CN119302994A - 一种脐带提取物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物脐带提取技术领域，具体涉及一种动物脐带提取物的制备方法及应用。本发明通过采用胰蛋白酶突变体来制备脐带提取物，不仅提高了酶解效率，而且获得的脐带提取物在皮肤修复效果上也显著优于普通酶解产物，在小鼠烧伤模型的修复中，小鼠皮肤的恢复速度比普通脐带提取物提前2天。本发明提供的方法制备得到的脐带提取物有望在伤口或皮肤修复中广泛应用。

Description

一种脐带提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及动物脐带提取技术领域，具体涉及一种动物脐带提取物的制备方法及应用。

背景技术

大量研究表明动物脐带蛋白、脐带肽、脐带提取物、脐带提取物均具有良好的修复组织损伤、促进新陈代谢、延缓皮肤衰老、调节机体免疫力、抗癌、护肝等功效，且具有极好的抗氧化活性，在临床实践中常用以治疗氧化诱导的疾病，其抗氧化活性主要由蛋白质调节。

脐带提取物，含有脐带干细胞外泌体，它内含健康肤质不可或缺的小分子肽类、游离氨基酸、维他命A群、有机酸、无机酸等自然成分，以及多达上百种调节细胞生长所需的活性营养及信号物质，具有全面调理皮肤，改善肤质，预防衰老的关键作用，能够快速修复皮肤屏障，恢复年轻健康活力的状态。

目前，动物组织来源的提取物通常采用酶解法的方式来制备。例如，公告号为CN105420325B的发明专利中公开了采用胰蛋白酶进行一步酶解法制备脐带多肽的方法。公告号为CN101773522B的发明专利中公开了利用两步酶解法来制备猪肠黏膜提取物，其先采用胰蛋白酶对猪肠黏膜进行酶解，然后再对酶解产物采用木瓜蛋白酶酶解。

然而，采用以上方法制备的提取物提取率较低、提取物效果差等缺陷。

发明内容

本发明的第一方面提供一种脐带提取物的制备方法，为了克服现有技术中酶解法酶解效率低，过程复杂的问题，采用胰蛋白酶的突变体来对动物脐带进行酶解。其具体步骤包括：

(1)、取动物脐带组织，匀浆；

(2)、在步骤(1)获得的匀浆组织中加入胰蛋白酶或其突变体的水溶液，制成混合液，然后搅拌，离心，收集上清液；

(3)、微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(2)获得的上清液灭活，收集灭活后的上清液；

(4)、提取物的过滤和超滤：将步骤(3)获得的上清液过滤以去除病原体；

(5)、对步骤(4)获得的过滤液超滤，超滤条件为：进口压力0.5～1.2MPa，出口压力-0.5～-1.2MPa，温度为4～15℃；

(6)、提取物的冻干保存：将步骤(5)获得的滤液在3-6小时内，冷冻到-40℃～-45℃，并真空干燥。

优选的动物脐带来源猪、牛、羊等；

优选的胰蛋白酶可来自于任意商购产品，更优选的所述胰蛋白酶的野生型氨基酸GenBank ID：1AVW_A，其含有223个氨基酸。

更优选的其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其具体序列为

优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其具体序列为：

ATCGTGGGTGGTTATACCTGTGCAGCAAATAGTATTCCGTATCAGGTGAGCCTGAATAGCGGTAGTCATTTTTGCGGTGGCAGCCTGATTAATAGTCAGTGGGTGGTTAGTGCCGCACATTGCTATAAAAGTCGTATTCAGGTTCGCCTGGGTGAACATAATATTGATGTGCTGGAAGGTAATGAACAGTTTATTAATGCAGCAAAAATCATCACCCATCCGAATTTTAATGGCAATACCCTGGATAATGATATTATGCTGATTAAGCTGAGCAGTCCGGCAACCCTGAATAGCCGCGTGGCAACCGTTAGCCTGCCGCGCAGCTGCGCAGCAGCAGGTACCGAATGCCTGATTAGCGGTTGGGGTAATACCAAAAGTAGTGGCAGCAGTTATCCGAGCCTGCTGCAGTGCCTGAAAGCCCCGGTTCTGAGCGATAGTAGCTGTAAAAGCAGCTATCCGGGCCAGATTACCGGCAATATGATTTGCGTTGGCTTTCTGGAAGGCGGCAAAGATAGCTGTCAGGGCGATAGTGGTGGTCCGGTTGTTTGCAATGGTCAGCTGCAGGGCATTGTGAGTTGGGGCTATGGCTGCGCACAGAAAAATAAGCCGGGTGTTTATACCAAAGTGTGTAATTATGTTAACTGGATTCAGCAGACCATTGCCGCCAATTAA；

更优选的所述其胰蛋白酶为突变体，可选自N31K、S92D、S161L中的一种或多种；

优选的突变体能N31K的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其具体序列为MHPLLILAFVGAAVAFPSDD DDKIVGGYTC KENSVPYQVS

LNAGYHFCGG SLINDQWVVS AAHCYQYHIQ

VRLGEYNIDV LEGGEQFIDA SKIIRHPKYS SWTLDNDILL IKLSTPAVIN

ARVSTLLLPS ACASAGTECL

ISGWGNTLSS GVNYPDLLQC LVAPLLSHAD CEASYPGQIT NNMICAGFLE

GGKDSCQGDS GGPVACNGQL

QGIVSWGYGC AQKGKPGVYT KVCNYVDWIQ ETIAANS；

优选的突变体N31K/S92D的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其具体序列为

MHPLLILAFV GAAVAFPSDD DDKIVGGYTC KENSVPYQVS LNAGYHFCGG

SLINDQWVVS AAHCYQYHIQ

VRLGEYNIDV LEGGEQFIDA SDIIRHPKYS SWTLDNDILL IKLSTPAVIN

ARVSTLLLPS ACASAGTECL

ISGWGNTLSS GVNYPDLLQC LVAPLLSHAD CEASYPGQIT NNMICAGFLE

GGKDSCQGDS GGPVACNGQL

QGIVSWGYGC AQKGKPGVYT KVCNYVDWIQ ET IAANS；

优选的突变体N31K/S161L的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其具体序列为

MHPLLILAFV GAAVAFPSDD DDKIVGGYTC KENSVPYQVS LNAGYHFCGG

SLINDQWVVS AAHCYQYHIQ

VRLGEYNIDV LEGGEQFIDA SNIIRHPKYS SWTLDNDILL IKLSTPAVIN

ARVSTLLLPS ACASAGTECL

I SGWGNTLSS GVNYPDLLQC LVAPLLSHAD CEASYPGQIT NNMICAGFLE

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QGIVSWGYGC AQKGKPGVYT KVCNYVDWIQ ETIAANS

优选的胰蛋白酶或变体的浓度为5-20g/L，更优选10-20g/L。

优选地，在步骤(1)中，匀浆前将脐带组织用水清洁。更优选地，清洁后的脐带组织用碘伏浸泡，取出后用酒精脱碘。

优选地，所述步骤(2)中的离心是以5000～10000r/min离心10～15min。

优选地，在60℃-85℃水浴锅中灭活30-40分钟；

本发明的另一方面提供一种由上述方法得到的脐带提取物，由该方法得到的提取物活性高、稳定性强，具备广泛的应用场景。

本发明的另一方面提供一种上述脐带提取物的应用，在小鼠模型的实验中表明，该脐带提取物在皮肤伤口愈合方面有较好的效果，有望在皮肤修复以及疤痕去除的产品中广泛应用。

附图说明

图1酶突变体Western电泳。其中条带1为N31K/S92D酶突变体，条带2为N31K/S161L酶突变体。

图2酶活检测图。其中1-6分别为胰蛋白酶WT、以及突变体N31K、S92D、S161 L、N31K/S92D、N31K/S161L的酶活。

图3不同处理组小鼠烧伤皮肤愈合率。

图4皮肤组织HE染色图。不同处理组5d和11d小鼠烫伤皮肤组织学观察结果。A：空白组；B：提取物1组；C：提取物2组；D：提取物3组。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并限于此。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂无特殊说明，均以首次表明的内容相同；所涉及到的是试剂、材料等如无特殊说明，均为商业途径获得。

实施例1胰蛋白酶突变体的制备

胰蛋白酶突变体的筛选为了提高野生型胰蛋白酶(GenBank：1AVW_A，氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2)酶活力，发明人通过定向进化技术对该酶活性位点附近的氨基酸进行了大量突变的筛选。

设计PCR引物如下：

F：GGC AATTCTAAATTGTGGGCGGCTATACCT(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点，SEQ ID NO：6)；

R：ATA GCGGCCGCAGCAGACCATTGCCGCCAAT(下划线为限制性内切酶NotI识别位点，SEQ ID NO：7)。

以胰蛋白酶基因(SEQ ID NO:2)为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有胰蛋白酶的大肠杆菌细胞裂解液。

取出50μL裂解液至两块新的96孔板，在37℃条件下分别测定其胰蛋白酶活和蛋白质含量，计算不同突变子的比活力。

实验结果表明在37℃条件下酶活得到显著提高的突变位点，分别为：N31K、S92D或S161L。

在此基础上，获得包含上述包含N31K、S92D或S161L中1个或2个突变位点组合的胰蛋白酶突变体。

实施例2重组菌株的构建

上述酶突变体核苷酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，分别将wt及其变体成功克隆到质粒pET-30a(+)中，同时在表达质粒构建过程中在基因的N端均添加有6个His标签，将成功构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，记为E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-WT、E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-mutN31K、E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-mutS92D、E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-mutS161L、E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-mutN31K/S92D、E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-mutN31K/S161L。挑取重组子单菌落，在培养基中培养，进行菌落PCR鉴定，酶切鉴定后测序验证并挑选野生型和突变型工程菌保存。

实施例3胰蛋白酶的表达和酶活测定

每个类型的菌株挑选3株在液体LB培养基(含5μg/mL红霉素)中培养，30℃静置培养过夜，次日以5％接种量接种于100mL LB液体培养基中(含5μg/mL红霉素)，30℃，静置培养到OD600＝0.5左右时，在超净工作台中加入过滤除菌的100μL 0.3M CuSO4，30℃，静置培养4h后，16℃置培养24h。分别取90μL重组菌株破壁液上清，各与30μL 4×Protein LoadingBuffer混合，100℃煮沸10min。4℃，12000rpm离心5min，收集样品处理液，利用离子交换层析法进行纯化。

具体地，取胰蛋白酶及其突变体浓缩液10.0mL经预先用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)进行线性梯度洗脱，用比色法进行酶活检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测。

如图1所示，针对双突变胰蛋白酶进行SDS-PAGE，得到约23.4Kda的清晰明亮条带，说明上述突变体均成功表达并且纯度较高。

如图2所示，WT、N31K、S92D、S161L、N31K/S92D、N31K/S161L(依次对应图2的酶种类)平均胞外酶活分别为225.6U/mL、255.1U/mL、245.3U/mL、276.8U/mL、332.7U/mL、305.2U/mL。

由图2可知，突变体N31K与S161L相较于野生型酶活有显著提升(P<0.05)，突变体N31K/S92D、N31K/S161L相较于野生型酶活有显著提升(P<0.01)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。

选择野生型胰蛋白酶以及酶活较高的N31K/S92D、N31K/S161L酶突变体进行动物脐带提取物的制备。

实施例4脐带提取物的制备

(1)动物组织的处理：收集猪脐带组织，用灭菌纯水清洁后，将脐带组织用无菌剪刀在无菌条件下，剪切成大小1cm³的块，转移到碘伏内浸泡2min后取出用体积比75％的酒精脱碘，用灭菌纯水冲洗3次，并在无菌条件下机械式匀浆。

(2)提取物的酶解：在步骤(1)获得的组织匀浆中加入4倍体积的25g/L的胰蛋白酶或其突变体水溶液，然后置于搅拌器中，搅拌24小时后，加入同等体积的灭菌纯水混匀后，以8000r/min离心10min，收集上清液5℃保存。

(3)微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(2)上清液在65℃水浴锅中灭活30分钟，收集灭活后的上清液。

(4)提取物的过滤除菌：将步骤(3)灭活后的上清液依次通过孔径为100μm、50μm、20μm、100nm、50nm、20nm的滤器去除病原体，过滤条件为进口压力0.9MPa，温度为8℃，收集过滤液。

(5)提取物的超滤：将步骤(4)收集的过滤液，施加正负压力分别过50000道尔顿和5000道尔顿分子量的滤膜，小于50000道尔顿大于5000道尔顿为细胞因子，小于5000道尔顿为复合多肽，分别收集过滤液，过滤条件为：进口压力1.0MPa，出口压力-1.0MPa，温度为5℃，低温保存。

其中使用野生型胰蛋白酶制备得到的脐带提取物为提取物1，使用酶突变体N31K/S92D制备得到的脐带提取物为提取物2，使用胰蛋白酶酶突变体A31T/K92N制备得到的脐带提取物为提取物3。

实施例5小鼠烧伤模型构建以及脐带提取物作用探究

挑选40只6-8周龄C57小鼠，随机分为四组(空白组、提取物1组、提取物2组、提取物3组)，每组10只C57小鼠，6％硫化钠稀释液脱毛后，自制烧烫伤仪，调整温度100℃，用统一烫头固定于小鼠背部已脱毛区，时间控制为5s，造创前5％水合氯醛麻醉，每天背部烧烫伤创口给予不同药物外抹，分别于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天、第15天拍照观察，分析烧烫伤的面积及愈合率。

烧烫伤的愈合率＝(原始面积－创面未愈合面积)/原始面积。

其结果见图3。提取物2-3组烧烫伤愈合率于伤后9天接近100％，空白组烧烫伤愈合率于13天接近100％。提取物1组于伤后11天左右完全愈合。提取物1组愈合率与空白组差异明显(P<0.05)。提取物2-3组愈合时间在9天左右，与空白组对比显示，愈合过程中烧烫伤愈合率明显大于空白组(P<0.01)，与提取物1组也存在显著差异(P<0.05)，完全愈合时间提前2天左右。

分别于第5天、第11天取样，颈椎脱臼法处死烧烫伤小鼠，操作过程中严格遵循动物伦理保护法，将小鼠于75％乙醇溶液中消毒60s，随即转移至超净工作台中，利用显微外科剪分离小鼠背部烧烫伤创口，距离烧烫伤创缘约0.3cm，并将游离创缘皮片转移至外科解剖显微镜下修剪平整规则，多聚甲醛固定24小时，梯度浓度乙醇(70％、80％、90％、95％和100％)脱水，透明浸蜡后，包埋成组织蜡块。

HE染色：将石蜡切片在烘箱60℃，烘烤1小时，依次将切片放入二甲苯I静置20min，二甲苯II 20min，无水乙醇I静置5min，无水乙醇II 5min，75％乙醇5min，自来水洗10s。切片入苏木素染液染4min，自来水洗10s，分化液分化5s，自来水洗10s，返蓝液返蓝，流水冲洗10s。切片依次入85％、95％的梯度乙醇脱水各5min，伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇I静置5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇III 5min，二甲苯I静置5min，二甲苯II5min透明，中性树胶封片。

由图4可知，空白组烫伤5d时损伤组织排列疏松，组织间含有大量粉染水肿液，有较明显组织结构和细胞水肿(HE，300x)，烫伤11d时损伤组织处可见一定量的新生毛细血管和成纤维细胞(HE，300x)；

提取物1组，烫伤5d时损伤组织排列疏松，组织间含有粉染水肿液和浸润的炎性细胞，有较明显组织结构和细胞水肿(HE，300x)；烫伤11d时损伤组织处可见丰富新生毛细血管、成纤维细胞和浸润的炎性细胞(HE，300x)；

提取物2组，烫伤5d时损伤组织排列疏松，组织间含有少量粉染水肿液和浸润的炎性细胞(HE，300x)；烫伤11d时可见大量的毛细血管和成纤维细胞，肉芽组织发达且健康(HE，300x)。

提取物3组，烫伤5d时损伤组织排列疏松，组织间少量粉染水肿液和浸润的炎性细胞(HE，300x)；烫伤11d烫伤11d时可见大量的毛细血管和成纤维细胞，肉芽组织发达且健康(HE，300x)。

即小鼠烧伤皮肤的愈合情况以及组织学评分上提取物2-3组均优于空白组以及提取物1组(P<0.05)。

因此本申请使用上述酶突变体制备脐带提取物，不仅制备过程简单，有效提高了酶解效率，进一步的制备得到的脐带提取物在针对烧伤组织的修复上有十分明显的效果，且显著优于常规方法得到的提取物，有望在皮肤修产品上应用。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脐带提取物的制备方法，其特征在于，采用胰蛋白酶突变体来酶解猪脐带组织，其中所述突变体为胰蛋白酶野生型存在N31 K、S92D或S161 L中一种或多种突变，其中野生型胰蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述突变体为N31 K/S92D或N31 K/S161 L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述突变体氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述突变体氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)、取动物脐带组织，匀浆；

(2)、在步骤(1)获得的匀浆组织中加入胰蛋白酶或其突变体的水溶液，制成混合液，然后搅拌，离心，收集上清液；

(3)、微生物和胰蛋白酶灭活：将步骤(2)获得的上清液灭活，收集灭活后的上清液；

(4)、提取物的过滤：将步骤(3)获得的上清液过滤以去除病原体；

(5)、对步骤(4)获得的过滤液超滤，超滤条件为：进口压力0.5～1.2MPa，出口压力-0.5～-1.2MPa，温度为4～15℃；

(6)、提取物的冻干保存：将步骤(5)获得的超滤滤液在3-6小时内，冷冻到-40℃～-45℃，并真空干燥。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述动物脐带组织来源于猪、牛或羊。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，灭活的步骤为在60℃-85℃水浴锅中灭活30-40分钟。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，胰蛋白酶或其突变体的浓度为10-20g/L。

9.权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的脐带提取物。

10.权利要求9所述的脐带提取物在制备皮肤修复制剂中的应用。