CN119422203A - 评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法。目标方法包括获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。所述主题方法还包括根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。同时，还提供了用于实施本发明的系统和非暂态计算机可读存储介质。

Description

评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法 和系统

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2022年6月1日提交的第63/347,848号美国临时专利申请的申请日优先权；所述第63/347,848号美国临时专利申请的公开通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

背景技术

生物流体中分析物的表征已成为生物研究、医疗诊断和患者整体健康评估的重要部分。检测生物流体（如人体血液或血液来源制品）中的分析物可以提供结果，这些结果可在确定患有各种疾病病症的患者的治疗方案中发挥作用。

粒子分析（如流式细胞术）是一项用于表征生物材料（如血液样本中的细胞，或另一种生物或化学样本中的目标粒子）的技术，有时还能对生物材料进行分选。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本（例如血样）的样本储液池和包含鞘液的鞘储液池。流式细胞仪将流体样本中的粒子（包括细胞）作为细胞流输送至流动室，同时还将鞘液引导至流动室。为了表征流动流中的成分，利用光对流动流进行辐照。流动流中材料的变化（如形态或存在荧光标签）可能会导致观察到的光发生变化，通过这些变化，可以进行表征和分离。为了表征流动流中的成分，光必须照射到流动流上，并对光进行收集。流式细胞仪中的光源多种多样，光源可包括一个或多个宽光谱灯、发光二极管以及单波长激光器。光源与流动流对准，然后收集并量化来自辐照粒子的光学响应。

使用粒子分析仪测量的参数通常包括粒子沿基本前向窄角散射的激发波长光（称为前向散射光（FSC））、粒子沿与激发激光器正交方向散射的激发光（称为侧向散射光（SSC））以及荧光分子或荧光染料发出的光。通过采用荧光染料标记抗体或其他荧光探针对各种细胞蛋白或其他成分进行标记后产生的光散射特性和荧光发射，可以标识不同的细胞类型。采用置于粒子分析仪内的光电检测器，检测前向散射光、侧向散射光和荧光。

在流式细胞术方案包括荧光检测的情况下，实验设计通常涉及标识荧光染料组合，即在给定的流式细胞术工作流程中一起使用的一系列荧光染料。由于生物分辨率（即区分粒子内部或粒子之间不同目标组分的能力）直接受到“原始”流式细胞术数据测量方差和光谱补偿或解混数学过程的影响，因此荧光染料组合设计过程很有必要。在很大程度上，这两个因素都取决于组合中荧光染料的选择。首先，流式细胞术中的测量方差（即噪声）来源广泛，包括细胞仪电子设备中的恒定基线测量噪声、随信号强度线性变化的光学散粒噪声，以及由细胞仪激光器和流体力学随机波动产生的随信号强度呈二次曲线变化的乘性测量噪声。测量噪声本身取决于荧光染料的选择。例如，较明亮的荧光染料将会比较暗的荧光染料诱发更多的散粒噪声，而与仪器光学器件和电子设备的恒定“本底噪声”相比，较暗的荧光染料的信号幅值则较小。其次，“检测器空间”（其维度数量等于仪器中的检测器数量）中的原始测量噪声通过荧光补偿（常规细胞仪中）或光谱解混（全光谱细胞仪中）数学过程传播至“补偿空间”或“解混空间”（其维度数量等于样本中荧光染料的数量）中的最终生物数据。由于要在“解混空间”中进行最终的目标生物分析（例如门控、聚类、分选、标志物定量等），因此“解混空间”的方差非常重要。这种噪声到生物空间的数学映射在很大程度上取决于荧光染料本身的光谱特征。

流式细胞术组合中存在显著的光谱重叠，可导致不可接受的解混数据方差（又称噪声或扩散），降低解混信噪比，且无法分辨多色流式细胞仪实验中生物标志物表达的差异。解混依赖性扩散表现在三个主要方面：i）未染色粒子上的解混方差增大，不依赖于荧光染料表达（即“阴性扩散”）；ii）由于一种或多种其他荧光染料的表达产生了强度依赖性光子噪声（即“溢出扩散”），导致一种荧光染料的解混方差增大；iii）解混荧光染料之间协方差增大（在未染色群体上最明显的表现为“倾斜对角双阴性”）。在给定组合中，解混依赖性扩散对某些荧光染料的影响往往比对其他荧光染料的影响要大得多。随着组合中荧光基团数量的增加和总光谱重叠度的提高，解混依赖性扩散对可在单个流式细胞术实验中同时使用的荧光基团数量设置了有效上限。实验操作人员在设计荧光染料组合时必须格外小心，避免或减轻这种解混依赖性扩散。

目前用于预测组合中解混依赖性扩散的指标有两个：余弦相似度（即“相似度指数”）和光谱矩阵条件数（即“复杂度分数”）。余弦相似度是一种描述两种荧光染料之间光谱重叠的成对指标。它可以预测最有可能发生溢出扩散的荧光染料对，并可用于“排除”不能一起使用的几乎完全相同的荧光染料对。光谱矩阵条件数是单一标量指标，用于描述在给定的全组合荧光染料中解决光谱解混问题所需的数值稳定性。它可以大致预测出哪些组合预计会有较多的解混依赖性扩散或较少的解混依赖性扩散。

常规流式细胞术采用分立式光电检测器，这种分立式光电检测器专门用于检测染料特定的荧光发射波段，常规流式细胞术针对可同时用于流动实验的荧光染料数量设置了硬性限制：荧光染料数量不得超出仪器上荧光检测通道的数量。相比之下，根据定义，全光谱流式细胞仪使用的检测器数量多于荧光染料数量，市售全光谱流式细胞仪有180多个荧光通道可供使用。

发明内容

本发明人已经意识到，在流式细胞术实验中可同时使用的荧光染料数量存在实际限制。尽管市面上可购得近百种不同的流式细胞术荧光染料分子，但是组合尺寸仍然有限。此实际限制源于所使用荧光染料不可避免的光谱重叠和相似性。此外，研究发现，常规的荧光染料分析方法也存在不足。例如，余弦相似度无法在全组合中考虑荧光基团的性能，也无法定量预测解混扩散的严重程度。此外，条件数无法指示哪些荧光基团受解混扩散的影响最大，也无法指示哪些荧光基团是问题的根源。在条件数几乎完全相同的两个不同组合中，相同荧光染料的解混扩散可能有很大差异。一般情况下，一个组合可具有“聚焦”在一种或两种荧光染料上的较高解混扩散度，而另一个条件数几乎完全相同的组合可具有更均匀分布在组合中更多荧光染料上的较低解混扩散度。不同尺寸组合上的条件数无法进行有意义的比较。可以从测量数据（如单染色粒子）中根据经验计算出替代指标，如溢出扩散矩阵（SSM）和总扩散矩阵（TSM）。然而，收集此类数据需要大量人力，而且每个候选组合都必须重复进行解混分析，计算复杂度高，无法进行快速计算（如自动化组合设计算法所需的计算）。

鉴于上述情况，发明人意识到需要新的组合性能指标，既能提供关于组合依赖性解混扩散的信息（如条件数），又能提供关于荧光染料特定性能和荧光染料-荧光染料相互作用的信息（如余弦相似度），同时要求最低实验开销或计算复杂度。相应地，需要使用用于评估和选择合适荧光染料组合的方法和系统。本发明的实施例满足了这一需求。

本发明的各个方面包括评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法。目标方法包括获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。此外，本发明的方法还包括根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。在某些实施例中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细胞仪数据方差。在附加实施例中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将受到流式细胞仪数据方差的影响。例如，逆矩阵可包括伪逆矩阵（如摩尔-彭若斯伪逆矩阵）。在某些实例中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵。在某些实例中，分析计算出的逆矩阵可包括从逆矩阵中推导出定量指标（如矩阵范数、向量范数）。所述主题方法的实施例还包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。在某些实例中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。在某些版本中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。在实施例中，所述流式细胞仪数据可包括与多个荧光染料中荧光染料的数量相等的维度数量（例如经过光谱解混或补偿）。在某些情况下，所述方差包括流式细胞仪数据中的噪声。方法可进一步包括产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性可视化，例如可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

本发明的各个方面还包括用于实施所述主题方法（例如如上所述）的系统。目标系统包括处理器，所述处理器可获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。本发明所述处理器还可根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。此外，所述处理器可基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。在某些实施例中，所述处理器可产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性可视化，例如可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。在某些此类实施例中，所述系统包括用于描绘可视化的显示器。

此外，本发明的各个方面还包括非暂态计算机可读存储介质，包括存储在其上的指令，所述指令用于采用本发明的方法（例如如上所述），对用于生成流式细胞仪的荧光染料组合的适用性进行评估。如上所述，方法包括获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。由非暂态计算机可读存储介质执行的方法还包括：通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

附图说明

专利或申请文件至少包含一张彩色绘制图纸。如果申请人提出要求并支付必要的费用，专利局将提供此专利或专利申请出版物及彩色图纸的副本。

根据以下具体实施方式并结合附图阅读，可以获得对本发明的最佳理解。附图包括以下各图：

图1显示了根据某些实施例所述的实施荧光染料组合评估方法的流程图。

图2显示了根据某些实施例所述的本发明基本原理。

图3显示了根据某些实施例所述的本发明基本原理。

图4A-4B显示了伪逆矩阵的特性在多大程度上决定了解混数据中的扩散（噪声）。

图5A-5D显示了根据本发明实施例所述的组合热点矩阵及其示例性计算过程。

图6A-6B显示了基于组合热点矩阵创建的可视化。

图7A-7E显示了根据本发明实施例所述的扩散相关矩阵及其示例性计算过程。

图8显示了根据某些实施例所述的实施本发明方法的流程图。

图9显示了根据某些实施例所述的流式细胞系统的功能框图。

图10显示了根据某些实施例所述的控制系统。

图11A-11B显示了根据某些实施例所述的粒子分选仪系统的示意图。

图12显示了根据某些实施例所述的计算系统的框图。

图13A-13B显示了原始流式细胞仪数据中的非预期阴性扩散。

图14A-14B显示了原始流式细胞仪数据中的非预期溢出扩散。

图15A-15B显示了原始流式细胞仪数据中的倾斜双阴性群体。

图16A-16G显示了APC光谱邻域中的扩散“热点”，这些热点取决于荧光染料组合中的全套染料。

图17A-17G显示了BB700光谱邻域中的扩散“热点”，这些热点取决于荧光染料组合中的全套染料。

图18展示了相似度指数在多大程度上无法预测全组合背景下的扩散差异。

图19展示了条件数在多大程度上无法指示哪些荧光基团与全组合扩散有关。

图20展示了相似度分析在多大程度上无法预测荧光染料组合中将要出现扩散的位置。

图21展示了相似度分析在多大程度上无法预测荧光染料组合中将要出现扩散的位置。

图22展示了组合热点分析如何正确标识荧光染料组合中的扩散问题区域。

图23展示了组合热点分析如何正确标识荧光染料组合中的扩散问题区域。

图24展示了组合热点分析如何正确标识荧光染料组合中的扩散问题区域。

图25展示了组合热点分析如何正确标识荧光染料组合中的扩散问题区域。

图26展示了组合热点分析如何半定量指示扩散严重程度。

图27A-27C展示了组合热点分析在多大程度上有利于改进或扩展现有组合。

图28A-28F展示了扩散相关矩阵的支持数据。

具体实施方式

本发明提供了评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法。目标方法包括获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。所述主题方法还包括根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。同时，还提供了用于实施本发明的系统和非暂态计算机可读存储介质。

在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施例，当然这些实施例可能会有所不同。还应理解，由于本发明的范围将仅受所附权利要求的限制，本发明中的术语仅用于描述具体实施例，并非旨在进行限制。

如果本发明提供了取值范围，应理解，本发明包括此范围上限与下限之间的每个中间值（除非上下文另有明确规定，否则精确到下限单位的十分之一），以及此规定范围内的任何其他规定值或中间值。这些较小范围的上限和下限可独立包含在较小范围内，同时包含在本发明的范围内，但受规定范围内任何明确排除的限值的约束。如果规定范围包括所述限值中的一个或两个，本发明还包括排除这些任一或两个所含限值的范围。

本发明中的某些范围以数值表示，数值前有术语“约”。本发明中使用的术语“约”用于为其后确切数字以及接近或近似于其后数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于明确列举的数字时，接近或近似的未列举数字可以是在其呈现的上下文中与明确列举的数字实质等同的数字。

除非另有定义，否则本发明中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实施或测试中也可使用与本发明所述方法或材料相似或等效的任何方法和材料，但代表性说明方法和材料如下所述。

本说明书中引用的所有出版物和专利通过本发明的引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物或专利均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分，旨在公开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用任何出版物的目的是在申请日之前公开，不应解释为承认由于先前的发明，本发明无权先于此类出版物公开。此外，所提供的出版日期可能与需要单独确认的实际出版日期不同。

值得注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明和所附权利要求中使用的单数形式“一个（a）”、“一个（an）”和“所述（the）”也包括复数指称对象。还应注意，在起草权利要求时可以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用如“只”、“仅”等与权利要求要素的叙述有关的排他性术语或使用“否定”限制的前提依据。

在阅读完本公开后，对本领域技术人员显而易见的是，本发明所述和所示的各个单独实施例具有离散的组成部分和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，这些组成部分和特征易于与其他多个实施例中任一实施例的特征分离或组合。可以按照所列事件的顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序实施所列举的任何方法。

虽然为了语法上的流畅性和功能上的解释，已经或将要对系统和方法进行描述，但是应明确理解，除非《美国专利法》第35篇第112条明确规定，否则权利要求不应解释为必须以任何方式受到“手段”或“步骤”的限制，而是根据司法等同原则赋予权利要求提供的定义的含义和等同的整个范围，并且在《美国专利法》第35篇第112条明确规定了权利要求的情况下，应根据《美国专利法》第35篇第112条赋予其完全的法定等同。

荧光染料组合评估方法

如上所述，本发明的各个方面包括评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法。目标方法包括接收荧光染料组合。如本发明所述，“荧光染料组合”是指一组不同的荧光分子物质（即染料），可用于标识样本中的粒子或与粒子相关联的特定部分或组分。本发明所述的“荧光染料组合”也可指一组唯一指代特定荧光分子物质并与其相关联的标识符（例如数字标识符）。此类标识符在本发明中可称为“荧光染料标识符”。在所述荧光染料组合中，有区别的荧光染料在吸收光谱、消光系数、发射光谱和量子效率（即每吸收一个光子所发射的光子数）或其组合等特性方面可能存在差异。因此，不同或有区别的荧光染料在化学成分和/或染料的一种或多种特性方面可能彼此存在差异。例如，如果一对给定的荧光染料在激发和/或发射最大值方面彼此不同，则可以认为这对荧光染料有区别，其中，在某些实例中，这种差异的大小为5 nm或以上，例如10 nm或以上，包括15 nm或以上，其中，在某些实例中，差异的大小范围为5-400 nm，例如10-200 nm，包括15-100 nm，例如25-50nm。

在某些情况下，执行所述方法时无需评价抗原数据。所谓“抗原数据”是指在给定的流式细胞仪方案中所评价抗原的相关信息，针对所述方案，需要使用荧光染料组合。换言之，与考虑到荧光染料相关联抗原的特点并相应选择荧光染料的方法不同，本主题方法的实施例旨在提供一组适合在相同流式细胞术方案中使用的荧光染料（即“调色板”）。在这些情况下，在标识和/或评估荧光染料组合时不考虑样本抗原性。在某些版本中，在标识出所述主题荧光染料组合后，所述方法还可选择性地包括将标识出的组合中的荧光染料分配给特定抗原（例如，通过针对相关抗原的抗体等）。

本发明的方法还包括接收仪器标识符。所谓“仪器标识符”是指与特定仪器（如粒子分析仪、流式细胞仪）相关的信息或数据。在某些情况下，通过仪器标识符标识的仪器是流式细胞仪。可采用任何适宜流式细胞仪来分析荧光粒子调制光。在某些实例中，目标流式细胞仪包括BD Biosciences生产的流式细胞仪。示例性流式细胞仪包括BD BiosciencesFACSCanto^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSCanto^TM II流式细胞仪、BD Accuri^TM流式细胞仪、BD Accuri^TM C6 Plus流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelesta^TM流式细胞仪、BDBiosciences FACSLyric^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerse^TM流式细胞仪、BDBiosciences FACSymphony^TM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessa^TM流式细胞仪、BDBiosciences LSRFortessa^TM X-20流式细胞仪、BD Biosciences FACSPresto^TM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVia^TM流式细胞仪和BD Biosciences FACSCalibur^TM细胞分选仪、BD Biosciences FACSCount^TM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyric^TM细胞分选仪、BDBiosciences Via^TM细胞分选仪、BD Biosciences Influx^TM细胞分选仪、BD BiosciencesJazz^TM细胞分选仪、BD Biosciences Aria^TM细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria^TM II细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria^TM III细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria^TMFusion细胞分选仪和BD Biosciences FACSMelody^TM细胞分选仪、BD BiosciencesFACSymphony^TM S6细胞分选仪等。

另外，本发明的方法还包括获得与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。如本发明所述，“光谱矩阵”是指包含关于一组荧光染料的光谱特性信息的矩阵。在实施例中，目标光谱矩阵包括与一组荧光染料标识符中的每个荧光染料标识符相关联的一组光谱特征。“光谱特征”是指以一个或多个数值表示的单个荧光染料荧光光谱的特点。如果两个实体在数据空间中相互关联和/或相关，则可将其描述为相互“关联”。换言之，与仪器标识符相关联的光谱矩阵（本发明中又称为“输入”或“原始”光谱矩阵）可代表可能的荧光染料或染料的“调色板”，可以从中选择所述主题荧光染料组合。在某些情况下，光谱矩阵包含与目标仪器（如流式细胞仪）上每个荧光基团的光谱特性有关的信息。此类信息在不同的机器上可能会有所不同。例如，单独仪器之间激光器和检测通道的数量和排列存在差异，可能导致与每台仪器相关联的不同光谱特征。相应地，所述主题方法的实施例采用了光谱矩阵，其中包括针对特定仪器（或仪器类别/类型）的光谱特征，在所述仪器中，假定采用评估后荧光染料组合中的荧光染料。由于仪器之间存在差异，如果将荧光染料应用于两种不同类型的仪器（如流式细胞仪），则相同的荧光染料组合可能与流式细胞仪数据的方差存在或多或少的关联。获得与仪器标识符相关联的光谱矩阵，就能在仪器特定背景下评估荧光染料组合，从而使本领域技术人员在实施本主题方法时能够更可靠地深入了解流式细胞仪数据的质量（如果给定组合中的荧光染料用于特定仪器）。

在某些实施例中，从实验数据（即在特定仪器上进行实验的结果）接收所述光谱特征。在其他情况下，从模拟数据接收所述光谱特征。输入光谱矩阵可与任何合适数量的荧光染料标识符相关联。在某些实施例中，所述输入光谱矩阵中的荧光染料标识符数量范围为2-150个，例如2-140个，例如2-130个，例如2-120个，例如2-110个，例如2-100个，例如2-90个，例如2-80个，例如2-70个，例如2-60个，包括2-50个。本发明给定实施例中采用的一系列荧光染料标识符可称为荧光染料调色板，统指荧光染料标识符，可从中选择给定的荧光染料组合。

在某些实例中，所述光谱特征包括一个或多个溢出值。所谓“溢出值”是指给定荧光染料发射到每个检测器波段的相对信号量。在某些情况下，溢出值归一化为该荧光染料的最大信号检测器（即“峰值”检测器）。在某些情况下，粒子分析仪（如流式细胞仪）中的一个或多个检测器接收到指示特定荧光染料的粒子调制光，所述检测器并非该荧光染料的峰值检测器。因此，光可能会“溢出”并由非峰值检测器检测到。换言之，为了与某些检测器大体上保持一致，可选择用于实验的特定荧光标签及其相关荧光发射波段。然而，由于提供了更多检测器，并且使用了更多标签，某些检测器与荧光发射光谱之间可能无法完全对应。一般而言，尽管特定荧光分子的发射光谱峰值可位于一个特定检测器的窗口内，但是该标签的一部分发射光谱也将与一个或多个其他检测器的窗口重叠。这种情况可称为溢出。

在某些实施例中，本发明所述的光谱矩阵可包括一个或多个自发荧光光谱特征。自发荧光是在流式细胞仪中测量细胞等粒子时由粒子产生的内源荧光信号。自发荧光产生于细胞中具有荧光活性的内源分子，如代谢物。同一类型的不同细胞（如淋巴细胞）可具有相同的自发荧光光谱，但强度不同，例如较大的细胞通常倾向于具有较大的自发荧光信号。在某些实例中，不同类型的粒子与不同的自发荧光光谱相关联。例如，不同类型的细胞（如淋巴细胞与单核细胞）不仅可具有不同的自发荧光水平，而且可具有不同的自发荧光光谱（例如淋巴细胞自发荧光的光谱特征可能与单核细胞自发荧光的光谱特征不同）。在某些情况下，例如在光谱细胞术中，通过观察未染色细胞，测量自发荧光的光谱特征，如果包括多个自发荧光光谱，则将该光谱特征作为额外的“荧光染料”参数包含在光谱解混过程中。

如上所述，获得的光谱矩阵与荧光染料组合和仪器标识符相关联。换言之，获得的光谱矩阵是输入光谱矩阵（即与仪器标识符相关联的光谱矩阵）的子矩阵，其中仅包括荧光染料组合中荧光染料的光谱特征。本发明所述的“子矩阵”是常规意义上的矩阵，描述了一种通过删除另一矩阵的某些行和/或列组合得到的矩阵。

在获得与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵后，本发明的方法包括根据获得的光谱矩阵计算逆矩阵。本发明所述术语“逆矩阵”可用于描述常规意义上的矩阵的逆，即当时，矩阵的逆是，其中是矩阵单位。然而，就本公开而言，术语“逆矩阵”也可包括其他类型的逆，例如非方形矩阵的逆。例如，在某些实施例中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。从广义上讲，“伪逆矩阵”是将方形可逆矩阵的逆概括为非方形矩阵的矩阵。在某些情况下，所述伪逆矩阵是摩尔-彭若斯伪逆矩阵。在这些情况下，可按如下方法计算所述伪逆矩阵：

其中，是矩阵，是转置，是伪逆。关于伪逆（例如摩尔-彭若斯伪逆）的一般性讨论，可参见第7,065,286号和第9,575,162号美国专利。

由于光谱矩阵伪逆决定了原始方差到解混方差的映射，因此伪逆适用于对荧光染料组合进行评估。例如，光谱和常规流式细胞术均可描述为线性混合模型：

其中，是检测器信号的[m-by-1]向量，是光谱特征的[m-by-n]矩阵，是荧光基团丰度的[n×1]向量。光谱解混涉及通过最小二乘法求解“”的线性方程组。对于普通最小二乘法，所述解法可描述为：

其中，是的摩尔-彭若斯伪逆（或补偿情况下的逆，其中，是方形）。

在附加实施例中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵（又称为光谱矩阵的“逆矩矩阵”）。Horn，R. A.和Johnson，C. R.（2012）的《矩阵分析》中描述了格拉姆矩阵，所述出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。在某些实施例中，根据以下公式计算格拉姆逆矩阵。

其中，是格拉姆逆矩阵，是光谱矩阵，是光谱矩阵转置。

也可采用线性估计器理论来计算解混解的方差-协方差矩阵，假设检测器测量值的方差-协方差矩阵为：

其中，^T表示转置算子。的对角元素是每个检测器的方差或噪声项，的对角元素是每个荧光染料的解混方差。

从这一关系可以明显看出，所述光谱矩阵伪逆决定了原始方差到解混方差的映射。以下证明可以论证这一结论：令表示光谱矩阵和表示光谱矩阵伪逆，其中为检测器数量，为荧光染料数量。令为检测器协方差矩阵，表示检测器的测量方差。尺寸的非混合荧光体协方差矩阵具有对角元素，表示荧光基团的解混方差，以及非对角元素，表示荧光基团和的解混协方差。则定义如下：

如上所示，无论的结构如何，荧光基团j的解混方差都取决于其逆谱的特性。荧光基团j和k的解混协方差同时取决于逆谱和。如果是对角线（无协方差）：

如果提出简化假设，即检测器噪声不相关，则解混方差仅取决于逆谱的大小，可以用逆谱的向量范数进行概括。如果是同方差的，则：

如果还假设所有通道的检测器方差都相等，则与格拉姆逆矩阵成正比。因此，由此可见，格拉姆逆矩阵近似预测了解混数据的真协方差矩阵。

在计算逆矩阵后，所述方法的实施例包括从逆矩阵中推导出定量指标。在某些情况下，所述定量指标是矩阵范数。在某些实例中，所述定量指标是向量范数。在其他实例中，所述定量指标从矩阵范数和向量范数的某种组合中推导出，例如，逆矩阵中列或行的某个子集的向量范数之和。合适的范数包括但不限于L²范数、1-范数、2-范数、无穷范数和弗罗贝尼乌斯范数。在某些情况下，所述范数是L²范数。在某些情况下，所述范数是1-范数。在某些情况下，所述范数是2-范数。在某些情况下，所述范数是无穷范数。在某些情况下，所述范数是弗罗贝尼乌斯范数。例如，Golub，G. H.和Van Loan，C. F.（1996）的《矩阵计算》第3版（美国马里兰州巴尔的摩: 约翰斯·霍普金斯）中介绍了弗罗贝尼乌斯范数，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在某些情况下，弗罗贝尼乌斯范数的计算方法如下（改编自Golub和Van Loan）：

其中，是矩阵。

在某些实施例中，方法还包括产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性的可视化。可采用任何合适的可视化。在某些实施例中，所述可视化包括基于给定的荧光染料组合模拟的流式细胞仪数据图。换言之，所述可视化包括如果在配备有特定荧光染料组合的特定仪器上运行样本，则会产生示例性流式细胞仪数据。在某些此类实施例中，所述可视化可以强调（例如，通过突出显示、彩色编码、分组、用箭头指出等）流式细胞仪数据，如果使用荧光染料组合中的某些荧光染料来产生所述数据，则这些数据将与方差相关联。在某些实施例中，所述可视化强调利用产生数据方差的荧光染料来产生流式细胞仪数据。在某些实例中，所述可视化强调利用受数据方差影响的荧光染料来产生流式细胞仪数据。在其他版本中，所述可视化包括表格或矩阵，用于对荧光染料组合中荧光染料与方差相关联（例如产生方差和/或受方差影响）的程度进行量化。例如，所述表格或矩阵可由上文所述的定量指标进行填充。在某些此类版本中，基于荧光染料与方差相关联（例如产生方差和/或受方差影响）的程度，对所述表格或矩阵的单元格进行颜色编码。在选定的实例中，如果相关联的荧光染料与方差的关联程度较低，则使用强度较轻的颜色对单元格进行颜色编码；如果相关联的荧光染料与方差的关联程度较高，则使用强度较高的颜色对单元格进行颜色编码。

图1显示了根据某些实施例所述的实施荧光染料组合标识方法的流程图。如图1所示，步骤101包括输入荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。步骤102包括计算逆矩阵（例如伪逆矩阵）。步骤103包括计算定量指标，步骤104包括基于步骤104中计算的定量指标，优化荧光染料组合。还可在步骤105中创建可视化，用于描绘荧光染料组合的评估情况。

图2-3展示了流式细胞仪数据（图2）和方差（图3）从“原始”空间（即维度数量等于仪器中检测器的数量）到“解混空间”（即维度数量等于样本中荧光染料的数量）的映射。如图2所示，光谱解混将数据从高维检测器空间（原始）转换到低维荧光基团空间。如上文详述，光谱和常规流式细胞术均可描述成线性混合模型。如图3所示，方差也是从检测器空间映射到荧光基团空间。基于解，可以明显看出，所述光谱矩阵伪逆决定了原始方差到解混方差的映射。如图2-3所示，所述光谱矩阵伪逆将原始检测器信号映射回解混荧光基团。所述光谱矩阵伪逆还能将原始检测器空间噪声映射回解混空间噪声，最终影响实验中的生物分辨率。

图4A-4B描述了伪逆矩阵的特性在多大程度上决定了解混数据中的扩散（噪声）。如图4A中描绘的正问题（混合）所示，光谱矩阵第j列是荧光基团j的光谱。描述了来自荧光基团j的信号如何映射到所有检测器。如图4B中描绘的逆问题（解混）所示，光谱矩阵伪逆第j行是荧光基团j的逆谱。描述了检测器信号如何映射回解混荧光基团j。

在某些实施例中，方法包括生成组合热点矩阵。如本发明所述，所述“组合热点矩阵”是一种对扩散对荧光基团的影响进行数学描述和/或可视化的机制。在选定情况下，所述组合热点矩阵作为上述可视化。在某些实施例中，所述组合热点矩阵是对角矩阵。在某些实例中，可通过求逆矩阵（如格拉姆逆矩阵）绝对值的平方根来计算所述组合热点矩阵。在某些情况下，可按如下方法计算所述组合热点矩阵：

计算组合热点矩阵可得出两种不同的组合适用性指标：伪逆矩阵行范数和非对角元素。伪逆矩阵行范数（即组合热点矩阵的对角线）说明了整个组合中哪些荧光染料受解混依赖性扩散的影响最大。在某些情况下，对角元素是每个荧光基团伪逆行的2-范数。在某些版本中，所述伪逆矩阵行范数可以用标度来表示，所述标度与该荧光基团解混数据的标准偏差因该组合中的解混而放大的系数相对应。例如，1与无影响相对应，2与2倍扩散相对应，以此类推。检查全组合热点矩阵中的非对角元素，可发现组合中存在问题的荧光基团组合。非对角元素是对应行和列荧光基团伪逆行的点积。非对角值表示两个荧光基团伪逆矩阵元素之间的协方差大小。例如，在某些实施例中，非对角值为0表示无协方差，而较高值则表示相应较高的协方差水平。

图5A-5D显示了根据本发明实施例所述的组合热点矩阵及其示例性计算过程。图5A展示了单染剂光谱的主数据库。图5A中展示图形的x轴包括不同的荧光基团，而y轴则包括检测器。给定荧光基团发出的光由给定检测器检测到的程度采用颜色编码表示。图5B表示图5A所示单染剂光谱主数据库的子集。所述子集包括x轴上给定组合的目标荧光基团，而省略了主数据库中的其余荧光基团。此子集构成了光谱矩阵。图5C描绘了格拉姆逆矩阵的计算（等于伪逆矩阵的格拉姆，与伪逆矩阵的协方差成正比）。图5D展示了组合热点矩阵，显示了格拉姆逆绝对值的平方根。对角501包括伪逆矩阵行范数，表明整个组合中哪些荧光染料受解混依赖性扩散的影响最大。组合热点矩阵的其余部分（即非对角元素）表示两个荧光基团伪逆矩阵元素之间协方差的大小。

在某些实施例中，方法包括对组合热点矩阵的伪逆矩阵行范数（即对角线）进行单独分析。在某些此类实施例中，方法包括产生对角可视化。所述对角可视化可以是分类数据的任何表示（例如图形表示），用于评估和/或比较荧光基团中解混数据的标准偏差因特定组合中的解混而放大的系数。在某些实施例中，所述对角可视化是条形图，其中，每个条形图代表每个荧光基团中解混数据的标准偏差因组合中的解混而放大的系数。

在某些情况下，方法包括基于组合热点矩阵，使用特定荧光基团生成示例性流式细胞仪数据的可视化。所述示例性流式细胞仪数据可以是实际的流式细胞仪数据，即从流式细胞术实验中产生的数据。可替代地，所述数据可以是模拟数据。示例性流式细胞仪数据的主题可视化展示了实验中使用某些荧光染料的效果。在某些实施例中，所述可视化显示了使用一对特定荧光染料产生的示例性流式细胞仪数据，以表明与这些荧光染料相关联的协方差会在多大程度上影响数据质量。可替代地或此外，也可以使用整个荧光染料组合来模拟示例性流式细胞仪数据，而非仅使用一对荧光染料。检查此类示例性流式细胞仪数据，可以发现组合中存在问题的荧光染料组合。

图6A-6B显示了基于组合热点矩阵创建的可视化。图6A显示了根据某些实施例所述的对角可视化。图6A所示的对角可视化是条形图，与图5D中的对角线501相对应。图形的x轴列出了不同的荧光基团，而y轴是标度，与荧光基团中解混数据的标准偏差因x轴上荧光基团构成的组合中解混而放大的系数相对应。在图6A的示例中，箭头所指的荧光基团（VioR667、APC、SparkNIR685）与荧光基团中解混数据的标准偏差放大时特别高的系数相关联。这些荧光基团可标识为整个组合中受解混依赖性扩散影响最大的荧光基团。图6B显示了示例性流式细胞仪数据，表明了加入图6A中标识的荧光染料对数据质量的影响。所述数据可以用特定的荧光染料对（右组合，最上面一行）或整个组合（右组合，最下面一行）来表示。

在某些情况下，方法包括产生扩散相关矩阵。如本发明所述，所述“扩散相关矩阵”是一种对特定荧光染料对某些数据群体（如双阴性群体）的影响进行数学描述和/或可视化的机制。在实施例中，所述扩散相关矩阵可用于预测双阴性群体中的倾斜。在本发明中，“倾斜”是指由于数据收集和/或准备的方式导致群体（例如双阴性群体）向特定方向（例如与正相关或负相关相对应）偏移的程度。在某些实施例中，准备扩散相关矩阵包括将格拉姆逆作为协方差矩阵处理，并将每行和每列归一化为其对角元素的平方根，以计算相关矩阵。在某些情况下，按如下方法计算所述扩散相关矩阵：

其中，表示取二维矩阵的对角线，或从一维向量形成对角矩阵。这步操作相当于每行除以其对角元素的平方根，每列除以对角元素的平方根。扩散相关矩阵元素[i,j]与对应于荧光基团i和j的伪逆矩阵行之间的相关性相对应。在某些情况下，方法包括基于扩散相关矩阵，使用特定荧光基团生成示例性流式细胞仪数据的可视化。与组合热点矩阵相关可视化一样，相对于扩散相关矩阵创建的示例性流式细胞仪数据可视化可以是实际可视化，也可以是模拟可视化。

图7A-7E显示了根据本发明实施例所述的扩散相关矩阵及其示例性计算过程。图7A显示了格拉姆逆矩阵逆的计算（等于伪逆矩阵的格拉姆，与伪逆矩阵的协方差成正比）。图7B显示了根据图7A中计算的格拉姆逆矩阵计算出的扩散相关矩阵。扩散相关矩阵的每个单元格都与对应于相关荧光基团的伪逆矩阵行之间测量范围介于-1.00到1.00之间的相关性相关联。单元格701限定了可能导致倾斜的目标荧光基团对。图7C-7D描述了使用单元格701中标识的荧光基团对创建的示例性流式细胞仪数据的示例性可视化。在图7C-7D中，双阴性群体702c和702d预计会呈较大的负相关。另一方面，图7E中的群体702e预计会呈较大的正相关。

在实施例中，方法包括基于用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估，对荧光染料进行优化，即，使得荧光染料组合适用于流式细胞术方案。当荧光染料组合产生可理解的流式细胞仪数据，并且这些数据可靠提供了有关所研究样本的目标特点时，可将所述荧光染料组合描述为“适用于”流式细胞术方案。在某些实施例中，当荧光素色组合提供更高的生物分辨率时，此荧光素色组合就适用于流式细胞术方案。“生物分辨率”是指区分生物试样中不同目标实体（如细胞、分子、抗原、部分、表位等）的能力。在某些情况下，尽管存在测量方差以及流式细胞仪数据空间的方差（例如，流式细胞仪数据经过荧光补偿或光谱解混处理），本发明中标识的荧光染料组合仍能产生最高生物分辨率。在某些版本中，“最高”生物分辨率相对于采用一组或多组不同于（即包含一组或多组不同于）本发明所述经评估和/或标识荧光染料的其他荧光染料所能达到的生物分辨率来进行评估。

在某些实施例中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。在某些情况下，所述组合优化算法是约束优化算法。本发明中提及的“约束优化”在其常规意义上描述了在变量受到约束的情况下，对这些变量进行优化的过程。可采用任何合适的约束优化方法。在某些情况下，所述约束优化方法是最小化算法。所谓“最小化算法”是指一种约束优化方法，其中，所述方法力求使特定变量最小化。可采用的约束优化技术的示例包括但不限于局部搜索、局部修复、回溯和约束传播。在某些情况下，这些技术可与模拟退火和遗传（进化）算法等最小化技术相结合。在某些情况下，可以结合2022年12月19日提交的第18/083,808号美国专利申请（代理人案号BECT-310（P-26714.US02））中描述的优化方案，对本发明所述的荧光染料组合进行优化，所述第18/083,808号美国专利申请的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

在实施例中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。所谓“调整”荧光染料组合中的荧光染料，是指将荧光染料或与其相关联的荧光染料标识符调换成光谱矩阵中的不同荧光染料，光谱矩阵代表可供选择的可能荧光染料或染料的调色板。可在任何给定的时间调整组合中的一种或多种荧光染料。在某些实例中，方法包括在给定的时间调换组合中的单个荧光染料。在某些情况下，优化荧光染料组合包括保持荧光染料组合的尺寸不变。换言之，即使调整了一个或多个荧光染料，所得荧光染料中的荧光染料数量也不会发生变化。例如，在调整后，经评估具有N个荧光染料的荧光染料组合将继续具有N个荧光染料。在某些实例中，荧光染料组合中的荧光染料不会被替换为荧光染料组合中已经存在的荧光素。生成调整后的荧光染料组合后，目标方法还包括评估调整后的荧光染料组合，即根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

目标方法进一步包括将第一荧光染料组合的评估与调整后荧光染料组合的评估进行比较。例如，方法可包括确定第一和调整后荧光染料组合中哪个荧光染料与流式细胞仪数据中的较小方差相关联。如果第一或调整后的荧光染料组合包括的与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料少于另一个荧光染料组合，和/或具有与方差关联较小的荧光染料（例如由定量指标确定），则可以认定此荧光染料组合更适用于生成流式细胞仪数据。在某些情况下，方法包括丢弃荧光染料与方差关联更大的荧光染料组合。

在某些情况下，方法包括迭代调整荧光染料组合，并评估每个迭代调整后的荧光染料组合的适用性。在实施例中，所述第一和调整后的荧光染料组合中，已经评估为与荧光染料数据方差关联较小的荧光染料组合可作为迭代过程下一个部分的种子。所谓“种子”是指在所述方法的一次迭代中已经确定为与一个或多个稍作修改的荧光染料组合相比，与流式细胞仪数据较小方差相关联的荧光染料组合。在某些实施例中，所述迭代过程本身重复进行，直至满足条件为止。可采用任何合适的条件来终止迭代过程。在某些实例中，所述迭代过程在一定的运行时间结束后终止。在其他实例中，所述迭代过程在针对每个经过迭代调整的荧光染料组合而产生的评估收敛时终止。换言之，所述迭代过程在后续荧光染料组合之间仅出现微小的方差差异时终止。

图8显示了根据某些实施例所述的实施本发明方法的流程图。方法包括接收输入801，其中可包括来自单染色对照组的实验/仪器特定矩阵801a，或者从参考数据库推导出的矩阵801b。在步骤802中，计算逆矩阵以及由此推导出的定量指标。这些指标可包括格拉姆逆802a、向量范数802b或矩阵范数802c。步骤802中计算出的指标后续可用于在步骤803中改进或分析荧光染料组合。其中可包括在步骤803a中采用组合热点矩阵进行扩散可视化，在步骤803b中采用扩散相关矩阵来预测双阴性群体的倾斜，在步骤803c中采用以指标为导向的手动组合优化来优化组合，或在步骤803d中采用以指标为导向的自动组合优化来优化组合。

所述主题荧光染料组合可包括任何合适的荧光染料。根据某些实施例，目标荧光染料具有范围为100 nm-800 nm（例如150 nm-750 nm，例如200 nm-700 nm，例如250 nm-650 nm，例如300 nm-600 nm，包括400 nm-500 nm）的激发极大值。根据某些实施例，目标荧光染料具有范围为400 nm-1000 nm（例如450 nm-950 nm，例500 nm-900 nm，例如550 nm-850 nm，包括600 nm-800 nm）的发射极大值。在某些实例中，所述荧光染料是发光染料，如峰值发射波长为200 nm或以上（例如250 nm或以上，例如300 nm或以上，例如350 nm或以上，例如400 nm或以上，例如450 nm或以上，例如500 nm或以上，例如550 nm或以上，例如600 nm或以上，例如650 nm或以上，例如700 nm或以上，例如750 nm或以上，例如800 nm或以上，例如850 nm或以上，例如900 nm或以上，例如950 nm或以上，例如1000 nm或以上，包括1050 nm或以上）的荧光染料。例如，荧光染料可以是峰值发射波长范围为200 nm-1200nm的荧光染料，例如300 nm-1100 nm，例如400 nm-1000 nm，例如500 nm-900 nm，包括峰值发射波长为600 nm-800 nm的荧光染料。

目标荧光染料可包括但不限于：氟硼二吡咯染料、香豆素染料、罗丹明染料、吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料、含叶绿素染料、三芳基甲烷染料、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、氰胺染料、不对称氰胺染料、醌亚胺染料、吖嗪染料、二氨吖嗪染料、番红染料、indamin、靛酚染料、氟染料、恶嗪染料、噁草酮染料、噻嗪染料、噻唑染料、氧杂蒽染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料、方酸菁、氟硼配合物、squarine roxitanes、萘类、香豆素类、恶二唑类、蒽类、芘类、吖啶类、芳基次甲基类或四吡咯类及其组合。在某些实施例中，偶联物可包括两种或两种以上染料，如两种或两种以上选自以下物质的染料：氟硼二吡咯染料、香豆素染料、罗丹明染料、吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料、含叶绿素染料、三芳基甲烷染料、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、氰胺染料、不对称氰胺染料、醌亚胺染料、吖嗪染料、二氨吖嗪染料、番红染料、indamin、靛酚染料、氟染料、恶嗪染料、噁草酮染料、噻嗪染料、噻唑染料、氧杂蒽染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料、方酸菁、氟硼配合物、squarine roxitanes、萘类、香豆素类、恶二唑类、蒽类、芘类、吖啶类、芳基次甲基类或四吡咯类及其组合。

在某些实施例中，目标荧光染料可包括但不限于异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）染料、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质-氰基染料（如PerCP-Cy5.5）、藻红蛋白-氰基（PE-Cy）染料（PE-Cy7）、别藻蓝蛋白（APC）染料（如APC-R700）、别藻蓝蛋白-氰基染料（如APC-Cy7）、香豆素染料（如V450或V500）。在某些实例中，荧光染料可包括以下一种或多种：1,4-双-(邻甲基苯乙烯基)-苯 (双-MSB 1,4-双[2-(2-甲基苯基)乙烯基]-苯)、C510染料、C6染料、尼罗红染料、T614染料（如N-[7-(甲磺酰基氨基)-4-氧代-6-苯氧基苯并吡喃-3-基]甲酰胺)、LDS 821染料((2-(6-(对二甲氨基苯基)-2,4-新戊二醇-1,3,5-六三烯基)-3-乙基苯并噻唑高氯酸盐)、mFluor染料（例如mFluor Red染料，如mFluor 780NS）。

目标荧光染料可包括但不限于荧光素、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、耐晒吕蓝色淀、Pacific Blue、Pacific Orange、罗氏黄、NBD、藻红蛋白（PE）、PE-Cy5偶联物、PE-Cy7偶联物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、BODIPY-FL、TRITC、X-Rhodamine、丽丝胺碱性蕊香红B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白（APC）、APC-Cy7偶联物、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX Blue、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX Green、TOTO-1、TO-PRO-1、噻唑橙、碘化丙啶（PI）、LDS751、7-AAD、SYTOX Orange、TOTO-3、TO-PRO-3、DRAQ5、Indo-1、Fluo-3、DCFH、DHR、SNARF、Y66H、Y66F、EBFP、EBFP2、蓝铜矿、GFPuv、T-Sapphire、TagBFP、Cerulean、mCFP、ECFP、CyPet、Y66W、dKeima-Red、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1 (Teal)、S65A、Midoriishi-Cyan、野生型GFP、S65C、TurboGFP、TagGFP、TagGFP2、AcGFP1、S65L、祖母绿、S65T、EGFP、Azami-Green、ZsGreen1、Dronpa-Green、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、TurboYFP、PhiYFP、PhiYFP-m、ZsYellow1、mBanana、Kusabira-Orange、mOrange、mOrange2、mKO、TurboRFP、tdTomato、DsRed-Express2、TagRFP、DsRed monomer、DsRed2（“RFP”）、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、mCherry、HcRed1、mKate2、Katushka（TurboFP635）、mKate（TagFP635）、TurboFP635、mPlum、mRaspberry、mNeptune、E2-Crimson、单氯二胺、钙黄绿素、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor750、Alexa Fluor 790和HyPer等。

在某些实例中，所述荧光染料组合包括一种或多种高分子染料（例如高分子荧光染料）。可用于所述主题方法和系统的高分子荧光染料多种多样。在所述方法的某些实例中，所述高分子染料包括偶联聚合物。偶联聚合物（CP）的特征是离域电子结构，所述离域电子结构包括不饱和键（如双键和/或三键）和饱和键（如单键）交替排列的主链，其中π电子可以从一个键移动至另一个键。因此，偶联主链可使高分子染料具有延伸线性结构，聚合物重复单元之间的键角有限。例如，虽然蛋白质和核酸也是聚合态，但在某些情况下并不会形成延伸杆状结构，而是折叠成更高阶的三维形状。此外，CP可能会形成“刚性杆”聚合物主链，并在沿着聚合物主链的单体重复单元之间经历有限的扭曲（如扭转）角。在某些实例中，所述高分子染料包括具有刚性杆结构的CP。高分子染料的结构特点会对分子的荧光特性产生影响。

在所述主题设备和方法中可采用任何适宜的高分子染料。在某些实例中，高分子染料是多色团，其结构能够捕获光来放大荧光基团的荧光输出。在某些实例中，所述高分子染料能够捕获光并高效地将其转换为波长较长的发射光。在某些情况下，所述高分子染料具有光捕获多发色团系统，能够将能量高效转移至附近的发光物种（如“信号发色团”）。能量转移机制包括共振能量转移（如福斯特（或荧光）共振能量转移，FRET）、量子电荷交换（德克斯特能量转移）等。在某些实例中，这些能量转移机制的距离相对较短；即，光捕获多色团系统与信号发色团的距离较近，可以实现高效能量转移。在高效能量转移的条件下，当光捕获多色团系统中存在数量较多的单个发色团时，信号发色团的发射会放大；即，当入射光（“激发光”）的波长通过光捕获多色团系统吸收时，信号发色团的发射比信号发色团直接通过泵浦光激发时更强烈。

所述多色团可以是偶联聚合物。偶联聚合物（CP）的特征是具有非定域电子结构，可用作化学和生物靶标的高响应光学报告基因。由于有效偶联长度较聚合物链长度大幅缩短，因此主链包含大量紧密相连的偶联片段。因此，偶联聚合物的光捕获效率较高，并能通过福斯特能量转移实现光放大。

目标高分子染料包括但不限于第7,270,956号；第7,629,448号；第8,158,444号；第8,227,187号；第8,455,613号；第8,575,303号；第8,802,450号；第8,969,509号；第9,139,869号；第9,371,559号；第9,547,008号；第10,094,838号；第10,302,648号；第10,458,989号；第10,641,775号和第10,962,546号美国专利中描述的染料，上述美国专利的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分；Gaylord等人，《美国化学会志》，2001，123（26），第6417–6418页；Feng等人，《化学会评论》，2010，39，2411-2419；Traina等人，《美国化学会志》，2011，133（32），第12600–12607页中描述的染料，上述出版物的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。可采用的特定高分子染料包括但不限于BD HorizonBrilliant™染料，例如BD Horizon Brilliant™紫色染料（例如BV421、BV510、BV605、BV650、BV711、BV786）；BD Horizon Brilliant™紫外线染料（例如BUV395、BUV496、BUV737、BUV805）；BD Horizon Brilliant™蓝色染料（例如BB515）（BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞）。本主题方法可采用本领域技术人员已知的任何荧光染料，包括但不限于上文所述的荧光染料或尚未发现的荧光染料。

本主题荧光染料组合中的荧光染料和/或光谱矩阵中参照的荧光染料可能与生物分子（如生物大分子）耦合，也可能不与其耦合。所述生物大分子可以是生物聚合物。“生物聚合物”是由一种或多种重复单元组成的聚合物。生物聚合物通常存在于生物系统中，具体包括多糖（如碳水化合物）、肽（使用此术语以包括多肽和蛋白质，无论是否附着于多糖）、多核苷酸及其类似物，例如由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成或包含这些物质的化合物。其中包括多核苷酸，其中常规主链由非天然生成的主链或合成主链取代；以及核酸（或合成或天然生成的类似物），其中一个或多个常规碱基由能够参与‌Watson-Crick型氢键相互作用‌的基团（天然或合成）取代。多核苷酸包括单链或多链构型，其中，一条或多条链可能与另一条链完全对齐，也可能不完全对齐。具体而言，“生物聚合物”包括DNA（包括cDNA）、RNA和寡核苷酸（不考虑来源）。因此，生物大分子可包括多糖、核酸和多肽。例如，核酸可以是寡核苷酸、截短或全长DNA或RNA。在实施例中，寡核苷酸、截短和全长DNA或RNA由10个或以上核苷酸单体（例如15个或以上，例如25个或以上，例如50个或以上，例如100个或以上，例如250个或以上，包括500个或以上核苷酸单体）组成。例如，目标寡核苷酸、截短和全长DNA或RNA的长度范围可以是10个核苷酸-10⁸个核苷酸，例如10²个核苷酸-10⁷个核苷酸，包括10³个核苷酸-10⁶个核苷酸。在实施例中，生物聚合物并非单核苷酸或短链寡核苷酸（例如少于10个核苷酸）。所谓“全长”是指DNA或RNA是一种具有70%或以上完整序列（例如在自然界中发现的完整序列）（例如75%或以上，例如80%或以上，例如85%或以上，例如90%或以上，例如95%或以上，例如97%或以上，例如99%或以上，包括100%的DNA或RNA全长序列（例如在自然界中发现的全长序列））的核酸聚合物。

在某些实例中，多肽可以是截短或全长蛋白质、酶或抗体。在实施例中，多肽、截短和全长蛋白质、酶或抗体由10个或以上氨基酸单体（例如15个或以上，例如25个或以上，例如50个或以上，例如100个或以上，例如250个或以上，包括500个或以上氨基酸单体）组成。例如，目标多肽、截短和全长蛋白质、酶或抗体的长度范围可以是10个氨基酸-10⁸个氨基酸，例如10²个氨基酸-10⁷个氨基酸，包括10³个氨基酸-10⁶个氨基酸。在实施例中，生物聚合物并非单个氨基酸或短链多肽（例如少于10个氨基酸）。所谓“全长”是指所述蛋白质、酶或抗体是一种具有70%或以上完整序列（例如在自然界中发现的完整序列）（例如75%或以上，例如80%或以上，例如85%或以上，例如90%或以上，例如95%或以上，例如97%或以上，例如99%或以上，包括100%的蛋白质、酶或抗体全长序列（例如在自然界中发现的全长序列））的多肽聚合物。

在某些实例中，所述荧光染料与特异性结合成员偶联。所述特异性结合成员和荧光染料可通过可选连接剂在两个分子的任何适宜位置相互偶联（例如以共价键联系）。本发明中使用的术语“特异性结合成员”是指彼此具有结合特异性的一对分子中的一个成员。这对分子中一个成员的表面可具有与这对分子中另一个成员的表面区域或空腔特异性结合的区域或空腔。因此，这对分子的成员具有彼此特异性结合的特性，从而产生出结合复合物。在某些实施例中，结合复合物中的特异性结合成员之间亲和力的特征是K_d（解离常数）为10^-6 M或以下，例如10^-7 M或以下，包括10^-8 M或以下，例如10^-9 M或以下、10^-10 M或以下、10^-11 M或以下、10^-12 M或以下、10^-13 M或以下、10^-14 M或以下，包括10^-15 M或以下。在某些实施例中，所述特异性结合成员以高亲和力特异性结合。所谓“高亲和力”是指结合成员以表观K_d为10×10^-9 M或以下（例如1×10^-9 M或以下，3×10^-10 M或以下，1×10^-10 M或以下，3×10^-11 M或以下，1×10^-11 M或以下，3×10^-12 M或以下，或1×10^-12 M或以下）的表观亲和力特异性结合。

特异性结合成员可以是蛋白质成员。本发明中使用的术语“蛋白质”是指由氨基酸残基组成的部分。蛋白质部分可以是多肽。在某些情况下，所述蛋白质特异性结合成员是抗体。在某些实施例中，所述蛋白质特异性结合成员是抗体片段，例如与高分子染料特异性结合的抗体结合片段。本发明中使用的术语“抗体”和“抗体分子”可交换使用，指一种由一个或多个多肽组成的蛋白质，这些多肽基本上由全部或部分已识别的免疫球蛋白基因进行编码。以人免疫球蛋白基因为例，所述已识别的免疫球蛋白基因包括kappa（k）、lambda（l）和重链基因座（它们共同组成了大量的可变区基因），以及恒定区基因mu（u）、delta（d）、gamma（g）、sigma（e）和alpha（a）（分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型）。免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个高变区（又称为“互补决定区”或“CDR”）打断的“框架”区（FR）组成。已精确限定框架区和CDR的范围（见“具有免疫学重要性的蛋白序列”，E. Kabat等人，美国卫生与公众服务部，（1991））。本发明所述的所有抗体氨基酸序列的编号均符合Kabat系统。一个物种内不同轻链或重链的框架区序列相对保守。抗体的框架区（即成分轻链和重链的组合框架区）用于定位和对齐CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。“抗体”包括全长抗体，可指来自任何生物体的天然抗体、工程抗体或出于实验、治疗或下文进一步定义的其它目的重组生成的抗体。目标抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或其他抗体抗原结合子序列，可通过修饰整个抗体产生这些抗体片段，也可利用DNA重组技术从头合成这些抗体片段。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，并且可以对细胞具有其他特异性活性（如拮抗剂、激动剂、中和抗体、抑制性抗体或刺激性抗体）。应理解，抗体可具有额外的保守氨基酸取代，对抗原结合或其他抗体功能基本没有影响。在某些实施例中，所述特异性结合成员是Fab片段、F(ab')₂片段、scFv、二抗体或三抗体。在某些实施例中，所述特异性结合成员是抗体。在某些情况下，所述特异性结合成员是鼠源性抗体或其结合片段。在某些实例中，所述特异性结合成员是重组抗体或其结合片段。

在实施例中，采用所述主题荧光染料组合来分析样本。在某些实例中，所分析的样本为生物样本。术语“生物样本”在其常规意义上是指整个生物体、植物或真菌，或者动物组织、细胞或组成部分的子集，在某些实例中，可见于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液等。因此，“生物样本”是指原生生物体或其组织的子集，以及由生物体或其组织的子集制得的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管、泌尿生殖道、泪液、唾液、乳液、血细胞、肿瘤、器官等。生物样本可以是任何类型的有机体组织，包括健康组织和病变组织（例如癌组织、恶性组织、坏死组织等）。在某些实施例中，所述生物样本是液体样本，例如血液或其衍生物，例如血浆、泪液、尿液、精液等，其中在一些情况下，所述样本是血样，包括全血，例如通过静脉穿刺或手指针刺获取的血液（血液在分析之前不一定与防腐剂、抗凝剂等任何试剂混合）。

在某些实施例中，所述样本的来源是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语广泛用于描述哺乳纲内的生物体，包括食肉目（例如狗和猫）、啮齿目（例如小鼠、豚鼠和大鼠）和灵长目（例如人类、黑猩猩和猴子）。在一些情况下，受试者是人类。所述方法可用于来自两个性别和处于任何发育阶段（即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人）的人类受试者的样本，其中在某些实施例中，所述人类受试者是少年、青少年或成人。尽管本发明可适用来自人类受试者的样本，但是应理解，所述方法也可适用来自其他动物受试者（即“非人类受试者”，例如但不限于鸟、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马）的样本。

荧光染料组合中的荧光染料可靶向不同类型的细胞（例如，通过靶向此细胞的抗体等）。使用上述目标方法可以表征多种细胞。目标靶细胞包括但不限于干细胞、T细胞、树突状细胞、B细胞、粒细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、病毒细胞（如HIV细胞）、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和红系细胞。目标靶细胞包括具有适当的细胞表面标记或抗原的细胞，利用适当的亲和剂或其偶联物，即可对所述抗原进行捕获或标记。例如，靶细胞可包括细胞表面抗原，如CD11b、CD123、CD14、CD15、CD16、CD19、CD193、CD2、CD25、CD27、CD3、CD335、CD36、CD4、CD43、CD45RO、CD56、CD61、CD7、CD8、CD34、CD1c、CD23、CD304、CD235a、T细胞受体α/β、T细胞受体γ/δ、CD253、CD95、CD20、CD105、CD117、CD120b、Notch4、Lgr5（N端）、SSEA-3、TRA-1-60抗原、双唾液酸神经节苷酯GD2和CD71。在某些实施例中，所述靶细胞选自含HIV细胞、Treg细胞、抗原特异性T细胞群、肿瘤细胞或来自全血、骨髓或脐带血的造血祖细胞（CD34+）。

在某些实施例中，通过本方法标识的荧光染料组合可用于流式细胞术方案（例如分析样本，如上文所述）。在实施此类方法时，样本（例如在流式细胞仪的流动流中）受到来自光源的光辐照。在某些实施例中，所述光源是宽带光源，发射具有宽波长范围的光，例如波长跨度为50 nm或以上，例如100 nm或以上，例如150 nm或以上，例如200 nm或以上，例如250 nm或以上，例如300 nm或以上，例如350 nm或以上，例如400 nm或以上，包括跨度500nm或以上。例如，一个合适的宽带光源发射波长为200 nm-1500 nm的光。又如，合适的宽带光源包括发射波长400 nm-1000 nm的光的光源。当方法包括用宽带光源辐照时，目标宽带光源方案可包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定型光纤耦合宽带光源、连续光谱宽带LED、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光光源、多LED集成白光光源等宽带光源或其任何组合。

在其他实施例中，本发明实施例的方法包括使用发射特定波长或窄波长范围的窄带光源进行辐照，例如使用在窄波长范围（例如50 nm或以下，例如40 nm或以下，例如30 nm或以下，例如25 nm或以下，例如20 nm或以下，例如15 nm或以下，例如10 nm或以下，例如5nm或以下，例如2 nm或以下）内发射光的光源，包括发射特定波长光（即单色光）的光源。当方法包括使用窄带光源进行辐照时，目标窄带光源方案可包括但不限于窄波长LED、激光二极管或与一个或多个光学带通滤波器、衍射光栅、单色仪或其任何组合耦合的宽带光源。

在某些实施例中，方法包括用一个或多个激光器对样本进行辐照。如上所述，激光器的类型和数量将根据样本以及所需的收集光而有所不同，可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氟化氩（ArF）准分子激光器、氟化氪（KrF）准分子激光器、氯化氙（XeCl）准分子激光器或氟化氙（XeF）准分子激光器或其组合。在其他情况下，所述方法包括采用染料激光器（如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器）对流动流进行辐照。在其他情况下，方法包括采用金属蒸气激光器（例如氦镉（HeCd）激光器、氦汞（HeHg）激光器、氦硒（HeSe）激光器、氦银（HeAg）激光器、锶激光器、氖铜（NeCu）激光器、铜激光器或金激光器及其组合）对流动流进行辐照。在其他情况下，方法包括采用固态激光器（例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO₄激光器、Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb₂O₃激光器或掺铈激光器及其组合）对流动流进行辐照。

可采用一个或多个上述光源对样本进行辐照，例如2个或更多光源，例如3个或更多光源，例如4个或更多光源，例如5个或更多光源，包括10个或更多光源。所述光源可包括各种类型光源的任何组合。例如，在某些实施例中，所述方法包括采用激光器阵列（例如具有一个或多个气体激光器、一个或多个染料激光器和一个或多个固态激光器的阵列）对流动流中的样本进行辐照。

可以在范围为200 nm-1500 nm（例如250 nm-1250 nm，例如300 nm-1000 nm，例如350 nm-900 nm，包括400 nm-800 nm）的波长下对样本进行辐照。例如，当光源是宽带光源时，可在200 nm-900 nm的波长下对样本进行辐照。在其他情况下，如果光源包括多个窄带光源，则可在范围为200 nm-900 nm的特定波长下对样本进行辐照。例如，光源可以是多个窄带LED（1 nm-25 nm），每个窄带LED都能独立发出波长范围介于200 nm-900 nm之间的光。在其他实施例中，所述窄带光源包括一个或多个激光器（如激光阵列），在范围为200 nm-700 nm的特定波长下对样本进行辐照，例如上述具有气体激光器、准分子激光器、染料激光器、金属蒸气激光器和固态激光器的激光阵列。

在使用一种以上光源的情况下，可以同时或依次使用光源或其组合对样本进行辐照。例如，可同时使用每个光源对样本进行辐照。在其他实施例中，依次使用每个光源对流动流进行辐照。在依次使用一种以上光源对样本进行辐照的情况下，每个光源辐照样本的时间可以独立为0.001微秒或以上，例如0.01微秒或以上，例如0.1微秒或以上，例如1微秒或以上，例如5微秒或以上，例如10微秒或以上，例如30微秒或以上，包括60微秒或以上。例如，方法可包括使用光源（如激光器）对样本进行辐照，持续时间范围为0.001微秒-100微秒，例如0.01微秒-75微秒，例如0.1微秒-50微秒，例如1微秒-25微秒，包括5微秒-10微秒。在依次使用两个或多个光源对样本进行辐照的实施例中，每个光源辐照样本的持续时间可以相同，也可以不同。

每个光源的辐照之间的时间段也可根据需要变化，以0.001微秒或以上（例如0.01微秒或以上，例如0.1微秒或以上，例如1微秒或以上，例如5微秒或以上，例如10微秒或以上，例如15微秒或以上，例如30微秒或以上，包括60微秒或以上）的延迟独立分开。例如，每个光源的辐照之间的时间段范围可以是0.001微秒-60微秒，例如0.01微秒-50微秒，例如0.1微秒-35微秒，例如1微秒-25微秒，包括5微秒-10微秒。在某些实施例中，每个光源的辐照之间的时间段为10微秒。在依次使用两个以上（即3个或以上）光源对样本进行辐照的实施例中，每个光源的辐照之间的延迟可以相同，也可以不同。

可连续辐照样本，也可以离散间隔辐照样本。在某些情况下，方法包括使用光源对样本中的样本进行连续辐照。在其他情况下，使用光源以离散间隔（例如每隔0.001毫秒、每隔0.01毫秒、每隔0.1毫秒、每隔1毫秒、每隔10毫秒、每隔100毫秒，包括每隔1000毫秒，或以其他间隔）对样本进行辐照。

根据光源的不同，辐照样本的距离可以不同，例如距离0.01 mm或以上，例如0.05mm或以上，例如0.1 mm或以上，例如0.5 mm或以上，例如1 mm或以上，例如2.5 mm或以上，例如5 mm或以上，例如10 mm或以上，例如15 mm或以上，例如25 mm或以上，包括50 mm或以上。此外，辐照角度也可以变化，角度范围为10°-90°，例如15°-85°，例如20°-80°，例如25°-75°，包括30°-60°，例如90°。

在实施例中，来自辐照样本的光传送至光检测系统，并采用一个或多个光电检测器进行测量。在实施主题方法时，将来自样本的光传送至三个或多个波长分离器，每个分离器可使具有预定光谱范围的光通过。将来自每个波长分离器的光谱范围的光传送至一个或多个光检测模块，所述模块具有光学元件，所述光学元件可将具有预定副光谱范围的光传送至光电检测器。

可采用光检测系统对光进行连续测量或以离散间隔测量。在某些情况下，方法包括对光进行连续测量。在其他情况下，以离散间隔测量光，例如每隔0.001毫秒、每隔0.01毫秒、每隔0.1毫秒、每隔1毫秒、每隔10毫秒、每隔100毫秒，包括每隔1000毫秒，或以其他间隔测量光。

在实施目标方法期间，可对收集到的光进行一次或多次（例如2次或更多、3次或更多、5次或更多，包括10次或更多）测量。在某些实施例中，进行2次或更多次光传播测量，在某些实例中，对数据求平均值。

在某些实施例中，所述方法包括在使用目标光检测系统检测光之前调节光。例如，来自样本源的光可经过一个或多个透镜、反射镜、针孔、狭缝、光栅、光折射器及其任何组合。在某些情况下，例如为了减小引导到上述光检测系统或光学收集系统的光的轮廓，收集到的光经过一个或多个聚焦透镜。在其他情况下，为了减少传送至光检测系统的光束发散，从样本发出的光经过一个或多个准直器。

系统

另外，本发明的各个方面还包括可执行上述方法的系统。目标系统包括处理器，所述处理器可获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。所述主题系统的处理器还可根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。在实施例中，结合可编程逻辑对目标处理器进行操作，可在硬件、软件、固件或其任何组合中实现可编程逻辑，以评估荧光色素组合。例如，在软件中实现可编程逻辑的情况下，可至少部分通过包括程序代码的计算机可读数据存储介质来实现荧光色素组合评估，所述程序代码包括指令，所述指令在执行时可获得荧光色素组合、仪器标识符以及与荧光色素组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。此外，所述指令可根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

此外，所述处理器可基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。如上所述，用于优化荧光染料组合的组合优化算法包括但不限于约束优化方法。在某些实施例中，所述处理器可产生用于生成流式细胞仪数据的荧光色素组合的评估适用性的可视化。例如，可视化实施例突出显示了荧光色素组合中与使用此荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素。在某些实施例中，所述可视化包括基于给定的荧光染料组合模拟的流式细胞仪数据图。换言之，所述可视化包括如果在配备有特定荧光染料组合的特定仪器上运行样本，则会产生示例性流式细胞仪数据。在其他版本中，所述可视化包括表格或矩阵，用于对荧光染料组合中荧光染料与方差的相关联（例如产生方差和/或受方差影响）程度进行量化。在某些此类实施例中，所述系统包括用于描绘可视化的显示器。可采用任何合适的显示器。所述主题显示器可包括但不限于监视器、平板电脑、智能手机或其他提供图形界面的电子设备。

可在多种设备（如专门编程的事件处理计算机、无线通信设备、集成电路设备或类似设备）中的任一种中实现所述主题可编程逻辑。在某些实施例中，所述可编程逻辑可由专门编程的处理器执行，可包括一个或多个处理器，如一个或多个数字信号处理器（DSP）、可配置微处理器、专用集成电路（ASIC）、现场可编程门阵列（FPGA）或其他等效集成或分立式逻辑电路。计算设备的组合（例如，DSP和微处理器的组合、多个微处理器、一个或多个微处理器与DSP内核的组合，或在至少部分数据连通情况下的任何其他此类配置）可以实现本发明所述的一个或多个特征。

在某些实例中，所述系统是或包括粒子分析仪。目标粒子分析仪可包括用于在流动流中输送粒子的流动室、用于在询问点对流动流粒子进行辐照的光源以及用于检测粒子调制光的粒子调制光检测器。在某些实施例中，所述粒子分析仪是流式细胞仪。在粒子分析仪为流式细胞仪的某些情况下，所述流式细胞仪是全光谱流式细胞仪。

如本发明所述，“流动室”在其常规意义上是指一种元件，例如小玻璃管，所述元件包含具有液体流动流的流动通道，用于在鞘液中输送粒子。目标小玻璃管包括容器，所述容器具有贯穿其中的通道。所述流动流可包括从样品管注入的液体样本。目标流动室包括可透光的流动通道。在某些情况下，所述流动室包括允许光通过的透明材料（例如石英）。在某些实施例中，所述流动室是空气流式流动室，在空气流式流动室中，对粒子的光询问发生在流动室外部（即自由空间内）。

在某些情况下，在询问点可用来自一个光源的光对流动流进行辐照。配置有流动通道的流动流可包括从样品管注入的液体样本。在某些实施例中，所述流动流可包括狭窄且快速流动的液体流，其布置方式可使在液体流中输送的线性分离粒子以单列方式相互分离。本发明中讨论的“询问点”是指流动室中的区域，在此区域中，粒子受到来自光源的光的辐照（例如用于分析）。所述询问点的大小可根据需要而变化。例如，在0 μm代表光源发射光的轴的情况下，所述询问点的范围可以是-100 μm-100 μm，例如-50 μm-50 μm，例如-25 μm-40 μm，包括-15 μm-30 μm。

粒子在流动室中受到辐照后，可观察到粒子调制型光。所谓“粒子调制型光”，是指在采用来自光源的光对粒子进行辐照后，从流动流中的粒子接收到的光。在某些情况下，所述粒子调制型光是侧向散射光。如本发明所述，侧向散射光是指从粒子表面和内部结构折射和反射的光。在附加实施例中，所述粒子调制型光包括前向散射光（即主要沿前向穿过或绕过粒子的光）。在另一些情况下，所述粒子调制型光包括荧光（即经过激发波长光的辐照之后，从荧光色素发出的光）。

如上所述，本发明的各个方面还包括光源，所述光源可在询问点对通过流动室的粒子进行辐照。本发明所述的光源可采用任何适宜的光源。在某些实施例中，所述光源是激光器。在实施例中，激光器可以是任何适宜的激光器，如连续波激光器。例如，所述激光器可以是二极管激光器，如紫外二极管激光器、可见二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，所述激光器可以是氦氖（HeNe）激光器。在某些实例中，所述激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO₂激光器、CO激光器、氩氟（ArF）准分子激光器、氪氟（KrF）准分子激光器、氙氯（XeCl）准分子激光器或氙氟（XeF）准分子激光器或其组合。在其他实例中，本发明流式细胞仪包括染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器。在其他实例中，目标激光器包括金属蒸气激光器，例如氦镉（HeCd）激光器、氦汞（HeHg）激光器、氦硒（HeSe）激光器、氦银（HeAg）激光器、锶激光器、氖铜（NeCu）激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他实例中，本发明流式细胞仪包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO₄激光器、Nd:YCa₄O(BO₃)₃激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb₂O₃激光器或掺铈激光器及其组合。

根据某些实施例，激光器光源还可包括一个或多个光学调节元件。在某些实施例中，所述光学调节元件位于光源和流动室之间，并且可包括任何能够改变辐照的空间宽度或光源辐照的某种其他特性（例如辐照方向、波长、光束宽度、光束强度和焦点）的器件。光学调节方案可包括调整光源一个或多个特性的任何适宜器件，包括但不限于镜头、反射镜、滤波器、光纤、波长分离器、针孔、狭缝、准直方案及其组合。在某些实施例中，目标流式细胞仪包括一个或多个聚焦镜头。在一个示例中，所述聚焦透镜可以是缩小镜。在其他实施例中，目标流式细胞仪包括光纤。

在光学调节元件配置为可移动光学调节元件的情况下，光学调节元件可连续移动或以离散间隔移动，例如以0.01 µm或更大增量移动，例如0.05 µm或更大增量，例如0.1 µm或更大增量，例如0.5 µm或更大增量，例如1 µm或更大增量，例如10 µm或更大增量，例如100 µm或更大增量，例如500 µm或更大增量，例如1 mm或更大增量，例如5 mm或更大增量，例如10 mm或更大增量，包括25 mm或更大增量。

可采用任何位移方案来移动光调节元件结构，例如与活动支撑台耦合，或直接采用电机驱动的平移台、导杆平移组件、齿轮式平移装置，例如采用步进电机、伺服电机、无刷电机、有刷直流电机、微型步进驱动电机、高分辨率步进电机及其他类型电机。

光源的定位可与流动室保持任何合适的距离，例如光源与流动室相隔0.005 mm或以上，例如0.01 mm或以上，例如0.05 mm或以上，例如0.1 mm或以上，例如0.5 mm或以上，例如1 mm或以上，例如5 mm或以上，例如10 mm或以上，例如25 mm或以上，包括距离100 mm或以上。此外，光源可以以相对于流动室的任何合适角度进行定位，例如范围为10°-90°的角，例如15°-85°，例如20°-80°，例如25°-75°，包括30°-60°，例如90°角。

在一些实施例中，目标光源包括多个（例如2个激光器或更多，例如3个激光器或更多，例如4个激光器或更多，例如5个激光器或更多，例如10个激光器或更多，包括15个激光器或更多）提供流动流离散辐照激光的激光器。根据照射流动流所需的光波长，每个激光器的特定波长可以在200 nm-1500 nm（例如250 nm-1250 nm、300 nm-1000 nm、350 nm-900nm，包括400 nm-800 nm）之间变化。在某些实施例中，目标激光器可包括405 nm激光器、488nm激光器、561 nm激光器和635 nm激光器中的一种或多种。

如上所述，目标粒子分析仪可进一步包括一个或多个粒子调制光检测器，用于检测粒子调制光强度数据。在某些实施例中，所述粒子调制光检测器包括一个或多个前向散射光检测器，所述前向散射光检测器可检测前向散射光。例如，所述主题粒子分析仪可包括1个前向散射光检测器或多个前向散射光检测器，如2个或更多，如3个或更多，如4个或更多，包括5个或更多。在某些实施例中，粒子分析仪包括1个前向散射光检测器。在其他实施例中，粒子分析仪包括2个前向散射光检测器。

本发明所述的前向散射光检测器可采用用于检测收集到的光的任何适宜检测器。目标检测器可包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器（APS）、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件（CCD）、增强电荷耦合器件（ICCD）、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管（PMT）、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，采用电荷耦合器件（CCD）、半导体电荷耦合器件（CCD）、有源像素传感器（APS）、互补型金属氧化层半导体（CMOS）图像传感器或N型金属氧化层半导体（NMOS）图像传感器，对收集到的光进行测定。在某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如每个区域的有源检测表面积范围为0.01 cm²-10 cm²（例如0.05 cm²-9 cm²，例如0.1 cm²-8 cm²，例如0.5 cm²-7 cm²，包括1cm²-5 cm²）的光电倍增管。

在实施例中，所述前向散射光检测器可连续或以离散的时间间隔测量光。在某些情况下，目标检测器连续测量收集到的光。在其他情况下，目标检测器可进行离散间隔测量，例如每隔0.001 ms、每隔0.01 ms、每隔0.1 ms、每隔1 ms、每隔10 ms、每隔100 ms（包括每隔1000 ms）或以其他间隔测量光。

在附加实施例中，所述一个或多个粒子调制光检测器可包括一个或多个侧向散射光检测器，用于检测侧向散射光（即从粒子表面和内部结构折射和反射出来的光）的波长。在某些实施例中，粒子分析仪包括单个侧向散射光检测器。在其他实施例中，粒子分析仪包括多个侧向散射光检测器，如2个或更多，如3个或更多，如4个或更多，包括5个或更多。

本发明所述的侧向散射光检测器可采用用于检测收集到的光的任何适宜检测器。目标检测器可包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器（APS）、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件（CCD）、增强电荷耦合器件（ICCD）、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管（PMT）、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，采用电荷耦合器件（CCD）、半导体电荷耦合器件（CCD）、有源像素传感器（APS）、互补型金属氧化层半导体（CMOS）图像传感器或N型金属氧化层半导体（NMOS）图像传感器，对收集到的光进行测定。在某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如每个区域的有源检测表面积范围为0.01 cm²-10 cm²（例如0.05 cm²-9 cm²，例如0.1 cm²-8 cm²，例如0.5 cm²-7 cm²，包括1cm²-5 cm²）的光电倍增管。

在实施例中，所述主题粒子分析仪还包括荧光检测器，所述荧光检测器可检测一种或多种荧光光波长。在其他实施例中，粒子分析仪包括多个荧光检测器，如2个或更多，如3个或更多，如4个或更多、5个或更多、10个或更多、15个或更多，包括20个或更多。

本发明所述的荧光检测器可采用用于检测收集到的光的任何适宜检测器。目标检测器可包括但不限于光学传感器或检测器，例如有源像素传感器（APS）、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件（CCD）、增强电荷耦合器件（ICCD）、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管（PMT）、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他检测器。在某些实施例中，采用电荷耦合器件（CCD）、半导体电荷耦合器件（CCD）、有源像素传感器（APS）、互补型金属氧化层半导体（CMOS）图像传感器或N型金属氧化层半导体（NMOS）图像传感器，对收集到的光进行测定。在某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如每个区域的有源检测表面积范围为0.01cm²-10 cm²（例如0.05 cm²-9 cm²，例如0.1 cm²-8 cm²，例如0.5 cm²-7 cm²，包括1 cm²-5cm²）的光电倍增管。

当所述主题粒子分析仪包括多个荧光检测器时，每个荧光检测器可以相同，或荧光检测器的集合可以是不同类型检测器的组合。例如，当所述主题粒子分析仪包括两个荧光检测器时，在某些实施例中，第一荧光检测器是CCD型器件，第二荧光检测器（或成像传感器）是CMOS型器件。在其他实施例中，所述第一和第二荧光检测器均为CCD型器件。而在其他实施例中，所述第一和第二荧光检测器均为CMOS型器件。在其他实施例中，所述第一荧光检测器是CCD型器件，所述第二荧光检测器是光电倍增管（PMT）。在其他实施例中，所述第一荧光检测器是CMOS型器件，第二荧光检测器是光电倍增管。而在其他实施例中，所述第一和第二荧光检测器均为光电倍增管。

在本公开的实施例中，荧光检测器在1个或多个波长（例如2个或更多波长、5个或更多不同波长、10个或更多不同波长、25个或更多不同波长、50个或更多不同波长、100个或更多不同波长、200个或更多不同波长、300个或更多不同波长）下测量收集到的光，包括在400个或更多不同波长下测量流动流中样本发出的光。在某些实施例中，本发明所述粒子分析仪中的2个或多个检测器可测量收集到的光的相同或交叠波长。

在某些实施例中，目标荧光检测器可测量一定波长范围内（例如200 nm-1000 nm）收集到的光。在某些实施例中，目标检测器可收集一定波长范围内光的光谱。例如，粒子分析仪可包括一个或多个检测器，所述检测器可收集一个或多个波长范围200 nm-1000 nm内光的光谱。在其他实施例中，目标检测器可测量流动流中样本在一个或多个特定波长下发出的光。例如，粒子分析仪可包括一个或多个检测器，所述检测器可测量波长450 nm、518nm、519 nm、561 nm、578 nm、605 nm、607 nm、625 nm、650 nm、660 nm、667 nm、670 nm、668nm、695 nm、710 nm、723 nm、780 nm、785 nm、647 nm、617 nm及其任何组合下的光。在某些实施例中，一个或多个检测器可与特定荧光基团配对，例如荧光分析法中与样本一起使用的荧光基团。

在某些实施例中，粒子分析仪包括一个或多个波长分离器，所述波长分离器位于流动室和粒子调制光检测器之间。本发明中使用的术语“波长分离器”在其常规意义上是指一种光学元件，可将从样本收集到的光分离成预定的光谱范围。在某些实施例中，粒子分析仪包括单个波长分离器。在其他实施例中，粒子分析仪包括多个波长分离器，如2个或更多波长分离器，如3个或更多，如4个或更多，如5个或更多，如6个或更多，如7个或更多，如8个或更多，如9个或更多，如10个或更多，如15个或更多，如25个或更多，如50个或更多，如75个或更多，包括100个或更多波长分离器。在某些实施例中，所述波长分离器可通过使具有预定光谱范围的光通过并反射一个或多个剩余光谱范围的光，将从样本收集到的光分离成预定光谱范围。在其他实施例中，所述波长分离器可通过使具有预定光谱范围的光通过并吸收一个或多个剩余光谱范围的光，将从样本收集到的光分离成预定光谱范围。在另一些实施例中，所述波长分离器可将从样本收集到的光在空间上衍射到预定光谱范围中。每个波长分离器可以是任何适宜的光分离方案，例如一个或多个二向色镜、带通滤波器、衍射光栅、分束器或棱镜。在一些实施例中，所述波长分离器是棱镜。在其他实施例中，所述波长分离器是衍射光栅。在某些实施例中，本发明光检测系统中的波长分离器是二向色镜。

合适的流式细胞术系统可包括但不限于以下文献所述内容：Ormerod（编辑）,《流式细胞术：实用方法》，牛津大学出版社（1997）；Jaroszeski等人（编辑），《流式细胞术方案》，《分子生物学方法》第91期，Humana出版社（1997）；《实用流式细胞术》，第3版，Wiley-Liss出版社（1995）；Virgo等人（2012），《临床生物化学年鉴》1月；49（pt 1）:17-28；Linden等人，《血栓形成和止血研讨会》，2004年10月；30（5）:502-11；Alison等人，《病理学杂志》，2010年12月；222（4）:335-344；以及Herbig等人（2007），《治疗药物载体系统的批判性评论》24（3）:203-255；上述文献的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。在某些实例中，目标流式细胞术系统包括BD Biosciences FACSCanto™流式细胞仪、BDBiosciences FACSCanto™ II流式细胞仪、BD Accuri™流式细胞仪、BD Accuri™ C6Plus流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelesta™流式细胞仪、BD BiosciencesFACSLyric™流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerse™流式细胞仪、BD BiosciencesFACSymphony™流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessa™流式细胞仪、BD BiosciencesLSRFortessa™ X-20流式细胞仪、BD Biosciences FACSPresto™流式细胞仪、BDBiosciences FACSVia™流式细胞仪和BD Biosciences FACSCalibur™细胞分选仪、BDBiosciences FACSCount™细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyric™细胞分选仪、BDBiosciences Via™细胞分选仪、BD Biosciences Influx™细胞分选仪、BD BiosciencesJazz™细胞分选仪、BD Biosciences Aria™细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria™ II细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria™ III细胞分选仪、BD Biosciences FACSAria™Fusion细胞分选仪和BD Biosciences FACSMelody™细胞分选仪、BD BiosciencesFACSymphony™S6细胞分选仪等。

在某些实施例中，所述本发明系统是流式细胞系统，例如以下美国专利所述的系统：第10,663,476号；第10,620,111号；第10,613,017号；第10,605,713号；第10,585,031号；第10,578,542号；第10,578,469号；第10,481,074号；第10,302,545号；第10,145,793号；第10,113,967号；第10,006,852号；第9,952,076号；第9,933,341号；第9,726,527号；第9,453,789号；第9,200,334号；第9,097,640号；第9,095,494号；第9,092,034号；第8,975,595号；第8,753,573号；第8,233,146号；第8,140,300号；第7,544,326号；第7,201,875号；第7,129,505号；第6,821,740号；第6,813,017号；第6,809,804号；第6,372,506号；第5,700,692号；第5,643,796号；第5,627,040号；第5,620,842号；第5,602,039号；第4,987,086号；第4,498,766号；所述美国专利的公开内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

在某些情况下，本发明的流式细胞术系统可通过使用射频标记发射（FIRE）的荧光成像技术对流式细胞流中的颗粒进行成像，如以下文献所述：Diebold等人《自然·光子学》第7(10); 806-810期（2013年）以及第9,423,353号；第9,784,661号；第9,983,132号；第10,006,852号；第10,078,045号；第10,036,699号；第10,222,316号；第10,288,546号；第10,324,019号；第10,408,758号；第10,451,538号；第10,620,111号美国专利；以及第2017/0133857号；第2017/0328826号；第2017/0350803号；第2018/0275042号；第2019/0376895号和第2019/0376894号美国专利出版物；所述美国专利出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

图9显示了根据本发明说明性实施例所述的用于流式细胞术的系统900。系统900包括流式细胞仪910、控制器/处理器990和存储器995。流式细胞仪910包括一个或多个激发激光器915a-915c、聚焦透镜920、流动腔925、前向散射检测器930、侧向散射检测器935、荧光收集透镜940、一个或多个分束器945a-945g、一个或多个带通滤波器950a-950e、一个或多个长通（“LP”）滤波器955a-955b和一个或多个荧光检测器960a-960f。

激发激光器915a-c发射激光束形式的光。在图9的示例系统中，从激发激光器915a-915c发射的激光束波长分别为488 nm、633 nm和325 nm。激光束首先通过一个或多个分束器945a和945b进行引导。分束器945a透射波长为488 nm的光，反射波长为633 nm的光。分束器945b透射紫外光（波长在10-400 nm范围内的光）并反射488 nm和633 nm的光。

然后，激光束被引导到聚焦透镜920，聚焦透镜920将光束聚焦到流动室925中样本粒子所在的流体流部分上。所述流动腔是将流动流粒子（通常每次一个）引导到聚焦激光束进行询问的流体系统的一部分。所述流动腔可包括台式细胞仪中的流动室或空气流式细胞仪中的喷嘴尖端。

根据粒子的特性（如尺寸、内部结构）以及是否存在一个或多个附着或天然存在于粒子之上或之中的荧光分子，在各种不同的波长下，来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收及再发射与样本中的粒子相互作用。通过分束器945c-945g、带通滤波器950a-950e、长通滤波器955a-955b和荧光收集透镜940中的一种或多种，可以将荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光导向到前向散射检测器930和侧向散射检测器935中的一个或多个，以及一个或多个荧光检测器960a-960f。

荧光收集透镜940收集通过粒子与激光束的相互作用发射的光，并将其导向到一个或多个分束器和滤波器。带通滤波器（如带通滤波器950a-950e）允许较窄范围的波长通过滤波器。例如，带通滤波器950a是510/20滤波器。第一个数字代表光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在光谱带中心每侧延伸10 nm，或者从500nm延伸到520 nm。短通滤波器透射小于等于指定波长的光。长通滤波器（例如长通滤波器955a-955b）透射波长大于等于指定光波长的光。例如，长通滤波器955b（即670 nm长通滤波器）透射大于等于670 nm的光。通常选用滤波器来优化用于特定的荧光染料的检测器的特异性。滤波器可使透射到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰值。

前向散射检测器930略微偏离通过流动室的直射光束的轴线，检测衍射光以及主要在前向上穿过或围绕粒子传播的激发光。所述前向散射检测器检测到的光的强度取决于粒子的总体尺寸。所述前向散射检测器可包括光电二极管。侧向散射检测器935可检测来自粒子表面和内部结构的折射光和反射光，而折射光和反射光往往会随着粒子结构复杂性的增加而增加。可使用一个或多个荧光检测器960a-960f检测来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器935和荧光检测器可包括光电倍增管。在前向散射检测器930、侧向散射检测器935和荧光检测器处检测到的信号可由检测器转换成电子信号（电压）。此数据可提供关于样本的信息。

本领域技术人员应认识到，根据本发明实施例所述的流式细胞仪不限于图9所示的流式细胞仪，而是可包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可具有任何数量的各种波长和各种不同配置的激光器、分束器、滤波器和检测器。

在运行过程中，流式细胞仪由控制器/处理器990控制，来自检测器的测量数据可存储在存储器995中并由控制器/处理器990进行处理。虽然未明确示出，但是控制器/处理器990与检测器耦合以从其接收输出信号，还可与流式细胞仪910的电气和机电部件耦合，从而控制激光器、流体流动参数等。所述系统还可具有输入/输出（I/O）能力997。存储器995、控制器/处理器990和I/O 997可全部作为流式细胞仪910的组成部分。在此类实施例中，显示器也可构成用于向细胞仪910的用户提供实验数据的I/O能力997的一部分。可替代地，存储器995和控制器/处理器990以及I/O能力中的部分或全部可以是一个或多个外部设备（例如通用计算机）的一部分。在一些实施例中，存储器995和控制器/处理器990中的部分或全部可与细胞仪910进行无线或有线通信。控制器/处理器990与存储器995和I/O 997一起执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。

图9所示的系统包括六个不同的检测器，所述检测器检测如从流动室925到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分束器的配置所定义的六个不同波段（在本发明中可称为用于给定检测器的“滤波器窗口”）中的荧光。用于流式细胞仪实验的荧光色素面板中的不同荧光分子将会以各自特有的波长带发光。为了与检测器的滤波器窗口大体上保持一致，可选择用于实验的特定荧光标签及其相关荧光发射带。I/O 997可接收关于流式细胞仪实验的数据，所述实验包含一组荧光标签以及具有多个标记的多个细胞群体，每个细胞群体具有所述多个标记的子集。I/O 997还可接收向一个或多个细胞群体分配一个或多个标记的生物数据、标记密度数据、发射光谱数据、向一个或多个标记分配标签的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据，例如标签光谱特征和流式细胞仪配置数据，也可存储在存储器995中。控制器/处理器990可评估标签在标志物中的一个或多个分配结果。

在一些实施例中，所述主题系统是粒子分选系统，可通过封闭式粒子分选模块分选粒子，例如2017年3月28提交的第2017/0299493号美国专利出版物中描述的粒子分选模块，所述美国专利出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块分选样本的粒子（例如细胞），例如于2019年12月23日提交的第2020/0256781号美国专利出版物中描述的分选决策模块，所述美国专利出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。在某些实施例中，样本组分分选系统包括具有偏转板的粒子分选模块，如2017年3月28日提交的第2017/0299493号美国专利出版物所述，所述美国专利出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

图10是用于分析和显示生物事件的控制系统（例如处理器1000）的一个示例的功能框图。处理器1000可实现用于控制生物事件的图形显示的各种过程。

流式细胞仪或分选系统1002可采集生物事件数据。例如，流式细胞仪可生成流式细胞事件数据（例如粒子调制型光数据）。流式细胞仪1002可向处理器1000提供生物事件数据。流式细胞仪1002与处理器1000之间可设有数据通信信道。通过数据通信信道，可以向处理器1000提供生物事件数据。

处理器1000可从流式细胞仪1002接收生物事件数据。从流式细胞仪1002接收到的生物事件数据可包括流式细胞事件数据。处理器1000可向显示设备1006提供图形显示，包括生物事件数据的第一图表。处理器1000可进一步将目标区域呈现为由显示设备1006所示覆盖在第一图表上的一组生物事件数据周围的门（例如第一门）。在某些实施例中，所述门可以是在单参数直方图或双变量图上绘制的一个或多个目标图形区域的逻辑组合。在某些实施例中，所述显示器可用于显示粒子参数或饱和的检测器数据。

处理器1000可进一步在显示设备1006上在门内显示生物事件数据，其与门外生物事件数据中的其他事件不同。例如，处理器1000可呈现包含在门内的生物事件数据的颜色，其与门外生物事件数据的颜色不同。显示设备1006可实现为监视器、平板电脑、智能手机或其他呈现图形界面的电子设备。

处理器1000可从第一输入设备接收识别门的门选择信号。例如，第一输入设备可实现为鼠标1010。鼠标1010可向处理器1000发送门选择信号，识别需在显示设备1006上显示或通过显示设备操纵的门（例如，当光标位于所需的门上或门中时，单击此处即可）。在一些实施方式中，第一设备可实现为键盘1008或其他用于向处理器1000提供输入信号的装置，例如触摸屏、手写笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备可包括多项输入功能。在此类实施方式中，每项输入功能均可视为输入设备。例如，如图10所示，鼠标1010可包括鼠标右键和鼠标左键，其中每个键均可生成触发事件。

触发事件可使处理器1000改变数据显示方式以及显示设备1006上实际显示的数据部分，并且/或者提供输入信息进行进一步处理，例如选择目标群体进行粒子分选。

在一些实施例中，处理器1000可检测由鼠标1010发起门选择的时间。处理器1000可进一步自动修改图表可视化来促进选通过程。修改可基于处理器1000接收到的生物事件数据的特定分布。在某些实施例中，处理器1000扩展第一门，从而生成第二门（例如，如上文所述）。

处理器1000可与存储设备1004连接。存储设备1004可接收并存储来自处理器1000的生物事件数据。存储设备1004还可接收并存储来自处理器1000的流式细胞事件数据。存储设备1004可进一步允许通过处理器1000检索生物事件数据，例如流式细胞事件数据。

显示设备1006可从处理器1000接收显示数据。显示数据可包括生物事件数据的图表以及勾勒出图表各部分的门。显示设备1006可进一步根据从处理器1000接收到的输入信息，结合来自流式细胞仪1002、存储设备1004、键盘1008和/或鼠标1010的输入信息，改变呈现的信息。

此外，处理器1000还可对荧光染料组合进行评估。在这种情况下，处理器1000可获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。处理器1000还可根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。在某些情况下，处理器1000还可基于荧光色素组合评估生成可视化。在某些情况下，这种可视化可以显示在显示设备1006上。

在一些实施方式中，处理器1000可生成用户界面来接收用于分选的示例事件。例如，所述用户界面可包括一个用于接收示例事件或示例图像的机构。可在收集样本的事件数据之前，或者根据部分样本的初始事件集，提供示例事件或图像或示例门。

图11A是根据本发明一个实施例所述的粒子分选仪系统1100（例如流式细胞仪502）的示意图。在某些实施例中，粒子分选仪系统1100是细胞分选仪系统。如图11A所示，液滴形成传感器1102（例如压电振荡器）与流体导管1101耦合，流体导管1101可与喷嘴1103耦合，可包括喷嘴1103，或者可以是喷嘴1103。在流体导管1101内，鞘液1104以流体力学方式将包含粒子1109的样本流体1106聚焦到移动液柱1108（例如液流）中。在移动液柱1108内，粒子1109（例如细胞）排列成单列，横穿监测区1111（例如激光与液流交汇处），并受到辐照源1112（例如激光器）的辐照。液滴形成传感器1102振动，使移动液柱1108断裂成多个液滴1110，其中一些液滴包含粒子1109。

在运行过程中，由检测站1114（例如事件检测器）确定目标粒子（或目标细胞）横穿监测区1111的时间。检测站1114馈入定时电路1128，定时电路1128再馈入闪光充电电路1130。在液滴断裂点处，在定时液滴延迟（Δt）的提醒下，可以对移动液柱1108进行闪光充电，以便使目标液滴带电。目标液滴可包括一个或多个待分选的粒子或细胞。然后，可以通过激活偏转板（未显示）对带电液滴进行分选，将带电液滴偏转到收集管或多孔或微孔样品板等容器中，在容器中，孔或微孔可与特定目标液滴相关联。如图11A所示，可在排放容器1138中收集液滴。

当目标粒子通过监测区1111时，检测系统1116（例如液滴边界检测器）起到自动确定液滴驱动信号相位的作用。第7,679,039号美国专利对示例性液滴边界检测器进行了描述，所述美国专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。检测系统1116允许仪器准确计算出每个检测粒子在液滴中的位置。检测系统1116可以馈入振幅信号1120和/或相位信号1118，进而（通过放大器1122）馈入振幅控制电路1126和/或频率控制电路1124。振幅控制电路1126和/或频率控制电路1124进而控制液滴形成传感器1102。振幅控制电路1126和/或频率控制电路1124可包含在控制系统中。

在某些实施方式中，分选电子设备（例如检测系统1116、检测站1114和处理器1140）可与存储器耦合，所述存储器可存储检测到的事件和基于事件的分选决策。分选决策可包含在粒子的事件数据中。在某些实施方式中，检测系统1116和检测站1114可以作为单个检测单元实现，也可以通信方式耦合，以便能够通过检测系统1116或检测站1114收集事件测量值并提供给非收集元件。

图11B是根据本发明一个实施例所述的粒子分选仪系统的示意图。图11B所示的粒子分选仪系统1100包括偏转板1152和1154。可通过倒刺中的液流充电线施加电荷。这样就形成了含有待分析粒子1109的液滴流1110。可采用一个或多个光源（例如激光器）对粒子进行辐照，以生成光散射和荧光信息。通过分选电子设备或其他检测系统（图11B中未示出）对粒子信息进行分析。偏转板1152和1154可以独立控制，以吸引或排斥带电液滴，将液滴导向目的地收集容器（例如，1172、1174、1176或1178其中的一个）。如图11B所示，可以控制偏转板1152和1154引导粒子沿第一路径1162流向容器1174或沿第二路径1168流向容器1178。如果所述粒子不是目标粒子（例如，在规定分选范围内未显示散射或照明信息），则偏转板可允许粒子继续沿流动路径1164流动。这种不带电的液滴可以经抽气机1170等进入废物容器。

分选电子设备可包含在内，以启动测量值收集、接收粒子的荧光信号以及确定如何调节偏转板，实现粒子分选。图11B所示实施例的示例实施方式包括美国BD公司（新泽西州富兰克林湖）提供的BD FACSAria™系列流式细胞仪。

计算机可读存储介质

本公开的各个方面进一步包括非暂态计算机可读存储介质，其存储有用于实施所述主题方法的指令。计算机可读存储介质可用于实现用于实施本发明所述方法的系统的完全自动化或部分自动化的一台或多台计算机。在某些实施例中，根据本发明中方法所述的指令可以以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中术语“计算机可读介质”是指任何参与向计算机提供指令和数据以供执行和处理的过程的非暂态存储介质。在某些情况下，所述指令在执行时可获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵。此外，所述指令可根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

合适的非暂态存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光盘、固态盘、闪存驱动器和网络附加存储（NAS）（无论此类设备位于计算机内部还是外部）。包含信息的文件可“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，使计算机以后可以访问和检索此信息。执行本发明所述由计算机实现的方法时，可以以任意数量的计算机编程语言中的一种或多种语言进行编程。此类语言包括Java、Python、Visual Basic和C++等。

在某些实施例中，目标计算机可读存储介质包括存储在其上的计算机程序，其中，在计算机上加载时，所述计算机程序包括用于获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵的指令。此外，指令还包括根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

计算机控制系统

本公开的各个方面进一步包括计算机控制系统，其中，所述系统包括一台或多台实现用于实施完全自动化或部分自动化的计算机。在某些实施例中，系统包括存储有计算机程序的计算机，其中，在计算机上加载时，所述计算机程序包括用于获得荧光染料组合、仪器标识符以及与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵的指令。此外，指令还包括根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵，以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素，以评估荧光色素组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

系统可包括显示器和操作员输入设备。例如，操作员输入设备可以是键盘、鼠标等。所述处理模块包括可访问存储器的处理器，所述存储器包含用于执行所述主题方法的步骤的指令。所述处理模块可包括操作系统、图形用户界面（GUI）控制器、系统存储器、记忆存储设备、输入和输出控制器、高速缓存存储器、数据备份单元及许多其他设备。所述处理器可以是市售处理器，也可以是一种现在或将来可用的其他处理器。所述处理器执行操作系统，所述操作系统以已知的方式通过接口与固件和硬件连接，帮助处理器协调和执行各种计算机程序的功能，所述计算机程序可采用各种编程语言，例如Java、Perl、C++、Python、其他本领域已知的高级或低级语言及其组合。所述操作系统通常与处理器协作，协调并执行计算机的其他组成部分的功能。所述操作系统还提供调度、输入和输出控制、文件和数据管理、存储器管理和通信控制及相关服务，所述服务均基于已知技术。在某些实施例中，所述处理器包括提供反馈控制（例如负反馈控制）的模拟电子设备。

所述系统存储器可以是各种已知或未来记忆存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器（RAM）、磁性介质（例如常驻硬盘或磁带）、光学介质（例如读写光盘）、闪存设备或其他记忆存储设备。所述记忆存储设备可以是各种已知或未来设备中任一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器或软盘驱动器。此类记忆存储设备通常对光盘等程序存储介质（未示出）进行读取和/或写入。这些程序存储介质中任何一种，或者其他当前使用或以后可能开发的程序存储介质，都可视为计算机程序产品。应理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序（又称为计算机控制逻辑）通常存储在系统存储器和/或配合记忆存储设备使用的程序存储设备中。

在某些实施例中，本发明描述了一种计算机程序产品，其包括包含控制逻辑（计算机软件程序，包括程序代码）的计算机可用介质。由处理器和计算机执行时，控制逻辑使处理器执行本发明所述的功能。在其他实施例中，主要（例如）通过硬件状态机在硬件中实现一些功能。对相关领域的技术人员来说显而易见的是，实现硬件状态机可以执行本发明所述的功能。

存储器可以是任何可供处理器存储和检索数据的适当设备，例如磁性、光学或固态存储设备（包括磁盘、光盘、磁带或RAM，或者任何其他适当的固定式或便携式设备）。所述处理器可包括通用数字微处理器，其由承载必要程序代码的计算机可读介质适当编程。编程可通过通信信道远程提供给处理器，或者先前保存在计算机程序产品（例如存储器或其他利用任何存储器相关设备的便携式或固定式计算机可读存储介质）中。例如，磁盘或光盘可承载编程，并且可由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括（例如）以计算机程序产品的形式对用于实施上述方法的算法进行编程。根据本发明所述的编程可记录在计算机可读介质（例如任何可供计算机直接读取和访问的介质）上。此类介质包括但不限于：磁性存储介质；光学存储介质，例如CD-ROM；电气存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合介质，例如磁性/光学存储介质。

所述处理器还可访问通信信道，与远程位置的用户进行通信。远程位置是指用户不直接与系统接触，将输入信息从外部设备（例如连接到广域网（“WAN”）、电话网、卫星网或任何其他适当通信信道的计算机，包括移动电话（即智能手机）中继到输入管理器。

在某些实施例中，根据本公开所述的系统可包括通信接口。在某些实施例中，所述通信接口包括接收机和/或发射机，其用于与网络和/或另一设备进行通信。所述通信接口可用于有线或无线通信，包括但不限于射频（RF）通信（例如射频识别（RFID））、Zigbee通信协议、Wi-Fi、红外、无线通用串行总线（USB）、超宽带（UWB）、Bluetooth^®通信协议，以及蜂窝通信，例如码分多址（CDMA）或全球移动通信系统（GSM）。

在一个实施例中，所述通信接口可包括一个或多个通信端口，例如物理端口或接口，例如USB端口、USB-C端口、RS-232端口或任何其他适当的电气连接端口，以实现（例如医生办公室或医院环境中）所述主题系统与用于类似补充数据通信的计算机终端等其他外部设备之间的数据通信。

在一个实施例中，所述通信接口用于红外通信、Bluetooth^®通信或任何其他适当的无线通信协议，使所述主题系统能够与计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理等其他设备或任何其他可供用户结合使用的通信设备进行通信。

在一个实施例中，所述通信接口通过手机网络、短信服务（SMS）、与连接到互联网的局域网（LAN）上的个人计算机（PC）的无线连接或Wi-Fi热点上与互联网的Wi-Fi连接，利用因特网协议（IP）提供用于数据传送的连接。

在一个实施例中，所述主题系统通过通信接口（例如采用802.11或Bluetooth^® RF协议等公共标准，或者IrDA红外协议）与服务器设备进行无线通信。所述服务器设备可以是另一台便携式设备，如智能手机、个人数字助理（PDA）或笔记本电脑；或者更大的设备，如台式计算机、家用电器等。在某些实施例中，所述服务器设备具有显示器（如液晶显示器（LCD））以及输入设备（如按钮、键盘、鼠标或触摸屏）。

在某些实施例中，所述通信接口通过采用上述一个或多个通信协议和/或机制的网络或服务器，自动或半自动地传递所述主题系统（例如可选数据存储单元）中存储的数据。

输出控制器可包括用于各种已知显示设备中任一种的控制器，所述显示设备用于向用户（无论人还是机器，无论本地还是远程）呈现信息。如果其中一种显示设备提供可视信息，通常可以在逻辑和/或物理上将这些信息整理成像素阵列。图形用户界面（GUI）控制器可包括用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口以及处理用户输入信息的各种已知或未来软件程序中的任一种。计算机的功能构件彼此可通过系统总线进行通信，在替代实施例中可利用网络或其他类型的远程通信完成其中一些通信。输出管理器还可根据已知技术，例如通过因特网、电话或卫星网络，向远程位置的用户提供处理模块生成的信息。输出管理器对数据的呈现可基于各种已知技术。例如，数据可包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件或其他形式的数据。数据可包括因特网URL地址，以便用户可以从远程源检索更多SQL、HTML、XML或其他文档或数据。尽管所述主题系统中存在的一个或多个平台通常属于俗称为服务器的计算机大类，但是它们也可以是任何类型的已知计算机平台或将来开发的类型。然而，它们还可以是主架计算机、工作站或其他计算机类型。这些平台可通过任何已知或未来类型的布线或其他通信系统（包括无线系统）以联网或其他方式连接。它们可以同地协作，也可以在物理上分开。各种操作系统可能应用于任何计算机平台，这很可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或型号。合适的操作系统包括Windows^® NT^®、Windows^® XP、Windows^® 7、Windows^® 8、Windows^® 10、iOS^®、macOS^®、Linux^®、Ubuntu^®、Fedora^®、OS/400^®、i5/OS^®、IBM i^®、Android™、SGI IRIX^®、Oracle Solaris^®等。

图12显示了根据某些实施例所述的示例计算设备1200的一般架构。图12所示计算设备1200的一般架构包括计算机硬件和软件组件的布置。然而，不必出于公开目的示出所有一般常规构件。如图所示，计算设备1200包括处理单元1210、网络接口1220、计算机可读介质驱动器1230、输入/输出设备接口1240、显示器1250和输入设备1260，所述全部设备均可以通信总线的方式进行相互通信。网络接口1220可提供与一个或多个网络或计算系统的连通性。因此，处理单元1210可通过网络从其他计算系统或服务接收信息和指令。处理单元1210还可与存储器1270进行通信，并进一步通过输入/输出设备接口1240向可选显示器1250提供输出信息。例如，作为可执行指令存储在分析系统非暂态存储器中的分析软件（如FlowJo^®等数据分析软件或程序）可向用户显示流式细胞术事件数据。输入/输出设备接口1240还可接收来自可选输入设备1260（例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏手柄、加速度计、陀螺仪或其他输入设备）的输入信息。

为了实现一个或多个实施例，存储器1270可包含处理单元1210执行的计算机程序指令（在某些实施例中以模块或组件形式进行分组）。存储器1270一般包括RAM、ROM和/或其他永久、辅助或非暂态计算机可读介质。存储器1270可存储操作系统1272，所述操作系统提供在计算设备1200的一般管理和操作方面供处理单元1210使用的计算机程序指令。数据可存储在数据存储设备1290中。存储器1270可进一步包括用于实施本公开各个方面的计算机程序指令及其他信息。

实用功能

本发明的方法、系统和计算机可读介质可用于需要自动确定用于粒子分析（如流式细胞仪）的几组可使用荧光染料组合的场合。在某些情况下，本发明尤其适用于全光谱（即“光谱”）流式细胞术组合的实验设计。换言之，通过指定一组染料是否可以同时使用，本发明可作为光谱组合设计的第一步。在某些实例中，本发明所述的方法、系统和计算机可读介质有助于确定哪一组（哪几组）荧光染料有可能提供最优质的数据（例如最大生物分辨率）。本发明可通过自动优化算法、将荧光染料的光谱特征作为算法的现成易测量输入以及将光谱矩阵作为高计算效率的启发式优化来实现上述目的。

本发明的实施例可用于可能需要使用由生物样本制得的细胞进行研究、实验室试验或治疗的应用。在一些实施例中，所述主题方法和设备可以有助于获得由目标流体或组织生物样本制得的单个细胞。例如，所述主题方法和系统有助于从流体或组织样本中获得细胞用作癌症等疾病的研究或诊断样本。同样，所述主题方法和系统可有助于从流体或组织样本中获得细胞用于治疗。与传统流式细胞术系统相比，本公开所述的方法和设备允许以高效率、低成本从生物样本（例如器官、组织、组织碎片、流体）中分离和收集细胞。

套件

本公开的各个方面进一步包括套件，其中，所述套件包括用于执行要求保护的方法的指令和/或可编程逻辑。例如，套件包括可以对荧光染料组合进行评估和可选优化的编程（例如，如上文方法部分所述），例如以计算机可读介质的形式（如闪存驱动器、USB存储、光盘、DVD、蓝光盘等）或从互联网网络协议或云服务器下载编程的指令。

套件可进一步包括用于实施所述主题方法的指令。这些指令可以以各种形式存在于所述主题套件中，其中在所述套件中可以存在一种或多种形式。这些指令的一种存在形式是在适当介质或基底（例如一张或多张印有信息的纸）上、套件包装中、包装说明书中等位置打印的信息。这些指令的另一形式是包含信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘（CD）、便携式闪存驱动器等。这些指令的另一种存在形式是可用于通过互联网访问被移除站点上信息的网址。

以解释说明的方式（而非限制的方式）提供以下示例：

实验性示例

示例1

对原始流式细胞仪数据（VioBrightR667单染色对照组）进行研究，了解三种不同类型的解混依赖性扩散：1）非预期阴性扩散；2）非预期溢出扩散；3）倾斜双阴性。这些扩散表现形式都会降低组合中的生物分辨率。关于1），原始数据显示，在用40C矩阵（图13B）和25C矩阵（图13A）解混时，解混后的VioBrightR667通道中阴性细胞的方差显著较高。关于2），相同的原始数据显示，在40C组合（图14B）和25C组合（图14A）中解混时，从R718到VioBrightR667中的溢出扩散显著较高。关于3），双阴性群体在完整40C组合（图15A-15B）中显示出极端程度的负协方差，不能反映真实的基本生物表达。

示例2

对荧光染料组合进行“热点”研究，即，在组合中一起使用时，具有发射光谱的荧光染料会产生上述类型的解混依赖性扩散。热点可能位于某些“光谱邻域”内部及其周围。例如，如果一种荧光染料和另一种荧光染料具有相似的光谱，以至于有可能发生重叠，则可以认为一种荧光染料在另一种荧光染料的光谱邻域内。评估两个热点：其中一个热点在APC光谱邻域内（热点1），另一个热点在BB700光谱邻域内（热点2）。SparkNIR685和VioR667可视为APC光谱邻域的一部分，而PerCP和PerCP-Cy5.5可视为BB700光谱邻域的一部分。利用这些荧光染料的组合，绘制流式细胞仪数据图。关于热点1，获得了SparkNIR685/APC、SparkNIR685/VioR667和APC/VioR667的流式细胞仪数据。关于热点2，获得了BB700/PerCP、BB700/PerCP-Cy5.5和PerCP/PerCP-Cy5.5的流式细胞仪数据。利用每个荧光染料对的效应，结合自发荧光、第一全组合（39C组合A）或第二全组合（39C组合B），获得这些数据。以下表1列出了这些组合。

图16A-16D显示了关于热点1收集的流式细胞仪数据。图16A-16C分别显示了SparkNIR685/APC、SparkNIR685/VioR667和APC/VioR667荧光基团对结合自发荧光的流式细胞仪数据。这些数据表明，在没有全组合的情况下，解混依赖性扩散的基线程度。图16D-16F分别显示了39C组合A背景下SparkNIR685/APC、SparkNIR685/VioR667和APC/VioR667的流式细胞仪数据。如图16D-16F所示，APC的光谱邻域存在严重的扩散热点。图16G显示了39C组合B背景下从SparkNIR685/APC收集的流式细胞仪数据。由于39C组合B中没有VioR667，因此未生成此荧光染料的流式细胞仪数据。

图17A-17D显示了关于热点2收集的流式细胞仪数据。图17A-17C分别显示了来自BB700/PerCP、BB700/PerCP-Cy5.5和PerCP/PerCP-Cy5.5的流式细胞仪数据（结合自体发光）。这些数据表明，在没有全组合的情况下，解混依赖性扩散的基线程度。图17D显示了39C组合A背景下来自BB700/PerCP荧光基团对的流式细胞仪数据。如图17D所示，BB700光谱邻域中存在最小扩散。图17E-17G显示了39C组合B背景下BB700/PerCP、BB700/PerCP-Cy5.5和PerCP/PerCP-Cy5.5荧光基团对的流式细胞仪数据。

将39C组合A的结果与39C组合B的结果进行比较，结果表明，扩散热点从APC光谱邻域转移至BB700光谱邻域。因此，结果表明，扩增并不仅仅取决于荧光基团对中使用的荧光染料，而是取决于组合中的全套染料。

示例3

计算39C组合中荧光染料的相似度指数。在0-1范围内，此指数比较了两种荧光基团光谱的相似程度。计算结果如图18所示。在图18左侧的图表中，基于相似度指数对每个单元格进行了颜色编码，颜色越深代表相似度越高。从图表中放大高相似度对的子集。如图表中放大部分所示，以相似度指数衡量时，BB515/cFluorB532和BB700/PerCP-Cy5.5具有明显相似的光谱。BB515/cFluorB532对的相似度指数为0.91，而BB700/PerCP-Cy5.5对的相似度指数为0.90。仅从荧光染料对及其相关自发荧光以及全荧光染料组合背景下的相同荧光染料对中收集流式细胞仪数据。由此得到的流式细胞仪数据图如图18右侧所示。收集到的BB515/cFluorB532（顶部）流式细胞仪数据表明，相对于仅从荧光染料对收集数据，全组合扩散未变化。然而，收集到的BB700/PerCP-Cy5.5（底部）流式细胞仪数据表明，相对于仅从荧光染料对收集数据，全组合扩散发生了明显变化。相应地，结果表明，荧光染料对1（BB515和cFluorB532）和荧光染料对2（BB700和PerCP-Cy5.5）的相似度指数相当，但在全组合中的扩散却显著不同。因此，结果表明，相似度指数无法预测全组合背景下的扩散差异。换言之，相似度指数表明两种荧光基团一起使用时是否可能产生问题，但并未表明是否确实存在问题。

此外，还计算了两种不同荧光染料组合（组合A和组合B）的条件数，这两种组合的差别仅在于一种荧光染料。下表1列出了每个组合的荧光染料。结果表明，组合A的条件数为69.8，而组合B的条件数为67.0。开发了组合A和组合B的背景下APC/SparkNIR685和BB700/PerCP荧光染料对中每个荧光染料对的流式细胞仪数据。结果如图19所示。组合A中荧光染料对的图在左侧显示，而组合B中荧光染料对的图在右侧显示。如图19所示，组合A和组合B的差别在于一个荧光基团，条件数相当，但相同染料对在组合A和组合B中的扩散情况却显著不同。因此得出的结论是，条件数并不能表明哪些荧光基团与全组合扩散有关。换言之，条件数能够表明给定组合可能存在问题，但并不能说明哪些荧光染料导致了问题或如何解决。

对上述组合A（图20）和组合B（图21）进行了相似度分析。这项分析涉及绘制相似度指数对比平均全矩阵溢出扩散（SS）。如图20和图21所示，相似度分析并不能预测两个不同组合中将会出现扩散的位置。

示例4

分别生成组合A和组合B的组合热点矩阵，如下表1所示。采用如上所述图5A-5D所示方法，创建组合热点矩阵。组合A热点矩阵如图22所示，而组合B热点矩阵如图23所示。如图22和图23所示，与之前的荧光染料组合分析不同，组合热点矩阵正确标识了哪些荧光染料在组合A和组合B中受解混扩散的影响最大。因此，结果表明，组合热点分析能够正确标识不同组合中的扩散问题区域。

为了进一步证明组合热点矩阵具备此能力，针对组合A（图 24）和组合B（图25）中的每个组合制作了与组合热点矩阵所标识的受扩散影响的荧光染料相关流式细胞仪数据图。如图24和图25所示，经组合热点矩阵标识为受扩散影响的荧光染料确实受到扩散影响。在组合热点矩阵中，高量级对角元素表示受影响最大的荧光染料，而高量级非对角元素表示有问题的染料对。

示例5

对组合热点矩阵估计扩散严重程度的能力进行研究。为此，对上述组合A热点矩阵进行了分析。结果如图26所示。组合A热点矩阵单元格中以颜色密度表示的定量指标的大小可以追踪热点的严重程度。在矩阵中定量指标大小较高的区域，热点的扩散较严重，而定量指标大小相对较低的热点，扩散相应较低。这些信息表明，在组合中，解混依赖性扩散在哪些地方最容易出现问题，在将荧光染料分配给标志物时，这些信息可用于组合设计（例如，由于“热点”荧光染料的生物分辨率会受到影响，因此要确保“热点”荧光染料在组合中不会共表达，也不会是较暗/敏感的标志物）。

示例6

采用组合A热点矩阵来改进组合A。通过以组合热点矩阵为导向的人工试错，即可实现组合的改进，或者通过自动算法来实现组合的改进，此算法可使由矩阵推导出的目标函数（例如最大元素的大小）最小化。组合A热点矩阵如图27A所示。随后，用QDot 800替换VioR667，分辨出APC光谱邻域中的热点。此交换得到组合A-1，见下表1。图27B显示了组合A-1的组合热点矩阵。如组合A-1热点矩阵所示，由于VioR667与QDot 800交换，消除了APC光谱邻域中的热点。条件数也由69.8减少至32.5。然而，在BV510光谱邻域的组合A-1热点矩阵中，仍然可以看到热点。通过用QDot 705替换BV510，分辨出热点，由此得到组合A-2，如下表1所示。图27C显示了组合A-2的组合热点矩阵。如组合A-2热点矩阵所示，由于BV510与QDot705交换，消除了BV510光谱邻域中的热点。这次交换还具有使荧光染料组合条件数由32.5减少至24.8的作用。因此，结果表明，所述组合热点分析有利于改进或扩展现有组合。

示例7

组合A中的荧光染料用于生成流式细胞仪数据。由此得到的数据用于填充图28A所示的扩散相关矩阵。矩阵单元格以颜色编码，使单元格颜色与双阴性群体的倾斜程度相关联，即具有正相关或负相关。将此矩阵与上述图7A-7B所示所产生的扩散相关矩阵进行比较。由此得到的矩阵能够预测由格拉姆逆推导出的相关性，如图28B所示。图28A和图28B中标识了目标区域1-4。与目标区域1-4中标识的荧光染料对有关的流式细胞仪数据分别如图28C-28F所示。如图28C-28F所示，扩散相关矩阵（图28B）能够准确预测所测量的相关数据（图28A）。

表1：参考组合

	39A	39A-1	39A-2	39B
					1	BUV395	BUV395	BUV395	BUV395
2	BUV496	BUV496	BUV496	BUV496
					3	自发荧光	自发荧光	自发荧光	自发荧光
4	BUV563	BUV563	BUV563	BUV563
					5	BUV615	BUV615	BUV615	BUV615
6	BUV661	BUV661	BUV661	BUV661
					7	BUV737	BUV737	QDot705	BUV737
8	BUV805	QDot800	BUV737	BUV805
					9	BV421	BUV805	QDot800	BV421
10	VioBlue	BV421	BUV805	VioBlue
					11	BV480	VioBlue	BV421	BV480
12	BV510	BV480	VioBlue	BV510
					13	AmethystOrange	BV510	BV480	AmethystOrange
14	BV570	AmethystOrange	AmethystOrange	BV570
					15	BV605	BV570	BV570	BV605
16	BV650	BV605	BV605	BV650
					17	BV711	BV650	BV650	BV711
18	BV750	BV711	BV711	BV750
					19	BV786	BV750	BV750	BV786
20	BB515	BV786	BV786	BB515
					21	cFluorB532	BB515	BB515	cFluorB532
22	BB630	cFluorB532	cFluorB532	BB630
					23	PerCP	BB630	BB630	PerCP
24	BB660	PerCP	PerCP	BB660
					25	BB700	BB660	BB660	PerCP-Cy5.5
26	BB755	BB700	BB700	BB700
					27	RB780	BB755	BB755	BB755
28	PE	RB780	RB780	RB780
					29	RY586	PE	PE	PE
30	PE-CF594	RY586	RY586	RY586
					31	PE-Cy5	PE-CF594	PE-CF594	PE-CF594
32	PE-Fire700	PE-Cy5	PE-Cy5	PE-Cy5
					33	NovaFluorY730	PE-Fire700	PE-Fire700	PE-Fire700
34	PE-Cy7	NovaFluorY730	NovaFluorY730	NovaFluorY730
					35	VioR667	PE-Cy7	PE-Cy7	PE-Cy7
36	APC	APC	APC	APC
					37	SparkNIR685	SparkNIR685	SparkNIR685	SparkNIR685
38	R718	R718	R718	R718
					39	APC-Cy7	APC-Cy7	APC-Cy7	APC-Cy7
40	APC-Fire810	APC-Fire810	APC-Fire810	APC-Fire810

尽管附有权利要求，本公开也由以下条款限定：

1.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法，所述方法包括：

获得：

荧光染料组合；

仪器标识符；

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵；

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

2.根据条款1所述的方法，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细胞仪数据方差。

3.根据条款1或2所述的方法，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将受到流式细胞仪数据方差的影响。

4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。

5.根据条款4所述的方法，其中，所述伪逆矩阵是摩尔-彭若斯伪逆矩阵。

6.根据条款1-3中任一项所述的方法，其中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵。

7.根据条款6所述的方法，其中，根据以下公式计算所述逆矩阵：

其中：

是格拉姆逆矩阵；

是光谱矩阵；

是光谱矩阵转置。

8.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，分析计算出的逆矩阵包括从逆矩阵中推导出定量指标。

9.根据条款8所述的方法，其中，所述定量指标是矩阵范数。

10.根据条款8所述的方法，其中，所述定量指标是向量范数。

11.根据前述条款中任一项所述的方法，进一步包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。

12.根据条款11所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。

13.根据条款11或12所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。

14.根据条款13所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括迭代调整荧光染料组合，并对迭代调整后每个荧光染料组合的适用性进行评估。

15.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据包括的维度数量等于多个荧光染料中荧光染料的数量。

16.根据条款15所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据是光谱解混流式细胞仪数据。

17.根据条款15所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据是流式细胞仪补偿数据。

18.根据前述条款中任一项所述的方法，其中，所述方差包括流式细胞仪数据中的噪声。

19.根据前述条款中任一项所述的方法，进一步包括产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性的可视化。

20.根据条款19所述的方法，其中，所述可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

21.根据条款19或20所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵。

22.根据条款21所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵的对角可视化。

23.根据条款19或20所述的方法，其中，所述可视化包括扩散相关矩阵。

24.一种系统，包括：

处理器，可：

获得：

荧光染料组合；

仪器标识符；

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵；

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

25.根据条款24所述的系统，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细胞仪数据方差。

26.根据条款24或25所述的系统，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将受到流式细胞仪数据方差的影响。

27.根据条款24-26中任一项所述的系统，其中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。

28.根据条款27所述的系统，其中，所述伪逆矩阵是摩尔-彭若斯伪逆矩阵。

29.根据条款24-26中任一项所述的系统，其中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵。

30.根据条款29所述的系统，其中，根据以下公式计算所述逆矩阵：

其中：

是格拉姆逆矩阵；

是光谱矩阵；

是光谱矩阵转置。

31.根据条款24-30中任一项所述的系统，其中，分析计算出的逆矩阵包括从逆矩阵中推导出定量指标。

32.根据条款31所述的系统，其中，所述定量指标是矩阵范数。

33.根据条款31所述的系统，其中，所述定量指标是向量范数。

34.根据条款24-33中任一项所述的系统，其中，所述处理器可基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。

35.根据条款34所述的系统，其中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。

36.根据条款34或35所述的系统，其中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。

37.根据条款36所述的系统，其中，所述优化荧光染料组合包括迭代调整荧光染料组合，并对迭代调整后的每个荧光染料组合的适用性进行评估。

38.根据条款24-37中任一项所述的系统，其中，所述流式细胞仪数据包括的维度数量等于多个荧光染料中荧光染料的数量。

39.根据条款38所述的系统，其中，所述流式细胞仪数据是光谱解混流式细胞仪数据。

40.根据条款38所述的系统，其中，所述流式细胞仪数据是流式细胞仪补偿数据。

41.根据条款24-40中任一项所述的系统，其中，所述方差包括流式细胞仪数据中的噪声。

42.根据条款24-41中任一项所述的系统，其中，所述处理器可产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性可视化。

43.根据条款42所述的系统，其中，所述可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

44.根据条款42或43所述的系统，其中，所述可视化包括组合热点矩阵。

45.根据条款44所述的系统，其中，所述可视化包括组合热点矩阵的对角可视化。

46.根据条款42或43所述的系统，其中，所述可视化包括扩散相关矩阵。

47.根据条款42-46中任一项所述的系统，进一步包括用于描绘可视化的显示器。

48.一种非暂态计算机可读存储介质，包括存储在其上的指令，所述指令用于采用方法对用于生成流式细胞仪的荧光染料组合的适用性进行评估，所述方法包括：

获得：

荧光染料组合；

仪器标识符；

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵；

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。

49.根据条款48所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细胞仪数据方差。

50.根据条款48或49所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将受到流式细胞仪数据方差的影响。

51.根据条款48-50中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。

52.根据条款51所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述伪逆矩阵是摩尔-彭若斯伪逆矩阵。

53.根据条款48-50中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵。

54.根据条款53所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，根据以下公式计算所述逆矩阵：

其中：

是格拉姆逆矩阵；

是光谱矩阵；

是光谱矩阵转置。

55.根据条款48-54中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，分析计算出的逆矩阵包括从逆矩阵中推导出定量指标。

56.根据条款55所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述定量指标是矩阵范数。

57.根据条款55所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述定量指标是向量范数。

58.根据条款48-57中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述方法进一步包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。

59.根据条款58所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。

60.根据条款58或59所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。

61.根据条款60所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述优化荧光染料组合包括迭代调整荧光染料组合，并对迭代调整后的每个荧光染料组合的适用性进行评估。

62.根据条款48-61中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述流式细胞仪数据包括的维度数量等于多个荧光染料中荧光染料的数量。

63.根据条款62所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述流式细胞仪数据是光谱解混流式细胞仪数据。

64.根据条款62所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述流式细胞仪数据是流式细胞仪补偿数据。

65.根据条款48-64中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述方差包括流式细胞仪数据中的噪声。

66.根据条款48-65中任一项所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述方法进一步包括产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性可视化。

67.根据条款66所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

68.根据条款66或67所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述可视化包括组合热点矩阵。

69.根据条款68所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述可视化包括组合热点矩阵的对角可视化。

70.根据条款66或67所述的非暂态计算机可读存储介质，其中，所述可视化包括扩散相关矩阵。

71.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法，所述方法包括：

（a）向处理器输入：

荧光染料组合；

仪器标识符；

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵，其中，所述处理器可：

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料；

（b）从处理器接收对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估。

72.根据条款71所述的方法，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细胞仪数据方差。

73.根据条款71或72所述的方法，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将受到流式细胞仪数据方差的影响。

74.根据条款71-73中任一项所述的方法，其中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。

75.根据条款74所述的方法，其中，所述伪逆矩阵是摩尔-彭若斯伪逆矩阵。

76.根据条款71-73中任一项所述的方法，其中，所述逆是格拉姆逆。

77.根据条款76所述的方法，其中，根据以下公式计算所述逆矩阵：

其中：

是格拉姆逆矩阵；

是光谱矩阵；

是光谱矩阵转置。

78.根据条款71-77中任一项所述的方法，其中，分析计算出的逆矩阵包括从逆矩阵中推导出定量指标。

79.根据条款78所述的方法，其中，所述定量指标是矩阵范数。

80.根据条款78所述的方法，其中，所述定量指标是向量范数。

81.根据条款71-80中任一项所述的方法，其中，所述处理器可基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。

82.根据条款81所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括使用组合优化算法。

83.根据条款81或82所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括调整荧光染料组合中的荧光染料，并对用于生成流式细胞仪数据的调整后的荧光染料组合的适用性进行评估。

84.根据条款83所述的方法，其中，所述优化荧光染料组合包括迭代调整荧光染料组合，并对迭代调整后每个荧光染料组合的适用性进行评估。

85.根据条款71-84中任一项所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据包括的维度数量等于多个荧光染料中荧光染料的数量。

86.根据条款85所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据是光谱解混流式细胞仪数据。

87.根据条款85所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据是流式细胞仪补偿数据。

88.根据条款71-87中任一项所述的方法，其中，所述方差包括流式细胞仪数据中的噪声。

89.根据条款71-88中任一项所述的方法，其中，所述处理器可产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用性可视化。

90.根据条款89所述的方法，其中，所述可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

91.根据条款89或90所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵。

92.根据条款91所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵的对角可视化。

93.根据条款89或90所述的方法，其中，所述可视化包括扩散相关矩阵。

94.根据条款89-93中任一项所述的方法，进一步包括接收所产生的可视化。

虽然为了理解清楚起见，已经通过说明和示例对上述发明进行了一些详细的描述，但对于本领域的普通技术人员来说，根据本发明的指导，显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些更改和修改。

因此，上述内容仅说明了本发明的原则。应理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，这些布置尽管在本发明中未明确描述或示出，但是体现了本发明的原理并且包含在其精神和范围内。此外，本发明所述的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和诸位发明人为拓深领域而提供的概念,并且应解释为不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本发明中记载本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，其意图在于此类等同物包括当前已知的等同物以及将来研发的等同物，即所研发的执行相同功能的任何部分（无论其结构如何）。另外，本发明公开的任何内容无论是否在权利要求中明确列举，均无意专门向公众开放。

因此，本发明的范围并非旨在仅限于本发明所示和所述的示例性实施例。相反，所附权利要求体现了本发明的范围和精神。在权利要求书中，《美国专利法》第35篇第112（f）条或《美国专利法》第35篇第112（6）条被明确定义为只有在权利要求中此类限制以确切短语“方式”或确切短语“步骤”开始时，才作为权利要求中的限制而援引；如果权利要求中没有使用此类确切短语，则没有援引《美国专利法》第35篇第112（f）条或《美国专利法》第35篇第112（6）条。

Claims (15)

1.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性的方法，所述方法包括：

获得：

荧光染料组合；

仪器标识符；和

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵；

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；和

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光染料组合中与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料会：

产生流式细胞仪数据方差；或

受到流式细胞仪数据方差的影响。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述逆矩阵是伪逆矩阵。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述逆矩阵是格拉姆逆矩阵。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，分析计算出的逆矩阵包括从逆矩阵中推导出定量指标。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述定量指标选自矩阵范数或向量范数。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染料组合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流式细胞仪数据包括的维度数量等于多个荧光染料中荧光染料的数量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来产生可视化。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述可视化突出显示了荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述可视化包括组合热点矩阵的对角可视化。

13.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述可视化包括扩散相关矩阵。

14.一种系统，包括：

处理器，被配置为：

获得：

荧光染料组合；

仪器标识符；和

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵；

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；和

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性。

15.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性的方法，所述方法包括：

（a）向处理器输入：

荧光染料组合；

仪器标识符；和

与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩阵，其中，所述处理器被配置为：

根据获得的光谱矩阵来计算逆矩阵；和

通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料；和

（b）从处理器接收对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估。