CN119264242A - 一种重组xvii型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供一种重组XVII型胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明以人源XVII型胶原蛋白序列为基础，通过生物信息学预测分析和整合设计而获得目的基因序列，并进行了密码子优化，还对质粒载体中的T7启动子进行优化，制备获得高疏水性人源化XVII型胶原蛋白的工程菌株，该菌株经培养和诱导表达能够获得高产量的重组ⅩⅦ型胶原蛋白。本发明的重组ⅩⅦ型胶原蛋白，其序列设计合理、表达量大、制备方法简单、遗传稳定，还能够利用高疏水性在生产制备过程中实现胶原蛋白的快速分离。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源化ⅩⅦ型胶原蛋白，还包括其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是人体中含量最丰富的结构和功能蛋白，约占人体蛋白质总量的三分之一，具有特征性的(Gly-Xaa-Yaa)n重复序列和独特的三螺旋结构。同时胶原蛋白也是包含29种亚型的蛋白质超家族，不同亚型的胶原蛋白分布于不同的结缔组织中，发挥不同的生物功能，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。所有类型的胶原蛋白都具有共同的三螺旋结构特征，并通过多级自组装形成复杂的高级结构。胶原蛋白具有良好的生物活性，可以调控细胞的粘附、增殖和分化等细胞行为。胶原蛋白因其低免疫原性、高生物相容性和生物降解性等优良性质，在生物医学和组织工程等领域广泛应用。
人XVII型胶原蛋白在人体中含量较少，且XVII型胶原蛋白在动物体内含量同样极为稀少，提取难度也非常大，无法量产，同时动物源性胶原蛋白产品不可避免的有免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患，没有大量应用。这些也就导致现在市场上没有人或其它动物来源的商品化XVII型胶原蛋白产品，这也进一步限制了人XVII型胶原蛋白的研究和应用。现在解决此类问题的主要方式则是通过基因工程等生物技术来完成胶原蛋白。
生物工程技术通常在分子水平将目的基因导入宿主细胞中，利用宿主细胞的转录翻译系统生产重组目标蛋白。相较于组织提取的胶原蛋白，重组胶原蛋白具有如下优势，1)无病毒隐患；2)低免疫原性；3)良好的水溶性；4)可加工性；5)质量稳定；6)可大规模制备。而现有技术缺乏可高效生产制备重组ⅩⅦ型胶原蛋白的方案。
发明内容
本发明提供一种重组人源化ⅩⅦ型胶原蛋白，以解决现有技术中，人XVII型胶原蛋白难以生产和批量获得的问题。
本发明的第一方面，提供一种重组XVII型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二方面，提供编码上述的重组XVII型胶原蛋白的核酸分子。
可选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第三方面，提供包含上述的核酸分子的表达载体。
可选地，所述表达载体为质粒载体，所述质粒载体含有T7启动子，所述T7启动子的序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
可选地，所述质粒为pBBR或pUC。
本发明的第四方面，提供一种重组表达菌株，所述重组表达菌株含有上述的核酸分子或上述的表达载体。
可选地，所述重组表达菌株的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五方面，提供一种重组XVII型胶原蛋白的制备方法，包括培养上述的重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株目的基因的表达，以获得重组XVII型胶原蛋白；对获得的重组XVII型胶原蛋白进行分离、纯化。
本发明的第六方面，提供如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列在制备重组XVII型胶原蛋白中的应用。
本发明的第七方面，提供上述的重组XVII型胶原蛋白、上述的核酸分子、上述的表达载体、上述的重组表达菌株在制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、器械产品中的应用。
有益效果：
本发明的重组ⅩⅦ型胶原蛋白是一种高疏水性人源ⅩⅦ型胶原蛋白。本发明的ⅩⅦ型胶原蛋白，通过生物信息学预测分析和整合设计而获得目的基因序列，并进行了密码子优化，还对质粒载体中的T7启动子进行优化，获得工程菌株；该工程菌株能够成功表达高疏水性人源化XVII型胶原蛋白，一些实施例中其蛋白产量可达5g/L。本发明的重组ⅩⅦ型胶原蛋白，其序列设计合理、表达量大、制备方法简单、遗传稳定，还能够利用高疏水性在生产制备过程中实现胶原蛋白的快速分离。本发明的人源化XVII型胶原蛋白，细胞活性高，并且可工业化生产，在护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、医疗器械等领域中具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例的10kDa胶原蛋白疏水性分析曲线图。其中，曲线值MIN:-1.633,MAX:1.133；横坐标：每个氨基酸位置，纵坐标：亲疏水性强弱，以0为分界线，＞0表示疏水性，＜0为亲水性。分析软件：Expasy-ProtScale。
图2为构建工程质粒pET-28a-LuxI-LuxR-PLux-COL17A 10(3)流程图。
图3为构建T7启动子的基因突变文库。图中，(A)部分突变菌株和WT菌株的荧光柱状图；(B)T7启动子基因突变序列的WebLogo；(C)基于荧光热图的表达水平的划分。
图4为诱导剂对表达10kDa(3)胶原蛋白的影响结果。
图5为本发明实施例的10kDa(3)工程菌株表达胶原蛋白的SDS-PAGE图。
图6为本发明的重组菌株5L发酵罐高密度表达重组胶原蛋白的SDS-PAGE图。
具体实施方式
本发明实施例提供一种高效生产重组高疏水性人源化XVII型胶原蛋白的工程改造技术与制备方法，利用生物信息学手段，预测筛选出高疏水性XVII型胶原蛋白α1链片段氨基酸序列，优选10kDa(SEQ ID NO.1)蛋白序列，相对应的序列(SEQ ID NO.2)，并对其编码的密码子按底盘菌株BL21(DE3)进行优化，获得相应序列(SEQ ID NO.3)；由此，本发明也提供了如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列在制备重组XVII型胶原蛋白中的应用，即将其作为重组胶原蛋白的基础目的基因片段，进行重组XVII型胶原蛋白的生产制备。
进一步地，为了使重组类胶原蛋白发挥更好的活性，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为重复单元首尾相接进行3次重复，得到重组类胶原蛋白序列(SEQ ID NO.4)，相应的基因序列为(SEQ ID NO.5)；紧接着又通过在SEQ ID NO.1氨基酸序列C端借助GS linker融合绿色荧光蛋白，通过PCR和Gibson组装技术将上述序列插入质粒pBBR或pUC的T7启动子后，获得工程质粒，并经过化学转染或电转化法，转染进大肠杆菌BL21中，获得高效表达高疏水性人源化XVII型胶原蛋白的工程菌株。对该工程菌株进行培养，包括高密度培养和发酵等，能够获得重组XVII型胶原蛋白
其中，对于所述生物信息学手段，可利用的工具或数据库包括alphfold、swissmodle、PDB或NCBI等。对于工程质粒，包含羧基端融合荧光蛋白，更具体地，除了绿色荧光蛋白外，还可以为红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等。本发明实施例中，工程质粒的启动子为噬菌体的T7启动子，本发明一方案中对其进行了优化研究，将其随机突变，获得不同表达强度的T7启动子，最后优选出两种表达强度较好的T7启动子(序列SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7)。
实施例1基因设计
本发明以NCBI数据库公布的人ⅩⅦ型胶原蛋白a1链的核酸序列(NM_000494.4)为模板，对该序列进行生物信息学分析、预测和筛选，最后选取了核心编码分子量为10kDa功能氨基酸的核酸序列(SEQ ID NO.2)。疏水性分析结果(图1)表明，10kDa胶原蛋白是疏水性蛋白。在此基础上，针对底盘菌株大肠杆菌的密码子偏好性，对核苷酸序列进行了优化设计(SEQ ID NO.3)。为了使重组类胶原蛋白发挥更好的活性，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为重复单元首尾相接进行3次重复，得到重组类胶原蛋白序列(SEQ ID NO.4)，相应的基因序列为(SEQ ID NO.5)，该基因序列亦是经过密码子优化后的序列。之后委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行了基因合成。
实施例2分子生物学实验
1)DNA片段扩增：使用Phanta聚合酶进行DNA片段的高保真PCR扩增，随后进行凝胶电泳分离，获得目的条带；使用E.Z.N.A.胶回收试剂盒，对目的条带进行回收纯化。
2)DNA组装：质粒采用Gibson assembly的方法完成DNA的组装。将上述回收的目标DNA溶液按骨架DNA片段100ng，其余DNA连接片段等摩尔混合，加灭菌双蒸水补至5μL，然后与Gibson Mixture混合，于50℃保温反应1h，获得目标产物。
3)质粒扩增：DNA组装产物通过化学转化的方法转入E.coli(BL21)化转感受态中，然后进行培养实现质粒的扩增。化学转化方法详述如下：
①取50ul冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟；
②42℃水浴热激45秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟；
③向每个离心管中加入500ul无菌的2×YT培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,200rpm培养1小时，使细菌复苏；
④吸取500ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的2×YT琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
实施例3构建工程菌株
以pET-PLux-LuxI-LuxR质粒为模板设计引物：
F.DHDK acgcgtgctagaggcatcaa
R.DHDK ggtacctttctcctctttaatgaattc
扩增骨架并胶回收，并将优化后的10kDa(3)基因片段通过同源重组的方法构建pET-28a-LuxI-LuxR-PLux-COL17A 10(3)工程质粒并将其化学转化至底盘大肠杆菌中(图2)。构建出的工程菌株为重组大肠杆菌E.coli BL21/pET-28a-Col17。
其中，上述工程质粒中的T7启动子为优化后的启动子T7H6(SEQ ID NO.7)。
对于T7启动子的优化：
随机突变了T7启动子的前五个碱基，并以gfp为报告基因构建了一个PT7的突变文库。如图3所示，随机挑选的372个克隆的突变株都可以表达GFP，从中获得覆盖原始T7启动子0.5～600％输出强度的突变体；然后对突变体PT7启动子的基因序列进行测序分析，以获得突变体文库并生成WebLogo(图3中的B)，来揭示突变位点上的碱基偏好性；之后，从突变体文库中选择了一些启动子序列，以测试在不同IPTG浓度下的gfp表达；结果进一步获得在相同浓度诱导剂下，呈现不同表达水平的PT7启动子库(图3中的C)。其优选两种T7启动子序列，T7L4和T7H6，其序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
实施例4质粒的测序与酶切验证
设计验证引物对上述pET-28a-LuxI-LuxR-PLux-COL17A 10(3)质粒进行PCR验证与Sanger测序。将测序结果正确的质粒使用限制性内切酶进行酶切验证，通过验证产物片段大小，以排除DNA片段重复连接或错误连接等带来的假阳性质粒。
实施例5工程菌株的表征
设计引物在ⅩⅦ型胶原蛋白基因尾部加入荧光蛋白基因eGFP，通过流式细胞术检测工程菌株表达情况。具体实施步骤为：向2×YT培养基中接入工程菌株，对照组为诱导发酵48h、实验组为诱导发酵24h随后加入诱导剂IPTG。
如图4所示，实验结果为通过加入诱导剂IPTG能使工程菌株表达能力增强。
实施例6工程菌株诱导发酵
实验室条件下，将工程菌株接种至500mL 2×YT培养基中发酵24h，随后向培养基中加入诱导剂IPTG诱导自诱导物及其受体蛋白的表达24h。取发酵液离心并超声破碎，离心后取上清和菌泥进行SDS-PAGE。如图5所示，本发明的重组ⅩⅦ型胶原蛋白(即10kDa(3)胶原蛋白)SDS-PAGE结果显示其分子量在35kDa，呈现出表观分子量比预计分子量偏大的结果，初步分析推测，该胶原蛋白存在糖基化修饰，这也与生物信息学预测的具有糖基化位点相符。
实施例7重组菌E.coli BL21/pET-28a-Col17 5L罐高密度培养
将重组菌E.coliBL21/pET-28a-Col17进行5L罐高密度培养。以1‰接种量将甘油管中的菌液接种至含有50μg/mL卡那霉素的100mL种子LB培养基中，37℃、180rpm培养约18h。将培养后的种子液全部转入到含有3L发酵培养基的5L发酵罐中。初始发酵参数设置为：搅拌转速150rpm，发酵温度37℃，通气量4L/min，溶氧关联搅拌进行调节，控制在20％，发酵过程中通过自动添加氨水将pH控制在7.0。待溶氧回升至35％后开始补料，初始补料速度1.0mL/min，通过提高通气量来调节溶氧维持在20％，加入0.5mM IPTG，控制溶氧在30％左右，诱导18h，发酵液进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测结果如图6所示，经imageJ软件分析，判定标准蛋白及重组人源化胶原蛋白的灰度值，计算得重组菌E.coliBL21/pET-28a-Col17进行5L罐高密度发酵诱导18h时，T7H6启动子调控的工程菌株，重组人源化胶原蛋白产量最高为5.3g/L，实现了重组人源化胶原蛋白的高表达效率。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明权利要求所主张的保护范围内。
Claims (10)
1.一种重组XVII型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2或3所述的核酸分子的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体，所述质粒载体含有T7启动子，所述T7启动子的序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
6.重组表达菌株，其特征在于，含有权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养权利要求6或7所述的重组表达菌株，诱导所述重组表达菌株目的基因的表达，以获得重组XVII型胶原蛋白；对获得的重组XVII型胶原蛋白进行分离、纯化。
9.如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列在制备重组XVII型胶原蛋白中的应用。
10.权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的表达载体、权利要求6或7所述的重组表达菌株在制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、器械产品中的应用。
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