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CN119424671A - 含糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物 - Google Patents

含糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物 Download PDF

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CN119424671A
CN119424671A CN202310961666.2A CN202310961666A CN119424671A CN 119424671 A CN119424671 A CN 119424671A CN 202310961666 A CN202310961666 A CN 202310961666A CN 119424671 A CN119424671 A CN 119424671A
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antibody
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drug conjugate
mmol
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CN202310961666.2A
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韩念和
安德强
李建石
缪中义
宋立伟
朱红菊
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Original Assignee
Newbio Therapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

本发明涉及含糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物。具体而言，本发明涉及糖基吡啶型连接子及含有其的抗体药物偶联物以及其制备方法和医药用途，特别是在制备治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的药物中的用途。本发明通过特定的糖基吡啶型连接子增强抗体药物偶联物的亲水性，并控制其在细胞内酶促作用下释放活性药物。

Description

含糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物
技术领域
本发明涉及一种新型糖基吡啶型连接子以及含有其的抗体药物偶联物，及其制备方法和在制备治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的药物中的用途。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugates,ADCs)是一类新型靶向治疗药物，主要应用于癌症、自免疫等治疗领域。其基本设计思想最早源于保罗﹒埃尔利希(PaulEhrlich)于1913年首次提出的“魔术子弹”(magic bullet)及药物靶向输送(drugtargeting)概念，即通过适当载体将药物靶向输送到疾患部位。然而，受制于抗体及高活性细胞毒性药物技术的制约，直到2000年第一个用于治疗急性髓样白血病(AML)的抗体药物偶联物(MylotargTM)才被FDA批准上市。到目前为止已有12款ADC药物相继获批上市，标志着抗体药物偶联物在肿瘤治疗领域的应用已进入了快速发展阶段。
抗体药物偶联物通常由三部分组成：抗体或其它类型配体，高活性细胞毒性药物，和将抗体与细胞毒性药物偶联起来的连接子。其作用机制如下：抗体特异性地识别细胞表面抗原并与之结合；形成的结合物以内吞的方式进入细胞内，同时将高活性细胞毒性药物带入；抗体被酶解或连接子自身断裂，高活性细胞毒性药物以适当的形式释放出来，杀死目标细胞。
基于细胞毒性药物在细胞内的释放机制，连接子可分为不可断裂连接子和可断裂连接子。目前已上市的ADC药物绝大部分均采用可断裂连接子。可断裂连接子按照断裂机制，又可分为以下几种主要类型：酸断裂机制(如腙类)，半胱氨酸/谷胱甘肽断裂机制(如二硫键类))和酶断裂机制(如肽类)。其中，酶断裂机制连接子以其稳定性和断裂机制专一性受到青睐。
细胞毒性药物具有一定的疏水性，将其偶联到抗体上通常会导致抗体药物偶联物的疏水性增强(相对于抗体而言)。这种疏水性增强不仅容易导致ADC分子聚集(产生多聚体)，而且导致ADC在体内清除速度加快。为降低ADC药物的疏水性，通常采用亲水性的连接子，用以降低或抵消细胞毒性药物的疏水性对ADC药物带来的不利影响。
为满足ADC药物领域的发展需求，本领域迫切需要开发具有新型结构、断裂机制及亲水性的连接子，从而构建具有更好成药性的ADC药物。
发明内容
本发明旨在提供一种新型的糖基吡啶型连接子，并基于这种连接子构建抗体药物偶联物。
本发明人经过多年的深入研究，开发了一种新型的糖基吡啶型连接子。基于这种连接子构建的ADC药物与细胞表面抗原结合并被内吞至细胞内后，可在β-葡糖苷酸酶作用下降解并释放出细胞毒性药物，达到杀伤细胞的作用。这种连接子具有良好的化学稳定型，在体内循环过程中不会断裂从而增加脱靶毒性。同时，这种连接子亲水性良好，可以大大提高ADC药物的亲水性及随之带来的体内代谢稳定性。这种连接子技术具有普适性，可以应用到绝大多数ADC药物上，因而具有广阔的应用前景。
具体地，本发明提供一种含有“糖基吡啶型连接子”的抗体药物偶联物，这种糖基吡啶型连接子结构中含有一个糖基(Su)取代吡啶基团。吡啶基团具有两个可偶联基团，其中之一可通过其它基团或直接偶联到抗体或其它类型配体上，另一个偶联基团可通过其它基团或直接与细胞毒性药物相连(如下式所示)。
所产生的抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，糖苷酶(Glycoside Hydrolases,GH)选择性的水解Su-O基团失去糖分子，吡啶环上残余的氧负离子与吡啶环发生电子重拍，将其对位连接的药物以活性药物的方式释放出来产生功效(见如下反应式)。
构建ADC药物的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体；可与抗原结合的抗体片段；抗体Fc融合蛋白；蛋白；或者其它类型的配体。药物是高活性药物，包括但不局限于，美登素类(Maytansinoids)、耳抑素肽类(Auristatins)、卡奇霉素类(Calicheamicins)、阿霉素类(doxorubicins)、苯并二吡咯类抗生素类(Duocarmycins and CC-1065)、吡咯并苯二氮卓二聚体类(PBD dimers)、喜树碱类(camptothecins)、Tubulysin类、鹅膏覃碱类(Amanitins)。
与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的亲水性增加，体内循环稳定性得到极大程度提高，从而大幅提升了产品的成药性。
因此，本发明的一个目的是提供一种式I所示的抗体药物偶联物，
或其药学上可接受的盐或水合物，
其中，
L是抗体、抗体片段、或其它类型配体；
A是连接子片段，同时与L和G相连；
G是糖基取代吡啶结构，如式II所示：
其中，
Su是一个糖分子；
每个R各自独立地选自氢、CN、卤素、NO2和C1-C4烷基；
X和Y各自独立地选自-CR2R3-、-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
Q选自-NR6-或-O-；
R1选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢或C1-C4烷基；
x、y、z各自独立地选自0或1；
g选自1或2；
W是可选的自杀性连接子；
w选自0或1；
D是药物；
p选自1至4的整数；
q选自1至8的整数。
在一个实施方案中，根据本发明所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式III所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、W、D、Su、x、y、z、w如式I中所定义。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式IV或式V所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、W、D、x、y、z、w如式I中所定义。
在另一个实施方案中，根据本发明所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式VI或式VII所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、D、x、y、z如式I中所定义。
在一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，x为0；
y为1；
Y选自-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，x为1；
y为1；
X选自-CR2R3-；
Y选自-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
R2和R3各自独立地选自氢或C1-C4烷基，优选氢；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，R1选自C1-C6亚烷基，优选C1-C6直链亚烷基，更优选C2-C4直链亚烷基；z为1。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，Q为-NR6-；R6各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，每个R各自独立地选自氢、卤素、C1-C4烷基，优选氢。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，G具有如下所示结构：
其中，R7选自氢，C1-4烷基例如甲基，和水溶性基团例如聚乙二醇。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，g是1。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，A为同时与抗体和G共价连接的连接子。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，A选自以下结构：
其中，R8选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R9选自H或卤素；
R10选自C1-C4烷基；
R11和R12各自独立地选自C1-C6亚烷基。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，L为人源化、嵌合或全人化的抗体或抗体片段，抗体Fc融合蛋白等配体。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，L为针对细胞表面受体或肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段、抗体Fc融合蛋白或其它类型配体。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，L为人源化抗CD30单克隆抗体或人源化CD79b单克隆抗体。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，L为Ab1，其具有SEQ ID NO：1所示的重链和SEQ ID NO：2所示的轻链。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，L为Ab2，其具有SEQ ID NO：3所示的重链和SEQ ID NO：4所示的轻链。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，D为抗肿瘤药物、治疗自身免疫疾病的药物或抗炎症的药物，所述抗肿瘤药物例如微管蛋白抑制剂、DNA烷基化试剂、DNA小沟结合剂、DNA拓扑异构酶抑制剂。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI、VII中，D为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、SN-38或依喜替康。
本发明另一个目的是提供一种式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
A’是连接子片段；
每个R各自独立地选自氢、CN、卤素、NO2和C1-C4烷基；优选氢、卤素、C1-C4烷基，更优选氢；
X和Y各自独立地选自-CR2R3-、-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
Q选自-NR6-或-O-，优选-NR6-；
R1选自C1-C6亚烷基或骨架内含O的C1-C6亚烷基，优选C1-C6亚烷基；
R2和R3各自独立地选自氢或C1-C4烷基，优选氢；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基；
R6选自氢或C1-C4烷基；
x为0或1；
y为0或1，优选1；
z为0或1，优选1；
D是药物分子；
p选自1至4的整数，优选1或2。
在一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中A’选自以下结构：
其中，
R8选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R9选自H或卤素；
R10选自C1-C4烷基；
R11和R12各自独立地选自C1-C6亚烷基。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构：
其中，R5、R6和D如式(A)中所定义。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中，D为抗肿瘤药物、治疗自身免疫疾病的药物或抗炎症的药物，所述抗肿瘤药物例如微管蛋白抑制剂、DNA烷基化试剂、DNA小沟结合剂、DNA拓扑异构酶抑制剂；优选地，D为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、SN-38或依喜替康。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构：
本发明还提供一种药物组合物，其含有根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI或VII所示的抗体药物偶联物以及药学上可接受的载体。
本发明还提供根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI或VII所示的抗体药物偶联物或者含有其的药物组合物在制备治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的药物中的用途。
本发明还提供根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI或VII所示的抗体药物偶联物或者含有其的药物组合物，其用于治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病。
本发明还提供一种治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的方法，其包括向受试者中施用有效量的根据本发明所述的式I、III、IV、V、VI或VII所示的抗体药物偶联物或者含有其的药物组合物。
术语说明
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至6个碳原子的烷基、含有1至4个碳原子的烷基或含有1至3个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“亚烷基”指二价烷基，其中烷基如上所定义，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C1-20亚烷基)。所述亚烷基优选具有1至12个碳原子的亚烷基(即C1-12亚烷基)，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基(即C1-6亚烷基)，进一步优选含有1至4个碳原子的亚烷基(即C1-6亚烷基)。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1,1-亚乙基(-CH(CH3)-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2)-、1,1-亚丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)和1,4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点上被取代，取代基可以选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个。
术语“烯基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上定义的烷基，优选含有2至4个碳原子的烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“炔基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的如上定义的烷基，优选含有2至4个碳原子的炔基或优选含有3至4个碳原子的炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基等。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基、四氢苯并呋喃基、四氢苯并噁唑基、四氢苯并异噁唑基、环戊并噻吩基、四氢苯并噻唑基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含4至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含7至12个环原子，其中1～4个是杂原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、吡喃基等，优选1、2、5-噁二唑基、吡喃基或吗啉基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基。杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。更优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，含1至3个杂原子；更优选为5元或6元，含1至2个杂原子；优选例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，优选为咪唑基、噻唑基、吡唑基或嘧啶基、噻唑基；更有选吡唑基或噻唑基。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“可药用盐”或“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
“载体”指的是不会对生物体产生明显刺激且不会消除所给予化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。
本文所述术语“药物/抗体比值(Drug/Antibody Ratio,DAR)”是指每个抗体分子上偶联的药物个数。因为抗体药物偶联物样品含有多种不同DAR值的组分，因此“平均DAR值”和“DAR值分布”这两个概念更适合用来描述抗体药物偶联物的组成。平均DAR值是一个样品中总药物分子数与总抗体数的比值，而DAR值分布是指样品中各不同DAR值组分的含量分布。
如本文所用，术语“抗体”或“抗体单元”在其所属的范围内，包括抗体结构的任何部分。这一单元可以结合、反应性关联、或者络合一个受体、抗原，或者靶向细胞群体具有的其他受体单元。抗体可以是任何蛋白或蛋白类分子，它可以结合、络合、或者与待治疗或生物改造的细胞群体的一部分发生反应。
本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够(最好专一性地)与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知或预知的具有功能性的)。肿瘤相关因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。与本发明中所述抗体结合的抗原可以是上述分类中一个或一个子集，而其它的子集则包含其它的具有特殊性质的分子/抗原(与目标抗原相比)。
应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性地表达在一种或多种癌症细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言，这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。
肿瘤相关抗原包括，但不局限于，以下列出的肿瘤相关抗原(1)-(36)。为方便起见，为业内所熟知的抗原相关信息标示如下，包括名称，其它名称，基因库登录号。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％、80％、85％、90％、或95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。
肿瘤相关抗原(1)-(36)：
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)；
(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)；
(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)；
(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号AF361486)；
(5)MPF(MPF，MSLN，SMR、巨核细胞强化因子，间皮素，Genbank登录号NM_005823)；
(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载运体家族34(磷酸钠)成员2，II型钠依赖型磷酸转运子3b，Genbank登录号NM_006424)；
(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白重复序列(1型和类1型)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008016Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体，Genbank登录号AY275463)；
(10)MSG783(RNF124,假拟蛋白FLJ20315,Genbank登录号NM_017763)；
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，六次跨膜的前列腺上皮抗原2，六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登录号AF455138)；
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电势阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)；
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体)或Hs.73792,Genbank登录号M26004)；
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29,Genbank登录号NM_000626)；
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有磷酸酶锚定蛋白1a的SH2结构域),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登录号NM_030764)；
(17)HER2(ErbB2,Genbank登录号M11730)；
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登录号M18728)；
(19)MDP(DPEP1,Genbank登录号BC017023)；
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登录号AF184971)；
(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登录号AF229053)；
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登录号NM_004442)；
(23)ASLG659(B7h,Genbank登录号AX092328)；
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)；
(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3,Genbank登录号AF116456)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型,Genbank登录号AK026467)；
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α，能够与Igβ(CD79B)发生共价作用并在表面与Ig M分子形成复合物，转导参与B细胞分化信号的B细胞特异性蛋白，Genbank登录号NP_001774.1)；
(29)CXCR5(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤受体1，被CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用，在HIV-2感染以及可能在艾滋病，淋巴瘤，骨髓瘤，和白血病中发挥作用，Genbank登录号NP_001701.1)；
(30)HLA-DOB(MHCII类分子的Beta亚基(Ia抗原)，其结合肽并将其呈递到CD4+T淋巴小细胞，Genbank登录号NP_002111.1)；
(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经新生，其缺陷可能导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况，Genbank登录号NP_002552.2)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2，Genbank登录号NP_001773.1)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复的I型膜蛋白(LRR)家族，调节B细胞活化和凋亡，功能的丧失与系统性红斑狼疮患者疾病活动增加有关，Genbank登录号NP_005573.1)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，推定的免疫球蛋白Fc结构域受体，包含C2型类Ig样和ITAM结构域，可能在B淋巴细胞分化中起作用，Genbank登录号NP_443170.1)；
(35)IRTA2(易位相关免疫球蛋白超家族受体2，推定的免疫受体，可能在B细胞发育和淋巴瘤产生中起作用；由易位导致的基因失调发生在一些B细胞恶性病上，Genbank登录号NP_112571.1)；
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖，与生长因子的EGF/调蛋白(heregulin)家族和卵泡抑素(follistatin)相关，Genbank登录号AF179274)。
如本文所用，“药物”或者代号“D”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括诊断、治愈、缓解、治疗、预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典、正式全国处方集、或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。随着新型药物不断被发现和发展，本专利规定这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的前药。
优选地，药物是指：用于癌症治疗的细胞毒性药物；具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如毒素，如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经原生长因子、血小板衍生生长因子、组织型纤酶溶原生长因子，以及生物反应调节制剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子、或其它生长因子。
一方面，药物是美登素(maytansine)或类美登素(maytansinoids)。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖(Science 1975，189，1002-1005；US5208020)。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了美登素、类美登素、以及在抗体药物偶联物应用中经常利用的三个类美登素分子结构。
合成类美登素的主要原料是美登醇(maytansinol)，主要由安丝菌素(ansamitocins)水解得到。安丝菌素可以通过发酵的方式制备。安丝菌素衍生物(Ansamitocin derivatives，WO 2012/061590)和丙氨酰基美登醇(Alaninylmaytansinol，US2012/0121615)据报道也可作为抗体药物偶联物的药物“弹头”(这两类分子结构如下所示)。
另一方面，药物是奥瑞他汀类(auristatins)药物。奥瑞他汀类药物是海兔毒素10(dolastatin 10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽(US 7498298)。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10、奥瑞他汀PE、奥瑞他汀E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的奥瑞他汀类化合物，单甲基奥瑞他汀E(MMAE)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物部分。
另一方面，药物是Tubulysins类药物。Tubulysins是从粘细菌中提取出来的一类天然产物，能有效抑制微管蛋白的聚合，因此具有抗细胞有丝分裂的活性，其中TubulysinD的活性最好。Tubulysin D是一个复杂的四肽化合物，其结构中含有O-酰基/N,O-缩醛官能团，因此在酸性和碱性条件下都不稳定。US2011/0021568和US2013/0224228分别披露了一系列tubulysin的类似物，其结构中去除了以上不稳定官能团，同时又具有高细胞活性。
另一方面，药物是卡奇霉素类(calicheamicins)药物。卡奇霉素类药物是抗肿瘤抗生素，通过结合DNA小沟并促使特定位点双螺旋DNA断裂，而导致细胞凋亡。卡奇霉素类药物具有体外亚皮克摩尔级别的高活性，但是它们的低治疗指数排除了临床应用前景。然而这种高活性却是它们成为抗体药物偶联物的理想候选药物(如吉妥单抗和InotuzumabOzogamicin)。
另一方面，药物是阿霉素类(doxorubicins)。阿霉素能够嵌入DNA双螺旋结构从而阻断DNA复制，因此被用作化疗药物。但是由于阿霉素类较低的细胞毒性(针对人源癌细胞系，半数抑制浓度为0.1-0.2微摩尔，而用于抗体药物偶联物的细胞毒性药物活性通常为亚纳摩尔级)，导致其在抗体药物偶联物中的应用并不普遍。
另一方面，药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins、CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one，CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one，CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性。
另一方面，药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBD dimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣(Biochemistry 2008，47，11818-11829)。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8’的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性(WO 2011/130616)。PBD二聚体被认为是可以产生序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5′-Pu-GATC-Py-3′链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。
另一方面，药物是喜树碱类毒素(Camptothecins,CPT)。喜树碱及其衍生物作为拓朴异构酶(TOP1)抑制剂选择性地捕获TOP1裂解复合体，成为了极具潜力的抗癌药物。喜树碱衍生物如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan；CPT-11)、贝洛替康(belotecan)，已被批准用于治疗非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌。此类化合物作为弹头也成功地被应用到ADC药物设计中，如SN-38，伊喜替康(Exatecan，DX-8951f)和DXd等。
另一方面，药物是鹅膏覃碱类(amanitin)。Amanitin是由一种毒菌类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)所生成的具有双环结构的八肽毒素，该毒素可与RNA聚合酶II(或B)进行特异性结合而进行非竞争性抑制，从而抑制磷酸二酯键的形成(RNA链合成的起始和延长，进而抑制催化合成mRNA，导致细胞凋亡。RNA聚合酶II催化的转录对于细胞功能至关重要，因此α-amanitin可以独特的机制同时杀伤分裂的细胞和静止的细胞。这一特性使其成为一类具有吸引力的ADC药物候选细胞毒性药物。
另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物，包括但不限于免疫激动剂类(如TLR7/8、Sting激动剂)、抗生素类、激素类等。
本文所述术语“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”是指一种具有双官能团或多官能团的分子，可分别与蛋白/抗体分子和药物分子反应，因此做为一种“桥梁”将蛋白/抗体与药物分子连接起来。按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子(non-cleavable linker)和可断裂连接子(cleavable linker)。
不可断裂连接子是一种相对比较稳定的连接子，其结构很难在体内环境下降解断裂。对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物、连接子、和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystander effect)(Bioconjugate Chem.2010，21，5-13)。
常见的连接子例如MC连接子和MCC连接子等，如下所示。
可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。
化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值、谷胱甘肽浓度等。
对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH 7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙、碳酸酯、缩醛、缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。
对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。
酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常在细胞外不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子例如vc连接子等。
自杀式连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自杀式连接子的作用机制是：当可断裂连接子在合宜的条件下断裂后，自杀式连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子如对氨基苄醇类(PAB)等。
本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、含糖基吡啶型片段的连接子和药物组成，所述糖基吡啶型连接子属于酶可断裂连接子。一方面，本发明提供的抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，结合物内吞进入细胞内，药物以活性形式释放到细胞内。
另一方面，本发明提供的抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，发生功效；或者在细胞外释放药物，药物渗入细胞内产生功效。
本发明的药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒和溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。
本领域技术人员熟知，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用特定化合物的活性、病人的年龄、病人的体重、病人的健康状况、病人的行为、病人的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等。另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供了一种含有糖基吡啶型连接子片段的抗体药物偶联物。所述的糖基吡啶型连接子片段具有良好的亲水性，从而可以大大提高抗体药物偶联物的亲水性，降低配体药物偶联物的聚体生成，改善抗体药物偶联物在体内的PK特性。
2、本发明提供的含有糖基吡啶型连接子片段，适用于绝大部分抗体药物偶联物的构建，具有普适性，因此具有广泛的应用前景。
附图说明
图1A-图1K为本发明抗体药物偶联物的疏水作用色谱(HIC)图。其中，图1A-图1E分别对应抗体药物偶联物Ab1-LD-02、Ab1-LD-10、Ab1-LD-11、Ab1-LD-12和Ab1-LD-14；图1F-图1K分别对应抗体药物偶联物Ab2-LD-02、Ab2-LD-04、Ab2-LD-14、Ab2-LD-15、Ab2-LD-16和Ab2-LD-17。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。所有反应都是在氮气保护下进行的(氢化反应除外)。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的实施方法与材料仅作示范用。
缩略语
Ab 抗体
ACN 乙腈
ADC 抗体药物偶联物
BOC(Boc) 叔丁氧羰基
DIPEA 二异丙基乙胺
ELISA 酶联免疫吸附测定
Eq(eq) 当量
HIC 疏水作用色谱
HPLC 高效液相色谱
LCMS 液相色谱-质谱联用
mAb 单克隆抗体
MS 质谱
Prep-RP-HPLC 制备高效液相色谱
Rt 保留时间
SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC 尺寸排阻色谱
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
除非另外说明，所有的无水试剂均直接从供应商购买，并保存在氮气下。购买的所有其它试剂和溶剂都是高纯度的，并且使用前不经过进一步纯化。实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。
核磁共振波谱是在Bruker Avance III 400兆核磁共振波谱仪上采集的。化学位移(δ)单位是ppm，以四甲基硅烷为参照系(化学位移为0)。
液相色谱-质谱联用分析方法中，低分辨质谱数据是在一台与惠普Agilent 1200高效液相色谱仪接口的Agilent 6110(酸法)或6120B(碱法)质谱仪上采集的：
方法1：酸法高效液相色谱方法采用沃特世Sunfire C18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.3分钟内5％-95％B相(乙腈，含0.01％TFA)在A相(水相，含0.01％TFA)中，流速为2.0mL/min，柱温为50℃；
方法2：酸法高效液相色谱方法采用沃特世Sunfire C18反相色谱柱(4.6×30mm，2.7μm)进行分离，洗脱液梯度为1.4分钟内5％-95％B相(乙腈，含0.01％TFA)在A相(水相，含0.01％TFA)中，流速为2mL/min，柱温为50℃；
方法3：碱法高效液相色谱方法采用沃特世Xbridge C18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.5分钟内5％-95％B相(乙腈)在A相(水相，含10mM碳酸氢铵)中，流速为1.8mL/min，柱温为50℃。
制备用反相-高效液相色谱纯化(prep-RP-HPLC)在吉尔森(Gilson)仪器上完成，使用的分离柱为沃特世Sunfire C18反相色谱柱(250×19mm，10μm)：
方法4：酸法制备，流动相：A：含0.1％TFA的水相；B：ACN，流速：15mL/min；
方法5：碱法制备，流动相：A：含10mM碳酸氢铵的水相；B：ACN。，流速：15mL/min。
使用的细胞系Ramos(CRL-1596，ATCC)和BJAB(ACC757，DSMZ)是人非霍奇金淋巴瘤细胞。使用的细胞系HH(CRL-2105，ATCC)、L540(CSC-C0233，Creative Bioarray)和SU-DHL-1(CRL-2955，ATCC)是人霍奇金淋巴瘤细胞。Ab1(人源化抗CD79b单克隆抗体，IgG1)和Ab2(人源化抗CD30单克隆抗体，IgG1)均为本公司自行研制抗体。酶标抗抗体购自西格玛公司(上海)。底物溶液购自Decent生物技术公司(上海)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒购自Dojindo公司(上海)。
以下为Ab1(人源化抗CD79b单克隆抗体，IgG1)的序列：
Ab1重链
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGNTFTSYGINWVKQAPGQGLEWIGEIFPRSGNIYYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGTGDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：1
Ab1轻链
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNIVHSDGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSFRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：2
以下为Ab2(人源化抗CD30单克隆抗体，IgG1)的序列：
Ab2重链
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWIKQAPGQGLEWIGYINPSSSYTDYNQNFKDKATLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREDYVPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：3
Ab2轻链
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYRIPHTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：4
实施例1连接子中间体KL-1的合成
步骤1：化合物1的制备
将2-溴-3-羟基吡啶(15g，86.2mmol)、氢氧化钾(KOH，4.83g，86.2mmol)和多聚甲醛((CH2O)n，7.76g，258.6mmol)加入到135毫升水中，然后反应液于80℃搅拌17小时。将反应液冷却至室温，向其中加入醋酸(5.17g，86.2mmol)，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(2/1))得到黄色固体化合物1(6.8g)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.18min，m/z(ES+)204.1[M+H]+。
步骤2：化合物2的制备
将化合物1(6.8g，33.33mmol)、4-甲氧基苄氯(5.7g，36.66mmol)和碳酸钾(K2CO3，6.9g，50mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(30mL)，反应液于室温搅拌17小时。将混合液倒入冰水(150毫升)，用乙酸乙酯萃取(30mL×4)。合并后的有机相依次经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用二氯甲烷洗涤(15mL×2)，干燥，得到白色固体化合物2(6.2g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.88min，m/z(ES+)324.0[M+H]+。
步骤3：化合物3的制备
将化合物2(6.2g，19.14mmol)溶于二甲亚砜(40毫升)，然后在搅拌条件下向其中加入2-碘酰基苯甲酸(IBX，6.4g，22.97mmol)。反应液于室温搅拌17小时，然后过滤，将滤液倒入冰水混合物(200毫升)，混合液用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、减压浓缩除去溶剂，得到白色固体化合物3粗品(6.0g)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.02min，m/z(ES+)322.0[M+H]+。
步骤4：化合物4的制备
将化合物3(6.0g，18.63mmol)、乙二醇(2.3g，37.26mmol)和对甲苯磺酸一水合物(TsOH·H2O，177mg，0.93mmol)依次加入甲苯(50mL)，反应液于100℃搅拌17小时。反应液冷却至室温后，向其中加入水(100mL)进行萃取，分离后的水相用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。合并后的有机相依次经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/1))，得到黄色固体化合物4(1.8g)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.59min，m/z(ES+)246.1[M+H]+。
步骤5：化合物5的制备
将化合物4(1.8g，7.32mmol)、4-甲氧基苄氯(1.26g，8.05mmol)和碳酸钾(1.52g，10.98mmol)依次加入N,N-二甲基甲酰胺(25mL)，反应液于室温搅拌17小时。将反应液倒入冰水(120mL)，然后用乙酸乙酯萃取(20mL×2)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/4))，得到白色固体化合物5(2.0g)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.01min，m/z(ES+)366.0[M+H]+。
步骤6：化合物6的制备
将叠氮乙醇(4.75g，54.6mmol)加入叔丁醇钾的四氢呋喃溶液(KOtBu，1N，54.6mL)，反应液于室温搅拌半小时。向上述溶液中加入化合物5(10.0g，27.3mmol)，反应液于80℃搅拌2小时。反应液冷却至室温后，向其中加入水(300mL)，然后用乙酸乙酯萃取(200mL×3)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(300mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到黄色油状化合物6(8.5g)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.06min，m/z(ES+)373.1[M+H]+。
步骤7：化合物7的制备
将化合物6(54g,145mmol)溶于四氢呋喃(1000mL)溶液中，然后在搅拌条件下依次加入三苯基膦(PPh3，57.1g，218mmol)和水(10mL)。反应液于室温搅拌过夜，然后减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/1)→甲醇/二氯甲烷(1/10))，得到白色固体化合物7(28.0g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.79min，m/z(ES+)347.1[M+H]+。
步骤8：化合物8的制备
将化合物7(28g,145mmol)和三乙胺(16.36g，162mmol)依次加入四氢呋喃(300mL)，然后将溶液冷却至0℃，加入笏甲氧羰酰氯(FmocCl，25.1g,97.2mmol)。反应液于室温搅拌1小时，然后过滤，所得滤液减压浓缩得到黄色油状物。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/4))，得到黄色固体化合物8(25.0g)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.21min，m/z(ES+)569.1[M+H]+。
步骤9：化合物9的制备
将化合物8(1.1g,1.93mmol)溶于二氯甲烷(8mL)和水(0.8mL)的混合溶液，然后在冰浴冷却下向其中加入三氟乙酸(4mL)。反应液在冰水浴冷却下搅拌1小时，然后向其中加入饱和碳酸氢钠溶液(100mL)淬灭反应，混合液用二氯甲烷萃取(15mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/3))，得到黄色固体化合物9(690mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.67min，m/z(ES+)405.1[M+H]+。
步骤10：化合物11的制备
将化合物9(690mg,1.7mmol)、化合物10(1.0g,2.55mmol，参考WO2017/51249公开的方法制备)和氧化银(Ag2O，1.97g,8.5mmol)依次加入乙腈(150mL)，反应液于室温避光搅拌17小时。将反应液过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(15mL×3)，滤液合并后减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/3))，得到白色固体化合物11(800mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.81min，m/z(ES+)721.1[M+H]+。
步骤11：化合物12的制备
将化合物11(800mg,1.11mmol)溶于异丙醇(1mL)和二氯甲烷(5mL)混合溶液，然后于冰水浴冷却条件下加入硼氢化钠(NaBH4，63mg，1.67mmol)。反应液在冰水浴下搅拌1.5小时后，然后向其中加入25毫升水，混合溶液用二氯甲烷萃取(15mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/1))，得到白色固体化合物12(310mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.59min，m/z(ES+)723.2[M+H]+。
步骤13：化合物KL-1的制备
将化合物12(270mg,0.373mmol)、双(对硝基苯基)碳酸酯(227mg,0.746mmol)和二异丙基乙胺(96mg,0.746mmol)依次加入干燥的N,N’-二甲基甲酰胺溶液(5mL)，反应液于室温搅拌17小时。向反应液中加入水(30mL)，然后用乙酸乙酯萃取(30mL×3)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/10→1/1))，得到白色固体化合物KL-1(310毫克)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.27min，m/z(ES+)888.2[M+H]+。
实施例2连接子中间体KL-2的合成
步骤1：化合物13的制备
将2-硝基-3羟基吡啶(7g,50mmol)溶于37％甲醛水溶液(100mL)，然后向其中滴加氢氧化钾(2.8g,50mmol)水溶液，反应液于加热回流条件下搅拌4天。将反应液冷却至室温，然后向其中滴加1N的盐酸溶液(50mL)，所得溶液用乙酸乙酯萃取(100mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到一种棕褐色的油状残余物。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯(1/10→1/1))，得到黄色固体化合物13(2.0g)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.18min，m/z(ES+)171.1[M+H]+。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.20(s,1H),7.66-7.71(m,2H),4.80(s,2H),3.10(s,1H)。
步骤2：化合物14的制备
将化合物13(800mg,4.7mmol)溶于乙腈(50mL)，在冰水浴冷却条件下依次加入10(1.5g,3.76mmol)和氧化银(2.17g,9.4mmol)，反应液于室温搅拌1小时。将混合溶液过滤，滤饼用乙腈洗涤(50mL×2)，合并滤液并减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/2→3/1))，得到黄色固体化合物14(400mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.72min，m/z(ES+)509.0[M+Na]+。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.87(d,1H),7.64(d,1H),5.30-5.38(m,2H),5.21-5.26(m,2H),4.79(s,2H),4.23(d,1H),3.74(s,3H),2.14(s,3H),2.07(d,6H)。
步骤3：化合物15的制备
将化合物14(520mg,1.02mmol)溶于乙酸乙酯(100毫升)，然后向其中加入10％的钯碳(Pd/C，52mg)，反应液于室温搅拌氢化过夜。将反应液过滤除去钯碳，滤液减压浓缩除去溶剂，得到黄色油状化合物15(450mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.64min,m/z(ES+)457.1[M+H]+。
步骤4：化合物16的制备
将化合物15(450mg,1mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，然后依次加入咪唑(102mg,1.5mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl，225mg,1.5mmol)，反应液于室温搅拌2小时。混合液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/10→1/2))，得到黄色固体化合物16(350mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.16min,m/z(ES+)571.2[M+H]+。
步骤5：化合物17的制备
将Fmoc-肌氨酸(286mg,0.921mmol)溶于二氯甲烷(10毫升)，然后依次加入氯化亚砜(367mg,1.84mmol)和微量的N,N-二甲基甲酰胺(4.5mg,0.0614mmol)，反应液于室温搅拌2小时。反应液经减压浓缩除去溶剂，向残余物中加入二氯甲烷(10mL)，然后向其中加入化合物16(350mg,0.614mmol)和DIPEA(158mg,1.23mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)，所得反应液于室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/10→1/1))得到黄色固体化合物17(200mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.23min,m/z(ES+)864.3[M+H]+。
步骤6：化合物18的制备
将化合物17(190mg,0.22mmol)溶于四氢呋喃(6mL)，然后向其中加入冰醋酸(AcOH，2mL)和水(2mL)，反应液于室温下搅拌2天。向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(30mL)，然后用乙酸乙酯萃取(30mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到黄色油状物。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(0/1→1/20))得到黄色固体化合物18(100mg)。LCMS(方法1):Rt＝1.86min，m/z(ES+)750.2[M+H]+。
步骤7：化合物KL-2的制备
将化合物18(87mg,0.116mmol)、对硝基苯基氯甲酸酯(35mg,0.174mmol)和吡啶(13.7mg,0.174mmol)依次加入二氯甲烷(4mL)，反应液于室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/10→1/2))，得到白色固体状化合物KL-2(45mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.08min,m/z(ES+)915.2[M+H]+。
实施例3连接子中间体KL-3的合成
步骤1：化合物19的制备
将甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(6.00g,31.6mmol)、2-羧基-3-羟基吡啶(4.00g，28.8mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt，4.30g，31.6mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，6.10g，31.6mmol)和二异丙基乙胺(5.60g，43.2mmol)依次加入N,N’-二甲基甲酰胺(60mL)中，反应液于室温搅拌16小时。向反应液中加入水(300mL)，然后用乙酸乙酯萃取(150mL×3)，合并的有机相依次用饱和食盐水洗涤(200mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/5))，得到灰白色固体化合物19(6.96g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.77min，m/z(ES+)310.2(M+H)+。
步骤2：化合物20的制备
将化合物19(4.80g，15.5mmol)、三乙胺(3.13g，31mmol)和37％甲醛(HCHO，3.77g，46.5mmol)依次加入到水(50mL)中，反应液于90℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温，加入冰醋酸中和，然后用乙酸乙酯萃取(100mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/2))，得到灰白色固体化合物20(1.4g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.63min，m/z(ES+)340.2(M+H)+。
步骤3：化合物21的制备
将化合物20(339mg,1.0mmol)、化合物10(397mg,1.0mmol)和氧化银(462mg,2.0mmol)依次加入到乙腈(50mL)中，反应液于40℃避光搅拌16小时。反应液冷却至室温后过滤，滤饼用乙腈洗涤，合并的滤液经减压浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC纯化(方法5:8分钟内40％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物21(120mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.84min，m/z(ES+)656.3(M+H)+。
步骤4：化合物KL-3的制备
在冰浴冷却条件下将化合物21(100mg,0.15mmol)、双(对硝基苯基)碳酸酯(48mg,0.24mmol)和吡啶(20mg,0.25mmol)依次加入到二氯甲烷(3mL)中，反应液于室温搅拌16小时。向反应液中加入水(20mL)，然后用二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/10))，得到灰白色固体化合物KL-3(100mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.06min，m/z(ES+)821.3(M+H)+。
实施例4连接子中间体KL-4的合成
步骤1：化合物22的制备
将3-羟基吡啶(9.50g,100mmol)、37％的甲醛溶液(12.20g,150mmol)、N-甲基苄胺(11.5g,95mmol)、和浓盐酸(8.5mL,100mmol)依次加入乙醇(120mL)中，反应液于85℃搅拌过夜。加入10％氢氧化钠溶液调节pH值至中性，减压浓缩除去乙醇，然后用乙酸乙酯萃取(80mL)。有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(150/1))，得到浅黄色固体化合物22(11.50g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.87min，m/z(ES+)229.1(M+H)+。
步骤2：化合物23的制备
将化合物22(12.5g,55mmol)溶于甲醇(100mL)中，向其中加入10％的钯碳(1.0g)，反应液于室温加氢条件下搅拌16小时。将反应液过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(10/1))，得到粉色固体化合物23(6.6g)。
LCMS(方法3)：Rt＝0.38min，m/z(ES+)139.2(M+H)+。
步骤3：化合物24的制备
将Boc-肌氨酸(6.24g，33mmol)、化合物23(5.10g，37mmol)、1-羟基苯并三唑(5.00g，37mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(7.10g，37mmol)和二异丙基乙胺(7.22g，56mmol)依次加入到DMF(80mL)中，反应液于室温搅拌16小时。将反应液倒入300毫升水中，用乙酸乙酯萃取(200mL×3)，合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(300mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(80/1→30/1))，得到淡黄色固体化合物24(7.8g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.75min，m/z(ES+)310.1(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98-7.97(m,1H),7.19-7.13(m,2H),4.56-4.51(m,2H)，4.15-4.04(m,2H),2.99-2.98(m，1H)，2.84(s,1H)，2.79-2.76(m，3H)，2.72(s,1H)，1.40-1.38(m,4H)，1.28(s,5H)。
步骤4：化合物25的制备
将化合物24(7.72g，25mmol)、三乙胺(5.05g，50mmol)和37％甲醛溶液(6.08g，75mmol)依次加入到水(60mL)中，反应液于90℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温，向其中加入醋酸调节pH至中性，然后用乙酸乙酯萃取(60mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(50/1→20/1))，得到灰白色固体化合物25(1.32g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.67min，m/z(ES+)340.1(M+H)+。
步骤5：化合物26的制备
将化合物25(1.32g，3.9mmol)溶于二氯甲烷(25mL)中，然后向其中加入活性二氧化锰(MnO2，1.35g，15.6mmol)，反应液于回流条件下搅拌16小时。将反应液冷却至室温后过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(100/1→80/1))，得到灰白色固体化合物26(0.86g)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.55min，m/z(ES+)338.1(M+H)+。
步骤6：化合物27的制备
将化合物26(438mg,1.3mmol)、化合物10(560mg,1.4mmol)和氧化银(534mg,2.3mmol)依次加入到乙腈(8mL)中，反应液于室温避光搅拌16小时。将反应液过滤，滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC纯化(方法5:8分钟内40％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物27(112mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.96min,，m/z(ES+)654.2(M+H)+。
步骤7：化合物28的制备
将化合物27(112mg,0.17mmol)溶于异丙醇(1mL)与二氯甲烷(2mL)的混合溶液中，在冰浴冷却条件下，向其中加入硼氢化钠(10mg,0.25mmol)，反应液于室温搅拌2小时。向反应液中加入20毫升水，然后用二氯甲烷萃取(20mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(60/1))，得到灰白色固体化合物28(100mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.81min，m/z(ES+)656.0(M+H)+。
步骤8：化合物KL-4的制备
将化合物28(92mg,0.14mmol)和对硝基氯甲酸苯酯(56mg,0.28mmol)加入到二氯甲烷(4mL)中，在冰浴冷却条件下，向其中加入三乙胺(43mg,0.42mmol)，反应液于室温搅拌16小时。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯(10/1→3/1))，得到灰白色固体状化合物KL-4(41mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.03min，m/z(ES+)820.9(M+H)+。
实施例5连接子中间体KL-5的合成
步骤1：化合物29的制备
将化合物6(4.5g,12mmol)溶于二氯甲烷(16mL)和水(0.4mL)的混合溶液，然后在冰浴冷却条件下，向其中加入三氟乙酸(8mL)，反应液于室温搅拌2小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(40mL)淬灭反应，然后用二氯甲烷萃取(50mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/3))，得到无色油状化合物29(1.64g)。
LCMS(方法3)：Rt＝0.67min，m/z(ES+)209.1(M+H)+。
步骤2：化合物31的制备
将化合物29(422mg,2.03mmol)、化合物30(1.0g,2.43mmol，参考US2019/367488公开的方法合成)和氧化银(938mg,4.06mmol)依次加入到乙腈(50mL)中，反应液于室温避光搅拌17小时。将反应液过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(15mL×3)，然后将合并后的滤液减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/二氯甲烷/石油醚(1/1/4→1/1/2))，得到无色油状化合物31(874mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.89min，m/z(ES+)539.1(M+H)+。
步骤3：化合物32的制备
将化合物31(874mg,1.62mmol)溶于异丙醇(10mL)和二氯甲烷(20mL)的混合溶液中，然后在冰水浴冷却条件下，向其中加入硼氢化钠(92mg，2.43mmol)，反应液在冰水浴下搅拌1小时。向反应液中加入水(50mL)，然后用乙酸乙酯萃取(50mL×3)。合并后的有机相依次用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到无色油状化合物32(850mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.63min，m/z(ES+)541.2(M+H)+。
步骤4：化合物KL-5的制备
将化合物32(850mg,1.57mmol)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)，然后向其中依次加入对硝基氯甲酸苯酯(476mg,2.36mmol)和吡啶(373mg,4.72mmol)，反应液于室温搅拌17小时。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚(1/3→1/1))，得到无色油状化合物KL-5(950毫克)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.10min，m/z(ES+)706.1(M+H)+。
实施例6连接子-药物LD-01的合成
步骤1：化合物33的制备
将化合物KL-1(240mg,0271mmol)、1-羟基苯并三唑(18.4mg,0.136mmol)、吡啶(0.5mL)和MMAE(195mg,0.271mmol，皓元医药)依次加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，反应液于室温搅拌17小时。向反应液中加入醋酸淬灭反应，然后用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内60％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物33(200mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.98min，m/z(ES+)1467.5(M+H)+。
步骤2：化合物34的制备
将化合物33(200mg,0.136mmol)溶于甲醇(10mL)，然后向其中加入氢氧化锂水溶液(1M，1.36mL,1.36mmol)。反应液于室温搅拌3小时，然后加入冰醋酸(150mg)淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内45％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物34(100mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.21min,m/z(ES+)1104.4(M+H)+。
步骤3：化合物LD-01的制备
将化合物34(20mg,0.018mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，然后向其中依次加入化合物35(6.7mg,0.022mmol，皓元医药)和二异丙基乙胺(9.3mg,0.072mmol)。反应液于室温搅拌2小时，然后加入冰醋酸(24mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内50％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物LD-01(13.4mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.70min,m/z(ES+)649.5[1/2(M+2H)]+。
实施例6连接子-药物LD-02的合成
将化合物34(55mg,0.05mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，然后向其中依次加入化合物36(23mg,0.06mmol，参考EP2949343,2015,A1中公开的方法合成)和二异丙基乙胺(25.8mg,0.2mmol)。反应液于室温搅拌2小时，然后加入冰醋酸(24mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内50％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物LD-02(50mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.36min,m/z(ES+)1378.4(M+H)+。
实施例7连接子-药物LD-03的合成
步骤1：化合物33的制备
将化合物37(100mg,0.225mmol，参考WO2016/192528公开的方法合成)溶于四氢呋喃中，然后向其中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，39mg，0.34mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC，70mg,0.34mmol)，反应液于室温搅拌17小时。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(0/1→1/30))，得到黄色固体化合物37(60mg)。
步骤2：化合物LD-03的制备
将化合物34(20mg,0.018mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，然后向其中依次加入化合物38(15mg,0.027mmol)和二异丙基乙胺(10mg,0.076mmol)。反应液于室温搅拌2小时，然后加入冰醋酸(24mg)淬灭,所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物LD-03(9.9mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.75min,m/z(ES+)766.5[1/2(M+2H)]+。
实施例8连接子-药物LD-04的合成
步骤1：化合物39的制备
在化合物33(300mg,0.2mmol)的四氢呋喃(30mL)溶液中加入哌啶(0.35g，4.1mmol)，反应液于室温搅拌17小时。反应液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内15％-85％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物39(200mg)。
LCMS(方法1):Rt＝1.63min,m/z(ES+)623.0[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物40的制备
将化合物39(98mg,0.079mmol)、化合物40(41mg,0.095mmol，参考CN107652219B公开的方法合成)、二异丙基乙胺(49mg,0.38mmol)和HATU(60mg,0.098mmol)依次加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，所得反应液于室温搅拌17小时。向反应液中加入30毫升水淬灭反应，所得溶液用乙酸乙酯萃取(25mL×3)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到黄色固体化合物41粗品(120mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.01min,m/z(ES+)829.6[1/2(M+2H)]+。
步骤3：化合物42的制备
将化合物41(120mg,0.079mmol)加入到盐酸二氧六环(4M,5mL)与乙酸乙酯(5mL)的混合溶液中，所得反应液于室温搅拌2小时。将反应液减压浓缩，得到黄色固体化合物42粗品(100mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.48min,m/z(ES+)729.5[1/2(M+2H)]+。
步骤4：化合物43的制备
将化合物42(100mg,0.069mmol)加入到甲醇(1mL)和水(2mL)的混合溶液中，然后向其中加入氢氧化锂一水合物(LiOH·H2O，84mg,2mmol)。反应液于室温搅拌2小时，然后加入冰醋酸(120mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内15％-85％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物43(14mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.38min，m/z(ES+)659.5[1/2(M+2H)]+。
步骤4：化合物LD-04的制备
将化合物43(14mg,0.010mmol)、化合物36(8.2mg,21.2μmol)和二异丙基乙胺(6mg,70.41μmol)依次加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，所得反应液于室温搅拌2小时，然后加入冰醋酸(10mg)淬灭反应。反应液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内15％-85％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物LD-04(14mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.64min,m/z(ES+)933.6[1/2(M+2H)]+。
实施例9连接子-药物LD-05的合成
步骤1：化合物44的制备
将化合物KL-1(500mg,0.564mmol)、HOBt(38mg,0.282mmol)、吡啶(2mL)、二异丙基乙胺(291mg,2.256mmol)和依喜替康(300mg,0.564mmol，皓元医药)依次加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，所得反应液于室温搅拌17小时。向反应液中加入150毫升水，然后用乙酸乙酯萃取(500mL×4)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(600mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。所得棕色油状物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(1/60→1/20))，得到棕色固体化合物44(1.74g)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.04min，m/z(ES+)593.1[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物45的制备
将化合物44(400mg,0.338mmol)溶于甲醇(80mL)，所得溶液于冰水浴中冷却，然后向其中加入氢氧化锂水溶液(1N，13.5mL,13.5mmol)。反应液于0℃反应2小时后，加入冰醋酸(1g)淬灭。将混合溶液减压浓缩至三分之一，然后用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内20％-90％B→4分钟内95％B)得到黄色固体化合物45(80mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.55min，m/z(ES+)411.8[1/2(M+2H)]+。
步骤3：化合物LD-05的制备
将化合物45(40mg,0.0487mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(2mL)，然后向其中加入化合物35(18mg,0.0585mmol)。将反应液冷却至0℃，然后加入二异丙基乙胺(25mg,0.195mmol)，反应液于室温搅拌4小时。向反应液中加入冰醋酸(25mg)淬灭反应，所得混合液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-90％B→4分钟内95％B)得到13.7毫克黄色固体化合物LD-05(13.7mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.81min，m/z(ES+)1015.4(M+H)+。
实施例10连接子-药物LD-06的合成
将化合物45(40mg,0.0487mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(2mL)，然后加入化合物36(18mg,0.0585mmol)。将溶液冷却至0℃，向其中加入二异丙基乙胺(25mg,0.195mmol)，反应液于室温搅拌4小时。加入冰醋酸(25mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-90％B→4分钟内95％B)得到黄色固体化合物LD-06(9.4mg)。
LCMS(方法1):Rt＝1.81min，m/z(ES+)1096.4(M+H)+。
实施例11连接子-药物LD-07的合成
步骤1：化合物46的制备
将甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(550mg,2.93mmol)和三乙胺(325mg,3.22mmol)依次加入到甲苯(15mL)中，然后在冰浴冷却下加入三光气(348mg,1.17mmol)。反应液在冰浴冷却条件下反应2小时，然后升至室温，继续反应16小时。将反应液过滤，所得滤液浓缩除去溶剂，然后向其中依次加入吡啶(15mL)和SN-38(918mg,2.34mmol，泰坦科技)，反应液在室温继续搅拌16小时。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(1/40→1/20))，得到黄色固体化合物46(670mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.89min，m/z(ES+)606.1(M+H)+。
步骤2：化合物47的制备
将化合物46(310mg,0.51mmol)溶于二氯甲烷(4mL)，然后加入盐酸-二氧六环溶液(4M，4mL,16mmol)，反应液于室温搅拌4小时。将反应液浓缩除去溶剂，得到黄色固体化合物47(277mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.41min，m/z(ES+)506.2(M+H)+。
步骤3：化合物48的制备
将化合物47(174mg,0.32mmol)、化合物KL-1(284mg,0.32mmol)、HOBt(43mg,0.32mmol)和吡啶(0.5mL)依次加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，反应液于室温搅拌16小时。反应完毕后加入水(30mL)，混合溶液用乙酸乙酯萃取(50mL×4)，合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤(60mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷(1/40→1/20))，得到黄色固体化合物48(324mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.98min，m/z(ES+)628.3[1/2(M+2H)]+。
步骤4：化合物49的制备
将化合物48(324mg,0.26mmol)溶于甲醇(2mL)和水(2mL)的混合溶液，然后向其中加入氢氧化锂一水合物(109mg,2.6mmol)，反应液于室温搅拌2小时。加入冰醋酸(160mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内20％-80％B→4分钟内95％B)，得到黄色固体化合物49(52mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.36min，m/z(ES+)893.3(M+H)+。
步骤5：化合物LD-07的制备
将化合物49(30mg,0.034mmol)、化合物35(9mg,0.034mmol)和二异丙基乙胺(17mg,0.136mmol)依次加入无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，反应液于室温搅拌3小时。加入冰醋酸(20mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-90％→4分钟内95％B)得到黄色固体化合物LD-07(16毫克)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.56min，m/z(ES+)1087.4(M+H)+。
实施例12连接子-药物LD-08的合成
将化合物49(21.8mg,0.024mmol)、化合物36(8.5mg,0.024mmol)和二异丙基乙胺(12.6mg,0.098mmol)依次加入无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，反应液于室温搅拌3小时。加入冰醋酸(20mg)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内35％-90％B→4分钟内95％B)，得到黄色固体化合物LD-08(6.7mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.74min，m/z(ES+)584.3[1/2(M+2H)]+。
实施例13连接子-药物LD-09的合成
步骤1：化合物51的制备
将化合物50(6.4mg,0.026mmol，泰坦科技)、HATU(48.6mg,0.128mmol)、化合物38(80mg,0.064mmol)和二异丙基乙胺(33mg,0.256mmol)依次加入到DMF(5mL)中，反应液于室温搅拌5小时。加入冰醋酸(20mg)淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物51(30mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.92min，m/z(ES+)900.9[1/3(M+3H)]+。
步骤2：化合物52的制备
将化合物51(30mg,0.011mmol)溶于乙酸乙酯(0.8mL)中，然后向其中加入4N的盐酸二氧六环溶液(0.2mL)，反应液于室温搅拌5小时。减压浓缩除去溶剂，得到白色固体状化合物52(20mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝2.26min，m/z(ES+)867.5[1/3(M+3H)]+。
步骤3：化合物53的制备
将化合物52(20mg,0.0077mmol)溶于甲醇(1mL)中，在冰浴冷却条件下，向其中加入1M氢氧化锂水溶液(77μL,0.077mmol)，反应液于室温搅拌3小时。加入冰醋酸(2mg)淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内20％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物53(4mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝2.04min，m/z(ES+)744.0[1/3(M+3H)]+。
步骤4：化合物LD-09的制备
将化合物53(4mg,0.0017mmol)溶于DMF(0.5mL)中，向其中加入化合物36(0.8mg,0.002mmol)，然后在冰浴冷却条件下，加入二异丙基乙胺(0.88mg,0.0068mmol)，反应液于室温搅拌3小时。加入冰醋酸(2mg)淬灭，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内35％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物LD-09(0.8mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝2.17min，m/z(ES+)865.2[1/3(M+3H)]+。
实施例14连接子-药物LD-10的合成
步骤1：化合物54的制备
将化合物KL-2(30mg,0.033mmol)溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)，然后向其中依次加入1-羟基苯并三唑(2.3mg,0.017mmol)、吡啶(0.2mL)和MMAE(23.7mg,0.033mmol)。反应液于室温搅拌过夜，然后用prep-RP-HPLC纯化(方法4：8分钟内65％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物54(20mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.14min,m/z(ES+)747.3[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物55的制备
将化合物54(20mg,0.0134mmol)溶于甲醇(1mL)，然后向其中加入1N的氢氧化锂水溶液(0.135mL,0.134mmol)。反应液于室温搅拌5小时，加入冰醋酸(0.1mL)淬灭反应，用prep–RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内50％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物55(10mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.47min，m/z(ES+)566.4[1/2(M+2H)]+。
步骤3：化合物LD-10的制备
将化合物55(13mg,0.0115mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，然后向其中依次加入化合物32(5.4mg,0.0138mmol)和二异丙基乙胺(5.9mg,0.046mmol)。反应液于室温搅拌5小时，加入冰醋酸(6mg)淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内55％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物LD-10(4mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.73min，m/z(ES+)703.3[1/2(M+2H)]+。
实施例15连接子-药物LD-11的合成
步骤1：化合物56的制备
将化合物KL-3(100mg,0.12mmol)、MMAE(70mg,0.10mmol)、1-羟基苯并三唑(7mg,0.05mmol)和吡啶(0.05mL)依次加入到无水N,N’-二甲基甲酰胺(1mL)中，反应液于室温搅拌16小时。反应完毕后用prep-RP-HPLC纯化(方法5:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物52(25mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝2.04min，m/z(ES+)700.4[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物57的制备
将化合物56(25mg,0.0179mmol)溶于乙酸乙酯(2mL)中，然后向其中加入4M盐酸二氧六环溶液(2mL,8mmol)，反应液于室温搅拌2小时。反应结束后将反应液减压浓缩除去溶剂，得到黄色固体化合物57(20mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.53min，m/z(ES+)650.5[1/2(M+2H)]+。
步骤3：化合物58的制备
将化合物57(20mg,0.015mmol)溶于甲醇(1mL)中，然后向其中加入1M氢氧化锂水溶液(0.15mL,0.15mmol)，反应液于室温搅拌3小时。加入冰醋酸(0.1mL)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内50％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物58(14mg)。
LCMS(方法1)：Rt＝1.42min，m/z(ES+)1160.8(M+H)+。
步骤4：化合物LD-11的制备
将化合物58(14mg,0.0121mmol)溶于N,N’-二甲基甲酰胺(1mL)，然后向其中依次加入化合物36(5.6mg,0.0145mmol)和二异丙基乙胺(9.4mg,0.0726mmol)，反应液于室温搅拌16小时。加入冰醋酸(10毫克)淬灭反应，所得溶液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物LD-11(2.7mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.78min，m/z(ES+)717.4[1/2(M+2H)]+。
实施例16连接子-药物LD-12的合成
步骤1：化合物59的制备
将化合物KL-4(41mg,0.05mmol)、MMAE(43mg,0.06mmol)、1-羟基苯并三唑(3mg,0.02mmol)和吡啶(0.03mL)依次加入到DMF(1mL)中，反应液于室温搅拌16小时。反应结束后，用prep-RP-HPLC纯化(方法5:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物59(50mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝2.14min，m/z(ES+)700.5[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物60的制备
将化合物59(50mg,0.04mmol)溶于乙酸乙酯(1mL)中，在冰浴冷却条件下，向其中加入4M盐酸二氧六环溶液(0.3mL)，反应液于室温搅拌2小时。反应完毕，减压浓缩除去溶剂，残余物用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物60(30mg)。
LCMS(方法3)：Rt＝1.53min,m/z(ES+)650.6[1/2(M+2H)]+。
步骤3：化合物61的制备
将化合物60(30mg,0.02mmol)溶于甲醇(0.5mL)中，在冰浴冷却条件下，向其中加入1M氢氧化锂水溶液(0.5mL)，反应液于室温搅拌2小时。加入冰醋酸(30mg)淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物61(15mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.43min，m/z(ES+)1160.7(M+H)+。
步骤4：化合物LD-12的制备
将化合物61(15mg,0.01mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(0.9mL)中，在冰浴冷却条件下，依次向其中加入化合物36(6.2mg,0.02mmol)和二异丙基乙胺(6.7mg,0.05mmol)，反应液于室温搅拌16小时。加入醋酸淬灭反应，用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内30％-95％B→4分钟内95％B)，得到白色固体化合物LD-12(2mg)。
LCMS(方法2)：Rt＝1.68min，m/z(ES+)717.5[1/2(M+2H)]+。
实施例17连接子-药物LD-13、LD-14和LD-15
连接子-药物LD-13、LD-14和LD-15是按照文献报道的方法合成的(LD-13：US7498298；LD-14：WO2014114207；LD-15：WO2019033773)。
实施例18连接子-药物LD-16的合成
步骤1：化合物62的合成
将化合物KL-5(197mg，0.28mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，然后依次向其中加入吡啶(0.5mL)、1-羟基苯并三唑(19mg，0.14mmol)和MMAE(201mg，0.28mmol)，反应液于室温搅拌17小时。向反应液中加入醋酸淬灭反应，然后加入水，用乙酸乙酯萃取(30mL×2)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯(1/0→5/1→3/1)，然后二氯甲烷/甲醇(30/1))得到无色油状物62(308mg)。
LCMS(方法3)：rt＝2.15min；m/z(ES+)643.0[1/2(M+2H)]+。
步骤2：化合物63的合成
将化合物62(308mg,0.24mmol)溶于甲醇(4.8mL)，然后向其中加入1M氢氧化锂水溶液(2.4mL，2.4mmol)，反应液于室温搅拌3小时。向反应液中加入冰醋酸(144mg)淬灭反应，然后加入水，用二氯甲烷萃取(30mL×2)。合并后的有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(40/1→15/1))得到无色胶状化合物63(240mg)。
LCMS(方法3)：rt＝1.91min，m/z(ES+)1116.5(M+H)+。
步骤3：化合物64的合成
将化合物63(240mg，215μmol)溶于四氢呋喃(4mL)，然后在搅拌条件下向其中加入三苯基膦(67mg，258μmol)和水(23mg)，反应液于室温搅拌过夜。将反应液减压浓缩除去溶剂，残余物用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内15％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体状化合物64(150mg)。
LCMS(方法1)：rt＝1.45min，m/z(ES+)1091.6(M+H)+。
步骤4：化合物LD-16的合成
将化合物64(21mg,19μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，然后向其中依次加入化合物36(8.5mg,22μmol)和二异丙基乙胺(10mg,76μmmol)，反应液于室温搅拌4小时。向反应液中加入冰醋酸(20mg)淬灭反应，然后用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内15％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体状化合物LD-16(13.6mg)。
LCMS(方法3)：rt＝1.84min，m/z(ES+)683.0[1/2(M+2H)]+2。
实施例19连接子-药物LD-17的合成
将化合物64(27.2mg,25μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，然后向其中依次加入化合物65(25.3mg,32.5μmol)、HATU(19mg,50μmol)和二异丙基乙胺(12.9mg,100μmmol)，反应液于室温搅拌2小时。向反应液中加入冰醋酸(26mg)淬灭反应，混合液用prep-RP-HPLC纯化(方法4:8分钟内20％-95％B→4分钟内95％B)得到白色固体化合物LD-17(27mg)。
LCMS(方法2):rt＝1.09min，m/z(ES+)926.8[1/2(M+2H)]+。
实施例20抗体药物偶联物的制备
向抗体溶液(2-10mg/mL，67mM PBS缓冲液，pH 7.0-7.2)中加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(2-10eq，储备液浓度10mM)。反应液于37℃恒温摇床内孵育2小时。将反应液冷却至约10℃，经超滤(Merck MilliporeUltra，50000MWCO)或凝胶过滤置换缓冲液(20mM柠檬酸-柠檬酸三钠，50mM氯化钠，1mM二乙烯三胺五乙酸，pH 5.8-6.2)，加入二甲亚砜和连接子-药物(二甲亚砜储备液，3-15当量)，并保证反应液中二甲亚砜体积占比达10％左右。偶联反应在10℃进行1.5小时。
向反应液加入过量的半胱氨酸溶液，以淬灭未反应的连接子-药物，淬灭反应在10℃进行30分钟。将反应液先经超滤(Merck Millipore Ultra，50000MWCO)或凝胶过滤除去半胱氨酸-连接子-药物加合物以及过量的半胱氨酸，然后经由0.22μm孔径的过滤装置(Merck Millex-GV Filter)除菌，得到抗体药物偶联物，并在4℃条件下保存。
利用上述制备方法，以Ab1和Ab2为抗体，以LD-01至LD-17为连接子-药物，制得抗体药物偶联物(见表1)。
表1制备的抗体药物偶联物
NA：未制备。
1)平均DAR值测定
平均DAR值根据实际情况，采用以下二种方法中的一种进行测定。
1a)疏水作用色谱法(HIC)
通过HIC谱图上各相对峰面积百分比和相应组分携带的药物数量计算得到(参考Anal.Chem.2013,85,1699-1704)。加权峰占比测定的是单一DAR值组分对平均DAR值的贡献，是将相对峰面积(％)乘以该组分所携带的药物数量。平均DAR值是将所有组分的加权峰占比求和，然后除以100得到的，如下式所示：
DAR＝Σ(相对峰面积×该组份携带药物数量)/100
1b)质谱法(MS)
取适量样品，加150mM乙酸铵溶液稀释至1mg/mL。实验中使用超高效液相色谱仪Acquity UPLC(Waters)与高分辨的Xevo G2-XS QTOF(Waters)质谱仪，进样10μL检测。采集正离子模式下的质谱数据。采集的非变性质谱数据使用UNIFI软件进行分析处理。
本发明抗体药物偶联物的平均DAR值测定结果如下表2所示。
表2抗体药物偶联物的平均DAR值
抗体药物偶联物 平均DAR值 抗体药物偶联物 平均DAR值
Ab1-LD-01 8.0a Ab2-LD-01 NA
Ab1-LD-02 4.1a Ab2-LD-02 4.0a
Ab1-LD-04 NA Ab2-LD-04 2.0a
Ab1-LD-05 NA Ab2-LD-05 7.5b
Ab1-LD-06 NA Ab2-LD-06 4.0b
Ab1-LD-07 8.0b Ab2-LD-07 NA
Ab1-LD-08 4.0b Ab2-LD-08 NA
Ab1-LD-09 8.1a Ab2-LD-09 NA
Ab1-LD-10 4.1a Ab2-LD-10 NA
Ab1-LD-11 4.3a Ab2-LD-11 NA
Ab1-LD-12 4.4a Ab2-LD-12 NA
Ab1-LD-13 NA Ab2-LD-13 4.1a
Ab1-LD-14 4.2a Ab2-LD-14 4.2a
Ab1-LD-15 2.2a Ab2-LD-15 2.1a
Ab1-LD-16 NA Ab2-LD-16 4.0a
Ab1-LD-17 NA Ab2-LD-17 2.2a
NA：未制备。
a：HIC法
b：MS法
2)疏水作用色谱(HIC)分析
疏水作用色谱是在安捷伦1100(Agilent 1100)色谱仪上测定的。固定相采用TSKgel丁基-NPR柱(4.6×35mm，2.5μm，东曹(上海)生物科技有限公司)。洗脱梯度为线性梯度，25分钟内从100％缓冲液A[50mM磷酸钾(pH 7.0)+1.5M硫酸铵]置换到100％缓冲液B[80％v/v 50mM磷酸钾(pH 7.0)，20％v/v异丙醇]。流速为0.8mL/min，柱温设在30℃，检测波长设在280nm。
本发明中ADC的HIC谱图见图1A-图1K，其主峰保留时间见表3和表4。
表3基于Ab1 ADC的HIC谱图主峰保留时间
由表3可知，与采用vc-PABC可断裂连接子的ADC药物Ab1-LD-14相比，Ab1-LD-02、Ab1-LD-10、Ab1-LD-11和Ab1-LD-12均采用了本发明的糖基吡啶型连接子。HIC谱图主峰保留时间对比显示，后者的出峰时间均显著低于前者。
表4基于Ab2 ADC的HIC谱图主峰保留时间
抗体药物偶联物 保留时间(min) 平均DAR值
Ab2-LD-02 12.0 4.0
Ab2-LD-04 9.9 2.0
Ab2-LD-14 13.5 4.2
Ab2-LD-15 12.5 2.1
Ab2-LD-16 11.2 4.0
Ab2-LD-17 9.3 2.2
由表4可知，当平均DAR值约为4时，采用糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物Ab2-LD-02和Ab2-LD-16，其HIC谱图主峰保留时间均显著小于采用vc-PABC连接子的抗体Ab2-LD-14。当平均DAR之约为2时，采用糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物Ab2-LD-04和Ab2-LD-17，其HIC谱图主峰保留时间均显著小于采用vc-PABC连接子的抗体Ab2-LD-15。
以上结果表明，相比常用的vc-PABC连接子，采用糖基吡啶型连接子可以显著增加ADC产品的亲水性。ADC产品亲水性的增加，可以减少ADC产品的聚体含量，改善ADC产品的体内PK特性。
3)尺寸排阻色谱(SEC)分析
尺寸排阻色谱是在安捷伦1100(Agilent 1100)或1260(Agilent 1260)色谱仪上测定的。固定相采用TSKgel G3000SWXL柱(7.8×300mm，5μm，东曹(上海)生物科技有限公司)。流动相为62mM磷酸氢二钠，55mM磷酸二氢钾，100mM硫酸钠，pH 6.7±0.1。流速为0.7mL/min，柱温设在25℃，检测波长设在280nm。
本发明实施例中的ADC产品的经SEC测试单体含量均在99％以上。
试验例1本发明的抗体药物偶联物抑制细胞增殖抑制的作用
细胞增殖实验(Cell Proliferation Assay)
抗体或抗体药物偶联物的细胞抑制活性是通过以下方法测定的：将表达肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞接种在96孔板上，每孔接种8000个细胞，悬浮于DMEM高糖细胞培养基(GIBCO)200μL；ADC样品初始浓度2μg/mL，用含2％FBS(GIBCO)的DMEM高糖细胞培养基进行3倍梯度稀释；移除原培养基，每孔加入200μL ADC样品，继续孵育72小时；移除原培养基，每孔加入CCK-8显色液100μL，继续培养30分钟；用酶标仪读取450nm/630nm的吸光度值，绘制曲线，计算IC50。
本发明的抗体药物偶联物抑制细胞增殖作用的结果如表5、表6所示。
表5本发明抗体药物偶联物抑制细胞增殖作用的结果
本发明制得的抗体药物偶联物均具有良好的细胞增殖抑制作用。如表5所示，Ab1-LD-04抑制细胞增殖作用效果略优于Ab1-LD-15，而二者结构上的差别主要在于可断裂连接子部分，前者采用本发明的糖基吡啶型连接子，而后者采用vc-PABC型连接子。
表6本发明抗体药物偶联物抑制细胞增殖作用的结果
如表6所示，当平均DAR值相近时，采用糖基吡啶型连接子的抗体药物偶联物，与采用vc-PABC型连接子的抗体药物偶联物的细胞增殖抑制效果相当。
由此可见，基于本发明的糖基吡啶型连接子构建的ADC药物在进入细胞后可以有效释放细胞活性药物，起到杀伤细胞的作用。
在本发明提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (26)

1.一种式I所示的抗体药物偶联物，
或其药学上可接受的盐或水合物，
其中，
L是抗体、抗体片段、或其它类型配体；
A是连接子片段，同时与L和G相连；
G是糖基取代吡啶结构，如式II所示：
其中，
Su是一个糖分子；
每个R各自独立地选自氢、CN、卤素、NO2和C1-C4烷基；
X和Y各自独立地选自-CR2R3-、-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
Q选自-NR6-或-O-；
R1选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢或C1-C4烷基；
x、y、z各自独立地选自0或1；
g选自1或2；
W是可选的自杀性连接子；
w选自0或1；
D是药物；
p选自1至4的整数；
q选自1至8的整数。
2.根据权利要求1所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式III所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、W、D、Su、x、y、z、w如权利要求1所定义。
3.根据权利要求1或2所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式IV或式V所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、W、D、x、y、z、w如权利要求1所定义。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其为式VI或式VII所示的抗体药物偶联物：
其中，L、A、Q、R1、R、X、Y、D、x、y、z如权利要求1所定义。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中：
x为0；
y为1；
Y选自-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中：
x为1；
y为1；
X选自-CR2R3-；
Y选自-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
R2和R3各自独立地选自氢或C1-C4烷基，优选氢；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中：R1选自C1-C6亚烷基，优选C1-C6直链亚烷基，更优选C2-C4直链亚烷基；
z为1。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中：Q为-NR6-；R6各自独立地选自氢或C1-C4烷基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中：每个R各自独立地选自氢、卤素、C1-C4烷基，优选氢。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中，G具有如下所示结构：
其中，R7选自氢，C1-4烷基例如甲基，和水溶性基团例如聚乙二醇。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中g是1。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中A选自以下结构：
其中，
R8选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R9选自H或卤素；
R10选自C1-C4烷基；
R11和R12各自独立地选自C1-C6亚烷基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中L为人源化、嵌合或全人化的抗体或抗体片段或抗体Fc融合蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中L为针对细胞表面受体或肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段或抗体Fc融合蛋白。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中L为人源化抗CD30单克隆抗体或人源化CD79b单克隆抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中L为Ab1，其具有SEQ ID NO：1所示的重链和SEQ ID NO：2所示的轻链。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中L为Ab2，其具有SEQ ID NO：3所示的重链和SEQ ID NO：4所示的轻链。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中D为抗肿瘤药物、治疗自身免疫疾病的药物或抗炎症的药物，所述抗肿瘤药物例如微管蛋白抑制剂、DNA烷基化试剂、DNA小沟结合剂、DNA拓扑异构酶抑制剂等。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物，其中D为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、SN-38或依喜替康。
20.一种式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
A’是连接子片段；
每个R各自独立地选自氢、CN、卤素、NO2和C1-C4烷基；优选氢、卤素、C1-C4烷基，更优选氢；
X和Y各自独立地选自-CR2R3-、-C(＝O)NR4-、-NR5C(＝O)-、-O-；
Q选自-NR6-或-O-，优选-NR6-；
R1选自C1-C6亚烷基或骨架内含O的C1-C6亚烷基，优选C1-C6亚烷基；
R2和R3各自独立地选自氢或C1-C4烷基，优选氢；
R4和R5各自独立地选自氢或C1-C4烷基；
R6选自氢或C1-C4烷基；
x为0或1；
y为0或1，优选1；
z为0或1，优选1；
D是药物分子；
p选自1至4的整数，优选1或2。
21.根据权利要求20所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中A’选自以下结构：
其中，R8选自C1-C6亚烷基、或骨架内含O的C1-C6亚烷基；
R9选自H或卤素；
R10选自C1-C4烷基；
R11和R12各自独立地选自C1-C6亚烷基。
22.根据权利要求20或21所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构：
其中，R5、R6和D如权利要求17所定义。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中，D为抗肿瘤药物、治疗自身免疫疾病的药物或抗炎症的药物，所述抗肿瘤药物例如微管蛋白抑制剂、DNA烷基化试剂、DNA小沟结合剂、DNA拓扑异构酶抑制剂；优选地，D为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、SN-38或依喜替康。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的式(A)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其选自以下结构：
25.一种药物组合物，其含有根据权利要求1至19中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物以及药学上可接受的载体。
26.根据权利要求1至19中任一项所述的式I所示的抗体药物偶联物或者根据权利要求25所述的药物组合物在制备治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的药物中的用途。
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