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CN119265223A - 增强基因组工程化效率的方法 - Google Patents

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CN119265223A
CN119265223A CN202411391577.XA CN202411391577A CN119265223A CN 119265223 A CN119265223 A CN 119265223A CN 202411391577 A CN202411391577 A CN 202411391577A CN 119265223 A CN119265223 A CN 119265223A
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孟玲
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Abstract

本文件涉及用于真核细胞中的基因组工程化的方法和材料，以及尤其涉及通过共同递送一种或多种化学物质诸如蛋白质脱乙酰基酶抑制剂、植物激素和/或再生加强基因与基因组工程化组分来提高基因组工程化(即转化或基因组编辑)效率的方法。

Description

增强基因组工程化效率的方法
本申请为申请日为2019年6月14日、申请号为201980053117.7、发明名称为“增强基因组工程化效率的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本文件涉及用于真核细胞中基因组工程化的方法和材料，且尤其涉及通过共同递送一种或多种化学物质(诸如表观遗传调控化学物质、植物激素和/或再生加强基因)与基因组工程化组分来提高基因组工程化(即，转化或基因组编辑)效率的方法。
发明背景
传统育种已产生驯养的植物和动物，而现代生物技术(尤其是基因组工程化)正在扩大育种能力，并实现仅单独用传统近缘种(close species)的杂交无法实现的改善。利用生物技术，已将诸如高产、除草剂耐受性和昆虫抗性的多种性状导入作物，其显著地增进全球农业和粮食安全。但是，由于产品中存在外来DNA，生物技术已引发生物安全和环境问题。
通过分离出整合的DNA，基因组编辑技术可用于生成靶基因组的位点特异性修饰，而在最终植物中不存在外来DNA。此外，通过瞬时表达，基因组编辑仅涉及瞬时编辑活性，以产生位点特异性修饰，而在过程的任何点没有DNA整合。基因组编辑的植物，特别是源自瞬时活性的那些，与常规的基因组修饰的植物有显著地不同，并且可能不会作为经遗传修饰的(GM)植物受到监管。基因组编辑技术(特别通过瞬时编辑方法)在农业中提供高度准确、安全和强大的植物育种和开发工具。
然而，基于瞬时活性的基因组工程化面临更多挑战。与稳定转化相比，瞬时工程化通常会导致更少的修饰的细胞并且在没有整合的可选择标志物时，鉴定工程化的细胞并在再生的植物中实现同质(homogenous)修饰是高度挑战的。这些挑战阻碍瞬时基因编辑作为改良植物的育种工具的常规实施。因此，非常需要增强基因组工程化效率的新方法和材料。
发明内容
在本发明中令人惊讶地发现，植物细胞中的基因组工程化效率可以通过将基因组工程化组分与第二化合物共同递送到细胞中而提高，所述第二化合物选自表观遗传调控化学物质例如蛋白质脱乙酰基酶抑制剂或DNA甲基转移酶抑制剂，特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI，例如曲古抑菌素(trichostatin)A(TSA))，植物激素(例如生长素、细胞分裂素)和/或引起从体细胞组织、愈伤组织或胚性组织中植物再生得到改善的蛋白质。另外，促进化学物质与基因组工程化组分的共同递送提供生长益处(特别是为转化的细胞)，并因此用作对于回收转化的细胞的积极选择策略。
因此，本发明的第一方面是用于在植物细胞中的遗传修饰的方法，其包含
(a)将以下共同导入植物细胞
(i)基因组工程化组分和
(ii)第二化合物，其包含
(ii.1)表观遗传调控化学物质或其活性衍生物，特别是DNA甲基转移酶抑制剂或蛋白质脱乙酰基酶抑制剂，优选组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，和/或
(ii.2)植物激素或其活性衍生物，和/或
(ii.3)引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒，和
(b)在允许在存在第二化合物时通过基因组工程化组分的活性来遗传修饰所述植物细胞的基因组的条件下培养植物细胞，
优选地，其中基因组工程化组分(i)和/或第二化合物(ii)在植物细胞中是瞬时有活性的和/或是瞬时存在的。
已经发现，所有三种类型的化合物(ii.1)，(ii.2)和(ii.3)均独立地能够提高受基因组工程化组分(i)影响的植物细胞遗传修饰的效率。化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)可以单独使用或以两种或更多种化合物或化合物类型的组合使用，例如类型(ii.1)的两种或更多种化合物或类型(ii.1)的一种化合物和类型(ii.2)的一种化合物等等。当提及所有三种化合物类型(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)时，同义地使用术语“化合物(ii)”。
在植物细胞中遗传修饰的方法可以包含另一个步骤c)，其获得和/或选择经遗传修饰的植物细胞或植物或其部分，所述植物或其部分包含经遗传修饰的植物细胞或衍生自经遗传修饰的植物细胞，并且在至少一个细胞中包含基因组的遗传修饰。选择可以通过检测遗传修饰的手段来进行例如通过基于PCR方法的手段，或通过表型特征的手段例如除草剂抗性、颜色或荧光标志物、形态特征如株高等等。这种表型特征可以由外源(标志物)基因赋予，所述外源(标志物)基因稳定地整合到植物细胞的基因组中。
在一个特定的优选实施方案中，上述方法不包含基于稳定整合到植物细胞基因组中的外源选择性标志物基因的选择过程。
在另一个特别优选的实施方案中，共同导入引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的一个或多个蛋白质或包含编码所述一个或多个蛋白质的核酸的表达盒。“一个或多个”可以是至少一个，至少两个、至少三个、至少四个、或者可以是一个、两个、三个、四个或更多个。优选地，所述一个或多个蛋白质相对于改善的植物再生具有累加作用或甚至协同作用。
适宜的植物细胞
用于本发明的植物细胞可以是任何类型的植物材料的部分或衍生自任何类型的植物材料，优选地为芽、下胚轴、子叶、茎、叶、叶柄、根、胚、愈伤组织、花、配子体或其部分。可以使用分离的植物细胞以及植物材料，即含有植物细胞的整个植物或植物的部分。
植物的一部分或多个部分可以与整个完整的植物附着或分开。这样的植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，及优选地为种子。
本发明适用于任何植物物种，无论是单子叶植物还是双子叶植物。优选地，可以经受本发明的方法和用途的植物是选自以下属的植物：大麦属(Hordeum)、高粱属(Sorghum)、甘蔗属(Saccharum)、玉蜀黍属(Zea)、狗尾草属(Setaria)、稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、黑小麦属(Triticale)、苹果属(Malus)、短柄草属(Brachypodium)、山羊草属(Aegilops)、胡萝卜属(Daucus)、甜菜属(Beta)、桉属(Eucalyptus)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、咖啡属(Coffea)、葡萄属(Vitis)、Erythrante、螺旋狸藻属(Genlisea)、黄瓜属(Cucumis)、Marus、拟南芥属(Arabidopsis)、须弥芥属(Crucihimalaya)、碎米荠属(Cardamine)、独行菜属(Lepidium)、荠属(Capsella)、Olmarabidopsis、筷子芥属(Arabis)、芸苔属(Brassica)、芝麻菜属(Eruca)、萝卜属(Raphanus)、柑橘属(Citrus)、麻风树属(Jatropha)、杨属(Populus)、苜蓿属(Medicago)、鹰咀豆属(Cicer)、木豆属(Cajanus)、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、黄芪属(Astragalus)、莲属(Lotus)、蝴蝶草属(Torenia)、葱属(Allium)或向日葵属(Helianthus)。更优选地，植物是选自以下种的植物：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、两色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharumofficinarium)、包括玉米(Zea mays)的玉蜀黍属物种(Zea spp.)、小米(Setariaitalica)、小粒稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、包括甜菜(Beta vulgaris)的甜菜属物种(Beta spp.)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotianatomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffeacanephora)、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumis sativus)、Marus notabilis、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine nexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursapastoris)、Olmarabidopsis pumila、硬毛南芥(Arabis hirsute)、欧洲油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncacea)、黑芥(Brassica nigra)、芝麻菜(Eruca vesicariasubsp.Sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populustrichocarpa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicer reticulatum)、Cicerjudaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalussinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)和/或韭菜(Allium tuberosum)。特别优选地是甜菜(Betavulgaris)、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)、向日葵(Helianthus annuus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、两色高粱(Sorghum bicolor)、芜菁(Brassica rapa)、欧洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncacea)、甘蓝(Brassica oleracea)、萝卜(Raphanus sativus)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)和/或棉花(Gossypium sp.)。
基因组工程化组分
本文所用的术语“基因组工程化”是指在植物中遗传修饰的方法学，即用于修饰植物的基因组的方法学。优选地，术语是指a)植物或植物细胞的转化，优选为稳定的转化以及b)植物或植物细胞的基因组编辑。基因组工程化可以在分离的植物细胞或植物组织中进行，优选在细胞培养物中或在完整的植物(intact plants)中进行，即它可以在体外或体内进行。
基因组工程化组分可以以蛋白质和/或编码基因组工程化组分的核酸特别是以DNA诸如质粒DNA、RNA、mRNA或RNP导入。
基因组工程化可用于制备转基因植物材料。根据本文公开内容使用的术语“转基因的(transgenic)”是指包含基因或遗传构建体的植物、植物细胞、组织、器官或材料，其包含自另一生物体通过自然手段或通过转化技术的手段已转移至植物、植物细胞、组织器官或材料中的“转基因”。术语“转基因”包含核酸序列(包括DNA或RNA)或氨基酸序列，或其组合或混合。因此，术语“转基因”不限于通常被识别为“基因”的序列，即编码蛋白质的序列。它也可以指，例如，非编码蛋白质的DNA或RNA序列。因此，术语“转基因的”通常意味着相应的核酸或氨基酸序列不是天然存在于相应的靶细胞(包括植物、植物细胞、组织、器官或材料)的。因此，本文所用的术语“转基因”或“转基因的”是指这样的核酸序列或氨基酸序列，其从一个生物体的基因组获得或合成产生，并然后通过分子生物学，遗传学等人工技术其以瞬时或稳定方式导入另一个生物体。如本文所用，“植物材料”是指可以在任何发育阶段期间从植物获得的任何材料。植物材料可以以植物原位(in planta)获得或从植物或其植物组织或器官的体外培养物中获得。因此，术语包含植物细胞、组织和器官以及发育的植物结构以及亚细胞组分，如核酸、多肽以及可以在植物细胞或区室内找到和/或可以由植物产生或可以从处于任何发育阶段的任何植物细胞、组织或植物的提取物中获得的所有化学植物物质或代谢物。术语还包含植物材料的衍生物(例如原生质体)，其衍生自植物材料所包含的至少一个植物细胞。因此，术语还包含植物的分生组织细胞或分生组织。
对于待修饰的植物细胞，尽管基于生物学方法的转化方法，诸如农杆菌属转化或病毒载体介导的植物转化和基于物理递送方法的转化方法，如粒子轰击或显微注射已发展成为将遗传物质导入感兴趣的植物细胞或组织的突出技术。Helenius等人，(“Genedelivery into intact plants using the HeliosTM gene Gun”，Plant MolecularBiology Reporter,2000,18(3):287-288)公开了一种粒子轰击作为将材料导入植物细胞的物理方法。目前，因此存在多种植物转化方法以将遗传构建体形式的遗传物质导入感兴趣的植物细胞，包含植物生物技术领域技术人员已知的并且可以用于将编码至少一个与壁相关的激酶的至少一个基因导入植物细胞、组织、器官或完整植物中至少一个的至少一个细胞中的生物和物理手段。值得注意的是，所述用于转化和转染的递送方法可同时应用于导入本发明的工具。一种常见的生物学手段是用农杆菌属转化，其几十年来已用于各种不同的植物材料。病毒载体介导的植物转化代表将遗传物质导入感兴趣的细胞的另一种策略。在植物生物学中发现应用的物理手段是粒子轰击，也称为基因枪转染(biolistictransfection)或微粒介导的基因转移，是指将包含感兴趣的核酸或遗传构建体的包被的微粒或纳米颗粒转移到靶细胞或组织中的物理递送方法。物理导入手段适合于导入核酸，即RNA和/或DNA以及蛋白质。同样，存在用于将感兴趣的核酸或氨基酸构建体特异性地导入植物细胞的特异性转化或转染方法，包括电穿孔、显微注射、纳米颗粒和细胞穿透肽(CPP)。此外，存在基于化学的转染方法以导入遗传构建体和/或核酸和/或蛋白质，尤其包含用磷酸钙转染、使用脂质体(例如阳离子脂质体)转染或使用阳离子聚合物(包括DEAD-右旋糖酐或聚乙烯亚胺)转染或其组合。单独或组合的以上递送技术可用于体内(包括植物原位)或体外方法。
如本文所用，术语“基因组编辑”是指用于植物细胞的任何遗传信息或基因组的靶向、特异性修饰的策略和技术。因此，这些术语既包含基因编辑，也包含除基因组的基因编码区域以外的区域的编辑，例如内含子序列、非编码RNA、miRNA、调节元件序列(如启动子、终止子、转录激活子结合位点、顺式或反式作用元件)。额外地，术语可以包含针对单个核碱基的靶向取代的碱基编辑。它可以进一步包含植物细胞的核基因组以及其他遗传信息(即线粒体基因组或叶绿体基因组以及miRNA、前体mRNA或mRNA)的编辑。此外，“基因组编辑”可以包含可能导致基因表达中的可遗传改变的表观遗传编辑或工程化，即靶向修饰，例如DNA甲基化或组蛋白修饰(诸如组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化)的靶向修饰。
根据本发明的优选实施方案，所述基因组工程化组分包含
a)双链DNA断裂(DSB)诱导酶或编码其的核酸，其优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，以及任选地包含修复核酸分子，或
b)单链DNA或RNA断裂(SSB)诱导酶或编码其的核酸，其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点，以及任选地包含修复核酸分子，或
c)碱基编辑器酶，任选地与解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶融合，其优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，或
d)影响DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化，组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的酶，其优选地与解除武装的DSB诱导酶或SSB诱导酶融合，其优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点。
如本文所用，“双链DNA断裂诱导酶”或“DSBI酶”是能够在特定核苷酸序列(被称为“识别位点”或“预定位点”)上诱导双链DNA断裂的酶。因此，“单链DNA或RNA断裂诱导酶”或“SSBI酶”是能够在特定核苷酸序列(被称为“识别位点”或“预定位点”)上诱导单链DNA或RNA断裂的酶。
为了能有在预定的靶位点的断裂，酶优选包括结合/识别结构域和切割结构域。能够诱导双链或单链断裂的特定酶是核酸酶或切口酶及其变体，包括不再包含核酸酶或切口酶功能而是作为识别分子与另一种酶组合起作用的分子。近年来，已经开发了许多合适的核酸酶，特别是定制的内切核酸酶，其包含大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶、Argonaute核酸酶(其衍生自例如利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi))和CRISPR核酸酶(包含例如作为成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)系统的部分的Cas9、Cpf1、CasX或CasY核酸酶)。因此，在本发明的一个优选方面，基因组工程化组分包含DSB或SSB诱导酶或其变体，其选自CRISPR/Cas内切核酸酶，优选地为CRISPR/Cas9内切核酸酶或CRISPR/Cpf1内切核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，归巢内切核酸酶，大范围核酸酶和TAL效应物核酸酶。
稀有切割(rare-cleaving)内切核酸酶是具有优选为约14至70个连续的核苷酸的识别位点的DSBI/SSBI酶，并因此即使在较大基因组(诸如大多数植物基因组)中，具有非常低的切割频率。归巢内切核酸酶，也称为大范围核酸酶，构成此类稀有切割内切核酸酶的家族。它们可由内含子、独立基因或间插序列(intervening sequence)编码，并呈现出惊人的结构和功能特性，使它们与更经典的限制性酶区分开，通常与细菌限制性修饰II型系统区分开。它们的识别位点具有一般的不对称性，这与大多数限制性酶识别位点的特征性二重对称性(characteristic dyad symmetry)相反。由内含子或内含肽编码的几种归巢内切核酸酶已显示促进其各自的遗传元件向等位基因无内含子或无内含肽位点归巢。通过在无内含子或无内含肽等位基因中进行位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生重组发生末端，所述重组发生末端参与基因转变过程，所述过程复制编码序列，并导致在DNA水平插入内含子或间插序列。在WO03/004659的表I(第17至20页)(其通过引用并入本文)中提供其他稀有切割大范围核酸酶及其各自的识别位点的列表。
此外，存在设计基本上识别所选的任何靶核苷酸序列的定制的稀有切割内切核酸酶的方法。简而言之，可以利用设计为识别特异性核苷酸序列的锌指结构域和诸如Fokl的来自天然限制性酶的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合限制性酶。此类方法在例如以下中进行描述：WO03/080809，WO94/18313或WO95/09233以及Isalan等，(2001)，A rapid,generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated bytargeting the HIV-1promoter.Nature biotechnology,19(7):656；Liu等，(1997)，Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing withincomplex genomes，Proceedings of the National Academy of Sciences，94(11):5525-5530.)。
专门设计的内切核酸酶的另一个示例包括TALE核酸酶(TALEN)，其基于融合到核酸酶的催化结构域(例如，FokI或其变体)的来自黄单胞菌(Xanthomonas)细菌属的转录激活因子样效应物(TALE)。这些TALE的DNA结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单元的重复可变二残基(RVD)定义，使得一个RVD特异性地识别靶DNA中的一个核苷酸。可以组装重复单元以基本上识别任何靶序列，并且可以将重复单元与核酸酶的催化结构域融合以产生序列特异性内切核酸酶(参见例如，Boch等，(2009)，Breaking the code of DNAbinding specificity of TAL-type III effectors，Science，326(5959)，509-1512；Moscou&Bogdanove(2009)。A simple cipher governs DNA recognition by TALeffectors，Science，326(5959)，1501-1501；以及WO2010/079430、WO2011/072246、WO2011/154393、WO2011/146121、WO2012/001527、WO2012/093833、WO2012/104729、WO2012/138927、WO2012/138939)。WO2012/138927还描述单体(紧凑型)TALEN和具有各种催化结构域的TALE及其组合。
最近，已经描述了一种新型的可定制内切核酸酶系统；即所谓的CRISPR/Cas系统。在其自然环境中的CRISPR系统描述了一种分子复合物，其包含至少一个与可产生特异性DNA双链断裂的Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶如Cpf1核酸酶(Zetsche等，“Cpf1Is aSingle RNA-Guides Endonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System”,Cell,163,pp.1-13,October 2015)组合的小的且单独的非编码RNA。目前，CRISPR系统分为两类，包括五种类型的CRISPR系统，例如用Cas9作为效应物的II型系统，以及用Cpf1作为效应物分子的V型系统(Makarova等，Nature Rev.Microbiol.，2015)。在人工CRISPR系统中，可以将合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或任选地修饰的CRISPR核酸酶(经修饰作为切口酶或缺乏任何核酸酶功能而作用)与至少一种组合crRNA和/或tracrRNA的功能的合成或人工向导RNA或gRNA组合使用(Makarova等，2015，同上)。在天然系统中CRISPR/Cas介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶特异性激活的该向导RNA的成熟在迄今为止已表征的多种CRISPR系统之间存在显著差异。首先，将入侵DNA(也称为间隔区)整合到CRISPR基因座近端的两个相邻重复区域之间。II型CRISPR系统将Cas9核酸酶编码为干扰步骤的关键酶，该系统既包含crRNA，且又包含反式激活RNA(tracrRNA)作为向导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区域，其被RNAseIII识别并可以被切割以形成成熟的crRNA。然后，这些反过来又与Cas分子缔合，以便将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组gRNA分子既可包含可变DNA识别区域，且也可包含Cas相互作用区域，并因此可以独立于特异性靶核酸和期望的Cas核酸酶而被专门设计。作为另一种安全机制，PAM(与前间隔区域邻近基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是与来自Cas9/RNA复合物识别的DNA直接相连的DNA序列。针对来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的PAM序列已被描述为“NGG”或“NAG”(标准IUPAC核苷酸代码)(Jinek等，“A programmabledual-RNA-guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity”，Science 2012，337：816-821)。针对来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”。其他变体CRISPR/Cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)Cas9在PAM序列NNNNGATT处切割。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9在PAM序列NNAGAAW处切割。最近，已经描述了用于弯曲杆菌(Campylobacter)的CRISPR系统的另一种PAM基序NNNNRYAC(WO2016/021973A1)。对于Cpf1核酸酶，已经描述了与通常由Cas9系统识别的富G的PAM相反，没有tracrRNA的Cpf1-crRNA复合物经由短的富T的PAM进行的有效地识别和切割靶DNA(Zetsche等，同上)。此外，通过使用修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用还可通过双DNA切口的方式诱导高度特异性DNA双链断裂。此外，通过使用两个gRNA，可以优化DNA结合的特异性，并因而可以优化DNA切割。同时，其他最初针对细菌描述的CRISPR效应物，如CasX和CasY效应物是可得到的并且代表其他效应物，其可用于基因组工程化目的(Burstein等，“New CRISPR-Cas systems fromuncultivated microbes”，Nature，2017，542，237-241)。
DSBI/SSBI酶的切割位点与DNA或RNA上诱导断裂的确切位置有关。切割位点可包含或可不包含在DSBI/SSBI酶的识别位点中(可与DSBI/SSBI酶的识别位点重叠或可不与DSBI/SSBI酶的识别位点重叠)，并因此据说DSBI/SSBI酶的切割位点位于其识别位点处或附近。DSBI/SSBI酶的识别位点，有时也称为结合位点，是由DSBI/SSBI酶(特异性)识别并确定其结合特异性的核苷酸序列。例如，TALEN或ZNF单体具有分别由其RVD重复或ZF重复确定的识别位点，而其切割位点由其核酸酶结构域(例如，FokI)确定，并且通常位于识别位点之外。在二聚TALEN或ZFN的情况下，切割位点位于相应单体的两个识别/结合位点之间，在此发生切割的该间插DNA或RNA区域称为间隔区域。
本领域技术人员将能够选择识别特定识别位点并在预选/预定位点处或附近的切割位点处诱导DSB或SSB的DSBI/SSBI酶，或工程化此类DSBI/SSBI酶。可选地，可以使用任何常规转化方法或通过与在其基因组中具有DSBI/SSBI酶识别位点的生物体杂交，将DSBI/SSBI酶识别位点导入靶基因组中，并然后可以在DSBI/SSBI酶的切割位点处或附近导入任何期望的核酸。
存在修复断裂的两个主要及独特的途径-同源重组和非同源末端连接(NHEJ)。同源重组需要作为模板的同源序列(例如“供体”)的存在以指导细胞修复过程，并且修复的结果是无错误且可预测的。在用于同源重组的模板(或“供体”)序列缺失时，细胞通常尝试通过非同源末端连接(NHEJ)过程修复断裂。
在该实施方案的特别优选的方面，将修复核酸分子额外地导入植物细胞中。如本文所用，“修复核酸分子”是单链或双链DNA分子或RNA分子，其用作修饰切割位点处或附近的预选位点处的基因组DNA或RNA的模板。如本文所用，“用作修饰基因组DNA的模板”是指通过在预选位点侧翼靶基因组中的侧翼区域和相应的同源区域之间的同源重组，任选地与修复核酸分子的两端中的一端处的非同源末端连接(NHEJ)组合(例如在只有一个侧翼区域的情况下)，而在预定位点复制或整合修复核酸分子。通过同源重组的整合将允许修复核酸分子精确地连接至靶基因组直至核苷酸水平，而NHEJ可导致修复核酸分子与基因组DNA之间的连接处的小插入/缺失。
如本文所用，“基因组的修饰”是指基因组已经在至少一个核苷酸被改变。这可以通过插入转基因，优选地为包含感兴趣的转基因的表达盒，取代至少一个核苷酸和/或缺失至少一个核苷酸和/或插入至少一个核苷酸而发生，只要与修饰前的预选基因组靶位点的核苷酸序列相比导致至少一个核苷酸的总改变，从而允许鉴定修饰，例如通过本领域技术人员熟知的诸如测序或PCR分析等的技术。
如本文所用，“预选位点”、“预定位点”或“预定义位点”表示在基因组(例如，核基因组或叶绿体基因组)中的特定核苷酸序列，在该位置期望插入、取代和/或缺失一个或多个核苷酸。这可以例如是在先前导入的外来DNA、RNA或转基因中或与之连接的内源基因座或特定核苷酸序列。预选位点可以是特定的核苷酸位置，在该位置(在该位置之后)意在制造一个或多个核苷酸的插入。预选位点还可以包含待交换(取代)或缺失的一个或多个核苷酸的序列。
如在本申请的上下文中使用的，术语“约”是指所述值的+/-10％，优选地指所述值的+/-5％。例如，应将约100个核苷酸(nt)理解为90nt和110nt之间的值，优选地为95nt和105nt之间。
如本文所用，“侧翼区域”是具有与位于预选位点侧翼(即上游或下游)的DNA区域的核苷酸序列同源的核苷酸序列的修复核酸分子的区域。显然应该选择侧翼区域的长度和序列相同性百分比，以使得能够在所述侧翼区域与它们在预选位点上游或下游的相应DNA区域之间进行同源重组。与修复核酸分子的一个或多个侧翼DNA区域具有同源性的位于预选位点侧翼的一个或多个DNA区域也被称为基因组DNA中的一个或多个同源区域。
为了具有足够的重组同源性，修复核酸分子的侧翼DNA区域的长度可有所不同，并且长度应至少为约10nt、约15nt、约20nt、约25nt、约30nt、约40nt或约50nt。然而，侧翼区域可以尽可能长(例如，高达约100-150kb，例如完整的细菌人工染色体(BAC))。优选地，侧翼区域将为约50nt至约2000nt，例如约100nt、200nt、500nt或1000nt。此外，位于感兴趣的DNA侧翼的区域不必与同源区域(位于预选位点侧翼的DNA区域)相同，并且可具有与位于预选位点侧翼的DNA区域约80％至约100％的序列相同性，优选地具有约95％至约100％的序列相同性。侧翼区域越长，对同源性的要求越不严格。此外，为了实现预选位点处的靶DNA序列的交换而不改变相邻DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应优选与位于预选位点侧翼的上游和下游DNA区域相同。
如本文所用，“上游”表示核酸分子上更靠近所述核酸分子的5'端的位置。同样地，术语“下游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子的3'端的位置。为避免疑问，核酸分子及其序列通常以其5'至3'方向(从左至右)表示。
为了在预选位点处的靶序列修饰，必须选择侧翼区域，使得上游侧翼区域的3'端和/或下游侧翼区域的5'端与预定义位点的端部对齐。这样，上游侧翼区域的3'端确定预定义位点的5'端，而下游侧翼区域的5'端确定预定义位点的3'端。
如本文所用，所述预选位点位于所述切割(和/或识别)位点之外或远离所述切割(和/或识别)位点，是指意欲在此进行基因组修饰的位点(预选位点)不包含切割位点和/或DSBI/SSBI酶的识别位点，即预选位点与切割(和/或识别)位点不重叠。因此，在这方面，之外/远离是指切割(和/或识别)位点的上游或下游。
如本文所用，“碱基编辑器(base editor)”是指具有与其衍生的蛋白质相同催化活性的蛋白质或其片段，该蛋白质或其片段单独或以分子复合物(在本文中称为碱基编辑复合物)提供时具有介导靶向碱基修饰的能力，即如果碱基转变(conversion)未引起沉默突变而是引起由包含待用碱基编辑器转变的位置的密码子所编码的氨基酸的转变，感兴趣的碱基的转变导致感兴趣的点突变，进而能导致靶向突变。优选地，根据本发明的至少一种碱基编辑器与至少一种位点特异性DSBI/SSBI酶复合物或至少一种修饰的位点特异性DSBI/SSBI酶复合物或任选地与所述至少一种位点特异性DSBI/SSBI酶复合物的组分暂时或永久连接。所述连接可以是共价和/或非共价的。
可以将本文公开的任何碱基编辑器或位点特异性DSBI/SSBI酶复合物或其催化活性片段，或碱基编辑器复合物的任何组分或位点特异性DSBI/SSBI酶复合物的任何组分可作为核酸片段导入细胞，所述核酸片段代表或编码DNA、RNA或蛋白质效应物，或其可以作为DNA、RNA和/或蛋白质或其任何组合导入。
碱基编辑器是具有介导靶向的碱基修饰(即，导致感兴趣的点突变的感兴趣的碱基的转变)能力的蛋白质或其片段。优选地，在本发明的上下文中，将至少一个碱基编辑器暂时或永久地融合至至少一个DSBI/SSBI酶，或任选地融合至至少一个DSBI/SSBI的组分。融合可以是共价和/或非共价的。多个出版物已显示靶向的碱基转变(主要从胞嘧啶(C)转变为胸腺嘧啶(T))，其使用与胞苷脱氨酶结构域(载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC1)(例如来自大鼠的APOBEC))连接的CRISPR/Cas9切口酶或非功能性核酸酶。由胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶(C)的脱氨基，并产生具有胸腺嘧啶(T)的碱基配对特性的尿嘧啶(U)。大多数已知的胞苷脱氨酶作用于RNA上，并且已知接受DNA的少数实例需要单链(ss)DNA。对dCas9-靶DNA复合物的研究揭示，在形成Cas9-向导RNA-DNA“R-环”复合物后，被取代的DNA链的至少九个核苷酸(nt)不配对(Jore et等,Nat.Struct.Mol.Biol.,18,529-536(2011))。确实，在Cas9 R-环复合物的结构中，被取代的DNA链上的前间隔序列的前11个nt是无序的，其表明它们的运动不被高度限制。还已经推测，Cas9切口酶诱导的在非模板链的胞嘧啶中的突变可能是由细胞胞嘧啶脱氨酶对它们的可及性引起。有理由认为，R-环中此ssDNA片段的子集可以作为dCas9-连接的胞苷脱氨酶的有效底物以实现DNA中C到U的直接可编程转变(Komor等，同上)。最近，Goudelli等((2017),Programmable base editing of A·T to G·C ingenomic DNA without DNA cleavage,Nature,551(7681),464)，描述了介导基因组DNA中的A·T至G·C转变的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。
在本领域中已经鉴定了影响DNA甲基化的酶以及组蛋白修饰酶。组蛋白翻译后修饰在调节染色质结构和基因表达中起重要作用。例如，在Sterner DE，Berger SL(2000年6月):“Acetylation of histones and transcription-related factors”,Microbiol.Mol.Biol.Rev.64(2):435–59中描述的用于组蛋白乙酰化的酶。影响组蛋白甲基化的酶描述于Zhang Y.，Reinberg D(2001)：“Transcription regulation by histonemethylation:interplay between different covalent modifications of the corehistone tails”,Genes Dev.15(18):2343–60。组蛋白的泛素化描述于Shilatifard A(2006):“Chromatin modifications by methylation and ubiquitination:implications in the regulation of gene expression”,Annu.Rev.Biochem.75:243–69。用于组蛋白磷酸化的酶描述于Nowak SJ.,Corces VG.(2004年4月):“Phosphorylationof histone H3:a balancing act between chromosome condensation andtranscriptional activation”,Trends genet.20(4):214–20。用于组蛋白SUMO化的酶描述于Nathan D.,Ingvarsdottir K.,Sterner DE.等，(2006年4月):“Histone sumoylationis a negative regulator in Saccharomyces cerevisiae and shows dynamicinterplay with positive-acting histone modifications”,Genes Dev.20(8):966–76。用于组蛋白核糖基化的酶描述于Hassa PO.,Haenni SS.,Elser M,Hottiger MO.(2006年9月):“Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells:where are we todayand where are we going？”,Microbiol.Mol.Biol.Rev.70(3):789–829。组蛋白瓜氨酸化被例如称为肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4，也称为PADI4)的酶催化，其将组蛋白精氨酸(Arg)和单甲基精氨酸残基两者转化为瓜氨酸。
可将影响DNA甲基化的酶和组蛋白修饰酶与解除武装的DSB或SSB诱导酶融合，其优选识别所述细胞的基因组中的预定位点。
表观遗传调控化学物质
如本文所用，“表观遗传调控化学物质”是指参与调控植物细胞的表观遗传状态(例如DNA甲基化、蛋白质甲基化，特别是组蛋白甲基化、以及乙酰化，特别是组蛋白乙酰化)的任何化学物质。根据本发明的第一实施方案，表观遗传调控化学物质，例如蛋白质脱乙酰基酶抑制剂(ii.1)是与基因组工程化组分共同导入。根据本发明所用的优选的表观遗传调控化学物质是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI)诸如曲古抑菌素A(TSA)或DNA甲基转移酶抑制剂。如本文所用，“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI)”是指抑制组蛋白脱乙酰基酶活性的任何物质，“DNA甲基转移酶抑制剂”是指抑制DNA甲基转移酶活性的任何物质。
据假设共同递送的表观遗传调控化学物质(ii.1)(特别是HDACI)松弛植物的染色质结构，促进轰击的细胞中对基因组工程化组分的DNA可及性，因而接着促进基因组工程化(即转化和基因组编辑)效率。这种假设的原因是：遗传物质的基本结构和功能单元是核小体，其中带负电荷的DNA包裹在带正电荷的组蛋白八聚体和相关的连接子组蛋白周围。核小体单元进一步折叠并堆积成染色质(Andrews,A.J.,和Luger,K.(2011).Nucleosomestructure(s)and stability:Variations on a theme.Annu.Rev.Biophys.40:99–117)。DNA可及性很大程度上取决于核小体和染色质的紧密度。染色质重塑酶可动态修饰组蛋白的赖氨酸或其他氨基酸，其导致它们电荷以及与DNA和其他蛋白质的相互作用的改变，并导致染色质折叠或解折叠(Bannister AJ.,Kouzarides T.(2011)Regulation of chromatinby histone modifications.Cell Res 21:381–95)。通过添加或去除乙酰基，组蛋白中赖氨酸残基的乙酰化和脱乙酰化通常参与真核生物中染色质结构的可逆调节，并介导染色质可及性和基因表达调控。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)是从位于组蛋白的N末端尾部的赖氨酸残基去除乙酰基的酶，其使组蛋白带更多正电荷，并因此允许组蛋白更紧地包裹DNA。抑制HDAC可能有助于染色质解折叠，并使DNA更易接近。
染色质重塑和其他表观遗传修饰无疑在调控细胞全能和再生中起重要作用(Zhang,H.,和Ogas,J.(2009).An epigenetic perspective on developmentalregulation of seed genes.Mol.Plant 2:610–627)。已经证明组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性的抑制与植物再生和小孢子胚胎发生有关(Miguel,C.,和L.Marum,2011.Anepigenetic view of plant cells cultured in vitro:somaclonal variation andbeyond.J.Exp.Bot.62:3713–3725.,Li Hui et al.(2014)The Histone DeacetylaseInhibitor Trichostatin A Promotes Totipotency in the Male Gametophyte PLANTCELL,26:195–209)。HDAC活性或下游HDAC介导的途径的抑制在起始应激诱导的单倍体胚胎发生中起主要作用。一种这样的HDACi是曲古抑菌素A(TSA)。已证明TSA在欧洲油菜的雄配子体中诱导大量的胚胎发生细胞增殖。TSA处理导致培养的小孢子和花粉中高频率的孢子体细胞分裂。
本文件描述了方法以在一种或多种表观遗传调控化学物质例如蛋白脱乙酰酶抑制剂特别是HDACi存在下，来提高基因组工程化效率。这样的HDACi可以是曲古抑菌素A(TSA)、N-羟基-7-(4-二甲基氨基苯甲酰基)-氨基庚酰胺(M344)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或其他。这些HDACI选自基于异羟肟酸(HA)的化学物质，其目标是锌依赖性HDAC。
植物激素
根据本发明的第二实施方案，将一种或多种植物激素(ii.2)，例如生长素和细胞分裂素，例如2,4-D、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和玉米素，与基因组工程化组分(i)共同递送。如本文所用，“植物激素”是指促进植物细胞分裂和/或植物形态发生的任何天然存在或合成的材料和化学物质。
植物体细胞能够通过体细胞胚胎发生或器官发生而在体外培养中恢复细胞分裂并再生为整个植物，这主要取决于植物激素诸如生长素和细胞分裂素。在本发明中，发现植物激素促进细胞增殖，提高植物细胞对基因组工程化的敏感性，并因此改善基因组工程化(即转化和基因组编辑)的效率。
生长素之一是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，其对于单子叶植物例如玉米和小麦中的体细胞胚胎发生和细胞再生几乎是必不可少的。同时，细胞分裂素例如6苄基氨基嘌呤(6-BA)或玉米素对植物器官发生、和芽分生组织的萌生和发育是必需的。本文件描述了通过与基因组工程化组分共同递送一种或多种植物激素(2,4-D、6-BA、玉米素等)来改善基因组工程化效率的方法。
再生加强基因
根据本发明的第三实施方案，与基因组工程化组分(i)共同导入引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒(ii.3)。这类型的化合物(ii.3)在本文中也称为“再生加强基因”。
据信转化的细胞的可再生性比野生型细胞低。由于细胞内存在外来DNA，转化的细胞容易受到程序性细胞死亡。递送(例如轰击破坏)引起的应激也可能引发细胞死亡。因此，促进细胞分裂对于修饰的细胞的再生是必需的。此外，基因组工程化效率很大程度上由宿主细胞状态控制。经历快速细胞分裂的细胞(像植物分生组织中的那些)是基因组工程化的最合适受体。促进细胞分裂将可能会提高DNA复制和分裂过程中的DNA整合或修饰，并因而提高基因组工程化效率。
基于它们在促进细胞分裂和植物形态发生中所起的作用来选择加强基因。每个候选基因均由强组成型启动子克隆和驱动，并通过在玉米细胞中瞬时表达来评估而无需选择。加强基因的实例是PLT5(PLETHORA5；SEQ ID NO：1、2、13和14)、PLT7(PLETHORA7；SEQ IDNO：3、4、15和16)和RKD基因(RKD2：SEQ ID NO：5、6、29、30、31和32；RKD4：SEQ ID NO：11、12、17、18、27和28；例如Waki,T.,Hiki,T.,Watanabe,R.,Hashimoto,T.,&Nakajima,K.(2011).The Arabidopsis RWP-RK protein RKD4 triggers gene expression and patternformation in early embryogenesis.Current Biology,21(15),1277-1281)
PLT(PLETHORA)，也称为AIL(AINTEGUMENT-LIKE)基因，是转录调节因子AP2家族的成员。转录因子AP2家族成员在植物的细胞增殖和胚胎发生中起重要作用(El Ouakfaoui,S.,Schnell,J.,Abdeen,A.,Colville,A.,Labbé,H.,Han,S.,Baum,B.,Laberge,S.,Miki,B(2010)Control of somatic embryogenesis and embryo development byAP2transcription factors.PLANT MOLECULAR BIOLOGY 74(4-5):313-326.)。PLT基因主要在芽和根的发育组织中表达，且是干细胞稳态、细胞分裂和再生，以及器官原基模式化所必需的。
PLT家族包含有六个成员的AP2子分支。四个PLT成员，PLT1/AIL3(SEQ ID NO：19和20)、PLT2/AIL4(SEQ ID NO：21和22)、PLT3/AIL6(SEQ ID NO：9、10、23和24)和BBM/PLT4/AIL2(SEQ ID NO：7、8、25和26)在根尖分生组织(RAM)中部分重叠表达，并且是在干细胞微环境内在正确的位置表达QC(静止中心)标志物所需的。这些基因对维持根尖分生组织的细胞分裂和防止细胞分化起冗余作用。
三个PLT基因，PLT3/AIL6，PLT5/AIL5和PLT7/AIL7在芽尖分生组织(shoot apicalmeristem)(SAM)中表达，它们在侧生器官(lateral organ)的定位和外生长(outgrowth)中起冗余作用。PLT3、PLT5和PLT7通过控制两个不同的发育事件来调节拟南芥中的新生芽再生。PLT3、PLT5和PLT7是在分生组织的外围维持高水平的PIN1表达所需的，并调节SAM中央区域的局部生长素生成，这是叶序转换(phyllotactic transition)的基础。这三个基因功能的累积丧失导致中间细胞团、愈伤组织不能形成芽祖细胞，而诱导PLT5或PLT7则可以以激素非依赖性方式使芽再生。PLT3，PLT5，PLT7调节并需要芽促进因子CUP-SHAPEDCOTYLEDON2(CUC2)来完成芽形成程序。PLT3，PLT5和PLT7也在侧根生成细胞(lateral rootfounder cells)中表达，在侧根生成细胞中它们冗余地激活PLT1和PLT2的表达，并接着调节侧根形成。
根据本发明，一种蛋白质引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善，优选地其包含选自以下的氨基酸序列
a)如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任何一个所示的序列，
b)具有与(a)的序列至少60％相同性的序列，
c)由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的序列，和
d)由具有与(c)的核酸序列至少60％相同性的核酸序列编码的序列。
e)由在严格条件下与与c)所定义的核酸序列互补的序列进行杂交的核酸序列所编码的序列。
对于上述(b)的氨基酸序列或(d)的核酸序列，整个序列长度上的序列相同性优选为至少70％、至少75％、至少80％，更优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
为了本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列相同性”(以百分比表示)是指在两个具有相同残基(x100)的最优比对序列中的位置数除以比较的位置数。缺口，即在一个序列中存在而另一个序列不存在的残基的比对中的位置，被认为是具有非相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行两个序列的比对。上面的计算机辅助序列比对可以使用标准软件程序诸如在European Molecular BiologyOpen Software Suite(EMBOSS)如版本6.3.1.2(Trends in genetics 16(6),276(2000))(其默认参数例如为对于蛋白质矩阵＝EBLOSUM62，gapopen＝10.0以及gapextend＝0.5)中实施的NEEDLE程序方便地进行。
如本文所用，术语“杂交”是指通过互补核苷酸的碱基配对在两个核酸分子之间杂交体的形成。术语“在严格条件下杂交”是指在特定条件下的杂交。这样的条件的一个实例包括这样的条件，在该条件下，基本上的互补链(即由具有至少80％互补性的核苷酸序列组成的链)与给定的链杂交，而较低互补链不杂交。可选地，这些条件是指钠盐浓度、温度和洗涤条件的特定杂交条件。例如，高度严格的条件包含在42℃、50％甲酰胺、5x SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠、5x Denhardt溶液、10x硫酸葡聚糖、20mg/ml剪切的鲑鱼精子DNA中孵育并在约65℃的0.2x SSC(SSC代表0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸三钠缓冲液)中洗涤。可选地，高度严格的条件可意指在68℃于0.25M磷酸钠、pH7.2、7％SDDS、1mMEDTA和1％BSA中杂交16小时，并在68℃用2 x SSC和0.1％SDDS洗涤两次。进一步可选地，高度严格的杂交条件例如是：在65℃在4×SSC中杂交，并然后在65℃在0.1×SSC中多次洗涤总共约1小时，或在68℃在0.25M磷酸钠、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，并然后在68℃用2x SSC和0.1％SDS洗涤两次。
共同导入
用于在植物细胞中遗传修饰的本发明的方法的特征在于，将基因组工程化组分(i)与化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一个共同导入进一个植物细胞。
如本文所用，“共同递送”或“共同-递送”和“共同导入”或“共同-导入”可互换使用。就本发明而言，“共同导入”是指这样的过程，其中至少两个不同的组分同时被递送进同一植物细胞中。因此，基因组工程化组分(i)与化合物(ii.1)、(ii.2)和/或(ii.3)一起导入同一植物细胞中。优选地，两种类型的组分/化合物均通过共同的构建体导入。
可以通过粒子轰击、显微注射、农杆菌属介导的转化、电穿孔、农杆菌渗入或真空渗入来共同导入进植物细胞。根据本发明，基于物理递送(如粒子轰击、显微注射、电穿孔、纳米颗粒和细胞穿透肽(CPP))的方法特别优选用于共同导入组分(i)和化合物(ii)。特别优选的是通过粒子轰击共同导入。
如本文所用，术语“粒子轰击”，也称为“基因枪法转染”或“微粒介导的基因转移”，是指一种用于将包含感兴趣的构建体的包被微粒或纳米颗粒转移进靶细胞或组织中的物理递送方法。为了用于本发明，感兴趣的构建体包含基因组工程化组分(i)和化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一个。微米或纳米颗粒起射弹的作用，并使用合适的装置(通常称为基因枪)在高压下发射到感兴趣的靶结构上。通过粒子轰击进行的转化使用包被有感兴趣的构建体的金属微弹(microprojectile)，然后使用称为“基因枪(gene gun)”的设备(Sandford等，1987)以足够快的高速(～1500km/h)将其发射到靶细胞上，以穿透靶组织细胞壁，但不够严酷以导致细胞死亡。对于原生质体，其细胞壁被完全去除，条件在逻辑上是不同的。至少一个微弹上的沉淀的构建体在轰击后释放到细胞中。微弹的加速是通过高压放电或压缩气体(氦气)来实现的。关于所使用的金属颗粒，它们必须是无毒的，无反应的，并且其直径小于靶细胞的直径。最常用的是金或钨。从基因枪及其相关系统的制造商和供应商可以公开获得大量有关其一般用途的信息。
在微粒轰击的一个特别优选的实施方案中，一种或多种化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)与基因组工程化组分(i)是通过包含具有0.4-1.6微米(μm)范围大小，优选0.4-1.0μm范围大小的金颗粒的微载体共同递送的。在示例性方法中，每一次轰击使用10-1000μg的金颗粒，优选50-300μg。
可以例如使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪或手持式Helios基因枪系统将化合物(ii)与基因组工程化组分(i)递送进靶细胞中。当使用PDS-1000/He粒子枪系统时，轰击破裂压力为450psi至2200psi，优选为450-1100psi，而Helios基因枪系统的破裂压力为100-600psi。可以同时将一种以上的化学物质或构建体与基因组工程化组分共同递送到进细胞中。
培养步骤
在本发明方法的步骤b)中，在至少一种化合物(ii)的存在下，通过基因组工程化组分的活性，在允许所述植物细胞的基因组的遗传修饰的条件下，培养已共同导入基因组工程化组分(i)和至少一种化合物(ii)的植物细胞。
如本文所用，“基因组的遗传修饰”包括任何类型的操作，使得内源核苷酸已被改变以包括突变诸如缺失、插入、转换(transition)、颠换(transversion)或其组合。例如，可以缺失内源编码区域。此类突变可导致多肽具有与内源多核苷酸编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。遗传修饰的另一个实例是调控序列诸如启动子的改变以导致提高或减少可操作连接的内源编码区域的表达。
“适合”植物基因组的遗传修饰发生的条件诸如多核苷酸的切割，或“适合”条件是不能阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有助于事件。根据各个基因组工程化组分(i)，这些条件可不同。
在本发明的方法中，优选用基因组工程化组分(i)和至少一种化合物(ii)瞬时转化植物细胞。如本文所用，“瞬时转化”是指外来材料[即核酸片段、蛋白质、核糖核蛋白(RNP)等]转移进宿主细胞而导致基因表达和/或活性，而没有整合和稳定遗传外来材料。因此，基因组工程化组分(i)在植物细胞中是瞬时有活性的和/或是瞬时存在的。基因组工程化组分不是永久性地并入细胞基因组中而是提供暂时的作用以导致基因组的修饰。例如，基因组工程化组分在植物细胞中的瞬时活性和/或瞬时存在可导致在植物细胞的基因组中导入一个或多个双链断裂、在植物细胞的基因组中导入一个或多个单链断裂、在植物细胞的基因组中导入一个或多个碱基编辑事件、或在植物细胞的基因组中导入以下的一个或多个：DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化。
优选在导入一个或多个双链断裂或一个或多个单链断裂之后为非同源N连接(NHIJ)和/或为通过同源重组机制对一个或多个断裂的同源定向修复。
植物细胞的基因组中的所得修饰可以例如选自转基因(优选地为包含感兴趣的基因的表达盒)的插入，至少一个核苷酸的取代，至少一个核苷酸的缺失，至少一个核苷酸的插入，DNA甲基化的改变，组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的改变，或其组合。根据本发明的一个特别优选的方面，没有与所应用的基因编辑机制/系统有关的外源遗传物质被稳定地整合进植物细胞的基因组中。
遗传修饰可以是植物细胞基因组中的永久且可遗传的改变。
任选的预处理
根据本发明的优选方面，通过在含有一种或多种化合物(ii)的培养基中体外培养植物材料，在共同导入步骤(a)之前，可以包括用一种或多种化学物质例如化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的一个或多个对植物材料预处理。因此，用于在植物细胞中遗传修饰的方法可以进一步包含对待用于步骤(a)的植物细胞的预处理的步骤，所述预处理包含在含有(ii.1)表观遗传调控化学物质或其活性衍生物，特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)或DNA甲基转移酶抑制剂，(ii.2)植物激素或其活性衍生物，(ii.3)引起从愈伤组织或胚性组织的植物再生得到改善的蛋白质，或其任何组合的培养基中培养植物细胞或包含其的植物材料。
在预处理步骤之后，从含有化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一种的培养基中提取处理过的植物细胞，并用于共同导入步骤(a)。
作为示例，对于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂TSA，HDACi预处理的持续时间为10分钟至2天，优选2.0小时至24小时。用于预处理的TSA浓度为1.0nM至1000nM，优选10nM至100nM。此后，将处理过的植物材料转移至无HDACi的培养基中，并立即用于TSA共同导入(延长时间的TSA预处理可能会造成非选择性地增强细胞再生，这可能会提高回收被轰击和修饰的细胞的难度)。
相似的预处理条件可以应用于所有类型的化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)。植物组织培养和基因组工程化可以使用目前可用的方法进行。可以使用红色荧光报告基因tdTomato(其编码异常亮的红色荧光蛋白，其激发最大值为554nm且发射最大值为581nm)或绿色荧光报告基因mNeonGreen(其编码最亮的单体绿色或黄色荧光蛋白，其最大激发波长为506nm，且最大发射波长为517nm)来监测瞬时转化和转基因表达。基因组编辑效率可以例如通过下一代测序(NGS)来分析。
微粒
在本发明的上下文中，发现对于将组分(i)和(ii)共同导入植物细胞，用两种组分包被的微粒是特别合适的。因此，根据另一个实施方案，本发明提供一种用至少以下包被的微粒
(i)基因组工程化组分和
(ii)第二化合物，其包含
(ii.1)表观遗传调控化学物质，例如蛋白质脱乙酰基酶抑制剂或其活性衍生物，特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，和/或
(ii.2)植物激素或其活性衍生物，和/或
(ii.3)引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒。
微粒由无毒、无反应的材料组成。优选地，微粒包括金属诸如金或钨。微粒的大小可以在0.4-1.6微米(μm)的范围，优选0.4-1.0μ的范围。
具有组分(i)和(ii)的包被可以包含一个或多个包被层。例如，微粒可含有包含基因组工程化组分(i)的第一包被层和包含化合物(ii.1)、(ii.2)和/或(ii.3)的第二包被层。可选地，微粒可含有包含基因组工程化组分(i)和化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一种的包被层。
另外，本发明提供一种通过微弹(microprojectile)轰击来遗传修饰植物基因组的试剂盒，其包含
(I)一个或多个微粒，和
(II)用于用至少基因组工程化组分和(1)表观遗传调控化学物质(例如DNA甲基转移酶抑制剂或蛋白质脱乙酰基酶抑制剂，特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi))或其活性衍生物，和/或(2)植物激素或其活性衍生物，和/或(3)引起从愈伤组织或胚性组织的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒包被所述微粒的工具。
本发明的另一方面是如上所述的微粒在植物细胞的基因枪法转化中的用途。
本发明的主题还是通过上述方法获得或可获得的植物细胞。因此，本发明的一个实施方案是通过上述在植物细胞中遗传修饰的方法获得或可获得的经遗传修饰的植物细胞。与原始植物细胞相比，这些植物细胞中的遗传修饰例如可包括转基因(优选地为包含感兴趣的基因的表达盒)的插入，至少一个核苷酸的取代，至少一个核苷酸的缺失，至少一个核苷酸的插入，DNA甲基化的改变，组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的改变，或其组合。优选地，经遗传修饰的植物细胞不包含任何稳定整合进植物细胞基因组中的外源遗传物质。
经遗传修饰的植物细胞可以是整个植物的部分或其部分。因此，本发明还涉及包含上述经遗传修饰的植物细胞的植物或植物部分。
根据本发明的另一方面，经遗传修饰的植物细胞可以再生为完整(可育)植物。因此，在本发明的优选方面，在植物细胞的遗传修饰之后是再生植物的步骤。因此，本发明提供了一种产生经遗传修饰的植物的方法，包括以下步骤：
a)根据上述用于在植物细胞中遗传修饰的方法对植物细胞遗传修饰，和
b)从步骤a)的修饰的植物细胞再生植物，
优选地，其中所产生的植物不包含在步骤a)中共同导入的任何基因组工程化组分、表观遗传调控化学物质或其活性衍生物(特别是DNA甲基转移酶抑制剂或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi))、植物激素或其活性衍生物，或引起从愈伤组织或胚性组织的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒。
如本文所用，“再生”是指单个或多个细胞增殖并发育成组织、器官以及最终整个植物的过程。
再生植物的步骤b)可以例如包含在再生培养基上培养来自步骤a)的经遗传修饰的植物细胞。
再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的处理，偶尔依赖于可以导入的抗微生物剂(biocide)和/或除草剂标志物。再生可以得自植物体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞以及衍生自不同外植体(例如愈伤组织、未成熟或成熟的胚、叶、芽、根、花、小孢子、胚性组织、分生组织、器官或其任何部分)的原生质体。此种再生技术在Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467486中有一般描述。从培养的原生质体的植物再生描述于Evans等,Protoplasts Isolation and Culture,Handbook of Plant cell Culture,pp.124-176,MacMillilan Publishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。要从转化的或基因编辑的细胞中获得完整的植物，可以在一系列含有营养和激素的介质中在受控的环境条件下生长细胞，该过程称为组织培养。一旦生成完整植物并产生种子，就开始评估后代。
本发明还提供通过上述产生经遗传修饰的植物或其后代植物的方法获得或可获得的经遗传修饰的植物。
本发明的另一主题是衍生自上述经遗传修饰的植物的植物细胞或种子。这种植物细胞或种子不包含任何基因组工程化组分、表观遗传调控化学物质或其活性衍生物(特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi))、植物激素或其活性衍生物、以及引起从愈伤组织或胚性组织的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒
本发明的另一主题是无需基于标志物基因的选择的衍生自上述经遗传修饰的细胞的植物、植物细胞或种子。如本文所用，“基于标志物基因的选择”是指通过使用整合的选择标志物(基因)，例如抗生素抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因)或除草剂抗性基因(例如膦丝菌素抗性基因、草甘膦抗性基因)从野生型细胞中选择，鉴定和/或纯化修饰的细胞，特别是转化的、基因编辑的或碱基编辑的细胞的任何过程。没有这样的选择，这种植物、植物细胞或种子可能不具有任何整合的基因组工程化组分，并从而可能导致无转基因的经遗传修饰的植物或仅整合了感兴趣的转基因的修饰的植物。
本发明的另一个方面是表观遗传学调控化学物质(例如蛋白质脱乙酰基酶抑制剂或其活性衍生物，特别是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi))、和/或植物激素或其活性衍生物，和/或引起从体细胞、愈伤组织细胞或胚性细胞的植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒用于提高在植物细胞中遗传修饰的效率的用途，优选地在本文上述方法中。
除非在实施例中另有说明，否则所有重组DNA技术均根据如在以下中所述的标准方案进行：Sambrook等(1989)，(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；以及Ausubel等(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的第1卷和第2卷。BIOSScientific Publications(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述了用于植物分子研究的标准材料和方法。标准分子生物学技术的其他参考包括Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY，Brown(1998)Molecular Biology LabFax,Second Edition,Academic Press(UK)的第I卷和第II卷。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可参见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press，以及McPherson等，(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,First Edition,Springer Verlag,Germany。
本文引用或援引的所有专利、专利申请和出版物或公共公开内容(包括互联网上的出版物)均通过引用以其全文并入本文。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，应当理解，本发明不限于这些实施例。
附图
图1：pLH-Pat5077399-70Subi-tDt构建体图谱。tDT定义tdTomato基因。
图2：通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送15ng TSA与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt(图1)。
A：红色荧光图像显示轰击后16小时的玉米Hi II未成熟胚中的表达tdTomato的细胞(白色斑点)。上面的图像是从没有TSA(无TSA)的对照轰击中拍摄的，而底部的图像是从具有15ng的TSA的共同轰击中拍摄的。
B：没有TSA(无TSA)或具有15ng的TSA(15ng TSA)的轰击后16小时每个胚的红色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图3：通过在玉米Hi II未成熟胚中的100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送不同量的TSA(无TSA、15ng、30ng和45ng)与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt(图1)。
A：用不同量的TSA轰击后16小时在玉米Hi II未成熟胚中每个视野的荧光细胞的平均数目。
B：当用不同量的TSA共同轰击时，荧光细胞的平均数目的增加百分比。误差线＝标准偏差。
图4：pGEP359构建体图谱。tDT定义tdTomato基因。ZmLpCpf1定义毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)CRISPR/Cpf1(LbCpf1)基因的玉米密码子优化的CDS。
图5：通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击共同递送15ng TSA与构建体pGEP359(图4)。
A：轰击后16小时，红色荧光图像显示玉米Hi II II型愈伤组织中表达tdTomato的细胞。左边的图像是从没有TSA(无TSA)的对照轰击中拍摄的，而右边的图像是从具有15ngTSA的共同轰击中拍摄的。
B：没有(无TSA)或具有15ng的TSA的轰击后16小时每个视野中红色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图6：通过300μg金颗粒(0.6μm)的微弹轰击来共同递送15ng TSA与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt(图1)。
A：红色荧光图像显示轰击后24小时，甜菜松散型愈伤组织(friable callus)中表达tdTomato的细胞(白色斑点)。上面的图像是从没有TSA(无TSA)的对照轰击中拍摄的，而底部的图像则显示具有15ng TSA的共同轰击。
B：在没有(-TSA)或具有15ng TSA(+TSA)的轰击后24小时每个视野的荧光细胞平均数目。误差线＝标准偏差。
图7：pGEP284构建体图谱。tDT定义tdTomato基因。TaCRISPR定义CRISPR核酸酶的小麦密码子优化的CDS。sgGEP14将向导RNA靶标定为玉米光泽2基因(maize glossy 2gene)的第一外显子。
图8：通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送不同量的TSA(无TSA、15ng、30ng和45ng)与基因编辑构建体pGEP284(图7)。A：共同轰击后2天，Hi II胚中位点特异性InDel(插入和缺失)率。B：当玉米Hi II胚中不同量的TSA(无TSA、15ng、30ng和45ng，从左到右)与基因组编辑构建体pGEP284共同轰击时，InDel率的变化百分比。
图9：pGEP353构建体图谱。crGEP46定义crRNA46，其靶向玉米甘油酸激酶基因(GLYK)。
图10：基因编辑构建体pGEP359(ZmLbCpf1，图4)和pGEP353(crRNA46，图9)与15ngTSA(右侧，15ng TSA)或无TSA(左侧，无TSA)共同传递进玉米Hi II愈伤组织。
图11：pGEP362构建体图谱。mNeonGreen定义mNeonGreen基因，其编码最亮的单体绿色或黄色荧光蛋白，激发最大值为506nm且发射最大值为517nm。ZmLpCpf1定义毛螺菌科细菌CRISPR/Cpf1(LbCpf1)基因的玉米密码子优化的CDS。
图12：通过微弹轰击将250ng 2,4-D与构建体pGEP362(图11)共同递送至玉米HiII未成熟胚中。
A：绿色荧光图像显示轰击后16小时，在玉米Hi II未成熟胚中表达mNeonGreen报告基因的细胞。上面的图像是从没有2,4-D(无2,4-D)的对照轰击中拍摄的，而底部的图像则显示了具有250ng 2,4-D的共同轰击。
B：轰击后16小时每个胚的绿色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图13：通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送不同量的2,4-D(0ng、125ng、250ng和500ng)与构建体pGEP362(图11)。
A：绿色荧光图像显示与不同量的2,4-D(0ng、125ng、250ng和500ng)共同轰击后16小时，玉米Hi II II型愈伤组织细胞中表达mNeonGreen报告基因的细胞。
B：用不同量的2,4-D(0ng、125ng、250ng和500ng)轰击后16小时，每个视野的绿色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图14：通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击将2,4-D与构建体pGEP359(图4)共同递送至玉米植物的叶中(上面：无2,4-D，底部：具有250ng的2,4-D)(示例性tdT表达由箭头指示)。
图15：通过与100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击，将250ng 6-BA或玉米素与构建体pGEP359(图4)共同递送至玉米Hi II II型愈伤组织中。
A：在没有激素(无激素)、具有250ng 6-BA或具有250ng玉米素的轰击后16小时，从左到右的红色荧光图像显示玉米Hi II II型愈伤组织细胞中表达tdTomato报告基因的细胞。
B：轰击后16小时每个视野中红色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图16：pABM-BdEF1_ZmPLT5构建体图谱。玉米PLT5基因(ZmPLT5)由来自短柄草属(Brachypodium)的强组成型EF1启动子(BDEF1)驱动。
图17：pABM-BdEF1_ZmPLT7构建体图谱。玉米PLT7基因(ZmPLT7)由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BDEF1)驱动。
图18：pABM-BdEF1_TaRKD构建体图谱。小麦RKD基因(TaRKD)由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(BDEF1)驱动。
图19：通过用100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击，将100ng加强基因构建体与构建体pGEP359(图4)共同递送到玉米Hi II未成熟胚中。
A：红色荧光图像显示轰击后16小时，在玉米Hi II未成熟胚中表达tdTomato报告基因的细胞。左到右的图像是从没有加强(仅tDT)的对照轰击或具有ZmPLT5(图16)(tDT+ZmPLT5)或小麦RKD(TaRKD，图18)(tDT+TaRKD)加强构建体的轰击中拍摄的。
B：轰击后16小时，每个胚的红色荧光细胞的平均数目。误差线＝标准偏差。
图20：与ZmPLT5或ZmPLT7基因构建体共同轰击后12天，观察到tdTomato荧光胚胎发生的愈伤组织。图中所显示的红色荧光图像显示在轰击后12天，在从未成熟胚诱导的胚胎发生的愈伤组织细胞中表达的tdTomato报告基因。从左至右的图像显示仅用tDTomato报告基因(仅tDT)或用100ng的加强ZmPLT5(tDT+ZmPLT5)或ZmPLT7基因构建体(tDT+ZmPLT7)轰击的胚。
图21：tdTomato与小麦RKD加强构建体共同轰击后17天，在A188未成熟胚中诱导愈伤组织。
A：明场图像显示从仅用tDTomato报告构建体轰击的未成熟胚中诱导愈伤组织。
B：明场图像显示了从用tDTomato报告和小麦RKD构建体共同轰击的未成熟胚中诱导愈伤组织。
实施例
实施例1：没有曲古抑菌素A(TSA)预处理的玉米未成熟胚中，通过微弹轰击将TSA与含有tdTomato报告基因(即pLH-Pat5077399-70Subi-tDt)的构建体的共同递送提高了瞬时转化效率。
过程：制备用于轰击的玉米未成熟胚：授粉后8-10天，收获具有0.8至1.8mm大小的未成熟胚的玉米穗(即A188或Hi II)。穗用70％乙醇消毒10-15分钟。在层流罩(laminarhood)中短暂风干后，用鲨鱼解剖刀从穗上除去上部～1/3的玉米粒，并用刮刀小心地将未成熟的胚从玉米粒中取出。将新鲜的分离的胚置于胚子叶面朝上的渗透培养平板(见下文)中的轰击靶区域上。轰击前，用石蜡膜包裹平板并将其在25℃黑暗中孵育4-20小时。
用于用100μg金颗粒(约4.0-5.0x 107 0.6微米金颗粒)轰击的TSA量为0.01ng至500ng的范围，优选为0.1至50ng的范围。将质粒DNA和TSA共同包被到用于轰击的金颗粒上：对于10次发射，将总体积为100微升(μl)的50％(v/v)甘油中的1mg大小为0.6微米(μm)的金颗粒(每次发射100μg金颗粒)吸移到透明的低滞留微离心管中。超声15秒钟使金颗粒悬浮。在低速涡旋下，向每100μl金颗粒中按顺序添加以下：
-多至10μl的DNA(1.0μg总DNA，每次发射100ng)
-100μl的2.5M CaCl2(在冰上预冷)
-40μl的0.1M冷亚精胺
盖上盖子并在0-10℃涡旋离心管2-30分钟，并旋转降下DNA包被的金颗粒。用500μl 100％乙醇洗涤两次后，将沉淀重悬于120μl的100％乙醇中。最后，将适量的TSA(对于100μg大小为0.6μm的金颗粒的轰击，TSA的量为0.01至500ng，优选为0.1-50ng；将TSA溶解在DMSO中)小心添加到重悬的金颗粒中。低速涡旋时，将10μl的质粒DNA(pLH-Pat5077399-70Subi-tDt构建体；图1)和TSA共同包被的金颗粒从管中以宽口的20μl吸头平均地吸移到大载体的中心，由于此时颗粒倾向于形成团块，因此尽快将金颗粒置于大载体上。空气干燥。
使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪进行轰击。轰击条件是：27-28mm/Hg真空，450或650psi破裂片，6mm的间隙距离，样品平台在距腔室底部60mm距离的第二位置。轰击后，将胚在渗透培养基上再保留16小时，并然后移至II型愈伤组织诱导培养基平板上(见下文)。轰击后16-48小时，使用荧光显微镜在激发最大值554nm和发射最大值581nm处针对tdTomato基因表达检查瞬时转化。
II型愈伤组织诱导培养基：N6盐、N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、2.9g/L的L-脯氨酸、20g/L的蔗糖、5g/L的葡萄糖、5mg/L的AgNO3、8g/L的细菌琼脂(Bacto-agar)、pH5.8。
渗透培养基：N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、0.7g/L的L-脯氨酸、0.2M的甘露醇(36.4g/L)、0.2M的山梨糖醇(36.4g/L)、20g/L蔗糖、15g/L细菌琼脂、pH5.8。
在图2中，通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送15ng TSA与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt(图1)改善玉米Hi II未成熟胚中的DNA瞬时转化。在图2A中，与未用TSA的对照轰击相比，红色荧光图像显示用15ng TSA轰击后16小时在玉米Hi II未成熟胚中表达tdTomato的细胞。通过共同递送15ng TSA，轰击后16小时每个胚的红色荧光细胞(即阳性瞬时转化的细胞)的平均数目提高了98.2％(图2B)。
已使用不同量的TSA-无TSA、15ng TSA、30ng TSA和45ng TSA重复了此共同递送实验(图3)。TSA的存在总是改善玉米Hi II未成熟胚中的瞬时转化。在16小时的玉米Hi II未成熟胚中每个视野的荧光细胞(即阳性瞬时转化的细胞)的平均数目在30ng的TSA左右显示出最佳值(图3A)。然而，甚至更低以及更高的浓度导致瞬时转化细胞的显著增加(图3B)。
实施例2：在没有曲古抑菌素A(TSA)预处理的II型玉米愈伤组织中，通过微弹轰击的TSA与tdTomato报告构建体pGEP359(图4)的共同递送促进了转化效率
II型愈伤组织诱导和选择：如实施例1中所述，分离出大小为0.8-1.8mm的Hi II未成熟胚，并立即将其胚子叶面朝上放置在II型愈伤组织诱导培养基(见下文)上，密度为每平板(直径为100毫米)10-15个胚。用石蜡膜包裹平板，并在黑暗中于27℃在平板中培养胚直到II型愈伤组织出现(～2周)。在立体镜下挑选松散型II型愈伤组织，并将其移至II型愈伤组织选择培养基上(见下文)。重复此过程2-3次，并在诱导后4周丢弃胚。基于松散性(高度松散型)、形态(无胚样结构)、颜色(新鲜、白色、半透明)，在立体镜下仔细选择II型愈伤组织的胚前阶段。每1-2周在愈伤组织选择培养基中选择并继代培养II型愈伤组织(见下文)，直到愈伤组织系稳定(约3-5轮选择)。每1-2周在II型愈伤组织继代培养基(见下文)中培养稳定的II型愈伤组织系。
用于轰击的II型愈伤组织的制备：在胚前阶段选择高度松散型II型愈伤组织并将其转移到渗透培养基平板中的轰击靶区域(见实施例1)(单层、无重叠)。轰击前，用石蜡膜包裹平板并在黑暗中于25℃孵育4-20小时(优选的4小时)。
使用与实施例1中所述相同的过程进行微弹轰击和轰击后处理。
II型愈伤组织诱导培养基：N6盐、N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、2.9g/L的L-脯氨酸、20g/L的蔗糖、5g/L的葡萄糖、5mg/L的AgNO3、8g/L的细菌琼脂、pH5.8
II型愈伤组织选择培养基：N6盐、N6维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、2.9g/L的L-脯氨酸、20g/L的蔗糖、2mg/L的AgNO3、8g/L的细菌琼脂、pH5.8
II型愈伤组织亚培养基：N6盐，N6维生素，1.0mg/L的2,4-D，100mg/L的酪蛋白，0.7g/L的L-脯氨酸，20g/L的蔗糖，8g/L的细菌琼脂，pH5.8
在图5中，通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送15ng TSA与构建体pGEP359提高了玉米Hi II II型愈伤组织中的瞬时转化。在图5A中，红色荧光图像显示与没有TSA的对照轰击相比，用15ng TSA轰击后16小时玉米Hi II II型愈伤组织中表达tdTomato的细胞。通过共同递送15ng TSA，轰击后16小时的玉米Hi II II型愈伤组织中每个视野的荧光细胞(即阳性瞬时转化的细胞)的平均数目提高了43.3％(图5B)。
实施例3：通过微弹轰击的曲古抑菌素A(TSA)与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt的共同递送改善了甜菜松散型愈伤组织的瞬时转化。
甜菜愈伤组织诱导：将在芽培养基中(见下文)来自体外培养的甜菜芽的幼叶在层流罩中切成小块(正方形，大小3-5mm)，并放在愈伤组织诱导培养基(见下文)上，密度为每平板(直径100毫米)10-15块，近轴面朝上。用石蜡膜包裹平板并在黑暗中于23℃在平板上培养叶段6-8周直到愈伤组织出现。
制备用于轰击的甜菜愈伤组织：在立体镜下收获松散型新鲜愈伤组织，并将它们转移到甜菜渗透培养基中的轰击靶区域(见下文)(单层，无重叠)。轰击前，用石蜡膜包裹平板并在黑暗中于25℃孵育4-20小时。
使用实施例1中描述的相同过程进行微弹轰击和轰击后处理，除了用于轰击的金颗粒的量为300μg。
甜菜芽培养基：MS、0.25mg/L的BAP、30g/L的蔗糖、8g/l的植物琼脂、pH6.0
甜菜愈伤组织诱导培养基：MS、2.0mg/L的BAP、15g/L的蔗糖、8g/l的植物琼脂、pH6.0
甜菜愈伤组织渗透培养基：MS、2.0mg/L的BAP、15g/L的蔗糖、0.2M的甘露醇(36.4g/L)、0.2M的山梨糖醇(36.4g/L)、8g/l的植物琼脂、pH6.0
在图6中，通过300μg金颗粒(0.6μm)的微弹轰击来共同递送15ng TSA与构建体pLH-Pat5077399-70Subi-tDt(图1)改善了甜菜松散型愈伤组织中的瞬时转化。在图6A中，红色荧光图像显示与没有TSA的对照轰击相比，用15ng TSA轰击后24小时在甜菜松散型愈伤组织中表达tdTomato的细胞。通过共同递送15ng TSA，轰击后24小时每个视野的荧光细胞(即阳性瞬时转化的细胞)的平均数目提高了193.7％(图6B)。
实施例4：曲古抑菌素A(TSA)与基因编辑构建体的共同递送改善了玉米未成熟胚中的基因组编辑效率。
使用与实施例1中所述相同的过程进行胚分离、微弹轰击和轰击后处理。
轰击后两天，收获胚并使用来自Qiagen(Venlo,Netherlands)的Plant DNAIsolation kit用于基因组DNA分离。NGS(下一代测序)由Illumina Inc.(San Diego,California,USA)的Miseq平台进行。通过CRISPResso(http://crispresso.rocks/)的工具分析InDel(插入和缺失)率。
在图8中，与TSA(从左到右分别为无TSA、15ng、30ng和45ng)的共同轰击导致轰击后2天Hi II胚中的基因编辑效率的改善。在图8A中，显示了针对不同量的TSA与基因编辑构建体pGEP284(图7)共同轰击后2天的Hi II胚中的位点特异性InDel率，其中位点特异性InDel率指示基因编辑效率。TSA的存在总是提高玉米Hi II未成熟胚中基因编辑事件的频率。InDel事件(即基因编辑阳性的胚)率显示出在30ng的TSA左右的最佳值。但是，与没有TSA相比，甚至更低以及更高的浓度会导致InDel率显著提高。当不同量的TSA与基因编辑构建体pGEP284在玉米Hi II胚中共同轰击时，InDel率的变化百分比如图8B所示。
实施例5：曲古抑菌素A(TSA)与基因编辑构建体pGEP359(图4)和pGEP353(图9)的共同递送提高了玉米Hi II II型愈伤组织中的基因组编辑效率
使用与实施例2中所述相同的过程进行II型愈伤组织培养和微弹轰击以及轰击后处理。
轰击后2-15天，收获胚并使用来自Qiagen的Plant DNA Isolation kit用于基因组DNA分离。NGS(下一代测序)由Illumina Miseq平台进行。通过CRISPResso的工具分析InDel(插入和缺失)率。
在图10中，基因编辑构建体pGEP359(ZmLbCpf1，图4)和pGEP353(crRNA46，图9)与15ng TSA(在右侧，15ng的TSA)或无TSA(在左侧，无TSA)在玉米Hi II愈伤组织中的共同轰击显示了共同轰击后13天，位点特异性InDel(插入和缺失)率提高为6.75倍或提高了575％。
实施例6：通过微弹轰击的生长素2,4-D与mNeonGreen报告构建体pGEP362(图11)的共同递送提高了其在玉米未成熟胚中的瞬时转化效率
采用与实施例1中所述相同的过程进行胚分离和微弹轰击以及轰击后处理。
用于用100μg金颗粒(约4.0 -5.0x 107的0.6μm金颗粒)轰击的2,4-D的量在1.0ng至1000ng的范围，优选10ng至500ng的范围。如实施例1所述进行质粒DNA和2,4-D共包被到用于轰击的金颗粒上。在100％DMSO中制备2,4-D储备溶液(例如1mg/ml)。
在图12中，通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送250ng 2,4-D与构建体pGEP362(图11)改善了玉米Hi II未成熟胚中的DNA瞬时转化。在图12A中，绿色荧光图像显示了轰击后16小时的玉米Hi II未成熟胚中表达mNeonGreen报告基因的细胞。B：与无2,4-D的对照轰击相比，用250ng的2,4-D轰击后16小时每个视野的绿色荧光细胞的平均数目。与250ng的2,4-D的共同轰击导致每个胚的荧光细胞平均数目增加187％(图12B)。
实施例7：通过微弹轰击的生长素2,4-D与mNeonGreen报告构建体pGEP362(图11)的共同递送提高了其在玉米Hi II II型愈伤组织中的瞬时转化效率
使用与实施例2中所述相同的过程进行II型愈伤组织培养和微弹轰击以及轰击后处理。
用于用100μg金颗粒(约4.0 -5.0x 107的0.6μm金颗粒)轰击的2,4-D的量在1.0ng至1000ng的范围，优选10ng至500ng的范围。如实施例6所述进行质粒DNA和2,4-D共同包被到用于轰击的金颗粒上。
在图13中，通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送不同量的2,4-D(0ng、125ng、250ng和500ng)与构建体pGEP362(图11)改善了玉米Hi II II型愈伤组织的瞬时转化。绿色荧光图像显示用不同量的2,4-D(从左上到右下：2,4-D 0ng、125ng、250ng和500ng)共同轰击后16小时玉米Hi II II型愈伤组织细胞中表达mNeonGreen报告基因的细胞，其显示用2,4-D的共同轰击使荧光显著增加(图13A)。在图13B中，显示出了在用不同量的2,4-D(0ng、125ng、250ng和500ng)轰击之后16小时，每个视野绿色荧光细胞的平均数目。通过添加2,4-D，荧光细胞的平均数目已经提高至少34.8％。
实施例8：通过微弹轰击的生长素2,4-D与tDTomato报告构建体pGEP359(图4)的共同递送提高了其在玉米植物叶中的瞬时转化效率
玉米植物已经在温室中生长。使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪在阶段V8中进行了微弹轰击。轰击条件是：27-28mm/Hg真空，450或650psi破裂片，6mm的间隙距离。轰击后20小时，使用荧光显微镜在激发最大值554nm和发射最大值581nm处针对tdTomato基因表达检查瞬时转化。如实施例1中所述将质粒DNA和2,4-D共同包被到用于轰击的金颗粒上。2,4-D储备溶液(例如在DMSO中为25mg/ml)。
在图14中，通过微弹轰击共同递送2,4-D与构建体pGEP359(图4)改善了玉米叶中的瞬时转化。
实施例9：通过微弹轰击的细胞分裂素如6-BA或玉米素与tDTomato报道构建体pGEP359(图4)的共同递送提高了其在玉米Hi II II型愈伤组织中的瞬时转化效率
使用与实施例2中所述相同的过程进行II型愈伤组织培养和微弹轰击以及轰击后处理。
用于用100μg金颗粒(约4.0 -5.0x 107的0.6μm金颗粒)轰击的6-BA或玉米素的量在1.0ng至1000ng的范围，优选10ng至1000ng的范围。如实施例6所述进行质粒DNA和细胞分裂素共同包被到用于轰击的金颗粒。
在图15中，通过用100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击，在玉米Hi II II型愈伤组织中的250ng 6-BA或玉米素与构建体pGEP359(图4)的共同递送。轰击后16小时(图15A)，红色荧光图像显示玉米Hi II II型愈伤组织细胞中的表达tdTomato报告基因的细胞，从左到右：没有激素的对照轰击(无激素)、用250ng的6-BA的轰击和用250ng的玉米素的轰击。在图15B中，显示了轰击后16小时每个视野红色荧光细胞的平均数目。250ng 6-BA共同轰击使荧光细胞的平均数目提高了35.8％，且250ng玉米素共同轰击使荧光细胞的平均数目提高了31.2％。
实施例10：通过微弹轰击的加强基因与tDTomato报告构建体(图4)的共同递送提高了其在玉米未成熟胚中的瞬时转化效率
使用与实施例1中所述相同的过程进行胚分离、微弹轰击和轰击后处理。
加强基因与荧光报告构建体(tdTomato基因，图4)共同轰击。用于用100μg金颗粒(约4.0 -5.0x 107的0.6μm的金颗粒)和100ng的tDTomato报告构建体进行轰击的加强基因构建体(图16，图17，图18)的量为10.0ng至1000ng的范围，优选50ng至100ng的范围。如实施例1所述进行质粒DNA包被在用于轰击的金颗粒上。
通过轰击玉米Hi II未成熟胚后16-20的其提高报告基因的瞬时转化频率的能力来测量加强作用。
通过100μg金颗粒(0.6μm大小)的微弹轰击来共同递送100ng加强基因构建体与100ng的tDTomato报告构建体(图4)改善了玉米Hi II未成熟胚中的tDTomato基因瞬时转化。
在图19A中，红色荧光图像显示轰击后16小时的玉米Hi II未成熟胚中的表达tDTomato报告基因的细胞。图19B：与仅用报告(仅tDT)的对照轰击相比，用加强基因构建物轰击后16小时每个胚的红色荧光细胞的平均数目。用100ng的ZmPLT5加强基因构建体(图16)(tDT+ZmPLT5)的共同轰击导致每个胚的荧光细胞的平均数目提高了102％，或者与100ng的小麦RKD(TaRKD)(图18)(tDT+TaRKD)的共同轰击导致每个胚的荧光细胞的平均数目提高了144％(图19B)。
实施例11：加强基因的瞬时过表达促进转化频率(TF)
使用与实施例10中所述相同的过程进行胚分离、微弹共同轰击和轰击后的处理。通过没有选择的轰击玉米Hi II未成熟胚(IE)后12天的其提高报告基因的转化频率的能力来测量对于转化的加强作用。
如表1所示，tdTomato构建体与ZmPLT5的共同轰击导致tdTomato基因的转化频率的提高42.9％(与对照相比提高超过16倍)，而与ZmPLT7的共同轰击使得没有选择的轰击后12天的tdTomato基因的转化频率的提高53％(与对照相比提高超过16倍)(图20)。
表1：轰击后12天的tDT转化频率(FT)：FT被定义为自100个被轰击的胚中具有至少一个表达tDT的胚胎发生结构的胚的数目(tDT阳性IE的数目)。
只tDT tDT+ZmPLT5 tDT+ZMPLT7
tDT阳性IE/总IE的数目 1/40 21/49 26/49
tDT TF 2.5％ 42.9％ 53.1％
实施例12：小麦RKD加强基因(SEQ ID NO：6)的瞬时过表达促进A188未成熟胚中的愈伤组织诱导
使用与实施例10中所述相同的过程进行的胚分离、微弹共同轰击和轰击后处理，并且如实施例2中所述进行愈伤组织诱导。
小麦RKD基因的瞬时过表达导致愈伤组织诱导的显著改善，诱导率从没有TaRKD的38％提高到有100ng的TaRKD的75％(几乎是加倍了愈伤组织诱导率)(图21)。

Claims (29)

1.一种用于在甜菜植物细胞中遗传修饰的方法，所述方法包含步骤(a)和(b)
(a)将以下(i)和(ii)共同导入所述甜菜植物细胞，
(i)基因组工程化组分，和
(ii)第二化合物，其包含
(ii.1)曲古抑菌素，或
(ii.2)植物激素，其选自2,4-二氯苯氧基乙酸、6苄基氨基嘌呤或玉米素，或
(ii.3)引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒，
(b)在允许存在所述第二化合物时，通过基因组工程化组分的活性来遗传修饰所述甜菜植物细胞的基因组的条件下培养所述甜菜植物细胞；
以及其中，所述引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质包含选自以下之一的氨基酸序列：
a)如SEQ ID NO：1、3、5、13、15、29或31中任何一个所示的序列，或
b)由如SEQ ID NO：2、4、6、14、16、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基因组工程化组分(i)和/或所述第二化合物(ii)在所述甜菜植物细胞中是瞬时有活性的和/或是瞬时存在的。
3.权利要求1所述的方法，其中所述基因组工程化组分包含
a.双链DNA断裂诱导酶或编码其的核酸，以及任选地包含修复核酸分子，或
b.单链DNA或RNA断裂诱导酶或编码其的核酸，以及任选地包含修复核酸分子，或
c.碱基编辑器酶，其任选地与解除武装的双链DNA断裂诱导酶或单链DNA或RNA断裂诱导酶融合，或
d.影响DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的酶，其任选地与解除武装的双链DNA断裂诱导酶或单链DNA或RNA断裂诱导酶融合。
4.权利要求3所述的方法，其中所述双链DNA断裂诱导酶识别所述细胞的基因组中的预定位点。
5.权利要求3所述的方法，其中所述单链DNA或RNA断裂诱导酶识别所述细胞的基因组中的预定位点。
6.权利要求3所述的方法，其中在c中，所述解除武装的双链DNA断裂诱导酶或单链DNA或RNA断裂诱导酶识别所述细胞的基因组中的预定位点。
7.权利要求3所述的方法，其中在d中，所述解除武装的双链DNA断裂诱导酶或单链DNA或RNA断裂诱导酶识别所述细胞的基因组中的预定位点。
8.权利要求1所述的方法，其中所述基因组工程化组分包含选自以下的双链DNA断裂诱导酶或单链DNA或RNA断裂诱导酶：CRISPR/Cas内切核酸酶，锌指核酸酶，归巢内切核酸酶，大范围核酸酶和TAL效应物核酸酶。
9.权利要求8所述的方法，其中所述CRISPR/Cas内切核酸酶是CRISPR/Cpf1内切核酸酶。
10.权利要求2所述的方法，其中步骤(b)中的所述基因组工程化组分的瞬时活性包含在所述甜菜植物细胞的基因组中诱导一个或多个双链断裂，在所述甜菜植物细胞的基因组中诱导一个或多个单链断裂，在所述甜菜植物细胞的基因组中诱导一个或多个碱基编辑事件，或在所述甜菜植物细胞的基因组中诱导一个或多个DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化。
11.权利要求10所述的方法，其中在诱导一个或多个双链断裂或一个或多个单链断裂之后为非同源末端连接和/或通过同源重组机制对断裂的同源性定向修复。
12.权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中所述基因组的修饰选自
a.取代至少一个核苷酸；
b.缺失至少一个核苷酸；
c.插入至少一个核苷酸；
d.DNA甲基化的改变，
e.组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组氨酸SUMO化、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化的改变，或
f.a-e的任何组合。
13.权利要求1的所述方法，其中步骤(a)中的所述甜菜植物细胞是衍生自愈伤组织、未成熟或成熟的胚、叶、芽、根、花、小孢子、胚性组织或分生组织的细胞。
14.权利要求1所述的方法，其还包含将待用于步骤(a)的甜菜植物细胞预处理的步骤，所述预处理包含在含有所述曲古抑菌素、所述植物激素、所述引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质的培养基中培养所述甜菜植物细胞或包含所述甜菜植物细胞的甜菜植物材料。
15.权利要求1所述的方法，其中共同导入是通过粒子轰击、显微注射、农杆菌属介导的转化、电穿孔、借助纳米颗粒或细胞穿透肽的物理递送、或真空渗入来进行的。
16.权利要求1所述的方法，其中所述共同导入是通过农杆菌渗入来进行的或基于物理递送。
17.权利要求16所述的方法，其中所述物理递送为粒子轰击、显微注射、或电穿孔。
18.权利要求15所述的方法，其中所述共同导入是通过粒子轰击。
19.权利要求1所述的方法，其中所述方法包含另一个步骤(c)，其获得和/或选择经遗传修饰的甜菜植物细胞或甜菜植物或其部分，所述甜菜植物或其部分包含经遗传修饰的甜菜植物细胞或衍生自经遗传修饰的甜菜植物细胞，并且在至少一个细胞中包含基因组的遗传修饰。
20.权利要求19所述的方法，其中选择是通过检测遗传修饰的手段来进行的。
21.权利要求20所述的方法，其中所述选择是通过基于PCR的方法，通过表型特征或通过形态特征来进行的。
22.权利要求21所述的方法，其中所述表型特征为除草剂抗性或颜色标志物。
23.权利要求21所述的方法，其中所述表型特征为荧光标志物。
24.权利要求23所述的方法，其中所述荧光标志物是tdTomato或mNeonGreen。
25.一种通过微弹轰击来对甜菜植物基因组遗传修饰的微粒，其用至少以下包被
(i)基因组工程化组分，和
(ii)第二化合物，其包含
(ii.1)曲古抑菌素，或
(ii.2)植物激素，其选自2,4-二氯苯氧基乙酸、6苄基氨基嘌呤或玉米素，或
(ii.3)引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒，
其中所述引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质包含选自以下之一的氨基酸序列：
a)如SEQ ID NO：1、3、5、13、15、29或31中任何一个所示的序列，或
b)由如SEQ ID NO：2、4、6、14、16、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
26.一种通过微弹轰击来对甜菜植物基因组遗传修饰的试剂盒，其包含
(I)具有基因组工程化组分和包含以下的第二化合物的一个或多个微粒
(1)曲古抑菌素，或
(2)植物激素，其选自2,4-二氯苯氧基乙酸、6苄基氨基嘌呤、玉米素，
或
(3)引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒，
其中所述引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质包含选自以下之一的氨基酸序列：
a)如SEQ ID NO：1、3、5、13、15、29或31中任何一个所示的序列，或
b)由如SEQ ID NO：2、4、6、14、16、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列；和
(II)包被所述微粒的工具。
27.一种产生经遗传修饰的甜菜植物的方法，其包含以下步骤：
1).根据权利要求1-24中任一项的方法遗传修饰甜菜植物细胞，和
2).从步骤1)的修饰的甜菜植物细胞再生甜菜植物。
28.权利要求27所述的方法，其中所产生的甜菜植物不含有在步骤(a)中共同导入的所述基因组工程化组分和所述第二化合物中的任一项。
29.曲古抑菌素，或植物激素，或引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质或包含编码所述蛋白质的核酸的表达盒在权利要求1-24、27或28中任一项的方法中的用途，所述植物激素选自2,4-二氯苯氧基乙酸、6苄基氨基嘌呤、或玉米素，
其中所述引起甜菜植物再生得以改善的蛋白质包含选自以下之一的氨基酸序列：
a)如SEQ ID NO：1、3、5、13、15、29或31中任何一个所示的序列，或
b)由如SEQ ID NO：2、4、6、14、16、30或32中任何一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
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