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CN119430661A - 作为用于受控释放的核酸载体的生物活性玻璃颗粒 - Google Patents

作为用于受控释放的核酸载体的生物活性玻璃颗粒 Download PDF

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CN119430661A
CN119430661A CN202310986665.3A CN202310986665A CN119430661A CN 119430661 A CN119430661 A CN 119430661A CN 202310986665 A CN202310986665 A CN 202310986665A CN 119430661 A CN119430661 A CN 119430661A
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CN
China
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glass particles
less
modified glass
nucleic acid
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CN202310986665.3A
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江佩珍
付强
许正宜
许玮伦
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Corning Inc
Original Assignee
Corning Inc
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Publication date
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Abstract

本申请涉及作为用于受控释放的核酸载体的生物活性玻璃颗粒。玻璃粉末包含多个改性玻璃颗粒，以重量百分比(重量％)计，所述多个改性玻璃颗粒包含：大于或等于20重量百分比(重量％)至小于或等于75重量％SiO2；大于或等于3重量％至小于或等于25重量％P2O5；大于或等于2重量％至小于或等于50重量％CaO；以及所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％，其中，所述多个改性玻璃颗粒在接触之后与核酸化合物结合。

Description

作为用于受控释放的核酸载体的生物活性玻璃颗粒
技术领域
本公开内容涉及用于将核酸传递到细胞中或者微生物中的玻璃组合物。具体来说，本公开内容涉及能够在指定环境中捕获和释放核酸的生物活性玻璃组合物。
背景技术
利用或转移外源核酸进行基因调节或调控是感兴趣的新兴市场，尤其是在农业和治疗领域。小干扰RNA(siRNA)调节基因表达的能力具有潜在的治疗应用，但其使用受到低效传递的限制。具体来说，由于核酸的低稳定性和低细胞摄取效率，外源核酸传递到目标有机物或细胞中仍然是具有挑战性的。因此，存在对于具有改进的表面性质的新的玻璃组合物的需求，其能够作为核酸载体来强化细胞摄取速率。
发明内容
第1个方面可以涉及包含多个改性玻璃颗粒的玻璃粉末，以重量百分比(重量％)计，所述多个改性玻璃颗粒包含：大于或等于20重量百分比(重量％)至小于或等于75重量％SiO2，大于或等于3重量％至小于或等于25重量％P2O5，大于或等于2重量％至小于或等于50重量％CaO，以及所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％，其中，所述多个改性玻璃颗粒在接触之后与核酸化合物结合。
本公开内容的第2个方面可以包括第1个方面，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％B2O3。
本公开内容的第3个方面可以包括第1或第2个方面，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％Al2O3。
本公开内容的第4个方面可以包括第1至第3个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于30重量％Na2O。
本公开内容的第5个方面可以包括第1至第4个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于10重量％K2O。
本公开内容的第6个方面可以包括第1至第5个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于20重量％MgO。
本公开内容的第7个方面可以包括第1至第6个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于10重量％Zr2O。
本公开内容的第8个方面可以包括第1至第7个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％F。
本公开内容的第9个方面可以包括第1至第8个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的10重量％，以及包含的磷灰石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的15重量％。
本公开内容的第10个方面可以包括第1至第9个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的50重量％，以及包含的磷灰石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的3重量％。
本公开内容的第11个方面可以包括第1至第10个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的60重量％。
本公开内容的第12个方面可以包括第1至第11个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于100m2/g至小于或等于300m2/g的BET表面积。
本公开内容的第13个方面可以包括第1至第12个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于2纳米(nm)至小于或等于10nm的平均孔宽度，这是通过BET确定的。
本公开内容的第14个方面可以包括第1至第13个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于-10mV至小于或等于5mV的泽塔电势。
本公开内容的第15个方面可以包括第1至第14个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包括具有大于或等于10nm至小于或等于50nm的最大长度的针状晶体。
本公开内容的第16个方面可以包括第1至第15个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度。
本公开内容的第17个方面可以包括第1至第16个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：大于或等于25重量％至小于或等于50重量％SiO2；大于或等于8重量％至小于或等于25重量％P2O5；以及大于或等于30重量％至小于或等于50重量％CaO。
本公开内容的第18个方面可以包括第1至第17个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：大于或等于25重量％至小于或等于35重量％SiO2；大于或等于15重量％至小于或等于25重量％P2O5；大于或等于3重量％至小于或等于6重量％MgO；大于或等于38重量％至小于或等于48重量％CaO；以及大于或等于2重量％至小于或等于6重量％ZrO2。
本公开内容的第19个方面可以包括第1至第18个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：大于或等于38重量％至小于或等于48重量％SiO2；大于或等于5重量％至小于或等于15重量％P2O5；大于或等于10重量％至小于或等于20重量％MgO；以及大于或等于28重量％至小于或等于38重量％CaO。
本公开内容的第20个方面可以包括第1至第19个方面中的任一项，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含核酸化合物从而得到生物活性玻璃载体。
本公开内容的第21个方面可以包括第20个方面或者任意前述方面，其中，核酸化合物包括包含小于或等于1500个碱基对的脱氧核糖核酸(DNA)，包含小于或等于1000个碱基对的核糖核酸(RNA)，或其组合。
本公开内容的第22个方面可以包括第20或第21个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，核酸化合物的浓度大于或等于500纳克每毫克(ng/mg)至小于或等于5,000ng/mg，基于所述多个改性玻璃颗粒的总重量。
本公开内容的第23个方面可以涉及形成玻璃粉末的方法，该方法包括：将玻璃加工成前体玻璃颗粒，其中，前体玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度；以及用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理，其中：处理溶液包含磷酸盐，以及处理形成了改性玻璃颗粒；其中：所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％，以及所述多个改性玻璃颗粒可以在接触之后与核酸化合物结合。
本公开内容的第24个方面可以包括第23个方面或者任意前述方面，其中，处理溶液的pH大于或等于2.5至小于或等于4.5。
本公开内容的第25个方面可以包括第23个或24个方面中的任一项或者任意前述方面，其中：处理包括形成包含前体玻璃颗粒和处理溶液的混合物；以及混合物中的磷酸盐的浓度大于或等于0.1摩尔(M)至小于或等于1M。
本公开内容的第26个方面可以包括第23至第25个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，处理溶液包括磷酸钠、磷酸钾，或其组合。
本公开内容的第27个方面可以包括第23至第26个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，处理包括：形成包含前体玻璃颗粒和处理溶液的混合物；以及在40℃至80℃的温度对混合物进行加热持续加热持续时间。
本公开内容的第28个方面可以包括第27个方面或者任意前述方面，其中，加热持续时间大于或等于1天。
本公开内容的第29个方面可以涉及形成生物活性玻璃载体的方法，该方法包括：将玻璃加工成前体玻璃颗粒，其中，前体玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度；以及用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理，其中：处理溶液包含磷酸盐，以及处理形成了改性玻璃颗粒；将所述多个改性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及在使得核酸化合物与所述多个改性玻璃颗粒非共价结合的条件下对混合物进行孵育，形成生物活性玻璃载体。
本公开内容的第30个方面可以包括第29个方面或者任意前述方面，其中，混合物包含的核酸化合物浓度为大于或等于500ng每mg的所述多个改性玻璃颗粒(ng/mg)至小于或等于10,000ng/mg。
本公开内容的第31个方面可以包括第29或第30个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，在大于或等于20℃至小于或等于40℃的温度进行混合物的孵育。
本公开内容的第32个方面可以包括第29至第31个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，对混合物进行孵育进行大于或等于10分钟的时间段。
本公开内容的第33个方面可以包括第29至第32个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，对混合物进行孵育包括以大于或等于50％的负载效率将核酸化合物负载到所述多个改性玻璃颗粒上。
本公开内容的第34个方面可以包括第29至第33个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，生物活性玻璃载体包含的核酸化合物浓度为大于或等于500ng每mg的生物活性玻璃载体(ng/mg)至小于或等于5,000ng/mg。
本公开内容的第35个方面可以涉及包含根据第1至第22个方面中的任一项或者任意前述方面的玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)的载剂。
本公开内容的第36个方面可以包括第35个方面或者任意前述方面，其中，载剂包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物处理或作物保护载剂、免疫调节载剂或者基因编辑复合载剂。
本公开内容的第37个方面可以包括第35或第36个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，至少一部分的核酸化合物在大于或等于3至小于或等于10的pH释放。
本公开内容的第38个方面可以包括第37个方面或者任意前述方面，其中，至少60重量百分比的核酸化合物得到释放，基于载剂中负载的核酸化合物的总重量。
本公开内容的第39个方面可以涉及从第20至第22或者第35至第38个方面中的任一项或者任意前述方面的玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)释放核酸化合物的方法，该方法包括：将玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)置于细胞环境中，其中，至少一部分的核酸化合物在细胞环境中从玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)释放。
本公开内容的第40个方面可以包括第39个方面或者任意前述方面，其中，至少一部分的核酸化合物在大于或等于3至小于或等于10的pH释放。
本公开内容的第41个方面可以包括第39或第40个方面或者任意前述方面，其中，至少60重量百分比的核酸化合物得到释放，基于玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)中的核酸化合物的总重量。
本公开内容的第42个方面可以包括第39至第41个方面中的任一项或者任意前述方面，其中，细胞环境包括以下一种或多种：昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼类、酵母、植物细胞，或其任意组合。
附图说明
图1提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的改性玻璃颗粒的X射线衍射(XRD)图，强度(y轴)与位置(x轴)的函数关系图；
图2A提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的前体玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图2B提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的改性玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图2C提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的改性玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图2D提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的前体玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图2E提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的改性玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图2F提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的改性玻璃颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像；
图3提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的经受DNase挑战的玻璃粉末的电泳图像；以及
图4提供了根据本文所示和所述一个或多个方面的细胞中内在化的玻璃粉末的荧光和合并共焦图像。
具体实施方式
现将具体参考可用作核酸载体的玻璃颗粒，在所附的附图中显示其各个方面。只要可能，在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。根据方面，玻璃粉末可以包含多个改性玻璃颗粒，其可以用作核酸载体。以重量百分比(重量％)计，所述多个改性玻璃颗粒可以包含：大于或等于20重量百分比(重量％)至小于或等于75重量％SiO2；大于或等于3重量％至小于或等于25重量％P2O5；以及大于或等于2重量％至小于或等于50重量％CaO。所述多个改性玻璃颗粒中的每一个的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量可以是大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％，其中，改性玻璃颗粒在接触之后与核酸化合物结合。本文将具体参照附图对用作核酸载体的玻璃颗粒的各个方面进行描述。附图中的组件不一定是成比例的，相反地，进行了突出强调来显示示例性方面的原理。
本公开内容大体上涉及玻璃粉末、玻璃粉末的形成方法以及生物活性玻璃载体的形成方法。
下文提供本公开内容中所用的某些术语的定义。除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语通常具有本文技术所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
在本公开内容和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，提到的“一种”部件包括具有两种或更多种这类部件的方面，除非文本中有另外的明确表示。例如，涉及“一种细胞”包括两种或更多细胞的组合等。此外，用词“或”的使用当没有先行词“任一”时(或者表明“或”是明确表示排除性的其他类似用语，例如，x或y中的仅一个时)，应该解读为包含性的(例如，“x或y”表示x或y中的一个或两个)。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学均为本领域熟知和常用的。
术语“和/或”也应解读为包含性的(例如，“x和/或y”表示x或y中的一个或两个)。在“和/或”或者“或”用于一组三个或更多个项目的情形时，应该将组理解为仅包含一个项目，包含全部项目一起，或者项目的任意组合或数量。此外，用于说明书和权利要求书的术语，例如：具有、有、包含了和包括了应解读为与术语包括和包含相同含义。通过“和/或”条款，除了具体指定的元素之外可以任选地存在其他元素，无论它们与具体指定的那些元素是否相关或者无关。作为非限制性例子，涉及“X和/或Y”在一个方面中可以指的是仅X(任选地包含除了Y之外的元素)；在一些方面中可以指的是仅Y(任选地包含除了X之外的元素)；在一些方面中可以指的是X和Y两者(任选地包含其他元素)。
除非另有说明，否则如本文所用，术语“粒度”指的是颗粒的最长维度。“平均粒度”指的是多个颗粒的最长维度的平均值。在颗粒是球形的方面中，最长维度是颗粒直径。例如，粒度表述为多个颗粒的平均粒度或者平均最长维度，这可以采用电子显微镜结合图像分析进行确定。
如本文所用，术语“生物活性玻璃”(“BAG”)或者“生物上活性的玻璃”指的是能够与所希望的生物材料(例如，核酸)结合的无机玻璃材料。如本文所用，术语“生物活性玻璃载体”指的是与所希望的生物材料(例如，核酸)结合的玻璃材料。
如本文所用，术语“受控释放”指的是核酸根据预定曲线从生物活性玻璃载体的释放。在一些方面中，所选择的受控释放可以包括在特定pH范围、离子强度范围内(或者这两种情况)的核酸化合物的释放。
本公开内容的各种方面和/或实施方式涉及包含改性玻璃颗粒的玻璃粉末。在各种方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％。改性玻璃颗粒能够在接触之后与核酸结合(binding)。本文公开的玻璃粉末展现出优异的生物相容性。玻璃粉末的生物活性特性源自某些条件下前体玻璃颗粒的表面上的一系列的反应。例如，当前体玻璃颗粒暴露于包含磷酸根的处理溶液时，可能发生阳离子交换，从而来自玻璃表面的阳离子被来自处理溶液的阳离子替代。由于玻璃网络的溶解导致的从玻璃表面释放的Ca2+离子结合溶液中的PO4 3-离子会在玻璃表面上发生反应。这促进了形成透钙磷石(CaHPO4·2H2O)(已知的生物活性陶瓷)或者磷灰石(例如，羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2))。透钙磷石和磷灰石这两者都能够与核酸(例如DNA和RNA)结合。在方面中，磷灰石指的可能是羟基磷灰石、氟磷灰石(Ca5(PO4)3F)、氯磷灰石(Ca5(PO4)3F)，或其组合。在方面中，磷灰石指的可能是羟基磷灰石。
可以形成包含多个改性玻璃颗粒的玻璃粉末。在方面中，从前体玻璃颗粒形成玻璃粉末的改性玻璃颗粒。玻璃粉末可以展现出优异的核酸俘获/释放效率。
玻璃粉末的形成方法可以包括将玻璃加工成前体玻璃颗粒。取决于组成，玻璃可以在约1000℃至约1600℃的温度范围内熔化。例如，玻璃可以在约1100℃至约1500℃的温度范围内或者甚至约1150℃至约1450℃的温度范围内熔化。玻璃可以在合适的设备(例如，有盖铂坩埚)中熔化持续足够的时间以使得玻璃熔化，例如约60分钟(min)至约24小时(h)，包括：约90min至约20h，约2h至约18h，约5h至约16h，约8h至约12h，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。在熔化和澄清之后，可以倾倒玻璃并在约350℃至约550℃的温度(例如，约400℃至约500℃)进行退火。然后，可以将经退火的玻璃浇注到合适的模具中，之后使所得到的材料冷却以形成玻璃。在某些方面中，可以通过空气喷射研磨将玻璃碾磨成粒度为0.5至10μm的前体玻璃颗粒。采用摩擦研磨或者球磨，粒度会在1-100μm范围内变化。此外，可以采用不同方法(例如，行星球磨或湿法碾磨)将这些玻璃后续加工至亚微米级粒度。在方面中，前体玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10.0μm的平均最长维度(粒度)，例如：0.5μm至9.0μm，0.6μm至8.0μm，0.7μm至7.0μm，0.8μm至6.0μm，1.0μm至5.0μm，2.0μm至4.0μm，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。对于工业规模而言，可以在研磨或碾磨之后采用自上往下的熔化方案来生产具有所需尺寸的前体玻璃颗粒，这提供了组成设计的灵活性以及低成本制造。在某些实施方式中，可以采用空气喷射、球磨或研磨将玻璃研磨成前体玻璃颗粒。可以对所需尺寸的前体玻璃颗粒进行进一步处理以形成改性玻璃颗粒。
玻璃粉末的形成方法可以包括用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理，其中，处理溶液包含磷酸盐，从而形成改性玻璃颗粒。在方面中，处理溶液包含磷酸盐，例如但不限于：硫酸钠、硫酸钾，或其组合。在方面中，处理溶液是水性溶液。
在方面中，处理溶液的pH可以是2.5至5.0，例如：2.5至4.8，3.0至4.5,3.5至4.5，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。不旨在受限于任何特定理论，相信用pH小于2.5的处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理可以使得至少部分的前体玻璃颗粒溶解。此外，相信用pH大于5.0的处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理可能减少磷灰石的形成。
处理可以包括形成包含前体玻璃颗粒和处理溶液的混合物。在方面中，混合物中的磷酸盐的浓度可以是0.1摩尔(M)至1M，例如：0.2M至0.8M，0.3M至0.7M，0.4M至0.6M，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
在方面中，处理可以包括在提升的温度(例如40℃至80℃或者50℃至70℃)加热混合物持续加热持续时间。在方面中，加热持续时间大于或等于1天，大于或等于3天，或者大于或等于5天。在方面中，加热持续时间是1天至60天，1天至30天，1天至15天，1天至7天，3天至60天，3天至30天，3天至15天，3天至10天，或者3天至7天。不旨在受限于任何特定理论，相信短于1天的加热持续时间可能无法提供在改性玻璃颗粒的表面上充分形成磷灰石和透钙磷石。
用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理可以形成改性玻璃颗粒，所述改性玻璃颗粒在改性玻璃颗粒的表面上具有增加浓度的透钙磷石和磷灰石(这是相对于前体玻璃颗粒的表面上的透钙磷石和磷灰石的浓度而言)。此外，处理可以增加改性玻璃颗粒的表面积。改性玻璃颗粒的表面积以及透钙磷石和磷灰石浓度这两者的增加可以增加改性玻璃颗粒的核酸负载能力。
在方面中，生物活性玻璃载体的形成方法可以包括：使得改性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物，以及在使得核酸化合物与改性玻璃颗粒非共价结合的条件下对混合物进行孵育，形成生物活性玻璃载体。在方面中，混合物可以包括合适的液体介质，例如：水、醇类或者烃类。
混合物包含的核酸化合物的浓度可以是500纳克(ng)每毫克(mg)改性玻璃颗粒(ng/mg)至10,000ng/mg。例如，混合物包含的核酸化合物的浓度可以是：500ng/mg至10,000ng/mg，750ng/mg至8,000ng/mg，1,000ng/mg至6,000ng/mg，1,250ng/mg至4,000ng/mg，1,500ng/mg至3,000ng/mg，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
在方面中，对混合物进行孵育可以包括在20℃至40℃的温度(例如20℃至30℃或者20℃至25℃)对混合物进行处理。不旨在受限于任何特定理论，相信在大于40℃的温度对混合物进行孵育可能使得核酸失稳。孵育可以进行大于或等于10分钟的时间段。在方面中，孵育可以进行如下时间段：小于或等于3小时，小于或等于2小时，或者小于或等于1小时。
可以通过如下方式确定改性玻璃颗粒上负载核酸的负载效率：计算混合物(添加总核酸)中的核酸量，以及计算去除改性玻璃颗粒(核酸未负载)之后的混合物的上清液中的残留核酸量。可以通过从混合物中的核酸总量减去上清液中的残留核酸量来确定负载的核酸量。通过负载核酸量除以混合物中的核酸总量来计算得到负载效率。可以使用本领域中的常规方法(例如采用微体积紫外-可见光分光光度计或者荧光Qubit核酸检测)来确定混合物和上清液中的核酸浓度。改性玻璃颗粒的表面电荷和容量可能影响负载效率。在方面中，对混合物进行孵育包括以大于或等于50％的负载效率将核酸化合物负载到改性玻璃颗粒上，例如：大于或等于70％，大于或等于80％，或者甚至大于或等于90％。在方面中，负载效率可以是50％至100％，例如：60％至95％，70％至95％，80％至95％，或者90％至95％。
如本文所讨论的那样，玻璃粉末可以包括多个改性玻璃颗粒。在方面中，从前体玻璃颗粒形成玻璃粉末的改性玻璃颗粒。玻璃粉末的生物相容性和稳定性受到改性玻璃颗粒的组成的影响。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒包含SiO2。当SiO2的含量太低时，玻璃可能具有差的化学耐久性和机械耐久性。另一方面，当SiO2的含量太高时，玻璃的熔化能力可能下降，因为纯SiO2的熔化温度较高。随着SiO2含量的增加，改性玻璃颗粒的生物活性可能下降。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒包括硅酸盐玻璃，其包含SiO2作为主要的形成玻璃的氧化物。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的SiO2的量是20重量％至75重量％，例如：25重量％至70重量％，30重量％至65重量％，35重量％至60重量％，40重量％至55重量％，45重量％至50重量％，分别是相对于前体玻璃颗粒和改性玻璃颗粒的总重量，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒还可以包含P2O5，其起到网络成形剂的作用。此外，磷酸根离子释放到前体玻璃颗粒的表面对形成钙-磷(Ca-P)化合物(例如，透钙磷石或磷灰石)可以具有贡献作用。此外，P2O5可以增加玻璃的粘度，这进而扩大了操作温度范围，并且对于后续加工成玻璃粉末的玻璃的制造和形成可能是有利的。在各种方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的P2O5的量是前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量的3重量％至25重量％，例如：8重量％至25重量％，15重量％至25重量％，或者5重量％至15重量％的P2O5。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒包含的P2O5是：3重量％至25重量％，5重量％至20重量％，8重量％至15重量％，10重量％至12重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含二价阳离子氧化物(例如碱土氧化物)，这改善了玻璃的熔化行为。二价阳离子还可以改善玻璃的生物活性。CaO可以与前体玻璃颗粒中的P2O5反应形成磷灰石。此外，CaO可以与包含磷酸盐的处理溶液反应形成磷灰石。从前体玻璃颗粒的表面释放的Ca2+离子可以对形成富集了磷酸钙的颗粒的表面层起到贡献。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的CaO的量是2重量％至50重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的CaO的量包括：30重量％至50重量％，28重量％至38重量％，或者38重量％至48重量％CaO，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的CaO的量是：2重量％至50重量％，5重量％至45重量％，10重量％至40重量％，15重量％至35重量％，20重量％至30重量％，28重量％至38重量％，38重量％至48重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含B2O3，这可以增加玻璃粉末的改性玻璃颗粒的生物活性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的B2O3的量是0重量％至5重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的B2O3的量包括：0重量％至5重量％，0.2重量％至4.5重量％，0.5重量％至4重量％，1重量％至3.5重量％，1.5重量％至3重量％，2重量％至2.5重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含Al2O3，这可以增加玻璃的热稳定性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的Al2O3的量是0重量％至5重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的Al2O3的量包括：0重量％至5重量％，0.2重量％至4.5重量％，0.5重量％至4重量％，1重量％至3.5重量％，1.5重量％至3重量％，2重量％至2.5重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含Na2O，这可以增加玻璃的生物活性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的Na2O的量是0重量％至30重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的Na2O的量包括：0重量％至30重量％，5重量％至25重量％，10重量％至20重量％，12重量％至15重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含K2O，这可以增加玻璃的生物活性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的K2O的量是0重量％至10重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的K2O的量包括：0重量％至10重量％，1重量％至9重量％，2重量％至8重量％，3重量％至7重量％，4重量％至6重量％，4重量％至5重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含MgO，这可以增加玻璃的生物活性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的MgO的量是0重量％至20重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的MgO的量包括：0重量％至20重量％，1重量％至18重量％，2重量％至16重量％，3重量％至15重量％，5重量％至15重量％，6重量％至14重量％，7重量％至13重量％，8重量％至12重量％，9重量％至11重量％，10重量％至20重量％，3重量％至6重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含ZrO2，这可以增加玻璃的热稳定性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的ZrO2的量是0重量％至10重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的ZrO2的量包括：0重量％至10重量％，1重量％至9重量％，2重量％至8重量％，3重量％至7重量％，4重量％至6重量％，4重量％至5重量％，2重量％至6重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒可以包含氟(F-)，这可以增加玻璃的生物活性。在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的F-的量是0重量％至5重量％，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。例如，在方面中，前体玻璃颗粒或者由其形成的玻璃粉末的改性玻璃颗粒中存在的F-的量包括：0重量％至5重量％，0.2重量％至4.5重量％，0.5重量％至4重量％，1重量％至3.5重量％，1.5重量％至3重量％，约2重量％至约2.5重量％，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，基于前体玻璃颗粒或者改性玻璃颗粒的总重量。
在方面中，改性玻璃颗粒包含：大于或等于25重量％至小于或等于50重量％SiO2；大于或等于8重量％至小于或等于25重量％P2O5；以及大于或等于30重量％至小于或等于50重量％CaO。
在方面中，改性玻璃颗粒包含：大于或等于25重量％至小于或等于35重量％SiO2；大于或等于15重量％至小于或等于25重量％P2O5；大于或等于3重量％至小于或等于6重量％MgO；大于或等于38重量％至小于或等于48重量％CaO；以及大于或等于2重量％至小于或等于6重量％ZrO2。
在方面中，改性玻璃颗粒包含：大于或等于38重量％至小于或等于48重量％SiO2；大于或等于5重量％至小于或等于15重量％P2O5；大于或等于10重量％至小于或等于20重量％MgO；以及大于或等于28重量％至小于或等于38重量％CaO。
由前体玻璃颗粒形成的改性玻璃颗粒可以展现出不同于前体玻璃颗粒的某些性质，例如但不限于：透钙磷石和磷灰石表面浓度，BET表面积，平均孔宽度，或者表面电荷。
可以采用本领域已知的里特沃尔德方法(Rietveld)，通过XRD的定量相分析来确定改性玻璃颗粒表面上的透钙磷石和/或磷灰石的浓度。
在方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的5重量％。例如，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量可以是：大于或等于10重量％，大于或等于20重量％，大于或等于30重量％，大于或等于40重量％，大于或等于50重量％，大于或等于60重量％，或者大于或等于70重量％的改性玻璃颗粒的总重量。改性玻璃颗粒包含的透钙磷石的量可以是5重量％至90重量％，10重量％至80重量％，20重量％至70重量％，30重量％至50重量％的改性玻璃颗粒的总重量，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
在方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的磷灰石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的2重量％。例如，改性玻璃颗粒的表面包含的磷灰石的量可以是：大于或等于3重量％，大于或等于4重量％，大于或等于5重量％，大于或等于8重量％，或者大于或等于10重量％的改性玻璃颗粒的总重量。改性玻璃颗粒包含的磷灰石的量可以是2重量％至40重量％，3重量％至30重量％，4量％至20重量％，5重量％至15重量％的改性玻璃颗粒的总重量，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
在方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％。例如，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量可以是：大于或等于35重量％，大于或等于40重量％，大于或等于50重量％，大于或等于60重量％，大于或等于70重量％，或者甚至大于或等于80重量％的改性玻璃颗粒的总重量。改性玻璃颗粒包含的透钙磷石和磷灰石的总量可以是：30重量％至95重量％，35重量％至90重量％，40重量％至85重量％，45重量％至80重量％，50重量％至75重量％，55重量％至70重量％，60重量％至65重量％的改性玻璃颗粒的总重量，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
在某些方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的10重量％，以及磷灰石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的15重量％。在其他方面中，改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的50重量％，磷灰石的量可以大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的3重量％。
在方面中，本文公开的磷灰石的重量百分比可以指的是羟基磷灰石的重量百分比。应理解的是，涉及改性玻璃颗粒表面上的磷灰石的量的所有范围和子范围也公开了改性玻璃颗粒表面上的羟基磷灰石的量。
不旨在受限于任何特定理论，相信在改性玻璃颗粒表面上的透钙磷石和/或磷灰石的量增加的改性玻璃颗粒可以增加改性玻璃颗粒的核酸负载能力。
改性玻璃颗粒可以包括100m2/g至300m2/g的BET表面积，例如：100m2/g至250m2/g，100m2/g至200m2/g，125m2/g至300m2/g，125m2/g至250m2/g，125m2/g至200m2/g，150m2/g至300m2/g，150m2/g至250m2/g，150m2/g至200m2/g，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。如本文所用，“BET表面积”指的是通过布鲁诺尔-埃米特-特勒理论确定的表面积。还可以通过改变粒度使得改性玻璃颗粒的表面积发生变化。不旨在受限于任何特定理论，相信具有增加的BET表面积的改性玻璃颗粒可以增加改性玻璃颗粒的核酸负载能力。
改性玻璃颗粒可以包括2nm至10nm的平均孔宽度，例如：3nm至9nm，4nm至8nm，5nm至7nm，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围(通过BET确定)。
改性玻璃颗粒可以包括大于或等于-10mV至小于或等于5mV的泽塔电势，例如：-8mV至4mV，-5mV至4mV，-2mV至3mV，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。不旨在受限于任何特定理论，相信接近中性的表面电荷(中性为0mV泽塔电势)(例如本文所述的泽塔电势范围)证实了改性玻璃颗粒的较低活性氧化物暴露。可以采用本领域常规方式(例如，电泳光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS))来测量泽塔电势。
在方面中，改性玻璃颗粒可以包括最大长度大于或等于10nm至小于或等于50nm的磷灰石和/或透钙磷石的针状晶体。不旨在受限于任何特定理论，相信改性玻璃颗粒表面上的针状晶体可以提供纳米尺寸孔用于核酸结合，这可以增加改性玻璃颗粒的核酸负载能力。可以通过本领域的常规方式(例如电子显微镜)来确定针状晶体的存在情况以及针状晶体的最大长度。
在方面中，改性玻璃颗粒可以具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10.0μm的平均最长维度，例如：0.5μm至9.0μm，0.6μm至8.0μm，0.7μm至7.0μm，0.8μm至6.0μm，1.0μm至5.0μm，2.0μm至4.0μm，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。可以通过本领域的常规方式(例如电子显微镜结合图像分析)来确定改性玻璃颗粒的平均最长维度。
如本文所述，改性玻璃颗粒可以在接触之后与核酸化合物结合。在方面中，改性玻璃颗粒可以包含核酸化合物。核酸化合物可以包括包含小于或等于1500个碱基对的DNA，包含小于或等于1000个碱基对的RNA，或其组合。包含核酸化合物的改性玻璃颗粒可以被称作生物活性玻璃载体。
在方面中，生物活性玻璃载体包含的核酸化合物浓度可以是500ng每mg生物活性玻璃载体(ng/mg)至5,000ng/mg。例如，生物活性玻璃载体包含的核酸化合物的浓度可以是：500ng/mg至5,000ng/mg，750ng/mg至3,000ng/mg，1,000ng/mg至2,500ng/mg，1,500ng/mg至2,000ng/mg，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。
改性玻璃颗粒可以在各种pH条件下与核酸化合物结合。核酸混合物可以涂覆在或者位于生物活性玻璃颗粒的表面上。合适的核酸包括任何核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，它们可以经过修饰或者未经修饰。在各种方面中，核酸化合物包括但不限于：单链或双链RNA，单链或双链DNA，单链和双链区的混合物的RNA，单链和双链区的混合物的DNA，包含DNA和RNA的混合分子(可以是单链的，或者是双链的，或者单链和双链区的混合物)。此外，核酸混合物可以指的是包含RNA或DNA或者它们两者的三链区，含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因修饰了主链的DNA或RNA。在一些方面中，核酸化合物包括核糖核酸、脱氧核糖核酸，或其衍生物。在一些方面中，核酸化合物包括核糖核酸或其衍生物。在其它方面中，核酸化合物包括脱氧核糖核酸或其衍生物。在一些方面中，核酸化合物包括干扰核糖核酸分子。
除了磷灰石和透钙磷石浓度之外，验证改性玻璃颗粒上负载的核酸的能力和容量的一些性质可以是表面电荷和表面积。可以通过泽塔电势测量直接确定表面电荷。颗粒表面上的正电荷越多，则俘获核酸化合物的负电荷的潜力越高。另一方面，核酸化合物的俘获和释放可以是可控和可逆的。承载的核酸可以在传递到目标的同时进行释放。已知的是，细胞内的pH值相比于体液而言略微酸性。因此，酸性溶液中的载体的表面负电荷可以促进核酸释放。改性玻璃颗粒表面上结合的核酸可以采用改性玻璃颗粒表面的泽塔电势的改变来进行评估。泽塔电势的改变可以表明与改性玻璃颗粒表面的配体结合。泽塔电势是改性玻璃颗粒上的表面电荷测量，并且可能对于各种pH条件下的颗粒稳定性具有影响。
本公开内容的另一个方面涉及从本文所述的玻璃粉末(例如，活性玻璃载体)或者包含玻璃粉末(或者活性玻璃载体)的载剂释放核酸化合物的方法。在方面中，方法可以包括将玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)置于细胞环境中，其中，至少部分核酸化合物在细胞环境中从玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)释放。在方面中，细胞环境可以具有3至10的pH，例如：4至9，5至8，6至7，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围，或者本文公开的任何其他pH值或条件。
在方面中，可以释放大于或等于60重量％的核酸化合物，例如：大于或等于65重量％，大于或等于70重量％，大于或等于75重量％，或者大于或等于80重量％，基于玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)中负载的核酸化合物的总重量。在细胞环境中释放的核酸化合物可以在细胞环境中被传递到目标细胞。不旨在受限于任何特定理论，相信细胞环境中从玻璃粉末(或者生物活性玻璃载体)受控释放核酸化合物可以选择性地增加细胞环境中的目标细胞中或者目标细胞附近的核酸化合物的浓度，从而增加向所需细胞环境传递核酸化合物的效率。在一些方面中，细胞环境包括以下一种或多种：昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼类、酵母、植物细胞，或其任意组合。
本公开内容的另一个方面涉及包括包含本文所述改性玻璃颗粒的玻璃粉末的载剂。载剂可以包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物治疗或作物保护载剂、免疫调节载剂或基因编辑复合载剂。载剂可以用于将本文所述的改性玻璃颗粒和/或生物活性玻璃载体传递到各种类型的细胞。根据本公开内容，任何类型的易于传递核酸的细胞类型都可以用作传输的目标。例子包括但不限于：昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼类、酵母和植物细胞。稳定的水性悬液可用作用于控制害虫的植物检疫组合物的一部分。例如，稳定的悬液可以用于保护作物免受昆虫影响，在这种情况下，核酸可以是杀虫双链RNA。采用干扰核糖核酸(RNA)分子，载剂可以用于预防和/或控制植物的虫害侵扰。包含本文技术的干扰RNA分子的组合物和组合可以用于局部应用，例如杀虫剂的形式。
在方面中，载剂的至少一部分的核酸化合物可以在pH为3至10的环境中释放，例如：4至9，5至8，6至7，或者包含这些数值中的任意两个和/或这些数值中的任意两个之间的任意范围。在方面中，可以释放大于或等于60重量％的核酸化合物，例如：大于或等于65重量％，大于或等于70重量％，大于或等于75重量％，或者大于或等于80重量％，基于载剂中负载的核酸化合物的总重量。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以在不背离所要求保护的主题的精神或范围的情况下作出各种修改和变动。因此，除了所附权利要求书及其等价形式外，所要求保护的主题不受限制。
实施例
下面将通过以下实施例来进一步阐明各种方面，其并不旨在以任意方式限制本本公开内容。
实施例1：初始玻璃粉末的制备
本文所述的示例性玻璃是硅酸盐玻璃，其包括的基础组合物包含表1所列出构成组分，以氧化物的重量百分比计。
表1
氧化物(重量％) 实施例1-1 实施例1-2
SiO2 29.5 42.8
B2O3 0 0
P2O5 19.5 9.5
Al2O3 0 0
Na2O 0 0
K2O 0 0
MgO 4.5 14.4
CaO 42.5 32.4
ZrO2 4.0 0
F- 0 0.8
退火点(℃) 650 400
采用表1所列出的原材料批料，在铂坩埚中制造玻璃。将含有原材料批料的每个坩埚放入经过预加热的炉中，并且在1100-1500℃熔化持续16小时。玻璃经过精炼以产生熔融前体玻璃，然后将其浇注成7英寸乘11英寸乘0.5英寸块体。前体玻璃在400-650℃的温度范围退火，如表1所记录的那样。玻璃采用空气喷射和球磨碾碎以形成初始玻璃粉末(前体玻璃颗粒)，标示为实施例1-1和实施例1-2。
实施例2：初始玻璃粉末的酸性磷酸盐处理
实施例1-1和实施例1-2的初始玻璃粉末通过使得初始玻璃粉末在水中0.5M酸性磷酸盐溶液中处理(60℃)进行改性以形成包含改性玻璃颗粒的玻璃粉末。在处理持续过程中，所使用的初始玻璃粉末以及实施例2的每个实例的酸性磷酸盐溶液如表2所示。
表2
实施例 初始玻璃粉末 酸性磷酸盐溶液 处理时间(天)
实施例2-1 实施例1-1 KH2PO4 3
实施例2-2 实施例1-1 NaH2PO4 3
实施例2-3 实施例1-2 KH2PO4 7
实施例2-4 实施例1-2 NaH2PO4 7
通过本领域技术人员已知的X射线衍射(XRD)分析技术，利用此类市售可得仪器例如美国马萨诸塞州布鲁克公司(Bruker Corporation,Massachusetts,United States)制造的Bruker D4 Endeavor衍射仪，来确定实施例(Ex)2-1至2-4的玻璃粉末的晶相集合的晶相和/或晶相的晶体尺寸。通常从10至100度的2θ获得光谱。对实施例2-1至2-4的玻璃粉末进行XRD分析，并且表2显示了所获得的结果。图1显示实施例2-1(110)、实施例2-2(120)、实施例2-3(130)以及实施例2-4(140)的XRD图案。形成透钙磷石(CaHPO4·2H2O)(表现为用圆圈标记的峰)和羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)(表现为用三角形标记的峰)表明在改性玻璃颗粒的表面上同时存在透钙磷石和磷灰石这两者，表明了这些改性玻璃颗粒的良好的生物相容性。采用里特沃尔德方法的XRD图案的定量相分析被用于确定改性玻璃颗粒表面处的透钙磷石和磷灰石相对于改性玻璃颗粒的总重量的重量％，并且总结见表3。
表3
通过扫描电子显微镜(SEM，具有EDS检测器的JEOL JSM-6500F)对实施例1和实施例2的玻璃组成的粒度和形貌进行分析。SEM图像如图2所示。图2A显示实施例1-1(未经处理)，图2B显示实施例2-1，图2C显示实施例2-2，图2D显示实施例1-2(未经处理)，图2E显示实施例2-3，以及图2F显示实施例2-4。实施例的平均粒度总结见表4。
表4
实施例 初始玻璃粉末 酸性磷酸盐溶液 平均粒度(μm)
实施例1-1 实施例1-1 未经处理 2.3±0.9
实施例2-1 实施例1-1 KH2PO4 2.0±0.6
实施例2-2 实施例1-1 NaH2PO4 5.9±3.1
实施例1-2 实施例1-2 未经处理 1.43±0.42
实施例2-3 实施例1-2 KH2PO4 4.1±1.2
实施例2-4 实施例1-2 NaH2PO4 1.1±0.5
通过测量样品的泽塔电势(Malvern Zetasizer Nano ZS)检查实施例1的初始玻璃粉末以及包含实施例2的改性玻璃颗粒的玻璃粉末的表面电荷。通过使得玻璃颗粒悬浮在乙醇中来制备用于测量泽塔电势的样品。测得的初始玻璃粉末以及酸性磷酸盐处理过的玻璃粉末的泽塔电势如表5所示。
表5
实施例 初始玻璃粉末 酸性磷酸盐溶液 泽塔电势(mV)
实施例1-1 实施例1-1 未经处理 0.4
实施例2-1 实施例1-1 KH2PO4 -7.2
实施例2-2 实施例1-1 NaH2PO4 1.4
实施例1-2 实施例1-2 未经处理 -16.0
实施例2-3 实施例1-2 KH2PO4 2.9
实施例2-4 实施例1-2 NaH2PO4 -0.6
通过BET分析实施例1-1、实施例2-1和实施例2-2的表面积和孔宽度。平均BET表面积和孔宽度总结见表6。如表6中的数据所示，用酸性磷酸盐溶液对初始玻璃粉末进行处理增加了BET表面积以及减小了孔宽度。
表6
实施例3：玻璃粉末上的核酸负载
在实施例3中，将核酸负载到实施例1的初始玻璃粉末以及实施例2的改性玻璃颗粒上以形成生物活性玻璃载体。具体来说，将具有195个碱基对的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)负载到实施例1-1、实施例2-1、实施例2-2、实施例1-2、实施例2-3和实施例2-4上以确定DNA有效载荷估计和结合率。GADPH作为人工DNA替代物，模拟了典型的RNAi片段长度。通过如下方式制备实施例3的GADPH负载的玻璃粉末：将5mg的实施例1或实施例2的玻璃粉末(5mg/40μL乙醇)与GADPH溶液(6,000ng/60μL H2O)结合，通过涡旋充分混合，以及然后在室温下的配有平缓振荡器(300rpm)的微管中孵育30分钟。样品以14,000rpm离心5分钟得到10μL的上清液样品，用于Qubit-HS-dsDNA试验进行DNA定量分析。表7记录了实施例3-1至3-6的DNA有效载荷和结合率。如表7中的数据所示，用酸性磷酸盐溶液对初始玻璃粉末进行处理增加了包含改性玻璃颗粒的玻璃粉末上的GADPH负载量。
表7
实施例4：来自生物活性玻璃载体的核酸洗脱
在形成了实施例3中的生物活性玻璃载体之后，在条件变化的情况下评估实施例3-1至3-4的洗脱效率。首先，在定量分析之前，生物活性玻璃载体离心以去除所有的上清液。根据表8和表9，将300μL的磷酸盐缓冲液添加到10mg的每个生物活性玻璃载体。溶液通过涡流再次悬浮，并采用平缓振荡器(300rpm)在室温孵育30分钟。溶液以14,000rpm离心5分钟去除所有的上清液，用于Qubit HS dsDNA试验进行DNA定量分析(10μL样品进行试验)。在表8和表9中记录的洗脱效率是释放的核酸的百分比(相对于实施例3中负载的核酸总量而言)。作为对照，还将生物活性玻璃载体添加到水和NaCl，但是没有检测到核酸释放。
表8
表9
实施例 玻璃粉末 溶液浓度(mM) 溶液pH 洗脱效率(％)
实施例4-16 实施例3-3 50 5.4 0
实施例4-17 实施例3-3 50 6.4 41.3
实施例4-18 实施例3-3 50 7.4 74.4
实施例4-19 实施例3-3 50 8.4 51.9
实施例4-20 实施例3-3 50 9.4 74.8
实施例4-21 实施例3-3 200 5.4 46.6
实施例4-22 实施例3-3 200 6.4 69.6
实施例4-23 实施例3-3 200 7.4 77.9
实施例4-24 实施例3-3 200 8.4 56.0
实施例4-25 实施例3-3 200 9.4 76.3
实施例4-26 实施例3-3 500 5.4 51.4
实施例4-27 实施例3-3 500 6.4 70.7
实施例4-28 实施例3-3 500 7.4 78.7
实施例4-29 实施例3-3 500 8.4 57.8
实施例4-30 实施例3-3 500 9.4 76.8
实施例4中的核酸负载以及实施例5中的核酸洗脱的结果证实了玻璃粉末用于核酸转移和传递的潜力。具体来说，观察到如本文所述用磷酸盐处理初始玻璃粉末可以增强中性条件下的核酸负载效率容量。此外，可以在30分钟或者更短的洗脱时间内在略微酸性缓冲体系中释放俘获的核酸。
实施例5：生物活性玻璃载体的核酸酶抗性
对实施例3的生物活性玻璃载体的核酸酶抗性进行评估。具体来说，实施例3的负载了核酸的玻璃粉末经受苛刻DNase挑战条件以模拟某些生物状态下的核酸酶攻击。首先，在定量分析之前，生物活性玻璃载体离心以去除所有的上清液。将180μL的H2O添加到5mg的实施例3的负载了核酸的玻璃粉末，之后添加20μL的10X TURBO DNase缓冲液和2μL的TURBODNase(4个单位，其中，1个单位是在37℃下10分钟内使得1μg的DNA分解所需的酶的量)。得到的混合物在37℃孵育30分钟。在混合物孵育之后，混合物在75℃加热10分钟，冷却到室温，以及以15,000rpm离心10分钟。去除每个样品的上清液。然后样品用200μL H2O冲洗，以15,500rpm离心10分钟，并且去除所有的上清液。通过qPCR采用量化确定来对回收的DNA进行检查。通过qPCR计算保护率并且总结见表10。
表10
实施例 生物活性玻璃载体 酸性磷酸盐溶液 保护率(％)
比较例5A 比较例3A 未经处理 3.1
实施例5-1 实施例3-1 KH2PO4 1.8
实施例5-2 实施例3-2 NaH2PO4 9.9
比较例5B 比较例3B 未经处理 22.6
实施例5-3 实施例3-3 KH2PO4 18.6
实施例5-4 实施例3-4 NaH2PO4 27.4
还通过电泳采用完整性确认来检查回收的DNA。DNA量和完整性与其对应的DNase处理过的和未处理的样品进行对比。电泳图像如图3所示。DNA输入302、DNA对照304、梯状条带(ladder)306、实施例3-3 308、实施例5-3 310、实施例3-4 312、实施例5-4 314、梯状条带(ladder)316、实施例3-1 318、实施例5-1 320、实施例3-2 322以及实施例5-2 324如图3所示。195bp的相关DNA片段在图3中被框出并标记。
实施例6：生物活性玻璃载体的细胞内在化
通过体外测试评估实施例1-2(未经处理)、实施例2-3(KH2PO4处理)和实施例2-4(NaH2PO4P处理)的玻璃粉末的细胞摄取效率和生物相容性。具体来说，实施例1-2、实施例2-3和实施例2-4负载荧光标记的dsRNA以形成生物活性玻璃载体。与生物活性玻璃载体共培养48小时后，在培养的昆虫细胞sf9内观察荧光标记的dsRNA。作为对照，在没有玻璃粉末的情况下，细胞培养dsRNA。图4显示荧光图像和合并的共焦图像，证实了生物活性玻璃载体在细胞中的内在化。可以在荧光显微镜下观察到dsRNA和生物活性玻璃载体的内在化，而在单独采用dsRNA的情况下没有在细胞内检测到dsNRA信号。由于用酸性磷酸盐溶液处理的玻璃粉末具有更高的核酸有效载荷，预期相对于未经处理的实例而言更多量的dsRNA被承载进入到目标细胞中。
除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法不应理解为其步骤需要按具体顺序进行，或者要求使任何设备具有特定取向。因此，如果方法权利要求没有实际叙述其步骤要遵循的顺序，或者任何设备权利要求没有实际叙述各组件的顺序或取向，或者权利要求书或说明书中没有另外具体陈述步骤限于具体顺序，或者没有叙述设备组件的具体顺序或取向，那么在任何方面都不应推断顺序或取向。这同样适用于任何可能的未明确表述的解释依据，包括：关于设置步骤、操作流程、组件顺序或组件取向的逻辑；由语法结构或标点获得的一般含义；以及说明书所述方面的数量或种类。
将所有揭示的范围理解为包含并提供对陈述了任何和所有子范围或由每个范围所包含的任何和所有单个值的权利要求的支持。例如，应该将陈述的1至10的范围视作包含并提供对陈述了介于和/或包含最小值1和最大值10之间的任何和所有子范围或个别值的支持；也就是说，所有的子范围开始于最小值1或更大和终止于最大值10或更小(例如，5.5至10，2.34至3.56等)，或者1至10的任意值(例如，3、5.8、9.9994等)。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并允许将同一范围至少被分解成对半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文所讨论的每个范围可以容易地分解成靠下的三分之一、中间的三分之一和靠上的三分之一等。本领域技术人员还会理解的是，所有的语言，例如“最高至”、“至少”、“大于”、“小于”等包括了所陈述的数字，并且涉及可以后续分解成上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员会理解的是，范围包括了每个单独成员。因此，例如，具有1-3层的组指的是具有1层、2层或3层的组。类似地，具有1-5层的组指的是具有1层、2层、3层、4层或5层的组，以此类推。
附图应解读为显示了以成比例绘制的一个或多个方面和/或没有成比例绘制的一个或多个方面。这意味着，附图可以解读为，例如，显示了如下情况：(a)所有都成比例绘制；(b)任意东西都没有成比例绘制；或者(c)一个或多个特征成比例绘制以及一个或多个特征没有成比例绘制。因此，附图可以用于提供对于单独或相对于彼此叙述的任何所示特征的尺寸，比例和/或其他尺寸的支持。此外，所有此类尺寸、比例和/或其他尺度理解为在任一方向上从0-100％变化，因此为陈述了此类值的权利要求或者可由此类值形成的任何和所有范围或子范围提供支持。
权利要求中所陈述的术语应当通过参考广泛使用的一般词典和/或相关技术词典中的相关条目，本领域技术人员通常理解的含义等来确定它们的普通和惯用含义，并且要理解的是，权利要求书的术语具有这些来源中的任何一个或其组合所赋予的最广泛的含义(例如，两个或多个相关的词典条目应该被组合以提供条目组合的最广泛含义等)，仅受以下例外的约束：(a)如果一个术语的使用方式比其普通和习惯含义更广泛，则该术语应赋予其普通和习惯含义加上额外的扩展含义，或(b)如果术语已明确定义通过如下方式进行了陈述具有不同含义，所述术语是“如本文件中使用的术语应该表示”或类似语言(例如，“这个术语的意思是”，“这个术语定义为”、“出于本公开内容的目的，这个术语应该表示”等)。对具体例子的引用，使用“即”，使用用语“技术”等并不意味着引用例外(b)或以其他方式限制所述权利要求术语的范围。除了适用例外情况(b)的情况外，本文件中所含的任何内容均不应视为放弃权利要求或对权利要求范围的否认。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)都具有本文技术所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。还会理解的是，术语(例如常用字典中定义的那些)应当理解为与其在本申请和相关领域中的定义一致，并且除非本文中有另外的定义，否则不应理解为理想化或者完全形式化的含义。虽然下文没有明确定义，但是此类术语应该根据它们的常用含义进行解读。
另外，对于按照马库什群(Markush group)描述本公开内容的特征或方面的情况，本领域技术人员将会认识到，本公开内容还可由此按照所述马库什群中的任意单独成员或者成员的子群描述。
除非上下文另有明确表述，否则旨在认为本文所述的本文技术的各种特征可以以任意组合使用。此外，在一些方面中，本公开内容还考虑了可以排除或者省略本文所述的任意特征或者特征组合。解释来说，如果说明书陈述了联合体包括组分A、B和C，那么它具体地旨在认为A、B或C中的任意或其组合可以被省略或者单独放弃或其任意组合。
除非另有明显说明，否则所有具体的方面、特征和术语旨在同时包括所陈述的方面、特征或术语及其生物等价性质。
本文所涉及或者引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开物它们的全文都通过引用结合如本文，包括所有的附图和表格，所结合的程度是它们没有与本说明书的教导不一致。

Claims (42)

1.一种玻璃粉末，其包含多个改性玻璃颗粒，
以重量百分比(重量％)计，所述多个改性玻璃颗粒包含：
大于或等于20重量百分比(重量)％至小于或等于75重量％SiO2；
大于或等于3摩尔％至小于或等于25摩尔％P2O5；
大于或等于2重量％至小于或等于50重量％CaO；以及
所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％，其中，所述多个改性玻璃颗粒在接触之后与核酸化合物结合。
2.如权利要求1所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％B2O3。
3.如权利要求1或2所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％Al2O3。
4.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于30重量％Na2O。
5.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于10重量％K2O。
6.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于20重量％MgO。
7.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于10重量％ZrO2。
8.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含大于0重量％至小于或等于5重量％F。
9.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的10重量％，以及磷灰石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的15重量％。
10.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的50重量％，以及磷灰石的量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的3重量％。
11.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的60重量％。
12.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于100m2/g至小于或等于300m2/g的BET表面积。
13.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于2纳米(nm)至小于或等于10nm的平均孔宽度，这是通过BET确定的。
14.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包括大于或等于-10mV至小于或等于5mV的泽塔电势。
15.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒的表面包括最大长度大于或等于10nm至小于或等于50nm的针状晶体。
16.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度。
17.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：
大于或等于25重量％至小于或等于50重量％SiO2；
大于或等于8摩尔％至小于或等于25摩尔％P2O5；以及
大于或等于30重量％至小于或等于50重量％CaO。
18.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：
大于或等于25重量％至小于或等于35重量％SiO2；
大于或等于15摩尔％至小于或等于25摩尔％P2O5；
大于或等于3重量％至小于或等于6重量％MgO；
大于或等于38重量％至小于或等于48重量％CaO；以及
大于或等于2重量％至小于或等于6重量％ZrO2。
19.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒包含：
大于或等于38重量％至小于或等于48重量％SiO2；
大于或等于5摩尔％至小于或等于15摩尔％P2O5；
大于或等于10重量％至小于或等于20重量％MgO；以及
大于或等于28重量％至小于或等于38重量％CaO。
20.如任意前述权利要求所述的玻璃粉末，其中，所述多个改性玻璃颗粒还包含核酸化合物。
21.如权利要求20所述的玻璃粉末，其中，核酸化合物包括：包含小于或等于1500个碱基对的脱氧核糖核酸(DNA)，包含小于或等于1000个碱基对的核糖核酸(RNA)，或其组合。
22.如权利要求20或21所述的玻璃粉末，其中，核酸化合物的浓度大于或等于500纳克每毫克(ng/mg)至小于或等于5,000ng/mg，基于所述多个改性玻璃颗粒的总重量。
23.一种形成玻璃粉末的方法，该方法包括：
将玻璃加工成前体玻璃颗粒，其中，前体玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度；以及
用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理，其中：
处理溶液包含磷酸盐；以及
处理形成改性玻璃颗粒；
其中：
所述多个改性玻璃颗粒的表面包含的透钙磷石和磷灰石的总量大于或等于改性玻璃颗粒的总重量的30重量％；以及
所述多个改性玻璃颗粒在接触之后与核酸化合物结合。
24.如权利要求23所述的方法，其中，处理溶液的pH大于或等于2.5至小于或等于4.5。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中：
处理包括形成包含前体玻璃颗粒和处理溶液的混合物；以及
混合物中的磷酸盐浓度大于或等于0.1摩尔(M)至小于或等于1M。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，处理溶液包含硫酸钠、硫酸钾，或其组合。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，处理包括：
形成包含前体玻璃颗粒和处理溶液的混合物；以及
在40℃至80℃的温度加热混合物持续加热持续时间。
28.如权利要求27所述的方法，其中，加热持续时间大于或等于1天。
29.一种形成生物活性玻璃载体的方法，该方法包括：
将玻璃加工成前体玻璃颗粒，其中，前体玻璃颗粒具有大于或等于0.5微米(μm)至小于或等于10μm的平均最长维度；以及
用处理溶液对前体玻璃颗粒进行处理，其中：
处理溶液包含磷酸盐；以及
处理形成改性玻璃颗粒；
将所述多个改性玻璃颗粒与核酸化合物接触以形成混合物；以及
在核酸化合物与所述多个改性玻璃颗粒非共价结合的条件下对混合物进行孵育，形成生物活性玻璃载体。
30.如权利要求29所述的方法，其中，混合物包含的核酸化合物浓度是大于或等于500ng每mg的所述多个改性玻璃颗粒(ng/mg)至小于或等于10,000ng/mg。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中，在大于或等于20℃至小于或等于40℃的温度对混合物进行孵育。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中，对混合物进行大于或等于10分钟的时间段的孵育。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中，对混合物进行孵育包括以大于或等于50％的负载效率将核酸化合物负载到所述多个改性玻璃颗粒上。
34.如权利要求29至33中任一项所述的方法，其中，生物活性玻璃载体包含的核酸化合物浓度是大于或等于500ng每mg的生物活性玻璃载体(ng/mg)至小于或等于5,000ng/mg。
35.一种载剂，其包含如权利要求1至22中任一项所述的玻璃粉末。
36.如权利要求35所述的载剂，其中，载剂包括：药物传递载剂、基因传递载剂、组织再生载剂、作物治疗或作物保护载剂、免疫调节载剂或基因编辑复合载剂。
37.如权利要求35或36所述的载剂，其中，至少一部分的核酸化合物在大于或等于3至小于或等于10的pH释放。
38.如权利要求37所述的载剂，其中，至少60重量百分比的核酸化合物得到释放，基于载剂中负载的核酸化合物的总重量。
39.一种从根据权利要求20-22或35-38中任一项的玻璃粉末释放核酸化合物的方法，该方法包括：
将玻璃粉末置于细胞环境中，其中，至少一部分的核酸化合物在细胞环境中从玻璃粉末释放。
40.如权利要求39所述的方法，其中，至少一部分的核酸化合物在大于或等于3至小于或等于10的pH释放。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中，至少60重量百分比的核酸化合物得到释放，基于玻璃粉末中负载的核酸化合物的总重量。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中，细胞环境包括以下一种或多种：昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼类、酵母、植物细胞，或其任意组合。
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