CN119264202B

CN119264202B - 桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子及其制备方法

Info

Publication number: CN119264202B
Application number: CN202411783551.XA
Authority: CN
Inventors: 年寅; 许刚; 解勇; 贺锐; 董泽军; 恭烨; 白雪; 田山黎; 阎慧
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Beijing Dr Plant Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Beijing Dr Plant Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2024-12-06
Filing date: 2024-12-06
Publication date: 2025-02-28
Anticipated expiration: 2044-12-06
Also published as: CN119264202A

Abstract

桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子及其制备方法，该天然分子具体为秦皮乙素‑7‑O‑樱草糖苷。本发明的天然分子，以桑白皮为原料，乙醇提取，利用乙醇‑水体系对所述桑白皮提取物进行第一分离，利用甲醇‑水体系进行第二分离，利用甲醇‑水体系进行第三分离后获得。本发明秦皮乙素‑7‑O‑樱草糖苷在开发美白、抗光损伤或双重功效化妆品中具有较好的应用前景。

Description

桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品应用开发领域，具体涉及桑白皮中一种天然分子秦皮乙素-7-O-樱草糖苷及其制备方法，以及其或其为活性成分的组合在制备美白和抗光损伤化妆品中的应用。

背景技术

酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，是人体内合成黑色素的关键酶。人类的皮肤颜色取决于体内的黑色素含量及分布范围，当黑色素水平发生异常时，常伴有黄褐斑，雀斑甚至色素瘤等病变产生。国内外学者通过采用有效的酪氨酸酶抑制剂，控制酪氨酸酶的活性水平，从而影响黑色素的生成，导致合成量减少，达到美白效果。

目前酪氨酸酶抑制剂来源于发酵，人工合成，天然植物等，广泛应用于宣称美白功效的化妆品产品，常用抑制剂包括曲酸，熊果苷，维生素C、间苯二酚及其衍生物，氢醌等，但以上抑制剂多存在一定的副作用或稳定性问题，在产品应用中不尽人意。如曲酸稳定低，且长期使用有致癌风险，而氢醌已被多国列为禁用添加剂。因此，寻找安全、有效的酪氨酸酶抑制剂是化妆品应用领域的热门研究课题，也是市场的迫切需求。

皮肤光损伤（Photodamage）是指皮肤由于暴露在紫外线（UV）和可见光下而受到的长期损伤。这种损伤可以导致皮肤老化、色素沉着、皱纹和皮肤癌等病变。值得指出的是，太阳照射到地球表面的紫外线主要是由UVA和UVB组成的，UVA是形成我们接受到的95%的紫外射线，比UVB更加危险，因为与UVB引起的晒伤不同，身体没有天然的警告系统，UVA所引起的损害往往难以发现，因此，防范UVA损伤尤其重要。

目前，抗光损伤化妆品主要包括基于物理隔绝的防晒霜、防晒喷雾、防晒乳液和凝胶等。然而，这些产品会引起一些问题，如对香料或防腐剂成分敏感，皮肤就会被刺激或产生过敏反应；或产生光敏反应，某些防晒成分可能会增加皮肤对阳光的敏感性，导致晒伤或红斑，又或导致皮肤干燥或油腻，因为某些产品可能会导致皮肤干燥或油腻。

因此，现有的产品不能起到很好的抗紫外损伤的作用，没同时具有酪氨酸酶抑制和抗UVA损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时具有酪氨酸酶抑制和抗UVA损伤的新天然分子实体及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

桑白皮中一种具有美白和抗光损伤的天然分子，为香豆素类分子，命名为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷，化学结构式如下：

。

桑白皮中一种具有美白和抗光损伤的天然分子的制备方法，具体步骤如下：

S1，桑白皮提取：采用乙醇对桑白皮浸泡提取，获得提取物；

S2，第一分离：将步骤S1获得的提取物用大孔吸附树脂柱，采用乙醇-水体系洗脱分离纯化获得第一分离部分；

S3，第二分离：将步骤S2获得的第一分离部分用葡聚糖凝胶柱，采用甲醇-水体系洗脱分离纯化获得第二分离部分；

S4，第三分离：将步骤S3获得的第二分离部分用半制备液相色谱仪，采用甲醇-水体系洗脱分离纯化获得化合物秦皮乙素-7-O-樱草糖苷。

所述步骤S1中，乙醇浓度为50-100%，乙醇和桑白皮的质量比为3-5:1，提取处理温度为20-60℃。

所述步骤S2中，乙醇浓度为25%。

所述步骤S3中，甲醇浓度为20%，洗脱流速为1-10BV/h。

所述步骤S4中，甲醇浓度为74%，流速为6-15ml/min。

本发明秦皮乙素-7-O-樱草糖苷用于抑制酪氨酸激酶活性，抑制率为40-80%，对酪氨酸酶的抑制率与浓度呈量效关系，浓度越高，对酪氨酸酶的抑制率越高。该分子对UVA损伤皮肤细胞具有保护作用，可用于抗UVA损伤。辐照剂量为 10J/cm²（1375-1400UW）情况下，该分子作用于紫外照射后的细胞后，其细胞活力与UVA损伤模型组相比提升了80-100%。

本发明秦皮乙素-7-O-樱草糖苷用于制备含有该物质的产品，或含有该物质的桑白皮提取物组分的产品。优选产品为日化品，所述日化品还含有额外的可用于日化品的成分。进一步的，所述日化品剂型包括但不限于乳液剂、喷雾剂、气雾剂、膏霜剂、水剂、凝胶剂、油剂、贴剂、膜剂或泥类剂。

优选的，所述产品具有美白和抗光老化，以及抑制酪氨酸酶活性的功效。进一步的，所述产品具有抗UVA损伤的功效。

本发明提供了一种新天然分子，为一种香豆素类分子，不仅对酪氨酸酶的抑制活性显著，其活性接近阳性对照苯乙基间苯二酚，而且对UVA损伤皮肤细胞显示出优越的保护作用，其活性优于阳性对照维生素C。该分子在开发美白、抗光损伤或双重功效化妆品具有较好的应用前景。

附图说明

图1为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的结构式及碳原子编号图。

图2为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的氢谱（500MHz,CDCl3）图。

图3为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的碳谱（150MHz, CDCl3）图。

图4为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的高分辨质谱图。

图5为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷（10、25、50 μM）对UVA损伤的人真皮成纤维细胞（HDF-α）的保护作用图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：天然分子秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的制备方法，包括以下步骤：

S1，桑白皮提取：采用75%乙醇对10kg干燥桑白皮在25℃下浸泡提取3次，第一次浸泡48h，第二和第三次浸泡各12h，合并三次提取液，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏；

所述乙醇和桑白皮质量比为4:1。

S2，第一分离：将步骤S1获得的浸膏用D101大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次采用纯水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、无水乙醇进行梯度洗脱，依次收集得到5个组分A-E；

其中，25％乙醇洗脱液洗脱出的B组分经浓缩、冷冻干燥处理，获得第一分离部分。

S3，第二分离：将25%乙醇洗脱出的B组分20.4g用LH-20葡聚糖凝胶柱进行层析纯化分离，依次采用纯水、20％甲醇、50％甲醇和100％甲醇行梯度洗脱，依次收集得到5个组分B1-B5；20％甲醇洗脱出B2组分的体积为3-10BV，将该部分的4.7-8.6BV进行浓缩和冷冻干燥处理获得第二分离部分；

其中，洗脱流速为5BV/h。

S4，第三分离：将浓缩和冷冻干燥处理获得第二分离部分2.7g用Waters 2535型半制备液相色谱仪，用74％甲醇，以10ml/min流速进行洗脱，分离纯化得到化合物秦皮乙素-7-O-樱草糖苷。

化合物秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的结构式及碳原子编号如图1所示。

化合物秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的表征图如图2-5所示。

本发明秦皮乙素-7-O-樱草糖苷（以下简称“Ehr824”），白色粉末。高分辨质谱（HRESIMS）表明其分子式为C₂₀H₂₄O₁₃ （[M + Na]⁺ m/z495.1108, calcd: 495.1109)。氢谱（¹HNMR ）如表1显示一组香豆素3，4位特征信号[δ _H6.27 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-3), 7.90(1H, d,J= 9.5, Hz, H-4)]，两个芳香氢质子信号[δ _H7.06 (1H, s, H-5), 7.14 (1H, s,H-8)]，以及两个端基氢质子信号[δ _H4.92 (1H, d,J= 7.4 Hz, H-1ˈ), 4.14 (1H, d,J=7.6, Hz, H-1ˈˈ)]。上述信号提示该化合物为香豆素糖苷类化合物。其碳谱（¹³C NMR）和DEPT（无畸变极化转移技术）数据显示该化合物有2个亚甲基、13个次甲基以及5个季碳。进一步对比发现Ehr824的上述数据与Scopoletin7-O-β-D-Xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside非常相似（Chem. Pharm. Bull.2003, 51,1106-1108），区别仅仅是Ehr824中少了一个6位甲氧基信号，结合质谱数据和¹³C NMR化学位移的变化推测Ehr824的6位由羟基替代了Scopoletin 7-O-β-D-Xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside的甲氧基。在HMBC（¹H的异核多碳相关谱）谱中，H-1ˈ与C-7的相关表明葡萄糖基位于香豆素苷元的C-7位；H-1ˈˈ与C-6ˈ的HMBC相关证实葡萄糖6位与木糖1位相连。在ROSEY（旋转坐标系的欧沃豪斯增强谱）谱中，H-1ˈ与H-8的ROSEY相关，再次验证葡萄糖基位于C-7位。通过上述解析最终确定Ehr824（6,7-二羟基香豆素-7-O-β-D-木糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）化学结构如图1所示。

表1 秦皮乙素-7-O-樱草糖苷的¹H-NMR和¹³C-NMR数据（DMSO-d ₆）

本发明秦皮乙素-7-O-樱草糖苷对酪氨酸酶抑制活性进行测试，测试方法如下：

将待测新天然分子与L-Dopa混合，加入酪氨酸酶（终浓度25 U/mL）开始反应，设定3个重复孔，同时设置不含待测新天然分子的空白对照和苯乙基间苯二酚阳性对照，室温下反应25 min，酶标仪测定OD值，检测波长为490 nm，并用以下公式计算酶活性抑制率：

酪氨酸酶活性抑制率（%）= （1–样品孔OD490 nm / 实验对照孔OD490 nm）×100%。

IC₅₀（50% inhibitory concentration）按Reed＆Muench法计算。

经测试，秦皮乙素-7-O-樱草糖苷在测试浓度范围内对酪氨酸酶表现出了浓度依赖性的抑制作用，活性突出，半数抑制浓度IC₅₀为0.51±0.01 μM，接近阳性对照苯乙基间苯二酚（IC₅₀：0.16±0.01 μM），如表2所示。

表2 样品对酪氨酸酶的抑制作用

表2数据每组设置三个平行实验，n=3，数据用Mean ± S.E.M.表示。

本发明秦皮乙素-7-O-樱草糖苷对UVA损伤的人真皮成纤维细胞（HDF-α）保护作用进行测试，测试方法如下：

步骤1，将HDF-α细胞以 1×10⁵/mL 密度传入 96 孔板中，过夜培养。

步骤2，将96孔板中细胞贴壁后吸出培养基，每孔加入100μL PBS 洗 2 次，随后每孔加入 100μL D-Hanks。

步骤3，设置UVA 损伤组（模型组）、UVA 损伤后加药组和普通对照组（NC 组），每组设置五个平行；其中：

普通对照组（NC）：锡纸避光，室内环境放置 2 小时后吸出 D-Hanks，每孔加入100μL DMEM 培养基，继续孵育 24h；

UVA 损伤组（模型组）：调节紫外灯辐照剂量为10J/cm²（1375-1400UW），辐照时间为2h，进行紫外照射；紫外照射后吸出 D-Hanks，每孔加入 100μL DMEM 培养基，继续孵育24h；

UVA 损伤后加药组: 调节紫外灯辐照剂量为 10J/cm²（1375-1400UW），辐照时间为2h，进行紫外照射；紫外照射后吸出 D-Hanks，每孔加入 100μL 秦皮乙素-7-O-樱草糖苷溶液，浓度分别为 20μM、50μM、100μM，实验终浓度分别为10μM、25μM、50μM，继续孵育 24h；

阳性药对照实验组：调节紫外灯辐照剂量为 10J/cm²，辐照时间为2h，进行紫外照射；紫外照射后吸出 D-Hanks，每孔加入 100μL 阳性药溶液，浓度为 200μM，实验终浓度为100μM，继续孵育 24h；

步骤4，吸出上清液，PBS 洗 2 次，使用 MTS 试剂盒进行细胞活力检测；

MTS提前解冻，MTS:培养基=1:4，避光关灯操作，给15ml离心管包上锡纸避光处理，加入100vl试剂培养箱孵育2-4h，培养完成后锡纸包裹去测数据。

步骤5，使用酶标仪进行 OD 490nm 检测，用下述公式计算细胞活力（Survivalrate）；

。

测试结果如图5所示，秦皮乙素-7-O-樱草糖苷在10 μM、25 μM及50 μM浓度时对UVA损伤的人真皮成纤维细胞（HDF-α）均有显著的保护作用。秦皮乙素-7-O-樱草糖苷在10μM浓度时其保护作用已达到饱和，在10 μM浓度时对UVA损伤的人真皮成纤维细胞（HDF-α）的保护作用已经显著优于阳性对照维生素C（100 μM）。

图5 中，NC为空白对照组；UVA为UVA损伤模型组；VC为阳性对照维生素C组。每组设置五个平行实验，n = 5，数据用Mean ± S.E.M.表示。采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验评价统计学显著性。

****P<0.05 (vs. VC组)；****P<0.0001(vs. UVA组)。

Claims

1.桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子，为香豆素类分子，命名为秦皮乙素-7-O-樱草糖苷，化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子的制备方法，其特征在于该方法具体步骤如下：

S4，第三分离：将步骤S3获得的第二分离部分用半制备液相色谱仪，采用甲醇-水体系洗脱分离纯化获得化合物秦皮乙素-7-O-樱草糖苷；

所述步骤S1中，乙醇浓度为50-100%，乙醇和桑白皮的质量比为3-5:1，提取处理温度为20-60℃；

所述步骤S2中，乙醇浓度为25%；

所述步骤S3中，甲醇浓度为20%，洗脱流速为1-10BV/h；

所述步骤S4中，甲醇浓度为74%，流速为6-15ml/min。

3.如权利要求2所述的桑白皮中一种美白和抗光损伤的天然分子的制备方法，其特征在于所述步骤S1中，乙醇浓度为75%，乙醇和桑白皮的质量比为4:1，提取处理温度为25℃。

4.如权利要求1所述的秦皮乙素-7-O-樱草糖苷应用于制备酪氨酸酶抑制剂、基于酪氨酸酶抑制的美白化妆品、抗UVA损伤制剂、抗UVA光损伤化妆品或美白和抗光损伤双重功效化妆品。