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CN119371541A - 一种靶向ror1的结合分子及其应用 - Google Patents

一种靶向ror1的结合分子及其应用 Download PDF

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CN119371541A
CN119371541A CN202411830726.8A CN202411830726A CN119371541A CN 119371541 A CN119371541 A CN 119371541A CN 202411830726 A CN202411830726 A CN 202411830726A CN 119371541 A CN119371541 A CN 119371541A
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CN
China
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seq
amino acid
acid sequence
antibody
variable region
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Application number
CN202411830726.8A
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徐培芳
刘婵娟
郎国竣
林晨
束庆玉
刘东舟
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Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本申请涉及特异性识别ROR1的抗体，其制备方法和用途。本申请还涉及靶向ROR1的抗体偶联药物(ADC)以及含有该分子的组合物。此外，本发明还涉及这些抗体、抗体片段以及抗体偶联药物的治疗和诊断用途。

Description

一种靶向ROR1的结合分子及其应用
本申请是申请日为2023年03月03日，发明名称为“一种靶向ROR1的结合分子及其应用”的中国申请202380025939.0的分案申请。
技术领域
本申请涉及特异性识别ROR1的抗体，其制备方法和用途。此外，本申请还涉及靶向ROR1的抗体偶联药物(ADC)以及含有该分子的组合物。此外，本发明还涉及这些抗体、抗体片段以及抗体偶联药物的治疗和诊断用途。
背景技术
抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugates，ADC)是传统抗体药物的衍生药物，由靶向特异性抗原的单克隆抗体药物和小分子细胞毒药物通过连接子偶联而成，兼具抗体药物的特异靶向性和传统小分子药物的杀伤效应，其主要的适应症为恶性肿瘤。ADC凭借其优异的肿瘤杀伤效应，迅速成为抗肿瘤药物研发的热点。但ADC的毒性通常较高，因此对于靶点抗原的特异性要求较高，适合开发ADC的靶点一般是在肿瘤中高表达，在健康组织中低表达或者几乎不表达；抗原为肿瘤细胞表达上调的表面受体，能够促进肿瘤生长或生存，并且该靶点抗原应具有内化特性。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphanreceptor 1，ROR1，也被称为受体相关的神经营养性酪氨酸激酶1，NTRKR1)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)是隶属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族的单次跨膜蛋白，其胞外由一个免疫球蛋白样结构域(Ig)和两个富含半胱氨酸的结构域(FZD结构域和KRD结构域)组成，胞内由一个酪氨酸激酶结构域、两个富含丝氨酸或苏氨酸的结构域和一个富含脯氨酸的结构域组成。ROR1和ROR2通过FZD结构域结合配体Wnt5a参与非经典Wnt信号通路(Oishi I,Suzuki H,Onishi N,Takada R,Kani S,Ohkawara B,Koshida I,Suzuki K,Yamada G,Schwabe GC et al(2003).GenesCells 8:645–654；Fukuda T,Chen L,Endo T,Tang L,Lu D,Castro JE,Widhopf GF II,Rassenti LZ,Cantwell MJ,Prussak CE et al(2008).Proc Natl Acad Sci USA 105:3047–3052；Paganoni S,Bernstein J,Ferreira A (2010).Neuroscience 165:1261–1274)。ROR1能抑制细胞凋亡，增强EGFR信号传导，诱导上皮间质转化(EMT)(Fukuda T,ChenL,Endo T,Tang L,Lu D,Castro JE,Widhopf GF II,Rassenti LZ,Cantwell MJ,PrussakCE et al(2008).Proc Natl Acad Sci USA 105:3047–3052；Yamaguchi T,Yanagisawa K,Sugiyama R,Hosono Y,Shimada Y,ArimaC,KatoS,TomidaS,Suzuki M,OsadaHet al(2012).Cancer Cell 21:348–361；Cui B,Zhang S,Chen L,Yu J,Widhopf GF,Fecteau J-F,Rassenti LZ,Kipps TJ(2013).Cancer Res 73:3649–3660)。
ROR1是保守的胚胎蛋白，随着胚胎发育其表达逐渐下降，在成人大多数组织中几乎不存在或低表达，而越来越多的文献发现ROR1在多种癌细胞中表达，比如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和其他血液恶性肿瘤、肾细胞癌、结肠癌和乳癌的某些其他癌细胞系。此外，ROR1在许多血液和实体恶性肿瘤的进展中起着重要作用。因此，作为癌症标志物，ROR1成为癌症治疗的理想药物靶点。
虽然现有技术公开了几款针对ROR1的抗体药物，但是作为泛癌种的肿瘤标志物，仍然迫切需要开发高质量的抗ROR1抗体，其可以用作开发表达ROR1的癌症的基于抗体的靶向疗法的基础，还可以用作诊断工具以检测ROR1相关病症中的ROR1表达。此外，基于ADC在肿瘤治疗领域展现出的良好前景，目前依然迫切需要具有有效治疗作用的包含ROR1的ADC，本发明满足了这些需求。
发明内容
第一方面，本发明提供了靶向ROR1的抗体、其具有以下优点：
(1)高亲和力结合ROR1、结合表达ROR1的靶细胞；
(2)能够通过内吞作用进入细胞；
(3)适合构建有效治疗的抗体偶联药物。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含：
1)如SEQ ID NO:57所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:56所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
2)如SEQ ID NO:55所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:54所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
3)如SEQ ID NO:59所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:58所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
4)如SEQ ID NO:61所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:60所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
5)如SEQ ID NO:63所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:62所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
6)如SEQ ID NO:65所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:64所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
7)如SEQ ID NO:67所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:66所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
8)如SEQ ID NO:68所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:66所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
9)如SEQ ID NO:70所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:69所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
10)如SEQ ID NO:72所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:71所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
11)如SEQ ID NO:74所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:73所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
12)如SEQ ID NO:75所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:79所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
13)如SEQ ID NO:76所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:81所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
14)如SEQ ID NO:77所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:82所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
15)如SEQ ID NO:78所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:80所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
16)如SEQ ID NO:78所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:81所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；
17)如SEQ ID NO:78所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:82所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)；或
18)如SEQ ID NO:84所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:89所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
一个实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含：
1)包含如SEQ ID NO:1、2和3所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:28、29和30所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
2)包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:31、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
3)包含如SEQ ID NO:7、8和9所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:34、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
4)包含如SEQ ID NO:10、11和12所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:35、32和36所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
5)包含如SEQ ID NO:4、13和14所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:35、32和37所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
6)包含如SEQ ID NO:15、16和17所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:38、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
7)包含如SEQ ID NO:18、8和19所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:31、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
8)包含如SEQ ID NO:20、21和12所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:31、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
9)包含如SEQ ID NO:22、23和24所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:39、40和41所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
10)包含如SEQ ID NO:4、25和26所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:35、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
11)包含如SEQ ID NO:18、25和27所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:35、32和33所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
12)包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:31、45和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
13)包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:43、46和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
14)包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:44、47和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
15)包含如SEQ ID NO:4、42和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:31、45和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
16)包含如SEQ ID NO:4、42和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:43、46和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
17)包含如SEQ ID NO:4、42和6所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:44、47和48所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
18)包含如SEQ ID NO:1、2和3所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:49、50和30所示序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过3个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中：
1)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：57所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：57组成；
2)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：55所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：55的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：55组成；
3)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：59所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：59组成；
4)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：61所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：61组成；
5)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：63组成；
6)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：65所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：65组成；
7)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：67所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：67组成；
8)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：68所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：68组成；
9)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：70所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：70的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：70组成；
10)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：72所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：72组成；
11)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：74所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：74组成；
12)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：83所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：83的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：83组成；
13)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：84组成；
14)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：85所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：85组成；
15)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：75所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：75组成；
16)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：76组成；
17)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：77组成；或
18)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：78组成。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中：
1)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：56所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：56组成；
2)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：54所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：54组成；
3)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：58所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：58的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：58组成；
4)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：60组成；
5)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：62组成；
6)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：64所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：64的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：64组成；
7)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：66组成；
8)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：69所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：69组成；
9)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：71所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：71组成；
10)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：73所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：73组成；
11)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：79所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：79组成；
12)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：80组成；
13)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：81组成；
14)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：82所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：82组成；
15)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：86所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：86组成；
16)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：87所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：87组成；
17)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：88所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：88组成；或
18)所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：89所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：89的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：89组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
1)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：57所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：57组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：56所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：56组成；
2)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：55所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：55的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：55组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：54所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：54组成；
3)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：59所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：59组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：58所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：58的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：58组成；
4)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：61所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：61组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：60组成；
5)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：63组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：62的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：62组成；
6)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：65所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：65组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：64所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：64的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：64组成；
7)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：67所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：67组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：66组成；
8)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：68所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：68的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：68组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：66组成；
9)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：70所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：70的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：70组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：69所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：69的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：69组成；
10)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：72所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：72组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：71所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：71组成；
11)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：74所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：74组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：73所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：73组成；
12)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：75所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：75组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：79所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：79组成；
13)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：76组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：80组成；
14)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：76组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：81组成；
15)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：77组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：80组成；
16)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：77组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：81组成；
17)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：77组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：82所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：82组成；
18)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：78组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：80组成；
19)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：78组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：81组成；
20)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：78组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：82所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：82组成；
21)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：83所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：83的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：83组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：86所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：86的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：86组成；
22)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：83所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：83的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：83组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：87所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：87组成；
23)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：84组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：87所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：87组成；
24)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：84组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：88所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：88组成；
25)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：84组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：89所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：89的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：89组成；
26)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：85所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：85组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：87所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：87组成；
27)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：85所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：85组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：88所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：88组成；或
28)所述重链可变区包含如SEQ ID NO：85所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：85组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：89所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：89的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：89组成。
在一些实施方案中，上述抗体或其抗原结合片段还包含来自人抗体胚系共有序列的重链和/或轻链恒定区序列。所述的轻链恒定区优选是人源的κ或λ链恒定区。重链恒定区可以是γ、μ、α、δ、或ε链，在一些实施方案中，所述的重链恒定区优选来自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区序列。在一个实施方案中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：53所示的序列，或者由所述序列组成。在另一个实施方案中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：52所示的序列。
应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体，例如包含一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸位点是应Kabat等人的(1991)EU索引系统标识。
在一个具体实施方案中，本发明提供了特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中：
1)所述重链包含如SEQ ID NO：93所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：93组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：92所示氨基酸序列，或与SEQ IDNO：92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：92组成；
2)所述重链包含如SEQ ID NO：91所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：91的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：91组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：90所示氨基酸序列，或与SEQ IDNO：90的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：90组成；
3)所述重链包含如SEQ ID NO：95所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：95的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：95组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：94所示氨基酸序列，或与SEQ IDNO：94的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：94组成；
4)所述重链包含如SEQ ID NO：97所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：97组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：96所示氨基酸序列，或与SEQ IDNO：96的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：96组成；
5)所述重链包含如SEQ ID NO：99所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：99组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：98所示氨基酸序列，或与SEQ IDNO：98的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：98组成；
6)所述重链包含如SEQ ID NO：101所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：101组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：100所示氨基酸序列，或与SEQID NO：100的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：100组成；
7)所述重链包含如SEQ ID NO：103所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：103的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：103组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：102所示氨基酸序列，或与SEQID NO：102的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：102组成；
8)所述重链包含如SEQ ID NO：104所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：104的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：104组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：102所示氨基酸序列，或与SEQID NO：102的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：102组成；
9)所述重链包含如SEQ ID NO：106所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：106组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：105所示氨基酸序列，或与SEQID NO：105的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：105组成；
10)所述重链包含如SEQ ID NO：108所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：108的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：108组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：107所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：107组成；
11)所述重链包含如SEQ ID NO：110所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：110的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：110组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：109所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：109组成；
12)所述重链包含如SEQ ID NO：111所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：111组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：115所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：115的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：115组成；
13)所述重链包含如SEQ ID NO：112所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：112的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：112组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：116所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：116组成；
14)所述重链包含如SEQ ID NO：112所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：112的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：112组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：117所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：117的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：117组成；
15)所述重链包含如SEQ ID NO：113所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：113组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：116所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：116组成；
16)所述重链包含如SEQ ID NO：113所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：113组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：117所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：117的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：117组成；
17)所述重链包含如SEQ ID NO：113所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：113组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：118所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：118的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：118组成；
18)所述重链包含如SEQ ID NO：114所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：114组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：116所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：116组成；
19)所述重链包含如SEQ ID NO：114所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：114组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：117所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：117的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：117组成；
20)所述重链包含如SEQ ID NO：114所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：114组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：118所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：118的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：118组成；
21)所述重链包含如SEQ ID NO：119所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：119的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：119组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：122所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：122的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：122组成；
22)所述重链包含如SEQ ID NO：119所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：119的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：119组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：123所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：123的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：123组成；
23)所述重链包含如SEQ ID NO：120所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：120组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：123所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：123的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：123组成；
24)所述重链包含如SEQ ID NO：120所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：120组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：124所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：124的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：124组成；
25)所述重链包含如SEQ ID NO：120所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：120的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：120组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：125所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：125的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：125组成；
26)所述重链包含如SEQ ID NO：121所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：121的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：121组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：123所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：123的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：123组成；
27)所述重链包含如SEQ ID NO：121所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：121的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：121组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：124所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：124的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：124组成；或
28)所述重链包含如SEQ ID NO：121所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：121的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：121组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：125所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：125的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：125组成。
在前述任一项的抗体的某些实施方案中，该抗体是单克隆的。
在前述任一项的抗体的某些实施方案中，该抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗ROR1抗体是完整抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗ROR1抗体仅涵盖其抗原结合部分，例如：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段。
第二方面，本发明提供了靶向人ROR1的抗体偶联药物，所述抗体偶联药物具有以下优点：
(1)结合表达人ROR1的靶细胞，与其具有高亲和力；
(2)能够通过内吞作用进入细胞，杀伤靶细胞；在一些实施方案中，本发明的ADC具有高内吞效率；
(3)治疗、预防、改善受试者与ROR1异常功能或表达相关的病症(例如癌症，诸如血液癌症、实体瘤)，或治疗、预防、改善所述疾病的一或多种症状；
(4)减少或抑制受试者(其具有表达ROR1的肿瘤)中肿瘤生长或进展；
(5)诱导表达ROR1的肿瘤消退(例如长期消退)；
(6)在表达ROR1的细胞中发挥细胞毒性活性；
在一个实施方案中，本申请提供了包含第一方面所述抗ROR1抗体的缀合物。在一个具体的实施方案中，可以与抗ROR1抗体缀合的分子例如是细胞毒性剂、免疫调节剂、显像剂、荧光蛋白、分子标志物、治疗性蛋白质、生物聚合物及寡核苷酸等。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体偶联药物(ADC)，其包含第一方面所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段和至少一种治疗活性物质或药物活性成分，具有Ab-(L-D)n的结构，其中：Ab为如本发明第一方面所述的结合ROR1的抗体或其抗原结合片段；L为接头；D为治疗活性物质或药物活性成分，n表示1-20的整数，例如1，2，3，4，5……。
在一个实施方案中，所述抗体偶联药物包含多个D成分，所述多个D成分可以是不同治疗活性物质或药物活性成分的组合，或者是相同治疗活性物质或药物活性成分的组合。在一个实施方案中，所述抗体偶联药物具有1-20的药物/抗体比(DAR)，例如数值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的DAR。在一个实施方案中，所述DAR为平均DAR。在一个实施方案中，平均DAR是1-15，例如1-10、2-8、2-6或3-5。在一个具体实施方案中，平均DAR为3.7。
在一个具体的实施方案中，所述治疗活性物质或药物活性成分是细胞毒素、植物毒素、小分子毒素、放射性同位素、美登木素生物碱等。在一个具体实施方案中，所述细胞毒素是海兔毒素(dolastatin)及其auristatin类衍生物，例如0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、8261(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)Dolastatin 10、Dolastatin 15、auristatin E、auristatin PE、monomethyl auristatin D(MMAD)、monomethyl auristatin E(MMAE)、monomethyl auristatin F(MMAF)、auristatin F苯二胺(AFP)、auristatin EB(AEB)、auristatin EFP(AEFP)、auristatin F羟丙基酰胺(AFHPA)。在另一个实施方案中，所述海兔毒素及其auristatin类衍生物是auristatin、多拉司他汀、MMAE、MMAF、auristatin F羟丙基酰胺或auristatin F苯二胺。
在一个实施方案中，细胞毒素以非位点特异性方式或者位点特异性方式借助接头与抗ROR1抗体或其抗原结合片段共价连接。
在一个实施方案中，所述接头选自马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基(mc-vc-PAB)、乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)、氨基PEG6-丙酰基、及马来酰亚胺己酸基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶-2-基二硫代)-丙酸酯(SPDP)。
在一个实施方案中，所述抗体偶联药物包含第一方面所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段和微管蛋白抑制剂(MMAE)。在进一步的实施方案中，MMAE通过MC-VC-PAB接头与抗ROR1抗体上半胱氨酸的巯基缀合，具有抗ROR1抗体-MC-VC-PAB-MMAE的结构。IgG1型抗体具有16对半胱氨酸残基，其中以12个链内和4个链间二硫键的形式存在。链间二硫键具有溶剂可及性，可以被还原剂还原形成八个巯基，进而成为偶联目标(McCombs J,OwenS.Antibody drug conjugates:design and selection of linker,payload andconjugation chemistry.AAPS J.2015；17:339-51)。
在一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物包含抗ROR1单克隆抗体B62-H3L3和MC-VC-PAB-MMAE，或由其组成。在进一步的实施方案中，MMAE通过MC-VC-PAB接头与B62-H3L3上半胱氨酸的巯基缀合。、
在另一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物包含抗ROR1单克隆抗体B31-H3L3和MC-VC-PAB-MMAE，或由其组成。在进一步的实施方案中，MMAE通过MC-VC-PAB接头与B31-H3L3上半胱氨酸的巯基缀合。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含(1)第一方面的抗体或其抗原结合片段或第二方面的抗体偶联药物，以及(2)可药用载体。
第四方面，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其编码第一方面所述的任一抗体或其抗原结合片段。
第五方面，本发明提供了载体，其包含第四方面的核酸分子。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。
第六方面，本发明提供了宿主细胞，其包含第五方面的载体或第四发明的核酸分子。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌。在其它实施方案中，该宿主细胞是真核的，例如HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞，或植物细胞。
第七方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中预防或治疗与ROR1异常表达相关的疾病的方法，包括向所述受试者施用预防有效量或治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段、或预防有效量或治疗有效量的本发明的抗体偶联药物、或预防有效量或治疗有效量的本发明药物组合物。
在一个实施方案中，所述与ROR1异常表达相关的疾病是高表达ROR1的癌症，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、头颈癌和黑色素瘤。在一个具体实施方案中，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。在一个具体实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，本发明的ADC分子或药物组合物还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种杀死表达ROR1的细胞或者抑制表达ROR1的细胞生长的方法，包括使所述细胞接触有效量的本发明抗体或其抗原结合片段、或有效量的本发明的抗体偶联药物、或有效量的本发明药物组合物。
第八方面，本发明提供了抗ROR1抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗癌症的抗体偶联药物中的用途。
本发明还提供了包含抗ROR1抗体或其抗原结合片段的抗体偶联药物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
附图说明
图1显示了基于FACS法测定的本申请获得的各个鼠源抗体克隆Fab结合huROR1-HEK293细胞的结合活性；图1A显示了克隆B31 Fab、B32 Fab、B34 Fab、B39 Fab、B62 Fab、B74 Fab、C38 Fab、M71 Fab和M78 Fab裂解液结合huROR1-HEK293细胞的结合活性；图1B显示了C42 Fab和C77 Fab裂解液结合huROR1-HEK293细胞的结合活性；NC表示阴性对照，MFI表示中位数荧光强度。
图2A-2L显示了本申请抗体的SEC-HPLC结果；图2A显示了B31的SEC-HPLC结果；图2B显示了B32的SEC-HPLC结果；图2C显示了B34的SEC-HPLC结果；图2D显示了B39的SEC-HPLC结果；图2E显示了B62的SEC-HPLC结果；图2F显示了B74的SEC-HPLC结果；图2G显示了C38的SEC-HPLC结果；图2H显示了M71的SEC-HPLC结果；图2I显示了M78的SEC-HPLC结果；图2J显示了C42的SEC-HPLC结果；图2K显示了C77的SEC-HPLC结果；图2L显示了99961.1的SEC-HPLC结果。
图3A-3B显示了基于ELISA法测定的本申请抗体与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图3A显示了B31、B32、B34、B39、B62和B74与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图3B显示了C38、C42、C77、M71和M78与抗原蛋白huROR1-His的结合活性。
图4A-4B显示了基于FACS法测定的本申请抗体与A549肿瘤细胞的结合活性；图4A显示了B31、B32、B34、B39、B62和B74与A549肿瘤细胞的结合活性；图4B显示了C38、C42、C77、M71和M78与A549肿瘤细胞的结合活性。
图5A-5B显示了基于FACS法测定的本申请抗体与huROR1-HEK293细胞的结合活性；图5A显示了B31、B32、B34、B39、B62和B74与huROR1-HEK293细胞的结合活性；图5B显示了C38、C42、C77、M71和M78与huROR1-HEK293细胞的结合活性。
图6A-6B显示了基于ELISA法测定的本申请抗体与抗原蛋白MusROR1-His的结合活性；图6A显示了B31、B32、B34、B39和B62与抗原蛋白MusROR1-His的结合活性；图6B显示了B74、C38、C42、C77、M71和M78与抗原蛋白MusROR1-His的结合活性。
图7A-7B显示了基于ELISA法测定的本申请抗体与抗原蛋白huROR2-His的结合活性；图7A显示了B31、B32、B34、B39和B62与抗原蛋白huROR2-His的结合活性；图7B显示了B74、C38、C42、C77、M71和M78与抗原蛋白huROR2-His的结合活性。
图8A-8B显示了基于FACS法测定的本申请抗体在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图8A显示了B62和C42在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图8B显示了B31、B32、B34、B39、B74、C38、C77、M71和M78在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率。
图9A-9F显示了基于Fab-Zap法测定的本申请抗体在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9A显示了B31和B32在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9B显示了B34和B39在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9C显示了B74和C38在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9D显示了C77和M71在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9E显示了M78在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率；图9F显示了B62和C42在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率。
图10A-10E显示了基于ELISA法测定的人源化抗体与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图10A显示了B31-H2L2、B31-H1L1和B31-H2L3与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图10B显示了B31-H3L2、B31-H3L3和B31-H3L4与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图10C显示了B31-H4L2、B31-H4L3和B31-H4L4与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图10D显示了B62-H1L1、B62-H1L2、B62-H2L2和B62-H2L3与抗原蛋白huROR1-His的结合活性；图10E显示了B62-H2L4、B62-H3L2、B62-H3L3和B62-H3L4与抗原蛋白huROR1-His的结合活性。
图11A-11B显示了基于FACS法测定的人源化抗体与A549肿瘤细胞的结合活性；图11A显示了B31-H1L1、B31-H2L2、B31-H2L3、B31-H3L2、B31-H3L3、B31-H3L4、B31-H4L2、B31-H4L3和B31-H4L4与A549肿瘤细胞的结合活性；图11B显示了B62-H1L1、B62-H1L2、B62-H2L2、B62-H2L3、B62-H2L4、B62-H3L2、B62-H3L3和B62-H3L4与A549肿瘤细胞的结合活性。
图12显示了基于Fab-Zap法测定的B31-H3L3和B62-H3L3在huROR1-HEK293细胞上的内吞效率。
图13A-13B显示了基于FACS法测定的本申请ADC与A549和HT29肿瘤细胞的结合活性；图13A显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE与A549肿瘤细胞的结合活性；图13B显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE与HT29肿瘤细胞的结合活性。
图14A-14D显示了基于MTS法检测的本申请ADC的肿瘤细胞杀伤效果；图14A显示了B31-H3L3-MMAE在A549肿瘤细胞上的杀伤效果；图14B显示了B62-H3L3-MMAE在A549肿瘤细胞上的杀伤效果；图14C显示了B31-H3L3-MMAE在HT29肿瘤细胞上的杀伤效果；图14D显示了B62-H3L3-MMAE在HT29肿瘤细胞上的杀伤效果。
图15A-15C显示了基于CCK8法测定的本申请ADC在三个肿瘤细胞Jeko-1、MDA-MB-468和NCI-H1944上的杀伤效果；图15A显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在Jeko-1细胞上的杀伤效果；图15B显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在Jeko-1细胞上的杀伤效果；图15C显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在NCI-H1944细胞上的杀伤效果。
图16显示了基于CCK8法测定的本申请ADC在huROR1-HEK293细胞上的抗原依赖杀伤效果。
图17A-17B显示了基于FACS法测定的本申请ADC在A549和HT-29肿瘤细胞上的内吞效率；图17A显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在A549肿瘤细胞上的内吞效率；图17B显示了B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在HT-29肿瘤细胞上的内吞效率。
图18A-18C显示了本申请ADC在HT-29肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图18A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化，箭头标注为给药的时间点；图18B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化；图18C显示了实验结束后不同实验组小鼠体内的肿瘤重量。
图19A-19C显示了本申请ADC在A549肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图19A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化；图19B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化；图19C显示了实验结束后不同实验组小鼠体内的肿瘤重量。
图20A-20B显示了本申请ADC在NCI-N87肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图20A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化，箭头标注为给药的时间点；图20B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化。
图21A-21B显示了本申请ADC在MDA-MB-231肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图21A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化，箭头标注为给药的时间点；图21B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化。
图22A-22B显示了本申请ADC在MDA-MB-468肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图22A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化，箭头标注为给药的时间点；图22B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化。
图23A-23B显示了本申请ADC在Jeko-1肿瘤模型的小鼠体内的抑瘤效果；图23A显示了实验周期内不同实验组小鼠体内的肿瘤体积变化，箭头标注为给药的时间点；图23B显示了实验周期内不同实验组小鼠的体重变化。
发明详述
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“ROR1”指任何重组体或天然存在形式的受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、其变体或同系物，所述变体或同系物维持ROR1活性的例如至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性。所述变体或同系物相比于天然存在的ROR1蛋白在完整序列或部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，ROR1蛋白包括Uniprot ID：Q01973的氨基酸序列。
ROR1在胚胎中高度表达，之后其表达水平在成人阶段显著下降。但是发现在多种血液癌症和实体瘤中ROR1的表达显著提高。高度表达ROR1的血液癌症包括B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)和髓系血液癌症。在实体瘤中，表达ROR1的癌症类型包括结乳腺癌、肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种癌症。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。
术语“抗ROR1抗体”是指特异性与ROR1结合的抗体分子，其能够抑制ROR1活性。相对于不存在ROR1抗体，抗ROR1抗体能够抑制ROR1活性，例如，通过至少部分地或完全地阻断ROR1的刺激，减少、预防或延迟ROR1的活化，或失活、脱敏或下调ROR1的信号转导、活性或量。在一些实施方案中，相比于对照，抗体可以抑制ROR1活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
术语“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且能够结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体(重链抗体)；和由抗体片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域足以给予抗原结合特异性。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。可变结构域中的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。在一个给定的可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(http://imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的AbM编号位置而确定。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR根据AbM编号方案确定位置。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区和CDR中的残基位置(包括重链可变区残基)时，是指根据AbM编号系统的编号位置。
“人源化抗体”是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体中的所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
术语“半数有效浓度(EC50)”是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“抗体偶联药物”或“ADC”是指以共价键偶联治疗活性物质或活性药物成分的抗体或抗体片段，从而使得治疗活性物质或活性药物成分靶向至抗体的结合靶标以表现出其药理学功能。治疗活性物质或活性药物成分可以是能够杀死ADC靶向的细胞(优选癌细胞)的细胞毒素。治疗活性物质、活性药物成分或细胞毒素的共价连接可以以非位点特异性方式利用接头进行，或者以位点特异性方式进行。
术语“位点特异性偶联”是指将治疗活性物质或活性药物成分特异性连接到抗体的特定位点的连接方式。在一个实施方式中，所述偶联借助连接子完成。
术语“细胞毒性剂”可以和“细胞毒素”互换使用，在本发明中指抑制或破坏细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。在一个实施方案中，细胞毒性剂可以包括但不限于细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素、放射性同位素、美登木素生物碱等，具体地，例如蒽环霉素(anthracycline)、喜树碱(camptothecin)、考布他汀(combretastain)、海兔毒素(dolastatin)及其auristatin类衍生物、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔(enediyne)、格尔德霉素(geldanamycin)、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体(indolino-benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯并苯二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepine dimer)、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、特吡莱辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、斯考他汀(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)及卡奇霉素(calicheamicin)。
本发明的任何抗体偶联药物均可用海兔毒素(dolastatin)及其auristatin类衍生物与抗体偶联制备。海兔毒素(dolastatin)及其auristatin类衍生物是抗体偶联药物(ADC)中使用的重要细胞毒素，其干扰微管动力学、细胞分裂等，具有抗肿瘤、抗真菌活性。其骨架的修饰已在文献中广泛报道，主要是对末端亚基：P1(N端)和P5(C端)的修饰，中央肽亚基的修饰也导致该类物质在体外具有有效的细胞毒活性。在一个方面中，海兔毒素(dolastatin)及其auristatin类衍生物例如可为0101(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、8261(2-甲基丙胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)、Dolastatin 10、Dolastatin 15、auristatin E、auristatinPE、monomethyl auristatin D(MMAD)、monomethyl auristatin E(MMAE)、monomethylauristatin F(MMAF)、auristatin F苯二胺(AFP)、auristatin EB(AEB)、auristatin EFP(AEFP)、auristatin F羟丙基酰胺(AF HPA)、及其他auristatin(例如美国公开案第20130129753号中所述的auristatin)等。
Monomethyl auristatin(MMAE)即去甲基-auristatin E，是auristatin化合物家族成员中著名的一员，其结构式如下：
MMAE通过抑制微管蛋白聚合而起到有效的有丝分裂抑制作用，因其细胞毒性而不能用作药物，但是却被广泛用以制备抗体偶联物。MMAE通过接头与单克隆抗体(MAB)偶联形成MMAE-MAB。一般而言，MMAE-MAB经抗体靶向肿瘤细胞，接头在MMAE-MAB进入肿瘤细胞后被裂解，从而释放MMAE，使其发挥细胞毒作用，杀伤肿瘤细胞。
术语“接头”和“连接子”在本申请中可以互换使用，指使抗体与ADC中的治疗活性物质或活性药物成分共价连接的化学模块。在一个实施方案中，接头可以包含将抗原与有效载荷连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸或β-氨基酸，例如β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。
根据性质分类，适用于本发明的接头可以是组织蛋白酶可降解的接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、cBu-Cit接头和CX接头；不可断裂接头例如SMCC接头或MD接头；酸敏接头、硅脂结构的接头、disulfide-carbamate接头、MC-GGFG接头、TRX接头、含半乳糖苷的接头、焦磷酸酯接头、近红外敏感的接头、紫外敏感的接头例如PC4AP。
本发明的接头还可以是一种或多种接头的组合，例如组织蛋白酶降解的接头可以与其它类型的接头组合，构成新的接头。因此，本发明所述的“接头”涵盖单个类型的接头，或不同类型接头的组合，只要其能够将本发明的抗体与药物偶联起来即可。
在具体实施方案中，接头包括但不限于马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基(mc-vc-PAB)、乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)、氨基PEG6-丙酰基、及马来酰亚胺己酸基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶-2-基二硫代)-丙酸酯(SPDP)。
术语“负载”或“药物负载”或“有效负载”是指在ADC分子内每个抗体的平均有效负载数(在本文中“有效负载”可与“治疗活性物质或活性药物成分”互换使用)。药物负载的范围可以为每个抗体1-20个治疗活性物质或活性药物成分。术语“药物/抗体比”或“DAR”是指偶联于抗体的治疗活性物质或活性药物成分(D)与抗体的比例。本文中所述ADC通常具有1-20的DAR，在某些具体实施方案中具有1-8、2-8、2-6、2-5、2-18、4-16、5-12、6-10、3-8、4-6、6-10，和2-4的DAR。代表性DAR值是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，通常表示为字母D和数字的组合，其中数字表示DAR的数值，例如D2表示DAR值为2的药物/抗体比。在一些实施方案中，DAR是平均DAR，即通过检测方法(例如通过常规方法如UV/可见光光谱法、质谱法、ELISA测定、与HPLC进行表征。也可测得定量DAR值。DAR可能受限于抗体上的连结位点数目。例如，在连结位点是半胱氨酸硫醇的情形下，抗体可能只有一或几个半胱氨酸硫醇基或可能只有一或几个具有充分反应性的硫醇基(通过此硫醇基可连结连接单元)。在一些实施方案中，本发明偶联物的平均DAR值是1至20，例如2-18、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如1.0-8.0，2.0-6.0，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0，以这些数值中的两个作为端点的范围。
术语“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“有效量”指本发明的抗体或缀合物或组合物的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。
术语“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
II.本发明组合物
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗ROR1抗体、或其ADC分子的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的抗ROR1抗体、或其ADC分子，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
本发明组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗ROR1抗体、或其ADC分子与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
III.制备本发明的抗体和抗体偶联药物
在一个实施方案中，本发明提供了制备抗ROR1抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗ROR1抗体的核酸的条件下培养包含编码抗ROR1抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述抗ROR1抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗ROR1抗体。
为了重组产生本发明的抗ROR1抗体，首先分离编码本发明抗ROR1抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明抗ROR1抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。
如本文所述制备的本发明的抗ROR1抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗ROR1抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
现有技术描述了用于将细胞毒性剂或其他治疗剂与抗体偶联的多种方法。例如，可以通过赖氨酸侧链的氨基和抗体N末端的氨基，天门冬氨酸、谷氨酸和C末端的羧基或活化的半胱氨酸巯基在抗体中进行，以使缀合反应发生。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
除非明确指明相反，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。
实施例1原材料制备及鉴定
1.1ROR1对照抗体制备及鉴定
ROR1对照抗体制备：本申请使用抗ROR1抗体Cirmtuzumab(西妥珠单抗)作为阳性对照抗体，根据WO/2019/173843公开的序列由通用生物科技股份有限公司进行目的片段的基因合成。然后通过同源重组的方法构建至真核表达载体pcDNA3.4(Invitrogen)，将构建好的重组蛋白表达载体分别转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，然后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，获得期望的表达西妥珠单抗的表达载体，克隆号为99961.1，下文将表达的西妥珠单抗简称为99961.1。通过ExpiFectamineTM CHO转染试剂盒(Thermo Fisher，A29129)将表达载体转染293细胞以表达西妥珠单抗，转染7天后，收集细胞培养物上清液，15000g离心10min，将所得上清液经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A/G亲和层析柱对上清液中的抗体进行亲和纯化。用100mM甘氨酸盐(pH 3.0)洗脱目的抗体，并将洗脱的抗体通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)换液至PBS缓冲液中。
ROR1对照抗体鉴定：用购买的huROR1-His抗原蛋白(恺佧生物，ROR-HM401)检测制备的阳性对照抗体99961.1(IgG1)的活性，具体方法如下：在96孔ELISA板上包被huROR1-His(2μg/mL、30μL/孔)，4℃包被过夜；洗板3次后，用PBS配置的5％脱脂牛奶室温封闭1小时；洗板3次后，加入用PBS梯度稀释的对照抗体99961.1室温孵育1小时；洗板后，加入PBS稀释(1：6000)的二抗Anti-human-IgG-Kappa+Lambda-HRP(Millipore，AP502P+AP506P)室温孵育1小时后，洗板6次加入TMB显色5-20min，终止显色后酶标仪OD450读取数据，处理数据Graphpad prism作图。结果显示，表达的对照抗体99961.1可以结合ROR1蛋白，具有正常的抗ROR1活性。
1.2抗原蛋白制备及鉴定
抗原蛋白制备：通过在编码基因水平的遗传操作，分别在人ROR1蛋白huROR1 ECDAA30-406(Uniprot ID：Q01973)、小鼠ROR1蛋白MusROR1 ECD AA30-406(Uniprot ID：Q9Z139)、人ROR2蛋白huROR2 ECD AA34-403(UniprotID：Q01974)的序列C端加上His标签或者人Fc(SEQ ID NO:51)标签。分别将获得的核酸序列构建至pcDNA3.4载体中，然后转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，之后利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)提取质粒。将所得到的质粒用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(GibcoTM，A14524)瞬转至HEK293细胞(CRL-1573TM)中，表达7天后，收取细胞培养物上清液，对含有Fc标签的蛋白通过COLUMN XK16/20(Cytiva)进行亲和纯化。纯化后用100mM甘氨酸盐(pH＝3.0)洗脱目的蛋白，浓缩、置换缓冲液，最后获得抗原蛋白(huROR1-huFc)。对含有His标签的蛋白用Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，SA036050)进行亲和纯化，然后用咪唑梯度洗脱目的蛋白。洗脱的各蛋白分别通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)换液至PBS缓冲液中，最后获得抗原蛋白(huROR1-His，MusROR1-His，huROR2-His)。
抗原鉴定：用实施例1.1获得的质检合格的抗体99961.1(IgG1)检测制得的抗原(huROR1-His，huROR1-huFc)。具体方法如下：分别用2μg/mL huROR1-His，huROR1-huFc包被Elisa板4℃过夜，以购买的抗原蛋白huROR1-His，huROR1-huFc(恺佧生物ROR-HM201)作为阳性对照；洗板3次后，用PBS配置的5％脱脂牛奶室温封闭1小时；洗板3次后，加入用PBS梯度稀释的抗体99961.1室温孵育1小时；洗板后，加入PBS稀释(1：6000)的二抗Anti-human-IgG-Kappa+Lambda-HRP(Millipore，AP502P+AP506P)室温孵育1小时，洗板6次然后加入TMB显色5-20min，终止显色反应，采用酶标仪OD450读取数据，处理数据Graphpad prism作图。结果显示，抗体99961.1可以以与购买的ROR1抗原蛋白相当的亲和力结合本申请发明人自行构建表达的抗原huROR1-His，huROR1-huFc。
实施例2构建及鉴定过表达人ROR1的细胞株
过表达人ROR1的HEK293细胞株(以下简称huROR1-HEK293)的构建：将全长人ROR1(Uniprot ID：Q01973)的编码核酸序列构建至pLVX-puro质粒(Clontech，Cat#632164)上。然后，将所得到的质粒通过电转仪(Invitrogen，NeonTM Transfection System，MP922947)电转化至HEK293细胞(CRL-1573TM)中。电转化后，将所得到的细胞分别转移至含有体积百分比为10％的FBS(Gibco，15140-141)且不含抗生素的DMEM培养基(Gibco，11995065)中，然后将细胞转入10×10cm细胞培养皿中培养48小时，接着以平均104个细胞/孔的密度将细胞分装至96孔细胞培养板中，加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素作为筛选压力，2周左右挑取形成克隆的细胞株进行鉴定。
huROR1-HEK293细胞的流式鉴定：将对数生长期的上述细胞株细胞消化并铺板到96孔板中，用FACS缓冲液(含体积百分比为2％的FBS的1×PBS缓冲液)清洗后，加入用PBS梯度稀释的一抗(99961.1)4℃孵育30min；清洗后，加入配制好的荧光二抗anti human IgGFc(abcam，98596)，4℃孵育30min；最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEXAOO-1-1102)进行检测。检测结果显示获得了表面高表达人ROR1的huROR1-HEK293细胞株。
实施例3动物免疫及免疫库构建
3.1免疫方案
采用huROR1-huFc和huROR1-His抗原通过皮下注射和腹腔注射交叉免疫3只Balb/C小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)，每两周免疫一次，总计免疫4次。第4次免疫后一周取小鼠血用于免疫效价检测，最后，再用huROR1-huFc加强免疫一次。
3.2免疫后小鼠血清抗体效价检测
分别用2μg/mL huROR1-His，huROR1-huFc包被Elisa板4℃过夜(30μL/孔)，洗板3次后，用PBS配置的5％脱脂牛奶室温封闭1小时；洗板3次后，加入用PBS梯度稀释的小鼠血清，同时加入抗体99961.1作为阳性对照，室温孵育1小时；洗板后，加入PBS稀释的二抗Goat-anti-mouse-lgG(1+2a+2b+3)-HRP(Jackson，115-035-164)或者Goat-anti-human-Kappa+Lambda-HRP(Millipore，AP502P+AP506P)室温孵育1小时后，洗板6次加入TMB显色5-20min，终止显色反应后采用酶标仪OD450读取数据，处理数据Graphpad prism作图。结果显示，3只小鼠血清效价均达标。
3.3噬菌体展示抗体基因文库构建
在免疫结束后，取小鼠脾脏，经研磨和过滤后收集脾细胞，加入1mL的TRIzolTMReagent(Thermo Fisher，15596026)裂解脾细胞，通过酚氯仿法提取总RNA，通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。之后以cDNA为PCR模板，采用鼠源抗体序列的特异性引物分别扩增抗体的轻链和重链可变区基因。PCR产物通过NcoI、NotI双酶切得到抗体基因片段，将其插入至噬菌体展示用载体上，通过T4连接酶连接，连接产物通过DNA回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，最后通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320中(Lucigen，MC1061F)，将电转后的细菌涂布于含有氨苄青霉素和四环素的2-YT(C+/K+2-YT)固体平板，扩增正确转化抗体质粒的SS320菌，采用VSCM13辅助噬菌体(购自Stratagene)对其进行包装，获得了含Fab序列的噬菌体展示文库。
实施例4噬菌体展示抗体基因文库筛选
4.1细胞法筛选噬菌体展示抗体基因文库
在T25培养方瓶中培养hROR1-HEK293T细胞。当细胞生长密度接近90％时，去除培养上清，并用PBS(源培，B310KJ)清洗一次，然后加入2mL的4％多聚甲醛(生工，E672002-0500)固定0.5小时，最后用PBS清洗两次后作为筛选原材料。筛选时，将噬菌体展示文库与固定的hROR1-HEK293T细胞在室温下孵育1小时，用1×PBS清洗三次后，加入2mL甘氨酸-HCl(pH＝2.0)轻轻混匀10分钟，以洗脱特异性结合人ROR1的噬菌体，接着将洗脱上清侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，静置30分钟，然后在37℃，220rpm条件下培养1小时，再加入VSCM13辅助噬菌体，静置30分钟，继续在37℃，220rpm条件下培养1小时，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于第二轮的筛选。多次重复筛选，同时每轮随机挑选10个克隆进行序列分析以对库进行评估，经过3轮筛选后，库内的序列富集明显。
4.2免疫管法和磁珠法筛选噬菌体展示抗体基因文库
采用免疫管法和磁珠法富集针对抗原的特异性抗体，两种方法互为补充和验证。
免疫管法筛选是将抗原蛋白huROR1-His或者huROR1-huFc包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2-4轮淘选，最终富集针对抗原的特异性单克隆抗体Fab。本实施例中，经过3轮淘选后富集了针对人ROR1的单克隆抗体Fab，具体方法参考专利CN112250763B中的实施例2.4.2。
磁珠法筛选是将抗原蛋白huROR1-His进行生物素标记后，再与偶联有链霉亲和素的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和抗体基因噬菌体展示文库进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程。通常经历3-4轮的淘选，由此针对抗原的特异性单克隆抗体可以大量富集。本实施例中，将生物素标记的huROR1-His用于噬菌体展示文库筛选，经过3轮淘选后进行针对人ROR1的单克隆抗体Fab初筛，具体方法参考专利CN112250763B中的实施例2.4.1。
4.3单克隆的挑选
对每轮洗脱下来的噬菌体池进行ELISA检测来评价富集的效果，并从每轮筛选的噬菌体池中随机挑选10个克隆进行序列分析，结合富集效果和所测序列重复性比例综合分析，选择合适的轮次进行单克隆挑选。
ELISA单克隆初筛使用抗原蛋白huROR1-His，将初筛获得的结合huROR1-His的抗体Fab制备成Fab裂解液，然后用实施例2.1制备的过表达细胞huROR1-HEK293通过流式细胞分析法(FACS)进行检测复核，共筛选到了11个特异结合人ROR1的抗体Fab分子，分别以相应的克隆号对获得的11株鼠源抗体Fab进行命名(B62、B31、B32、B74、B34、B39、C38、C77、C42、M71和M78)，具体的FACS结果见图1A-1B。所得鼠源抗体Fab的CDR氨基酸序列见表1，采用AbM定义CDR的方式，确定CDR序列。
表1鼠源抗体CDR区域的氨基酸序列
实施例5抗体构建、表达与纯化
5.1质粒构建
将筛选获得的单克隆B62、B31、B32、B74、B34、B39、C38、C77、C42、M71和M78的Fab序列中的VH编码序列与人IgG1的重链恒定区(SEQ ID NO:52)的编码序列连接获得嵌合抗体的重链编码序列，将Fab序列中的VL编码序列与人轻链恒定区(CL)的Kappa型(SEQ ID NO:53)的编码序列连接获得嵌合抗体的轻链编码序列。将抗体重链和轻链的编码序列分别插入真核表达载体质粒pcDNA3.4(Invitrogen)上，转化到大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养。利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA，D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体质粒以供真核表达使用。
5.2抗体的表达和纯化
通过Expi CHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达上述获得的抗体全长序列，具体方法如下：转染当天，确认CHO细胞密度为7×106至1×107个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，此时用37℃预温的新鲜ExpiCHO表达培养基将细胞调整到终浓度为6×106个细胞/mL。用4℃预冷的OptiPROTM SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，同时用OptiPROTMSFM稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合液，室温孵育1-5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、8％ CO2条件下培养。
转染18-22h后，向培养液中添加ExpiCHOTMEnhancer试剂和ExpiCHOTMFeed试剂，摇瓶放置于32℃摇床和5％ CO2条件下继续培养。在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHOTMFeed试剂，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液。转染7天后，收集表达有目的蛋白的细胞培养上清液，15000g离心10min，所得上清液用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore，UFC901096)将所得蛋白换液至PBS缓冲液中。
实施例6抗体的理化性质检测
本实施例中，采用SDS-PAGE和SEC-HPLC检测了上述获得的抗体的相对分子量和纯度。
6.1抗体SDS-PAGE鉴定
非还原溶液制备：分别将1μg各个获得的抗体以及质控品IPI(伊匹木单抗，Ipilimumab)加入5×SDS上样缓冲液和40mM碘代乙酰胺中，75℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min取上清。
还原溶液制备：分别将2μg各个获得的抗体以及质控品IPI加入5×SDS上样缓冲液和5mM DTT中，100℃干浴加热10min，冷却到室温后，12000rpm离心5min取上清。将上清加入Bis-tris 4-15％梯度胶(金斯瑞)进行凝胶电泳并通过考马斯亮蓝染色使蛋白条带显色。
使用EPSON V550彩色扫描仪扫描带有显色蛋白条带的蛋白凝胶(脱色液脱色至凝胶背景透明)，通过ImageJ按照峰面积归一法计算还原和非还原条带纯度。
试验结果表明，各个抗体非还原胶的条带在150kD左右，还原胶的条带在55kD左右和25kD左右，符合预期大小。通过还原胶检测的所有本申请获得的抗体纯度均大于95％(表2)。
6.2SEC-HPLC鉴定抗体的单体纯度
材料准备：1、流动相：150mmol/L磷酸缓冲液，pH7.4；2、样品制备：分别用流动相溶液稀释各个抗体以及质控品IPI到0.5mg/mL。Agilent HPLC 1100或岛津LC2030C PLUS液相色谱仪，色谱柱为XBridge BEH(SEC 3.5μm，7.8mm I.D.×30cm)，Waters流速设为0.8mL/min，进样体积20μL，VWD检测器波长为280nm和214nm。依次进样空白溶液、IPI质控品溶液和抗体样品溶液。按照面积归一法计算样品中高分子聚合物、抗体单体和低分子物质百分比。
结果如图2A-2K和表2所示，除抗体B74外，其余抗体的SEC单体纯度均大于96％。
表2本申请获得的抗体表达量和理化性质
克隆号 SDS-PAGE(％) SEC-HPLC(％)
99961.1 >95.0 98.68
B31 >95.0 96.45
B62 >95.0 99.1
B32 >95.0 98.79
B34 >95.0 99.29
B39 >95.0 98.6
B74 >95.0 峰形异常
C38 >95.0 98.9
C42 >95.0 99.39
C77 >95.0 100
M71 >95.0 100
M78 >95.0 98.93
实施例7抗体的抗原结合活性检测
在本实施例中，基于ELISA方法检测了表达的11个抗体(B62、B31、B32、B34、B39、B74、C38、C42、C77、M71和M78)与人ROR1抗原蛋白huROR1-His的结合情况，还基于FACS方法检测了所述抗体(B62、B31、B32、B34、B39、B74、C38、C42、C77、M71和M78)与人ROR1过表达细胞huROR1-HEK293和A549肿瘤细胞的结合能力。A549肿瘤细胞是人类非小细胞肺癌细胞系，其过表达人ROR1。
7.1基于ELISA检测抗体对抗原蛋白huROR1-His的结合能力
以2μg/mL的huROR1-His包被96孔ELISA板(30μL/孔)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释(3.00000、0.33333、0.11111、0.03704、0.01235、0.00412、0.00046、0.00005μg/mL)的各个抗体及阳性对照抗体99961.1并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入二抗Goat-anti-human Fc-HRP(abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读取数据。
结果如图3A-3B所示，本申请获得的全部抗体和抗原蛋白huROR1-His都具有较好的亲和活性，各抗体的亲和力均与99961.1相当。
7.2基于FACS检测抗体对huROR1-HEK293和A549肿瘤细胞的结合能力
本实施例中分别用人ROR1过表达细胞huROR1-HEK293和A549肿瘤细胞两种细胞对抗体的结合活性进行评价。
具体方法如下：将对数生长期的huROR1-HEK293细胞或者A549细胞制备成单细胞悬液，密度调整为1×106个细胞/mL，以每孔100μL加至96孔圆底板中，4℃、300g离心并去除上清。向对应孔中加入梯度稀释的本申请获得的抗体和阳性对照抗体99961.1，混匀并于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入100μL 1：300稀释的二抗Goat F(ab’)2Anti-Human IgG-Fc(abcam,ab98596)，4℃避光孵育30min，洗涤3次后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
结果如图所示，在A549细胞上(图4A-4B)，除C42外，其他抗体的亲和力均优于对照抗体99961.1；在huROR1-HEK293细胞上(图5A-5B)，所有抗体的亲和力与对照抗体99961.1相当。
实施例8抗体种属及同族交叉活性检测
本实施例中检测了本申请获得的各个抗体在种属及同族上的交叉反应性。采用实施例1.2制备的鼠ROR1抗原蛋白MusROR1-His和人ROR2抗原蛋白huROR2-His对本申请获得的抗体的种属及同族交叉活性进行鉴定。
8.1抗体的种属交叉反应性鉴定
用2μg/mL的MusROR1-His包被96孔ELISA板(30μL/孔)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释(1.00000、0.11111、0.03704、0.01235、0.00412、0.00137、0.00015、0.00002μg/mL)的各个抗体及阳性对照抗体99961.1并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入二抗Goat-anti-human Fc-HRP(abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读取数据。
结果如图6A-6B和表3所示，B62、B32、C38和C42与抗原蛋白MusROR1-His结合，显示出了良好的鼠交叉活性。而其他抗体和阳性对照抗体99961.1均不结合鼠源抗原蛋白。因此本申请获得的抗体B62、B32、C38和C42在基于小鼠模型的实验及测试中具有广泛用途。
8.2本申请抗体同族交叉反应性检测
用2μg/mL的huROR2-His包被96孔ELISA板(30μL/孔)，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的抗体及阳性对照抗体99961.1并孵育1h。之后用PBST清洗3次后加入二抗Goat-anti-human Fc-HRP(abcam，ab97225)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板6次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读取数据。
结果如图7A-7B和表3所示，所有抗体均不与抗原蛋白huROR2-His结合，说明本申请制得的抗体能够特异性结合人ROR1。
表3本申请获得的抗体种属交叉和同族交叉活性
克隆编号 种属 MusROR1-His huROR2-His
B31 鼠 不结合 不结合
B62 鼠 结合 不结合
B32 鼠 结合 不结合
B34 鼠 不结合 不结合
B39 鼠 不结合 不结合
B74 鼠 不结合 不结合
C38 鼠 结合 不结合
C42 鼠 结合 不结合
C77 鼠 不结合 不结合
M71 鼠 不结合 不结合
M78 鼠 不结合 不结合
实施例9抗体内吞效率检测
在本实施例中，分别运用FACS和Fab-Zap两种检测方法对本申请获得的抗体的内吞效率进行检测。FACS法内吞检测是用过饱和的抗体结合细胞，检测短时间内的抗体内吞效率；Fab-Zap法是以不同浓度的结合了Fab-Zap毒素的抗体去结合细胞，通过内吞将毒素带进去杀伤靶细胞，此种方法反映的是内吞效率长期累加的效果。
9.1FACS法检测本申请抗体的内吞效率
抗体稀释：将测试抗体用DMEM完全培养基稀释成10.0000μg/mL的终浓度。
处理细胞：将huROR1-HEK293细胞消化后加入DMEM完全培养基。充分混匀细胞后，细胞计数并测定其活率。分别取106的细胞加到1.5mL离心管，300g离心5分钟，弃去上清，用1mL预冷的DMEM培养基重悬，300g离心5分钟，弃去上清。
一抗孵育：取1000μL预冷的上述稀释的抗体，加到已有细胞的离心管中制备抗体细胞混悬液，将抗体细胞混悬液加入96孔板中，4℃孵育。
胞外二抗孵育：快速转移96孔板中的混悬液到第二个96孔板中。向第二块96孔板中每孔加入180μL预冷FACS buffer清洗2遍。之后每孔各加入100μL的稀释二抗FITC-labeled anit-huFc或RPE-labeled anit-huFc(二抗采用FACS buffer以1：150倍稀释)；4℃孵育30min。
细胞固定：孵育结束后，离心弃上清液，每孔加入180μL预冷FACS buffer，清洗细胞2遍。离心去上清，每孔用100μL 4％多聚甲醛室温固定细胞30min。
破碎细胞膜：固定完后，加入180μL FACS buffer清洗2遍。每孔加入100μL预热的0.5％ Triton X-100，室温穿孔5min。
胞内二抗孵育：清洗96孔板之后，每孔加入180μL预热的PermeabilizationBuffer(InvitrogenTM eBioscienceTM，00-8333-56)清洗2遍。每孔各加入100μL的稀释二抗RPE-labeled anit-huFc(采用Perm buffer以1：150倍稀释)。室温孵育60min。
检测荧光：清洗96孔板之后，用100μL FACS buffer重悬，通过流式细胞仪检测。
本实验采用两组不同荧光设置对每个样品染色，第一组设置为FITC+PE，即先用FITC二抗染胞外一抗，破膜后用PE二抗染胞内一抗，在这一组中PE为胞内信号，FITC为胞外信号；第二组设置为PE+PE，即先用PE二抗染胞外一抗，破膜后用PE二抗染胞内一抗，这一组PE为胞内和胞外信号的总和。同时这两组样品均用FITC和PE通道去检测，内吞率计算值都是计算PE通道检测值，具体公式为：
内吞率＝一组(FITC+PE)PE通道/二组(PE+PE)PE通道×100％。
结果如图8A-8B所示，本实施例的结果显示本申请制得的所有抗体在较短的时间内(3h内)的内吞效率均优于对照抗体99961.1。
9.2Fab-Zap法检测抗体内吞效率
本实验通过抗体介导Fab-ZAP内吞的细胞毒性来检测抗体的内吞活性。Fab-ZAP是连接了saporin(皂素)的Fab片段，saporin是一种核糖体抑制剂，能够抑制蛋白质的合成而使细胞死亡。本实验用的Fab-ZAP是一种能够和嵌合抗体的人源Fc结合的Fab片段，Fab-ZAP和嵌合抗体孵育后使嵌合抗体带上毒素，当嵌合抗体被内吞时，毒素随着嵌合抗体进入到细胞内，使细胞死亡，然后通过MTS(Promega，G3580)检测细胞的活性来检测抗体是否内吞。
具体实验方法如下：首先将Fab-Zap用DMEM完全培养基稀释成0.4nM，然后用0.4nMFab-Zap梯度稀释(0.020000、0.006667、0.002222、0.000741、0.000247、0.000082、0.000027、0.000009μg/mL)本申请获得的各个抗体及阳性对照抗体制成抗体稀释液。将对数生长期huROR1-HEK293细胞制成单细胞悬液，调整密度为6×106个细胞/mL,以每孔50μL接种到96孔板中，然后取前述抗体稀释液，以每孔5 0μL加入细胞培养板中，充分吹打混匀。将细胞培养板放入37℃细胞培养箱孵育48小时。孵育结束后，向每孔中加入7.5μLTritonX-100溶液，轻轻拍打混匀，将细胞培养板放入37℃细胞培养箱孵育0.5小时。接着向每孔中继续加入20μL MTS，37℃孵育1-4小时。最后以1000rpm离心细胞培养板5分钟，酶标仪读取数据，检测波长A492。
结果如图9A-9F所示，表明在本实施例限定的抗体浓度条件下，本申请制得的抗体的内吞效果与对照抗体相当。考虑到细胞对于毒素敏感是在某一个阈值以上才会出现反应，当累加的毒素差异不大时较难拉开差距。
实施例10抗体亲和动力学(Gator)检测
本实施例中，基于Gator设备检测本申请获得抗体和阳性对照抗体99961.1与抗原蛋白huROR1-His的亲和力。
首先将PBS(10mM pH7.4)(IgG-free，购自Jackson ImmunoResearch Lab)+0.02％Tween 20(购自thermo)+0.2％BSA(购自源培)配置成Q缓冲液，用配置好的Q缓冲液将待测抗体的存储液稀释到终浓度为30nM的工作液；将抗原蛋白huROR1-His存储液用Q缓冲液配置成倍数稀释(480、240、120、60、30、15、7.5nM)的工作液，然后利用Gator仪器及其配套软件，选择Advanced Kinetics实验模式进行检测和分析。试验结果如表4所示。
结果显示：除C42抗体与对照抗体99961.1具有相当的亲和力之外，其余抗体的亲和力均优于对照抗体99961.1的亲和力1个数量级或以上，其中B62抗体的亲和力优于对照抗体99961.1的亲和力约2个数量级，亲和力达到9.84E-10。
表4本申请获得的抗体的亲和动力学检测结果
实施例11抗体亲和动力学(Biacore)分析
本实施例中，基于Biacore设备检测本申请获得的抗体和阳性对照抗体99961.1与抗原蛋白huROR1-His的亲和力。
蛋白的偶联：将实施例1.2生产的huROR1-His蛋白用pH5.0的NaAc缓冲液稀释至5.6μg/mL，流速设置为10μL/min，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合液活化芯片时间为默认值420s，采用预设偶联量的偶联模式固定抗原蛋白huROR1-His至约75RU水平，以乙醇胺封闭未结合供试品的活化基团。
样品测试条件：以含有0.05％ Tween-20的PBS缓冲液(pH7.4)作为运行缓冲液，将运行缓冲液作为对照测试样品，设置系列抗体浓度(4nM，20nM)，样品分析时设置流速为30μL/min，结合时间为120s，解离时间为360s。解离结束之后，采用10mM Gly-HCl(pH 2.0)再生20s以完全去除与配体结合的抗体。
参数拟合：实验采用多循环运行，其响应信号以分析时间为横坐标，响应值为纵坐标。所得数据进行双参比扣减后，通过BIAcore T200分析软件进行拟合，所采用的拟合模型为1:1Langmuir结合模型，确定其结合解离常数等亲和力指标。
结果如表5所示，B62抗体亲和力优于对照抗体99961.1约2个数量级，其KD达到6.39E-11，而对照抗体99961.1的KD只有1.98E-9；此外B31抗体的亲和力与对照抗体99961.1相当。
表5本申请获得的抗体的亲和动力学检测结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) t 1/2(s) KD(M) Rmax(RU) Chi2(RU2)
99961.1 6.94E+05 1.37E-03 504.4 1.98E-09 Local Fit 3.13
B31 6.53E+05 8.17E-04 848.8 1.25E-09 Local Fit 1.61
B62 1.21E+06 7.74E-05 8954.3 6.39E-11 Local Fit 0.92
实施例12亲和动力学表位分组
本实施例采用亲和动力学的方法，对本申请获得的抗体和阳性对照抗体99961.1的表位进行分组。
具体试验方法如下：首先将PBS(10mM PH7.4)(IgG-free，购自JacksonImmunoResearch Lab)+0.02％ Tween 20(购自thermo)+0.2％BSA(购自源培)配置成Q缓冲液，用配置好的Q缓冲液将待测抗体的存储液稀释到终浓度为100nM的工作液；将抗原huROR1-His存储液用Q缓冲液配置成50nM的工作液，然后利用Gator仪器及其配套软件，基于Epitope Binning实验模式的Tandem设置进行检测和分析。
具体检测和分析步骤如下：
平衡1阶段：探针以1000rpm的转速在Q缓冲液内平衡反应60s；
固化抗原阶段：平衡1阶段完成后的探针以400rpm的转速在含有50nM抗原的Q缓冲液内固化反应90s；
平衡2阶段：固化抗原阶段完成后探针以1000rpm的转速在Q缓冲液内平衡反应60s；
抗体1结合阶段：平衡2阶段完成后的探针以1000rpm的转速在含有100nM抗体1的Q缓冲液内结合反应180s；
平衡3阶段：抗体1结合阶段完成后的探针以1000rpm的转速在Q缓冲液内平衡反应30s；
抗体2结合阶段：平衡3阶段完成后的探针以1000rpm的转速在含有100nM抗体2的Q缓冲液内结合反应180s；
再生阶段：从平衡1阶段到抗体2结合阶段为1个Assay，完成1个Assay的探针在进行下一次Assay前需要以1000rpm的转速在Q缓冲液内再生反应50s。
由此获得的各个抗体表位分组结果如表6所示。结果显示，本申请抗体和对照抗体99961.1共分成2个表位分组，仅C42和对照抗体具有相同的结合表位，其余抗体与对照抗体的结合表位不同。
表6表位分组结果汇总
表位分组 克隆号
1 99961.1、C42
2 B62、B32、C38、B74、M71、B34、M78、C77、B39、B31
实施例13鼠源抗体的人源化
将实施例4筛选得到的鼠源抗体B31和B62的VH和VL序列分别和已知的人源抗体数据库进行比对，找到分别与鼠源VH和VL序列同源性最高的人种系(germline)基因VH和VL序列。选择相应人种系基因VH和VL序列的框架区(采用AbM定义CDR和框架区)，将该种系基因的互补决定区(CDR)序列替换为本申请鼠源抗体B31和B62中对应的CDR序列，然后借助计算机预测模拟，通过回复突变的方式保留鼠源抗体B31和B62框架区中对抗原结合具有重要影响的鼠源氨基酸。鼠源抗体B31和B62经人源化后获得人源化抗体CDR区氨基酸序列见表7。通过实施例5的方法进行构建、表达、纯化获得对B31和B62进行人源化后的多个抗体，并通过SDS-PAGE和SEC-HPLC鉴定对B31和B62进行人源化后获得的多个抗体蛋白，结果见表8。结果表明各个抗体非还原胶的条带在150kD左右，还原胶的条带在55kD左右和25kD左右，符合预期大小，通过还原胶检测的所有本申请获得的抗体纯度均大于95％；所有抗体的SEC单体纯度均大于96％。
表7人源化抗体的CDR区氨基酸序列
表8人源化抗体的理化性质
克隆号 SDS-PAGE(％) SEC(％)
B31 >95.0 100
B31-H1L1 >95.0 98.34
B31-H2L2 >95.0 100
B31-H2L3 >95.0 100
B31-H3L2 >95.0 100
B31-H3L3 >95.0 100
B31-H3L4 >95.0 100
B31-H4L2 >95.0 100
B31-H4L3 >95.0 99.1
B31-H4L4 >95.0 100
B62 >95.0 98.72
B62-H1L1 >95.0 100
B62-H1L2 >95.0 100
B62-H2L2 >95.0 100
B62-H2L3 >95.0 100
B62-H2L4 >95.0 96.73
B62-H3L2 >95.0 100
B62-H3L3 >95.0 100
B62-H3L4 >95.0 97.07
实施例14人源化抗体的抗原亲和力检测
在本实施例中，基于ELISA方法检测了人源化抗体与人ROR1抗原蛋白huROR1-His的亲和效果，还基于FACS方法检测了人源化抗体与A549肿瘤细胞的亲和能力。具体测试方法参照实施例7。
ELISA检测结果如图10A-10E所示，人源化抗体与抗原蛋白的亲和力与对应母本分子和对照抗体99961.1相当。
FACS测试结果如图11A-11B所示，除B31-H3L4、B31-H4L3、B31-H4L2和B31-H4L4外，人源化抗体对A549肿瘤细胞上的抗原蛋白的亲和力与对应母本分子和对照抗体9996.1相当。
实施例15人源化抗体内吞效率检测
本实施例中，对实施例13中人源化抗体B31-H3L3和B62-H3L3进行Fab-Zap法内吞检测，具体方法参照实施例9，结果如图12所示，B31-H3L3和B62-H3L3的内吞效果与对照抗体99961.1相当。
实施例16ADC制备
本实施例中将抗体B62-H3L3、B31-H3L3和对照抗体99961.1与毒素MMAE(一种tubulin抑制剂，具有抗癌活性)偶联构建了抗体偶联药物，MMAE与接头MC-VC-PAB连接构成MC-VC-PAB-MMAE，并借助接头与抗体的半胱氨酸上的巯基共价连接，从而使得抗体与MMAE缀合制得抗体偶联药物。IgG1型抗体具有16对半胱氨酸残基，其中以12个链内和4个链间二硫键的形式存在。链间二硫键具有溶剂可及性，可以被还原剂还原形成八个巯基，进而成为偶联目标(McCombs J,Owen S.Antibody drug conjugates:design and selection oflinker,payload and conjugation chemistry.AAPS J.2015；17:339-51)。
具体制备方法如下：
将抗体B62-H3L3、B31-H3L3和对照抗体99961.1从-80℃冰箱取出，融化后分别转移到15mL 30KD超滤离心管中，补加偶联缓冲液(每1L含量：Na2HPO4·2H2O 6.86g，NaH2PO4·H2O 1.58g，纯化水定容至1000g，pH7.4)至15mL，4500rpm离心约30min，浓缩至2-3mL，重新补加透析液(每1L含量：组氨酸0.73g，一水盐酸组氨酸1.12g，纯化水定容至1000g，pH6.0)至15mL，反复透析8-10次，获得抗体原液，检测透析后抗体浓度。
依次加入抗体原液、10mM二硫键还原剂TCEP母液(三(2-羧乙基)膦盐酸盐母液，每1L含量：Na2HPO4·2H2O 6.86g，NaH2PO4·H2O 1.58g，纯化水定容至1000g)、10mM DTPA母液(二乙烯三胺五乙酸母液，每1L含量：DTPA 3.90g，NaOH 1.20g，纯化水定容至1000g)和偶联缓冲液构成还原反应体系，以还原抗体的半胱氨酸上的巯基。还原反应体系中各组分的加入量参见表9，使得还原反应体系中抗体浓度为5mg/mL，DTPA终浓度为1mM，TCEP与B62-H3L3或B31-H3L3的摩尔比为2，TCEP与9996.1的摩尔比为2.2。充分混匀之后，将还原反应体系置于25℃恒温混匀仪中，转速为400rpm，还原反应2h。
称量MC-VC-PAB-MMAE，使用DMSO溶解，配置成5mM MC-VC-PAB-MMAE母液。还原反应结束后，在冰水浴中依次向还原反应体系中添加MC-VC-PAB-MMAE母液，添加量如表10所示，制成偶联反应体系。充分混匀后，将偶联反应体系置于25℃恒温混匀仪中，400rpm，偶联反应1h获得包含ADC的溶液。
偶联结束后，离心包含ADC的溶液并过滤，获得ADC样品，并将其转移到15mL 30KD超滤离心管中。补加透析液至15mL，4500rpm离心20min，浓缩至2-3mL，重新补加透析液至15mL，反复透析8-10次。对透析后的ADC样品进行SEC-HPLC检测、HIC-HPLC检测、浓度检测、游离药物检测等。测试结果参见表11。测试结果显示获得了纯度99％以上的ADC。
表9还原反应体系组成
表10MC-VC-PAB-MMAE母液添加量
克隆号 B62-H3L3 B31-H3L3 99961.1
MC-VC-PAB-MMAE与抗体摩尔比 6.0 6.0 6.0
5mM MC-VC-PAB-MMAE母液添加体积(μL) 620 384 642
表11ADC样品测试结果
实施例17ADC的抗原结合活性检测
本实施例中，基于FACS方法检测了所述制得的ADC(B62-H3L3-MMAE、B31-H3L3-MMAE)与肿瘤细胞A549和HT-29(人结肠癌细胞)上的人ROR1的结合能力。
具体方法如下：将对数生长期的A549细胞或者HT-29细胞制备成单细胞悬液，密度调整为1×106个细胞/mL，以每孔100μL加至96孔圆底板中，4℃、300g离心并去除上清。向对应孔中加入梯度稀释(1.0000、0.3333、0.1111、0.0370、0.0123、0.0041、0.0014、0.0001μg/mL)的本申请抗体(B62-H3L3和B31-H3L3)、本申请ADC(B62-H3L3-MMAE、B31-H3L3-MMAE)、99961.1、99961.1-MMAE和阴性对照，混匀并于4℃孵育30min。将孵育后的细胞混合液洗涤3次后加入100μL 1：300稀释的二抗Goat F(ab’)2Anti-Human IgG-Fc(abcam,ab98596)，4℃避光孵育30min，洗涤3次后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)检测。
结果如图13A-13B所示：与A549细胞结合的结果显示于图13A，在偶联后，B62-H3L3-MMAE和99961.1-MMAE与A549细胞的结合活性略差于对应裸抗，B62-H3L3和B62-H3L3-MMAE与A549细胞结合活性都要优于相应阳性对照；与HT-29细胞结合的结果显示于图13B：裸抗和相应的ADC与HT-29细胞的结合活性相当，且B62-H3L3和B62-H3L3-MMAE与HT-29细胞的结合活性都要略优于相应阳性对照。
实施例18基于MTS法检测ADC肿瘤细胞杀伤效果
本实施例中分别用A549和HT-29细胞检测本申请ADC和对照ADC对肿瘤细胞的杀伤情况。
具体方法如下：将对数生长期的A549细胞或者HT-29细胞制备成单细胞悬液，A549密度调整为1×104个细胞/mL，HT-29密度调整为1.5×104个细胞/mL，以每孔100μL加至96孔细胞培养板中，37℃，5％ CO2，培养12h后。之后加入梯度稀释(2000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、1.953nM)的ADC样品，37℃，5％ CO2，培养72h(A549细胞)或者96h(HT-29细胞)。然后每孔加入40μL MTS(Promega，G3580)，37℃孵育1h后，通过酶标仪在OD492下读取数据。
结果如图14A-14D所示：B31-H3L3-MMAE在两个肿瘤细胞A549(图14A)和HT-29(图14C)上的杀伤效果要略优于对照ADC 99961.1-MMAE，而B62-H3L3-MMAE在A549(图14B)和HT-29(图14D)上的杀伤效果要略差于对照ADC 99961.1-MMAE。
实施例19基于CCK8法检测ADC肿瘤细胞杀伤效果
实施例中分别用Jeko-1细胞(人套细胞淋巴瘤细胞)、MDA-MB-468细胞(人乳腺癌细胞)和NCI-H1944细胞(人肺癌细胞)检测B31-H3L3-MMAE、B62-H3L3-MMAE和对照ADC对肿瘤细胞的杀伤情况。
具体方法如下：将对数生长期的Jeko-1细胞、MDA-MB-468细胞或NCI-H1944细胞制备成单细胞悬液，Jeko-1密度调整为1×105个细胞/mL，MDA-MB-468密度调整为2×105个细胞/mL，NCI-H1944密度调整为1.2×105个细胞/mL，以每孔90μL加至96孔细胞培养板中，37℃，5％ CO2，培养12h。之后加入ADC样品，将药物浓度梯度稀释至500、158、50、15.8、5、1.58、0.5、0.158、0.05nM，37℃，5％ CO2，培养72h。然后每孔加入10μL CCK8(Bimake，B34304)，37℃孵育1h后，通过酶标仪在OD450下读取数据。
试验结果如图15A-15C所示，B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE在三个肿瘤细胞Jeko-1(图15A)和MDA-MB-468(图15B)和NCI-H1944(图15C)上的杀伤效果与对照ADC99961.1-MMAE相当，其中B31-H3L3-MMAE在Jeko-1、MDA-MB-468和NCI-H1944上的EC50分别是38.24nM、15.24nM和117.3nM，B62-H3L3-MMAE在Jeko-1、MDA-MB-468和NCI-H1944上的EC50分别是50.14nM、28.64nM和128.6nM。
实施例20基于CCK8法检测ADC抗原依赖的杀伤效果
本实施例中用huROR1-HEK293细胞检测B31-H3L3-MMAE和对照ADC抗原依赖的杀伤效果。
具体方法如下：将对数生长期的huROR1-HEK293细胞制备成单细胞悬液，细胞密度调整成6×104个细胞/mL，以每孔50μL加至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2，培养24h后，每孔加入50μL浓度为100μg/mL的抗体B31-H3L3和阳性对照抗体99961.1，37℃孵育2h后，加入浓度梯度稀释(42.6667、21.3333、10.6667、5.3333)的对应的ADC B31-H3L3-MMAE和对照ADC 99961.1-MMAE，37℃，5％ CO2，培养96h后，每孔30μL CCK8(absin/爱必信，abs50003)，37℃孵育1-4h后，通过酶标仪在OD450下读板。采用未加抗体仅加入ADC的体系作为对照组。
结果如图16所示，抗体B31-H3L3和99961.1的竞争能够显著抑制其对应ADC对huROR1-HEK293细胞的杀伤效果，证明本申请制得的ADC对于细胞的杀伤依赖于连接在ADC上的抗体与细胞表面的抗原的结合，因而是抗原依赖性杀伤而非连接毒素的非特异性杀伤。
实施例21ADC内吞效率检测
本实施例中用A549和HT-29肿瘤细胞基于FACS法检测了本申请获得的ADC的内吞效率，具体实验方法参见实施例9。
实验结果表明，在A549细胞上(图17A)，B31-H3L3-MMAE和对照ADC 99961.1-MMA内吞效率相当，B62-H3L3-MMAE的内吞效率略低于阳性对照ADC，且ADC的内吞效率均高于其对应抗体；在HT-29细胞上(图17B)，B31-H3L3-MMAE的内吞效率略高于阳性对照ADC，B62-H3L3-MMAE的内吞效率略低于阳性对照ADC，且抗体内吞效率普遍低于其对应ADC。
实施例22ADC抑制HT-29小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例中，验证了2个候选ADC(B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，以99961.1-MMAE为阳性对照，所使用肿瘤细胞为结肠癌细胞HT-29(BNCC337732)。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在20g左右的雌性Balb/C裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠皮下单侧注射1×106个HT-29细胞，待荷瘤体积达100mm3左右时，进行随机分组分笼。每组6只荷瘤裸鼠，共9组，包括一个PBS阴性对照组、5个候选ADC组(B31-H3L3-MMAE 0.4mg/kg(mpk)、B31-H3L3-MMAE 2mg/kg、B31-H3L3-MMAE 10mg/kg、B62-H3L3-MMAE 2mg/kg和B62-H3L3-MMAE 10mg/kg)和3个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE0.4mg/kg、99961.1-MMAE 2mg/kg和99961.1-MMAE 10mg/kg)，给药方式为尾静脉注射给药，每周给药2次并测量2次瘤体积，共给药8次/4周(BIW*4)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。给药结束后1周将小鼠安乐死，取肿瘤并测量瘤重。分析瘤体积、瘤重和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图18A-18C和表12。
试验结果表明，各组小鼠体重之间无明显差异，并且治疗期间各组小鼠体重均无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图18B)；B31-H3L3-MMAE、B62-H3L3-MMAE和对照ADC 99961.1-MMAE均在高剂量(10mpk)的条件下显示出了显著的抑瘤效果，在高剂量的条件下，B31-H3L3-MMAE和99961.1-MMAE抑瘤效果相当，B62-H3L3-MMAE的抑瘤率略弱于对照ADC 99961.1-MMAE，而在较低剂量(2mpk)的条件下，B62-H3L3-MMAE的抑瘤效果明显优于对照ADC 99961.1-MMAE和B62-H3L3-MMAE(图18A、图18C和表12)。
表12ADC在小鼠体内的抑瘤率
实施例23ADC抑制A549小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例检测了2个候选ADC(B31-H3L3-MMAE和B62-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，所使用肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞A549(中科院上海细胞库，C2107019)，以99961.1-MMAE作为阳性对照。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在18-20g的雌性裸鼠(Balb/C北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠右侧背部皮下单侧注射1×106个A549细胞，待荷瘤体积达100mm3左右时，进行随机分组分笼。每组6只荷瘤裸鼠，共4组，包括一个PBS阴性对照组、2个ADC组(B31-H3L3-MMAE 10mpk(mg/kg)和B62-H3L3-MMAE 10mpk)和1个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE 10mpk)，给药方式为尾静脉注射给药，每周给药2次并测量2次瘤体积，共给药6次/3周(BIW*3)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。给药结束后观察一定时间后将小鼠安乐死，取肿瘤并测量瘤重。分析瘤体积、瘤重和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图19A-19C和表13。
试验结果表明，治疗期间各组小鼠体重均无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图19B)；B62-H3L3-MMAE在同等剂量下显示出了与阳性对照ADC相当的抑瘤效果，B31-H3L3-MMAE显示出了优于阳性对照ADC的抑瘤效果(图19A，19C和表13)。
表13ADC在小鼠体内的抑瘤率
实施例24ADC抑制NCI-N87小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例检测了1个候选ADC(B31-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，所使用肿瘤细胞为胃癌细胞NCI-N87(中科院上海细胞库，C2009021，P3)，以99961.1-MMAE作为阳性对照。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在18-20g的雌性裸鼠(Balb/C北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠进行背部皮下注射1×106个NCI-N87细胞，待荷瘤体积达100mm3左右时，进行随机分组分笼。每组10只荷瘤裸鼠，共5组，包括一个PBS阴性对照组、2个ADC组(B31-H3L3-MMAE 5mpk(mg/kg)和B31-H3L3-MMAE 10mpk)和2个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE 5mpk和99961.1-MMAE 10mpk)，给药方式为尾静脉注射给药，每周给药1次并测量2次瘤体积，共给药3次/3周(QW*3)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。分析瘤体积和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图20A-20B和表14。
试验结果表明，治疗期间各组小鼠体重均无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图20B)；和PBS组比较，各剂量组都具有显著的抑瘤效果，B31-H3L3-MMAE分子与99961.1-MMAE分子在10mpk下抑瘤效果均相当(图20A和表14)。
表14ADC在小鼠体内的抑瘤率
实施例25ADC抑制MDA-MB-231小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例检测了1个候选ADC(B31-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，所使用肿瘤细胞为三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(中科院上海细胞库，C2006040)，以99961.1-MMAE作为阳性对照。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在20-22g的雌性裸鼠(NSG北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠背部皮下注射1×106个MDA-MB-231细胞，待荷瘤体积达100mm3左右时，进行随机分组分笼。每组10只荷瘤裸鼠，共5组，包括一个PBS阴性对照组、2个ADC组(B31-H3L3-MMAE 5mpk(mg/kg)和B31-H3L3-MMAE 10mpk)和2个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE 5mpk和99961.1-MMAE 10mpk)，给药方式为尾静脉注射给药，每周给药1次并测量2次瘤体积，共给药3次/3周(QW*3)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。分析瘤体积和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图21A-21B和表15。
试验结果表明，各组小鼠给药前期未见明显差异，PBS组于第35天开始出现体重下降，预计为肿瘤负荷过大导致，ADC组和阳性对照组小鼠体重无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图21B)；和PBS组比较，阳性对照和测试ADC的高剂量组有相当的抑瘤作用，效果显著；低剂量条件下测试ADC(B31-H3L3-MMAE)显现出了优于阳性对照ADC的肿瘤抑制效果。低剂量组在停药后有一定的肿瘤组织反弹(图21A和表15)。
表15ADC在小鼠体内的抑瘤率
实施例26ADC抑制MDA-MB-468小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例检测了1个候选ADC(B31-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，所使用肿瘤细胞为三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468(中科院上海细胞库，TCHu136)，以99961.1-MMAE作为阳性对照。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在21-25g的雌性裸鼠(NOD SCID浙江维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠背部皮下注射1×107个MDA-MB-468细胞，待荷瘤体积达200mm3左右时，进行随机分组分笼。每组6只荷瘤裸鼠，共5组，包括一个PBS阴性对照组、2个ADC组(B31-H3L3-MMAE 5mpk(mg/kg)(QW*3)、B31-H3L3-MMAE 10mpk(QW*3)和2个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE 5mpk(QW*3)、99961.1-MMAE 10mpk(QW*3)；每组3只荷瘤裸鼠，共2组，包括B31-H3L3-MMAE 10mpk(单次给药)和99961.1-MMAE 10mpk(单次给药)，给药方式为尾静脉注射给药，共给药3次/3周(QW*3)或单次给药(singledose)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。分析瘤体积和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图22A-22B和表16-17。
试验结果表明，治疗期间各组小鼠体重均无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图22B)；QW*3给药10mpk B31-H3L3-MMAE的组的抑瘤速度略高于QW*3给药10mpk99961.1-MMAE的组(表17)，但都在给药后大约18天达到全部小鼠的完全缓解(CR)；QW*3给药5mg/kg B31-H3L3-MMAE组优于QW*3给药5mg/kg 99961.1-MMAE组的抑瘤效果，且在给药后25天达到4/6小鼠的CR。单次给药10mg/kg剂量B31-H3L3-MMAE的组表现出优于单次给药10mg/kg 99961.1-MMAE组的抑瘤效果，其中B31-H3L3-MMAE组在给药后18天全部CR，而99961.1-MMAE组却在给药后20天出现瘤体复发。本实验中，所有B31-H3L3-MMAE组未见瘤体复发(图22A和表16-17)。
表16ADC在小鼠体内的抑瘤率
表17ADC在小鼠体内的完全缓解率
实施例27ADC抑制Jeko-1小鼠荷瘤模型药效检测
本实施例检测了1个候选ADC(B31-H3L3-MMAE)在动物体内的抑瘤效果，所使用肿瘤细胞为套细胞淋巴瘤细胞Jeko-1(ATCC，CRL-3006)，以99961.1-MMAE作为阳性对照。
具体方法如下：使用6-8周龄、体重在21-25g的雌性裸鼠(BALB/c浙江维通利华实验动物技术有限公司)，每只裸鼠背部皮下注射1×107个Jeko-1细胞，待荷瘤体积达100mm3左右时，进行随机分组分笼。每组7只荷瘤裸鼠，共9组，包括一个PBS阴性对照组、4个ADC组(B31-H3L3-MMAE 2.5mpk(mg/kg)(QW*3)、B31-H3L3-MMAE 10mpk(QW*3)、B31-H3L3-MMAE10mpk(单次给药)和B31-H3L3-MMAE 2.5+3.5mpk(Q2W*2，即第15天给药2.5mpk和第29天给药3.5mpk，简写为D15 2.5mpk+D29 3.5mpk))和4个阳性对照ADC组(99961.1-MMAE 2.5mpk(QW*3)、99961.1-MMAE 10mpk(QW*3)、99961.1-MMAE 10mpk(单次给药)和99961.1-MMAE2.5+3.5mpk(Q2W*2，即第15天给药2.5mpk和第29天给药3.5mpk，简写为D15 2.5mpk+D293.5mpk))，给药方式为尾静脉注射给药，共给药3次/3周(QW*3)或单次给药(singledose)或给药2次/3周(Q2W*2)。瘤体积(V)计算方式：V＝L×W2/2(其中L是肿瘤直径中最长的，W是肿瘤直径中最短的)。分析瘤体积和小鼠体重变化数据，计算抑瘤率。结果示于图23A-23B和表18-19。
试验结果表明，治疗期间各组小鼠体重均无明显变化，表明小鼠对ADC的耐受性良好(图23B)；QW*3给药组，B31-H3L3-MMAE-10mpk和99961.1-MMAE-10mpk剂量组的小鼠肿瘤生长抑制率TGI约为96％，抑瘤率相当，给药后23天肿瘤未复发；B31-H3L3-MMAE-2.5mpk和99961.1-MMAE-2.5mpk剂量组的抑瘤效果相当，TGI分别为60.47％和59.22％。单次给药组，B31-H3L3-MMAE(10mpk)和99961.1-MMAE(10mpk)剂量组的TGI分别为79.24％和91.74％，给药后23天肿瘤均未复发。Q2W*2给药组，B31-H3L3-MMAE(2.5+3.5mpk)剂量组的抑瘤效果与99961.1-MMAE(2.5+3.5mpk)组相当，TGI分别为34.96％和34.60％(图23A和表18-19)。
表18ADC在小鼠体内的抑瘤率
表19ADC在小鼠体内的抑瘤率
序列表

Claims (27)

1.一种特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:77所示的重链可变区所包含的3个重链CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和如SEQ ID NO:81所示的轻链可变区所包含的3个轻链CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
2.一种特异性结合ROR1的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和如SEQ ID NO:43、46和48所示序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
3.权利要求1或2所述的抗ROR1抗体及其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列且包含如SEQ ID NO:4、5和6所示序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3，或由SEQ ID NO：77组成，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列且包含如SEQ IDNO:43、46和48所示序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3，或由SEQ ID NO：81组成。
4.权利要求1至3中任一项的分离的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’-SH、Fv(例如scFv)或(Fab’)2片段。
5.权利要求1至4中任一项的分离的抗ROR1单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含恒定区序列，其中所述恒定区序列的至少一部分是人共有恒定区序列。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的重链恒定区包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，轻链恒定区包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任何一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中：所述重链包含如SEQ ID NO：113所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：113组成，所述轻链包含如SEQ ID NO：117所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO：117的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：117组成。
8.一种具有Ab-(L-D)n结构的抗体偶联药物，其中Ab为如权利要求1-7中任一项所述的抗ROR1的抗体或其抗原结合片段，L为接头，D为治疗活性物质或药物活性成分，n表示1-20的整数。
9.如权利要求8所述的抗体偶联药物，其中所述治疗活性物质或药物活性成分是细胞毒素、植物毒素、小分子毒素、放射性同位素。
10.如权利要求8或9所述的抗体偶联药物，其中所述治疗活性物质或药物活性成分是海兔毒素(Dolastatin)及其auristatin类衍生物，例如Dolastatin 10、Dolastatin 15、auristatin E、auristatin PE、monomethyl auristatin D(MMAD)、monomethylauristatin E(MMAE)、monomethyl auristatin F(MMAF)、auristatin F苯二胺(AFP)、auristatin EB(AEB)、auristatin EFP(AEFP)、auristatin F羟丙基酰胺(AF HPA)。
11.如权利要求8-10中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述海兔毒素(Dolastatin)及其auristatin类衍生物是MMAE、MMAF、auristatin F羟丙基酰胺或auristatin F苯二胺。
12.如权利要求8-11中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述接头是组织蛋白酶可降解的接头(例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、cBu-Cit接头和CX接头)、不可断裂接头(例如SMCC接头或MD接头)、酸敏接头、硅脂结构的接头、disulfide-carbamate接头、MC-GGFG接头、TRX接头、含半乳糖苷的接头、焦磷酸酯接头、近红外敏感的接头、紫外敏感的接头(例如PC4AP)。
13.如权利要求8-12中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述接头选自马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基(mc-vc-PAB)、乙酰基-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(AcLys-VC-PABC)、氨基PEG6-丙酰基、及马来酰亚胺己酸基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶-2-基二硫代)-丙酸酯(SPDP)。
14.如权利要求8-13中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述接头是MC-VC-PAB、SMCC或MC-GGFG。
15.如权利要求8-14中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述Ab包含
如SEQ ID NO:4、5和6所示序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3和如SEQ ID NO:43、46和48所示序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
16.如权利要求8-15中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述Ab包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区包含如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO：81所示氨基酸序列。
17.如权利要求8-16中任一项所述的抗体偶联药物，其中所述Ab包含：
如SEQ ID NO：113所示氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO：117所示氨基酸序列的轻链。
18.权利要求15-17中任一项所述的抗体偶联药物，其所述接头是MC-VC-PAB，所述细胞毒素是MMAE.
19.一种药物组合物，其包含：
(1)如权利要求1-7中任一项所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段，或如权利要求8-18中任一项所述的抗体偶联药物，以及；
(2)可药用载体。
20.一种分离的多核苷酸分子，其编码如权利要求1-7中任一项所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段。
21.一种载体，其包含权利要求20所述的核酸分子，优选地，所述载体是表达载体。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的载体或权利要求20所述的核酸分子。
23.如权利要求1-7中任一项所述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗癌症的抗体偶联药物中的用途，或在制备用于预防或治疗与ROR1异常表达相关的疾病的药物中的用途。
24.如权利要求8-18中任一项所述的抗体偶联药物在制备用于预防或治疗与ROR1异常表达相关的疾病的药物中的用途。
25.权利要求24所述的用途，其中与ROR1异常表达相关的疾病是高表达ROR1的癌症。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述高表达ROR1的癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、胃癌、头颈癌和黑色素瘤。
27.一种杀死表达ROR1的细胞或者抑制表达ROR1的细胞生长的方法，包括使所述细胞接触有效量的如权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或有效量的如权利要求8-18任一项所述的抗体偶联药物、或有效量的如权利要求19所述的药物组合物。
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