CN119278213A - 针对ctla-4的抗体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA‑4)的抗体及其使用方法。
Description
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序列表
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技术领域
本发明涉及针对人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抗体及其使用方法。
背景技术
CTLA-4是充当T细胞应答的主要负调节因子的抑制性受体。CTLA4针对其天然B7家族配体CD80和CD86的亲和力强于它们的同源刺激辅助受体CD28的亲和力。
发明内容
本发明提供了人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)及其使用方法。
实施方案涉及与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的抗体或其片段，该分离的抗体或其片段包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL CDR3；或(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL CDR3；或(f)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH 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本发明的方面还涉及与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL CDR3；或(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL CDR3；或(f)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID 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CDR1、包含SEQ ID NO:483的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:484的氨基酸序列的VL CDR3；或(w)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ IDNO:444的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:445的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ IDNO:485的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:486的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQID NO:487的氨基酸序列的VL CDR3；或(x)包含SEQ ID NO:446的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:447的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:448的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:488的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:489的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:490的氨基酸序列的VL CDR3；或(y)包含SEQ ID NO:449的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:450的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:451的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:491的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:492的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:493的氨基酸序列的VL CDR3；或(z)包含SEQ ID NO:452的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:453的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:454的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:494的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:495的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:496的氨基酸序列的VL CDR3；或(aa)包含SEQ ID NO:857的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:858的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:859的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:892的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:893的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:894的氨基酸序列的VL CDR3；或(bb)包含SEQ ID NO:860的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:861的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:862的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:895的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:896的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:897的氨基酸序列的VL CDR3；或(cc)包含SEQ ID NO:863的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQID NO:864的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:865的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQID NO:898的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:899的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:900的氨基酸序列的VL CDR3；或(dd)包含SEQ ID NO:866的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:867的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:868的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:901的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:902的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:903的氨基酸序列的VL CDR3；或(ee)包含SEQ ID NO:869的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:870的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:871的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:904的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:905的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:906的氨基酸序列的VL CDR3；或(ff)包含SEQID NO:872的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:873的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQID NO:874的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:907的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:908的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:909的氨基酸序列的VL CDR3；或(gg)包含SEQ ID NO:875的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:876的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:877的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:910的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:911的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:912的氨基酸序列的VL CDR3；或(hh)包含SEQ ID NO:878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:915的氨基酸序列的VL CDR3；或(ii)包含SEQ ID NO:880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQID NO:881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQID NO:916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:918的氨基酸序列的VL CDR3；或(jj)包含SEQ ID NO:883的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:885的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:920的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:921的氨基酸序列的VL CDR3；或(kk)包含SEQ ID NO:886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:887的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:922的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:924的氨基酸序列的VL CDR3；或(ll)包含SEQID NO:889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQID NO:891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:927的氨基酸序列的VL CDR3。
更进一步地，本发明的方面涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的抗体或其片段，该分离的抗体或其片段包含：重链可变区，该重链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021和1023；以及轻链可变区，该轻链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、368、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022和1024。
另外，本发明的方面涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含：重链可变区，该重链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021和1023；以及轻链可变区，该轻链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、368、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022和1024。
例如，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:2约95％相同的氨基酸序列。
另一个实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ IDNO:1约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:2约95％相同的氨基酸序列。
另一个实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:3约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:4约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:3约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:4约95％相同的氨基酸序列。
实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:5约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ IDNO:6约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:5约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:6约95％相同的氨基酸序列。
更进一步地，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:7约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:8约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:7约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:8约95％相同的氨基酸序列。
另外的实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:9约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:10约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:9约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:10约95％相同的氨基酸序列。
实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:11约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQID NO:12约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:11约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:12约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:13约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:14约95％相同的氨基酸序列。
更进一步地，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQID NO:13约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:14约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:15约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:16约95％相同的氨基酸序列。
更进一步地，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQID NO:15约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:16约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:17约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQID NO:18约95％相同的氨基酸序列。
另外，实施方案涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:17约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:18约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:19约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQID NO:20约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:19约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:20约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:21约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQID NO:22约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:21约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:22约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:23约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQID NO:24约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:23约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:24约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:385约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:386约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:385约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:386约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:387约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:388约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:387约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:388约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:389约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:390约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:389约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:390约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:391约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:392约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:391约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:392约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:393约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:394约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:393约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:394约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:395约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:396约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:395约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:396约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:397约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:398约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:397约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:398约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:399约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:400约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:399约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:400约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:401约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:402约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:401约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:402约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:403约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:404约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:403约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:404约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:405约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:406约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:405约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:406约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:407约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:408约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:407约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:408约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:409约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:410约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:409约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:410约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:411约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:412约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:411约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:412约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1001约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1002约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1001约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1002约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1003约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1004约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1003约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1004约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1005约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1006约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1005约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1006约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1007约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1008约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1007约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1008约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1009约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1010约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1009约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1010约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1011约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1012约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1011约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1012约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1013约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1014约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1013约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1014约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1015约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1016约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1015约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1016约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1017约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1018约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1017约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1018约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1019约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1020约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1019约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1020约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1021约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1022约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1021约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1022约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，该分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1023约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1024约95％相同的氨基酸序列。
实施方案也涉及一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，该分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含与SEQ ID NO:1023约95％相同的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:1024约95％相同的氨基酸序列。
本发明的方面也涉及根据权利要求1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77或79所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中分离的单克隆抗体或抗原结合片段包含野生型Fc或经修饰的Fc。
另外，本发明的方面涉及一种分离的双特异性抗体，该分离的双特异性抗体包含如本文所述的抗体或片段以及对免疫细胞上的分子具有特异性的第二抗原结合片段。例如，该分子选自由以下项组成的组：CCR4、B7H3、B7H4、CD27、CD28、CD40、CD40L、CD47、CD122、CTLA-4、GITR、GITRL、ICOS、ICOSL、LAG-3、LIGHT、OX-40、OX40L、PD-1、TIM3、4-1BB、TIGIT、VISTA、HEVM、BTLA、CD47、PDL1、MICA、MICB和KIR。
在实施方案中，该片段和该第二片段各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
实施方案还可包括Fc片段。例如，Fc片段包括野生型Fc片段或经修饰的Fc片段。
本发明的方面涉及一种核酸，该核酸编码如本文所述的抗体。
更进一步地，本发明的方面涉及一种核酸，该核酸编码如本文所述的双特异性抗体。
另外，本发明的方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的抗体或其片段以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
实施方案还可包含至少一种附加的治疗剂。例如，治疗剂可以为毒素、放射标记物、siRNA、小分子或细胞因子。
本发明的方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的双特异性抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
在实施方案中，药物组合物还可包含至少一种附加的治疗剂。例如，治疗剂可以为毒素、放射标记物、siRNA、小分子或细胞因子。
另外，本发明的方面涉及一种分离的细胞，该分离的细胞包含编码如本文所述的抗体或片段的一种或多种多核苷酸。
另外，本发明的方面涉及一种分离的细胞，该分离的细胞包含编码如本文所述的双特异性抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。
另外，本发明的方面涉及一种载体，该载体包含如本文所述的核酸。
另外，本发明的方面涉及一种细胞，该细胞包含如本文所述的载体。
本发明的方面涉及治疗受试者的癌症的方法。例如，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的CTLA-4抗体或其片段。例如，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的CTLA-4双特异性抗体。
本发明的方面也涉及一种嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，该CAR包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，其中细胞外结构域为与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL CDR3；或(d)包含SEQID NO:34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQID NO:36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VLCDR3；或(f)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR3；或(g)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VL CDR3；或(h)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR3；或(i)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQID NO:87的氨基酸序列的VL CDR3；或(j)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR3；或(k)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VL CDR3；或(l)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR3；或(m)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:414的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:415的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:455的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:456的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:457的氨基酸序列的VL CDR3；或(n)包含SEQ ID NO:416的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:417的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:418的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:458的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:459的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:460的氨基酸序列的VLCDR3；或(o)包含SEQ ID NO:419的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:461的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:462的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的VL CDR3；或(p)包含SEQ ID NO:422的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:423的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:424的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ IDNO:464的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:465的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQID NO:466的氨基酸序列的VL CDR3；或(q)包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:426的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:427的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:467的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的VL CDR3；或(r)包含SEQ ID NO:428的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:429的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:470的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:471的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:472的氨基酸序列的VL CDR3；或(s)包含SEQ ID NO:431的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:433的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:473的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:474的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:475的氨基酸序列的VL CDR3；或(y)包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:476的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:478的氨基酸序列的VL CDR3；或(u)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:479的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:480的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:481的氨基酸序列的VL CDR3；或(v)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ IDNO:441的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ IDNO:482的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:483的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQID NO:484的氨基酸序列的VL CDR3；或(w)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:445的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:485的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:486的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列的VL CDR3；或(x)包含SEQ ID NO:446的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:447的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:448的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:488的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:489的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:490的氨基酸序列的VL CDR3；或(y)包含SEQ ID NO:449的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:450的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:451的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:491的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:492的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:493的氨基酸序列的VL CDR3；或(z)包含SEQ ID NO:452的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:453的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:454的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:494的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:495的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:496的氨基酸序列的VL CDR3；或(aa)包含SEQ ID NO:857的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:858的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:859的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:892的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:893的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:894的氨基酸序列的VL CDR3；或(bb)包含SEQ ID NO:860的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQID NO:861的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:862的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQID NO:895的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:896的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:897的氨基酸序列的VL CDR3；或(cc)包含SEQ ID NO:863的氨基酸序列的VHCDR1、包含SEQ ID NO:864的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:865的氨基酸序列的VHCDR3、包含SEQ ID NO:898的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:899的氨基酸序列的VLCDR2以及包含SEQ ID NO:900的氨基酸序列的VL CDR3；或(dd)包含SEQ ID NO:866的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:867的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:868的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:901的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:902的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:903的氨基酸序列的VL CDR3；或(ee)包含SEQID NO:869的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:870的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQID NO:871的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:904的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:905的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:906的氨基酸序列的VL CDR3；或(ff)包含SEQ ID NO:872的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:873的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:874的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:907的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:908的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:909的氨基酸序列的VL CDR3；或(gg)包含SEQ ID NO:875的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:876的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:877的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:910的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:911的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:912的氨基酸序列的VL CDR3；或(hh)包含SEQ ID NO:878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQID NO:1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:915的氨基酸序列的VL CDR3；或(ii)包含SEQ ID NO:880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:918的氨基酸序列的VL CDR3；或(jj)包含SEQ ID NO:883的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:885的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:920的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:921的氨基酸序列的VL CDR3；或(kk)包含SEQ ID NO:886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:887的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:922的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:924的氨基酸序列的VL CDR3；或(ll)包含SEQ ID NO:889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:927的氨基酸序列的VL CDR3。例如，跨膜结构域包含CD28。
在实施方案中，跨膜结构域还包含定位在细胞外结构域与跨膜结构域之间的茎区。
实施方案还可包括定位在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的一种或多种附加的共刺激分子。例如，共刺激分子为CD28、4-1BB、ICOS或OX40。例如，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ链。
在实施方案中，抗体为Fab或scFV。
本发明的方面也涉及一种核酸，该核酸编码如本文所述的CAR。在实施方案中，该核酸还可包括编码定位在细胞内信号传导结构域之后的多肽的核酸。例如，该多肽为抗体或细胞因子，诸如scFV。
本发明的方面涉及一种核酸，该核酸编码CAR，其中该CAR包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，该核酸还包括编码定位在细胞内信号传导结构域之后的多肽的核酸，其中多肽包括与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列的VL CDR3；或(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQID NO:35的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQID NO:70的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL 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本发明的方面涉及一种载体，该载体包含如本文所述的核酸。
本发明的方面也涉及一种细胞，该细胞包含如本文所述的载体。
本发明的方面涉及一种遗传工程细胞，该遗传工程细胞在细胞表面膜上表达和承载如本文所述的嵌合抗原受体。例如，该细胞为T细胞或NK细胞。例如，T细胞为CD4+或CD8+。
实施方案还可包括CD4+和CD8细胞+的混合群体。
本发明的方面也涉及一种遗传工程细胞，该遗传工程细胞在细胞表面膜上表达和承载嵌合抗原受体，并且该遗传工程细胞还经工程化以表达和分泌多肽，其中多肽为与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，其中重链包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或(b)包含SEQID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VLCDR3；或(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID 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本发明的其他目的和优点根据随后的描述是显而易见的。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。
图1示出了将ELISA与处于变化的稀释度的经PEG纯化的噬菌体结合。
图2示出了FACS确认CTLA-4噬菌体可与表达CTLA-4的1G5 Jurkat细胞结合。
图3提供了抗CTLA-4抗体氨基酸(AA)和核苷酸(Nuc)序列。“HC”为重链，并且“LC”为轻链。
图4至图8提供了抗CTLA-4抗体氨基酸(AA)和核苷酸(Nuc)序列。
图9至图11提供了抗CTLA-4抗体氨基酸(AA)和核苷酸(Nuc)序列。
图12示出了与CD80 hFc竞争与1G5 Jurkat上的CTLA4结合的百分比。1G5 Jurkat细胞被转导以过表达CTLA4。将细胞与处于指定浓度的可溶性抗体一起温育，洗涤，然后与经标记的CD80-Fc一起温育。在BD FACSCanto II上读取样品。荧光的减少用于指示对CD80与细胞表面上的CTLA4的结合的阻滞。
图13示出了改编自Metzler,William J.等人“Solution Structure of HumanCTLA-4and Delineation of a CD80/CD86 Binding Site Conserved in CD28”的带状图。
图14示出了改编自Stamper,Carin C.等人“Crystal Structure of the B7-1/CTLA-4Complex That Inhibits Human Immune Responses.”Nature的带状图。
图15示出了抑制免疫应答的机制的示意图。
图16示出了现有疗法：伊匹木单抗-IgG1和曲美木单抗-IgG2的带状图。小图A和小图B示出了改编自Ramagopal,Udupi A.等人“Structural Basis for CancerImmunotherapy by the First-in-Class Checkpoint Inhibitor Ipilimumab”的带状图。小图C示出了改编自He,Mengnan等人“Remarkably Similar CTLA-4Binding Propertiesof Therapeutic Ipilimumab and Tremelimumab Antibodies”的带状图。
图17示出了针对抗CTLA4抗体的示例性淘选结果的图表。轮次：1、1b、2、2b、3、3b。在第3轮和第3b轮中引入小鼠CTLA4。结果是10种独特的抗体。
图18示出了aCTLA4抗体的示例性动力学分析的图表。
图19示出了aCTLA4抗体的示例性竞争分析的图表。
图20示出了与T细胞结合的aCTLA4抗体的FACS的图。与T2-C10相比，E1-D7结合T细胞上显著更多的CTLA4。将来自biolegend的抗CTLA4ab在单个点(推荐的染色浓度)处用于对照。Ipi IgG为在实验室中进行克隆以代表伊匹木单抗的抗体，它不是商业制剂或生物类似物。
图21示出了与T细胞结合的aCTLA4 Ab的示例性FACS。
图22示出了小鼠/人CTLA4交叉反应性的ELISA结果的示例性图。E1-D7与小鼠CTLA4交叉反应。
图23示出了改编自P.Ott等人2014的T细胞的示例性机制的示意图。
图24示出了MLR测定的示意图。示意图由Explicyte提供。方案：CD4+T细胞与各自来自不同供体的单核细胞衍生DC的共培养。这指示树突状细胞的同种识别引起T细胞的活化。表达PDL1的DC可抑制T细胞活化。免疫检查点抑制剂的添加可使T细胞从抑制恢复。我们研究了抗PD1是否增强T细胞活化。测量的IFNy和IL2细胞因子产生是T细胞活化的指标。
图25示出了来自改编自Miltenyi的单核细胞、imMo-DC和mMo-DC的免疫分型的数据。在该方案中，将使用Miltenyi CD14+微珠的分离CD14+单核细胞在Miltenyi Mo-DC培养基(带有GM-CSF+IL4的预制备培养基)中培养并培养5天。然后，加入TNF-α(1000U/ml)、IL-1β(5ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和前列腺素E2(PGE2)(1μM)并培养2天以使DC成熟。mMo-DC表达参与DC与原初T细胞之间的免疫学突触的形成的各种DC标志物，包括CD80、CD86和MHC II(HLA-DR)。成熟Mo-DC也表达DC活化标志物CD83、CD40和CCR7。
图26示出了DC供体AD染色的数据和分析。
图27示出了示例性MLR1数据：测量IFNγ产量的图。我们研究了E1-D7是否抑制T细胞活化。与仅T细胞+DC、抗PD1处理和无关Ab对照相比，在用E1-D7处理的孔中观察到IFNy的降低。吸光度值4用于表示饱和。
图28示出了aCTLA4/aPD-1MLR的组合的示例性数据：IFNγ产量的图。
图29示出了使用CTLA4-PMPL的第二次淘选的示例性示意图。
图30示出了来自于将ELISA与处于变化的稀释度的经PEG纯化的噬菌体结合的数据的示例性图。
图31示出了示例性FACS确认我们的CTLA4噬菌体可与表达CTLA-4的1G5 Jurkat细胞结合。
图32示出了aCTLA4 scFv-Fc上清液的示例性动力学筛选数据的图表。
图33示出了针对hCTLA4的示例性结合曲线。
图34示出了针对mCTLA4的示例性结合曲线。
图35示出了BSA阴性对照结合曲线。
图36示出了数据和观察结果的图表。按抗体的25nM浓度处的缔合应答的递减次序来排列数据。所有候选抗体都具有比伊匹木单抗和BiolegendaCTLA4(商业对照)更高的解离速率。大多数候选物似乎具有比商业对照更高的缔合应答。4种候选物(在表中突出显示)具有比E1-D7(泰勒抗体—实验室对照)更低的解离常数。E2-D10和E1-A12具有相同的重链但具有不同的轻链家族。它们的应答速率中的差异由轻链结合介导。E2-H10也属于与上述两者相同的Vh家族。
图37示出了来自竞争测定的示例性数据的图表。CD80阻滞：所有候选抗体都在一定程度上阻断CD80结合，但不超过伊匹木单抗，因此我选择具有比E1-D7(实验室对照，泰勒候选物)更高的阻滞(更低的第二缔合值)的候选物。CD86阻滞：所有候选物都具有负的第二缔合值，表示它们都完全阻断CD86(归一化值＝0)。我选择具有在与伊匹木单抗进行比较时更接近于零的负值的候选物，因为较高的负值可指示抗体解离。E1-A8和E2-A4属于相同的种系家族。E1-D7阻滞：突出显示的候选物相比于伊匹木单抗更好地阻断E1-D7结合。伊匹木单抗阻滞：突出显示的候选物比E1-D7更好地阻断伊匹木单抗结合。所有阻断CD80和CD86的候选物在动力学方面都表现得相对较差。
图38示出了CTLA4结合的示例性图。将Jurkat细胞用hCTLA4转导并用于生成结合曲线。
图39示出了改编自www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/characterize-biologics-for-immune-checkpoint-blockade-with-reporter-bioassays-using-spectramax-microplate-readers#gref的PROMEGA荧光素酶报告基因测定的示意图。
图40示出了示例性Promega CTLA4生物测定数据的图。针对Ipi生物类似物IgG对抗CTLA4 scFv-Fc进行测试。使用BMG polarstar omega以1秒(左列)或10秒(右列)的间隔对板进行读取。E1-B10、E1-A8、E2-A4和E1-D7在Ipi的约40％处显示出类似的活性。在板2上，E2-G9显示出与ipi相当的活性，然而E2-H10、E1-A4和E2-H12显示出最小限度的改善。
图41示出了双特异性设计的图示。当表达时，用IgG1铰链构建的BsAb显示出单体和二聚体的混合物，因此增加我们转换为IgG3铰链的二聚反应频率。我们最初建立两个构建体，一个在IgG3铰链之前带有(G4S)5接头，并且另一个没有前导接头。第二接头被保持在5个重复处，以为第2scFv提供充足的空间来达到结合位点而没有来自铰链的干扰。
图42示出了IgG3铰链接头序列的序列。
图43示出了针对非还原和还原的E1D7-IgG3铰链-P4B3M3和P4B3M3-IgG3铰链-E1D7 bsAb的示例性经标记的SDS Page Gel的图片。
图44示出了示例性数据的图表。SA传感器装载有生物素酰化的CTLA4或PD1，并且允许所指示的ab缔合/解离。由于传感器漂移，装载PD1的传感器的解离速率是不可靠的。
图45示出了来自示例性双重结合测定的数据。CTLA4+、PD1+或CTLA4+PD1+Jurkat细胞首先用指示量的单或双特异性蛋白包被。接下来添加可溶性蛋白并允许其与游离臂结合。如此处所示，单特异性ab不能结合显著量的可溶性抗原，然而当与表达PD1的细胞结合时，bsAb能够从溶液中捕获可溶性CTLA4。
图46示出了来自针对Ab(包括组合mAb)相比CD80 hFc对于CTLA4+/PD1+1G5Jurkat的竞争测定的非限制性示例性数据。在与单特异性抗体和混合物进行比较时，BsAb展示出CD80与PD1+CTLA4+jurkat细胞结合的明显改善的竞争。
图47示出了来自用CD80 hFc进行的针对与1G5 Jurkat上的CTLA4结合的％竞争测定的非限制性示例性数据。使用经CTLA4转导的Jurkat细胞的CD80竞争测定：针对CD80竞争对四种双特异性构建体进行了测试。两种具有完整的5,5接头构象，并且另外两种具有缩写的0,5接头。我们也转换了最终构建体中的aPD1/aCTLA4 ab的次序。如此处所示，E1-D7和E1-D7+P4B3m3组合疗法引起中度竞争，然而bsAb的形成显示出CD80竞争中的显著增加，这可能是由于由抗PD1结构域生成的附加的结合潜力。
图48示出了透明细胞肾细胞癌小图(A)特征(改编自Li等人,2019)和小图(B)针对细胞分化的模型(改编自Tun等人,2010)。
图49示出了改编自Feng等人,2019的ccRCC患者的OS的图。
图50示出了改编自Chevrier等人,2017的ccRCC的免疫群体的表示的图。
图51示出了CTLA4信号传导途径的图示和图。小图A示出了CTLA4信号传导途径的图示。小图B示出了ccRCC中的CTLA4过表达的图(改编自Lie等人,2020)。小图C示出了伊匹木单抗和CTLA4阻滞的图示。
图52示出了改编自Kim等人,2021的PD1信号传导途径的图片和图示。小图A示出了PD1-PDL1信号传导途径。小图B示出了ccRCC中的PD1过表达的组织学图像。小图C示出了PD1阻滞和非限制性效应的图示。
图53示出了双特异性抗体的双重检查点阻滞的图示。小图A示出了双重CTLA4/PDL检查点阻滞的示意图。小图B示出了非限制性示例性双特异性抗体形式。
图54示出了在临床中使用的示例性抗CTLA4/抗PD1双特异性抗体的表格。
图55示出了用于使用ELISA来评估抗CTLA4候选物对处于不同浓度的人和小鼠CTLA4的结合亲和力的非限制性示例性实验设计的示意图。
图56示出了ELISA结合曲线的非限制性数据和结果。小图A示出了ELISA结合曲线以指示抗CTLA4候选物对hCTLA4的结合亲和力。小图B示出了ELISA结合曲线以指示抗CTLA4候选物对mCTLA4的结合亲和力。小图C示出了ELISA结合曲线以指示抗CTLA4候选物对BSA(阴性对照)的结合亲和力。
图57示出了用于使用BLI-Octet来表征抗体候选物的动力学特性的非限制性示例性实验设计。
图58示出了指示抗CTLA4候选物的动力学特性的非限制性数据。在与伊匹木单抗进行比较时，所有所测试的候选物都具有更高的解离速率，即使当它们具有更高的缔合应答时。在候选物当中，C、B和G看起来具有最低的解离速率。KD-解离常数、Kon-缔合速率、Kon-缔合速率。
图59示出了用于确定抗CTLA4抗体阻断CD80/CD86/伊匹木单抗结合的能力以及确定抗体和配体在CTLA4的表面上的定位中的相似性的非限制性示例性实验设计的示意图。
图60示出了抗CTLA4候选物对CD80/CD86/伊匹木单抗与CTLA4结合的阻滞百分比的图表。CD80：伊匹木单抗在最高程度上阻断CD80。显示出最高CD80阻滞的候选物：I、E、J。CD86：所有候选物都显示出对CD86结合的100％阻滞。这可能是由于记录的CD86与CTLA4结合的较低亲和力。伊匹木单抗：所有候选物都在一定程度上阻断伊匹木单抗与CTLA4的结合，甚至是与mCTLA4产生交叉反应的那些。
图61示出了改编自He M,Chai Y,Qi J,Zhang CWH,Tong Z,Shi Y,Yan J,Tan S,Gao GF.Remarkably similar CTLA-4binding properties of therapeutic ipilimumaband tremelimumab antibodies.Oncotarget.2017年5月19日；8(40):67129-67139.doi:10.18632/oncotarget.18004.PMID:28978021；PMCID:PMC5620161的伊匹木单抗复合物的带状图。小图A示出了与突出显示的hCTLA4-接触残基复合的伊匹木单抗。小图B示出了与突出显示的mCTLA4-对准表位复合的伊匹木单抗。
图62示出了改编自Stamper CC,Zhang Y,Tobin JF,Erbe DV,Ikemizu S,DavisSJ,Stahl ML,Seehra J,Somers WS,Mosyak L.Crystal structure of the B7-1/CTLA-4complex that inhibits human immune responses.Nature.2001年3月29日；410(6828):608-11.doi:10.1038/35069118.Nature 2001年5月31日中的勘误表；411(6837):617.PMID:11279502的CD80复合物的带状图。小图A示出了与突出显示的hCTLA4-接触残基复合的CD80。小图B示出了与突出显示的mCTLA4-对准表位复合的CD80。
图63示出了用于确定候选抗体对表达CTLA4的Jurkat细胞的结合亲和力的实验设计的非限制性示例性示意图。
图64示出了抗CTLA4候选物对CTLA4+Jurkat细胞的结合亲和力的非限制性示例性结合曲线。
图65示出了用于评定抗体结合在促进CD28信号传导中的生物学意义的实验设计的非限制性示例性示意图。
图66示出了荧光素酶的诱导倍数相比抗CTLA4候选物的浓度的非限制性示例性图。跨两个板，伊匹木单抗显示出最高的荧光素酶表达诱导。8种所测试的候选物中的五种：E、H、J、F和I显示出类似的应答。
图67示出了抗CTLA-4抗体种系比对。
图68示出了抗CTLA-4抗体氨基酸序列。
图69示出了抗CTLA-4抗体核酸序列。
具体实施方式
缩写和定义
本文提供了一个或多个实施方案的具体实施方式。然而，应当理解，本发明可以用各种形式来体现。因此，本文所公开的具体细节不应被解释为限制性的，而是作为权利要求书的基础并且作为教导本领域技术人员以任何适当的方式来采用本发明的代表性基础。
除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(one or more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。
无论本文何处使用了“例如”、“如”、“包含”等短语，除非另有明确说明，否则应理解为短语“和但不限于”跟随其后。类似地，“实例”、“示例性”等应理解为非限制性的。
术语“基本上”允许与对预期目的不产生负面影响的描述符的偏离。即使“基本上”一词没有明确地列举出来，描述性术语也应理解为由术语“基本上”修饰。
术语“包括(comprising)”和“包含(including)”和“具有(having)”和“涉及(involving)”(和类似地“包括(comprises)”、“包含(includes)”、“具有(has)”和“涉及(involves)”)等可互换使用且具有相同含义。具体地，这些术语中的每个术语被定义成与“包括”的通用美国专利法定义一致，并且因此应被解释为意指“至少以下”的开放术语，并且还应被解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“涉及步骤a、b和c的过程”意指包含至少步骤a、b和c的过程。无论什么情况下使用术语“一个”或“一种”，除非这种解释在上下文中是没有意义的，否则应理解为“一个或多个/一种或多种”。
本文中使用术语“约”意指大约、大致、左右或在其区域中。当结合数值范围使用术语“约”时，该术语通过扩展所阐述的数值以上和以下的界限来修改所述范围。通常，本文中使用术语“约”按向上或向下(更高或更低)例如20％的变化来修饰所述值以上和以下的数值。
CTLA-4
针对人CTLA-4(第1轮至第3轮)或鼠CTLA-4(第3轮)执行人抗体-噬菌体筛选。经由针对可溶性蛋白的淘选发现第一组抗体，并且通过PMPL淘选发现第二组。
已表征针对人CTLA-4的一组人单克隆抗体的结合活性。抗CTLA-4免疫疗法正作为新兴的免疫肿瘤学领域的一部分进行评估。本文所述的抗CTLA-4mAb可具有治疗潜力。CTLA-4抗体已被鉴定为带有对CTLA-4的变化的亲和力。
本发明的方面提供了针对CTLA-4具有特异性的分离的抗体。如本文所用的关于细胞、核酸(诸如DNA或RNA)的术语“分离的”是指分别与大分子的天然来源中存在的其他DNA或RNA分开的分子。术语“分离的”也可指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。例如，“分离的核酸”可包括并非作为片段天然存在并且不会以天然状态被发现的核酸片段。“分离的”也可指从其他细胞蛋白或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽可包括经纯化的多肽和重组的多肽两者。通过使用针对显示CTLA4作为选择靶标的可溶性或顺磁性蛋白脂质体进行淘选的270亿成员人单链抗体(scFv)噬菌体文库来鉴定分离的抗体。这些抗体代表新的一类针对CTLA-4的单克隆抗体。本文所讨论的单克隆CTLA-4抗体也可用于构建多特异性抗体或用作针对遗传工程细胞(诸如CAR-T细胞、CAR-NK细胞或遗传工程B细胞)的有效载荷。
本文描述了独特的重组单克隆CTLA-4抗体。“重组的”在其涉及多肽(诸如抗体)或多核苷酸时是指天然不存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性示例可通过组合通常不会一起出现的多核苷酸或多肽来形成。
本文提供了单克隆CTLA-4抗体的氨基酸序列(参见表1至表26)；CTLA-4抗体的重链和轻链互补决定区CDR的氨基酸序列为下文加下划线的(CDR1)、加下划线且加粗的(CDR2)或加下划线、斜体且加粗的(CDR3)：
本文提供了单克隆CTLA-4抗体的核酸序列(参见表27至表52)：
CTLA-4抗体的重链和轻链互补决定区的氨基酸序列在下表53A-B中示出：
表53A.CTLA-4抗体的重链(VH)互补决定区(CDR)
表53B.CTLA-4抗体的轻链(VL)互补决定区(CDR)
CTLA-4抗体的重链和轻链互补决定区的核酸序列在下表54A-B中示出：
表54A.CTLA-4抗体的重链(VH)互补决定区(CDR)
表54B.CTLA-4抗体的轻链(VL)互补决定区(CDR)
CTLA4抗体的重链和轻链框架区的氨基酸序列在下表55A-B中示出：
表55A.CTLA-4抗体的重链(VH)框架区(FR)
表55B.CTLA-4抗体的轻链(VL)框架区(FR)
CTLA-4抗体的重链和轻链框架区的核酸序列在下表56A-B中示出：
表56A.CTLA-4抗体的重链(VH)框架区(FR)
表56B.CTLA-4抗体的轻链(VL)框架区(FR)
本文所述的CTLA-4抗体与CTLA-4结合。在一个实施方案中，CTLA-4抗体具有针对CTLA-4的高亲和力和高特异性。一些实施方案也以与本文所述的抗CTLA-4抗体的氨基酸序列或核苷酸序列具有指定百分比同一性或相似性的抗体为特征。例如，“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过将每个序列中的位置进行比较来确定，出于比较的目的，可对每个序列进行比对。当所比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性的程度是序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。例如，在与本文所述的抗CTLA-4抗体中的任一种抗体的指定区域或全长进行比较时，抗体可具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性。例如，在与本文所述的抗CTLA-4抗体中的任一种抗体的指定区域或全长进行比较时，抗体可具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核酸同一性。与本发明的核酸和蛋白质的序列同一性或相似性可通过本领域中已知的方法通过序列比较和/或比对来确定，例如，使用本领域中已知的软件程序，诸如Ausubel等人编写(2007)Current Protocols in Molecular Biology中所描述的那些。例如，序列比较算法(即BLAST或BLAST 2.0)、人工比对或目视检查可用于确定针对本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性或相似性。
如本文所用，“多肽”可涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性联结的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、低聚肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或者用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语在本文中可指“多肽”，并且术语“多肽”可代替这些术语中的任一个术语或与这些术语中的任一个术语可互换地使用。“多肽”也可指多肽的表达后修饰(包括但不限于通过已知的保护(protecting)/保护(blocking)基团糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸修饰)的产物。多肽可衍生于天然生物来源或通过重组技术产生，但不必从指定的核酸序列翻译而成。它可以任何方式生成，包括通过化学合成。关于氨基酸序列，本领域技术人员将易于认识到，改变、添加、缺失或取代编码的序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸序列、肽序列、多肽序列或蛋白质序列的单独的取代、缺失或添加在本文中统称为“保守地修饰的变异体”。在一些实施方案中，该改变引起氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。与未修饰的CTLA-4抗体相比，本文所公开的抗CTLA-4抗体的此类保守地修饰的变异体可表现出对CTLA-4增加的交叉反应性。
例如，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，氨基酸串可被在侧链家族成员的次序和/或组成上不同的结构上相似的串替代。
抗体
如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”可指特异性地识别抗原并与该抗原结合的多肽或多肽复合物。抗体可以为整个抗体以及任何抗原结合片段或其单链。例如，“抗体”可包括含有这样的分子的任何蛋白质或肽，该分子包含具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。非限制性示例为重链或轻链的互补决定区(CDR)或者其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或它们的任何部分、或结合蛋白的至少一部分。如本文所用，术语“抗体”可指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫学活性部分，即，含有特异性地结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。所谓“特异性地结合”或“与……发生免疫反应”意指抗体与期望抗原的一种或多种抗原决定簇发生反应，并且不与其他多肽发生反应。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，诸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论结构如何，抗体片段都与被完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”可包括适体(诸如spiegelmer)、微抗体和双体。术语“抗体片段”也可包括通过与特异性抗原结合以形成复合物而像抗体一样起作用的任何合成或遗传工程蛋白质。本文所述的抗体、抗原结合多肽、变异体或衍生物包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、dAb(结构域抗体)、微抗体、二硫键联结的Fv(sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)的融合蛋白。单链Fv(“scFv”)多肽分子为共价联结的VH:VL异质二聚体，其可由包括通过肽编码接头联结的VH编码基因和VL编码基因的基因融合体表达。(参见Huston等人(1988)Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883)。在一些方面，这些区域用十个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可为了灵活性而富含甘氨酸以及为了溶解性而富含丝氨酸或苏氨酸，并且可将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或者反之亦然。该蛋白质保持初始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头。已经描述了许多方法来辨别用于将来自抗体V区的天然聚集但化学上分开的轻多肽链和重多肽链转化成scFv分子的化学结构，该scFv分子将折叠成基本上类似于抗原结合位点的结构的三维结构。参见例如美国专利号5,091,5 13；美国专利号5,892,019；美国专利号5,132,405；和美国专利号4,946,778，这些专利中的每个专利的全部内容以引用方式并入本文。
已经创建并且可以创建非常大的原初人scFv文库，以提供针对过多靶分子的大量重排抗体基因来源。可以从患有感染性疾病的个体构建较小的文库，以便分离疾病特异性抗体。(参见Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9339-43(1992)；Zebedee等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3 175-79(1992))。
还可以修饰本发明的抗体以产生镶嵌抗体。镶嵌抗体是这样一种抗体：其中一个物种的抗体的外部氨基酸残基被第二物种的抗体的外部氨基酸残基合理地替代或“镶嵌”，使得第一物种的抗体在第二物种中无免疫原性，从而降低该抗体的免疫原性。由于蛋白质的抗原性主要取决于其表面特性，因此抗体的免疫原性可以通过取代暴露的残基来降低，这些暴露的残基不同于通常在另一哺乳动物物种的抗体中发现的那些残基。这种外部残基的合理置换应当对内部结构域或结构域间接触几乎没有影响，或完全没有影响。因此，由于变化限于可变区框架残基，所以配体结合特性不应受到影响。该过程被称为“镶嵌”，是因为只有抗体的外表面或外层发生改变，支持残基保持未受干扰。
“镶嵌”过程利用由可获得的Kabat等人(1987)Sequences of Proteins ofImmunological interest，第4版，Bethesda,Md.,National Institutes of Health，该数据库的更新，以及其他可访问的美国和国外数据库(核酸和蛋白质)汇编的人抗体可变结构域的序列数据。用于生成镶嵌抗体的方法的非限制性实例包括EP 519596、美国专利6,797,492号；并且在Padlan等人，1991中有所描述。
从人获得的抗体分子分为五类免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，它们因分子中存在的重链的性质而彼此不同。本领域技术人员将理解，重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中在它们当中有一些亚类(例如，γ1至γ4)。某些类别也具有亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等等。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被充分表征并且已知赋予功能特化。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两个相同轻链多肽以及分子量53,000至70,000的两个相同重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构象接合，其中轻链在“Y”的开口处开始并继续通过可变区来支撑重链。本文所述的免疫球蛋白或抗体分子可具有免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
轻链被分类为kappa或lambda(κ、λ)。每种重链类别可与κ轻链或λ轻链结合。一般来讲，轻链和重链彼此共价结合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程宿主细胞生成时这两条重链的“尾区”部分通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构象的分叉端处的N-末端延伸至每条链的底部处的C-末端。
轻链和重链两者都被分成结构和功能同源性区域。术语“恒定的”和“可变的”在功能上进行使用。轻(VL)链部分和重(VH)链部分两者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，诸如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。术语“抗原结合位点”或“结合部分”可指参与抗原结合的免疫球蛋白分子部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度差异区段，称为“高变区”，插入在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”可指天然存在于免疫球蛋白的高变区之间以及与这些高变区相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此设置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链各自的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。含有CDR的VH区和VL区以及CTLA-4抗体的框架(FR)在表1A至表12B中示出。
每个抗原结合结构域中存在的六个CDR为短的非连续氨基酸序列，这些短的非连续氨基酸序列被特异性地定位以形成抗原结合结构域，因为抗体在水性环境中呈现其三维构象。抗原结合结构域(FR区)中的氨基酸中的其余氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区主要采用β-折叠(β-sheet)构象，并且CDR形成连接β-折叠结构(并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分)的环。框架区用于形成支架，该支架通过链间非共价相互作用来提供以正确取向定位CDR。由被定位的CDR形成的抗原结合结构域提供与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，这促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于重链可变区或轻链可变区，本领域普通技术人员可易于鉴定分别包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们先前已被定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.等人,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。
在存在本领域内使用和/或接受的术语的两种或更多种定义的情况下，如本文所用的术语的定义旨在包括所有此类含义，除非有相反的明确说明。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链多肽和轻链多肽的可变区内存在的非连续抗原结合位点。已由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983)以及由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述了这种特定区，这些文献的全部内容以引用方式并入本文。根据Kabat和Chothia的CDR定义包括在针对彼此进行比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，用于指抗体或其变异体的CDR的任一定义的应用旨在处于如本文所定义和所使用的术语的范围内。在下表中列出涵盖如上文引用的参考文献中的每个参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基来作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数量将根据CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规方式来确定哪些残基包含特定CDR。
Kabat等人定义了适用于任何抗体的针对可变结构域序列的编号系统。技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)阐述的编号系统。
除上表之外，Kabat编号系统还描述了如下CDR区：CDR-H1在约氨基酸31(即，在第一个半胱氨酸残基之后约9个残基)处开始，包括约5个至7个氨基酸，并且在下一个色氨酸残基处结束。CDR-H2在CDR-H1的端部之后第十五个残基处开始，包括约16个至19个氨基酸，并且在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。CDR-H3在CDR-H2的端部之后约第三十三个氨基酸残基处开始；包括3个至25个氨基酸；并且在序列W-G-X-G处结束，其中X为任何氨基酸。CDR-L1在约残基24处(即，在半胱氨酸残基之后)开始；包括约10个至17个残基；并且在下一个色氨酸残基处结束。CDR-L2在CDR-L1的端部之后约第十六个残基处开始并且包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2的端部之后约第三十三个残基处(即，在半胱氨酸残基之后)开始；包括约7个至11个残基并且在序列F或W-G-X-G处结束，其中X为任何氨基酸。
如本文所用，术语“表位”可包括可与免疫球蛋白、scFv或T细胞受体特异性地结合的任何蛋白质决定簇。可变区允许抗体选择性地识别以及特异性地结合抗原上的表位。例如，抗体的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)子集组合形成定义三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构(quaternary antibody structure)形成存在于Y的每个臂的端部处的抗原结合位点。表位决定簇可由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，可针对多肽的N-末端肽或C-末端肽而产生抗体。更具体地，抗原结合位点由VH链和VL链中的每一者上的三个CDR定义(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在一个实施方案中，抗体可针对具有Ann UniProt参考号：P16410的人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)(CTLA-4_HUMAN)(长度为223个氨基酸残基)，其包含SEQ ID NO:[]的氨基酸序列：
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”可以指发生在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)表示，其中Kd越小代表亲和力越大。可以使用本领域熟知的方法来定量所选多肽的免疫结合特性。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)均可以通过计算浓度以及实际结合和解离速率来确定。(参见Nature 361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率使得能够消除与亲和力无关的所有参数，并且等于平衡结合常数KD。(一般参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。如通过动力学测定(诸如放射性配体结合测定)或本领域技术人员已知的类似测定(诸如BIAcore或Octet(BLI))所测量的，当平衡结合常数(KD)为≤1μM、≤10μΜ、≤10nM、≤10pM或≤100pM至约1pM时，本发明的抗体可与CTLA4表位特异性地结合。例如，在一些实施方案中，KD为约1E-12M至KD约1E-11M。在一些实施方案中，KD为约1E-11M至KD约1E-10M。在一些实施方案中，KD为约1E-10M至KD约1E-9M。在一些实施方案中，KD为约1E-9M至KD约1E-8M。在一些实施方案中，KD为约1E-8M至KD约1E-7M。在一些实施方案中，KD为约1E-7M至KD约1E-6M。例如，在一些实施方案中，KD为约1E-12M，而在其他实施方案中，KD为约1E-11M。在一些实施方案中，KD为约1E-10M，而在其他实施方案中，KD为约1E-9M。在一些实施方案中，KD为约1E-8M，而在其他实施方案中，KD为约1E-7M。在一些实施方案中，KD为约1E-6M，而在其他实施方案中，KD为约1E-5M。在一些实施方案中，例如，KD为约3E-11M，而在其他实施方案中，KD为约3E-12M。在一些实施方案中，KD为约6E-11M。“特异性地结合”或“对……具有特异性”可指经由其抗原结合结构域与表位结合的抗体，并且该结合需要抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。例如，当抗体经由其抗原结合结构域比其会与随机的不相关表位结合更容易地与表位结合时，称该抗体与该表位“特异性地结合”。
例如，CTLA4抗体可以为一价或二价的，并且可包含单链或双链。在功能上，CTLA4抗体的结合亲和力处于10-5M至10-12M的范围内。例如，CTLA4抗体的结合亲和力为10-6M至10-12M、10-7M至10-12M、10-8M至10-12M、10-9M至10-12M、10-5M至10-11M、10-6M至10-11M、10-7M至10- 11M、10-8M至10-11M、10-9M至10-11M、10-10M至10-11M、10-5M至10-10M、10-6M至10-10M、10-7M至10- 10M、10-8M至10-10M、10-9M至10-10M、10-5M至10-9M、10-6M至10-9M、10-7M至10-9M、10-8M至10-9M、10-5M至10-8M、10-6M至10-8M、10-7M至10-8M、10-5M至10-7M、10-6M至10-7M或10-5M至10-6M。
CTLA-4蛋白或者其衍生物、片段、类似物、同源物或直系同源物可在免疫特异性地结合这些蛋白组分的抗体的生成中用作免疫原。与蛋白脂质体偶联的CTLA-4蛋白或者其衍生物、片段、类似物、同源物或直系同源物可在免疫特异性地结合这些蛋白组分的抗体的生成中用作免疫原。
本领域技术人员将认识到，通过查明人单克隆抗体是否阻止本发明的人单克隆抗体与CTLA-4结合，无需过度实验就可以确定前者是否具有与后者相同的特异性。例如，如果受测试的人单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体竞争，如通过由本发明的人单克隆抗体进行的结合的降低所示，那么这两种单克隆抗体可能与相同表位或者与密切相关的表位结合。
另一种确定人单克隆抗体是否具有本发明的人单克隆抗体的特异性的方式是将本发明的人单克隆抗体与CTLA-4蛋白(本发明的人单克隆抗体通常与该蛋白发生反应)一起预温育，并且随后添加受测试的人单克隆抗体以确定受测试的人单克隆抗体在其结合CTLA-4的能力方面是否受到抑制。如果受测试的人单克隆抗体受到抑制，则极有可能具有与本发明的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。对本发明的人单克隆抗体的筛选也可通过利用CTLA-4并且确定测试单克隆抗体是否能够中和CTLA-4来进行。
本领域已知的各种方法可用于产生针对本发明的蛋白或针对其衍生物、片段、类似物同源物或直系同源物的多克隆抗体或单克隆抗体。(参见例如Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow E和Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，该文献以引用方式并入本文)。
可以通过熟知的技术纯化抗体，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析，其主要提供免疫血清的IgG级分。随后，或另选地，可将作为所探索的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲合层析来纯化免疫特异性抗体。例如，D.Wilkinson(The Scientist，The Scientist,Inc.出版，Philadelphia PA，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25至28页)论述了免疫球蛋白的纯化方法。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”或“单克隆抗体组合物”可指包含由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的仅一个分子种类的抗体分子的群体。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中都是相同的。MAb包含能够与抗原特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，该抗原特定表位的特征在于对该抗原结合位点具有独特的结合亲和力。
可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，例如由Kohler和Milstein，Nature,256:495(1975)描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物进行免疫，以诱发产生或能够产生将特异性地结合到该免疫剂的抗体的淋巴细胞。替代性地，淋巴细胞可以进行体外免疫。
免疫剂可以包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。例如，如果需要人源细胞，则可使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则可使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress,(1986)第59至103页)。无限增殖化细胞系可以为转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物源、牛源和人源的骨髓瘤细胞。例如，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，该培养基含有抑制未融合的无限增殖化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质防止HGPRT缺陷细胞生长。
可用的无限增殖化细胞系为有效地融合、支持由所选择的抗体产生细胞进行抗体的稳定的高水平表达并且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些。例如，无限增殖化细胞系可以为鼠骨髓瘤系，其可获自例如Salk Institute Cell Distribution Center(加利福尼亚州圣地亚哥)和American Type Culture Collection(弗吉尼亚州马纳萨斯)。人骨髓瘤细胞系和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体。(参见Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)第51至63页))。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中存在针对抗原的单克隆抗体。例如，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。这样的技术和测定是本领域已知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力可以通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析来确定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是识别对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体。
在鉴别期望的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，然后通过标准方法培育。(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59至103页)。用于此目的的合适培养基包括，例如，Dulbecco改良的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。可选地，杂交瘤细胞可以作为哺乳动物的腹水在体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(诸如，蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基或腹水中分离或纯化。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法(诸如美国专利号4,816,567(全文以引用方式并入本文)中描述的那些)来制备。可使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地对编码本发明的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。本发明的杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染至宿主细胞，例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。也可对DNA进行修饰，例如，通过用针对人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；Morrison,Nature 368,812-13(1994))，或者通过将针对非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价接合到免疫球蛋白编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明抗体的恒定结构域，或者可以取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。
完全人抗体例如为其中轻链和重链两者的整个序列(包括CDR)来自人基因的抗体分子。此类抗体被称为“人抗体”或“完全人抗体”。可通过使用三源杂交瘤(trioma)技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人,1983Immunol Today 4:72)；以及用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77至96页中)来制备人单克隆抗体(诸如完全人抗体和人源化抗体)。可利用人单克隆抗体，并且可通过使用人杂交瘤(参见Cote等人,1983.Proc Natl AcadSci USA 80:2026-2030)或通过在体外用爱泼斯坦-巴尔病毒转化人B细胞(参见Cole等人,1985MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77至96页中)来产生人单克隆抗体。
“人源化抗体”可以为来自非人物种(诸如小鼠)的抗体，其氨基酸序列(例如，在CDR区中)已被修饰以增加它们与人产生的抗体变异体的相似性。抗体可以通过本领域已知的方法(例如CDR移植)进行人源化。还可参见Safdari等人,(2013)Biotechnol Genet EngRev.；29:175-86。此外，人源化抗体可在转基因植物中产生，作为现有哺乳动物系统的廉价产生替代形式。例如，转基因植物可以是烟草植物，即本氏烟草(Nicotiania benthamiana)和普通烟草(Nicotiana tabaccum)。抗体从植物叶中纯化。植物的稳定转化可以通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或粒子轰击来实现。例如，至少含有重链和轻链序列的核酸表达载体通过转化在细菌培养物(即根癌农杆菌菌株BLA4404)中表达。植物的渗透可以通过注射来完成。可溶性叶提取物可以通过在研钵中研磨叶组织并通过离心进行制备。可以通过本领域技术人员已知的许多方法容易地进行抗体的分离和纯化。在植物中产生抗体的其他方法描述于，例如，Fischer等人,Vaccine,2003,21:820-5；和Ko等人,Current Topics in Microbiology and Immunology,第332卷,2009，第55-78页。因此，本发明还提供了包括编码本发明的抗体或产生本发明的抗体的载体的任何细胞或植物。
可使用本领域中已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶面(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.等人,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))和链改组(美国专利号5,565,332，该美国专利以其全文以引用方式并入本文)。“人源化”(也称为再成形或CDR移植)是为技术人员所理解的用于降低来自异种来源(通常为啮齿动物)的单克隆抗体(mAb)的免疫原性以及用于改善它们对人免疫系统的活化的完善的技术(参见例如Hou S,Li B,Wang L,QianW,Zhang D,Hong X,Wang H,Guo Y(2008年7月).“Humanization of an anti-CD34monoclonal antibody by complementarity-determining region grafting based oncomputer-assisted molecular modeling”.J Biochem.144(1):115–20)。
此外，也可使用其他技术(包括噬菌体展示文库)来产生抗体(诸如人抗体)。(参见Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol,222:581(1991))。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物(例如，其中已使内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。在攻击后，观察到人抗体产生，这在所有方面(包括基因重排、组装和抗体组库)与在人体中见到的高度相似。该方法描述于例如以下文献中：美国专利5,545,807号、5,545,806号、5,569,825号、5,625,126号、5,633,425号、5,661,016号；以及Marks等人,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
可另外使用转基因非人动物来产生人抗体，该动物经修饰以便产生完全人抗体，而不是响应于抗原激发的动物的内源性抗体。(参见PCT公开号WO94/02602和美国专利号6,673,986)。已使非人宿主中编码重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的内源性基因失去功能，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座被插入到宿主的基因组中。例如，使用包含必需的人DNA区段的酵母人工染色体掺入人基因。然后，通过杂交所包含的修饰比全部期望修饰的全互补物少的中间转基因动物，获得提供全部期望修饰的动物作为后代。此类非人动物的非限制性示例为小鼠，并且如PCT公开号WO96/33735和WO96/34096中所公开的被称为XenomouseTM。这种动物产生的B细胞可分泌完全人免疫球蛋白。抗体可以在用目标免疫原免疫后直接从动物获得，例如，多克隆抗体的制备物，或可选地从动物衍生的永生化B细胞获得，例如产生单克隆抗体的杂交瘤。此外，可以回收和表达编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因以直接获得抗体，或可以进一步修饰以获得抗体的类似物，例如单链Fv(scFv)分子。
因此，使用此类技术，可产生治疗上可用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于产生人抗体的这种技术的综述，参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.73:65-93(1995)。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开号WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，这些文献以其全文以引用方式并入本文。此外，可雇佣诸如Creative BioLabs(纽约州雪莉)等公司使用与本文所述的技术类似的技术来提供针对所选择的抗原的人抗体。
美国专利号5,939,598中公开了产生缺乏内源性免疫球蛋白重链表达的非人宿主(例如小鼠)的方法的实例。它可以通过以下方法获得：该方法包括从胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座使J区段基因缺失以防止该基因座重排以及防止形成重排免疫球蛋白重链基因座的转录物，该缺失是通过包含编码选择性标志物的基因的靶向载体来实现的；然后从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞含有编码选择性标志物的基因。
在美国专利号5,916,771中公开了一种用于产生目标抗体(例如人抗体)的方法。该方法包括将包含编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养中的一个哺乳动物宿主细胞中，将包含编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一个哺乳动物宿主细胞中，并将两个细胞融合以形成杂交细胞。杂交细胞表达包含重链和轻链的抗体。
在该程序的进一步改善中，PCT公开号WO99/53049中公开了一种用于鉴别免疫原上的临床相关表位的方法以及一种用于选择以高亲和力与相关表位免疫特异性地结合的抗体的相关方法。
也可通过包含编码本文所述的单链抗体的DNA区段的载体来表达感兴趣抗体。载体包括但不限于：具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)的化学缀合物(诸如WO 93/64701中所描述的)；病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)；作为含有靶部分(例如对靶细胞特异的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白的融合蛋白(诸如PCT/US 95/02140(WO 95/22618)中所描述的)；质粒；噬菌体；病毒载体等。载体可以为染色体的、非染色体的或合成的。逆转录病毒载体也可被使用并且包括莫洛尼鼠白血病病毒。DNA病毒载体也可被使用并且包括：痘病毒载体，诸如正痘病毒或禽痘病毒载体；疱疹病毒载体，诸如单纯疱疹I型病毒(HSV)载体(参见Geller,A.I.等人,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.等人,DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover编中(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等人,ProcNatl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA 87:1149(1990)；腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人,Science,259:988(1993)；Davidson等人,Nat.Genet 3:219(1993)；Yang等人,J.Virol.69:2004(1995)；以及腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G..等人,Nat.Genet.8:148(1994)。
痘病毒载体将基因引入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体仅引起核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可用于将核酸引入到神经细胞中。与腺相关病毒(约4个月)相比，腺病毒载体引起较短期表达(约2个月)，而腺相关病毒的表达时间又比HSV载体更短。所选择的特定载体将取决于靶细胞和所治疗的病况。引入可通过标准技术例如感染、转染、转导或转化来进行。基因转移模式的示例包括例如裸DNA、CaP04沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染、细胞显微注射和病毒载体。
该载体可以用于基本上靶向任何期望的靶细胞。例如，立体定向注射可用于将载体(例如，腺病毒、HSV)引导至期望的位置。此外，可以使用微型泵输注系统，诸如SynchroMed输注系统，通过脑室内(icv)输注来递送颗粒。一种基于整体流动(称为对流)的方法也已被证明可有效地将大分子递送至大脑的扩展区域，并可用于将载体递送至靶细胞。(参见Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994)；Morrison等人,Am.J.Physiol.266:292-305(1994))。可以使用的其他方法包括导管、静脉内注射、肠胃外注射、腹膜内注射和皮下注射，以及口服或其他已知的施用途径。
这些载体可用于表达可用于多种方式的大量抗体。例如，用于检测样品中CTLA4的存在。该抗体也可用于尝试与CTLA4结合并破坏其活性。
在实施方案中，可使用基于基因的方法将本文的抗体递送至受试者。例如，可使用载体、DNA或RNA将如本文所述的抗CTLA4抗体的核苷酸序列递送到受试者中。参见例如Deal,Cailin E.,Andrea Carfi和Obadiah J.Plante.“Advancements in mRNA EncodedAntibodies for Passive Immunotherapy.”Vaccines 9.2(2021):108。此类方法可允许设计和生成带有改善和/或增加的功能的更复杂的抗体分子。
病毒载体(诸如腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV))已通过用编码感兴趣抗体的核酸序列取代它们的基因组的一部分而被工程化用于体内mAb表达。术语“病毒载体”可指包括病毒来源的至少一个元件并且具有被封装到病毒载体颗粒中的能力的核酸载体构建体。病毒载体可含有编码如本文所述的抗体、其抗原结合部分或CAR的核酸以取代非必需病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中的目的。
逆转录病毒是用于基因递送的常用工具。在实施方案中，逆转录病毒用于将编码抗体的多核苷酸递送至细胞。术语“逆转录病毒”可指将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价地整合到宿主基因组中的RNA病毒。一旦病毒被整合到宿主基因组中，则称之为“原病毒”。原病毒充当针对RNA聚合酶II的模板并且引导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。
适用于具体实施方案中的例示性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒属。
术语“慢病毒属”可指复杂逆转录病毒的组(或属)。例示性慢病毒属包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)是优选的。在具体实施方案中，慢病毒属用于将包含CAR的多核苷酸递送至细胞。
抗体核苷酸序列本身(如DNA或RNA)的基因转移是针对瞬态体内抗体产生的另选的选项。例如，质粒DNA方法可利用电穿孔组分以增强IM递送后的转染效率。此外，mRNA递送可用于抗体的体内表达。在实施方案中，编码感兴趣抗体的mRNA可被修饰，诸如优化mRNA密码子使用，并且脂质纳米颗粒可用于mRNA递送。
在一个实施方案中，本文所述的抗体可以为全长抗体，含有和与Fc受体结合的野生型Fc区相似的Fc区。
多种技术可适于产生对本发明的抗原蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如美国专利号4,946,778)。此外，多种方法可适用于构建Fab表达文库(参见例如Huse等人,1989Science 246:1275-1281)以允许快速和有效地鉴定带有针对蛋白质或者其衍生物、片段、类似物或同系物的期望特异性的单克隆Fab片段。含有针对蛋白质抗原的独特型的抗体片段可通过本领域中已知的技术来产生，包括但不限于：(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化所产生的F(ab')2片段；(ii)通过还原F(ab')2片段的二硫桥所生成的Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子所生成的Fab片段，以及(iv)Fv片段。
异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，此类抗体可将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(参见美国专利号4,676,980)以及用于治疗HIV感染(参见PCT公开号WO91/00360；WO92/20373)。可使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯，以及例如在美国专利4,676,980号中所公开的那些。
本发明的抗体可在效应子功能方面被修饰，以便增强例如抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而使得在该区域中形成链间二硫键。由此生成的同源二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人,J.Exp Med.,176:1 191-1 195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992))。可选地，可以设计具有双Fc区的抗体，从而可以增强补体裂解和ADCC能力。(参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230(1989))。在一个实施方案中，本发明的抗体具有对Fc区的修饰，使得Fc区不与Fc受体结合。例如，Fc受体为Fcγ受体。带有对Fc区的修饰使得Fc区不与Fcγ结合但仍与新生Fc受体结合的抗体是可用的，如本文所述。
在某些实施方案中，本发明的抗体可包含Fc变异体，该Fc变异体包含改变抗体的非抗原依赖性效应子功能，特别是抗体的循环半衰期的氨基酸取代。在与缺乏这些取代的抗体进行比较时，此类抗体表现出增加的或减少的与FcRn的结合，因此分别具有增加的或减少的在血清中的半衰期。预期带有针对FcRn的改善的亲和力的Fc变异体具有较长的血清半衰期，并且此类分子可用于治疗哺乳动物的方法(其中期望所施用的抗体的长半衰期，例如以治疗慢性疾病或疾患)中。相比之下，预计带有降低的FcRn结合亲和力的Fc变异体具有较短的半衰期，并且此类分子也可用于例如施用于哺乳动物(其中缩短的循环时间可有利地例如用于体内诊断成像，或者在其中起始抗体在循环中存在达延长的周期时具有毒性副作用的情况下)。带有降低的FcRn结合亲和力的Fc变异体也不太可能穿过胎盘，并且因此也可用于治疗怀孕妇女的疾病或疾患。此外，其中可能期望降低的FcRn结合亲和力的其他应用包括其中期望定位到脑、肾脏和/或肝脏的那些应用。在一个实施方案中，含有Fc变异体的抗体可表现出减少的从脉管系统穿过肾脏肾小球的上皮的转运。在另一个实施方案中，含有Fc变异体的抗体可表现出减少的从脑穿过血脑屏障(BBB)进入脉管空间的转运。在一个实施方案中，带有改变的FcRn结合的抗体包含在Fc结构域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。FcRn结合环由氨基酸残基280至299(根据EU编号)组成。带有改变的FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于PCT公开号WO05/047327中，其以引用方式并入本文。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其片段包含具有以下取代中的一个或多个取代的Fc结构域：V284E、H285E、N286D、K290E和S304D(EU编号)。
在一些实施方案中，将突变引入到mAb的恒定区，使得mAb的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性被改变。例如，突变为CH2结构域中的LALA突变。在一个实施方案中，抗体(例如，人mAb或双特异性Ab)在异质二聚体mAb的一个scFv单元上含有突变，其降低ADCC活性。在另一个实施方案中，mAb在异质二聚体mAb的两条链上都含有突变，其完全消除ADCC活性。例如，引入到mAb的一个或两个scFv单元中的突变为CH2结构域中的LALA突变。可优化带有可变ADCC活性的这些mAb，使得mAb对表达被mAb识别的一种抗原的细胞表现出最大选择性杀伤，然而对被mAb识别的第二种抗原表现出最小杀伤。
在其他实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的本发明的抗体具有恒定区，例如，IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，其可被改变以减少或消除糖基化。例如，本发明的抗体也可包含Fc变异体，该Fc变异体包含改变抗体的糖基化的氨基酸取代。例如，Fc变异体可具有减少的糖基化(例如，N-联结或O-联结的糖基化)。在一些实施方案中，Fc变异体包含通常存在于氨基酸位置297(EU编号)处的N-联结的聚糖的减少的糖基化。在另一个实施方案中，抗体在糖基化基序(例如，含有氨基酸序列NXT或NXS的N-联结的糖基化基序)附近或之内具有氨基酸取代。在具体实施方案中，抗体包含在氨基酸位置228或299(EU编号)处带有氨基酸取代的Fc变异体。在更具体的实施方案中，抗体包含IgGl或IgG4恒定区，该恒定区包含S228P和T299A突变(EU编号)。
赋予减少或改变的糖基化的示例性氨基酸取代描述于PCT公开号WO05/018572中，该文献以其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，修饰本发明的抗体或其片段以消除糖基化。此类抗体或其片段可被称为“agly”抗体或其片段(例如“agly”抗体)。不受理论的束缚，“agly”抗体或其片段可具有改善的体内安全性和稳定性特征。示例性agly抗体或其片段包含IgG4抗体的非糖基化Fc区，其缺乏Fc效应子功能，从而消除对表达CTLA4的正常生命组织和细胞的Fc介导的毒性的可能性。在其他实施方案中，本发明的抗体或其片段包含改变的聚糖。例如，抗体可在Fc区的Asn297处的N-聚糖上具有减少数量的岩藻糖残基，即，该抗体为非岩藻糖基化的。在另一个实施方案中，抗体可在Fc区的Asn297处的N-聚糖上具有改变的数量的唾液酸残基。
本发明也涉及包含与细胞毒性剂诸如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)缀合的抗体的免疫缀合物。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、三年桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂菌褶素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。多种放射性核素可用于产生放射性缀合的抗体。非限制性示例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
使用多种双官能蛋白偶联剂制成抗体和细胞毒性剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性含氟化合物(诸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等人,Science238:1098(1987)中所描述的来制备蓖麻毒素免疫毒素。碳14标记的l-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见PCT公开号WO94/11026和美国专利号5,736,137)。
本领域的普通技术人员理解，各种各样的可能部分均可与本发明的所得抗体或其他分子偶联。(参见例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology andImmunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr(编),Carger Press,New York,(1989)，其全部内容以引用方式并入本文)。
只要抗体和其他部分保留它们各自的活性，偶联可以通过将结合两个分子的任何化学反应来完成。这种连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。在一个实施方案中，结合为共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子(诸如本发明的抗体)与其他分子偶联。例如，代表性偶联剂可以包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表并非旨在穷尽本领域已知的各种类型的偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例。(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；以及Vitetta等人,Science 238:1098(1987))。接头的非限制性示例描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan,S.等人,Cancer Res.44:201-208(1984)描述了MBS(间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途)。另见，美国专利号5,030,719，描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤代乙酰酰肼衍生物的用途。可与本发明的抗体一起使用的可用接头的非限制性示例包括：(i)EDC(l-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.，目录(21558G)；(iii)SPDP，琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(PierceChem.Co.，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.目录号2165-G)；以及(v)与EDC缀合的磺基-NHS(-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，目录号24510)。
本文所述的接头包含具有不同属性的组分，从而产生具有不同物理化学性质的缀合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。包含NHS酯的接头比磺基-NHS酯的溶解度更低。此外，接头SMPT包含空间位阻二硫键，并且可以形成稳定性更高的缀合物。二硫键通常比其他键更不稳定，因为二硫键在体外裂解，导致可获得的缀合物更少。特别地，磺基-NHS可以提高碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS结合使用时，碳二亚胺偶联(例如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。
本文公开的抗体也可以配制成免疫脂质体。含有该抗体的脂质体通过本领域中已知的方法来制备，诸如以下文献中描述的那些：Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；以及美国专利4,485,045号和4,544,545号。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
可用的脂质体的非限制性示例可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法来生成。脂质体通过限定孔径的滤器挤出，得到具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab'片段可经由二硫化物交换反应与如Martin等人,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述的脂质体缀合。
多特异性抗体(双特异性和三特异性)
多特异性抗体为可识别两种或更多种不同抗原的抗体。例如，双特异性抗体(bsAb)为包含两种可变结构域或scFv单元使得所得抗体识别两种不同抗原的抗体。例如，三特异性抗体(tsAb)为包含两种可变结构域或scFv单元使得所得抗体识别三种不同抗原的抗体。本发明提供了识别CTLA-4和第二抗原和/或第三抗原的多特异性抗体，诸如双特异性抗体和三特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体)可包括涵盖本文所述的抗体的CTLA-4特异性融合蛋白。示例性第二抗原和/或第三抗原包括肿瘤相关抗原(例如，LINGO1)、细胞因子(例如，IL-12(具有NCBI参考号NP_000873.2的IL-12A(p35亚单位)蛋白序列；具有NCBI参考号NP_002178.2的IL-12B(p40亚单位)蛋白序列)；IL-18(具有NCBI参考号NP_001553.1的蛋白序列)；IL-15(具有NCBI参考号NP_000576.1的蛋白序列)；IL-7(具有NCBI参考号NP_000871.1的蛋白序列)；IL-2(具有NCBI参考号NP_000577.2的蛋白序列)；和IL-21(具有NCBI参考号NP_068575.1的蛋白序列))、细胞因子同源受体(例如，IL-12R)和细胞表面受体。第二抗原和/或第三抗原的非限制性示例包括CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM(或BTLA)、CD47、PDL1、MICA、MICB和CD73。在一个实施方案中，双特异性抗体和三特异性抗体包括CTLA-4融合蛋白。例如，如本文所述，融合蛋白包含：包含可变结构域或scFv单元的抗体，以及配体或抗原和/或第三配体或抗原，使得所得抗体识别抗原并与配体特异性受体结合。可用于设计如本文所述的CTLA-4融合蛋白的示例性抗体组合物(例如，VH序列和/或VL序列或它们的片段)包括但不限于PCT/US2006/046350和PCT/US2015/067178中所述的抗CAIX抗体；PCT/US20006/005691中所述的抗CXCR4抗体；PCT/US2008/088435、PCT/US2013/039744和PCT/US2015/054202中所述的抗CCR4抗体；PCT/US2008/088435和PCT/US2020/062815中所述的抗PD-L1抗体；PCT/US2020/037791和PCT/US2020/037781中所述的抗PD-1抗体；PCT/US2017/043504中所述的抗GITR抗体；PCT/US2019/022272中所述的抗紧密连接蛋白-4抗体；以及PCT/US2020/037783中所述的抗MUC1抗体(这些申请中的每个申请以其全文以引用方式并入本文)。在一个实施方案中，融合蛋白还包含如本文所述的恒定区和/或接头。本文描述了不同形式的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如包含识别CTLA-4的抗体和配体的融合蛋白)。配体可以为肿瘤相关抗原(例如，LINGO1、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、MUC1、MSLN、CD19、CD20、CD30、CD40、CD22、RAGE-l、MN-CA IX、RET1、RET2(AS)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、PAP、p53、Ras、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、存活蛋白、9D7、前列腺癌肿瘤抗原-l(PCTA-1)、GAGE、MAGE、间皮蛋白、β-连环蛋白、TGF-βRII、BRCA1/2、SAP-1、HPV-E6、HPV-E7(对于附加的肿瘤相关表面抗原，还可参见PCT/US2015/067225和PCT/US2019/022272，这些文献以其全文以引用方式并入本文))；细胞因子(例如，IL-12(具有NCBI参考号NP_000873.2的IL-12A(p35亚单位)蛋白序列；具有NCBI参考号NP_002178.2的IL-12B(p40亚单位)蛋白序列)；IL-18(具有NCBI参考号NP_001553.1的蛋白序列)；IL-15(具有NCBI参考号NP_000576.1的蛋白序列)；IL-7(具有NCBI参考号NP_000871.1的蛋白序列)；IL-2(具有NCBI参考号NP_000577.2的蛋白序列)；和IL-21(具有NCBI参考号NP_068575.1的蛋白序列))；CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM(或BTLA)、CD47、PDL1、MICA、MICB和CD73。本文也提供了不同形式的双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中，抗CTLA-4片段和第二抗原特异性片段和/或第三抗原特异性片段中的每一者各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体或三特异性抗体还包含Fc片段(例如，如PCT/US2015/021529和PCT/US2019/023382中所描述的，这些文献中的每个文献以其全文以引用方式并入本文)。本发明的双特异性抗体或三特异性抗体可包含本文所述的CTLA-4抗体的重链和轻链组合或scFv。
可使用本领域已知的方法来构建本发明的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体)(例如，抗CTLA-4-scFv融合蛋白)。在一些实施方案中，双特异性抗体为单一多肽，其中两个scFv片段通过长接头多肽接合，该长接头多肽具有足够的长度以允许两个scFv单元之间的分子内缔合以形成抗体。在其他实施方案中，双特异性抗体为通过共价键或非共价键联结的多于一个多肽。在一些实施方案中，本文所描述的氨基酸接头(GGGGSGGGGS；“(G4S)2”(SEQ ID NO:[]))可用较长的G4S接头来生成以改善灵活性。例如，接头也可以为“(G4S)3”(例如，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:[]))；“(G4S)4”(例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO:[])；“(G4S)5”(例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:[]))；“(G4S)6”(例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:[]))；“(G4S)7”(例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:[]))；等等。例如，(G4S)5接头的使用可为本文所述的配体提供更大的灵活性并且可改善表达。在一些实施方案中，接头也可以为(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n或(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。本领域技术人员已知的可用于构建本文所述的融合体的接头的非限制性示例可见于美国专利号9,708,412；美国专利申请公开号US 20180134789和US20200148771；以及PCT公开号WO2019051122(这些文献中的每个文献以其全文以引用方式并入本文)。
在另一个实施方案中，可使用“杵臼结构(knob into hole)”法(Ridgway等人,Protein Eng 7:617-621(1996))来构建多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)。在该方法中，减少两个不同可变结构域的Ig重链以选择性地断开重链配对，同时保持重-轻链配对。将识别两种不同抗原/配体或三种不同抗原/配体的两种重-轻链异质二聚体混合以促进异质连接配对，该异质连接配对是通过CH3结构域的工程化“杵臼结构”来介导的。
在另一个实施方案中，可通过交换来自两种或更多种不同抗体的重-轻链二聚体以生成杂交抗体来构建多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)，其中第一重-轻链二聚体识别CTLA-4并且第二重-轻链二聚体识别第二抗原和/或第三抗原。针对重-轻链二聚体的机制与也用作双特异性分子的人IgG4的形成类似。IgG重链的二聚反应由分子内力(诸如使每个重链的CH3结构域与二硫键配对)驱动。已显示CH3结构域中的特定氨基酸(R409)的存在促进二聚体交换和IgG4分子的构建。还通过抗体的铰链区中的重链间二硫键也使重链配对稳定。具体地，在IgG4中，铰链区在氨基酸226至230处含有氨基酸序列Cys-Pro-Ser-Cys(与含有序列Cys-Pro-Pro-Cys的稳定的IgGl铰链区相比)。已将在第229位处的丝氨酸的这种序列差异与IgG4在铰链区中形成链内二硫键的趋势相联系(Van der Neut Kolfschoten,M.等人,2007,Science 317:1554-1557以及Labrijn,A.F.等人,2011,Journal of Immunol 187:3238-3246)。
可通过以下操作来形成本发明的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)：引入识别CTLA-4或者第二抗原和/或第三抗原的抗体的CH3结构域中的R409残基以及铰链区中的Cys-Pro-Ser-Cys序列，使得重-轻链二聚体交换以产生带有识别CTLA-4的一个重-轻链二聚体以及识别第二抗原和/或第三抗原的第二重-轻链二聚体的抗体分子，其中第二抗原(或配体)和/或第三抗原(或配体)为本文所公开的任何抗原(或配体)。也可改变已知的IgG4分子，使得重链和轻链识别CTLA-4或者第二抗原和/或第三抗原，如本文所公开的。使用用于构建本发明的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合物)的该方法可以是有益的，这是由于IgG4分子的固有特征，其中Fc区与其他IgG亚型的不同之处在于其与免疫应答的效应子系统(诸如由某些白血细胞表达的补体和Fc受体)的相互作用较差。这种特定特性使得这些基于IgG4的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)对于这样的治疗应用是有吸引力的，在该治疗应用中需要抗体结合靶标并且功能性地改变与靶标相关联的信号传导途径，然而不触发效应子活性。
本文所述的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)可用非耗尽重链同种型(诸如IgG1-LALA或稳定化的IgG4或其他非耗尽变异体中的一种非耗尽变异体)来工程化。在一些实施方案中，将突变引入到bsAb的恒定区，使得bsAb的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性被改变。例如，突变为CH2结构域中的LALA突变。在一个方面，多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)在异质二聚体多特异性抗体的一个scFv单元上含有突变，其降低ADCC活性。另一个方面，多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)在异质二聚体多特异性抗体的两条链上都含有突变，其完全消除ADCC活性。例如，在多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)的一个或两个scFv单元中引入的突变为CH2结构域中的LALA突变。可优化带有可变ADCC活性的这些多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)，使得多特异性抗体对表达被多特异性抗体识别的一种抗原的细胞表现出最大选择性杀伤，然而对被多特异性抗体识别的第二种抗原表现出最小杀伤。
本文所述的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)可被工程化为模块化四聚体双特异性抗体(tBsAb)。参见例如WO 2018/071913，该文献以其全文以引用方式并入本文。例如，四价抗体可以为包含针对第一抗原的第一结合位点以及针对第二抗原的第二结合位点的双特异性scFv片段的二聚体。在实施方案中，抗CTLA-4抗体可以为针对第一抗原的第一结合位点。在实施方案中，抗CTLA-4抗体可以为针对第二抗原的第二结合位点。这两个结合位点可经由接头结构域接合在一起。在实施方案中，scFv片段为串联scFv，接头结构域包含免疫球蛋白铰链区(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4铰链区)氨基酸序列。在实施方案中，免疫球蛋白铰链区氨基酸序列可侧接有灵活接头氨基酸序列，例如具有接头氨基酸序列(GGGS)x1-6、(GGGGS)x1-6或GSAGSAAGSGEF。在实施方案中，接头结构域包含免疫球蛋白Fc结构域的至少一部分，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域的该至少一部分不包含CH2结构域。在实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域的该至少一部分可以为CH2结构域。示例性CH2结构域氨基酸序列包含APELLGGPDVFLF(SEQ ID NO:[])。Fc结构域可与免疫球蛋白铰链区(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4铰链区)氨基酸序列的C-末端联结。接头结构域可在一个末端处或在两个末端处包含灵活接头氨基酸序列(例如，(GGGS)x1-6、(GGGGS)x1-6或GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:[]))。
在实施方案中，本文所述的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)可用野生型Fc区或修饰的Fc区来工程化。例如，实施方案可包括IgG3 CH2结构域。在其他实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)被工程化而没有Fc结构域和/或Fc片段。
在实施方案中，tBsAb可针对CTLA-4具有特异性，并且也可以为选自由以下项组成的组的靶标：B7H3、B7H4、CD27、CD28、CD40、CD40L、CD47、CD122、CCR4、CTLA-4、GITR、GITRL、ICOS、ICOSL、LAG-3、LIGHT、OX-40、OX40L、PD-L1、PD-1、TIM3、4-1BB、TIGIT、VISTA、HEVM、BTLA、MICA、MICB和KIR。
本文所公开的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体，诸如抗CTLA-4-scFv融合体)可用于治疗慢性感染、疾病或医学病症，例如癌症。
针对抗CTLA-4的抗体的用途
可施用特异性地结合CTLA-4蛋白的本发明抗体或其片段来治疗CTLA-4相关疾病或疾患。“CTLA-4相关疾病或疾患”包括其中发现增加的CTLA-4水平和/或涉及CTLA-4的细胞信号传导途径的活化的疾病状态和/或与疾病状态相关联的症状。在一些实施方案中，癌可以为肺癌、肾脏癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、肾癌(诸如透明细胞肾细胞癌)或胃癌。
本发明的抗体(包括双特异性抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和完全人抗体)可用作治疗剂。此类药剂通常会用于治疗受试者的癌症、增加疫苗效率或增强天然免疫应答。抗体制备物(例如，对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制备物)被施用给受试者并且通常会由于其与靶标结合而具有效果。抗体的施用可消除或抑制或干扰CTLA-4蛋白的活性。
药物组合物
特异性地结合CTLA-4蛋白的本发明抗体或其片段可以药物组合物的形式施用以治疗癌症。制备包含抗体的治疗药物组合物中所涉及的原则与考虑以及在组分选择方面的指导在例如以下文献中提供：Remington:The Science And Practice Of Pharmacy第20版(Alfonso R.Gennaro等人编者)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.,2000；Drug AbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood AcademicPublishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(AdvancesIn Parenteral Sciences，第4卷),1991,M.Dekker,New York。
针对任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定抗体、其变异体或衍生物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，以及施用的时间、排泄率、药物组合和所治疗的特定疾病的严重程度。医护人员对此类因素的判断在本领域普通技术人员的范围内。量也将取决于要治疗的个体患者、施用的途径、制剂的类型、所使用的化合物的特征、疾病的严重程度和期望的效果。所使用的量可通过本领域中众所周知的药理学和药代动力学原理来确定。
本发明的抗体的治疗有效量可以为实现治疗目标所需的量。如本文所指出的，这可以为抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，该结合相互作用干扰靶标的功能。此外，需要施用的量将取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，还将取决于所施用的抗体从其所施用的其他受试者的自由体积中消耗的速率。本文所述的抗原结合多肽施用给受试者(例如，患者)的剂量通常为0.1mg/kg患者体重至100mg/kg患者体重、0.1mg/kg患者体重至20mg/kg患者体重、或1mg/kg患者体重至10mg/kg患者体重。由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体内具有比来自其他物种的抗体更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的施用通常是可能的。此外，本公开的抗体的施用剂量和频率可通过经由修饰(诸如，例如，脂化)增强抗体的摄入和组织渗透(例如，进入到脑中)来降低。作为非限制性示例，针对本发明的抗体或抗体片段的治疗有效给药的常见范围可以为约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率的范围可以为例如从每天两次到每周一次。
在使用抗体片段的情况下，优选的是与靶蛋白的结合结构域特异性结合的最小抑制片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列的能力的肽分子。此类肽可以化学合成，以及/或者通过重组DNA技术生产。(参见例如Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。该制剂也可含有如对于所治疗的特定适应症必需的多于一种活性化合物，例如，带有不会对彼此产生不利影响的互补活性的那些。另选地或除此之外，该组合物可包含增强其功能的药剂，诸如，例如，细胞毒性剂、细胞因子(例如IL-15)、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以能够有效实现预期目的的量适当地组合存在。
活性成分也可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶态药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或者在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过无菌过滤膜过滤来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制备物的合适的示例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质呈成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球))以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间段较短。
可以将本发明的抗体或试剂(在本文中也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。此类药物组合物可包含抗体或药剂以及药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”可包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载剂描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中，该文献是本领域的标准参考文本，以引用方式并入本文。此类载剂或稀释剂的非限制性示例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物(诸如固定油)。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑此类介质和试剂在组合物中的用途。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的示例包括肠胃外施用，例如，静脉内施用、真皮内施用、皮下施用、口服施用(例如，吸入施用)、透皮施用(即，局部施用)、经粘膜施用和经直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液剂或混悬剂可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)来调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器，或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西波尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在实施方案中，组合物是无菌的并且是达到易于注射的程度的流体。其在制造和储存的条件下可以是稳定的，并且可被保存为防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在许多情况下，可在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液剂可以通过将所需量的活性化合物与上文枚举成分中的一种或组合(根据需要)掺入适当溶剂中，之后过滤灭菌来制备。例如，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上文所枚举的那些成分的所需的其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末而言，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从先前无菌过滤的溶液剂中产生活性成分加上任何附加期望成分的粉末。
口服组合物可包含惰性稀释剂或可食用载剂。口服组合物可以封装在明胶胶囊中，或者压制成片剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂掺和，然后以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用流体载剂制备以用作漱口剂，其中流体载剂中的化合物经口施用，漱口后吐出或吞下。药学上相容的粘合剂和/或助剂材料可以作为组合物的一部分包含在组合物中。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何下列成分，或具有类似性质的化合物：粘结剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或者调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于吸入施用，化合物以气溶胶喷雾剂的形式从包含合适的推进剂(例如，气体，诸如二氧化碳)的加压容器或分配器或者从喷雾器递送。
全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中是公知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域众所周知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
也可将化合物制备成用于直肠递送的栓剂(例如，带有常规栓剂基质，诸如可可油和其他甘油酯)或滞留型灌肠剂的形式。
在一个实施方案中，活性化合物与将保护化合物免于从身体快速消除的载剂一起制备，诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体混悬剂(包含靶向感染细胞的脂质体，与针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些材料可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
口服组合物或肠胃外组合物可配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀度。如本文所用的单位剂型，是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每单位含有与所需药物载剂缔合的经计算可产生期望治疗效果的预定量活性化合物。本发明单位剂型的规格由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及本领域中配混这种活性化合物以治疗个体所固有的限制因素来规定并直接取决于此。
药物组合物可以连同施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
诊断
根据本发明的抗体可用作用于检测样品中CTLA-4(或其蛋白片段)的存在的药剂。例如，抗体可包含可检测的标记。抗体可以是多克隆或单克隆的。可使用完整抗体或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体，术语“标记的”可涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理地联结)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一种被直接标记的试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物学样品”可包括从受试者分离的组织、细胞和生物学流体，以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。因此，在术语“生物学样品”的使用中包括血液以及血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴液。也就是说，本发明的检测方法可以用于在体外以及在体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括北方杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括南方杂交。
用于进行免疫测定的过程描述于例如以下文献中：“ELISA:Theory andPractice:Methods in Molecular Biology”，第42卷,J.R.Crowther(编)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；以及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入受试者体内。例如，抗体可以用放射性标志物标记，其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
针对CTLA-4(或其片段)的抗体可用于本领域中已知的与CTLA-4蛋白的定位和/或定量相关的方法(例如，用于测量适当的生理学样品内的CTLA-4蛋白的水平，用于诊断方法，用于对蛋白质成像等)。在一个给定的实施方案中，包含抗体衍生的抗原结合结构域的对CTLA-4蛋白或者其衍生物、片段、类似物或同系物具有特异性的抗体被用作药理学活性化合物(本文称为“治疗剂”)。
对于CTLA-4蛋白具有特异性的本发明抗体可用于通过标准技术(诸如免疫亲和、层析或免疫沉淀)来分离CTLA-4多肽。针对CTLA-4蛋白(或其片段)的抗体可用于作为临床检测过程的一部分诊断性地监测组织中的蛋白质水平，例如，以例如确定给定的处理方案的功效。
可通过将抗体与可检测物质偶联(即，物理地联结)来促进检测。可检测物质的示例包括但不限于各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的非限制性示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的示例包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的示例包括125I、131I、35S、32P或3H。
细胞疗法
这里也提供了细胞疗法。例如，细胞疗法可包含经遗传工程化以表达如本文所述的抗CTLA4抗体的细胞，诸如T细胞、NK细胞或B细胞。“遗传工程细胞”可指通过添加或修饰基因、DNA序列或RNA序列或者蛋白质或多肽而被修饰、转化或操纵的任何生物体的任何细胞。分离的细胞、宿主细胞和遗传工程细胞可包括分离的免疫细胞，诸如NK细胞、T细胞和B细胞，其含有编码如本文所述的抗体的DNA序列或RNA序列，和/或在细胞表面上表达的嵌合受体或嵌合受体复合物。
“T细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统的细胞。T细胞可以为原初细胞(未与抗原接触；与TCM相比增加的CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA表达以及减少的CD45RO表达)、记忆T细胞(TM)(与抗原接触且长寿命)和效应细胞(与抗原接触，具有细胞毒性)。TM可进一步细分为中心记忆T细胞的亚群(TCM，与原初T细胞相比增加的CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95表达以及降低的CD54RA表达)和效应记忆T细胞的亚群(TEM，与原初T细胞或TCM相比减少的CD62L、CCR7、CD28、CD45RA表达以及增加的CD127表达)。效应T细胞(TE)可指与TCM相比具有减少的CD62L、CCR7、CD28表达并且对颗粒酶和穿孔蛋白呈阳性的CD8+抗原接触细胞毒性T淋巴细胞。
可从多个来源获得T细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(诸如FICOLLTM分离)从收集自受试者的单位血液获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采血液成分法获得来自受试者的循环血液的细胞。单采血液成分法产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一个实施方案中，可对通过单采血液成分法收集的细胞进行洗涤以去除血浆级分并置于适当的缓冲液或介质中用于后续的处理。在本发明的一个实施方案中，用PBS对细胞进行洗涤。在另选的实施方案中，经洗涤的溶液不含钙和/或镁或者可不含许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员将理解的，可通过本领域技术人员已知的方法来实现洗涤步骤，诸如通过使用半自动化流通式离心机，例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate等。在洗涤之后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液或者含有或不含缓冲液的其他盐水溶液中。在某些实施方案中，可去除单采血液成分法样品的不期望的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在实施方案中，从PBMC分离T细胞。可从通过全血的密度梯度离心(例如通过LYMPHOPREPTM梯度、PERCOLLTM梯度或FICOLLTM梯度的离心)获得的血沉棕黄层分离PBMC。可通过耗尽单核细胞(例如通过使用CD14)从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，可在密度梯度离心之前裂解红血细胞。
“NK细胞”为大颗粒淋巴细胞，它是衍生于普通淋巴样祖细胞的天然不包含抗原特异性受体(例如T细胞受体或B细胞受体)的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞可通过其CD3-、CD56+表型来表征。在实施方案中，NK细胞可指任何已知的NK细胞或任何NK样细胞或具有NK细胞特征的任何细胞。因此，可使用原代NK细胞，或者在另一个实施方案中可使用本领域中已知的先前已分离和培养的NK细胞。因此，可使用NK细胞系。多种不同的NK细胞是已知的且在文献中有报告，并且可使用这些NK细胞中的任何NK细胞，或者可从原代NK细胞制备细胞系，例如通过病毒转化(Vogel等人2014,Leukemia 28:192-195)。除NK-92之外，合适的NK细胞包括(但决不限于)NK-YS、NK-YT、MOTN-1、NKL、KHYG-1、HANK-1或NKG细胞系。也可使用其他细胞系的变异体。
“B细胞”为B淋巴细胞，其在活化后可产生抗体分子。B细胞的活化可以但不限于经由通过B细胞表面上的抗原特异性免疫球蛋白受体或通过非特异性刺激物(例如，B细胞促细胞分裂剂，诸如脂多糖或美洲商陆促细胞分裂剂)识别抗原来进行。因此，B细胞可以为先前从未被活化的“原始”B淋巴细胞、或先前已被活化的“记忆”B淋巴细胞、或此类B淋巴细胞的子代。
本文也提供了细胞疗法，诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法或嵌合抗原受体(CAR)NK细胞疗法。例如，CAR T细胞疗法通过CAR在T细胞或NK细胞上的外源性表达来重新引导患者的T细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞。例如，当在T细胞或NK细胞中表达时，CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式朝所选择的靶标重新引导T细胞或NK细胞特异性和反应性的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞或NK细胞独立于抗原处理来识别抗原的能力，因此绕过主要的肿瘤逃逸机制。
CAR可以为跨膜融合蛋白，其将抗体的抗原识别结构域与T细胞受体和辅助受体的细胞内信号传导结构域联结。可使用合适的细胞，例如，其可分泌本发明的抗CTLA-4抗体(或另选地经工程化以表达要分泌的如本文所述的抗CTLA-4抗体)。要分泌的抗CTLA-4“有效载荷”可以为例如微抗体、scFv、IgG分子、双特异性融合分子以及如本文所述的其他抗体片段。在接触或工程化时，本文所述的细胞然后可通过本领域技术人员已知的输注疗法被引入到需要治疗的患者。患者可患有如本文所述的CTLA-4相关疾病或疾患，诸如慢性感染或癌症。细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以非限制地为例如T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合。可用于本发明的方面中的示例性CAR和CAR工厂包括在例如PCT/US2015/067225和PCT/US2019/022272中所公开的那些，这些文献中的每个文献据此以其全文以引用方式并入本文。在一个实施方案中，本文所讨论的CTLA-4抗体可用于构建多特异性抗体或用作针对遗传工程细胞(诸如CAR-T细胞、CAR NK细胞或遗传工程B细胞)的有效载荷。例如，在一个实施方案中，本文所讨论的抗CTLA-4抗体可用于靶向CARS(即，作为靶向部分)。在另一个实施方案中，本文所讨论的抗CTLA-4抗体可用作靶向部分，并且靶向不同表位的不同CTLA-4抗体可用作有效载荷。在另一个实施方案中，有效载荷可以为免疫调节抗体有效载荷。
处理方法
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗以及预防性或防止性措施两者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或疾患，诸如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的消减、稳定的(即，不恶化的)疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”可指与在不接受治疗的情形下的预期存活相比延长存活。需要治疗者包括已经患有病症或疾患者，以及倾向于患有病症或疾患者，或者其中要预防病症或疾患者。
本发明提供了治疗有癌症风险(或易受癌症影响)的受试者(例如，如果在此类受试者中鉴定出早期检测癌症生物标志物)或者有其他细胞增殖相关疾病或疾患风险(或者易受其他细胞增殖相关疾病或疾患影响)的受试者的预防性方法和治疗性方法两者。此类疾病或疾患包括但不限于例如与CTLA-4的异常表达相关联的那些疾病或疾患。例如，该方法用于治疗、预防或缓解癌症的症状。在一个实施方案中，该方法用于治疗、预防或缓解实体肿瘤的症状。可通过本文所述的组合物治疗的其他肿瘤的非限制性示例包括肺癌(例如，非小细胞肺癌或肺腺癌)、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、食管鳞状细胞癌、鼻咽癌、多形性胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、肾细胞癌、尿道上皮癌、肝细胞癌、恶性胸膜间皮瘤和液体肿瘤或胃癌。另外，本发明的方法可用于治疗血液学癌症，诸如白血病和淋巴瘤。另选地，该方法可用于治疗、预防或缓解已转移的癌症的症状。例如，可治疗或预防或者可缓解其症状的癌症包括B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、淋巴瘤或肾细胞癌。也可治疗或预防或者可缓解其症状的癌症包括带有高突变负荷和滤液中WBC的那些实体肿瘤。
因此，在一个方面，本发明提供了用于通过向受试者施用本发明的单克隆抗体、scFv抗体或双特异性抗体来预防、治疗或缓解受试者的癌症或者细胞增殖性疾病或疾患的症状的方法。例如，抗CTLA-4抗体可以治疗有效量施用。
有癌症或者细胞增殖相关疾病或疾患风险的受试者可包括具有癌症家族史的患者或暴露于已知或怀疑的致癌剂的受试者。预防剂的施用可在癌症表现之前进行，使得疾病被预防或者另选地在其进展方面被延迟。
另一方面，通过使细胞与本发明的抗CTLA4抗体接触来抑制肿瘤细胞生长。该细胞可以为表达CTLA-4的任何细胞。
本发明中也包括增加或增强对抗原的免疫应答的方法。通过向受试者施用本发明的单克隆抗体、scFv抗体或双特异性抗体来增加或增强免疫应答。例如通过增强抗原特异性T效应子功能来增强免疫应答。抗原为病毒(例如HIV)、细菌、寄生生物或肿瘤抗原。免疫应答为天然免疫应答。所谓天然免疫应答意指因感染引起的免疫应答。感染为慢性感染。增加或增强对抗原的免疫应答可通过本领域中已知的多种方法来测量。例如，可通过测量以下项中的任一项来测量免疫应答：T细胞活性、T细胞增殖、T细胞活化、效应细胞因子的产生和T细胞转录谱。另选地，免疫应答为由于疫苗接种诱导的应答。
因此，在另一方面，本发明提供了通过向受试者施用本发明的单克隆抗体或scFv抗体以及疫苗来增加疫苗效率的方法。抗体和疫苗相继或同时施用。疫苗为肿瘤疫苗、细菌疫苗或病毒疫苗。
组合方法
如本文所述的本发明组合物可与化学治疗剂组合施用。可与本公开的组合物一起施用的化学治疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如，多柔比星、博莱霉素、柔红霉素和更生霉素)；抗雌激素(例如，他莫昔芬)；抗代谢物(例如，氟尿嘧啶、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤和6-硫鸟嘌呤)；细胞毒素剂(例如，卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾酮、己烯雌酚二磷酸酯、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥子气衍生物(例如，mephalen、苯丁酸氮芥、双氯乙基甲胺(氮芥子气)和噻替哌)；类固醇和组合(例如，倍他米松磷酸钠)；以及其他(例如，dicarbazine、门冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。
在另外的实施方案中，如本文所述的本发明组合物可与细胞因子组合施用。可与组合物一起施用的细胞因子包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CD40、CD40L和TNF-α。
在另外的实施方案中，本文所述的组合物可与其他治疗性方案或预防性方案(诸如，例如，放射疗法)组合施用。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可与其他免疫治疗剂组合施用。免疫治疗剂的非限制性示例包括辛妥珠单抗、阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿麦妥单抗、安那莫单抗、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐珠单抗、比伐珠单抗、博纳吐单抗、本妥昔单抗、坎妥珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、西他土珠单抗、西妥木单抗、克利妥珠单抗、可那木单抗、达雷木单抗、曲齐妥单抗、杜利戈妥单抗(duligotumab)、度司妥单抗、地莫单抗、达西组单抗、达罗托组单抗、依美昔单抗、埃罗妥珠单抗、恩妥昔单抗、厄妥索单抗、埃达组单抗、法妥组单抗、非拉妥组单抗、芬妥木单抗、法兰妥单抗、伏妥昔单抗、加尼妥单抗、吉妥珠单抗、吉妥昔单抗、格巴妥木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、伊马曲单抗、英达妥昔单抗、奥英妥珠单抗、英妥木单抗、伊匹木单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、洛沃妥珠单抗、卢卡木单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、米拉组单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫赛妥莫单抗、那呐妥单抗、那普妥莫单抗、耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、诺非妥莫单抗、奥卡妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉妥单抗、奥那妥组单抗、莫妥组单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、帕萨妥珠单抗、帕曲妥单抗、佩图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗、平妥莫单抗、普托木单抗、雷妥莫单抗、雷曲妥单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、西罗珠单抗、司妥昔单抗、索利托单抗、替组单抗、他利妥莫单抗、替妥莫单抗、替妥木单抗、替加组单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、西莫白介素单抗、乌妥昔单抗、维妥组单抗、沃瑟妥珠单抗、伏妥莫单抗、扎芦木单抗、CC49和3F8。
本发明提供了通过施用与CTLA-4蛋白的相同表位或另选地CTLA-4蛋白的两种不同表位结合的两种抗体来治疗患者的癌症的方法。另选地，可通过施用与CTLA-4结合的第一抗体以及与CTLA-4之外的蛋白质结合的第二抗体来治疗癌症。在其他实施方案中，可通过施用与CTLA-4结合并与CTLA-4之外的蛋白质结合的双特异性抗体来治疗癌症。例如，CTLA-4之外的其他蛋白质可包括但不限于IL-12、IL-12R、IL-2、IL-2R、IL-15、IL-15R、IL-7、IL-7R、IL-21或IL-21R。例如，CTLA-4之外的其他蛋白质为肿瘤相关抗原；CTLA-4之外的其他蛋白质也可以为细胞因子。
在一些实施方案中，本发明提供了与能够实现或增强免疫应答的细胞一起单独地或与识别CTLA-4之外的另一种蛋白质的附加的抗体组合地施用抗PD-1抗体。例如，这些细胞可以为外周血单核细胞(PBMC)或PBMC中存在的任何细胞类型，例如，细胞毒性T细胞、巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞。
另外，本发明提供了与CTLA4蛋白结合的抗体和抗肿瘤剂的施用，该抗肿瘤剂诸如小分子、生长因子、细胞因子或其他治疗剂，包括生物分子，诸如肽、肽模拟物、类肽、多核苷酸、脂质衍生调节剂、小生物胺、激素、神经肽和蛋白酶。小分子包括但不限于无机分子和小有机分子。合适的生长因子或细胞因子包括IL-2、GM-CSF、IL-12和TNF-α。小分子文库在本领域中是已知的。(参见Lam,Anticancer Drug Des.,12:145,1997。)
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法
本文也提供了细胞疗法，诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。例如，CAR T细胞疗法通过CAR在T细胞上的外源性表达来重新引导患者的T细胞杀伤肿瘤细胞。CAR可以为跨膜融合蛋白，其将抗体的抗原识别结构域与T细胞受体和辅助受体的细胞内信号传导结构域联结。可使用合适的细胞，例如，其可分泌本发明的抗CTLA-4抗体(或另选地经工程化以表达要分泌的如本文所述的抗CTLA-4抗体)。要分泌的抗CTLA-4“有效载荷”可以为例如微抗体、ScFv、IgG分子、双特异性融合分子以及如本文所述的其他抗体片段。
实体肿瘤对CAR-T疗法提出了独特的挑战。CAR-T在实体肿瘤中的有效性的一些障碍包括异质抗原表达、不充分的组织归巢、活化、持续和免疫抑制性肿瘤微环境。与血癌不同，肿瘤相关靶蛋白在肿瘤与健康组织之间过表达，导致对健康组织的非肿瘤靶向毒性(on-target/off-tumor)T细胞杀伤。此外，肿瘤微环境(TME)中的免疫阻遏限制了CAR-T细胞朝杀伤肿瘤的活化。在此类接触或工程化时，细胞然后可通过本领域技术人员已知的输注疗法被引入到需要治疗的癌症患者。癌症患者可患有如本文所公开的类型中的任何类型的癌症。细胞(例如，T细胞)可以非限制地为例如肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或它们的组合。
可用于本发明的方面中的示例性CAR和CAR工厂包括在例如PCT/US2015/067225和PCT/US2019/022272中所公开的那些，这些文献中的每个文献据此以其全文以引用方式并入本文。例如，可根据本领域中已知的方法使用慢病毒属系统(经由转导)、逆转录病毒系统(经由转染(电穿孔))和转座子系统(经由PiggyBac)来生成CAR-T细胞。针对可用于生成CAR-T或CAR NK的有效载荷的可用启动子包括例如组成型启动子(其中该启动子与针对CAR-T或CAR NK的启动子相同，诸如EF1a然后IRES或2A)；诱导型启动子(其中该启动子与针对CAR-T的启动子不同，诸如NFAT、IL-2prom)；和遗传工程启动子(诸如细胞因子的CTLA-4基因座“敲入”和/或在内源性启动子的控制下的启动子)。在一个实施方案中，本文所讨论的CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用于构建多特异性抗体或用作针对遗传工程细胞(诸如CAR-T细胞、CAR NK细胞或遗传工程B细胞)的有效载荷。例如，在一个实施方案中，本文所讨论的抗CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用于靶向CARS(即，作为靶向部分)。在一个实施方案中，本文所讨论的抗CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用作要由遗传工程细胞(诸如CAR-T细胞、CAR NK细胞或遗传工程B细胞)分泌的有效载荷。在另一个实施方案中，本文所讨论的抗CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用作靶向部分，并且靶向不同表位的不同CTLA-4抗体可用作有效载荷。在另一个实施方案中，有效载荷可以为免疫调节抗体有效载荷。在一些实施方案中，用于CAR-T组合物中的如本文所述的CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白不是高亲和性CTLA-4抗体(例如，使得抗体不与其CTLA-4靶标强结合)。例如，本文所述的CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用作由遗传工程细胞(诸如CAR-T细胞、CAR-NK细胞或遗传工程B细胞)分泌的有效载荷，其中两个靶向部分(例如，肿瘤相关表面抗原)针对特定癌症而被选择(即针对卵巢癌的MSLN和MUC1)。肿瘤相关表面抗原的非限制性示例包括ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、MUC1、MSLN、CD19、CD20、CD30、CD40、CD22、RAGE-l、MN-CA IX、RET1、RET2(AS)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、PAP、p53、Ras、前列腺特异性蛋白、PSMA、存活蛋白、9D7、前列腺癌肿瘤抗原-l(PCTA-1)、GAGE、MAGE、间皮蛋白、β-连环蛋白、TGF-βRII、BRCA1/2、SAP-1、HPV-E6、HPV-E7(对于附加的肿瘤相关表面抗原，还可参见PCT/US2015/067225和PCT/US2019/022272，这些文献以其全文以引用方式并入本文)。示例性的装甲CAR-T细胞列于下表中。
在一个实施方案中，提供了双特异性(或双重靶向)CAR-T。在另一个实施方案中，CAR-T为包含嵌合抗原受体的工程化细胞，其中嵌合抗原受体包含针对癌细胞表面上的第一抗原和第二抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域，其中第一抗原包含CXCR4且第二抗原包含CLDN4，或者第一抗原包含CAIX且第二抗原包含CD70，或者第一抗原包含MUC1且第二抗原包含Msln。例如，本文所述的抗CTLA-4抗体或CTLA-4融合蛋白可用作针对遗传工程细胞(诸如本文所述的CAR-T、CAR-NK细胞或遗传工程B细胞)的有效载荷。在一个实施方案中，带有抗CTLA-4融合有效载荷的CXCR4/CLDN4双重靶向CAR-T可用于乳腺癌。在一个实施方案中，带有抗CTLA-4融合有效载荷的CAIX/CD70双重靶向CAR-T可用于透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。在一个实施方案中，带有抗CTLA-4融合有效载荷的MUC1/Msln双重靶向CAR-T可用于卵巢癌。
诊断测定
抗CTLA-4抗体可在诊断上用于例如作为临床测试过程的一部分监测癌症的发展或进展，以例如确定给定的治疗和/或预防方案的功效。
在一些实施方案中，出于诊断目的，本发明的抗CTLA-4抗体与可检测部分联结，例如以便提供用于检测有癌症风险或患有癌症的受试者的癌细胞的方法。
可检测部分可直接与抗体或片段缀合或者通过使用例如荧光二抗间接地与抗体或片段缀合。可通过例如荧光团与抗体或抗体片段的标准化学偶联或者通过遗传工程来实现直接缀合。可构建含有与荧光或生物发光蛋白偶联的抗体或抗体片段的嵌合体或融合蛋白。例如，Casadei等人(Proc Natl Acad Sci U S A.1990年3月；87(6):2047-51)描述了一种制备能够在哺乳动物细胞中表达水母发光蛋白和抗体基因的融合蛋白的载体构建体的方法。
如本文所用，关于探针或抗体，术语“标记的”可涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理地联结)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一种被直接标记的试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物学样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物学流体(诸如活组织检查)，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。即，本发明的检测方法可用于在体外以及在体内检测在生物学样品中表达CTLA-4的细胞。例如，用于检测CTLA-4的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印记、免疫沉淀和免疫荧光。此外，用于检测CTLA-4的体内技术包括将标记的抗CTLA-4抗体引入受试者。例如，抗体可以用放射性标志物标记，其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
在“靶向”缀合物(即，含有靶向部分的缀合物，该靶向部分为设计成将缀合物在受试者或动物体内定位在一个或多个特定位点处的分子或特征)的情况下，定位可指当受试者体内的结合的“定位的”实体与未结合的“游离的”实体之间的平衡已基本上实现时的状态。在其处实现此类平衡的速率取决于施用的途径。例如，通过静脉内注射施用的缀合物可在注射几分钟内实现定位。另一方面，口服施用的缀合物可能需要数小时才能实现定位。另选地，定位可只是指在施用实体之后在所选择的时间段处实体在受试者或动物体内的定位。作为另一个示例，当部分在施用后变成为分布的时实现定位。
应当理解，本领域技术人员可对实现定位的时间进行合理的估计。此外，可通过根据本发明的方法对可检测部分(例如，发光缀合物)进行成像来跟踪随时间变化的定位状态，诸如利用光电检测器装置。所使用的“光电检测器装置”应具有足够高的灵敏度以使得能够在合理的时间量内对来自哺乳动物体内的微弱光进行成像，并且以使用来自此类装置的信号来构建图像。
在其中可以使用极其明亮的光生成部分和/或检测定位在被成像的受试者或动物的表面附近的光生成融合蛋白的情况下，可使用一对“夜视”护目镜或标准高灵敏度摄像机，诸如Silicon Intensified Tube(SIT)相机(例如，来自Hammamatsu PhotonicSystems，新泽西州布里奇沃特)。然而，更典型地，需要更灵敏的光检测方法。
在极低的光水平下，每单位面积的光子通量变得如此之低以至于被成像的场景不再看起来是连续的。相反，其由在时间上以及在空间上彼此不同的单独的光子来表示。在监测器上观察，此类图像看起来是闪烁的光点，每个光点表示单个检测到的光子。通过随时间推移在数字图像处理器中聚积这些检测到的光子，可获取并构建图像。与其中在每个图像点处的信号被指派强度值的常规相机相比，在光子计数成像中，信号的幅度不具有显著性。目的是只是检测信号(光子)的存在并且相对于其随时间推移的位置来对信号的出现进行计数。
下文描述的至少两种类型的光电检测器装置可检测单独的光子并生成可由图像处理器分析的信号。与放大光子信号相比，减少噪音光电检测装置通过减少光子检测器中的背景噪音来实现灵敏度。主要通过冷却检测器阵列来减少噪音。该装置包括电荷耦合器件(CCD)相机，该相机被称为“背薄化(backthinned)”冷却式CCD相机。在更灵敏的仪器中，使用例如液氮来实现冷却，这使得CCD阵列的温度达到约-120℃。“背薄化”是指超薄背板，其减小光子遵循以被检测的路径长度，从而增加量子效率。特别灵敏的背薄化致冷CCD相机为“TECH 512”，它是购自Photometries,Ltd.(亚利桑那州图森)的200系列相机。
“光子放大装置”在光子撞击检测屏之前放大光子。该类别包括带有增强器(诸如微通道增强器)的CCD相机。微通道增强器通常含有与相机的检测屏垂直且共同延伸的通道的金属阵列。将微通道阵列置于要成像的样品、受试者或动物与相机之间。进入阵列通道的光子中的大多数光子在离开之前接触通道的侧面。跨阵列施加的电压引起从每次光子碰撞释放许多电子。来自此类碰撞的电子以“鸟枪”模式离开它们的原始通道，并且被相机检测到。
通过串联放置强化微通道阵列可实现甚至更高的灵敏度，使得在第一级中生成的电子继而引起第二级处的电子的放大的信号。然而，灵敏度的增加是以空间分辨率为代价来实现的，空间分辨率随着放大的每个附加级而降低。示例性的基于微通道增强器的单光子检测装置为购自Hamamatsu的C2400系列。
图像处理器对由光电检测器装置生成的信号进行处理，该光电检测器装置对光子进行计数以便构建图像，该图像可例如显示在监测器上或打印在视频打印机上。此类图像处理器通常作为包括上述灵敏光子计数相机的系统的一部分出售，并且因此可购自相同的来源。图像处理器通常连接至个人计算机，诸如兼容IBM的PC或Apple Macintosh(AppleComputer，加利福尼亚州库比蒂诺)，其可被包括或可不被包括作为购买的成像系统的一部分。一旦图像呈数字文件的形式，则可通过多种图像处理程序(诸如“ADOBE PHOTOSHOP”，Adobe Systems，Adobe Systems，加利福尼亚州Mt.View)来对它们进行操纵和打印。
在一个实施方案中，生物学样品含有来自测试受试者的蛋白质分子。一种示例性生物学样品为通过常规方式从受试者分离的外周血白细胞样品。
本发明也涵盖用于检测生物学样品中CTLA-4或表达CTLA-4的细胞的存在的试剂盒。例如，试剂盒可包括：能够检测生物学样品中的癌症或肿瘤细胞(例如，抗CTLA-4scFv或单克隆抗体)的标记的化合物或药剂；用于确定样品中的CTLA-4的量的装置；以及用于将样品中的CTLA-4的量与标准物进行比较的装置。在一些实施方案中，标准物为非癌细胞或其细胞提取物。化合物或试剂可以包装在合适的容器中。试剂盒还可包括针对使用该试剂盒来检测样品中的癌症的说明。
其他实施方案
尽管已经结合其具体实施方式对本发明进行描述，但前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例并不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实施例
下面提供了实施例，以促进更全面地理解本发明。以下实施例展示了制备和实践本发明的示例性模式。然而，本发明的范围并不限于仅出于说明目的在这些实施例中所公开的具体实施方案，因为可以使用替代性方法获得类似的结果。
实施例1
本文描述了经由噬菌体展示鉴定的阻断CTLA-4/CD80结合的抗CTLA-4抗体。此外，也从该淘选活动生成酵母展示文库以进一步询问第2轮和第3轮淘选的结果。在对结合高于本体的克隆进行分选之后，对克隆进行测序，并且鉴定出与在第三轮ELISA筛选中发现的原始克隆相比展示出改善的结合曲线的附加的克隆。
本文的实施方案可作为独立的抗体疗法或与其他疗法相组合而具有商业应用。
实施例2—来自PMPL淘选的aCTLA-4ab(第一组)
如图1所示，执行了抗CTLA-4噬菌体结合测定。所执行的测定是使用PEG+NaCl以沉淀出噬菌体并对它们进行纯化的中等规模噬粒营救。
利用经纯化的噬菌体，从ELISA数据形成结合曲线。我们从2E13噬粒颗粒/mL开始稀释9个噬菌体PMPL候选物+E1-D7中的每一者并降低，降低倍数为5倍。对于CTLA-4Fc包被的板和CAIX Fc包被的板，我们重复三次地添加这些噬菌体。
如图2所示，FACS确认CTLA-4噬菌体可与表达CTLA-4的1G5 Jurkat细胞结合。阴性对照为细胞+二抗(红色框)，并且阳性比较/对照为当前的E1-D7候选物(绿色框)。
处于过滤出候选物的目的，我们将认为具有超过25％阳性细胞的任何CTLA-4噬菌体候选物都是阳性的。在我们的9个可能的噬菌体候选物中，仅有一个可比较的候选物B10(以蓝色圈出)，因为它是超过75％阳性。也存在一些部分阳性，这些以橙色圈出并且是超过25％阳性的B6和C12。
实施例3
本文所利用的可溶性蛋白质包括：
从人293细胞(HEK293)表达人CTLA-4人CTLA-4，His Tag(CT4-H5229)。其含有AAAla 37-Phe 162(登录号NP_005205.2)
从人293细胞(HEK293)表达小鼠CTLA-4，His Tag(CT4-M52H5)。
其含有AA Glu 36-Phe 162(登录号NP_033973)。
使用来自Transomic(BC074893)的cDNA克隆全长CTLA4
实施例4—aCTLA-4
CTLA4概述：
-用作免疫检查点的蛋白受体
-整体结构：细胞外V结构域、跨膜结构域、细胞质尾区
-膜结合时的同源二聚体：可溶形式的单体
CTLA4结合：
-CD28同系物
-与CD-80/86(B7-1/2)结合
-参与结合的高度保守的MYPPY基序
抑制免疫应答的机制(图15)
-仍有许多争论：配体竞争、负信号传导、配体去除、对T细胞移动性的影响
背景(图23)：
-T细胞是抗肿瘤免疫的重要调节剂
-它们表达抑制性免疫检查点：这些免疫检查点用于限制T细胞活化，防止不受限制的T细胞活性对身体的附带损害
-PD1蛋白在T细胞的表面上表达：在连接到其配体PDL-1和PDL-2时，负途径被促进以抑制T细胞功能
-在连接到其配体PDL-1和PDL-2时，负途径被促进以抑制T细胞功能：肿瘤细胞也表达可促进肿瘤逃逸的PDL1。
MLR测定(图24)：
-CD4+T细胞与各自来自不同供体的单核细胞衍生DC的共培养：
树突状细胞的同种识别引起T细胞的活化
-表达PDL1的DC可抑制T细胞活化：免疫检查点抑制剂的添加可使T细胞从抑制恢复
-研究抗PD1是否增强T细胞活化
-测量IFNy和IL2细胞因子产生，T细胞活化的指标
方案：
-使用Miltenyi CD14+微珠分离CD14+单核细胞
-在Miltenyi Mo-DC培养基(用GM-CSF+IL4预先制备的培养基)中培养
-培养5天，然后加入：TNF-α(1000U/ml)、IL-1β(5ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和前列腺素E2(PGE2)(1μM)，并培养2天以使DC成熟
-mMo-DC表达参与DC与原初T细胞之间的免疫学突触的形成的多种DC标志物，包括CD80、CD86和MHC II(HLA-DR)。成熟Mo-DC也表达DC活化标志物CD83、CD40和CCR7
续前的方案：
-MLR实验日分离T细胞(CD4+负选择试剂盒StemCell)
-用于MLR的每孔100,000个T细胞和10,000个MoDC细胞
-以期望的浓度加入抗体并将培养物温育5天
-保存上清液用于ELISA筛选(IL2和IFNy)
aCTLA4抗体MLR 1和2：
MLR1：
-2个T细胞供体，2个DC供体
-DC培养7天—在第5天加入辅助细胞因子
-合并细胞并培养4天
-阳性对照：aPD-1抗体
-阴性对照：aSARS2抗体
MLR 2：
-测试2种aCTLA4抗体(D7、C10)与aPD-1抗体的组合。
-4个板：2个T细胞供体，2种aPD1浓度
-用于制备抗体稀释液(从100nM处开始，5份4倍稀释液)的所使用的aPD-1培养基：5nM aPD-1培养基和100nM aPD-1培养基
-100000个T细胞+10000个MoDC/孔
-首先与50ul T细胞相组合的50ul的抗体
-然后将Ab/T细胞加入DC
-对照：aPD-1+细胞、aPD-1高+细胞、DC+T细胞
-温育5天
用于确认我们的CTLA4噬菌体可与表达CTLA-4的1G5 Jurkat细胞结合的FACS(图
31)
-为了确保我们能够找到合适的候选物，我们返回并筛选CTLA4PMPL噬菌体菌落的第2个板，并将它们与来自板E1的数据相组合。将所有独特的菌落克隆到scFv-Fc表达载体中，并转染到Expi293F细胞中，以经由Octet进行高通量筛选。
-SA传感器装载有生物素酰化的CTLA4。经由IgG定量ELISA(Bethyl)测量expi293上清液中的scFv-Fc浓度并用于对样品进行归一化。使用OctetRed96来测量上清液中的scFv-Fc的结合。
这里考虑分析数据的分类的非限制性示例：
非常重要
1.CD80阻滞
2.CD86阻滞
3.解离常数(Kd)
中等重要
1.小鼠交叉反应性
具有低重要性
1.应答
示例性的所选择的候选物：
E1-A8
针对候选物选择的非限制性原因：
显示最终挑选的候选物当中的最高CD80阻滞
CD86阻滞与伊匹木单抗相当
显示与小鼠CTLA4的显著交叉反应性
具有比伊匹木单抗和E1-D7两者更高的应答
缺点：
显示在与大多数其他测试抗体进行比较时相对较高的解离速率
注释：
E1-A8具有与E2-A4相同的重链，其显示出最高应答速率和低解离常数。
E1-A8衍生于与伊匹木单抗相同的V基因(IGHV3)但不同的等位基因
实施例5—抗PD1/抗CTLA4双特异性抗体的工程化和表征
双特异性抗体的双重检查点阻滞(图53)：
不受理论的束缚，优点可包括：较低的治疗剂量、协同结合、靶向疗法和减少的制造成本。
本文所述的目标的非限制性概述：
1.新的抗CTLA4抗体的发现和表征：
1A：动力学筛选和表征
1B：表位分选
1C：细胞结合测定
1D：生物学测定
2.抗PD1/抗CTLA4双特异性抗体的工程化和表征
3.作为CAR T有效载荷的抗PD1/抗CTLA4双特异性抗体的表征
hCTLA2 ELISA结合曲线数据和结果(图56小图A)：
-用于展示抗CTLA4候选物与hCTLA4的结合亲和力的ELISA结合曲线。
-所有候选物在最高浓度处都具有相当的与hCTLA4的结合亲和力。
-大多数候选物显示出相当的与伊匹木单抗的结合亲和力
-顶部3：I、J、H
-A、E、I具有最佳饱和浓度
mCTLA4 ELISA结合曲线数据和结果(图56小图B)
-显示出高交叉反应性的候选物：E、F、A
-显示出中等交叉反应性的候选物：J、H
-伊匹木单抗和Biolegend抗CTLA4未显示出忠实于文献的交叉反应性
BSA阴性曲线(图56小图C)
-指示抗CTLA4候选物与BSA的结合亲和力(阴性对照)
抗CTLA4候选物与CTLA4+Jurkat细胞的结合亲和力(图64)
-抗体与细胞的结合亲和力相比与可溶性蛋白的结合亲和力的明显不一致性。
-J和H对伊匹木单抗具有高得多的结合亲和力和较低的饱和浓度
-E和F具有相当的与伊匹木单抗的结合特征
来自本文所述的数据的非限制性示例性结论：
-从不同候选物的文库筛选的5种抗CTLA4抗体显示：
a.与CTLA4的显著的结合亲和力
b.阻断CTLA4与CD80/86相互作用的能力
c.通过促进效应细胞中的CD80/CD28信号传导的生物学功能相关性。
不受理论的束缚，以下实验可对本文所述的数据进行补充：
-用于确定对于抗PD1/抗CTLA4双特异性最合适的抗CTLA4抗体的用双特异性形式进行的进一步实验
-用于表征双特异性抗体的体外测定
-作为CAR T细胞疗法中的有效载荷的双特异性的表征和功效研究。
等效物
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文描述的特定物质和程序的许多等效物。这样的等效物被认为是在本发明的范围内并且被所附权利要求所覆盖。
Claims (124)
1.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段包含：
(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR3；或
(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL CDR3；或
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(hh)包含SEQ ID NO：878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：915的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ii)包含SEQ ID NO：880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：918的氨基酸序列的VL CDR3；或
(jj)包含SEQ ID NO：883的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：885的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：920的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：921的氨基酸序列的VL CDR3；或
(kk)包含SEQ ID NO：886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：887的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：922的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：924的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ll)包含SEQ ID NO：889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：927的氨基酸序列的VL CDR3。
2.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VL CDR3；或
(b)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的VL CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL CDR3；或
(d)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL CDR3；或
(f)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL CDR3；或
(g)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的VL CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VL CDR3；或
(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的VL CDR3；或
(j)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的VL CDR3；或
(k)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL CDR3；或
(l)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的VL CDR3；或
(m)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：414的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：415的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：455的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：456的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：457的氨基酸序列的VL CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO：416的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：417的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：458的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：459的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：460的氨基酸序列的VL CDR3；或
(o)包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：461的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：462的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：463的氨基酸序列的VL CDR3；或
(p)包含SEQ ID NO：422的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：423的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：424的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：464的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：465的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：466的氨基酸序列的VL CDR3；或
(q)包含SEQ ID NO：425的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：426的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：467的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：468的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：469的氨基酸序列的VL CDR3；或
(r)包含SEQ ID NO：428的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：429的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：430的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：470的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：471的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：472的氨基酸序列的VL CDR3；或
(s)包含SEQ ID NO：431的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：473的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：474的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：475的氨基酸序列的VL CDR3；或
(t)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：476的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：477的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的VL CDR3；或
(u)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：479的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：480的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：481的氨基酸序列的VL CDR3；或
(v)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：482的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：483的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：484的氨基酸序列的VL CDR3；或
(w)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：445的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：485的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：486的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：487的氨基酸序列的VL CDR3；或
(x)包含SEQ ID NO：446的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：447的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：448的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：488的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：489的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：490的氨基酸序列的VL CDR3；或
(y)包含SEQ ID NO：449的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：450的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：451的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：491的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：492的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：493的氨基酸序列的VL CDR3；或
(z)包含SEQ ID NO：452的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：453的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：494的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：495的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：496的氨基酸序列的VL CDR3；或
(aa)包含SEQ ID NO：857的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：858的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：859的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：892的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：893的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：894的氨基酸序列的VL CDR3；或
(bb)包含SEQ ID NO：860的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：861的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：862的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：895的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：896的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：897的氨基酸序列的VL CDR3；或
(cc)包含SEQ ID NO：863的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：864的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：865的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：898的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：899的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：900的氨基酸序列的VL CDR3；或
(dd)包含SEQ ID NO：866的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：867的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：868的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：901的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：902的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：903的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ee)包含SEQ ID NO：869的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：870的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：871的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：904的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：905的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ff)包含SEQ ID NO：872的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：873的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：874的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：907的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：908的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：909的氨基酸序列的VL CDR3；或
(gg)包含SEQ ID NO：875的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：876的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：877的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：910的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：911的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：912的氨基酸序列的VL CDR3；或
(hh)包含SEQ ID NO：878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：915的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ii)包含SEQ ID NO：880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：918的氨基酸序列的VL CDR3；或
(jj)包含SEQ ID NO：883的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：885的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：920的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：921的氨基酸序列的VL CDR3；或
(kk)包含SEQ ID NO：886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：887的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：922的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：924的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ll)包含SEQ ID NO：889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：927的氨基酸序列的VL CDR3。
3.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的抗体或其片段，所述分离的抗体或其片段包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021和1023；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、368、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022和1024。
4.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、1001、1003、1005、1007、1009、1011、1013、1015、1017、1019、1021和1023；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、368、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022和1024。
5.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：2约95％相同的氨基酸序列。
6.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：2约95％相同的氨基酸序列。
7.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：3约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：4约95％相同的氨基酸序列。
8.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：3约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：4约95％相同的氨基酸序列。
9.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：5约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：6约95％相同的氨基酸序列。
10.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：5约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：6约95％相同的氨基酸序列。
11.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：7约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：8约95％相同的氨基酸序列。
12.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：7约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：8约95％相同的氨基酸序列。
13.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：9约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：10约95％相同的氨基酸序列。
14.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：9约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：10约95％相同的氨基酸序列。
15.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：11约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：12约95％相同的氨基酸序列。
16.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：11约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：12约95％相同的氨基酸序列。
17.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：13约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：14约95％相同的氨基酸序列。
18.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：13约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：14约95％相同的氨基酸序列。
19.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：15约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：16约95％相同的氨基酸序列。
20.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：15约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：16约95％相同的氨基酸序列。
21.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：17约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：18约95％相同的氨基酸序列。
22.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：17约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：18约95％相同的氨基酸序列。
23.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：19约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：20约95％相同的氨基酸序列。
24.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：19约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：20约95％相同的氨基酸序列。
25.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：21约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：22约95％相同的氨基酸序列。
26.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：21约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：22约95％相同的氨基酸序列。
27.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：23约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：24约95％相同的氨基酸序列。
28.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：23约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：24约95％相同的氨基酸序列。
29.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：385约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：386约95％相同的氨基酸序列。
30.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：385约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：386约95％相同的氨基酸序列。
31.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：387约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：388约95％相同的氨基酸序列。
32.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：387约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：388约95％相同的氨基酸序列。
33.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：389约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：390约95％相同的氨基酸序列。
34.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：389约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：390约95％相同的氨基酸序列。
35.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：391约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：392约95％相同的氨基酸序列。
36.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：391约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：392约95％相同的氨基酸序列。
37.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：393约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：394约95％相同的氨基酸序列。
38.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：393约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：394约95％相同的氨基酸序列。
39.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：395约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：396约95％相同的氨基酸序列。
40.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：395约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：396约95％相同的氨基酸序列。
41.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：397约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：398约95％相同的氨基酸序列。
42.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：397约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：398约95％相同的氨基酸序列。
43.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：399约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：400约95％相同的氨基酸序列。
44.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：399约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：400约95％相同的氨基酸序列。
45.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：401约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：402约95％相同的氨基酸序列。
46.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：401约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：402约95％相同的氨基酸序列。
47.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：403约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：404约95％相同的氨基酸序列。
48.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：403约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：404约95％相同的氨基酸序列。
49.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：405约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：406约95％相同的氨基酸序列。
50.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：405约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：406约95％相同的氨基酸序列。
51.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：407约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：408约95％相同的氨基酸序列。
52.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：407约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：408约95％相同的氨基酸序列。
53.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：409约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：410约95％相同的氨基酸序列。
54.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：409约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：410约95％相同的氨基酸序列。
55.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：411约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：412约95％相同的氨基酸序列。
56.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：411约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：412约95％相同的氨基酸序列。
57.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1001约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1002约95％相同的氨基酸序列。
58.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1001约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1002约95％相同的氨基酸序列。
59.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1003约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1004约95％相同的氨基酸序列。
60.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1003约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1004约95％相同的氨基酸序列。
61.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1005约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1006约95％相同的氨基酸序列。
62.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1005约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1006约95％相同的氨基酸序列。
63.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1007约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1008约95％相同的氨基酸序列。
64.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1007约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1008约95％相同的氨基酸序列。
65.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1009约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1010约95％相同的氨基酸序列。
66.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1009约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1010约95％相同的氨基酸序列。
67.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1011约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1012约95％相同的氨基酸序列。
68.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1011约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1012约95％相同的氨基酸序列。
69.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1013约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1014约95％相同的氨基酸序列。
70.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1013约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1014约95％相同的氨基酸序列。
71.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1015约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1016约95％相同的氨基酸序列。
72.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1015约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1016约95％相同的氨基酸序列。
73.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1017约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1018约95％相同的氨基酸序列。
74.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1017约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1018约95％相同的氨基酸序列。
75.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1019约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1020约95％相同的氨基酸序列。
76.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1019约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1020约95％相同的氨基酸序列。
77.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1021约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1022约95％相同的氨基酸序列。
78.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1021约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1022约95％相同的氨基酸序列。
79.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1023约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ IDNO：1024约95％相同的氨基酸序列。
80.一种与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的scFv抗体，所述分离的scFv抗体包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含与SEQ ID NO：1023约95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链包含与SEQ ID NO：1024约95％相同的氨基酸序列。
81.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77或79所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或抗原结合片段包含野生型Fc或经修饰的Fc。
82.一种分离的双特异性抗体，所述分离的双特异性抗体包含根据权利要求1至81中任一项所述的抗体或片段以及对免疫细胞上的分子具有特异性的第二抗原结合片段。
83.根据权利要求82所述的双特异性抗体，其中所述分子选自由以下项组成的组：CCR4、B7H3、B7H4、CD27、CD28、CD40、CD40L、CD47、CD122、CTLA-4、GITR、GITRL、ICOS、ICOSL、LAG-3、LIGHT、OX-40、OX40L、PD-1、TIM3、4-1BB、TIGIT、VISTA、HEVM、BTLA、CD47、PDL 1、MICA、MICB和KIR。
84.根据权利要求82所述的双特异性抗体，其中所述片段和所述第二片段各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
85.根据权利要求82所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体还包含Fc片段。
86.根据权利要求85所述的双特异性抗体，其中所述Fc片段包括野生型Fc片段或经修饰的Fc片段。
87.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至81中任一项所述的抗体。
88.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求82至86中任一项所述的双特异性抗体。
89.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至81中任一项所述的抗体或其片段以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
90.根据权利要求89所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种附加的治疗剂。
91.根据权利要求90所述的药物组合物，其中所述治疗剂为毒素、放射标记物、siRNA、小分子或细胞因子。
92.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求82至86中任一项所述的双特异性抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
93.根据权利要求92所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种附加的治疗剂。
94.根据权利要求93所述的药物组合物，其中所述治疗剂为毒素、放射标记物、siRNA、小分子或细胞因子。
95.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含编码根据权利要求1至81中任一项所述的抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。
96.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含编码根据权利要求82至86中任一项所述的双特异性抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。
97.根据权利要求95或权利要求96所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞为免疫细胞。
98.根据权利要求97所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。
99.一种载体，所述载体包含根据权利要求87或88所述的核酸。
100.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求99所述的载体。
101.根据权利要求100所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。
102.根据权利要求101所述的细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。
103.一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至81中任一项所述的CTLA-4抗体或其片段。
104.一种治疗对其有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求82至86中任一项所述的CTLA-4双特异性抗体。
105.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，其中所述细胞外结构域为与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，其中所述重链包含
(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VL CDR3；或
(b)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的VL CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL CDR3；或
(d)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL CDR3；或
(f)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL CDR3；或
(g)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的VL CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VL CDR3；或
(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的VL CDR3；或
(j)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的VL CDR3；或
(k)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL CDR3；或
(l)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的VL CDR3；或
(m)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：414的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：415的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：455的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：456的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：457的氨基酸序列的VL CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO：416的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：417的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：458的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：459的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：460的氨基酸序列的VL CDR3；或
(o)包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：461的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：462的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：463的氨基酸序列的VL CDR3；或
(p)包含SEQ ID NO：422的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：423的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：424的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：464的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：465的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：466的氨基酸序列的VL CDR3；或
(q)包含SEQ ID NO：425的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：426的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：467的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：468的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：469的氨基酸序列的VL CDR3；或
(r)包含SEQ ID NO：428的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：429的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：430的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：470的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：471的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：472的氨基酸序列的VL CDR3；或
(s)包含SEQ ID NO：431的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：473的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：474的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：475的氨基酸序列的VL CDR3；或
(t)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：476的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：477的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的VL CDR3；或
(u)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：479的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：480的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：481的氨基酸序列的VL CDR3；或
(v)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：482的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：483的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：484的氨基酸序列的VL CDR3；或
(w)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：445的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：485的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：486的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：487的氨基酸序列的VL CDR3；或(x)包含SEQ ID NO：446的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：447的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：448的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：488的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：489的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ IDNO：490的氨基酸序列的VL CDR3；或
(y)包含SEQ ID NO：449的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：450的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：451的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：491的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：492的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：493的氨基酸序列的VL CDR3；或
(z)包含SEQ ID NO：452的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：453的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：494的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：495的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：496的氨基酸序列的VL CDR3；或
(aa)包含SEQ ID NO：857的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：858的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：859的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：892的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：893的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：894的氨基酸序列的VL CDR3；或
(bb)包含SEQ ID NO：860的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：861的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：862的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：895的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：896的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：897的氨基酸序列的VL CDR3；或
(cc)包含SEQ ID NO：863的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：864的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：865的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：898的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：899的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：900的氨基酸序列的VL CDR3；或
(dd)包含SEQ ID NO：866的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：867的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：868的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：901的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：902的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：903的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ee)包含SEQ ID NO：869的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：870的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：871的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：904的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：905的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ff)包含SEQ ID NO：872的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：873的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：874的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：907的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：908的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：909的氨基酸序列的VL CDR3；或
(gg)包含SEQ ID NO：875的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：876的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：877的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：910的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：911的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：912的氨基酸序列的VL CDR3；或
(hh)包含SEQ ID NO：878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：915的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ii)包含SEQ ID NO：880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：918的氨基酸序列的VL CDR3；或
(jj)包含SEQ ID NO：883的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：885的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：920的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：921的氨基酸序列的VL CDR3；或
(kk)包含SEQ ID NO：886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：887的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：922的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：924的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ll)包含SEQ ID NO：889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：927的氨基酸序列的VL CDR3。
106.根据权利要求105所述的CAR，其中所述跨膜结构域还包含定位在所述细胞外结构域与所述跨膜结构域之间的茎区。
107.根据权利要求105所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28。
108.根据权利要求105所述的CAR，所述CAR还包含定位在所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间的一种或多种附加的共刺激分子
109.根据权利要求105所述的CAR，其中共刺激分子为CD28、4-1BB、ICOS或OX40。
110.根据权利要求105所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ链。
111.根据权利要求105所述的CAR，其中所述抗体为Fab或scFV。
112.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求105至111中任一项所述的CAR。
113.根据权利要求112所述的核酸，所述核酸还包括编码定位在所述细胞内信号传导结构域之后的多肽的核酸。
114.根据权利要求113所述的核酸，其中所述多肽为抗体或细胞因子。
115.根据权利要求114所述的核酸，其中所述抗体为scFV。
116.一种核酸，所述核酸编码CAR，其中所述CAR包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，所述核酸还包括编码定位在所述细胞内信号传导结构域之后的多肽的核酸，其中所述多肽包括与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，
其中所述重链包含
(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VL CDR3；或
(b)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的VL CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL CDR3；或
(d)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL CDR3；或
(f)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL CDR3；或
(g)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的VL CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VL CDR3；或
(i)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的VL CDR3；或
(j)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的VL CDR3；或
(k)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL CDR3；或
(l)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的VL CDR3；或
(m)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：414的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：415的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：455的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：456的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：457的氨基酸序列的VL CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO：416的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：417的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：458的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：459的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：460的氨基酸序列的VL CDR3；或
(o)包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：461的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：462的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：463的氨基酸序列的VL CDR3；或
(p)包含SEQ ID NO：422的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：423的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：424的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：464的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：465的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：466的氨基酸序列的VL CDR3；或
(q)包含SEQ ID NO：425的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：426的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：467的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：468的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：469的氨基酸序列的VL CDR3；或
(r)包含SEQ ID NO：428的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：429的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：430的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：470的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：471的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：472的氨基酸序列的VL CDR3；或
(s)包含SEQ ID NO：431的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：473的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：474的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：475的氨基酸序列的VL CDR3；或
(t)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：476的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：477的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的VL CDR3；或
(u)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：479的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：480的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：481的氨基酸序列的VL CDR3；或
(v)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：482的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：483的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：484的氨基酸序列的VL CDR3；或
(w)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：445的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：485的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：486的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：487的氨基酸序列的VL CDR3；或
(x)包含SEQ ID NO：446的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：447的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：448的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：488的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：489的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：490的氨基酸序列的VL CDR3；或
(y)包含SEQ ID NO：449的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：450的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：451的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：491的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：492的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：493的氨基酸序列的VL CDR3；或
(z)包含SEQ ID NO：452的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：453的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：494的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：495的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：496的氨基酸序列的VL CDR3；或
(aa)包含SEQ ID NO：857的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：858的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：859的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：892的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：893的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：894的氨基酸序列的VL CDR3；或
(bb)包含SEQ ID NO：860的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：861的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：862的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：895的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：896的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：897的氨基酸序列的VL CDR3；或
(cc)包含SEQ ID NO：863的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：864的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：865的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：898的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：899的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：900的氨基酸序列的VL CDR3；或
(dd)包含SEQ ID NO：866的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：867的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：868的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：901的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：902的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：903的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ee)包含SEQ ID NO：869的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：870的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：871的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：904的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：905的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ff)包含SEQ ID NO：872的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：873的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：874的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：907的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：908的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：909的氨基酸序列的VL CDR3；或
(gg)包含SEQ ID NO：875的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：876的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：877的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：910的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：911的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：912的氨基酸序列的VL CDR3；或
(hh)包含SEQ ID NO：878的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：1000的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：879的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：913的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：914的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：915的氨基酸序列的VL CDR3；或
(ii)包含SEQ ID NO：880的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：881的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：882的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：916的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：917的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：918的氨基酸序列的VL CDR3；或
(jj)包含SEQ ID NO：883的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：884的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：885的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：919的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：920的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：921的氨基酸序列的VL CDR3；或
(kk)包含SEQ ID NO：886的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：887的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：888的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：922的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：923的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：924的氨基酸序列的VL CDR3；或(ll)包含SEQ ID NO：889的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：890的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：891的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ IDNO：925的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：926的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQID NO：927的氨基酸序列的VL CDR3。
117.一种载体，所述载体包含根据权利要求112至116中任一项所述的核酸。
118.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求117所述的载体。
119.根据权利要求118所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。
120.一种遗传工程细胞，所述遗传工程细胞在细胞表面膜上表达和承载根据权利要求105至111中任一项所述的嵌合抗原受体。
121.根据权利要求120所述的细胞，其中免疫细胞为T细胞、NK细胞或B细胞。
122.根据权利要求121所述的细胞，其中所述T细胞为CD4+或CDS+。
123.根据权利要求122所述的遗传工程细胞，所述遗传工程细胞包含CD4+和CD8细胞+的混合群体。
124.一种遗传工程细胞，所述遗传工程细胞在细胞表面膜上表达和承载嵌合抗原受体，并且所述遗传工程细胞还经工程化以表达和分泌多肽，其中多肽为与人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其片段包含重链、轻链或它们的组合，
其中所述重链包含
(a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VL CDR3；或
(b)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的VL CDR3；或(c)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL CDR3；或
(d)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VHCDR2、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3、包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VL CDR2以及包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VL CDR3；或
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