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CN119421701A - 用以使多肽稳定的羟丙基甲基纤维素衍生物 - Google Patents

用以使多肽稳定的羟丙基甲基纤维素衍生物 Download PDF

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CN119421701A
CN119421701A CN202380031437.9A CN202380031437A CN119421701A CN 119421701 A CN119421701 A CN 119421701A CN 202380031437 A CN202380031437 A CN 202380031437A CN 119421701 A CN119421701 A CN 119421701A
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CN
China
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formulation
antibody
polypeptide
spray
hpmcas
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CN202380031437.9A
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P·K·纳亚克
张翡珊
K·拉贾戈帕尔
J·扎扎
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Original Assignee
Genentech Inc
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Abstract

本发明提供了包含多肽和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)衍生物的制剂。所述制剂是稳定的；例如在高温处理期间以及在可能的低pH环境中。此外，所述HPMCAS衍生物为pH敏感蛋白质提供保护，使所述蛋白质免受来自基于PLGA的递送系统中的聚(乳酸‑共‑乙醇酸)(PLGA)的水性水解的酸性降解产物的影响。

Description

用以使多肽稳定的羟丙基甲基纤维素衍生物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年4月1日提交的美国临时专利申请号63/326,772的优先权和权益，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明提供了醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)衍生物作为用于使多肽稳定的聚合物赋形剂的用途；例如，在高温处理期间以及在可能的低pH环境中。此外，HPMCAS衍生物为pH敏感蛋白质提供保护，使该蛋白质免受来自基于PLGA的递送系统中的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的水性水解的酸性降解产物的影响。
背景技术
基于蛋白质的治疗药物在制造、储存和递送期间容易发生物理和化学降解反应(Le Basle,Y等人,J Pharm Sci,2020.109(1):p.169-190)。虽然对赋形剂如何使液态和固态蛋白质稳定的了解已经使许多基于蛋白质的药品得以成功开发，但是仍然需要鉴定新赋形剂并且设计制剂以实现基于聚合物的缓释药物的开发(Fu,K等人,Nat Biotechnol,2000,18(1):24-5；Putney,SD和PA Burke,Nat Biotechnol,1998.16(2):153-7)。蛋白质稳定性包含与小分子治疗药物无关的理化现象以及构象结构变化(Manning,MC等人,PharmRes,2010,27(4):544-75)。在聚合物控释系统的情况下，蛋白质药物应在生理温度下在制剂内保持数周至一年(Zhu,G等人,Nat Biotechnol,2000,18(1):52-7；Vaishya,R等人,Expert Opin Drug Deliv,2015,12(3):415-40)。例如，在载药PLGA杆状物的制备中，药物在制造期间暴露于高温，并且随后当杆状物在体温下停留较长时间时，由于聚合物水解，药物暴露于低pH微环境中。在缺少稳定赋形剂的情况下，蛋白质药物可能在递送系统内部以及在其体内释放时发生降解(Rajagopal,K等人,J Pharm Sci,2013,102(8):2655-66)。
使用热熔挤出工艺制备PLGA杆状物涉及将喷雾干燥蛋白质制剂与固体PLGA混合，在90℃进行微复合，随后挤出，将挤出物冷却并且切割成所需尺寸的固体杆状物(Rajagopal,K等人,J Pharm Sci,2013,102(8):2655-66)。先前已经证明，在喷雾干燥制剂中加入亲水性小分子赋形剂(诸如海藻糖或四氢嘧啶)，能够使蛋白质在高温下保持稳定，使得热熔挤出工艺可用于制备载有蛋白质的PLGA杆状物(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358；Nayak,PK等人,Molecular Pharmaceutics,2020,17(9):3291-3297)。虽然这些赋形剂在PLGA杆状物的制备和保质期内储存期间使蛋白质稳定在固态，但它们不能提供对由于杆状物植入体内后水解聚合物降解所产生的低pH微环境的稳定性(Chang,DP等人,J Pharm Sci,2015,104(10):3404-17)。由于聚合物的水解导致乳酸和乙醇酸的形成(Pitt,CG等人,Biomaterials,1981,2(4):215-20)，这些酸在PLGA递送系统中的积累产生酸性微环境(Shenderova,A等人,Pharm Res,1999.16(2):241-8；Brunner,A等人,Pharm Res,1999,16(6):847-53)。这些赋形剂不仅缺乏中和酸性微环境的缓冲容量，而且由于它们的小尺寸和亲水性，其释放速度快于蛋白质。这种情况使蛋白质在杆状物内不受保护，并且导致聚集、药物释放不完全并且促进低pH化学降解反应(诸如异构化和碎裂)，可能导致活性丧失(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358；Liu,Y和SPSchwendeman,Mol Pharm,2012,9(5):1342-50；Fu,K等人,Pharm Res,2000,17(1):100-6；Lu,W和TG Park,PDA J Pharm Sci Technol,1995,49(1):13-9；Shao,PG.和LC Bailey,Pharm Dev Technol,2000,5(1):1-9)。Zhu等人的研究已经表明，在PBS缓冲剂中在37℃长时间孵育期间，大的球状蛋白质(如BSA)在PLGA系统内经历广泛聚集(Zhu,G和SPSchwendeman,Pharm Res,2000,17(3):351-7)。因此，中和酸性微气候并且抵抗蛋白质降解的赋形剂对于从PLGA系统中稳定释放蛋白质是必要的。
已经探索了在PLGA装置中稳定蛋白质的各种途径，诸如加入碱性添加剂Mg(OH)2以使BSA稳定(Zhu,G等人,Nat Biotechnol,2000,18(1):52-7)，以及加入二价金属阳离子盐(如CaCl2或MnCl2)以使奥曲肽稳定(Sophocleous,AM等人,J Control Release,2009.137(3):179-84)。然而，上述方法依赖于小的无机离子作为添加剂以中和降解产物或防止蛋白质与来自PLGA水解的降解物交互作用，而并非作为赋形剂提供对蛋白质的保护。
需要使用聚合物赋形剂使喷雾干燥制剂中的蛋白质在高温下保持稳定，并且还中和PLGA内形成的低pH环境。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和公布)均通过引用以其整体并入本文。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含多肽和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)。在一些实施例中，HPMCAS包含约8％至约12％的醋酸根和约7％至约15％的琥珀酸根。在一些实施例中，HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)。在其他实施例中，HPMCAS包含约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约10:1(mg/mg)至约1:10(mg/mg)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约4:1(mg/mg)至约1:4(mg/mg)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约4:1(mg/mg)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约1:1(mg/mg)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约1:4(mg/mg)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约1:1(mg/mg)至约1:5(mg/mg)。在一些实施例中，制剂进一步包含组氨酸缓冲剂。在一些实施例中，组氨酸缓冲剂为组氨酸HCl缓冲剂。在一些实施例中，制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度为约5mM至约20mM。在一些实施例中，制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度为约10mM。在一些实施例中，制剂进一步包含聚山梨醇酯。在一些实施例中，聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，制剂中的聚山梨醇酯的浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)。在一些实施例中，制剂中的聚山梨醇酯的浓度为约0.01％(w/v)。在一些实施例中，制剂的pH为约5.5至约7.0。在一些实施例中，制剂的pH为约6.5。
在本发明的一些实施例中，制剂中的多肽为抗体。在一些实施例中，多肽为单克隆抗体。在一些实施例中，多肽为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施例中，抗体为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段。在一些实施例中，抗体片段为(Fab')2片段。在一些实施例中，制剂中的多肽的浓度为约5mg/mL至约100mg/mL、或约10mg/mL至约80mg/mL。在一些实施例中，制剂中的多肽的浓度为约10mg/mL。
在一些方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与抗体的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约5.5至约7.0。在一些方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约10mg/mL的抗体；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与抗体的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。在一些方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与抗体的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约5.5至约7.0。在一些方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约10mg/mL的抗体；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与抗体的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。
在本发明的一些实施例中，制剂经喷雾干燥以形成多肽或抗体的喷雾干燥制剂。在一些实施例中，制剂中的多肽(例如，抗体)在约90℃稳定至少约5小时和/或在约37℃稳定至少约4周。在一些实施例中，制剂中的多肽显示减少的聚集和/或减少的化学降解。在一些实施例中，减少的化学降解包括减少的多肽的琥珀酰亚胺变体的形成和/或减少的多肽的焦谷氨酸变体的形成。在一些实施例中，制剂为无定形玻璃态制剂。
在本发明的一些实施例中，多肽或抗体(例如，抗体)的喷雾干燥制剂被包封在产生酸性微气候的聚合物系统中。在一些实施例中，多肽的喷雾干燥制剂被包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。在一些实施例中，多肽的喷雾干燥制剂被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)中。在一些实施例中，多肽的喷雾干燥制剂被包封在PLGA杆状物中。
在一些方面，本发明提供了一种包含本文所述的任何制剂的组合物；例如，包含如本文所述的多肽(例如，抗体)的喷雾干燥制剂的组合物。在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，该组合物包含含有本文所述的任何制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，该组合物包含含有本文所述的任何喷雾干燥制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。在一些实施例中，乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。在一些实施例中，乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA杆状物。
在一些方面，本发明提供了制备喷雾干燥多肽的方法，所述方法包括制备如本文所述的制剂，以及使该制剂经受喷雾干燥。在一些方面，本发明提供了制备喷雾干燥抗体的方法，所述方法包括制备如本文所述的制剂，以及使该制剂经受喷雾干燥。在一些实施例中，使用包括入口和出口的喷雾干燥器进行喷雾干燥。在一些实施例中，入口具有约90℃至约120℃、约100℃或约110℃的温度。在一些实施例中，出口具有约60℃的温度。
在一些方面，本发明提供了制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，所述方法包括将如本文所述的制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。在一些方面，本发明提供了制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，所述方法包括将如本文所述的喷雾干燥制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。在一些实施例中，乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。
在一些方面，本发明提供了包含如本文所述的任何制剂(例如，喷雾干燥制剂)或组合物的制品。
附图说明
图1示出海藻糖的结构以及纤维素的通用结构。底部子图示出定义Metolose、AS-LF和AS-HF的R基团的性质以及聚合物赋形剂与海藻糖的分子量和玻璃化转变温度
图2示出由所有五种喷雾干燥的Fab2制剂的差示扫描量热法(DSC)热谱图表示的制剂玻璃化转变温度
图3为示出喷雾干燥的AS-LF和AS-HF制剂的制备的示意图。将AS-HF或AS-LF聚合物溶于水中，用组氨酸碱滴定至pH 6.5，然后在pH5.5缓冲剂中与Fab2溶液混合。将混浊的聚合物和蛋白质混合溶液喷雾干燥以得到固体制剂。
图4A和4B示出示出喷雾干燥制剂的表征。图4A示出使用激光衍射测量的喷雾干燥的Fab2制剂的粒径分布。图4B示出喷雾干燥制剂的SEM图像。各图像中的比例尺对应于10μm。
图5A和5B示出喷雾干燥制剂中的Fab2聚集。喷雾干燥制剂中的Fab2单体含量作为时间的函数：在90℃暴露5小时后(图5A)；以及在37℃暴露4周后(图5B)。
图6A至6D示出喷雾干燥制剂中的Fab2的化学降解。不同制剂中Fab2的离子交换色谱图：在90℃保持5小时后(图6A)；以及在37℃保持4周后(图6B)。焦谷氨酸的形成(作为PyroE与主峰面积的比率来衡量)随时间的变化：在90℃(图6C)；以及在37℃(图6D)。
图7A和7B示出AS赋形剂的缓冲容量。HPMCAS赋形剂能够抵抗pH的变化(图7A)：在原料形式中用强碱(0.5N NaOH)滴定后(图7B)；以及在喷雾干燥的Fab2制剂中用强酸(0.1NHCl)滴定期间。
图8示出PLGA杆状物内的Fab2稳定性。对于所有四种制剂，在37℃在PLGA杆状物内3周后回收时提取的Fab2单体含量的变化。
图9为示出喷雾干燥制剂中的蛋白质和聚合物分布的示意图。在固态下，喷雾干燥蛋白质-聚合物混合物产生两种类型的分布。Fab2与HPMCAS聚合物之间的静电相互作用确保在固态下均匀共混，而在Metolose制剂中，理化不相容性导致喷雾干燥后分层和相分离。
图10示出由我们的研究中使用的所有四种赋形剂的差示扫描量热法(DSC)热谱图所表示的赋形剂玻璃化转变温度。
图11示出喷雾干燥制剂中的MAb1聚集。示出在90℃暴露不同时间段(0至5小时)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb1的单体含量随时间的变化。
图12示出喷雾干燥制剂中的MAb1聚集。示出在37℃暴露不同时间段(0至8周)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb1的单体含量随时间的变化。
图13示出喷雾干燥制剂中的MAb2聚集。示出在90℃暴露不同时间段(0至4小时或5小时)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb2的单体含量随时间的变化。
图14示出喷雾干燥制剂中的MAb2聚集。示出在37℃暴露不同时间段(0至8周)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb2的单体含量随时间的变化。
图15示出含有不同赋形剂的MAb1制剂的缓冲容量。示出在喷雾干燥后向溶于水中的MAb1制剂中加入稀盐酸后的pH变化。箭头指示包含蛋白质的制剂中的赋形剂含量的增加。
图16示出含有不同赋形剂的MAb2制剂的缓冲容量。示出在喷雾干燥后向溶于水中的MAb2制剂中加入稀盐酸后的pH变化。箭头指示包含蛋白质的制剂中的赋形剂含量的增加。
图17示出PLGA杆状物中的MAb1稳定性。示出四种制剂在37℃在PLGA杆状物内4周后回收时提取的MAb1单体含量的变化。
图18示出PLGA杆状物中的MAb2稳定性。示出四种制剂在37℃在PLGA杆状物内4周后回收时提取的MAb2单体含量的变化。
图19示出喷雾干燥制剂中的MAb3聚集。示出在90℃暴露不同时间段(0至5小时)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb3的单体含量随时间的变化。
图20示出喷雾干燥制剂中的MAb3聚集。示出在37℃暴露不同时间段(0至3个月)后，含有不同赋形剂与蛋白质重量比(E/P)的喷雾干燥制剂中的MAb3的单体含量随时间的变化。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供包含多肽(例如，抗体)和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)衍生物的制剂。HPMCAS的使用为蛋白质在高温处理期间以及在药物递送平台的可能的低pH环境中提供稳定性。此外，在基于聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的递送系统内，HPMCAS为pH敏感多肽提供保护，使其免受来自PLGA水性水解的酸性降解产物的影响。在一些实施例中，HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)或约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。
在一些方面，本发明提供了包含以下的制剂：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS，其中该制剂中的HPMCAS与多肽的比率为约1:1(mg:mg)；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0。
在一些方面，本发明提供了包含以下的喷雾干燥制剂：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS，其中该制剂中的HPMCAS与多肽的比率为约1:1(mg:mg)；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0，其中该制剂中的多肽在约90℃稳定至少约5小时和/或在约37℃稳定至少约4周。
还提供了制备制剂、喷雾干燥制剂和PLGA包封的多肽的方法，以及包含制剂、喷雾干燥制剂和PLGA包封的多肽的制品。
定义
“喷雾干燥”是指在高于环境温度的温度下使用气体(通常为空气或氮气)雾化并且干燥包含蛋白质或单克隆抗体的液体或浆料以便产生包含蛋白质或单克隆抗体的干粉颗粒的工艺。在该工艺期间，液体蒸发，并且形成干燥颗粒。在一个实施例中，使用喷雾干燥器进行喷雾干燥，例如，该喷雾干燥器具有约80℃至约220℃的空气入口温度和约50℃至约100℃的空气出口温度。可通过多种方法诸如旋风分离器、高压气体、静电荷等将颗粒与气体分离。本文对喷雾干燥的该定义明确排除对单克隆抗体进行冷冻干燥或结晶。
本文中的“干燥”颗粒、蛋白质或单克隆抗体已经受干燥工艺，使得其含水量已经显著降低。在一个实施例中，颗粒、蛋白质或单克隆抗体具有小于约10％、例如小于约5％的含水量，例如，其中含水量是通过化学滴定法(例如，卡尔费休法)或失重法(高温加热)来测量的。
如本文所用，“喷雾干燥前制备物”是指多肽(例如，抗体)和一种或多种赋形剂诸如稳定剂(例如，HPMCAS衍生物)以及任选的缓冲剂的制剂。在一个实施例中，制备物呈液体形式。
“悬浮液制剂”为包含固体颗粒(例如，喷雾干燥抗体颗粒)的液体制剂，所述固体颗粒分散在它们不溶于其中的整个液相中。在一个实施例中，悬浮液制剂中的固体颗粒具有约2微米至约30微米(例如，约5微米至约10微米)的平均粒径(例如，如通过激光衍射所分析)。任选地，悬浮液制剂中的固体颗粒具有小于约30微米并且任选地小于约10微米的峰值(最高百分比)粒径(例如，如通过激光衍射所分析)。可以通过将喷雾干燥抗体颗粒与非水性悬浮媒介物合并来制备悬浮液制剂。在一个实施例中，悬浮液制剂被调节为适于、或适合于向受试者或患者皮下施用。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以间插有非氨基酸。这些术语还涵盖已经过天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰(诸如与标记组分缀合)。在定义内还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”具体地涵盖抗体。
“纯化的”多肽(例如抗体或免疫粘附素)意指已经提高纯度的多肽，使得其以比存在于自身天然环境中和/或在实验室条件下初始合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是一个相对术语，并不一定意味着绝对纯度。
“结合”目的抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标)的多肽是以足够高的亲和力结合抗原的多肽，由此使得所述多肽可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且与其他多肽不发生显著的交叉反应。在此类实施例中，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测得，多肽与“非靶”多肽的结合程度将小于多肽与其特定靶标多肽结合程度的约10％。
关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相比于对照分子的结合来测量，该对照分子通常为具有类似结构但不具有结合活性的分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子(过量的无标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合受到过量无标记靶标的竞争性抑制，则表明存在特异性结合。
本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，全部都基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体有两条“重”链和两条“轻”链，它们进行二硫键结以形成功能性抗体。每个重链和轻链本身都包含“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性在可变结构域的110个氨基酸之间并非均匀分布。相反，V区域由相对不变的、由15至30个氨基酸组成的框架区(FR)的区段组成，这些框架区由变化极大的较短区域隔开，这些较短的区域称为“高变区”，其各自长9至12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采用β折叠结构，由三个高变区(“HVR”)连接，这三个高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各自效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。
每个V区通常包含三个高变区，例如互补决定区(“CDR”，每个互补决定区均含有“高变环”)，以及四个框架区。因此，抗体结合位点，即以实质上的亲和力结合特定所需抗原所需的最小结构单元，将典型地包括三个CDR，以及散布在其间的至少三个、优选四个框架区，以保持和呈现适当构象的CDR。经典的四链抗体具有由VH和VL结构域共同定义的抗原结合位点。某些抗体，诸如骆驼和鲨鱼抗体，缺乏轻链，并且仅依赖于由重链形成的结合位点。可以制备其中结合位点由重链或轻链单独形成的单一结构域工程化免疫球蛋白，而无需VH与VL之间的合作。
术语“可变的”是指以下事实：可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的可变结构域中均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段中。可变结构域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采用β折叠结构，由三个高变区连接，这三个高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各自效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。
如本文所用的术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)周围，以及VH中约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)周围)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体(diabody)；串联双体抗体(taDb)、三体抗体(triabody)、线性抗体(例如，美国专利第5,641,870号，实例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、sc-Fv、di-scFv、bi-scFv或串联(di,tri)-scFv)；双特异性T细胞接合剂(BiTE)，以及三功能抗体(trifunctional antibody)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密、非共价缔合的二聚体组成。以此构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分为不同的类别。存在以下五大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干类别可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施例中，Fv多肽进一步在VH和VL结构域之间包括多肽接头，使得scFv能形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见Plückthun的The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用过短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
术语“多特异性抗体”在最广泛的意义上使用，并且具体地涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单元结合不同表位，具有两个或更多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同表位，全长抗体，抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体、三体抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。根据一个实施例，多特异性抗体为IgG抗体，其以5M至0.001pM、3M至0.001pM、1M至0.001pM、0.5M至0.001pM或0.1M至0.001pM的亲和力与各表位结合。
“单结构域抗体”(sdAbs)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常是指单可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单个可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括来源于骆驼(羊驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的抗体和来源于人和小鼠抗体的重组方法的抗体(Nature(1989)341:544-546；DevComp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的生产过程中可能产生的可能的变体之外，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除特异性以外，单克隆抗体的优势还在于它们不受其他免疫球蛋白污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)以及Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类源化”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，旧大陆猴，诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区中的残基被来自非人类物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人类物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物，其具有所需的特异性、亲和力和功能。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰旨在进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR，但如上所述的FR取代除外。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，该免疫球蛋白通常为人免疫球蛋白。更多详情参见：Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
出于本文的目的，“完整抗体”是包含重可变结构域和轻可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，其后是多个恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
“裸抗体”是不与异源分子如细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体(如本文中所定义)。
在一些实施例中，抗体“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页表3中。为评定目标分子的ADCC活性，可执行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内进行评定，例如在诸如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中进行评定。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应子功能的白细胞。在一些实施例中，这些细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施例中，FcR为天然序列人FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两者具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。有关FcR的综述见：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods4:25-34(1994)；以及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，其中包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的变型。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“或”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。应当理解，本文描述的本发明的方面和变型包括“由方面和变型组成”和/或“基本由方面和变型组成”。
制剂
在一些方面，本发明提供了包含多肽和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)的制剂。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含在约1％至约20％之间的醋酸根。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或大于20％中的任一者的醋酸根。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含在约1％至约20％之间的琥珀酸根。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或大于20％中的任一者的琥珀酸根。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含在约1％至约20％之间的醋酸根及在约1％至约20％之间的琥珀酸根。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)或约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。
在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率在约10:1(mg/mg)至约1:10(mg/mg)之间。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率在约1:1(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:6(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:5(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:4(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:3(mg/mg)、1:1(mg/mg)至1:2(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:6(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:5(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:4(mg/mg)、1:2(mg/mg)至1:3(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:6(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:5(mg/mg)、1:3(mg/mg)至1:4(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:6(mg/mg)、1:4(mg/mg)至1:5(mg/mg)、1:5(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:5(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:5(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:5(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:5(mg/mg)至1:6(mg/mg)、1:6(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:6(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:6(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:6(mg/mg)至1:7(mg/mg)、1:7(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:7(mg/mg)至1:9(mg/mg)、1:7(mg/mg)至1:8(mg/mg)、1:8(mg/mg)至1:10(mg/mg)、1:8(mg/mg)至1:9(mg/mg)、或1:9(mg/mg)至1:10(mg/mg)中任一者之间。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率在约10:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、5:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、4:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、3:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、2:1(mg/mg)至1:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、5:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、4:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、3:1(mg/mg)至2:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、5:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、4:1(mg/mg)至3:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、5:1(mg/mg)至4:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至5:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至5:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至5:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至5:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)至5:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至6:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至6:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至6:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)至6:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至7:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至7:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)至7:1(mg/mg)、10:1(mg/mg)至8:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)至8:1(mg/mg)、或10:1(mg/mg)至9:1(mg/mg)中任一者之间。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约10:1(mg/mg)、9:1(mg/mg)、8:1(mg/mg)、7:1(mg/mg)、6:1(mg/mg)、5:1(mg/mg)、4:1(mg/mg)、3:1(mg/mg)、2:1(mg/mg)、1:1(mg/mg)、1:2(mg/mg)、1:3(mg/mg)、1:4(mg/mg)、1:5(mg/mg)、1:6(mg/mg)、1:7(mg/mg)、1:8(mg/mg)、1:9(mg/mg)或1:10(mg/mg)中的任一者。
在一些实施例中，制剂进一步包含组氨酸缓冲剂(即，制剂包含多肽、HPMCAS和组氨酸缓冲剂)。在一些实施例中，组氨酸缓冲剂为组氨酸HCl缓冲剂。在一些实施例中，制剂中的组氨酸缓冲剂(例如，组氨酸HCl缓冲剂)的浓度为约1mM至约50mM。在一些实施例中，制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度在约1mM与50mM、5mM与50mM、10mM与50mM、15mM与50mM、20mM与50mM、25mM与50mM、30mM与50mM、40mM与50mM、1mM与40mM、5mM与40mM、10mM与40mM、15mM与40mM、20mM与40mM、25mM与40mM、30mM与40mM、1mM与30mM、5mM与30mM、10mM与30mM、15mM与30mM、20mM与30mM、25mM与30mM、1mM与25mM、5mM与25mM、10mM与25mM、15mM与25mM、20mM与25mM、1mM与20mM、5mM与20mM、10mM与20mM、15mM与20mM、1mM与15mM、5mM与15mM、10mM与15mM、1mM与10mM、5mM与10mM、1mM与5mM中任一者之间。在一些实施例中，制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度为约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM中的任一者。
在一些实施例中，制剂进一步包含表面活性剂(即，制剂包含多肽、HPMCAS、组氨酸缓冲剂和表面活性剂)。在一些实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯。在一些实施例中，聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，制剂中的表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)的浓度为约0.005％(w/v)至约1.0％(w/v)。在一些实施例中，制剂中的表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20)的浓度在约0.005％(w/v)至1.0％(w/v)、0.01％(w/v)至1.0％(w/v)、0.05％(w/v)至1.0％(w/v)、0.1％(w/v)至1.0％(w/v)、0.5％(w/v)至1.0％,(w/v)、0.005％(w/v)至0.5％(w/v)、0.01％(w/v)至0.5％(w/v)、0.05％(w/v)至0.5％(w/v)、0.1％(w/v)至0.5％(w/v)、0.005％(w/v)至0.1％(w/v)、0.01％(w/v)至0.1％(w/v)、0.05％(w/v)至0.1％(w/v)、0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、或0.005％(w/v)至0.01％(w/v)中任一者之间。在一些实施例中，制剂中的表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20)的浓度为约0.005％(w/v)、0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.5％(w/v)或1％(w/v)中的任一者。
在一些实施例中，制剂的pH为约4.0至约9.0。在一些实施例中，制剂的pH在约4.0至9.0、5.0至9.0、5.5至9.0、6.0至9.0、6.5至9.0、7.0至9.0、7.5至9.0、8.0至9.0、4.0至8.0、5.0至8.0、5.5至8.0、6.0至8.0、6.5至8.0、7.0至8.0、7.5至8.0、4.0至7.5、5.0至7.5、5.5至7.5、6.0至7.5、6.5至7.5、7.0至7.5、4.0至7.0、5.0至7.0、5.5至7.0、6.0至7.0、6.5至7.0、4.0至6.5、5.0至6.5、5.5至6.5、6.0至6.5、4.0至6.0、5.0至6.0、5.5至6.0、4.0至5.5、5.0至5.5、或4.0至5.0中任一者之间。在一些实施例中，制剂的pH为约4.0、5.0、5.3、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或9.0中的任一者。
在一些实施例中，制剂的多肽为抗体。在一些实施例中，制剂的多肽为单克隆抗体。在一些实施例中，制剂的多肽为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施例中，制剂的多肽为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段。在一些实施例中，制剂中的多肽的浓度为约5mg/mL至约100mg/mL。
在一些实施例中，制剂中的多肽(例如，抗体)的浓度在约5mg/mL至100mg/mL、10mg/mL至100mg/mL、15mg/mL至100mg/mL、20mg/mL至100mg/mL、25mg/mL至100mg/mL、30mg/mL至100mg/mL、40mg/mL至100mg/mL、50mg/mL至100mg/mL、60mg/mL至100mg/mL、70mg/mL至100mg/mL、75mg/mL至100mg/mL、80mg/mL至100mg/mL、90mg/mL至100mg/mL、5mg/mL至90mg/mL、10mg/mL至90mg/mL、15mg/mL至90mg/mL、20mg/mL至90mg/mL、25mg/mL至90mg/mL、30mg/mL至90mg/mL、40mg/mL至90mg/mL、50mg/mL至90mg/mL、60mg/mL至90mg/mL、70mg/mL至90mg/mL、75mg/mL至90mg/mL、80mg/mL至90mg/mL、5mg/mL至80mg/mL、10mg/mL至80mg/mL、15mg/mL至80mg/mL、20mg/mL至90mg/mL、25mg/mL至80mg/mL、30mg/mL至80mg/mL、40mg/mL至80mg/mL、50mg/mL至80mg/mL、60mg/mL至80mg/mL、70mg/mL至80mg/mL、75mg/mL至80mg/mL、5mg/mL至75mg/mL、10mg/mL至75mg/mL、15mg/mL至75mg/mL、20mg/mL至75mg/mL、25mg/mL至75mg/mL、30mg/mL至75mg/mL、40mg/mL至75mg/mL、50mg/mL至75mg/mL、60mg/mL至75mg/mL、70mg/mL至75mg/mL、5mg/mL至70mg/mL、10mg/mL至70mg/mL、15mg/mL至70mg/mL、20mg/mL至70mg/mL、25mg/mL至70mg/mL、30mg/mL至70mg/mL、40mg/mL至70mg/mL、50mg/mL至70mg/mL、60mg/mL至70mg/mL、5mg/mL至65mg/mL、10mg/mL至65mg/mL、15mg/mL至65mg/mL、20mg/mL至65mg/mL、25mg/mL至65mg/mL、30mg/mL至65mg/mL、40mg/mL至65mg/mL、50mg/mL至65mg/mL、60mg/mL至65mg/mL、5mg/mL至60mg/mL、10mg/mL至60mg/mL、15mg/mL至60mg/mL、20mg/mL至60mg/mL、25mg/mL至60mg/mL、30mg/mL至60mg/mL、40mg/mL至60mg/mL、50mg/mL至60mg/mL、5mg/mL至50mg/mL、10mg/mL至50mg/mL、15mg/mL至50mg/mL、20mg/mL至50mg/mL、25mg/mL至50mg/mL、30mg/mL至50mg/mL、40mg/mL至50mg/mL、5mg/mL至40mg/mL、10mg/mL至40mg/mL、15mg/mL至40mg/mL、20mg/mL至40mg/mL、25mg/mL至40mg/mL、30mg/mL至40mg/mL、5mg/mL至30mg/mL、10mg/mL至30mg/mL、15mg/mL至30mg/mL、20mg/mL至30mg/mL、25mg/mL至30mg/mL、5mg/mL至25mg/mL、10mg/mL至25mg/mL、15mg/mL至25mg/mL、20mg/mL至25mg/mL、5mg/mL至20mg/mL、10mg/mL至20mg/mL、15mg/mL至20mg/mL、5mg/mL至15mg/mL、10mg/mL至15mg/mL、或5mg/mL至10mg/mL中任一者之间。在一些实施例中，制剂中的多肽(例如，抗体)的浓度为约5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL或多于100mg/mL。
在一些实施例中，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与多肽的比率在约1:1(mg/mg)与1:5(mg/mg)之间；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0。在一些实施例中，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约10mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与多肽的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。
在一些实施例中，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与多肽的比率在约1:1(mg/mg)与1:5(mg/mg)之间；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0。在一些实施例中，本发明提供了一种制剂，该制剂包含：浓度为约10mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与多肽的比率为约1:1(mg:mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。
喷雾干燥制剂
在本发明的一些方面，本发明的制剂经喷雾干燥。在一些实施例中，本发明提供了一种喷雾干燥制剂，该喷雾干燥制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与多肽的比率在约1:1(mg/mg)与1:5(mg/mg)之间；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0。在一些实施例中，本发明提供了一种喷雾干燥制剂，该喷雾干燥制剂包含：浓度为约10mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与多肽的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。
在一些实施例中，本发明提供了一种喷雾干燥制剂，该喷雾干燥制剂包含：浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与多肽的比率在约1:1(mg/mg)与1:5(mg/mg)之间；浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.0至约7.0。在一些实施例中，本发明提供了一种喷雾干燥制剂，该喷雾干燥制剂包含：浓度为约10mg/mL的多肽(例如，抗体)；HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与多肽的比率为约1:1(mg/mg)；浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂；浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约6.5。
在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽(例如，抗体)在约90℃稳定至少约15分钟至至少约10小时。在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽在约90℃稳定约15分钟与10小时、30分钟与10小时、45分钟与10小时、1小时与10小时、2小时与10小时、3小时与10小时、4小时与10小时、5小时与10小时、6小时与10小时、7小时与10小时、8小时与10小时、9小时与10小时中的任一者之间。在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽在约90℃稳定至少约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时中的任一者。
在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽(例如，抗体)在约37℃稳定至少约1周至多于6周。在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽在约37℃稳定约1周与6周、2周与6周、3周与6周、4周与6周或5周与6周之间中的任一者。在一些实施例中，喷雾干燥制剂的多肽在约37℃稳定约1周、2周、3周、4周、5周、6周或多于6周中的任一者。
在本发明的一些实施例中，制剂中的多肽(例如，抗体)显示减少的聚集和/或减少的化学降解。在本发明的一些实施例中，与不包括HPMCAS的类似制剂相比，制剂中的多肽显示减少的聚集和/或减少的化学降解。在一些实施例中，减少的化学降解包括减少的多肽的琥珀酰亚胺变体的形成和/或减少的多肽的焦谷氨酸变体的形成。
在一些实施例中，喷雾干燥制剂为粉末。在一些实施例中，喷雾干燥制剂提供了多肽的无定形制剂。在一些实施例中，喷雾干燥制剂提供了多肽的无定形玻璃态制剂。无定形制剂为不具有长程有序性的非结晶制剂。在一些实施例中，玻璃为可例如通过玻璃化转变温度来测量的刚性惰性基质。
包封形式的多肽
在一些实施例中，本发明提供了包封形式的多肽。在一些实施例中，本发明的喷雾干燥制剂被包封在酸聚合物系统中。在一些实施例中，酸聚合物系统为乳酸/乙醇酸聚合物系统。在一些实施例中，酸聚合物系统为聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)系统。在一些实施例中，酸性聚合物系统为喷雾干燥多肽生成低pH微环境。在一些实施例中，低pH微环境为约pH3至约pH 5。在一些实施例中，低pH微环境低于约pH 5。在一些实施例中，低pH微环境低于约pH 6。在一些实施例中，低pH微环境低于约pH 7。不受理论的约束，喷雾干燥制剂中的HPMCAS的存在使多肽在包封喷雾干燥多肽时形成的低pH微环境中保持稳定。
在一些实施例中，多肽的喷雾干燥制剂被包封在PLGA中。在一些实施例中，多肽的喷雾干燥制剂被包封在PLGA杆状物中。
生产多肽的制剂的方法
在一些实施例中，本发明提供了生产制剂的方法，所述方法包括将醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)加入多肽制剂中。在一些实施例中，HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)或约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。在一些实施例中，制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约1:1(mg/mg)至约1:5(mg/mg)。在一些实施例中，将组氨酸缓冲剂(例如，组氨酸HCl缓冲剂)加入制剂中。在一些实施例中，将组氨酸缓冲剂以约5mM至约20mM的浓度加入制剂中。在一些实施例中，将组氨酸缓冲剂以约10mM的浓度加入制剂中。在一些实施例中，将聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)加入制剂中。在一些实施例中，将聚山梨醇酯以约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的浓度加入制剂中。在一些实施例中，将聚山梨醇酯以约0.01％(w/v)的浓度加入制剂中。在一些实施例中，将制剂的pH调节为约6.0至约7.0。在一些实施例中，将制剂的pH调节为约6.5。在一些实施例中，将多肽(例如，抗体)以约5mg/mL至约100mg/mL或约10mg/mL至约80mg/mL的浓度加入制剂中。在一些实施例中，将多肽(例如，抗体)以约10mg/mL的浓度加入制剂中。
制剂的附加方面
在一些实施例中，多肽制剂中的多肽维持功能活性。
待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这可以透过无菌滤膜过滤轻松实现。
本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性化合物，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，除多肽以外，可能需要在一种制剂中包括另外的多肽(例如，抗体)。替代性地或另外地，组合物可以进一步包含化学治疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子适合地以对预期目的有效的量组合存在。
喷雾干燥
在一些方面，本发明提供了多肽的喷雾干燥制剂。在一些实施例中，包含如本文所述的多肽和HPMCAS的制剂经喷雾干燥。喷雾干燥为通过用热气体快速干燥而由液体或浆料生产干粉的方法。在一些实施例中，喷雾干燥为干燥热敏材料诸如药物(例如，多肽诸如抗体)和/或可能需要极其一致的细粒径的材料的方法。如本文所用的喷雾干燥不同于通常用于制备单克隆抗体制剂的冷冻干燥，因为其在高于环境温度的温度进行。喷雾干燥温度通常表示为“空气入口”和“空气出口”温度。在一个实施例中，喷雾干燥在约100℃至约220℃(例如，约120℃至约160℃)的空气入口温度以及约50℃至约100℃例如，约60℃至约80℃、约100℃或约120℃)的空气出口温度下进行。在一些实施例中，空气入口温度为约110℃并且空气出口温度为约60℃。在一些实施例中，空气入口温度为约80℃至约220℃并且空气出口温度为约50℃至约100℃。在一些实施例中，空气入口温度在约80℃与约220℃、约80℃与约180℃、约80℃与约160℃、约80℃与约140℃、约90℃与约220℃、约90℃与约180℃、约90℃与约160℃、约90℃与约140℃、约100℃与约220℃、约100℃与约180℃、约100℃与约160℃、约100℃与约140℃、约110℃与约220℃、约110℃与约180℃、约110℃与约160℃、或约110℃与约140℃中任一者之间。在一些实施例中，空气入口温度为约80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃或220℃中的任一者。在一些实施例中，空气出口温度在约50℃至约100℃、50℃至约90℃、50℃至约80℃、50℃至约70℃、50℃至约60℃、约60℃至约100℃、60℃至约90℃、60℃至约80℃、60℃至约70℃、约70℃至约100℃、70℃至约90℃、70℃至约80℃、约80℃至约100℃、80℃至约90℃或约90℃至约100℃中任一者之间。在一些实施例中，空气出口温度为约50℃、约60℃、约70℃、约80℃、约90℃或约100℃。
喷雾干燥工艺通常包括：液体进料的原子化；液滴的干燥；以及干燥产物的分离或回收。
在一些实施例中，本文所述的本发明中使用的原子化器包括但不限于旋转原子化器、气动喷嘴原子化器、超声波喷嘴原子化器和声波喷嘴。
液体进料与干燥空气之间的接触能够以两种不同的模式发生。在并流系统中，干燥空气和颗粒(液滴)沿相同方向移动穿过干燥室。当干燥空气和液滴沿相反方向移动时，其称为逆流模式。在逆流模式下产生的颗粒通常显示比排出空气更高的温度。排出的空气本身可离开系统或者能够再循环。通过从各种喷雾干燥器设计(尺寸、原子化器、无菌条件等)中进行选择并且调整不同的工艺参数(干燥气流、干燥空气温度等)，可修改最终粉末特性(如粒径、形状以及结构或甚至无菌性)。如果所回收的粉末的所得水分不够低，则可能需要进行后处理，例如以二次干燥的形式(例如，使用台式冻干器)、流化床干燥机和冷却器、接触式干燥机或甚至微波干燥机。
当液体进料原子化时，其表面积与质量的比率增加，空气与液滴之间的传热加快，并且液滴能够相对快速地干燥。可能涉及两个对流过程：水分的传热(空气到液滴)和传质(液滴到空气)。在后者中，水分渗透穿过各液滴周围的边界层。传送率可能受到温度、湿度、周围空气的传送特性、液滴直径以及液滴与空气之间的相对速度的影响。
喷雾干燥工艺的最后一步通常是将粉末与空气/气体分离并且去除干燥产物。在一些实施例中，该步骤尽可能有效以获得高粉末产率并且防止粉末排放到大气中而造成空气污染。为此，可使用多种方法，诸如旋风分离器、袋式过滤器、静电除尘器、高压气体、静电荷及其组合。
喷雾干燥工艺产生包含多肽(例如，抗体)的颗粒。
在一个实施例中，喷雾干燥粉末的特征包含以下任何一者或多者：
(a)平均粒径：约2微米至约30微米；例如，约2微米至约10微米；
(b)颗粒形态：主要呈球形的颗粒、坍塌球体、颗粒中的一些凹坑或孔、“干葡萄干”形状；
(c)含水量：小于约10％，例如小于约5％，例如，其中含水量是通过化学滴定法(例如，卡尔费休法)或失重法(高温加热)来测量的；以及
(d)稳定性：例如，通过将颗粒悬浮在媒介物中并且评估悬浮液制备物的物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性来评定。在一个实施例中，此类制备物的单体百分比为95％至100％，例如，如通过体积排阻色谱(SEC)所评估。
多肽的控释制剂
根据本发明所述的缓释制剂通常包含与本文所述的HPMCAS、聚合物载体以及用于改变多肽从聚合物载体中的释放速率的释放调节剂一起配制的多肽(例如，抗体)。通过改变基于聚合物的递送组合物的制造条件，可调节所得组合物的释放动力学特性。聚合物载体通常包含一种或多种可生物降解的聚合物或共聚物或其组合。例如，聚合物载体可选自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚酯、聚(原酸酯)、聚(磷嗪)、聚(磷酸酯)、聚乙二醇(PEG)、聚己内酯或其组合。用于在本发明的制剂中使用的其他聚合物包括但不限于聚(甲基)丙烯酸衍生物、不溶性纤维素衍生物、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素(HPC)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、泊洛沙姆(poloxamer)、羧甲基纤维素钠(NaCMC)、聚(丙烯酸)、聚乙烯乙酰邻苯二甲酸酯(PVAP)、多糖(例如，海藻酸钠、鹿角菜胶、瓜尔胶和黄原胶)、聚(甲基)丙烯酸酯、L、L、100-55、L 30D-55、L 100、S、S100、FS、FS 30D、934P、940、974P、971(Lubrizol)和AA-1。在一些实施例中，制剂包含Maskova,E.等人,J.Controlled Release,2020,324:695-727(其整体并入本文)中所述的聚合物。
在某些实施例中，聚合物载体为PLGA。释放调节剂通常为长链脂肪醇，优选地包含10至40个碳原子。常用的释放调节剂包括辛醇、壬醇、癸醇、月桂醇、肉荳蔻醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、硬脂醇、异硬脂醇、反油醇(elaidyl alcohol)、油醇、亚油醇、多不饱和9E,12E-十八二烯-1-醇(polyunsaturated elaidolinoleyl alcohol)、多不饱和亚麻油醇、9E,12E-十八二烯-1-醇(elaidolinolenyl alcohol)、多不饱和蓖麻油醇、花生醇、二十二醇、二十二烯醇、二十四烷醇、蜡醇(ceryl alcohol)、二十九烷醇、二十八烷醇、蜂花醇、三十烷醇和三十四烷醇(geddyl alcohol)。
在某些实施例中，将与HPMCAS一起配制的多肽(例如，抗体)掺入基于微球的缓释组合物中。在某些实施例中，微球由PLGA制备。可通过改变用于制备微球的条件来控制掺入微球中的多肽的量以及多肽的释放速率。US2005/0281861和US2008/0107694中描述了用于生产此类缓释制剂的方法。
在某些实施例中，将与HPMCAS一起配制的多肽掺入可生物降解的植入物(诸如微针)中。基质植入物(诸如微针)通常用于治疗眼部疾病，这些眼部疾病需要在1天至6个月的时间段内负荷剂量，然后逐渐减少药物剂量(Davis等人(2004)Curr Opin Mol Therap 6,195-205)。它们最常由共聚物聚乳酸(PLA)和/或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)制成，其降解为水和二氧化碳。可通过改变丙交酯(慢)和乙交酯(快)的相对浓度、改变聚合物重量比、添加额外的聚合物包衣或使用疏水性不溶性药物来降低药物从植入物中释放的速率和程度。药物的释放通常遵循一阶动力学，初始爆发性释放药物，随后药物含量迅速下降。可生物降解的植入物无需移除，因为它们随时间推移而溶解(Hsu(2007)Curr Opin Ophthalmol 18,235-9)。可生物降解的植入物还允许根据聚合物PLA/PLGA比率灵活调整剂量和治疗时间(从短持续时间(数周)到较长的持续时间(数月至一年))，这是根据疾病进展定制药物递送的另一个优势，因为剂量和治疗要求可能随时间推移而改变。
多肽的缓释制剂是使用聚乳酸-乙醇酸聚合物(PLGA)开发的，因为它具有生物相容性以及广泛的生物可降解特性。PLGA的降解产物(乳酸和乙醇酸)能够在人体内快速清除。此外，该聚合物的可降解性可根据其分子量和组成进行调整，从数月到数年不等。Lewis.“Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolidepolymer”，收录于：M.Chasin和R.Langer(编),Biodegradable Polymers as DrugDelivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),第1-41页。
在一些实施例中，多肽的控释制剂是通过热熔挤出工艺生产的。例如，可使用具有5g或7cm3的料筒容量的HAAKETM MiniCTW微型锥形双螺杆混料机(Thermo Scientific,Karlsruhe,Germany)进行热熔挤出。在一些实施例中，挤出机料筒经预热至90℃，并且将螺杆速度设定为40rpm。在一些实施例中，挤出机的前料筒开口在再循环模式下保持关闭。在一些实施例中，将预称重的固体聚合物和喷雾干燥多肽手动缓慢进料至挤出机中，并且再循环回料筒以进行微复合。在一些实施例中，用于植入物的多肽载量使用固定为约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约15％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约15％、约10％至约30％、约10％至约20％、约10％至约15％(w/w)的多肽/PLGA的喷雾干燥制剂。在一些实施例中，用于植入物的多肽载量使用固定为约1％、5％、10％、15％、20％或30％(w/w)多肽/PLGA中任一者的喷雾干燥制剂。在一些实施例中，用于植入物的多肽载量使用固定为约15％(w/w)多肽/PLGA的喷雾干燥制剂。在一些实施例中，完全进料后，熔体相共混在再循环模式下继续约30min，然后通过约0.5mm圆形模具挤出。在一些实施例中，将挤出物冷却至室温，切割成具有所需长度的圆柱体，并且储存在2℃至8℃，直至进一步使用。
醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)
在一些方面，本发明提供了多肽和HPMCAS的制剂。在一些实施例中，HPMCAS在高温喷雾干燥工艺期间为多肽提供保护，并且在酸性聚合物包封期间中提供针对低pH微环境的保护。
HMPC与乙酸和琥珀酸的反应产生HPMC衍生物，其称为醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(简称为HPMCAS)，其中HPMC中的羟基基团经改性以形成相应的酯。与乙酸反应，使HPMC中的羟基基团转化为乙酰基基团，而与琥珀酸反应，使HPMC中的羟基基团转化为琥珀酰基基团。在一些实施例中，HMPC为HPMC衍生物。在一些实施例中，HPMC包含8％乙酸(称为HPMCAS-LF)。在一些实施例中，HPMC包含7％琥珀酸(称为HPMCAS-HF)。当用作药物载体时，乙酰基和琥珀酰基取代含量对HPMCAS的增溶效应具有显著影响。由于HPMCAS的琥珀酸根基团的酸解离常数(pKa)值为约5，聚合物在pH值低于4时主要未电离，而在pH值约5或更高时部分至完全电离。因此，HPMC衍生物为包含琥珀酸的聚合物缓冲剂。在其非电离状态(pH<5)，HPMCAS不溶于水；而在中性(pH 6.0至7.5)条件下，其形成稳定的水溶性胶体组装体。它是难溶性药物的增溶剂(Friesen,DT等人,Mol Pharm,2008.5(6):1003-19)，不溶于胃液，并且在小肠中迅速溶解(Curatolo,W等人,Pharm Res,2009,26(6):1419-31)。尽管基于HPMCAS的分散体适用于基于小分子的药物缓释应用，但先前尚未探索其在大蛋白质治疗药物中的使用。喷雾干燥粉末形式的HPMCAS在pH 6以下不溶解，在大约pH 6至pH 6.5时开始溶解，并且在pH≥6.5时完全溶解。因此，优势在于HPMCAS将通过以喷雾干燥形式包被蛋白质(因此仍保留为SD粉末)来提供保护，并且防止其在低pH微环境中与酸性相对离子相互作用。因此，我们已经尝试利用HPMCAS的低pH不溶性，将其用作PLGA系统的酸性微气候内的喷雾干燥药物载体。然而，目前几乎所有使用HPMCAS的递送系统均针对小分子药物口服施用，并且尚无研究表明它们可以用于递送大分子蛋白质(Woodley,JF,Crit Rev Ther DrugCarrier Syst,1994,11(2-3):61-95)。具体地，本文所述的HPMCAS制剂是一种使蛋白质稳定的新策略，对任何特定的递送途径无明显影响。此外，具有高玻璃化转变温度(>100℃)的非离子态HPMCAS可作为赋形剂在喷雾干燥蛋白质治疗药物中使用，并且用于药物递送系统的高温制造。
Maskova,E.等人(J.Controlled Release,2020,324:695-727)提供了对HPMC用于口服和口腔粘膜药物递送的赋形剂的综述。
多肽
在本文所述的制剂中使用的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫黏附素、抗体、酶、激素、融合蛋白、含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子和白介素。多肽的实例包括但不限于：哺乳动物蛋白质，例如肾素；激素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利尿钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调节表达和分泌的正常T细胞活化)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人血清白蛋白；穆勒抑制物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；酶；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴球相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5或神经营养因子-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子诸如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子诸如aFGF、bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包含在两个或多个异源多肽或其片段上并由重组核酸编码的多肽；含Fc的多肽，例如，包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白；免疫缀合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰减加速因子；病毒抗原，诸如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫黏附素；和任何上述蛋白质的片段和/或变体，以及与蛋白质(例如任何上述蛋白质)结合的抗体(包括抗体片段)。
抗体
在本文所述的任何方法的一些实施例中，本文所述的多肽或制剂为抗体。
抗体的分子靶标包括CD蛋白质及其配体，诸如但不限于：(i)CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族的成员，诸如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞黏附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整合素，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；(iv)生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C、BR3、c-met、组织因子、β7等；(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，诸如美国专利号7,521,541中所述的那些。
其他示例性抗体包括选自但不限于以下的那些：抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗HER2抗体、抗IL6抗体、抗IgE抗体、抗IL13抗体、抗Flu A抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-L1抗体、抗VEGF-A抗体、抗VEGF-A/ANG2抗体、抗CD79b抗体、抗ST2抗体、抗因子D抗体、抗因子IX抗体、抗X因子抗体、抗Aβ抗体、抗tau抗体、抗CEA抗体、抗CEA/CD3抗体、抗CD20/CD3抗体、抗FcRH5/CD3抗体、抗Her2/CD3抗体、抗FGFR1/KLB抗体，FAP-4-1BBL融合蛋白、FAP-IL2v融合蛋白、抗雌激素受体抗体、抗孕激素受体抗体、抗p53抗体、抗EGFR抗体、抗组织蛋白酶D抗体，抗Bcl-2抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖蛋白抗体、抗CEA抗体、抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗ras癌蛋白抗体、抗Lewis X抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD10抗体、抗CD11a抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD39抗体、抗CD100抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD106抗体、抗泛素抗体、抗CD71抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗HPV蛋白抗体、抗κ轻链抗体、抗λ轻链抗体、抗黑素体抗体、抗前列腺特异性抗原抗体、抗S-100抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体和抗Tn抗原抗体。
多克隆抗体
在一些实施例中，抗体为多克隆抗体。优选地通过多次皮下(sc)或腹腔(ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内产生多克隆抗体。使用双功能或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，将相关抗原缀合至要免疫的物种中具有免疫原性的多肽(例如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)，可能会很有用。
通过将例如100μg或5μg多肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂混合，并且在多个部位皮内注射溶液，使动物对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，通过在多个部位进行皮下注射，以弗氏完全佐剂中原始量的肽或缀合物的1/5至1/10的剂量增强动物的免疫力。7至14天后，对动物采血并且测定血清的抗体效价。对动物进行加强免疫，直至效价稳定。在一些实施例中，用相同抗原但缀合至不同多肽和/或通过不同的交联剂缀合的缀合物对动物进行加强免疫。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为多肽融合物制备。另外，聚集剂诸如明矾适合用于增强免疫应答。
单克隆抗体
在一些实施例中，在通过本发明的方法净化的可重复使用的色谱材料纯化的抗体为单克隆抗体。单克隆抗体从基本上同质的抗体群体获得，即，除了在单克隆抗体的生产过程中产生的可能的变体之外，包含所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，这些变体通常以少量存在。因此，修饰语“单克隆的”表明抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可借由重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，如本文所述对小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)进行免疫以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将与多肽特异性结合以用于免疫。替代性地，可以体外免疫淋巴细胞。接着使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)融合淋巴细胞与瘤细胞以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并且使其生长，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或生存的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
在一些实施例中，骨髓瘤细胞是有效融合的那些，其支持选定抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体，并且对培养基诸如HAT培养基敏感。其中，在一些实施例中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如源自可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，以及源自可从American Type CultureCollection,Rockville,Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc,New York,1987))。
关于针对抗原的单克隆抗体的产生而分析其中生长杂交瘤细胞的培养基。在一些实施例中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等人,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，便可通过有限稀释法对该克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice第59-103页(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为动物的腹水瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，诸如，例如，多肽A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，适当地将亚克隆物分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离并测序。在一些实施例中，利用杂交瘤细胞作为此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染至不另外产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在编码抗体的DNA的细菌中的重组表达的综述论文包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)；以及Plückthun,Immunol.Revs,130:151-188(1992)。
在一个进一步的实施例中，抗体或抗体片段可自使用McCafferty等人，Nature348:552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等人,Nature352:624-628(1991)以及Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于构建极大噬菌体文库(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))的策略。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
DNA也可以被修饰，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或者通过共价连接至免疫球蛋白编码序列的全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。
典型地，此类非免疫球蛋白多肽序列代替抗体的恒定结构域，或它们代替抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点及另一对不同抗原具有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
在本文所述的任何方法的一些实施例中，抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施例中，抗体为IgG单克隆抗体。
人源化抗体
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。人源化非人抗体的方法在本领域中已有描述。在一些实施例中，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和其同事的方法进行(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人类可变结构域已被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人类可变结构域的轻链和重链的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后将最接近啮齿动物的人类序列作为人源化抗体的人类框架区(FR)(Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一方法使用源自轻链或重链可变区特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993))。
进一步重要的是将抗体人源化，同时保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现该目的，在所述方法的一些实施例中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可获得并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用于说明和展示选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和导入序列中选择并且结合FR残基，从而获得所需的抗体特性，诸如对靶抗原的亲和力增加。一般而言，高变区残基直接并且最实质地参与影响抗原结合。
人抗体
在一些实施例中，抗体为人抗体。作为人源化的替代物，可生成人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的完整谱。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。人类种系免疫球蛋白基因阵列在这种种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immuno.7:33(1993)；以及美国专利号5591669；5,589,369；和5,545,807。
替代性地，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系产生人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳多肽基因中，并且在噬菌体颗粒表面上作为功能性抗体片段展示。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体功能特性的选择也导致选择编码表现出这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模仿B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；其有关综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in StructuralBiology 3:564-571(1993)。几种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)从源自免疫小鼠脾的V基因小随机组合文库中分离出多种抗噁唑酮抗体。基本上按照Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBOJ.12:725-734(1993)所述的技术，可以构建来自未免疫的人供体的V基因谱系，并且可分离针对不同抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。另外参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
人抗体也可通过体外活化的B细胞产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
抗体片段
在一些实施例中，抗体为抗体片段。已经开发出用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见例如，Morimoto等人,Journalof Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)和Brennan等人,Science229:81(1985))。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。另选地，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌(E.coli)中回收，并且化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练的技术人员而言将是显而易见的。在其他实施例中，所选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。例如，该抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如美国专利号5,641,870中所述。此类线性抗体片段可以具有单特异性或双特异性。
在一些实施例中，提供了本文所述的抗体的片段。在一些实施例中，抗体片段为抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合片段选自由以下项组成的组：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双体抗体和三体抗体。
双特异性抗体
在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可与两个不同表位结合。替代性地，双特异性抗体结合臂可与结合白细胞上的触发分子的臂结合，所述触发分子例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，从而将细胞防御机制集中于细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机多样性，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤完成的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物产率低。在WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的过程。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在一些实施例中，融合使用免疫球蛋白重链恒定结构域，包含铰链的至少一部分、CH2和CH3区。在一些实施例中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物中的至少一者中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物中。当在构建中使用的三个多肽链的不相等比例提供最佳产率时，这在实施例中提供了调节三个多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等的比率表达导致高产率或当比率没有特别意义时，有可能在一个表达载体中插入两条或全部三条多肽链的编码序列。
在该方法的一些实施例中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一臂中具有杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已经发现，这种不对称结构促进了所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种简便的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。对于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可以对一对抗体分子之间的界面进行工程化以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。在一些实施例中，界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。具有与大侧链相同或相似大小的补偿性“腔”是通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面上创建。这提供了一种机制，可以提高异源二聚体而不是其他不需要的最终产物(诸如同源二聚体)的产率。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已经提出了此类抗体以将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO92/200373和EP 03089)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法进行制备。合适的交联剂在本领域中是众所周知的，并且与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
由抗体片段生成双特异性抗体的技术也已在文献中有所描述。例如，可使用化学键合来制备双特异性抗体。Brennan等人,Science 229:81(1985)描述了一种程序，其中完整抗体被蛋白水解裂解以生成F(ab')2片段。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二硫醇并且防止分子间二硫化物的形成。然后将生成的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物中的一种转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
还已经描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos蛋白和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体同源二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化以形成抗体异源二聚体。该方法也可以用于抗体同源二聚体的产生。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。这些片段包含通过接头连接至轻链可变结构域(VH)的重链可变结构域(VL)，该接头过短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。
设想到具有多于两个价态的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
多价抗体
在一些实施例中，抗体为多价抗体。通过表达抗体结合的抗原的细胞，多价抗体可以比二价抗体更快地内化(和/或分解代谢)。本文提供的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不是IgM类的抗体)(例如，四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包括Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基末端的抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含三至约八个，但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(并且优选两个多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一个多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两个(并且优选四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。本文设想到的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地，进一步包含CL结构域。
在一些实施例中，抗体为多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单元具有多表位特异性，具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单元结合不同表位，具有两个或更多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同表位，全长抗体，抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体、三体抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施例中，抗体具有多表位特异性；例如与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。在一些实施例中，抗体是单特异性的；例如只结合一个表位的抗体。根据一个实施例，多特异性抗体是以5ΓM至0.001pM、3ΓM至0.001pM、1ΓM至0.001pM、0.5ΓM至0.001pM或0.1ΓM至0.001pM的亲和力与各自表位结合的IgG抗体。
其他抗体修饰
可能期望在效应子功能方面修饰本文提供的抗体，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸取代来实现。替代性地或另外地，半胱氨酸残基可以在Fc区中引入，从而允许在该区中形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见：Caron等人,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)；以及Shopes,B.J.,Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体，如Wolff等人,CancerResearch 53:2560-2565(1993)中所述。替代性地，可对抗体进行工程设计，使其具有双Fc区，从而可具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人,Anti-CancerDrug Design 3:219-230(1989)。
为了增加抗体的血清半衰期，可以如US2006/0067930中所述在抗体中进行氨基酸改变，该专利通过引用以其整体并入本文。
多肽变体和修饰
本文所述的多肽(包括抗体)的一种或多种氨基酸序列修饰可用于通过本文所述的方法净化的可重复使用的色谱材料中。
变体多肽
“多肽变体”是指如本文所定义与多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、多肽(具有或不具有信号肽)的胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性的多肽，优选活性多肽。此类多肽变体包括例如多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。通常，TAT多肽变体与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列，多肽(有或没有信号肽)的胞外结构域将具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者的氨基酸序列同一性。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守性氨基酸取代，或与天然多肽序列相比，包含不超过约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个中任一个保守性氨基酸取代。
例如，与全长天然多肽相比，变体多肽可能在N末端或C末端被截断，或者可能缺少内部残基。某些变体多肽可能缺少对所需生物活性不是必需的氨基酸残基。这些具有截断、缺失和插入的变体多肽可以通过许多常规技术中的任何一种来制备。所需的变体多肽可以化学合成。另一种合适的技术包括通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增编码所需变体多肽的核酸片段。在PCR中的5'和3'引物处使用定义核酸片段的所需末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共用至少一种生物和/或免疫活性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。
例如，可能期望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物特性。多肽的氨基酸序列变体是通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成而制备的。此类修饰包括例如多肽氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特性。氨基酸变化还可以改变多肽(例如抗体)的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
通过将多肽序列与同源的已知多肽分子的序列进行比较，并且将高同源性区中氨基酸序列变化的数量降至最低，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指导。
可用于鉴定多肽(例如抗体)的某些残基或区域(它们是诱变的优选位置)的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)所述。此处，鉴定残基或一组靶标残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且用中性或带负电氨基酸(最优选为丙氨酸或多丙氨酸)替代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在取代位点或针对取代位点引入进一步的或其他变体，对那些对取代表现出功能敏感性的氨基酸位置进行精制。因此，虽然预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点，但是不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点的突变的表现，在靶标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并且筛选表达的抗体变体的所需活性。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至一个氨基酸残基被不同的残基替代。替代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也设想到FR改变。保守取代显示在下表A的“优选取代”标题下。如果此类取代导致生物活性的变化，则可以引入在表A中命名为“示例性取代”或者如以下参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并且对产物进行筛选。
表A.示例性氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
多肽的生物学特性的实质性修饰是通过以下方式完成的：选择对维持(a)该取代区域中的多肽骨架的结构，例如作为片状或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的影响显著不同的取代。氨基酸可根据其侧链特性的相似性进行分组(在A.L.Lehninger,Biochemistry第二版,Worth Publishers,New York(1975)中)：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
替代性地，天然存在的残基可基于常见的侧链特性分为以下几类：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
通常还可以用丝氨酸取代不参与维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反地，可将一个或多个半胱氨酸键添加至多肽以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
一种特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。一种用于生成此类取代变体的方便的方法涉及使用噬菌体展示进行亲和力成熟。简言之，几个高变区位点(例如，6至7个位点)发生突变，以在每个位点产生所有可能的氨基取代。由此生成的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒中展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。替代性地或另外地，可能有益于分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与靶标之间的接触点。根据本文阐述的技术，此类接触残基和邻近残基是用于取代的候选物。一旦生成此类变体，即如本文所述对变体组进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。
另一种类型的多肽氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。此类糖基化可以在多肽在宿主细胞或宿主生物体中表达期间自然发生，或者可以是由人类干预引起的故意修饰。改变是指使多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。“N-连接的”是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸以外的任何氨基酸)为用于将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一者的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以使其含有上述三肽序列中的一者或多者(对于N-连接的糖基化位点)，会方便地向多肽添加糖基化位点。这种改变也可以通过在原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(对于O-连接的糖基化位点)。
除去多肽上存在的碳水化合物部分可以通过化学或酶法或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
其他修饰包括：谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化；N末端胺的乙酰化；以及任何C末端羧基的酰胺化。
嵌合多肽
本文所述的多肽可以以形成嵌合分子的方式进行修饰，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施例中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合体，所述标签多肽提供抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常被置于多肽的氨基或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体来检测这种表位标记形式的多肽的存在。此外，表位标签的提供使得多肽能够通过使用抗标签抗体或与表位标签结合的另一种类型的亲和基质进行的亲和纯化而容易地纯化。
在替代实施例中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合。嵌合分子的二价形式被称为“免疫黏附素”。
如本文所用，术语“免疫黏附素”表示将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合的抗体样分子。在结构上，免疫黏附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合，该所需结合特异性不同于抗体的抗原识别和结合位点结合特异性(即“异源”)。免疫黏附素分子的黏附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的接续氨基酸序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白中获得，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
Ig融合体优选地包括在Ig分子中至少一个可变区的位置取代可溶性(跨膜结构域缺失或失活)形式的多肽。在一个特别优选的实施例中，免疫球蛋白融合体包括IgG1分子的铰链区CH2和CH3，或铰链区CH1、CH2和CH3。
多肽缀合物
用于在多肽制剂中使用的多肽可以与细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)缀合。
可以使用可用于产生这种缀合物的化学治疗剂。此外，可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。多种放射性核素可用于产生放射性缀合多肽。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。多肽和细胞毒性剂的缀合物是使用多种双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)来制得的。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述来制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至多肽。
本文还设想到多肽与一种或多种小分子毒素(诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素类(maytansinoid)、新月毒素(trichothene)和CC1065)以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物的缀合物。
美登木素类是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初是从东非灌木锯齿美登木(Maytenus serrata)中分离得到的。随后，发现某些微生物也产生美登木素类，诸如美登醇(maytansinol)和C-3美登醇酯。还设想到合成的美登醇及其衍生物和类似物。本领域中已知许多用于制备多肽-美登木素缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开的那些。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如上述专利中所公开的，优选的是二硫化物和硫醚基团。
接头可以在不同的位置与美登木素分子连接，这取决于连接的类型。例如，可以使用常规的偶联技术通过与羟基基团反应形成酯键。反应可以在具有羟基的C-3位、经羟甲基修饰的C-14位、经羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位进行。在一个优选的实施例中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成键合。
另一种目的缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的多肽。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族的缀合物的制备，参见例如，美国专利号5,712,374。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θ1 I。抗体可缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，其为抗叶酸剂。加利车霉素和QFA两者均具有细胞内作用位点，并且不易穿过质膜。因此，通过多肽(例如，抗体)介导的内化作用细胞摄入这些药剂大大增强了它们的细胞毒性作用。
可与本文所述的多肽缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲佐菌素、长春新碱和5-氟尿嘧啶(统称为LL-E33288复合体的药剂家族)以及埃斯培拉霉素。
在一些实施例中，多肽可以是多肽与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间的缀合物。
在又一个实施例中，多肽(例如，抗体)可与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将多肽受体缀合物施用于患者，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，亲和素)。
在一些实施例中，多肽可以与前药活化酶缀合，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂)转化为活性抗癌药物。免疫缀合物的酶组分包括能够以这种方式作用在前药上的任何酶，以便将其转化为其更活跃的细胞毒性形式。
可用的酶包括但不限于碱性磷酸酶，可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶,可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷氏蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰基羧肽酶，可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；和青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可用于将在其胺氮处衍生化成具有苯氧基乙酰基或苯基乙酰基的药物分别转化为游离药物。替代性地，具有酶活性的抗体，在本领域中也称为“抗体酶”，可用于将前药转化为游离活性药物。
其他
多肽的另一类共价修饰包括将多肽连结到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。多肽还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Gennaro,A.R.编,(1990)中。
获得用于在制剂中使用的多肽
可使用在本领域中众所周知的方法(包括重组方法)获得将使用通过本文所述的方法净化的可重复使用的色谱材料纯化的多肽。以下部分提供有关这些方法的指导。
多核苷酸
本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。
编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于由据信具有多肽mRNA并且以可检测水平表达该多肽的组织制备的cDNA文库。因此，可以方便地从由人组织制备的cDNA文库中获得编码多肽的多核苷酸。多肽编码基因也可以从基因组文库或通过已知的合成程序(例如，自动核酸合成)获得。
例如，多核苷酸可以编码整个免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(VH)，而且包括重链恒定区(CH)，该重链恒定区通常包括三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3；以及“铰链”区。在一些情况下，希望存在恒定区。
其他可以由多核苷酸编码的多肽包括抗原结合抗体片段，例如单结构域抗体(“dAbs”)、Fv、scFv、Fab’和F(ab')2以及“微抗体”。微抗体是(通常)已切除CH1和CK或CL结构域的二价抗体片段。由于微抗体小于常规抗体，因此它们在临床/诊断使用中应实现更好的组织穿透，但作为二价抗体，它们应保持比单价抗体片段(诸如dAb)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有说明，否则本文所用的术语“抗体”不仅包括整个抗体分子，而且包括上述类型的抗原结合抗体片段。优选地存在于编码的多肽中的每个框架区将包含相对于相应的人受体框架的至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体框架区，框架区总共包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。
适当地，可以分离和/或纯化本文所述的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸为分离的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”旨在指示该分子从其正常或自然环境中移除或分离，或者以其不存在于其正常或自然环境中的方式产生。在一些实施例中，多核苷酸为纯化的多核苷酸。术语“纯化的”旨在指示至少一些污染分子或物质已被去除。
适当地，多核苷酸为实质上纯化的，使得相关多核苷酸构成组合物中存在的主要(即，最丰富的)多核苷酸。
多核苷酸的表达
下面的描述主要涉及通过培养用含有编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞来生产多肽。当然，设想到可以采用本领域中众所周知的替代方法来制备多肽。例如，可以使用固相技术通过直接肽合成产生适当的氨基酸序列或其部分(参见例如，Stewart等人,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co,San Francisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以使用手动技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。例如，可以使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City,Calif.)按照生产商的说明书完成自动合成。多肽的各部分可以分别化学合成，并且使用化学或酶促方法结合以产生所需多肽。
将如本文所述的多核苷酸插入用于产生多肽的表达载体中。术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。
当多肽与另一个多核苷酸序列处于功能性关系中时，该多肽经“可操作地连接的”。例如，将前序列或分泌前导序列的核酸与用于多肽的核酸(如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白)可操作地连接；将启动子或增强子与影响序列的转录的编码序列可操作地连接；或者将核糖体结合位点与定位为便于翻译的编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的核酸序列是连续的，并且对于分泌前导序列而言是连续的并且在读段阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性酶切位点连接来完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
对于抗体，可将轻链和重链克隆到相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的核酸片段可操作地连接至一种或多种表达载体中的控制序列，以确保免疫球蛋白多肽的表达。
含有多核苷酸序列(例如，可变重链和/或可变轻链编码序列以及任选的表达控制序列)的载体可通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，其取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press,第2版,1989))。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合体、脂质体、电穿孔和显微注射。对于转基因动物的产生，可将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并且将此类细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体以及穿梭载体。
术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”意指能够从一个实体转移到另一个实体的构建体，所述实体可以属于同一物种或者可以属于不同物种。如果构建体能够从一个物种转移到另一个物种，诸如从大肠杆菌(Escherichia coli)质体转移到细菌，诸如芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，则转化载体有时被称为“穿梭载体”。它甚至可以为能够从大肠杆菌(E.coli)质体转移到农杆菌属(Agrobacterium)再到植物的构建体。
可以如下所述将载体转化到适当的宿主细胞中以提供多肽的表达。各种载体是公开可用的。载体可以呈例如质体、黏粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。适当的核酸序列可以通过各种程序插入到载体中。一般而言，使用本技术领域中已知的技术将DNA插入适当的限制性核酸内切酶位点中。含有这些组分中的一者或多者的合适的载体的构建采用本领域技术人员已知的标准连接技术。
载体可以为例如质体、病毒或设有复制起点的噬菌体载体、任选地用于表达所述多核苷酸的启动子及任选的启动子的调节剂。载体可含有本领域中众所周知的一种或多种选择性标记基因。
这些表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分为可复制的。
宿主细胞
宿主细胞可以为例如细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
可以使用经遗传操作的转基因多细胞宿主生物体来生产多肽。生物体可以为例如转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠品系)。
合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如大肠杆菌(E.coli)。各种大肠杆菌菌株是公开可用的，诸如大肠杆菌(E.coli)K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌(E.coli)X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌(E.coli)菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；伊文氏杆菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；以及沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌属(Serratiamarcescans)；以及志贺氏菌属(Shigella)；以及杆菌(Bacilli)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis41P))；假单孢菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；以及链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是说明性而非限制性的。菌株W3110是一种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组多核苷酸产物发酵的常用宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌极少量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以经修饰以在编码宿主内源性多肽的基因中产生基因突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌(E.coli)W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌(E.coli)W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌(E.coli)W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT kan'；大肠杆菌(E.coli)W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvG kan'；大肠杆菌(E.coli)W3110菌株40B4，其为具有非卡那霉素(non-kanamycin)抗性degP缺失突变的菌株37D6；以及具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌(E.coli)菌株。替代性地，体外克隆方法(例如PCR或其他核酸聚合酶反应)为合适的。
在这些原核宿主中，可制备表达载体，其通常将含有与宿主细胞兼容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任意数量的各种众所周知的启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将控制表达，任选地与操纵子序列一起控制表达，并且具有核醣体结合位点序列等，用于启动并且完成转录和翻译。
真核微生物可用于表达。真核微生物诸如丝状真菌或酵母菌为用于编码多肽载体的合适的克隆或表达宿主。酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核生物宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克哈米克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母(Candida)；瑞氏木霉(Trichodermareesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，诸如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)；以及曲霉属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养型酵母在本文中是合适的并且包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母，选自汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、圆酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。酵母菌属(Saccharomyces)为优选的酵母宿主，其具有表达所需的控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等的合适载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酯激酶和其他肝糖分解酶。诱导型酵母启动子包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶等。
除微生物以外，哺乳动物组织细胞培养物还可用于表达并且产生如本文所述的多肽，并且在一些情况下为优选的(参见Winnacker,From Genes to Clones VCHPublishers,N.Y,N.Y.(1987))。对于一些实施例，真核细胞可能是优选的，因为本领域已经开发出许多能够分泌异源性多肽(例如，完整免疫球蛋白)的合适的宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施例中，哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。
在一些实施例中，宿主细胞为脊椎动物宿主细胞。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为：由SV40(COS-7,ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾系(293或用于在悬浮培养物中生长的亚克隆的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12细胞系)；小鼠睾丸支持细胞；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。
制品
本文所述的多肽制剂可包含在制品中。制品可包括含有多肽(例如，多肽的制剂、多肽的喷雾干燥制剂或控释形式的多肽)的容器。优选地，制品包括：(a)容器，在该容器内包含组合物，该组合物包含本文所述的多肽和/或多肽制剂；以及(b)包装插页，其包含关于向受试者施用制剂的说明书。
该制品包括容器以及在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳或含有制剂，并且可具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是多肽。标签或包装插页表明组合物在受试者中的用途，并且附有关于多肽和所提供的任何其他药物的给药量和间隔的具体指导。制品可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。在一些实施例中，容器为注射器。在一些实施例中，注射器进一步包含在注射装置内。在一些实施例中，注射装置为自动注射器。
“包装插页”用于指治疗产物的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产物的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装内的产物组合使用的其他治疗产物和/或警告的信息。
示例性实施例
本发明提供了以下示例性实施例。
1.一种制剂，其包含多肽和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)。
2.根据实施例1所述的制剂，其中HPMCAS包含约8％至约12％的醋酸根和约7％至约15％的琥珀酸根。
3.根据实施例2所述的制剂，其中HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)或者约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。
4.根据实施例1至3中任一项所述的制剂，其中该制剂中的HPMCAS与蛋白质的比率为约4:1(mg/mg)至约1:4(mg/mg)，任选地其中该比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)。
5.根据实施例1至4中任一项所述的制剂，其中该制剂进一步包含组氨酸缓冲剂。
6.根据实施例5所述的制剂，其中组氨酸缓冲剂为组氨酸HCl缓冲剂。
7.根据实施例5或6所述的制剂，其中该制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度为约5mM至约20mM，任选地其中该制剂中的组氨酸缓冲剂的浓度为约10mM。
8.根据实施例1至7中任一项所述的制剂，其中该制剂进一步包含聚山梨醇酯。
9.根据实施例8所述的制剂，其中聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20。
10.根据实施例8或9所述的制剂，其中该制剂中的聚山梨醇酯的浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)。
11.根据实施例8至10中任一项所述的制剂，其中该制剂中的聚山梨醇酯的浓度为约0.01％(w/v)。
12.根据实施例1至11中任一项所述的制剂，其中该制剂的pH为约5.5至约7.0。
13.根据实施例1至12中任一项所述的制剂，其中该制剂的pH为约6.5。
14.根据实施例1至13中任一项所述的制剂，其中多肽为抗体。
15.根据实施例1至14中任一项所述的制剂，其中多肽为单克隆抗体。
16.根据实施例1至15中任一项所述的制剂，其中多肽为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
17.根据实施例14至16中任一项所述的制剂，其中抗体为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段，任选地其中该抗体片段为(Fab')2片段。
18.根据实施例1至17中任一项所述的制剂，其中该制剂中的多肽的浓度为约5mg/mL至约100mg/mL。
19.根据实施例1至18中任一项所述的制剂，其中该制剂中的多肽的浓度为约10mg/mL。
20.一种制剂，其包含：
浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体，
HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约5.5至约7.0。
21.一种制剂，其包含：
浓度为约10mg/mL的抗体，
HPMCAS-LF，其中该制剂中的HPMCAS-LF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中该制剂的pH为约6.5。
22.一种制剂，其包含：
浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体，
HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且其中该制剂的pH为约5.5至约7.0。
23.一种制剂，其包含：
浓度为约10mg/mL的抗体，
HPMCAS-HF，其中该制剂中的HPMCAS-HF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中该制剂的pH为约6.5。
24.根据实施例20至23中任一项所述的制剂，其中抗体为单克隆抗体。
25.根据实施例20至24中任一项所述的制剂，其中抗体为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
26.根据实施例20至25中任一项所述的制剂，其中抗体为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段，任选地其中该抗体片段为(Fab')2片段。
27.根据实施例1至26中任一项所述的制剂，其中该制剂经喷雾干燥以形成多肽或抗体的喷雾干燥制剂。
28.根据实施例27所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中该制剂中的多肽或抗体在约90℃稳定至少约5小时和/或在约37℃稳定至少约4周。
29.根据实施例27或28所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中该制剂中的多肽或抗体显示减少的聚集和/或减少的化学降解。
30.根据实施例29所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中减少的化学降解包括减少的该多肽的琥珀酰亚胺变体的形成和/或减少的多肽的焦谷氨酸变体的形成。
31.根据实施例27至30中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中该制剂为无定形玻璃态制剂。
32.根据实施例27至31中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的该喷雾干燥制剂被包封在产生酸性微气候的聚合物系统中。
33.根据实施例27至32中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的该喷雾干燥制剂被包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
34.根据实施例27至33中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的该喷雾干燥制剂被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)中。
35.根据实施例27至33中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的该喷雾干燥制剂被包封在PLGA杆状物中。
36.一种组合物，其包含根据实施例1至27中任一项所述的制剂。
37.一种组合物，其包含根据实施例27至35中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂。
38.一种组合物，其包含含有根据实施例1至27中任一项所述的制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。
39.一种组合物，其包含含有根据实施例27至35中任一项所述的喷雾干燥制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。
40.根据实施例38或39所述的组合物，其中乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。
41.根据实施例38至40中任一项所述的组合物，其中乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA杆状物。
42.一种制备喷雾干燥多肽的方法，该方法包括制备根据实施例1至19中任一项所述的制剂，以及使该制剂经受喷雾干燥。
43.一种制备喷雾干燥抗体的方法，该方法包括制备根据实施例20至26中任一项所述的制剂，以及使该制剂经受喷雾干燥。
44.根据实施例42或43所述的方法，其中使用包括入口和出口的喷雾干燥器进行喷雾干燥。
45.根据实施例44所述的方法，其中入口具有约90℃至约120℃、约100℃或约110℃的温度。
46.根据实施例44所述的方法，其中出口具有约60℃的温度。
47.一种制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，该方法包括将根据实施例1至26中任一项所述的制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
48.一种制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，该方法包括将根据实施例27至30中任一项所述的喷雾干燥制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
49.根据实施例47或48所述的方法，其中乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。
50.一种制品，其包含根据实施例1至27中任一项所述的制剂、根据实施例28至35中任一项所述的喷雾干燥制剂或根据实施例36至41中任一项所述的组合物。
51.一种制品，其包括通过根据实施例42至46中任一项所述的方法制备的喷雾干燥制剂。
52.一种制品，其包括通过根据实施例47至49中任一项所述的方法制备的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒包封的多肽。
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可由用于相同、等效或类似目的的替换特征来代替。因此，除非另外明确说明，否则所公开的每个特征仅是一通用系列的等同或类似特征的实例。
本发明的进一步的细节通过以下非限制性实例说明。在本说明书中所有参考文献的公开内容通过引用明确地并入本文。
实例
缩略语：AS-HF(包含约12％醋酸根和约7％琥珀酸根的HPMCAS)；AS-LF(包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根的HPMCAS)；E/P(赋形剂/蛋白质比率)；HPMC(羟丙基甲基纤维素，也称为羟丙甲纤维素)；HPMCAS(醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯)；IEC(离子交换色谱)；PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))；和SEC(体积排阻色谱)。
以下实例仅旨在作为本发明的示例并且因此不应被认为以任何方式限制本发明。以下实例及详细描述仅以说明而非限制的方式提供。
实例1.羟丙基甲基纤维素衍生物使抗体片段稳定并且抵抗pH变化
评估羟丙基甲基纤维素(HPMC或羟丙甲纤维素)的醋酸根和琥珀酸根衍生物在PLGA杆状物的情境下使模型蛋白(标记为Fab2)稳定的效用。考察了两种不同的HPMC衍生物；一种包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(称为AS-LF)，另一种包含约12％醋酸根和7％琥珀酸根(称为AS-HF)。
对包含Fab2的喷雾干燥制剂中的HPMCAS赋形剂与海藻糖、Metolose和不含赋形剂的制剂在90℃持续数小时以及在37℃持续4周的性能进行比较。先前已经研究了海藻糖在喷雾干燥制剂中以及在高温下稳定Fab2的作用(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。选择90℃的温度以指导用于高温处理(诸如在用于药物递送的PLGA聚合物杆状物的制备中使用的热熔挤出)的喷雾干燥制剂的相容性。执行37℃稳定性研究，以提供可适用于2℃至8℃的制剂之间有意义的相对稳定性。此外，37℃还模拟体温，并且记录蛋白质药物暴露于PLGA杆状物的持续递送系统中长期停留期间所经历的生理温度的影响。Fab2作为喷雾干燥粉末通过热熔挤出法被包封在PLGA圆柱杆状物中。随后在生理条件下在37℃研究在HPMCAS赋形剂、Metolose和海藻糖存在下配制时PLGA杆状物内的Fab2稳定性，持续3周。为表征包封在PLGA杆状物中的蛋白质稳定性，对从杆状物中提取的Fab2的聚集或化学降解进行考察。尽管与在人体内可水解的海藻糖不同，HPMCAS为不可生物降解的，因此在肠胃外递送方面的应用受到限制。
材料与方法
材料。Fab2获自基因泰克(South San Francisco,CA)。α–α海藻糖二水合物获自Ferro Pfanstiehl Laboratories(Cleveland,OH)；醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)获自Shin-Etsu Chemical Co,Ltd.(Tokyo,Japan)，具有两种不同的等级，即HPMCAS-HF(12％乙酰基、7％琥珀酰基，溶解pH≥6.5)和HPMC AS-LF(8％乙酰基、15％琥珀酰基，溶解pH≥5.5)。羟丙甲纤维素(Metolose)还获自Shin-Etsu Chemical Co,Ltd.(Tokyo,Japan)。组氨酸和组氨酸HCl获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，聚山梨醇酯20(PS20)获自Spectrum Chemical(New Burnswick,NJ)。PLGA RG755S购自EvonikCorporation(Piscataway,NJ)。
Fab2的喷雾干燥。针对含有0.01％(w/v)聚山梨醇酯20的10mM组氨酸/组氨酸HCl缓冲剂(pH 5.5)，对40mg/mL的Fab2(MWCO＝10,000Da)进行透析。透析缓冲剂在16小时内更换四次。将Fab2用含有0.01％聚山梨醇酯20的10mM组氨酸/组氨酸HCl缓冲剂(pH 5.5)稀释至20mg/mL。使用紫外光谱测量Fab2浓度(ε＝1.39mL·cm–1·mg–1，在280nm处)。按照制造商的规定，HPMC AS-LF和HPMC AS-HF级在以20mg/mL制备并且混合物的最终pH为约4时最初不溶于水。在含有10mg/mL组氨酸碱和0.01％聚山梨醇酯20的水中制备20mg/mL的HPMC AS-LF和HPMC AS-HF工作溶液，最终pH为6.5。将所需量的海藻糖二水合物、HPMC AS-LF、HPMCAS-HF和Metolose加入Fab2中，得到具有相同赋形剂/蛋白质质量比1.0的溶液(见表1-1)。然后，在入口和出口温度分别为110℃±2℃和60℃±2℃的条件下，使用Buchi B290型微型喷雾干燥器(New Castle,NJ)对水性制剂进行喷雾干燥。泵功率为8％，并且抽吸器以100％容量操作。液体进料速率为3.4mL/min，并且压缩空气流速为600L/h。将收集的喷雾干燥粉末转移至干净、干燥的15cc Lyo玻璃小瓶中，并且在真空室中储存于氮气下，直至进一步使用。将所有喷雾干燥的粉末在冻干器(Advantage Pro Lyophilizer,SP Scientific,UK)中进一步二次干燥。
扫描电子显微镜(SEM)。喷雾干燥颗粒的形态是用Quanta 3D(Hillsboro,OR)FEGSEM进行成像的。将样品用碳粘合剂固定在铝短柱上，并且用金/钯(Cressington溅射涂布器，TED Pella,Inc.)溅涂以改善其电导率。SEM图像是在低电压下采集，以最大程度减少任何潜在的样品损坏或表面充电。
通过激光衍射进行粒径表征。使用Partica LA-950V2激光衍射粒径分布分析仪(Horiba Ltd,Kyoto,Japan)测量喷雾干燥的Fab2粉末的粒径分布。将大约1mg喷雾干燥粉末分散在1ml异丙醇中，并且将分散体逐滴加入50ml异丙醇中，直至达到目标光阻水平。利用异丙醇的折射率(1.3776)，用粒度分级程序计算粒径分布。
Fab2的高温热处理。称取来自各制剂的喷雾干燥粉末(2mg至7mg，相当于1mg至1.5mg Fab2)置于7mL玻璃小瓶中。将小瓶盖子打开，并且放入Binder强制空气对流烘箱(Bohemia,NY)中，预热并且平衡至90±5℃的所需温度。在1、2、3、4和5h取出样品，立即加盖，并且使其冷却至室温。将小瓶内容物溶于纯化水中，使得最终蛋白质浓度为约1mg/mL。观察复溶水样的澄清度，并且将明显澄清的样品用于SEC和IEC分析。
体积排阻色谱(SEC)。对于Fab2，使用配备TOSOH TSKgel G2000SWXL(7.8×300mm内径，5μm粒径)柱的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行体积排阻色谱(SEC)HPLC分析。在25℃在等度模式下使用0.20M K3PO4和0.25M KCl(pH 6.2)作为流动相(流速为0.7mL/min)分析样品。进样浓度为1mg/mL的20μL样品，并且总运行时间为20min。使用280nm处的吸光度进行检测。通过将各组在各时间点处的峰面积除以总峰面积来计算百分比峰面积。
离子交换色谱(IEC)。使用配备两根串联连接的Dionex(Sunnyvale,CA)ProPacSAX-10(2×250mm)强阴离子交换柱和二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行离子交换色谱(IEC)HPLC分析。流动相A(溶剂A)为20mM Tris缓冲剂，pH 8.2，并且流动相B(溶剂B)为250mM溶于溶剂A中的氯化钠。分析前，将样品用溶剂A稀释至约1mg/mL，并且进样20μL样品。采用从0min时的100％溶剂A开始到45min时的20％溶剂A的线性梯度，在总共约60min的运行时间内分离Fab2电荷变体。利用280nm处的吸光度进行检测。将IEC峰分离为主峰、酸性峰和碱性峰。
Fab2与AS-LF和AS-HF喷雾干燥制剂的分离。通过将粉末复溶于水中并且将Fab2与HPMCAS分离，经由SEC和IEC来分析测量HPMCAS粉末制剂中的Fab2的稳定性。将复溶的包含AS-LF和AS-HF的Fab2喷雾干燥粉末用0.1N HCl滴定，以使溶液的pH降至pH 3并且沉淀出HPMCAS赋形剂。将沉淀的样品以4000g离心，并且将上清液通过在对应于测定的流动相中稀释以用于Fab2分析目的。
差示扫描量热法(DSC)。在TA仪器DSC Q200(New Castle DE)量热仪上，在调制条件下进行DSC分析。称取大约2±1mg样品置于铝盘中并且气密密封。将样品在5℃平衡10min，然后以2℃/min加热并且以±1.00℃/min调制至120℃，并且以2℃/min冷却回5℃。在样品在5℃再次平衡后，第二次重复相同的加热和调制斜率，直至达到180℃。完成第一加热斜率以消除由于储存或处理条件而与样品相关联的任何热历程。出于报告的目的，使用样品的第二加热斜率，其不含任何热历程。将玻璃化转变温度报告为第二加热循环的半高中点(图2)。
碱和酸滴定。使用带有Micro-Pro-ISM pH探针的Mettler Toledo pH计(MettlerToledo,Columbus,OH)对HPMC AS-LF和HPMC AS-HF赋形剂在水中的单独溶液进行碱滴定实验。分别以5重量％和7重量％制备HPMC AS-LF和HPMC AS-HF在水中的混合物。两种混合物的初始pH值经测量为约4，并且大多数HPMCAS赋形剂不溶于水。将溶液用0.5N NaOH逐渐滴定，并且持续涡漩，直至完全混溶。完全混溶后，HPMC AS-LF和HPMC AS-HF在水中的pH经测量均超过pH 6。对水中的HPMCAS、Metolose、海藻糖和无赋形剂制剂的喷雾干燥粉末样品进行类似的酸滴定实验，在这种情况下，通过用0.1N HCl滴定至pH 3。
喷雾干燥Fab2和PLGA圆柱杆状物的热熔挤出(HME)。使用料筒容量为5g或7cm3的HAAKETMMiniCTW微型锥形双螺杆混料机(Thermo Scientific,Karlsruhe,Germany)进行热熔挤出。挤出机料筒经预热至90℃，并且将螺杆速度设定为40rpm。挤出机的前料筒开口在再循环模式下保持关闭。将预称重的固体聚合物和喷雾干燥Fab2手动缓慢进料至挤出机中，并且再循环回料筒以用于微复合。将使用不同喷雾干燥制剂的植入物的Fab2载量固定为15％(w/w)Fab2/PLGA。完全进料后，在再循环模式下继续熔体相共混30min，然后通过0.5mm圆形模具挤出。将挤出物冷却至室温，切割成所需长度的圆柱体并且储存在2至8℃，直至进一步用于释放研究。
体外稳定性研究设置。用于研究来自PLGA杆状物的Fab2的体外稳定性设置在玻璃小瓶(VWR硼硅酸盐玻璃瓶，7.4mL)中进行，其中包含5mg聚合物杆状物和1mL PBSTN(1xPBS，含0.01％(w/v)PS20和0.02％(w/v)叠氮化钠)。在80％ RH的湿度受控培养箱中，研究温度保持在37℃，以最大程度减少蒸发。对于样品制备，将聚合物杆状物切割成五个1mg节段并且置于单独标记的玻璃小瓶中。使用微量天平(Mettler Toledo XPE56,Columbus,OH)记录杆状物的精确重量。释放研究一式三份进行，并且在第1天对释放缓冲剂采样，然后每7天采样一次。在每个时间点，将释放缓冲剂(PBSTN)完全移出并且收集到1.5mL Eppendorf管(Eppendorf,CT,USA)中，并且用1mL新鲜PBSTN替代。如先前所述，使用SEC方法测量释放缓冲剂中的Fab2浓度。释放3周后，将缓冲剂从小瓶中的杆状物中彻底吸出，然后将杆状物用1mL水冲洗两次，并且在化学/生物安全柜内风干3小时至4小时，直至小瓶内部无可见液体。然后将杆状物置于真空干燥器中持续至少一周，以使所有水分完全变干。
Fab2从PLGA杆状物中的回收。使杆状物干燥后，使用相同的杆状物分析杆状物中剩余的Fab2。利用提取方案从聚合物中去除Fab2并且将其分离。首先，将干燥杆状物转移至锥底玻璃小瓶(Worldwide Glass Resource,4mL)中，然后通过加入4mL四氢呋喃(THF)并且搅拌小瓶直至杆状物可见溶解来溶解杆状物。PLGA可溶于THF，而蛋白质不溶于THF。将包含溶解的PLGA杆状物的小瓶离心，以在小瓶底部形成Fab2沉淀。蛋白质沉淀容易受到干扰，因此从上清液中去除大约3.5mL THF。然后将小瓶用THF再冲洗一次，并且离心。将管底Fab2沉淀用THF二次冲洗并且离心，以再次重复该过程。此操作的目的是在用THF首次冲洗后去除任何剩余的聚合物残留物。因此，留下湿粉末形式的富含Fab2的沉淀。蒸发掉剩余THF，留下干燥的Fab2粉末。将最终干燥的Fab2粉末用1ml PBS缓冲剂复溶，并且用于分析检测。
结果
Fab2的喷雾干燥制剂。制备五种浓度为10mg/mL的Fab2制剂，并且评估喷雾干燥后的稳定性(表1-1)。所有五种制剂均在10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20中配制。其中一种制剂仅具有10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20，不含任何糖或HPMCAS，将其用作对照。两种制剂包含HPMCAS赋形剂的制剂是在pH6.5、10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20中配制的。包含Fab2的喷雾干燥AS-LF和AS-HF制剂的制备示意性地显示于图3中。各制剂中海藻糖、Metolose、AS-LF和AS-HF赋形剂与蛋白质的质量比为1:1。然而，赋形剂与蛋白质的摩尔比因赋形剂分子质量的不同而不同，并且范围在0.3至137之间，具体取决于制剂。如表1-1中所示，所有制剂的pH均在液态喷雾干燥之前以及通过复溶于水中进行喷雾干燥之后进行测量。两次pH测量结果相同，指示未因喷雾干燥而发生电离状态变化。
喷雾干燥Fab2的特性。喷雾干燥后的所有五种制剂均得到微米级颗粒(图4A)，所述颗粒具有相似的颗粒形态，范围从球形到坍塌球形(图4B)。在不同的赋形剂制剂中，颗粒的直径范围为3微米至10微米。将所有喷雾干燥粉末均复溶于水中，并且使用体积排阻色谱(SEC)分析聚集，并且使用离子交换色谱(IEC)分析化学降解。对于包含AS-LF和AS-HF的制剂，在分析Fab2之前遵循方法部分中重点介绍的分离方案。喷雾干燥后，所有制剂中通过SEC得到的单体含量与通过IEC得到的主电荷变体峰相似，并且与喷雾干燥前的Fab2相当(表1-1)。
表1-1.针对稳定性研究评估的喷雾干燥Fab2制剂的详细信息
1喷雾干燥后的pH是在将1％固体溶于水中后测量的。
HPMCAS对Fab2的固态稳定性的影响。喷雾干燥制剂中的Fab2的稳定性在90℃测试5小时，并且在37℃测试4周。在两种温度下，在不含赋形剂的制剂的情况下观察到最大水平的聚集，其次为含有Metolose的制剂。在不含赋形剂的制剂的情况下，90℃下在5小时后的最大单体损失为6.2％(图5A)，并且37℃下在四周后的最大单体损失为1.5％(图5B)。其次为Metolose制剂，其在90℃的单体损失为5％并且在37℃的单体损失为0.9％。在含有HPMCAS赋形剂和海藻糖的制剂中，无论赋形剂的性质如何，单体损失均相当且显著减少。在90℃孵育五小时后，海藻糖、AS-LF和AS-HF制剂显示最少的单体损失(0.7％至0.9％)。在37℃孵育四周后，海藻糖、AS-LF和AS-HF制剂再次显示最少的单体损失(≤0.2％)。与37℃下较长的孵育期相比，90℃下较短的孵育期引起更多聚集。比较Fab2在两种温度储存后的赋形剂依赖性物理聚集，聚合物赋形剂AS-LF和AS-HF提供与海藻糖相同的抗聚集保护作用。
IEC方法依赖阴离子交换柱将不同的Fab2相关电荷变体物质分离成碱性或酸性变体。在Fab2主峰的左侧观察到碱性峰，并且酸性电荷变体显示在Fab2主峰的右侧。IEC上峰的详细表征和种类以及Fab2的化学降解机制先前已有报道(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。研究已经表明，紧邻Fab2主峰左侧的峰为经由Fab2中N末端谷氨酸的分子内环化形成的焦谷氨酸峰形成。约19分钟及21分钟处的峰分别对应于Fab2序列中的两个和一个天冬氨酸残基的琥珀酰亚胺中间产物。此类焦谷氨酸和琥珀酰亚胺中间产物的形成导致净负电荷去除，并且在阴离子IEC上产生碱性峰。然而，由天冬酰胺酸侧链形成脱酰胺物质导致净负电荷以及Fab2等电点(pI)的增加，从而引起阴离子IEC上的酸性变体峰。在测定期间未观察到主要Fab2脱酰胺峰。
在Fab2的情况下，暴露于90℃和37℃后，观察到不同途径的化学降解(图6A和6B)。经由Fab2中的一个天冬氨酸侧链环化形成的琥珀酰亚胺产物以及经由N末端谷氨酸环化形成的焦谷氨酸产物(PyroE)在IEC上分别在约21分钟和24.2分钟处得到碱性峰。对于所有制剂，在使Fab2暴露在90℃后观察到这两种降解反应的增加(图6A)。而在37℃，所有制剂在应激后约19分钟出现新峰(图6B)，并且该峰在约21分钟时消失。表明暴露于37℃后，由第二天冬氨酸形成新的琥珀酰亚胺产物。
在90℃和37℃，制剂中赋形剂的存在均不影响琥珀酰亚胺形成。然而，赋形剂的性质显示对焦谷氨酸形成的大小有影响。IEC色谱图已相对于主峰进行了归一化。通过测量主峰与焦谷氨酸峰面积的比率来定量分析焦谷氨酸形成(图6C和6D)。与不含赋形剂的制剂相比，HPMCAS赋形剂的存在对Fab2焦谷氨酸形成无任何影响，相比之下，海藻糖抑制焦谷氨酸峰形成。这与我们先前的结果一致，即海藻糖在类似条件下抑制Fab2中焦谷氨酸峰形成(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。同时，在90℃和37℃应激条件下，HPMCAS赋形剂的存在均未改善Fab2的化学稳定性。
HPMCAS赋形剂的缓冲容量。HPMCAS原材料的碱滴定实验揭示了两种赋形剂对添加氢氧化钠后pH变化的抗性(图7A)。此类碱滴定模拟制备用于喷雾干燥的HPMCAS储备液期间由HPMCAS链形成的水性环境(图3)。AS-LF在随后的碱添加后显示对约pH 5.2的pH变化的抗性，并且AS-HF显示对约pH 5.8的pH变化第抗性，进一步确认了这两种赋形剂提供如制造商所指定的缓冲容量范围的事实。在碱滴定实验期间，AS-LF在其观察到的约pH 5.2的缓冲范围内抗pH变化能力更强，即，几乎是AS-HF的两倍，如根据单位质量的各赋形剂所引入的羟基基团的毫摩尔数所确定(图7A)。为考察HPMCAS赋形剂在PLGA装置的酸性微气候内的中和作用，在用强盐酸对HPMCAS喷雾干燥粉末制剂进行酸滴定时监测pH的变化(图7B)。HPMCAS赋形剂在喷雾干燥Fab2粉末中的存在在约pH 5的条件下抗酸添加引起的pH变化。与不含HPMCAS赋形剂的喷雾干燥蛋白质粉末相比，在海藻糖和无赋形剂的制剂的情况下，仅加入1mM酸，pH即显著下降(从pH 5.5降至2.5)。类似地，在结构上与HPMCAS相同但不包含醋酸根和琥珀酸根官能团的Metolose的情况下，未见缓冲能力。重要的是，有趣地发现，与不含HPMCAS的制剂相比，含有HPMCAS的喷雾干燥蛋白质制剂产生类似的pH变化所需的酸量几乎高达6倍(约6mM)。
体外释放期间包封在PLGA植入物中的Fab2的稳定。为考察赋形剂对PLGA植入杆状物内蛋白质稳定性的影响，将包含海藻糖、AS-LF、AS-HF并且不含任何赋形剂的Fab2喷雾干燥制剂包封在1mg PLGA圆柱形杆状物中，用于研究药物释放和PLGA植入物降解。在PBSTN中在37℃孵育3周后，从载有15％药物的PLGA杆状物中回收Fab2，分析聚集体稳定性(图8)。对于载有不同Fab2的PLGA杆状物，此操作一式三份进行。在不存在任何赋形剂的情况下，Fab2的聚集度更高，并且单体含量降低9.5％。含有海藻糖的杆状物状制剂在3周后表现出类似的单体含量损失(7％)。对于所有HPMCAS赋形剂制剂，观察到的Fab2聚集体的量最少，单体含量降低4％(AS-LF)和3.2％(AS-HF)。
讨论
喷雾干燥提供了物理稳定的无定形药物形式，使喷雾干燥产物能够加工成难溶性聚合物药物递送系统。无定形药物能够以稳定的微米形式分子分散，用于持续递送药物释放系统，如毫米级PLGA圆柱形杆状物。喷雾干燥粉末的热重分析(图2)和玻璃化转变温度(Tg)测量结果(表1-1)可提供有关鉴定用于制备PLGA杆状物的热熔挤出加工温度窗口的信息。另外，喷雾干燥可产生大小和形态均一的固体药物形式，该固体药物形式可通过可重现、可控和可放大的工艺来制造。喷雾干燥粉末的物理表征表明，赋形剂的性质不影响喷雾干燥粉末的总体粒径或形态，如SEM图像所示(图4)。之前在类似的干燥实验中已经报道了颗粒的塌陷形状，其随制剂组成以及喷雾干燥参数(如温度、气体流速和进料速率)而变化(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。
控制喷雾干燥条件对于在整个操作期间维持蛋白质稳定性以及进一步加工非常重要。我们的喷雾干燥Fab2的稳定性似乎不受干燥条件以及赋形剂的性质或不存在的影响。此外，由于干燥是快速的溶剂蒸发和液滴形成方法，因此具有适量的赋形剂对于具有单一Tg值的同质蛋白质-赋形剂固相基质至关重要。因为分散特性与纯赋形剂的Tg以及产品的最终相对湿度(RH)有关(Jang,JW等人,PDA J Pharm Sci Technol,1995,49(4):166-74)。赋形剂的类型影响喷雾干燥蛋白质粉末的Tg。与此同时，粉末的Tg与纯赋形剂的Tg相对应(图1)，并且赋形剂的Tg越大，则总体赋形剂-蛋白质制剂的Tg越高。因此，海藻糖制剂的Tg(79℃)高于AS-HF(67℃)和AS-LF制剂(59℃)。由于所有喷雾干燥制剂是在类似的RH条件下进行加工的，因此水分的影响应当是微乎其微的。
先前的研究已经表明，已知Fab2在不存在赋形剂的情况下在90℃受应激时经历聚集和化学降解(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。在存在AS-LF或AS-HF的情况下，已确认Fab2在暴露于90℃和37℃时以粉末形式稳定，提供与海藻糖类似的抗聚集保护作用(图5A和5B)。然而，HPMCAS的存在不抑制固态制剂中焦谷氨酸的形成(图6A至6D)。由于赋形剂的性质将决定保护抗体所需的合适的赋形剂载量(Costantino,HR等人,JPharm Sci,1998,87(11):1412-20)，因此进一步优化赋形剂载量以考察HPMCAS所提供的最大保护是必要的。然而，HPMCAS作为聚合物赋形剂在PLGA杆状物在高湿度条件下储存时以及在药物释放期间优先保护抗体方面可能优于小分子赋形剂海藻糖，因为它具有较慢的整体流动性(Mensink,MA等人,Eur J Pharm Biopharm,2017,114:288-295)。目前的研究已经确认，在赋形剂与蛋白质的质量比为1.0时，HPMCAS赋形剂在释放条件下为PLGA杆状物内的Fab2提供了优异的保护作用。
良好的赋形剂对蛋白质的固态稳定作用可基于以下因素来解释：其玻璃化转变、水置换趋势及其化学稳定性(Colaco,CJ等人,Science,1995,268(5212):788)。在干燥状态下，选择的赋形剂应能够通过优先排除水分子以防止蛋白质变性。一种此类赋形剂选择为海藻糖，其为干燥状态下的蛋白质提供最大的氢键形成保护作用(Allison,SD等人,ArchBiochem Biophys,1999,365(2):289-98)。因此，水分子的置换以及通过氢键形成的直接的蛋白质-赋形剂相互作用是在固体制剂中保持蛋白质处于折叠状态的基准。在我们先前的研究中，已确定在赋形剂与蛋白质质量比为1.0时，海藻糖饱和浓度为Fab2提供最大保护(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。在当前的赋形剂与蛋白质质量比1.0下，HPMCAS赋形剂的摩尔数远低于海藻糖的摩尔数。据报道，聚合物糖与蛋白质的氢键不同于二糖(Allison,SD等人,Arch Biochem Biophys,1999,365(2):289-98)。尽管考察Fab2与HPMCAS之间的氢键形成相互作用的强度超出当前的范围，但HPMCAS似乎与海藻糖相似，为避免Fab2在37℃和90℃聚集提供等效保护(图5A和5B)。有必要进行进一步研究以确定Fab2稳定性对HPMCAS的浓度依赖性。
本文提供的数据支持在高温下使用HPMCAS作为蛋白质药物的无定形固体分散体载体。在90℃，HPMCAS制剂的物理稳定性与海藻糖相当，这可能是玻璃态基质中与蛋白质的氢键形成的类型和强度的作用。HPMCAS的羟基基团可与蛋白质形成氢键，并且提高喷雾干燥固体的稳定性。这应使用存在于适当的蛋白质-聚合物混合相中的更紧密的蛋白质-赋形剂相互作用的形成来限制任何分子流动性、相分离(图9)。Al-Obaidi等人已经报道，HPMCAS作为强氢键供体，经由与药物羰基基团的氢键形成相互作用改善了疏水性药物的无定形相稳定性(Al-Obaidi,H.和G.Buckton,AAPS PharmSciTech,2009,10(4):1172-7)。此外，琥珀酸根部分的存在促进了HPMCAS与蛋白质之间额外的分子间氢键形成相互作用。琥珀酸根中的游离羧酸基团可同时用作蛋白质酰胺基团的氢键供体和受体。与此同时，具有与HPMCAS相似的甲氧基和羟基丙氧基基团但不含额外的琥珀酸根基团的Metolose将缺乏蛋白质的氢键供体和受体位点。因此，在Metolose制剂的情况下，蛋白质赋形剂相互作用将较弱。如Metolose喷雾干燥制剂的Tg(150℃)值所证明，它可能在干燥状态下作为单独的蛋白质和赋形剂相存在(图9)，由蛋白质-聚合物分层驱动。因此，喷雾干燥的Metolose具有与纯Metolose相同的Tg值(图1和图10)，不受任何蛋白质相互作用的影响。相反，蛋白质和HPMCAS的喷雾干燥分子分散体产生一种单一无定形相，其玻璃化转变与纯HPMCAS不同(表1-1和图10)。
有趣的是，海藻糖而非HPMCAS能够防止固态Fab2的化学降解(图6C和6D)。所有喷雾干燥制剂在90℃应激后，均具有增加的碱性变体，其中在含有海藻糖的制剂中形成的碱性变体最少(图6A和6B)。先前已经在Fab2的情况下报道了这一结果，因为它容易发生依赖于加热的脱水/异构化，从而导致降低的化学稳定性(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。值得注意的是，与含有海藻糖的制剂相比，HPMCAS制剂中的琥珀酰亚胺和焦谷氨酸形成更多。焦谷氨酸是蛋白质上N末端谷氨酸环化的产物。正如我们先前研究中所假设的，海藻糖的供体羟基基团与Fab2的受体N末端氨基之间的氢键形成相互作用能够抑制焦谷氨酸形成(Rajagopal,K等人,Mol Pharm,2019.16(1):349-358)。出人意料地，在HPMCAS的情况下似乎不存在类似的胺-羟基相互作用，导致在90℃和37℃应激持续期间焦谷氨酸物质增加。另外，包含蛋白质的AS-LF和AS-HF喷雾干燥制剂的玻璃化转变温度略低于海藻糖喷雾干燥蛋白质的玻璃化转变温度。因此，HPMCAS制剂中的迁移率可能略高，限制OH基团与N末端胺Fab基团的氢键形成相互作用。不受理论的约束，可能存在比海藻糖远远过量的HPMCAS赋形剂(以1:1w/w赋形剂与Fab载量的比率)，因此在喷雾干燥HPMCAS粉末的情况下，未与蛋白质结合的过量赋形剂可能导致不稳定，并且可能导致玻璃化转变温度较低。
目前的数据表明，将HPMCAS加入水性介质中时，其能够抵抗pH约5左右的pH变化(图7A)。在中性状态下(当pH＝7时)，由于其琥珀酸根基团(pKa约5)的去质子化状态，其为可溶的，形成稳定的聚合物胶体。由于在中性至碱性pH下形成琥珀酸根阴离子，因此HPMCAS上的净负电荷防止聚合物链彼此相互作用。随着HPMCAS浓度的增加，达到形成胶体的最大容量后，聚合物链开始聚集。随着琥珀酸根基团向非电离质子化为主的状态转变，系统的pH逐渐降低(pH≤4)，并且最终沉淀析出。HPMCAS链的此类pH驱动的去质子和质子化现象是可逆的。此外，当pH在琥珀酸根的pKa左右时，HPMCAS/水混合物用作缓冲剂，吸收引入水性混合物中的任何过量质子。这种缓冲能力在使用纯原材料和HPMCAS喷雾干燥蛋白质粉末的滴定研究中得到证明(图7A和7B)。利用HPMCAS的这一独特的理化特性，已经配制得到稳定的药物-聚合物胶体(当电离时)和喷雾干燥药物分散体(当未电离时)(Friesen,DT等人,MolPharm,2008,5(6):1003-19)。在添加pH 5.5的Fab2储备液进行喷雾干燥期间，HPMCAS/水混合物(pH约6.5)未显示pH变化。表明来自Fab2溶液的盐酸质子被赋形剂中存在的琥珀酸根阴离子中和，从而用作缓冲剂。
许多出版物已经指出，由于聚合物作为沉淀抑制剂的优势，HPMCAS能够维持药物在溶液状态下的过饱和性，形成稳定的药物/聚合物胶体溶液。Friesen等人已经报道，由HPMCAS制成的喷雾干燥药物分散体在水溶解后出现胶体状态，其稀释后溶解以形成游离药物和聚合物链(Friesen,DT等人,Mol Pharm,2008,5(6):1003-19)。该胶体状态本质上为无定形的，并且对于维持药物在生理条件下的溶解度非常重要。本发明包括在将HPMCAS喷雾干燥Fab2暴露于水后以及从PLGA杆状物释放药物期间形成类似的HPMCAS和Fab2的胶体溶液(图3)。同时快速形成胶体的pH应与喷雾干燥前储备液的pH相同，后者由于HPMCAS储备液(pH 6.5)与Fab2储备液(pH 5.5)的混合而本身处于高能胶体状态。这应高于琥珀酸根基团的酸离解常数，导致HPMCAS链电离。此类由带有Fab2的电离HPMCAS链组成的系统用作静电组装体，应能够中和外加的质子，并且用作抗pH变化的缓冲剂。为证明HPMCAS的此类特性，本发明的实例示出可能暴露于来自PLGA杆状物植入物的水解的酸性质子时释放的稳定蛋白质。
在制备载有蛋白质的聚合物杆状物时，赋形剂的适当组合对于耐受热熔挤出法的高温处理条件以及PLGA水解产生的酸性降解产物是必要的(Rajagopal,K等人,J PharmSci,2013,102(8):2655-66；Zhu,G和SP Schwendeman,Pharm Res,2000,17(3):351-7)。一般而言，有效维持固态稳定性以及抗pH变化的相同赋形剂还促进Fab2在体外释放期间的稳定性。重要的是，目前的结果表明，与不存在任何赋形剂或含有海藻糖的制剂相比，HPMCAS赋形剂为避免Fab2在PLGA植入杆状物内聚集提供更好的保护。先前已经报道了显示无机碱性添加剂在保护由PLGA植入物递送的蛋白质方面的作用的类似结果(Zhu,G和SPSchwendeman,Pharm Res,2000,17(3):351-7)。这进一步证明，HPMCAS赋形剂可以限制由PLGA水解产物中出现的酸性微气候所引起的非共价蛋白质聚集。
换句话说，具有能够中和PLGA系统中的酸性降解物的化学成分(如醋酸根和琥珀酸根)的聚合物赋形剂有助于稳定的药物释放。酸性水解产物与Fab2之间可能的相互作用似乎在3周内减弱，但需要研究在HPMCAS存在下杆状物环境内长期储存的影响。
实例2.羟丙基甲基纤维素衍生物使固态单克隆抗体稳定并且抗水相中的pH变化
评估羟丙基甲基纤维素(HPMC或羟丙甲纤维素)的醋酸根和琥珀酸根衍生物在PLGA杆状物的情境下使三种全长单克隆抗体(MAb)稳定的效用。考察了两种不同的HPMC衍生物；一种包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(称为AS-LF)，另一种包含约12％醋酸根和7％琥珀酸根(称为AS-HF)。用于测试MAb制剂的材料与方法如用于测试Fab2制剂的实例1中所述，但以下所述的针对MAb制剂特有的材料与方法除外。
材料与方法
材料。MAb1、MAb2和MAb3获自基因泰克(South San Francisco,CA)。MAb1是与HER2反应的重组人源化IgG1κ抗体。MAb2是与VEGF-A反应的重组人源化IgG1κ抗体。MAb3是与IgE反应的重组人源化IgG1κ抗体。
体积排阻色谱(SEC)。对于MAb1、MAb2和MAb3，使用配备TOSOH TSKgel G3000SWXL(7.8×300mm内径，5μm粒径)柱的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行体积排阻色谱(SEC)HPLC分析。在25℃在等度模式下使用0.20M K3PO4和0.25M KCl(pH6.2)作为流动相(流速为0.5mL/min)分析样品。进样浓度为1mg/mL的20μL样品，并且总运行时间为30min。使用280nm处的吸光度进行检测。通过将各组在各时间点处的峰面积除以总峰面积来计算百分比峰面积。
离子交换色谱(IEC)。对于MAb1，使用配备ThermoScientific/Dionex(SantaClara,CA)ProPac WCX-10分析型(4×250mm)弱阳离子交换柱和二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行离子交换色谱(IEC)HPLC分析。流动相A(溶剂A)为10mM磷酸钠缓冲剂，pH 7.5，并且流动相B(溶剂B)为100mM溶于溶剂A中的氯化钠。分析前，将样品用溶剂A稀释至约1mg/mL，并且以0.5mL/min的流速进样20μL样品。采用从0min时的85％溶剂A开始到45min时的0％溶剂A的线性梯度，在总共约60min的运行时间内分离MAb1电荷变体。利用214nm处的吸光度进行检测。将IEC峰分离为主峰、酸性峰和碱性峰。
对于MAb2，使用配备ThermoScientific/Dionex(Santa Clara,CA)ProPac WCX-10分析型(4×250mm)弱阳离子交换柱和二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行离子交换色谱(IEC)HPLC分析。流动相A(溶剂A)为20mMACES缓冲剂，pH 6.5，并且流动相B(溶剂B)为200mM溶于溶剂A中的氯化钠。分析前，将样品用溶剂A稀释至约1mg/mL，并且以0.5mL/min的流速进样20μL样品。采用从0min时的70％溶剂A开始到50min时的0％溶剂A的线性梯度，在总共约90分钟的运行时间内分离MAb2电荷变体。利用280nm处的吸光度进行检测。将IEC峰分离为主峰、酸性峰和碱性峰。
对于MAb3，使用配备ThermoScientific/Dionex(Santa Clara,CA)ProPac WCX-10分析型(4×250mm)弱阳离子交换柱和二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200系列HPLC系统(Santa Clara,CA)进行离子交换色谱(IEC)HPLC分析。流动相A(溶剂A)为20mM MES缓冲剂，pH 6.1，并且流动相B(溶剂B)为100mM溶于溶剂A中的氯化钠。分析前，将样品用溶剂A稀释至约1mg/mL，并且以0.8mL/min的流速进样20μL样品。采用从0min时的50％溶剂A开始到60min时的0％溶剂A的线性梯度，在总共约90分钟的运行时间内分离MAb3电荷变体。利用280nm处的吸光度进行检测。将IEC峰分离为主峰、酸性峰和碱性峰。
对包含三种全长MAb的喷雾干燥制剂中的HPMCAS赋形剂与海藻糖、Metolose和不含赋形剂的制剂在90℃持续数小时以及在37℃持续若干周的性能进行比较。选择90℃的温度以指导用于高温处理(诸如在用于药物递送的PLGA聚合物杆状物的制备中使用的热熔挤出)的喷雾干燥制剂的相容性。评定37℃下的稳定性，以提供可适用于储存在2℃至8℃的制剂之间有意义的相对稳定性。此外，37℃还模拟体温，并且记录蛋白质药物暴露于包含PLGA杆状物的持续递送系统中长期停留期间所经历的生理温度的影响。三种MAb中的两种(MAb1和MAb2)作为E/P质量比为1/1的喷雾干燥粉末，是通过热熔挤出法包封在PLGA圆柱形杆状物中。随后在生理条件下在37℃研究在HPMCAS赋形剂和海藻糖存在下配制时PLGA杆状物内的MAb稳定性，持续若干周。为表征包封在PLGA杆状物中的蛋白质稳定性，对从杆状物中提取的MAb的聚集或化学降解进行考察。尽管与在人体内可水解的海藻糖不同，HPMCAS为不可生物降解的，因此在肠胃外递送方面的应用受到限制。
结果
MAb的喷雾干燥制剂。制备各mAb含量为5mg/mL或10mg/mL的13种制剂，并且评估喷雾干燥后的稳定性。所有13种制剂均在10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20中配制。其中一种制剂仅具有10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20，不包含任何糖或HPMCAS(对照制剂)。包含HPMCAS赋形剂的制剂是在pH 6.0±0.5的10mM His-HCl/His缓冲剂和0.01％w/v聚山梨醇酯20中配制的。包含MAb的喷雾干燥AS-LF和AS-HF制剂的制备如针对Fab2的图3所示意性地示出。各制剂中海藻糖、Metolose、AS-LF和AS-HF赋形剂与蛋白质的质量比为1:1、1:4和4:1(w/w)。然而，赋形剂与蛋白质的摩尔比因赋形剂分子质量的不同而不同，并且范围在0.3至1752.9之间，具体取决于制剂。如针对MAb1的表2-1以及针对MAb2的表2-2中所示，所有制剂的pH均在液态喷雾干燥之前以及通过复溶于水中进行喷雾干燥之后进行测量。pH测量结果相似，指示几乎不存在因喷雾干燥导致的电离状态变化。
喷雾干燥MAb的特性。喷雾干燥后的所有13种制剂均得到微米级颗粒，所述颗粒具有相似的颗粒形态，范围从球形到坍塌球形。在不同的赋形剂制剂中，含有MAb1的颗粒的直径范围为3.8微米至10.0微米。在不同的赋形剂制剂中，含有MAb2的颗粒的直径范围为4.4微米至11.2微米。将所有喷雾干燥粉末均复溶于水中，并且使用体积排阻色谱(SEC)分析聚集，并且使用离子交换色谱(IEC)分析化学降解。对于包含AS-LF和AS-HF的制剂，在分析MAb之前遵循分离方案。喷雾干燥后所有制剂的SEC单体含量相似，并且与喷雾干燥前的MAb制剂相当(表2-1和表2-2)。
HPMCAS对MAb固态稳定性的影响。喷雾干燥制剂中的MAb的稳定性在90℃测试数小时(参见图11、图13和图19)，并且在37℃测试数周(图12、图14和图20)。在不含赋形剂的MAb制剂(对照)的情况下观察到最大水平的聚集，其次为储存在90℃时含有Metolose的MAb制剂，以及储存在37℃的MAb3的情况。
表2-1.针对稳定性研究评估的喷雾干燥MAb1制剂的详细信息
1使用不包含赋形剂的MAb1制剂的一个样品(即对照)分析E/P＝1/1、E/P＝1/4和E/P＝4/1条件。
2喷雾干燥后的pH是在将1％固体溶于水中后测量的。
表2-2.针对稳定性研究评估的喷雾干燥MAb2制剂的详细信息
1在针对E/P＝1/1和E/P＝1/4条件的SEC和IEC分析中使用不包含赋形剂的MAb2制剂的一个样品(即对照)，并且在针对E/P＝4/1条件的SEC和IEC分析中使用单独的样品。
2喷雾干燥后的pH是在将1％固体溶于水中后测量的。
当储存在90℃时，AS赋形剂和海藻糖为MAb1提供相似水平的聚集保护，在E/P＝4制剂中观察到最高水平的保护。相比之下，不含醋酸根和琥珀酸根基团的Metolose不保护MAb1免于聚集。
此外，当储存在90℃时，AS赋形剂和海藻糖为MAb2提供相似水平的聚集保护，在E/P＝4制剂中观察到最高水平的保护。相比之下，不含醋酸根和琥珀酸根基团的Metolose为MAb2提供的聚集保护作用较小。
此外，当储存在90℃时，AS赋形剂和海藻糖为MAb3提供相似水平的聚集保护，在E/P＝1/4制剂中观察到最高水平的保护。相比之下，不含醋酸根和琥珀酸根基团的Metolose几乎不保护MAb3免于聚集。
HPMCAS赋形剂的缓冲容量。为考察HPMCAS赋形剂在PLGA装置的酸性微气候内的中和作用，在用强盐酸对HPMCAS喷雾干燥粉末制剂进行酸滴定时监测pH的变化(图15和图16)。HPMCAS赋形剂在喷雾干燥MAb粉末中的存在于约pH 5至pH 6条件下抵抗酸添加引起的pH变化。与不含HPMCAS赋形剂的喷雾干燥蛋白质粉末相比，在海藻糖和缺乏赋形剂的对照制剂的情况下，仅加入1mM酸时，pH值即显著下降(从pH 5.5降至2.5)。类似地，在结构上与HPMCAS相同但不包含醋酸根和琥珀酸根官能团的Metolose的情况下，未见缓冲能力。重要的是，有趣地发现，与在具有高E/P比的制剂中不含HPMCAS的制剂相比，含有HPMCAS的喷雾干燥蛋白质制剂产生类似的pH变化所需的酸的等效量大得多。
体外释放期间包封在PLGA植入物中的MAb的稳定。为考察赋形剂对PLGA植入物内蛋白质稳定性的影响，将包含海藻糖、AS-LF、AS-HF并且不含任何赋形剂的MAb喷雾干燥制剂包封在1mg PLGA圆柱形杆状物中，用于研究药物释放和PLGA植入物降解。分析从37℃在PBSTN中储存若干周的载药PLGA杆状物中回收的MAb的单体稳定性(图17和图18)。含有海藻糖的PLGA杆状物在4周后具有显著降低的单体含量。对于两种HPMCAS赋形剂制剂，观察到的MAb1和MAb2聚集体少得多。

Claims (52)

1.一种制剂，其包含多肽和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述HPMCAS包含约8％至约12％的醋酸根和约7％至约15％的琥珀酸根。
3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述HPMCAS包含约8％醋酸根和约15％琥珀酸根(HPMCAS-LF)或约12％醋酸根和约7％琥珀酸根(HPMCAS-HF)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述HPMCAS与蛋白质的比率为约4:1(mg/mg)至约1:4(mg/mg)，任选地其中所述比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含组氨酸缓冲剂。
6.根据权利要求5所述的制剂，其中所述组氨酸缓冲剂为组氨酸HCl缓冲剂。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的制剂，其中所述制剂中的所述组氨酸缓冲剂的浓度为约5mM至约20mM，任选地其中所述制剂中的所述组氨酸缓冲剂的浓度为约10mM。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含聚山梨醇酯。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20。
10.根据权利要求8或9所述的制剂，其中所述制剂中的所述聚山梨醇酯的浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述聚山梨醇酯的浓度为约0.01％(w/v)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述制剂的pH为约5.5至约7.0。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的制剂，其中所述制剂的pH为约6.5。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的制剂，其中所述多肽为抗体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述多肽为单克隆抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的制剂，其中所述多肽为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的制剂，其中所述抗体为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段，任选地其中所述抗体片段为(Fab')2片段。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述多肽的浓度为约5mg/mL至约100mg/mL。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的制剂，其中所述制剂中的所述多肽的浓度为约10mg/mL。
20.一种制剂，其包含：
浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体，
HPMCAS-LF，其中所述制剂中的所述HPMCAS-LF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中所述制剂的pH为约5.5至约7.0。
21.一种制剂，其包含：
浓度为约10mg/mL的抗体，
HPMCAS-LF，其中所述制剂中的所述HPMCAS-LF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，
浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中所述制剂的pH为约6.5。
22.一种制剂，其包含：
浓度为约5mg/mL至约50mg/mL的抗体，
HPMCAS-HF，其中所述制剂中的所述HPMCAS-HF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，浓度为约5mM至约20mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.005％(w/v)至约0.5％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中所述制剂的pH为约5.5至约7.0。
23.一种制剂，其包含：
浓度为约10mg/mL的抗体，
HPMCAS-HF，其中所述制剂中的所述HPMCAS-HF与抗体的比率为约4:1(mg/mg)、约1:1(mg/mg)或约1:4(mg/mg)，浓度为约10mM的组氨酸HCl缓冲剂，
浓度为约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯20，并且
其中所述制剂的pH为约6.5。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的制剂，其中所述抗体为单克隆抗体。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的制剂，其中所述抗体为人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的制剂，其中所述抗体为选自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段的抗体片段，任选地其中所述抗体片段为(Fab')2片段。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的制剂，其中所述制剂经喷雾干燥以形成多肽或抗体的喷雾干燥制剂。
28.根据权利要求27所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中所述制剂中的所述多肽或抗体在约90℃稳定至少约5小时和/或在约37℃稳定至少约4周。
29.根据权利要求27或28所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中所述制剂中的所述多肽或抗体表现出减少的聚集和/或减少的化学降解。
30.根据权利要求29所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中所述减少的化学降解包括减少的所述多肽的琥珀酰亚胺变体的形成和/或减少的所述多肽的焦谷氨酸变体的形成。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中所述制剂为无定形玻璃态制剂。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的所述喷雾干燥制剂被包封在产生酸性微气候的聚合物系统中。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的所述喷雾干燥制剂被包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的所述喷雾干燥制剂被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)中。
35.根据权利要求27至33中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂，其中多肽或抗体的所述喷雾干燥制剂被包封在PLGA杆状物中。
36.一种组合物，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的制剂。
37.一种组合物，其包含根据权利要求27至35中任一项所述的多肽或抗体的喷雾干燥制剂。
38.一种组合物，其包含含有根据权利要求1至27中任一项所述的制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。
39.一种组合物，其包含含有根据权利要求27至35中任一项所述的喷雾干燥制剂的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的组合物，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA杆状物。
42.一种制备喷雾干燥多肽的方法，所述方法包括制备根据权利要求1至19中任一项所述的制剂，以及使所述制剂经受喷雾干燥。
43.一种制备喷雾干燥抗体的方法，所述方法包括制备根据权利要求20至26中任一项所述的制剂，以及使所述制剂经受喷雾干燥。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中使用包括入口和出口的喷雾干燥器进行所述喷雾干燥。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述入口具有约90℃至约120℃、约100℃或约110℃的温度。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述出口具有约60℃的温度。
47.一种制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求1至26中任一项所述的制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
48.一种制备包含多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求27至30中任一项所述的喷雾干燥制剂包封在乳酸/乙醇酸聚合物系统中。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述乳酸/乙醇酸聚合物颗粒为PLGA颗粒。
50.一种制品，其包括根据权利要求1至27中任一项所述的制剂、根据权利要求28至35中任一项所述的喷雾干燥制剂或根据权利要求36至41中任一项所述的组合物。
51.一种制品，其包括通过根据权利要求42至46中任一项所述的方法制备的喷雾干燥制剂。
52.一种制品，其包括通过根据权利要求47至49中任一项所述的方法制备的包封多肽的乳酸/乙醇酸聚合物颗粒。
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