CN119371496A - 一种呼吸道合胞病毒f蛋白突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，尤其涉及呼吸道合胞病毒F蛋白突变体及其应用。所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体包括F蛋白多肽的F1亚基和/或F2亚基中的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代，和/或F蛋白信号肽部分被人免疫球蛋白轻链信号肽替代，和/或多碱基序列107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R，能够暴露更多中和抗体表位，在维持稳定的融合前构象的同时确保了其可引起对RSV亚型A和B的有效中和抗体反应和抗体结合反应，适用于以RSV F蛋白为抗原的各种疫苗形式。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体及其在制备呼吸道合胞病毒疫苗中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)是世界范围内引起婴幼儿下呼吸道严重感染的重要病原体之一。据统计，全球5岁以下儿童感染RSV人数高达3400万，由于RSV感染后无法获得持续免疫，可出现反复感染，几乎100％的婴幼儿在2岁以内感染过1次以上，并导致66000-199000例死亡。在1月至1岁儿童全因死亡的单病原感染因素分析中，RSV感染引起1岁以下患儿病死率高达6.7%，仅次于疟疾，在全球范围内造成严重的疾病负担。除婴幼儿外，免疫功能低下的成年及老年人也是RSV感染的高危人群。每年有3%~10%的成年人感冒由 RSV引起，老年人群中RSV感染引起的疾病负担与非流行季节感冒引起的疾病负担相当。感染RSV后会导致黏液分泌增加及发炎，引起心脏衰竭和继发性细菌性肺炎等多种严重的并发症。RSV也是一种重要的医源性感染病原，特别是对早产儿、先天性心脏病、支气管肺发育不良的婴儿及所有免疫功能抑制的病人具有很大的危害，对人类健康、全球医疗及经济影响巨大。因此，WHO将RSV疫苗列为二十一世纪全球应优先发展的疫苗之一，研发安全且有效的RSV疫苗是当前的迫切需求。
RSV属于副粘病毒科肺炎病毒属，为单股负链RNA病毒。其基因组全长15.2kb，转录十个基因组，共编码包括3个跨膜蛋白 (G、F和SH)、2个基质蛋白 (M和M2)、3个核衣壳蛋白(N、P和L)及2个非结构蛋白(NS1和NS2)在内的10种主要蛋白。其中黏附蛋白G和融合蛋白F是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的两个病毒蛋白。G蛋白介导病毒的结合，并决定RSV抗原的多样性，根据其抗原差异性将RSV分为A、B两个亚型；F蛋白主要负责病毒和宿主细胞膜融合，其蛋白序列在不同亚型间高度保守，在诱导免疫保护、高水平血清中和抗体中起重要作用。F蛋白诱导的中和抗体可同时抑制A和B两个亚型的RSV病毒感染，且能够诱导细胞免疫CD8+毒性T细胞应答，以清除体内病原体。因此F蛋白是RSV疫苗开发的重要抗原靶点。
RSV的F蛋白是中和抗体的主要靶标蛋白，属于I型整合膜蛋白，其前体蛋白F0由574个氨基酸组成，三个F0之间通过疏水作用形成三聚体。在病毒入侵介导膜融合过程中，前体F0会被Furin蛋白酶切割并释放出一个含有27个氨基酸的短肽P27(109~127aa)，其余两段F2及F1通过两个二硫键连接形成成熟的F蛋白，通过出芽的方式展示到细胞膜或病毒体表面。此时的F蛋白处于高能级亚稳态，十分不稳定，被称为pre-F。感染细胞后会自发变成低能态的融合后构象post-F。大量临床前及临床数据表明高中和活性的位点主要存在于融合前构象，以RSV F融合前构象为抗原的疫苗能够刺激机体产生更高水平的病毒中和抗体。虽然以pre-F为基础的 RSV疫苗展现出良好的应用前景，但维持F蛋白融合前构象也成为疫苗研发的重难点。目前为止，全球仅有GSK和辉瑞两款针对RSV F蛋白的重组蛋白类疫苗获批上市，两个产品都采用了F蛋白融合前构象，且均用于美国60岁及以上群体，但国内尚无任何相关预防性疫苗类产品上市。
因此开发一种安全性好、表达量高且稳定的融合前构象F蛋白抗原成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为解决现有技术存在的技术问题，本发明开发了一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，该突变体蛋白能够具有稳定的融合前构象和高表达量，可形成稳定的三聚体，从而可用于RSV感染的治疗。2013年，McLellan团队等人首次通过点突变的方式开发了第一个获得稳固的融合前构象F蛋白“DS-Cav1”：通过在F1片段内S155C和S290C点突变获得分子内二硫键，同时加入S190F和V207L点突变以增强关键中和表位的结合活性(DOI:10.1126/science.1243283)，该蛋白被证实可以激发显著更高水平的中和抗体滴度。目前以结构生物学为基础开发的稳定融合前构象F蛋白疫苗也已进入临床阶段。因此本发明所述重组RSVF蛋白在DS_Cav1（称为野生型）的氨基酸序列基础上引入突变，所述突变包括氨基酸的替换、缺失和插入。
本发明的第一方面提供一种呼吸道合胞病毒F蛋白，所述F蛋白包含至少一种选自以下组的突变：
(a)至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代；
(b)F蛋白信号肽部分被人免疫球蛋白轻链信号肽替代；
(c)至少两个多碱基序列的位点被替换。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括F蛋白多肽的F1亚基和/或F2亚基中的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代。
在一些实施方式中，所述半胱氨酸取代使得所述F蛋白的F1亚基和F2亚基之间形成非天然二硫键连接，所述非天然二硫键包括除F1亚基和F2亚基之间形成的Cys69-Cys212和Cys37-Cys439之外的二硫键。
在RSV F蛋白融合前构象中，β2与β4链之间彼此靠近，促进0表位两个不连续表位的空间折叠；通过添加非天然二硫键可以相对稳定β2与β4链之间空间位置，以增强融合前F1亚基和F2亚基之间的结构稳定性，阻止七肽重复区HRA和HRB区域构象变化，很好的稳定Pre-F蛋白结构，同时维持或增强0表位和V表位等重要位点的结合活性，提高突变抗原的融合前F蛋白特异性免疫原性。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括102C+147C，102C+149C，102C+150C，101C+147C，101C+146C，100C+145C中的至少一对半胱氨酸突变，突变位点参考如SEQ ID NO:01所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列的位点。
在一些实施方式中，被人免疫球蛋白轻链信号肽取代的所述F蛋白信号肽部分至少包括SEQ ID NO:1所示序列的第1~25位氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述人免疫球蛋白轻链信号肽如SEQ ID NO:2所示。
野生型F蛋白首先形成F0前体蛋白，经弗林蛋白酶切割后释放出一个由27个氨基酸组成的多肽pep27，其余两段F2和F1通过两个二硫键连接形成成熟的F蛋白-pre-F，通过出芽的方式展示到细胞膜或病毒体表面。
在一些实施方式中，为了提高F蛋白内部p27多肽的移除效率，F蛋白上的两个多碱基位点被替换。
在一些实施方式中，所述F蛋白内部的p27多肽至少包括野生型呼吸道合胞病毒F蛋白的110~136位氨基酸残基。
在一些实施方式中，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变102C+147C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变102C+149C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变102C+150C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变101C+147C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变101C+146C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括半胱氨酸突变100C+145C，所述F蛋白信号肽部分被如SEQ ID NO:2所示的人免疫球蛋白轻链信号肽替代，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括选自SEQ ID NO:3-8任一所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述F蛋白包括蛋白酶切割位点序列，例如HRV 3C酶切割位点(LEVLFQGP)或蛋白标签，诸如6×His-标记(HHHHHH)和Strep tag-II标签(WSHPQFEK)，所述序列不是RSV F蛋白的功能(例如诱导免疫应答反应)所必需。
本发明的另一方面提供一种重组核酸，包括编码如前所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的核苷酸序列。
在一些实施方式中，对重组核酸进行密码子优化以在选定的原核或真核宿主细胞中表达。
本发明的另一方面提供一种表达载体，包括如前所述的重组核酸。
本发明的另一方面提供一种宿主细胞，包括如前所述的重组核酸或所述的表达载体。
在一些实施方式中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选地，所述哺乳动物细胞选自ExpiCHO、VERO和Expi293等。
本发明的另一方面提供一种制备如前所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，所述方法包括：
S1：在适合所述呼吸道合胞病毒F蛋白表达的条件下培养如前所述的宿主细胞；
S2：收集表达产物，并对所述表达产物进行纯化，得到所述呼吸道合胞病毒F蛋白。
本发明的另一方面还提供了所述的呼吸道合胞病毒F蛋白在制备预防呼吸道合胞病毒感染疫苗中的应用。
本发明还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，包括如前所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，或如前所述的制备方法制备得到的呼吸道合胞病毒F蛋白，和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所述重组RSV F蛋白60~120ug。在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所述重组RSV F蛋白优选60ug。在一些实施方式中，所述单剂人用疫苗中含有所属重组RSV F蛋白优选120ug。
在一些实施例中，所述载体或赋形剂包含缓冲剂。药学可接受载体和赋形剂是本领域公知的，并且可以由本领域技术人员进行选择。包括但不限于：PH调节剂(如磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(如阳离子、阴离子或者非离子型表面活性剂)，佐剂，增溶剂，稳定剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。本领域技术人员可以选择合适的赋性剂和载体以产生适合通过选定的使用途径向受试者施用的配制剂。药学上可接受的载体可以是无菌液体，如水和油，包括源自石油、动物、植物或合成的油。合适的赋性剂包括但不限于甘油、聚乙二醇以及钙离子、镁离子、锌离子和其他二价阳离子相关盐等。
在一些实施方式中，所述疫苗进一步包括佐剂。
在一些实施例中，所述佐剂包括铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG以及QS-21中的至少一种。
通常在佐剂选择时应能够在接受疫苗施用的受试者或受试者群体中增强Th1偏向性免疫应答，且在受试者或受试者群体中是安全且有效的。
任选地，疫苗还可以包含与RSV不同的病原性生物体的至少一种其他的抗原，例如，病原性生物体是与RSV不同的病毒，诸如带状疱疹病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、冠状病毒或流感病毒。或者病原性生物体可以是细菌，诸如白喉、破伤风或肺炎球菌等。
本发明还提供制备上述预防RSV感染的疫苗的方法，具体包括：将纯化后的F蛋白与佐剂按比例单独包装或充分混匀。
在一些实施例中，所述方法还包括基因合成、表达载体构建、纯化蛋白冻干等额外步骤。可以通过本领域公知的许多方法的任一种或几种来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的重组RSV F蛋白，包括硫酸铵沉淀、过滤、超滤、亲和层析、阴/阳离子交换层析、疏水性相互作用层析等。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
本发明通过对野生型RSV F蛋白进行多种氨基酸的替代和缺失，获得了能够暴露更多中和抗体表位的RSV F蛋白融合前构象，在维持稳定的融合前构象的同时确保了其可引起对RSV亚型A和B的有效中和抗体反应和抗体结合反应。并且本发明使用重组RSV F蛋白作为免疫原联合佐剂，获得了更强的免疫诱导效力，不仅提高体液免疫应答，还强效地刺激Th1型免疫，大大提升了RSV抗原的免疫原性。本发明公开的突变方式适用于人RSV的其他病毒株；适用于以RSV F蛋白为抗原的各种疫苗形式，如重组蛋白疫苗、核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗和载体疫苗等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为pCAGGS质粒图谱。
图2为免疫印迹法(Western blot)检测F蛋白突变体的表达结果。
图3为F蛋白突变体HN108-05和对照蛋白Ds_Cav1经纯化后蛋白在还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果。
图4为免疫印迹法(Western blot)检测F蛋白与Furin蛋白酶共表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明中做进一步的阐述：
便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例一：通过半胱氨酸取代引入二硫键稳定F蛋白融合前构象的突变体设计与基因合成：
通过观察呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的空间结构，根据结构生物学原理设计可稳定融合前构象的氨基酸突变。以野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白(Ds_Cav1)的氨基酸序列（SEQ ID No. 01）为模板，通过半胱氨酸取代引入二硫键，以增强融合前F1亚基和F2亚基之间的结构稳定性以阻止七肽重复区HRA和HRB区域的构象转变，同时维持或增强Φ表位和V表位等重要位点的结合活性，提高突变抗原的融合前F蛋白特异性免疫原性。为促进F蛋白分泌性表达，将F蛋白信号肽（1～25aa）替换为人免疫球蛋白轻链信号肽“MRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID No .02)”。为了提高F蛋白内部p27多肽的移除效率（110～136aa），F蛋白上的两个多碱基位点（RARR109 和 KKRKRR134）被替换为（RRRR107 和KKRRRR134）。基于原序列DS_Cav1，共设计了6种蛋白变体，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3,4，5，6，7和8所示。
将按下表设计的F蛋白变体核苷酸序列提交北京擎科生物科技有限公司，按照宿主Expi293F细胞进行密码子优化确定核酸序列，并将其插入真核表达pCAGGS(质粒图谱见图1，购买自北京擎科生物科技有限公司，序列如SEQID NO.9所示)序列中，进行全基因合成。
表1 通过半胱氨酸取代引入二硫键及多碱基位点替换的突变体设计，详细序列见SEQ ID No.03～No.08。
表1.半胱氨酸取代引入二硫键及多碱基位点替换的突变体设计
实施例二：重组F蛋白表达和初步筛选：
1.细胞转染及生长曲线监测：
将通过基因工程技术合成的表达载体，进行克隆转化和质粒大提后用于转染Expi293细胞进行重组蛋白表达。处于对数生长期的Expi293细胞转染前一天进行高密度传代，活细胞密度为2-3×106/mL。细胞生长过夜后，将细胞密度稀释至3×106/mL。每孔取2.5mL细胞悬液用于转染。每孔使用2ul DNA，用Opti-MEM培养基稀释并轻轻混匀，然后立即向稀释后的DNA中轻柔的滴加8ul PEI40000，室温静置10-20min以制备DNA复合物。孵育结束后将DNA复合物逐滴滴加到待转染的细胞液中，并转移至37℃含8%CO2的摇床中以225rpm的转速进行培养。转染18-22h后加入500ul补料并继续培养。表2显示了转染不同蛋白变体期间，细胞的活率及密度变化情况。
表2. 转染不同蛋白变体期间细胞活率及密度变化情况
不同F蛋白突变体表达鉴定：
2.1 Western Blot法检测不同蛋白变体的表达：
(1) 培养至第3天，4℃ 4700rpm离心40min收集细胞培养上清，并用0.22um的滤膜过滤除菌。
(2)样品中加入β巯基乙醇及Loading buffer，100℃热变性10min，细胞上清电泳样品上样量为25μl/孔，对照组纯化后的DS_Cav1蛋白上样5ug，120V的电压，电泳60分钟。
(3)电泳完成后，用干转的方法将蛋白转印到PVDF膜上，并用含5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭2小时。
(4)His鼠源单克隆抗体用TBS缓冲液以1：2000稀释，将PDVF膜转移到稀释好的抗体中，4℃孵育过夜。
(5)隔天用TBST清洗三次，每次5min。
(6)用含5％脱脂奶粉的TBS稀释HRP-Goat anti Mouse二抗，将PVDF膜转移到稀释好的二抗中，室温摇床孵育1h。
(7)用TBST清洗三次，每次10min，加入底物显色液，避光显色10min并拍照。
(8)如图2所示，Western Blot分析F蛋白突变体在Expi293细胞上的表达水平。检测抗体为His tag。图中第一泳道为Marker， 第二泳道为对照的融合前F蛋白Ds_Cav1，第三至八泳道为F蛋白突变体HN108-01至HN108-06。
2.2 双夹心ELISA检测不同蛋白变体的表达量：
基于Western Blot的结果，以D25(D25抗体能够特异性识别呼吸道合胞病毒融合前构象的F蛋白)作为包被抗体，MPE8作为标记抗体检测配对，进一步检测各突变体表达量情况。具体步骤如下所示：
抗体包被：将D25抗体用包被液稀释至100ng/ml，100μl/孔加入酶标板孔中，4℃包被过夜。
封闭：洗板300μl/孔，2次清洗拍干，加封闭液300μl/孔、37℃孵育2小时。
加样：洗板2次，加入倍比稀释的标准品及待检样品，100μl/孔，室温孵育1.5h。
一抗孵育：洗板5次后，加入终浓度为100ng/mL的检测抗体MPE8，100μl/孔，室温孵育1.5h。
二抗孵育：洗板5次，加入HRP标记的抗IgG抗体100μl/孔，室温孵育1h。
显色：加入显色液100μl/孔，室温避光反应15分钟。
读数：提前打开酶标仪，显色完全后酶标板反应孔中加入终止液50μl/孔，置于酶标仪(450nm)读数，结果以OD值表示。结果如表3所示：
表3 ELISA检测不同突变体的表达量结果
经综合考量表达量，半胱氨酸取代的突变体pHN108-03、pHN108-04、pHN108-05及pHN108-06表现较优，具有与野生型DS_Cav1蛋白相当的表达量。且在其余突变设计均相同的情况下，引入101C-146C突变的pHN108-05，可在一定程度提升蛋白表达量，可用于下一步的筛选和评价。
实施例三：重组preF蛋白制备和蛋白稳定性检测：
蛋白大量表达：
通过使用PEI40000在Expi293F细胞中瞬时转染来表达重组蛋白DS_Cav1和pHN108-05。转染前一天将对数生长期的Expi293F细胞进行高密度传代，按2.5×106 /ml细胞密度接种于1L摇瓶中。 转染当天将细胞密度稀释至3×106 /ml，使用Opti-MEM稀释表达质粒DNA，然后立即向混匀后的DNA中加入转染试剂PEI40000并混匀，室温静置15min。将DNA-PEI复合物加入细胞中，置于37℃，8% CO2，125rpm的二氧化碳摇床中培养。在转染后第4天4700rpm离心40min，收集细胞培养上清。0.22um过滤除菌后，通过StrepII亲和层析法纯化蛋白。
蛋白纯化：
准备30mL的重力柱，细胞上清过滤除杂以防堵塞柱子。使用一步亲和层析法对大量表达的重组蛋白进行纯化。
装柱：取一支空柱，将下垫片压制柱底部并压实，用去离子水冲洗垫片，待水从下出口流出后马上关闭下出口；将树脂悬浮起来，用枪取适量浆液加入柱中(保存液与填料比是1：1)，打开下出口流干保护液；加入适量去离子水润洗柱料，待柱料流干后关闭下出口；装入上垫片，确保垫片与柱料无空隙，注意不可用力要垫片，防止损坏柱料。
平衡：用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同缓冲体系下。
结合：取适量样品悬浮平衡好的填料，并将样品填料混合物转移至全部样品中，4℃摇床结合过夜。
上样：将样品加入平衡好的柱子中，期间可以多次上样增加结合效率并收集流穿液。
平衡/洗杂：用10倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性结合的杂蛋白，收集洗杂液。
洗脱：再用5倍柱体积的洗脱液进行洗脱目的蛋白，分管收集。
浓缩换液：收集后的蛋白样品用30kDa超滤管进行浓缩换液。
定量：将浓缩后的蛋白混匀后对其进行UV280nm定量，并取出少量蛋白进行电泳检测，检测结果如图3所示，其余分装后置于-80℃冻存。
双抗体夹心ELISA检测纯化蛋白表达量稳定性：
取纯化后的蛋白分装成50ul/管，每组各取2管，分别避光在4℃放置0d、7d、14d和28d，再采用双抗体夹心ELISA法，以D25作为包被抗体，MPE8作为标记抗体检测配对，检测pDs-Cav1和突变体pHN108-05纯化后蛋白在4℃孵育不同时间后的表达量变化。其中，表达量以表位特异性中和抗体检测活性浓度表示，结果如表4所示：
表4 突变体与野生型的表达量对比结果
SEC-HPLC检测纯化蛋白结构稳定性：
为分析所设计的蛋白突变体结构的稳定性，本发明采用体积排阻色谱法(SEC-HPLC)，对纯化后的样品进行分离和检测，根据色谱峰峰面积计算主峰的相对比例。分别测定了对照样品pDs_Cav1和突变体pHN108-05纯化后样品在4℃放置不同时间后的SEC纯度，具体实施方法为：色谱柱为TSKgel G3000SWXL (7.8*300mm 5μm)，检测波长为280nm，流动相为磷酸盐缓冲液，流速为0.6ml/min，进样量12μg，等度洗脱15min。其中供试品溶液的配制如下：空白溶液：取0.5ml Buffer至进样瓶中，备用；取200μl样品加入进样瓶中的内衬管中，将气泡排除，备用。经检测证实本发明所述突变体为三聚体构象，且纯化后抗原色谱检测均为单一蛋白峰，满足纯度要求，检测三聚体相对比例结果如表5所示。
表5 突变体与野生型的三聚体检测结果
经综合考量表达量和结构稳定性，半胱氨酸取代的突变体pHN108-05表现较优。与野生型DS-Cav1相比，在4℃条件下储存28天后D25检测活性浓度下降不明显或未发生下降，融合前构象保留率与DS-Cav1相当或具有更高的稳定性。
实施例四：小鼠免疫和中和抗体检测：
动物免疫：
选择6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫，随机分组，6只/组，分别为阴性对照组、HN108-05+HA201组、HN108-05+HA208组、Ds-Cav1+HA201组、Ds-Cav1+HA208组，具体分组及编号如表6所示。阴性对照组动物给予PBS缓冲液；供试品组分别给予含10μg目的蛋白配伍25μL HA201或HA208佐剂。免疫方式为后肢肌肉注射，注射体积为100ul/剂/只。每只小鼠免疫2次，免疫间隔为3周。在第二次免疫后两周分别对各组小鼠进行采血，采集的血清储存于-20℃，后续进行中和抗体检测。
表6 免疫小鼠分组及编号
中和抗体检测：
具体实施步骤为:(1)免疫后血清于56℃水浴孵育30min；(2)灭活后的血清样本以适当倍数起始，用含2%FBS的DMEM培养基在96孔板中3倍梯度稀释，共6个梯度，每个样本4个复孔；(3)将50-100 PFU的RSV A2和RSV B毒株分别添加至孔中，混匀后于37℃，5%CO2条件下孵育1h；(4)将病毒与血清混合液转移至预先接种Hep-2细胞的96孔板中，37℃、5%CO2条件下培养5-10天;（5）观察细胞病变，应用Reed-Muench计算中和抗体滴度，中和抗体滴度定义为有50%以上完整Hep-2细胞的最高血清稀释度。
如表7和表8结果显示，与阴性对照PBS组相比，各实验组别小鼠第二次免疫后两周的血清均能诱导较高水平的中和抗体，且各试验组别小鼠二免后三周的血清均能高效中和A型和B型野生型活病毒在体外细胞中的复制。其中本发明的候选抗原HN108-05+佐剂HA201诱导产生的中和抗体几何平均滴度与 HN108-05+佐剂HA208水平相当，HN108-05+HA208略高于HN108-05+HA201，但没有显著性差异，但二者诱导产生的中和抗体几何平均滴度均显著高于DS-Cav1+HA201和DS-Cav1+HA208。
表7 血清中和抗体滴度检测结果（A型）
表8 血清中和抗体滴度检测结果（B型）
综上所述，本发明所提供的RSV F蛋白突变体HN108-05相对于DS-Cav1来说，能够诱导更高水平的中和抗体滴度，且其作为疫苗产品使用时能够诱导产生针对A/B两种毒株的交叉保护。
实施例五：共表达弗林酶蛋白促进F蛋白表达：
细胞转染及生长曲线监测：
Furin蛋白酶是pre-F成熟的加速剂，在细胞发育过程中将Furin表达框整合到载体上，可进一步提高F蛋白的产量。研究发现可能是由于使用了不同启动子的原因，若共表达Furin蛋白酶和F蛋白，可实现更高水平的表达量。基于该研究及以上突变体的筛选结果，分别将Furin蛋白酶与对照蛋白Ds_Cav1、突变体pHN108-05共转染Expi293细胞。具体实施方案如表9所示：
表9 共表达弗林酶实施方案
2.共表达弗林蛋白酶对重组F蛋白表达量的影响：
2.1 Western Blot检测共表达上清样品F蛋白的表达情况：
(1) 培养至第3-4天，4℃ 4700rpm离心40min收集细胞培养上清，并用0.22um的滤膜过滤除菌。
(2)样品中加入β巯基乙醇及Loading buffer，100℃热变性10min，细胞上清电泳样品上样量为10μl/孔，对照组纯化后的DS_Cav1蛋白上样3ug，120V的电压，电泳60分钟。
(3)电泳完成后，用干转的方法将蛋白转印到PVDF膜上，并用含5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭2小时。
(4)抗RSV F蛋白单克隆抗体用TBS缓冲液以1：2000稀释，将PDVF膜转移到稀释好的抗体中，4℃孵育过夜。
(5)隔天用TBST清洗三次，每次5min。
(6)用含5％脱脂奶粉的TBS稀释HRP-Goat anti Rabbit二抗，将PVDF膜转移到稀释好的二抗中，室温摇床孵育1h。
(7)用TBST清洗三次，每次10min，加入底物显色液，避光显色10min并拍照。
(8)如图4所示，Western Blot分析F蛋白突变体在Expi293细胞上的表达水平。检测抗体为抗RSV F蛋白。图中第一泳道为235KDa的蛋白Marker， 第二泳道为阴性对照空载pCAGGS，第三泳道为对照样品纯化后蛋白Ds_Cav1，第四至七泳道为HN108-05和Ds_Cav1未加和加Furin蛋白酶的表达情况。
3.双抗体夹心ELISA检测共表达上清样品F蛋白的表达情况：
基于Western Blot的结果，以D25(D25抗体能够特异性识别呼吸道合胞病毒融合前构象的F蛋白)作为包被抗体，MPE8作为标记抗体检测配对，进一步检测对照样品DS_Cav1及突变体pHN108-05分别与Furin共转表达后，pre-F蛋白的表达量变化情况，结果如表10所示。
表10 与Furin共转表达后突变体与野生型的表达量：
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。
Claims (15)
1.一种呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包含至少一种选自以下组的突变：
(a)至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代；
(b)F蛋白信号肽部分被人免疫球蛋白轻链信号肽替代；
(c)至少两个多碱基序列的位点被替换。
2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括F蛋白多肽的F1亚基和/或F2亚基中的至少一对氨基酸残基被半胱氨酸取代。
3. 根据权利要求2所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括102C+147C，102C+149C，102C+150C，101C+147C，101C+146C，100C+145C中的至少一对半胱氨酸突变，突变位点参考如SEQ ID NO:01所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列的位点。
4.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，被人免疫球蛋白轻链信号肽取代的所述F蛋白信号肽部分至少包括SEQ ID NO:1所示序列的第1~25位氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白轻链信号肽如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，与如SEQ ID NO:1所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列相比，所述F蛋白的多碱基序列RARR和KKRKRR中107位丙氨酸A突变为精氨酸R，134位赖氨酸K突变为精氨酸R，
任选地，所述F蛋白包括6×His和Strep tag-II标签。
7.根据权利要求1-6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括选自SEQ ID NO:3-8任一所示的氨基酸序列。
8.一种重组核酸，包括编码如权利要求1-7任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的核苷酸序列。
9.一种表达载体，包括权利要求8所述的重组核酸。
10.一种宿主细胞，包括如权利要求8所述的重组核酸或权利要求9所述的表达载体。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
12.一种制备如权利要求1-7任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1：在适合所述呼吸道合胞病毒F蛋白表达的条件下培养如权利要求10或11所述的宿主细胞；
S2：收集表达产物，并对所述表达产物进行纯化，得到所述呼吸道合胞病毒F蛋白。
13.如权利要求1-7任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，或如权利要求12所述的制备方法制备得到的呼吸道合胞病毒F蛋白在制备预防呼吸道合胞病毒感染疫苗中的应用。
14.一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，包括如权利要求1-7任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，或如权利要求12所述的制备方法制备得到的呼吸道合胞病毒F蛋白，和药学上可接受的载体或赋形剂。
15.如权利要求14所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗进一步包括佐剂，所述佐剂包括铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG以及QS-21中的至少一种。
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