CN119464162A - 一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用，属于水产有益微生物及其应用领域，能够解决目前尚无拮抗杀鲑气单胞菌等水产常见病原菌效果显著的益生菌的问题。该乳酸乳球菌CX212于2024年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.32948，其拉丁文名称为Lactococcus lactis。该乳酸乳球菌CX212从菲律宾蛤仔肠道内分离获得的可以显著抑制杀鲑气单胞菌的益生菌，通过从乳酸乳球菌CX212基因组中挖掘出细菌素Nisin Z合成相关的基因簇，并从CX212代谢产物中分离细菌素Nisin Z。乳酸乳球菌CX212和细菌素Nisin Z用于杀菌组合物、抑菌剂或者饲料添加剂。

Description

一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用

技术领域

本发明属于属于水产有益微生物及其应用领域，尤其涉及一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用。

背景技术

杀鲑气单胞菌是导致虹鳟等鱼类严重疖疮的重要细菌性病原，引起极高的死亡率。当前抗生素在水产养殖业中被广泛禁用，而探寻抗生素替代品是实现健康养殖的重要途径。

乳酸菌等有益菌是替代抗生素的重要途径之一。益生菌活菌数量以及定植效果等因素影响了益生菌的使用，而作为后生元的益生菌代谢产物，具有更高效率、稳定、靶向性的特点。其中，细菌素是是细菌代谢过程中产生的一类具有抗菌生物活性的多肽或蛋白质物质，它们类型多样，具有独特的抑菌机制，不易引起耐药性。因此，细菌素在水产领域应用对于精准抗病和替代抗生素新材料发掘具有重要意义。但目前对于杀鲑气单胞菌等水产常见病原菌并无行之有效的益生菌。

发明内容

本发明针对目前尚无拮抗杀鲑气单胞菌等水产常见病原菌效果显著的益生菌的技术问题，提出一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种乳酸乳球菌CX212，该乳酸乳球菌于2024年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.32948，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其拉丁文名称为Lactococcus lactis。

在一实施方式中，所述乳酸乳球菌CX212从菲律宾蛤仔肠道内分离获得，该乳酸乳球菌CX212的16S rDNA全序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提出一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括上述实施方式所述的乳酸乳球菌CX212。

在一实施方式中，在所述饲料添加剂中所述乳酸乳球菌CX212的添加量为使饲料中活菌数量大于或等于10⁸ CFU/g；

其中，所述饲料中活菌数量为采用平板涂布方法检测所得的单位质量的饲料中所含的益生菌组分的活菌数量。

本发明还提出一种细菌素Nisin Z，该细菌素Nisin Z提取自乳酸乳球菌CX212，所述细菌素Nisin Z的氨基酸序列为：

MSTKDFNLDLVSVSKKNSGASPRITSISLCTPGCKTGAVMGCNMKTATCNCSIHVSK。

在一实施方式中，所述细菌素Nisin Z的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

本发明还提出一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括纯化后的细菌素Nisin Z，其中，在所述饲料添加剂中所述纯化后的Nisin Z按照0.5-3.0g/kg的比例进行添加。

本发明还提出一种杀菌组合物或者抑菌制剂，该杀菌组合物或者抑菌制剂包括乳酸乳球菌CX212；或者，该杀菌组合物或者抑菌制剂包括细菌素Nisin Z。

本发明又提出一种乳酸乳球菌CX212或者细菌素Nisin Z在非疾病治疗目的的抑制水产病原菌中的应用，所述水产病原菌包括杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌。

本发明又提出一种饲料添加剂在非疾病治疗目的的改善水产动物肠道菌群结构中的应用，所述水产动物包括虹鳟鱼。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提出一种乳酸乳球菌CX212，该乳酸乳球菌是从菲律宾蛤仔肠道内分离获得的可以显著抑制杀鲑气单胞菌的益生菌，通过从乳酸乳球菌CX212基因组中挖掘出细菌素Nisin Z合成相关的基因簇，并从CX212代谢产物中分离细菌素Nisin Z；

2、本发明提出一种细菌素Nisin Z，该细菌素可以通过杀伤杀鲑气单胞菌外膜，细胞质膜破裂，导致细胞质流出细胞死亡，从而显著抑制其生长；

3、本发明提出通过以乳酸乳球菌CX212或者细菌素Nisin Z作为饲料添加剂作为日粮补充剂投喂虹鳟，可以促进虹鳟幼鱼的生长，改善肠道菌群结构，提高其对杀鲑气单胞菌的抵抗能力。

附图说明

图1为本发明实施例1所提供的乳酸乳球菌CX212抑菌特性图；

图2为本发明实施例1所提供的乳酸乳球菌CX212产细菌素预测图；

图3为本发明实施例1所提供的细菌素Nisin Z抑菌特性图；

图4为实施例所提供1所提供的细菌素Nisin Z抑菌特性电镜观察图；

图5为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼的体重变化图；

图6为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼的特定增长率示意图；

图7为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群α多样性图（Shannon指数）；

图8为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群α多样性图（Simpson指数）；

图9为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群α多样性图（Ace指数）；

图10为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群α多样性图（Chao1指数）；

图11为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群门水平堆积柱状图；

图12为本发明实施例2所提供的虹鳟鱼肠道菌群属水平堆积柱状图；

图13为本发明实施例2所提供的肠道微生物群落的功能预测；

图14为本发明施例3所提供的体重变化图；

图15为本发明施例3所提供的特定增长率示意图；

图16为本发明实施例3所提供的攻毒死亡率；

图17为本发明实施例3所提供的虹鳟鱼肠道菌群门水平堆积柱状图；

图18为本发明实施例3所提供的虹鳟鱼肠道菌群属水平堆积柱状图；

图19为本发明实施例3所提供的虹鳟鱼肠道菌群氨基酸相关的预测途径（10d）；

图20为本发明实施例3所提供的虹鳟鱼肠道菌群氨基酸相关的预测途径（20d）。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种乳酸乳球菌CX212，该乳酸乳球菌于2024年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.32948，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其拉丁文名称为Lactococcus lactis。

在一具体实施方式中，乳酸乳球菌CX212从菲律宾蛤仔肠道内分离获得，该乳酸乳球菌CX212的16S rDNA全序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明实施例提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括如上述实施方式所述的乳酸乳球菌CX212。

在一具体实施方式中，在所述饲料添加剂中所述乳酸乳球菌CX212的添加量为使饲料中活菌数量大于或等于10⁸ CFU/g；

其中，所述饲料中活菌数量为采用平板涂布方法检测所得的单位质量的饲料中所含的益生菌组分的活菌数量。

本发明实施例提供了一种细菌素Nisin Z，该细菌素Nisin Z提取自乳酸乳球菌CX212，所述细菌素Nisin Z的氨基酸序列为：

MSTKDFNLDLVSVSKKNSGASPRITSISLCTPGCKTGAVMGCNMKTATCNCSIHVSK。

在一具体实施方式中，所述细菌素Nisin Z的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

需要说明的是，Nisin Z的核苷酸序列全长为20111bp，因其序列长度过长，所以XML版本的序列表中将其拆分为两条序列，如SEQ ID NO.2-3所示。其中，SEQ ID NO.2的序列长度为10673bp，SEQ ID NO.3的序列长度为9438bp，二者顺序连接即为上述Nisin Z的核苷酸序列，共计20111bp。

本发明实施例提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括纯化后的细菌素NisinZ，其中，在饲料添加剂中所述纯化后的Nisin Z按照0.5-3.0g/kg的比例进行添加。

本发明实施例还提供了一种杀菌组合物或者抑菌制剂，该杀菌组合物或者抑菌制剂包括乳酸乳球菌CX212；或者，杀菌组合物或者抑菌制剂包括细菌素Nisin Z。

本发明实施例还提供了一种乳酸乳球菌CX212或者细菌素Nisin Z在非疾病治疗目的的抑制水产病原菌中的应用，水产病原菌包括但不限于杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌。

本发明实施例还提供了一种饲料添加剂在非疾病治疗目的的改善水产动物肠道菌群结构中的应用，水产动物包括但不限于虹鳟鱼。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种乳酸乳球菌CX212、细菌素Nisin Z及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

本实施例提供一种乳酸乳球菌的筛选、鉴定及细菌素发掘及纯化，具体为：

本实施例从菲律宾蛤仔肠道分离获得乳酸菌菌株，经16S rRNA鉴定为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），编号为CX212，其16S rDNA全序列如SEQ ID NO.1所示。采用牛津杯法进行体外抑菌实验，发现CX212对水产常见病原菌杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等均具有显著的抑菌效果，实验结果如图1所示，其中，图1中A为杀鲑气单胞菌，图1中B为大肠杆菌，图1中C为迟缓爱德华氏菌，图1中D为副溶血弧菌。

（1）乳酸乳球菌细菌素发掘

对根据乳酸乳球菌CX212进行全基因组测序分析，结合次级代谢产物数据库antiSMASH与细菌素在线软件BAGEL4，挖掘序列中潜在的细菌素基因簇，预测CX212可能产生的细菌素种类，结果显示CX212可以生产细菌素Nisin Z（图2）。

（2）Nisin Z纯化

（2-1）载体构建

使用直接克隆的方法异源表达Nisin Z：使用Geneious Prime软件构建P15A启动子-氯霉抗性基因-Nisin Z合成基因簇载体，同时设计P15A质粒的P15A启动子-氯霉抗性基因扩增特异性引物。使用AflⅢ酶对乳酸乳球菌CX212株全基因组进行酶切（酶切体系400微升），将Nisin Z合成基因簇酶切下来，同时使用设计的特异性引物扩增P15A启动子-氯霉抗性基因部分，将扩增产物与酶切的基因组进行T4连接酶链接（连接体系20微升）。连接产物脱盐40min~1h后，放冰上电转转入大肠杆菌感受态细胞中，随后进行阳性菌落筛选并使用酶切验证，将转化成功的阳性菌进行保种。

（2-2）扩大培养及破菌

挑选含重组质粒的单菌落接种于10mL的LB液体培养基（加氯霉），37℃震荡培养过夜；将10mL菌液接种于1000mL的LB液体培养基中，37℃扩大培养至 OD₆₀₀=0.5~0.6，降温至16℃，加IPTG诱导20h以上；大离心机4℃，6000rpm离心5min收集菌体，倒上清，收菌至50ml离心管中，用超声破碎菌体，用Lysis buffer进行润洗摇匀至无颗粒；于离心机中4℃、12000rpm，离心1h，收集上清；

（2-3）重组蛋白纯化

镍柱用清水清洗2-3遍后用Lysis buffer洗一遍；4℃条件下用层析柱洗脱上清，用10mM、25mM、50mM、100mM、500mM洗脱液洗脱，将洗脱液收集到超滤离心管中，离心过滤浓缩，并使用NaCl的Tris-HCl缓冲液及高浓度Tris-HCl缓冲液进行除盐，最后保留蛋白质样品，用于最后分析。

（3）Nisin Z的抑菌特性

使用牛津杯法验证Nisin Z对杀鲑气单胞菌的抑菌效果。同时将Nisin Z与杀鲑气单胞菌共培养后，分别采集共培养实验6h、12h、24h的样品，进行电镜观察，观察其具体杀菌机制。发现Nisin Z通过杀伤杀鲑气单胞菌外膜，细胞质膜破裂，导致细胞质流出细胞死亡，从而显著抑制其生长。实验结果如图3和图4所示。其中，图3中L为每千克饲料0.2g Nisin Z的低浓度组，M为每千克饲料1.0g Nisin Z的中浓度组，N为每千克饲料3.0g Nisin Z的高浓度组（H组）。图4中各图展示的是不同时间Nisin Z损伤杀鲑气单胞菌电镜图，其中，图4中A-B为对照组，即不添加Nisin Z的杀鲑气单胞菌电镜图；图4中C-D为Nisin Z与杀鲑气单胞菌共培养6h时，Nisin Z损伤杀鲑气单胞菌电镜图；图4中E-F为Nisin Z与杀鲑气单胞菌共培养12h时，Nisin Z损伤杀鲑气单胞菌电镜图；图4中G-H分别为Nisin Z与杀鲑气单胞菌共培养24h时，Nisin Z损伤杀鲑气单胞菌电镜图。

实施例2

本实施例通过投喂乳酸乳球菌CX212研究其对虹鳟生长及肠道菌群的影响，具体为：

以虹鳟专用饲料组成包括：粗蛋白质45%、粗脂肪20%、粗纤维3%、粗灰分9%、水分8.5%、总磷2.0%、钙0.8%、氨基酸3.3%。实验设计四个处理组，分别为：

每克饲料10⁷cfu CX212的低浓度组（A组）；

每克饲料10⁸ cfu CX212的中浓度组（B组）；

每克饲料10⁹ cfu CX212的高浓度组（C组）；

不补充CX212的对照组（CK组）。

实验过程为：在青岛农业大学综合养殖中心进行实验，养殖系统为静水养殖。试验分为低浓度组（A组）、中浓度组（B组）、高浓度组（C组）和对照组（CK组），每组3个平行，采用12个养殖桶，单桶水体300L，每个桶30尾虹鳟，初始体重为37.57±1.01 g。养殖水体平均温度15.5±0.5℃，溶解氧为6.9±0.7 mg/L，pH为7.0±0.5。每日上午9：00和下午16：00进行投喂，投饲量为鱼体重的2%，实验周期为30天，分别在第7天，第14天和第21天对鱼进行取样，分析鱼体生长和肠道菌群变化情况。

实验结果如下：

实验开始和结束时对鱼苗平均体重进行测试以分析虹鳟生长，测试结果如图5-6所示。采集肠道用于16S rRNA基因测序，并进行肠道微生物多样性、肠道菌群差异和功能预测分析，分析结果分别如图7-图13所示。

结果分析：

（1）从图5-图6所示的实验结果可知，三种浓度益生菌添加饲料组的的终末体重（FW）和特定生长率（SGR）均明显高于普通饲料组（CK组），即本实施例的益生菌应用于饲料可以促进虹鳟生长。同时，在本实施例的整个实验过程中，各个实验组均未出现鱼苗死亡情况，攻毒前存活率为100%。

（2）图7-图12表明，通过投喂CX212菌株，10d多样性未发生显著变化，20d低浓度组（A）显著降低了群落多样性，中浓度组（B）显著降低了群落多样性，升高了群落丰富度，高浓度组（C）显著升高了群落多样性和群落丰富度。具体表现为：在门水平上，厚壁菌门普遍提高、拟杆菌门降低、变形菌门普遍降低；在属水平上，各个处理组支原体属普遍升高，金黄杆菌属普遍降低。潜在致病菌金黄杆菌、从毛单胞菌丰度减少，同时，一些潜在的有益细菌乳酸杆菌丰度增加。

（3）图13表明，通过投喂CX212菌株，能提高多种氨基酸代谢途径（半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等）、乙醛酸和二羧酸的代谢及氧化磷酸化等多种途径的丰度。

实施例3

本实施例通过投喂Nisin Z制剂探究其对虹鳟生长和抗病的影响，具体为：

实验设计四个处理组，具体如下：

每千克饲料0.2g Nisin Z的低浓度组（L组）；

每千克饲料1.0g Nisin Z的中浓度组（M组）；

每千克饲料3.0g Nisin Z的高浓度组（H组）；

不补充Nisin Z的对照组（CK组）。体内投喂实验方法同实施例2。

实验结果如下：

实验开始和结束时对鱼苗平均体重进行测试以分析虹鳟生长和抗病力，测试结果如图14-图15。

采集肠道用于16SrRNA基因测序，并进行肠道微生物多样性、肠道菌群差异和功能预测分析，分析结果分别如表1，图16-图20所示。

表1 虹鳟肠道菌群α多样性

结果分析：

（1）由图14-图16可知，Nisin Z各浓度处理组特定生长率（SGR）及增重（WG）显著高于对照组（CK），在杀鲑气单胞菌侵染后的7天内，所有组的虹鳟存活率都显著降低。CK组虹鳟的存活率是所有组中最低的，攻击5天后低于60%。其他的处理组，特别是M和H组的存活率在5天后超过70%，显著高于CK组（P<0.05）。

（2）由图17-图18可知，Nisin Z处理组虹鳟鱼的肠道α多样性指数呈现第10天下降，第20天增加的趋势。在门水平上，投喂Nisin Z提高了厚壁菌门的丰度，降低了变形菌门、梭杆菌门的丰度；在属水平上，支原体属丰度升高，变形菌属丰度降低。同时，潜在病原菌如不动杆菌属、链球菌属及希瓦氏菌属的相对分度降低。

（3）由图19-图20可知，Nisin Z处理组显著提升肽酶相关功能、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、多种氨基酸生物合成（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和赖氨酸）的丰度。

以上所述，仅是本发明的实施例证而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸乳球菌CX212，其特征在于，该乳酸乳球菌于2024年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.32948，其拉丁文名称为Lactococcus lactis。

2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌CX212，其特征在于，所述乳酸乳球菌CX212从菲律宾蛤仔肠道内分离获得，所述乳酸乳球菌CX212的16S rDNA全序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括如权利要求1所述的乳酸乳球菌CX212。

4.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，在所述饲料添加剂中所述乳酸乳球菌CX212的添加量为使饲料中活菌数量大于或等于10⁸ CFU/g；

其中，所述饲料中活菌数量为采用平板涂布方法检测所得的单位质量的饲料中所含的益生菌组分的活菌数量。

5.一种细菌素Nisin Z，其特征在于，该细菌素Nisin Z提取自如权利要求1所述的乳酸乳球菌CX212，所述细菌素Nisin Z的氨基酸序列为：

MSTKDFNLDLVSVSKKNSGASPRITSISLCTPGCKTGAVMGCNMKTATCNCSIHVSK。

6.根据权利要求5所述的细菌素Nisin Z，其特征在于，所述细菌素Nisin Z的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

7.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括纯化后的如权利要求5所述的细菌素Nisin Z，其中，在所述饲料添加剂中所述纯化后的Nisin Z按照0.5-3.0g/kg的比例进行添加。

8.一种杀菌组合物或者抑菌制剂，其特征在于，所述杀菌组合物或者抑菌制剂包括如权利要求1所述的乳酸乳球菌CX212；或者，

所述杀菌组合物或者抑菌制剂包括如权利要求5所述的细菌素Nisin Z。

9.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌CX212或者根据权利要求5所述的细菌素Nisin Z在非疾病治疗目的的抑制水产病原菌中的应用，其特征在于，所述水产病原菌包括杀鲑气单胞菌、大肠杆菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌。

10.根据权利要求3所述的饲料添加剂或者根据权利要求7所述的饲料添加剂在非疾病治疗目的的改善水产动物肠道菌群结构中的应用，其特征在于，所述水产动物包括虹鳟鱼。