CN119326742B

CN119326742B - 肌氨酸作为唯一活性成分在制备防治肥胖和/或高血脂症的药物中的用途

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Publication number: CN119326742B
Application number: CN202411893575.0A
Authority: CN
Inventors: 戴伦治; 董碧蓉; 岳冀蓉; 刘宇; 葛美玲
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2024-12-20
Filing date: 2024-12-20
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2044-12-20
Also published as: CN119326742A

Abstract

本发明属于药物应用领域，具体公开了肌氨酸作为唯一活性成分在制备防治肥胖和/或高血脂症的药物中的用途。本发明通过肌氨酸处理老年小鼠试验，证实肌氨酸在不影响绝对瘦体重的情况下，能降低机体总质量和脂肪质量，降低体脂率。经组织染色和生化分析，确定肌氨酸能减小内脏脂肪组织（VAT）细胞横截面积，上调内脏脂肪组织中棕色脂肪组织的标志物UCP1的表达，显著降低血浆中甘油三酯的水平。肌氨酸在治疗肥胖和高血脂症上具有实际应用价值。

Description

肌氨酸作为唯一活性成分在制备防治肥胖和/或高血脂症的药物中的用途

技术领域

本发明属于药物应用领域，具体涉及肌氨酸作为唯一活性成分在制备防治肥胖和/或高血脂症的药物中的用途。

背景技术

肥胖是体内脂肪积累过多，导致体重超过正常范围的状态。肥胖者通常摄入过多的热量，这些热量没有被有效转化为能量消耗掉，而是转化为脂肪堆积在体内，尤其是腹部脂肪的堆积。这种脂肪组织的增加会释放出多种细胞因子和激素，干扰正常的脂质代谢过程。例如，脂肪细胞可促进肝脏合成和分泌更多的极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C），这是导致血脂升高的重要因素之一。此外，肥胖者往往存在胰岛素抵抗，这会进一步影响脂质代谢，使甘油三酯水平升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低，从而引发高脂血症。

随着年龄的增长，老年人的基础代谢率逐渐降低，肌肉量减少而脂肪量增加，这使得身体消耗的能量减少，容易导致体重增加。并且老年人由于生理变化和共病的影响，更容易出现血脂高的情况。

肌氨酸（Sarcosine），CAS号：107-97-1，化学式：C₃H₇NO₂，是一种非蛋白质氨基酸，也是胆碱自然代谢过程中的一个中间体。其在生物医学领域具有广泛的应用，研究表明，其可作为甘氨酸转运蛋白-1（GlyT1）的竞争性抑制剂和NMDA受体的协同激动剂，增强甘氨酸受体功能，从而提高智力，并在神经退行性疾病和心脏病治疗中有潜在应用。此外，肌氨酸还被用于运动营养补剂，以提高肌肉力量、耐力和恢复能力。

目前还没有关于肌氨酸在防治肥胖、高血脂症方面的应用报道。

肌氨酸结构式为。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了肌氨酸作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗肥胖的药物中的用途，

所述肌氨酸的结构式为。

进一步地，所述药物具有降低体重的作用。

更进一步地，所述药物具有降低白色脂肪质量的作用。

更进一步地，所述药物具有降低体脂率的作用。

更进一步地，所述药物具有升高内脏脂肪组织中解偶联蛋白1水平，促进白色脂肪棕色化；降低内脏脂肪组织细胞横截面积的作用。

本发明最后提供了肌氨酸作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗高血脂症的药物中的用途。

进一步地，所述药物具有减低血浆中甘油三酯水平的作用。

更进一步地，所述药物是以肌氨酸为活性成分，加上药品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

更进一步地，所述制剂为口服制剂。

更进一步地，所述口服制剂为溶液剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、丸剂、胶囊剂或片剂。

本发明肌氨酸作为唯一活性成分可以有效防治肥胖和/或高血脂症，通过肌氨酸处理老年小鼠试验，证实肌氨酸在不影响绝对瘦体重的情况下，能降低机体总质量和白色脂肪质量，降低体脂率。经组织染色和生化分析，确定肌氨酸能减小内脏脂肪组织（VAT）细胞横截面积，上调内脏脂肪组织中棕色脂肪组织的标志物UCP1的表达，促进白色脂肪棕色化，显著降低血浆中甘油三酯的水平。将肌氨酸应用于治疗肥胖和高血脂症，特别是高甘油三酯血症具有实际价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：肌氨酸处理降低老年小鼠DXA检测结果；a：针对18个月大雄性小鼠进行4个月肌氨酸治疗方案的示意图；b：对照组和肌氨酸治疗组小鼠的代表性DXA图像；c-d：与基线相比，对照组和肌氨酸治疗组小鼠的体重、瘦肉质量、脂肪质量、瘦肉百分比和脂肪百分比的绝对值（c）和变化（d）的统计分析（每组n = 8）。

图2：对照组和肌氨酸治疗组小鼠的骨骼肌（a）和脂肪组织（b）相对重量的统计分析（每组n = 8）。

图3：对照组和肌氨酸治疗组小鼠内脏脂肪组织（VAT）的H&E染色代表性图像（a）和脂肪细胞横截面积的统计评估（b）（每组n = 7；每个样本测量超过450个脂肪细胞）。

图4：肌氨酸处理后上调白色脂肪中UCP1的表达；a-b，肌氨酸治疗和未治疗小鼠的VAT中UCP1的免疫印迹（a）和统计分析（b）（每组n = 5）；c-d，肌氨酸治疗和未治疗小鼠的VAT中UCP1的免疫组织化学（c）和统计分析（d）（每组n = 6）。

图5：对照组和肌氨酸治疗组小鼠的血液甘油三酯血生化分析结果；n = 8（对照组）或n = 11（肌氨酸治疗组）。

图中ns，不显著，*，p<0.05；双尾非配对t检验；**，p<0.01。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，可通过购买市售产品获得。

实施例1 肌氨酸减肥和降血脂研究

一、实验方法

1、药物配置

肌氨酸（Sarcosine），购买于Sigma-Aldrich，货号131776-100G。

2、动物模型构建

本发明使用的动物模型为自然衰老的小鼠模型，购买于恩斯维尔公司（重庆）。小鼠自由饮食饮水，在SPF环境中生长至18月龄。

3、肌氨酸功效实验

实验分为对照组和Sarcosine治疗组，Sarcosine治疗组给予添加Sarcosine的饲料（每kg饲料中含Sarcosine 0.75g），对照组给予不含Sarcosine的同种饲料。两组小鼠均自由饮食。实验总时长为4个月。

4、检测指标与检测方法

1）小鼠体成分DXA检测

实验开始前，利用DXA（双能X线吸收测定法，仪器型号InAlyzer，生产商：韩国MEDIKORS）对所有小鼠进行检测，测定指标包括体重（Weight）、瘦体重（Leanmass）、脂肪重量（Fat mass）、瘦体重百分比（Lean percent (%)）、以及脂肪百分比（Fat percent (%)）。根据测定结果将小鼠随机分为两组，对照组和Sarcosine治疗组。实验开始后，每两个月进行依次DXA检测。DXA检测方法具体如下：

a.小鼠禁食约4-6小时，确保胃肠内容物不会显著影响测量。

b.麻醉小鼠：将小鼠放入麻醉室，使用异氟烷麻醉。在麻醉室中选择chamber模式，异氟烷起始浓度为3-5%，维持浓度为1-2%，并将麻醉室气管与DXA扫描台相连。

c.打开InAlyzer软件，登陆账号，选择Maintance模式，进行仪器预热和维护。运行Maintance前需要在DAX仪器扫描台上放好配备的扫描纸和模具，模具按照说明书指定的位置和朝向摆放，等待Maintance结束。Maintance结束后，进入Registry界面，设置小鼠信息：日期、名称、年龄等，设置好后点击scan，选择scan模式：mouse with mask，第一步按照仪器提示，不放入小鼠，仅扫描mask，mask扫描结束后放入处于完全麻醉状态（无痛觉反射）的小鼠，此时将麻醉室模式调为mask，设置维持浓度，轻柔地将小鼠摆放在DXA仪器的扫描台上，并使小鼠头部位于面罩内，背部贴合扫描台，四肢自然伸展，避免重叠，确保扫描清晰。使用无菌纱布轻轻固定小鼠，避免位置移动。

d.扫描结束后查看结果，手动去除耳标，导出数据即可。

2）小鼠肌肉和脂肪组织称重

a.到达实验终点后，小鼠脱颈处死。

b.小心剥离小鼠胫骨前肌（TA），腓肠肌（GA），内脏脂肪（VAT）和棕色脂肪（BAT）组织，利用精密天平称量，记录数据。矫正小鼠体重后进行统计。

3）VAT组织H&E染色

a.在解剖小鼠时，使用脂肪组织专用固定液（Servicebio，货号CR2310085）固定适宜大小的VAT组织24小时。

b.使用自动脱水机进行组织脱水和透明化。

c.使用石蜡进行组织包埋，并切片。使用二甲苯Ⅰ和Ⅱ对切片进行脱蜡，共两次，每次10分钟。

d.将切片浸入不同浓度的乙醇（100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇）中，每次5分钟，然后换蒸馏水Ⅰ和Ⅱ，各2分钟。

e.将切片浸入苏木精染液中，染色3分钟，然后用蒸馏水冲洗去除浮色。

f.使用1%的盐酸酒精分化液处理切片30秒，然后换自来水Ⅰ和Ⅱ，各3分钟。

g.将切片浸入伊红染液中，染色2分钟，之后用蒸馏水冲洗去除浮色。

h.进行75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇的脱水，每次1分钟。然后换二甲苯Ⅰ和Ⅱ，各1分钟。

i.在组织中央滴加适量的中性树脂，一手持载玻片，一手持盖玻片，轻轻让盖玻片中心点接触到中性树脂脂滴的凸点，待两者接触后，缓缓放下盖玻片，让中性树脂自然地在盖玻片下扩散开来，以避免气泡产生。

j.成像：利用全自动扫片机（VS200）进行切片扫描。

4）VAT组织UCP1免疫组化染色

a.石蜡组织切片脱蜡至水（同上述H&E染色步骤）。

b.利用微波技术进行抗原修复，具体步骤如下：用塑料切片架，置于塑料容器内，枸橼酸钠缓冲液（10 mM，PH = 6.0）淹没切片，入切片，置于微波炉中火8min，停火7min，转小火8min；取出染色盒，冷却至室温。

c.用PBS洗涤2次，每次5分钟。

d.利用3%过氧化氢（H₂O₂）封闭内源性过氧化物酶，室温浸泡10分钟（需避光）。

e.蒸馏水洗涤2次，每次5分钟。

f.血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态），滴加兔血清（用PBS稀释，血清：PBS = 1：20），37℃孵育15分钟。封闭结束后，用PBS洗涤切片1次。

g.吸去血清，将UCP1（Proteintech，货号23673-1-AP）一抗稀释液（UCP1:PBS = 1:200）均匀涂覆在已封闭的组织切片上，放入湿盒内，室温孵育2小时，使一抗与抗原充分结合。

h.吸去一抗，用PBS洗涤3次，每次5分钟。

i.将稀释好的兔二抗（Abcam，货号ab6702）稀释液（二抗:PBS = 1:1000）滴加在组织切片上，室温孵育1小时。

j.吸去二抗，用PBS洗涤3次，每次5分钟。

k.加入DAB（Merck，货号102924）进行显色，镜下观察，适时终止。

l.将染色好的切片依次使用70%、85%、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇Ⅱ分别浸泡1min进行脱水处理。

m.将脱水后的切片用使用二甲苯浸泡两次，每次1分钟，进行透明化处理。

n.将一滴封片剂滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。

o.成像：利用全自动扫片机（VS200）进行切片扫描。

5）VAT组织UCP1蛋白免疫印迹检测

a.蛋白提取和浓度测定：称取50 mg白色脂肪组织，加入500 μL预加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（康唯世纪，货号CW2333S），用组织研磨仪破碎30秒。4 ℃，20000g，离心30分钟后取上清液，用BCA法进行蛋白浓度测定。

b.根据测定的浓度将样品制备成1 μg/μL的浓度，利用10% SDS-PAGE胶进行电泳分离，完成后利用湿转法进行转膜。

c.转膜完成后，用PBST洗涤1次，5分钟。随后用4%牛奶（溶解于PBST中）封闭PVDF膜，室温1小时。

d.封闭完成后，弃封闭液，用PBST洗涤1次。加入UCP1（Proteintech，货号23673-1-AP）一抗稀释液（UCP1:5% BSA (in PBST) = 1:2000）,4 ℃孵育过夜。

e.回收一抗稀释液，用PBST洗涤3次，每次5分钟。

f.加入对应种属的二抗（Abcam，货号ab6702）稀释液（二抗:5% BSA (in PBST) =1:10000），室温孵育1小时。

g.弃二抗稀释液，用PBST洗涤3次，每次5分钟。

h.显影：用ECL Western Blotting显影液（Merck，货号WBKLS0500），进行成像。

5、数据处理

1）VAT组织脂肪细胞面积计算

a.利用CaseViewer软件，每张切片随机截取三个视野。

b.将截取的图片导入FIJI软件，利用Adiposoft插件计算每个脂肪细胞的面积。

c.根据每个样本的脂肪细胞面积分布进行数据统计。

2）VAT组织UCP1免疫组化染色定量

a.利用CaseViewer软件，每张切片随机截取三个视野。

b.将截取的图片导入ImagePro Plus软件，每张图片UCP1的平均光密度值。

c.根据每个样本的平均光密度值进行数据统计。

3）VAT组织UCP1蛋白免疫印迹定量

a.将蛋白免疫印迹条带导入FIJI软件，计算每个条带的intensity。

b.用Vinculin蛋白的表达量作为内参。

c.每个样本的UCP1表达量矫正内参表达量后进行数据统计。

二、实验结果

老年小鼠（18月龄）补充肌氨酸四个月，每两个月使用DXA测量一次身体成分（图1a）。DXA结果显示，补充肌氨酸可降低总质量和白色脂肪质量，而不会影响绝对瘦体重（图1b、c）。与对照组相比，接受肌氨酸治疗的小鼠的瘦体重百分比显著升高，而脂肪的百分比显著下降（图1c-d；图2a）。此外，棕色脂肪组织（BAT）的重量在接受肌氨酸治疗的小鼠中显著增加（图2a-b）。接受肌氨酸治疗后，内脏脂肪组织（VAT）细胞横截面积显著减小（图3a-b）。BAT的标志物解偶联蛋白1（UCP1）在肌氨酸处理后的VAT中显著上调（图4a-d），说明肌氨酸具有升高内脏脂肪组织中UCP1水平，促进白色脂肪棕色化的作用。此外，接受肌氨酸处理的小鼠血浆中甘油三酯的水平显著降低（图5）。以上结果说明肌氨酸本身具有降低老年小鼠体脂率、体重和血脂水平的作用。

综上，本发明通过肌氨酸处理老年小鼠试验，证实肌氨酸在不影响绝对瘦体重的情况下，能降低机体总质量和白色脂肪质量，降低体脂率。经组织染色和生化分析，确定肌氨酸能减小内脏脂肪组织（VAT）细胞横截面积，上调内脏脂肪组织中棕色脂肪组织的标志物UCP1的表达，促进白色脂肪组织棕色化，显著降低血浆中甘油三酯的水平。本发明肌氨酸作为唯一活性制成的药物，可以有效治疗肥胖和高血脂症（特别是高甘油三酯血症），临床应用前景良好。

Claims

1.肌氨酸作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗肥胖的药物中的用途，其特征在于：所述肌氨酸的结构式为

2.肌氨酸作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗高血脂症的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗高甘油三酯血症的药物。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于：所述药物是以肌氨酸为活性成分，加上药品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述制剂为口服制剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述口服制剂为溶液剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、丸剂、胶囊剂或片剂。