID NO:158，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:159；或者
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO:161，
CDR-H2包含SEQ ID NO:162，
CDR-H3包含SEQ ID NO:163，
CDR-L1包含SEQ ID NO:164，CDR-L2包含SEQ ID NO:165，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:166。
19.如权利要求1-8和11-17中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是包含以下的抗TfR Fab：
(a)SEQ ID NO:102和103；
(b)SEQ ID NO:104和105；
(c)SEQ ID NO:110和111；
(d)SEQ ID NO:122和123；
(e)SEQ ID NO:132和133；或者
(f)SEQ ID NO:143和144；
任选地其中P包含用于所述寡核苷酸的共价缀合的一个或多个修饰。
20.如权利要求1-3、5-6、8-10、11、14和16-17中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是包含以下的scFv：
(a)SEQ ID NO:106
(b)SEQ ID NO:107
(c)SEQ ID NO:171
(d)SEQ ID NO:153
(e)SEQ ID NO:160
(f)SEQ ID NO:112和113
(g)SEQ ID NO:124和125
(h)SEQ ID NO:145和146。
21.如权利要求1-3、5-6、8-10、11、14和16-17中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P是包含以下的抗体：
(a)SEQ ID NO:108和109；
(b)SEQ ID NO:120和121；
(c)SEQ ID NO:9、10和11；或者
(d)SEQ ID NO:18、19；
任选地其中所述抗体含有一个或多个修饰以增加血清稳定性、调节效应子功能、影响糖基化、降低人体内的免疫原性、促进异二聚化和/或促进所述寡核苷酸的缀合。
22.如权利要求1-21中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸，其中P、F或P′包含用于所述寡核苷酸的缀合的修饰。
23.如权利要求22所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中用于缀合的所述修饰是半胱氨酸修饰。
24.如权利要求23所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F包含所述Fc多肽或所述Fc二聚体，并且其中所述半胱氨酸修饰是S239C、S442C、A330C或T289C取代，其中位置根据EU编号。
25.如权利要求24所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述半胱氨酸修饰是所述S239C取代。
26.如权利要求23所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P包含Fab或scFab，并且其中所述半胱氨酸修饰包含K149C取代，其中位置根据EU编号；或A114C取代，其中位置根据Kabat编号。
27.如权利要求22所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F包含Fc多肽或Fc二聚体，并且其中所述修饰包含N297A取代或N297G取代，其中位置根据EU编号。
28.如权利要求1-7和11-27中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F包含Fc多肽或Fc二聚体，并且其中所述Fc多肽或所述Fc二聚体的一种或两种Fc多肽含有至少一个修饰以增加血清稳定性、调节效应子功能、影响糖基化、降低人体内的免疫原性和/或促进异二聚化。
29.如权利要求28所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述至少一个修饰包括：
(a)L234A取代和L235A取代；
(b)P329G取代；或者
(c)L234A取代、L235A取代和P329G取代；
其中位置根据EU编号。
30.如权利要求28或29所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述至少一个修饰包括：
(a)M428L取代和N434S取代；
(b)M428L取代；
(b)N434S取代；
(c)N434A取代；或者
(d)M252Y取代、S254T取代和T256E取代；
其中位置根据EU编号。
31.如权利要求28-30中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述至少一个修饰包括：羧基末端赖氨酸的缺失。
32.如权利要求28-31中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述至少一个修饰包括：
(a)M428L取代和N434S取代；
(b)M428L取代；
(b)N434S取代；
(c)N434A取代；或者
(d)M252Y取代、S254T取代和T256E取代；
其中位置根据EU编号。
33.如权利要求28-32中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中F包含所述Fc二聚体，并且其中所述Fc二聚体的第一Fc多肽包含杵突变，并且所述Fc二聚体的第二Fc多肽包含臼突变。
34.如权利要求33所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述杵突变包含根据EU编号方案的T366W取代；并且所述臼突变包含根据EU编号方案的Y407V取代以及任选的T366S取代和L368A取代。
35.如权利要求1、5-7、11-34中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P′存在并且包含非结合Fab或NBVR，其中所述非结合Fab或NBVR包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中：
(a)CDR-H1包含SEQ ID NO:45，
CDR-H2包含SEQ ID NO:47，
CDR-H3包含SEQ ID NO:49，
CDR-L1包含SEQ ID NO:39；
CDR-L2包含SEQ ID NO:41，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:43；
(b)CDR-H1包含SEQ ID NO:46，
CDR-H2包含SEQ ID NO:48，
CDR-H3包含SEQ ID NO:49，
CDR-L1包含SEQ ID NO:40；
CDR-L2包含SEQ ID NO:42，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:44；或者
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO:46，
CDR-H2包含SEQ ID NO:50，
CDR-H3包含SEQ ID NO:49，
CDR-L1包含SEQ ID NO:40；
CDR-L2包含SEQ ID NO:42，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:44；或者
36.如权利要求35所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中P′包含：
(a)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；
(b)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:38；
(c)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:53；
(d)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:54；
(e)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:55；
(f)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:56；
(g)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:57；
(h)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:58；
(i)SEQ ID NO:37或52和SEQ ID NO:59；
(j)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:60；
(k)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:61；
(l)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:65；
(m)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:66；
(n)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:67；
(o)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:68；
(p)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:69；
(q)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:70；或者
(r)SEQ ID NO:62或64和SEQ ID NO:71。
37.如权利要求1-36中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸是单链寡核苷酸。
38.如权利要求37所述的缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
39.如权利要求22-36中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸通过所述连接基团与所述修饰的位点缀合。
40.如权利要求1所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含：
蛋白质，所述蛋白质包含：
Fc二聚体，
已知特异性结合TfR的第一Fab，以及
S239C取代，其中位置根据EU编号；以及
在所述S239C取代处与所述蛋白质缀合的寡核苷酸。
41.一种调节受试者的肌细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-40中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述肌细胞是心肌细胞或骨骼肌细胞。
43.一种将寡核苷酸递送至受试者的中枢神经系统(CNS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-40中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
44.一种将寡核苷酸递送至受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-40中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
45.一种TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含：
特异性结合TfR的抗体，其中所述抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中：
a)CDR-H1包含SEQ ID NO:12，
CDR-H2包含SEQ ID NO:13，
CDR-H3包含SEQ ID NO:14，
CDR-L1包含SEQ ID NO:15，
CDR-L2包含SEQ ID NO:16，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:17；
b)CDR-H1包含SEQ ID NO:21，
CDR-H2包含SEQ ID NO:22，
CDR-H3包含SEQ ID NO:23，
CDR-L1包含SEQ ID NO:24，
CDR-L2包含SEQ ID NO:25，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:26；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO:114，
CDR-H2包含SEQ ID NO:115，
CDR-H3包含SEQ ID NO:116，
CDR-L1包含SEQ ID NO:117，
CDR-L2包含SEQ ID NO:118，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:119；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO:126，CDR-H2包含SEQ ID NO:127，
CDR-H3包含SEQ ID NO:128，
CDR-L1包含SEQ ID NO:129，CDR-L2包含SEQ ID NO:130，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:131；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO:134，CDR-H2包含SEQ ID NO:135，
CDR-H3包含SEQ ID NO:136，
CDR-L1包含SEQ ID NO:137，CDR-L2包含SEQ ID NO:138，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:139；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO:154，CDR-H2包含SEQ ID NO:155，
CDR-H3包含SEQ ID NO:156，
CDR-L1包含SEQ ID NO:157，CDR-L2包含SEQ ID NO:158，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:159；或者
(g)CDR-H1包含SEQ ID NO:161，
CDR-H2包含SEQ ID NO:162，
CDR-H3包含SEQ ID NO:163，
CDR-L1包含SEQ ID NO:164，
CDR-L2包含SEQ ID NO:165，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:166；以及
与所述抗体的恒定结构域上的半胱氨酸修饰缀合的寡核苷酸。
46.如权利要求45所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述半胱氨酸修饰是S239C、S442C、A330C、K149C或T289C取代，其中位置根据EU编号；或A114C取代，其中位置根据Kabat编号。
47.如权利要求46所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述半胱氨酸修饰是所述S239C取代。
48.如权利要求45-47中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述寡核苷酸是单链寡核苷酸。
49.如权利要求48所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
50.一种TfR结合剂-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含：
特异性结合TfR的抗体，其中所述抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中
a)CDR-H1包含SEQ ID NO:12，
CDR-H2包含SEQ ID NO:13，
CDR-H3包含SEQ ID NO:14，
CDR-L1包含SEQ ID NO:15，CDR-L2包含SEQ ID NO:16，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:17；
b)CDR-H1包含SEQ ID NO:21，
CDR-H2包含SEQ ID NO:22，
CDR-H3包含SEQ ID NO:23，
CDR-L1包含SEQ ID NO:24，CDR-L2包含SEQ ID NO:25，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:26；
(c)CDR-H1包含SEQ ID NO:114，CDR-H2包含SEQ ID NO:115，
CDR-H3包含SEQ ID NO:116，
CDR-L1包含SEQ ID NO:117，CDR-L2包含SEQ ID NO:118，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:119；
(d)CDR-H1包含SEQ ID NO:126，CDR-H2包含SEQ ID NO:127，
CDR-H3包含SEQ ID NO:128，CDR-L1包含SEQ ID NO:129，CDR-L2包含SEQ ID NO:130，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:131；
(e)CDR-H1包含SEQ ID NO:134，CDR-H2包含SEQ ID NO:135，
CDR-H3包含SEQ ID NO:136，
CDR-L1包含SEQ ID NO:137，CDR-L2包含SEQ ID NO:138，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:139；
(f)CDR-H1包含SEQ ID NO:154，CDR-H2包含SEQ ID NO:155，
CDR-H3包含SEQ ID NO:156，
CDR-L1包含SEQ ID NO:157，CDR-L2包含SEQ ID NO:158，并且CDR-L3包含SEQ ID NO:159；或者(g)CDR-H1包含SEQ ID NO:161，CDR-H2包含SEQ ID NO:162，
CDR-H3包含SEQ ID NO:163，
CDR-L1包含SEQ ID NO:164，CDR-L2包含SEQ ID NO:165，并且
CDR-L3包含SEQ ID NO:166；以及
通过接头与所述抗体的恒定结构域上的S239C取代缀合的寡核苷酸，其中位置根据EU编号。
51.一种调节受试者的肌细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求45-50中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述肌细胞是心肌细胞或骨骼肌细胞。
53.一种将寡核苷酸递送至受试者的CNS的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求45-50中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
54.一种将寡核苷酸递送至受试者的癌细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求45-50中任一项所述的TfR结合剂-寡核苷酸缀合物。
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