CN119326910A - 一种胰腺靶向脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种胰腺靶向脂质体及其制备方法与应用，涉及纳米材料技术领域，旨在解决现有药物靶向胰腺效率较低的技术问题。所述胰腺靶向脂质体由氢化卵磷脂、胆固醇、适配体、脂溶性药物和中性溶液组成；所述脂溶性药物包括辅酶Q10和姜黄素中的至少一种，所述中性溶液包括PBS、水、生理盐水、多肽的PBS溶液、多肽的水溶液和多肽的生理盐水溶液中的至少一种；所述多肽包括艾塞那肽和司美格鲁肽中的至少一种。

Description

一种胰腺靶向脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本申请涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种胰腺靶向脂质体及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病是四大非传染病之一，根据国际糖尿病联合会(IDF),预计2030年糖尿病患者将达到6.43亿，到2045年，世界上患糖尿病的人数可达7.83亿。二型糖尿病占糖尿病病例的90％。全球每年用于糖尿病治疗的费用高昂，尽管如此，每年仍有数百万糖尿病患者死亡。

因此，二型糖尿病的高效治疗不仅对广大患者，乃至整个社会的发展都具有极其重要的意义；故亟需研发出一种具有高效针对性的靶向胰腺药物。

发明内容

本申请提供了一种胰腺靶向脂质体及其制备方法与应用，旨在解决现有药物靶向胰腺效率较低的技术问题。

为解决上述技术问题，本申请实施例提供了：一种胰腺靶向脂质体，所述胰腺靶向脂质体由氢化卵磷脂、胆固醇、适配体、脂溶性药物和中性溶液组成；所述中性溶液包括PBS、水、生理盐水、多肽的PBS溶液、多肽的水溶液和多肽的生理盐水溶液中的至少一种；所述多肽包括艾塞那肽和司美格鲁肽中的至少一种；所述脂溶性药物包括辅酶Q10和姜黄素中的至少一种。

作为本申请一些可选实施方式，所述适配体的序列为(5'to 3')：CGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT，5'端修饰Cholesteryl，3'端修饰FAM。

作为本申请一些可选实施方式，所述氢化卵磷脂和所述胆固醇的摩尔比为(1.5-4)：1，脂溶性药物和脂质的质量比为1：(10～30)，所述脂质是指氢化卵磷脂和胆固醇。

作为本申请一些可选实施方式，所述多肽和所述脂溶性药物的质量比为2：5，所述脂溶性药物和所述脂质的质量比1：10或1：30，所述氢化卵磷脂和所述胆固醇的摩尔比为(1.5-2)：1。

另一方面，本申请实施例还提供了：一种如上所述胰腺靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：

将氢化卵磷脂、胆固醇和脂溶性药物混合，溶于有机溶剂中，蒸干处理后得到磷脂薄膜；

在所述磷脂薄膜中加入中性溶液进行水化处理，加入适配体溶液，超声处理，得到脂质体溶液。

作为本申请一些可选实施方式，所述水化处理为37℃～50℃；所述超声处理是指在超声功率为100W，每超声2s停3s后继续超声，超声总时间为10分钟～20分钟。

作为本申请一些可选实施方式，所述水化处理的温度为40℃或50℃，所述超声总时间为15分钟。

作为本申请一些可选实施方式，所述蒸干处理是指：37℃，20rpm/min旋蒸除去有机溶剂，蒸干时间为20min；

所述有机溶剂是指氯仿。

作为本申请一些可选实施方式，所述水化处理的转速为120rpm/min，常压，40℃～50℃水化15分钟～20分钟。

另一方面，本申请实施例还提供了：一种胰腺靶向脂质体的应用，应用于制备靶向胰腺的药物。

与现有技术相比，本申请的技术方案具有以下有益技术效果：

本申请所述胰腺靶向脂质体，可有效提高多肽在血液循环系统中的稳定性，提高药物半衰期，改善治疗效果。改善了脂溶性药物的水溶性，可有效提高其利用率，改善治疗效果。本申请构建的载体系统，可实现主动靶向性，有效提高药物在目标组织的药物浓度，同时促使药物分布到胰腺，改善胰岛的氧化应激，恢复胰岛的功能。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt的粒径分布图。

图2是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt的透射电镜图。

图3是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt作用于糖尿病小鼠的离体成像图。

图4是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响结果图。

图5是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数的影响结果图。

图6是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠肝脏MDA含量的影响结果图。

图7是本申请实施例4所述(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠肝脏SOD活性的影响结果图。

图8是本申请实施例2所述Cur-Lip-Apt的粒径分布图。

图9是本申请实施例2所述Cur-Lip-Apt的透射电镜图。

图10是本申请实施例2所述Cur-Lip-Apt作用于糖尿病小鼠的离体成像图。

图11是本申请实施例2所述Cur-Lip-Apt对糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响结果图。

图12是本申请实施例2所述Cur-Lip-Apt对糖尿病小鼠肝脏TC的影响结果图。

图13是本申请实施例5所述(S+Q)-Lip-Apt的粒径分布图。

本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

高糖状态下，β细胞会发生氧化应激失衡，损害细胞抗氧化酶SOD、GPH-Px以及CAT活性。氧化应激和炎症会损害胰岛功能，过量ROS可以导致包括GLUT-4等在内的胰岛素信号转导发生损害，导致胰岛素分泌降低和胰岛素抵抗。反过来氧化应激又可以损伤并造成胰岛β细胞凋亡。由此可见，氧化应激诱导胰岛β细胞功能受损是糖尿病发病的重要原因。

脂质体是由磷脂和胆固醇合成的排列有序的单层或多层囊泡，可用于包裹水溶性药物或脂溶性药物。和其他纳米材料相比。脂质体的组成成分与细胞膜相似，具有较高的生物相容性和较低的毒性，脂质体具有独特的双分子层结构，能够同时传递水溶性药物和脂溶性药物。提高药物在体内的稳定性。

适配体易于合成，特异性高，易于简单修饰，可用石墨烯辅助的指数富集的配体系统进化技术(SELEX)技术合成。适配体可以通过各种接合方式灵活地锚定到各种纳米载体上。通过在适配体上修饰胆固醇，有利于提高适配体的稳定性，有利于适配体锚定到脂质体上，实现脂质体的主动靶向作用。

本申请构建了一个具有主动靶向性能的纳米传递系统。通过后插入法将适配体与脂质体连接，得到具有靶向功能的脂质体。

为了进一步说明本申请，以下结合实施例对本申请提供的靶向脂质体的制备方法及应用进行详细描述。

实施例1靶向辅酶Q10脂质体(CoQ10-Lip-Apt)

S1.称取60.0mg氢化卵磷脂、15.22mg胆固醇和7.52mg辅酶Q10(氢化卵磷脂和胆固醇的摩尔比为2：1，药脂质量比为1：10)，溶于三氯甲烷中，在真空旋转蒸发仪中除去三氯甲烷，得到磷脂薄膜。除去三氯甲烷旋转速度为20rpm/min，温度为37℃，时间为20min。

S2.往磷脂薄膜中加入10mLPBS，常压50℃，120rpm/min，旋转水化20min将磷脂薄膜进行完全水化处理，得到脂质体初溶液。

S3.配置100μM适配体溶液，取上述100μM适配体溶液10μL加入脂质体初溶液中，避光、冰浴探头超声，得到辅酶Q10脂质体溶液。探头超声时间为15min，超声功率为100W(超2s停3s)。

实施例2靶向姜黄素脂质体(Cur-Lip-Apt)

S1.称取104.4mg氢化卵磷脂、34.8mg胆固醇和4.64mg姜黄素(氢化卵磷脂和胆固醇的摩尔比为1.5：1，药脂质量比为1：30)溶于三氯甲烷中，在真空旋转蒸发仪中除去三氯甲烷，得到磷脂薄膜。除去三氯甲烷旋转速度为20rpm/min，温度为37℃，时间为20min。

S2.往磷脂薄膜中加入10mL生理盐水，常压40℃，120rpm/min，旋转水化20min将磷脂薄膜进行完全水化处理，得到脂质体初溶液。

S3.配置100μM适配体溶液，取上述100μM适配体溶液10μL加入脂质体初溶液中，避光、冰浴探头超声，得到姜黄素脂质体溶液。探头超声时间为15min，超声功率为100W(超2s停3s)。

实施例3靶向艾塞那肽脂质体(Ext-4-Lip-Apt)

S1.称取60.0mg氢化卵磷脂、15.22mg胆固醇(氢化卵磷脂和胆固醇的摩尔比为2：1)，溶于三氯甲烷中，在真空旋转蒸发仪中除去三氯甲烷，得到磷脂薄膜。除去三氯甲烷时的旋转速度为20rpm/min，温度为37℃，时间为20min。

S2.配置0.3mg/ml艾塞那肽的PBS溶液，取上述艾塞那肽溶液10ml，加入磷脂薄膜水化，常压50℃，120rpm/min，旋转水化20min将磷脂薄膜进行完全水化处理，得到脂质体初溶液。

S3.配置100μM适配体溶液，取上述100μM适配体溶液10μL加入脂质体初溶液中，避光、冰浴探头超声，得到靶向艾塞那肽脂质体溶液。探头超声时间为15min，超声功率为100W(超2s停3s)。

实施例4靶向共载艾塞那肽和辅酶Q10脂质体((E+Q)-Lip-Apt)

S1.称取60.0mg氢化卵磷脂、15.22mg胆固醇和7.52mg辅酶Q10(氢化卵磷脂和胆固醇的摩尔比为2：1，药脂质量比为1：10)，置于500ml茄形瓶中，加入15ml三氯甲烷中，水浴超声溶解完全后，在真空旋转蒸发仪中除去三氯甲烷，得到磷脂薄膜。除去三氯甲烷时的旋转速度20rpm/min，温度37℃，时间为20min。

S2.配置0.3mg/ml艾塞那肽的PBS溶液，取上述艾塞那肽溶液10ml，加入磷脂薄膜中水化得到脂质体初溶液。水化时温度50℃，旋转速度120rpm/min，时间20min，常压水化，得到脂质体初溶液。

S3.配置100μM适配体溶液，取上述100μM适配体溶液10μL加入脂质体初溶液中，冰浴、避光100W(超2秒停3秒)探头超声15min，最终得到共载艾塞那肽和辅酶Q10脂质体溶液。

实施例5靶向共载司美格鲁肽和辅酶Q10脂质体((S+Q)-Lip-Apt)

S1.称取60.0mg氢化卵磷脂、15.22mg胆固醇和7.52mg辅酶Q10(氢化卵磷脂和胆固醇的摩尔比为2：1，药脂质量比为1：10)，置于500ml茄形瓶中，加入15ml三氯甲烷中，水浴超声溶解完全后，在真空旋转蒸发仪中除去三氯甲烷，得到磷脂薄膜。除去三氯甲烷时的旋转速度20rpm/min，温度37℃，时间为20min。

S2.配置0.3mg/ml司美格鲁肽的PBS溶液，取上述司美格鲁肽溶液10ml，加入磷脂薄膜中水化得到脂质体初溶液。水化时温度50℃，旋转速度120rpm/min，时间20min，常压水化，得到脂质体初溶液。

S3.配置100μM适配体溶液，取上述100μM适配体溶液10μL加入脂质体初溶液中，冰浴、避光100W(超2秒停3秒)探头超声15min，最终得到共载司美格鲁肽和辅酶Q10脂质体溶液。

实验例1(E+Q)-Lip-Apt的表征

粒径及分布的测定：将脂质体稀释10倍，用粒度分析仪测定脂质体的粒径及其分布、多分散指数(PDI)及Zeta电位。

包封率的测定：

辅酶Q10包封率(EE％)：通过低速离心将游离的辅酶Q10和载药脂质体分离。移取脂质体上清，加入甲醇破乳，测定上清的药物浓度进而计算上清中的药物质量，即被包封的药物质量。取等量的脂质体溶液，加入甲醇破乳，测定总的药物浓度进而计算总药物质量，按照以下公式计算辅酶Q10包封率：

包封率(％)＝被包封的药物质量/总药物质量*100％

艾塞那肽包封率(EE％)：艾塞那肽为水溶性大分子物质，普通离心方法难以分离，适合用超滤离心法进行分离。用BCA法对多肽进行定量。用50kd超滤管，4℃，高速离心分离游离多肽和脂质体。收集下层管滤液测定浓度并计算药物质量为m_游离，取未离心的脂质体溶液，破乳测定总多肽浓度并计算其总药物质量为m_总。按照以下公式计算包封率：

艾塞那肽包封率(％)＝(1-m_游离/m_总)*100％

适配体修饰率(CE％)：在适配体的末端修饰荧光基团FAM，用50kd超滤管低温高速离心分离游离适配体和被修饰脂质体。下层为游离适配体溶液，收集超滤管上层溶液，测定其荧光强度，即为被修饰的脂质体荧光强度，取等量脂质体溶液测定总荧光强度。按照以下公式计算修饰率：

适配体修饰率(％)＝被修饰脂质体的荧光强度/总荧光强度*100％

TEM分析：用透射电子显微镜(TEM)检查脂质体的微观形貌。

表1：(E+Q)-Lip-Apt的表征结果

如图1所示，为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt的粒径分布图；图2为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt的透射电镜图。

实验例2(E+Q)-Lip-Apt的体内研究

动物：雄性C57BL/6小鼠，购自珠海百试通生物科技有限公司。

本实验例构建HFD/STZ二型糖尿病动物模型。每组8-10只小鼠。

正常对照组(CON)：正常小鼠；

模型组(DM)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠；

阳性对照组(DM+EXT-4)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠，每日注射艾塞那肽，共8周；

实验组(DM+(E+Q)-Lip-Apt)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠，每日注射双载药脂质体(用实施例4步骤制得)，共8周。

给药结束后收集小鼠血清，取肝脏进行固定或匀浆，测定其生化指标，并进行体外成像。

如图3所示，为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt作用于糖尿病小鼠的离体成像图，图4为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响结果图，图5为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数的影响结果图，图6为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠肝脏MDA含量的影响结果图，图7为实施例4中(E+Q)-Lip-Apt对糖尿病小鼠肝脏SOD活性的影响结果图。

实验例3Cur-Lip-Apt的表征

粒径及分布的测定：将脂质体稀释10倍，用粒度分析仪测定脂质体的粒径及其分布、多分散指数及Zeta电位。

包封率的测定：

姜黄素包封率(EE％)：通过低速离心将游离的姜黄素和载药脂质体分离。移取脂质体上清，加入甲醇破乳，测定上清的药物浓度进而计算被包封的药物质量。取等量的脂质体溶液，破乳，测定总的药物浓度进而计算总药物质量，按照以下公式计算姜黄素包封率：

包封率(％)＝被包封的药物质量/总药物质量*100％

适配体修饰率(CE％)：在适配体的末端修饰荧光基团FAM，用50kd超滤管低温高速离心分离游离适配体和被修饰脂质体。收集超滤管下层溶液，测定其荧光强度，为游离适配体荧光强度，取等量脂质体溶液测定总荧光强度。按照以下公式计算修饰率：

适配体修饰率(％)＝(1-游离适配体荧光强度/总荧光强度)*100％

TEM分析：用透射电子显微镜(TEM)检查脂质体的微观形貌。

表2：(Cur)-Lip-Apt的表征结果

如图8所示，为实施例2中Cur-Lip-Apt的粒径分布图；如图9所示，为实施例2中Cur-Lip-Apt的透射电镜图。

实验例4Cur-Lip-Apt的体内研究

动物：雄性C57BL/6小鼠，购自珠海百试通生物科技有限公司。

本实验例构建HFD/STZ二型糖尿病动物模型，每组6-8只小鼠。

正常对照组(CON)：正常小鼠；

模型组(DM)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠；

姜黄素对照组(DM+Cur)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠，每日注射姜黄素，共6周；

实验组(DM+Cur-Lip-Apt)：HFD/STZ二型糖尿病小鼠，每日注射Cur-Lip-Apt(用实施例2步骤制得)，共6周。

给药结束后收集小鼠血清，取肝脏、肾脏、心脏、胰腺进行固定或匀浆，测定其生化指标，并进行体外成像。

如图10所示，为实施例2中Cur-Lip-Apt作用于糖尿病小鼠的离体成像图，图11为实施例2中Cur-Lip-Apt对T2DM小鼠糖化血红蛋白的影响结果图，图12为实施例2中Cur-Lip-Apt对T2DM小鼠肝脏TC的影响结果图。

实验例5(S+Q)-Lip-Apt的表征

粒径及分布的测定：将脂质体稀释10倍，用粒度分析仪测定脂质体的粒径及其分布、多分散指数及Zeta电位，结果如图13所示，为(S+Q)-Lip-Apt的粒径分布图。

以上仅为本申请的优选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种胰腺靶向脂质体，其特征在于，所述胰腺靶向脂质体由氢化卵磷脂、胆固醇、适配体(Apt)、脂溶性药物和中性溶液组成；所述中性溶液包括PBS、水、生理盐水、多肽的PBS溶液、多肽的水溶液和多肽的生理盐水溶液中的至少一种；所述多肽包括艾塞那肽和司美格鲁肽中的至少一种；所述脂溶性药物包括辅酶Q10和姜黄素中的至少一种。

2.根据权利要求1所述胰腺靶向脂质体，其特征在于，所述适配体的序列为(5'to 3')：CGTGCAATGTCGAATGCATGAGCAAACATGGCGAT，5'端用Cholesteryl修饰，3'端用FAM修饰。

3.根据权利要求1所述的胰腺靶向脂质体，其特征在于，所述氢化卵磷脂和所述胆固醇的摩尔比为(1.5～4)：1，脂溶性药物和脂质的质量比为1：(10～30)，所述脂质是指氢化卵磷脂和胆固醇。

4.根据权利要求1所述的胰腺靶向脂质体，其特征在于，所述多肽和所述脂溶性药物的质量比为2：5，所述脂溶性药物和所述脂质的质量比1：10或1：30，所述氢化卵磷脂和所述胆固醇的摩尔比为(1.5-2)：1。

5.一种如权利要求1-4任一项所述胰腺靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将氢化卵磷脂、胆固醇和脂溶性药物混合，溶于有机溶剂中，蒸干处理后得到磷脂薄膜；

在所述磷脂薄膜中加入中性溶液进行水化处理，加入适配体溶液，超声处理，得到脂质体溶液。

6.根据权利要求5所述胰腺靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述水化处理为37℃～50℃；所述超声处理是指在超声功率为100W，每超声2s停3s后继续超声，超声总时间为10分钟～20分钟，超声过程在冰水浴中进行。

7.根据权利要求6所述胰腺靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述水化处理的温度为40℃或50℃，所述超声总时间为15分钟。

8.根据权利要求5所述胰腺靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述蒸干处理是指：37℃，20rpm/min旋蒸除去有机溶剂，蒸干时间为20min；

所述有机溶剂是指氯仿。

9.根据权利要求5所述胰腺靶向脂质体的制备方法，其特征在于，所述水化处理的转速为120rpm/min，常压，40℃～50℃水化15分钟～20分钟。

10.一种胰腺靶向脂质体的应用，其特征在于，应用于制备靶向胰腺的药物。