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CN119258210A - 新型疫苗递送体系 - Google Patents

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CN119258210A
CN119258210A CN202410888145.3A CN202410888145A CN119258210A CN 119258210 A CN119258210 A CN 119258210A CN 202410888145 A CN202410888145 A CN 202410888145A CN 119258210 A CN119258210 A CN 119258210A
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protein
peptide
antigen
tumor
complex
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CN202410888145.3A
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葛胜祥
潘海峰
李廷栋
于思远
庄昊昀
杨晗
蒋金露
杨海辉
张军
夏宁邵
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Xiang'an Innovation Laboratory
Xiamen University
Original Assignee
Xiang'an Innovation Laboratory
Xiamen University
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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种新型疫苗递送体系。本发明的疫苗递送体系能够实现抗原及佐剂的淋巴结共递送，有效增强佐剂的促免疫效应，显著提升抗原特异性免疫应答，且优于临床常用的油式复合佐剂系统。特别地，本发明的疫苗递送体系在肿瘤预防及治疗中展现出显著的抗肿瘤作用，为新型疫苗体系的开发及应用提供了新的思路。

Description

新型疫苗递送体系
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种新型疫苗递送体系。
背景技术
抗肿瘤治疗中，肿瘤疫苗作为肿瘤免疫疗法的三驾马车之一，在过去的50年里被广泛研究。肿瘤疫苗通过加强现有的、或引起新的T淋巴细胞介导的肿瘤抗原特异性反应发挥作用[1,2]。由于目标抗原主要与肿瘤细胞有关，所以肿瘤疫苗可以避免脱靶效应，安全性高[3]；且肿瘤疫苗产生的是主动免疫效应，可通过免疫系统的激活，诱导全身性的抗肿瘤作用及记忆保护效应[3]，已成为肿瘤学领域中一类很有前途的疗法，特别是生物相容性较好的多肽类肿瘤疫苗[4]。但目前肿瘤疫苗的临床效益有限[5,6]，肿瘤特异性免疫应答激活不足是主要因素，而免疫激活水平受制于肿瘤抗原的交叉递呈[7]。在肿瘤疫苗体系中，佐剂效率、递送方式是影响交叉递呈的关键因素[8,9]。
首先佐剂对于疫苗的效能起到重要作用，决定了疫苗所引起的免疫应答类型及强度。其中，CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)作为一种高效的TLR9激动剂被广泛关注和使用，其不仅可以增强体液免疫应答，而且可以大大增强细胞免疫应答，后者是铝佐剂所达不到的。CpG的作用受体位于胞内的内吞小体膜上，所以CpG佐剂需要进入抗原递呈细胞内才能发挥作用，如何将其高效递送入胞是此类佐剂在疫苗应用中的关键问题。
肿瘤疫苗递送方式可以改变疫苗成分的分布及药代动力学从而影响交叉递呈。在以CpG为佐剂的肿瘤疫苗方案中，良好的疫苗载体除了递送CpG入胞外，对于抗原的递送同样重要。首先，外源性抗原在抗原递呈细胞中的胞质递送是交叉递呈的重要前提[10]，其次，通过疫苗载体实现抗原和CpG佐剂共递送是促进交叉递呈的另一重要方式。目前有众多方法可以用来促进疫苗的递送，其中研究较多的纳米载体虽然可有效包裹抗原及佐剂实现共递送，且能够不同程度地增强交叉递呈，但是大部分的纳米颗粒入胞后会被溶酶体降解[11]，导致抗原胞质递送效率低，且纳米颗粒的生产成本、安全性及生物相容性等同样是待解决的问题[12,13]。
发明内容
目前已报道细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)在跨膜递送中具有较高的效率及生物相容性，是一种有潜力的疫苗递送载体，其中应用最为广泛的是来自于HIV病毒的阳离子肽TAT。然而，虽然TAT能够增强抗原交叉递呈[14]，但其内吞小泡逃逸效率同样不高，大部分递送的抗原无法有效释放到细胞质中[10,15,16]。需要进一步增强胞质递送效率来促进交叉递呈。并且基于穿膜肽实现抗原和佐剂共递送的可能性及具体效率还有待研究。
本研究团队在前期已开发了被称为eTAT的胞内递送系统，具有良好的胞质递送能力，eTAT详细描述于中国专利申请CN202011240557.4、国际专利申请WO2021135647A1，以及Yu,S.,Yang,H.,Li,T.et al.Nat Commun 12,5131(2021)。本申请的发明人出乎意料地发现，eTAT在促进抗原交叉递呈方面具有很大潜力并对其作为疫苗递送载体的免疫增效作用进行了研究。由此，本发明提供了一种新型疫苗递送体系，其可显著提升淋巴结共递送及交叉递呈，显示出显著的免疫增效作用，最终诱导强效的抗原特异性的免疫反应，具有显著的肿瘤预防及治疗作用。
复合物
在第一方面，本发明提供了一种复合物，其包含：
(i)蛋白组分，其包含载体肽(carrier peptide)和货物肽(cargo peptide)；其中，所述载体肽包含多聚化结构域序列、细胞穿膜肽、pH敏感融合肽以及蛋白酶识别序列；所述货物肽包含抗原肽；
(ii)核酸组分，其包含CpG佐剂。
I.连接方式
在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分通过静电作用缀合。
在某些实施方案中，所述蛋白组分从N端至C端包含载体肽和货物肽。在某些实施方案中，所述蛋白组分从N端至C端包含货物肽和载体肽。
在某些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与抗原肽可以通过融合或共价连接或非共价连接。
在一些实施方案中，所述载体肽与货物肽通过融合方式连接。
在某些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头融合至所述载体肽的N端或C端。在某些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头融合至所述载体肽的C端。在某些实施方案中，所述接头优选是肽接头，例如柔性肽接头，例如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头。
在另一些实施方案中，所述载体肽与货物肽通过共价方式连接。
在某些实施方案中，所述蛋白组分中的载体肽任选地通过接头连接至蛋白质-蛋白质结合对的第一成员以形成第一蛋白，所述货物肽任选地通过接头连接至所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员以形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由共价键结合。在本文中，“蛋白质-蛋白质结合对”具备本领域技术人员通常理解的含义，其包含两种蛋白质(例如第一成员(例如第一多肽)和第二同源成员(例如第二多肽))，其在实现或促进共价键(如异肽键)形成的条件下相互作用以形成共价键(如异肽键)，其中术语“同源”是指在一起起作用，即在一起反应以形成共价键(如异肽键)的组分。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的C端。在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的N端。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的N端。在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的C端。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的C端。在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的C端。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的N端。在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的N端。
在某些实施方案中，所述共价键为异肽键。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对选自：(i)SpyTag:SpyCatcher对，(ii)SpyTag:KTag对，(iii)Isopeptag:pilin-C对，(iv)SnoopTag或SnoopTagJr:SnoopCatcher对，(v)SpyTag002:SpyCatcher002对，(vi)RrgATag、RrgATag2或DogTag:RrgACatcher对，(vii)IsopepTag-N:Pilin-N对，(viii)PsCsTag:PsCsCatcher对。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对是SpyTag:SpyCatcher对。例如，所述SpyTag包含如SEQ ID NO:9所示的序列；例如，所述SpyCatcher包含如SEQ ID NO:10所示的序列。
在某些实施方案中，所述接头优选是肽接头，例如柔性肽接头，例如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头。
在某些实施方案中，所述蛋白组分由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：
所述第一蛋白包含所述载体肽以及SpyTag:SpyCatcher对的第一成员，所述第一成员任选地通过第一接头与所述载体肽连接(例如连接至所述载体肽的C端)；
所述第二蛋白包含所述货物肽以及SpyTag:SpyCatcher对的第二成员，所述第二成员任选地通过第二接头与所述货物肽连接(例如连接至所述货物肽的N端)。
在某些实施方案中，所述第一蛋白包含所述载体肽以及SpyCatcher，所述第二蛋白包含所述货物肽以及SpyTag。
在另一些实施方案中，所述载体肽与货物肽通过非共价方式连接。如本文使用的术语“非共价结合”是指特异性结合，诸如在抗体和其抗原之间、配体和其受体之间、或者酶和其底物之间的特异性结合，例如由链霉亲和素结合蛋白和链霉亲和素之间或抗体和其抗原之间的相互作用例示。
在某些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头连接至特异性结合对的第一成员以形成第一蛋白，所述载体肽任选地通过接头连接至所述特异性结合对的第二成员以形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员通过由特异性结合介导的非共价键结合。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的C端。在某些实施方案中，所述特异性结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的N端。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的N端。在某些实施方案中，所述特异性结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的C端。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的C端。在某些实施方案中，所述特异性结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的C端。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一成员任选地通过接头连接至载体肽的N端。在某些实施方案中，所述特异性结合对的第二成员任选地通过接头连接至货物肽的N端。
II.多聚化结构域
在本文中，术语“多聚化结构域”是指，能够使包含该多聚化结构域的融合多肽的若干拷贝多聚化(即形成生物分子复合物)的任何多肽或蛋白质。在某些实施方案中，所述多聚化结构域是同源多聚化结构域，其将相同的融合多肽聚集并形成多聚体。
在某些实施方案中，所述多聚化结构域可以是二聚化结构域、三聚化结构域、四聚化结构域，或基本上任何更高级别的多聚化结构域，只要该结构域能够促进至少两个结构域(和它们形成部分的多肽)之间的相互作用。
在某些实施方案中，所述多聚化结构域选自：亮氨酸拉链、NOE(SEQ ID NO:38)、GCN4-P1(SEQ ID NO:39)、Delta(SEQ ID NO:40)及其任何组合。
在某些实施方案中，所述多聚化结构域选自亮氨酸拉链。
在某些实施方案中，所述多聚化结构域序列包含SEQ ID NO:36或37所示的序列。在某些实施方案中，所述多聚化结构域序列包含SEQ ID NO:36所示的序列。
III.pH敏感肽
在本文中，术语“pH敏感融合肽(pH-sensitive fusogenic peptide)”与“pH敏感肽”可互换使用，其是指一类能够在酸性条件(例如，pH<6.5)下发生构象改变从而促进与内吞小泡囊膜融合的多肽。当pH敏感肽被细胞内吞后，内吞小泡在成熟酸化的过程中，一旦pH值下降到临界点，此类多肽发生构象改变并与小泡囊膜的脂双层结合从而剧烈扰动磷脂双层膜的完整性，在其上形成小孔或导致囊膜裂解，从而将被转运的生物大分子释放进入胞浆。这类多肽是本领域熟知的，并描述于例如，Varkouhi,Amir K.,et al.Journal ofControlled Release 151.3(2011):220-228；Erazo-Oliveras A,Muthukrishnan N,BakerR,et al.Pharmaceuticals,2012,5(11):1177-1209，其全部通过引用并入本文。
能够用于本发明的载体肽的pH敏感肽可以选自下列的蛋白或多肽，或者源自选自下列蛋白或多肽：
病毒蛋白来源：HA2(流感病毒)及其突变体KALA,GALA；五邻体蛋白(penton base)(腺病毒或鼻病毒)，gp41(HIV)，L2(乳头瘤病毒)，包膜蛋白(西尼罗河病毒(West Nilevirus))；
细菌蛋白来源：单增李斯特氏菌溶血素O(Listeriolysin O(LLO))，肺炎球菌溶血素(Pneumococcal pneumolysin(PLO))，链球菌溶血素O(Streptococcal streptolysin O(SLO))，白喉毒素(Diphtheria toxin)，铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosaexotoxin A)，志贺毒素(Shiga toxin)，霍乱毒素(Cholera toxin)；
植物蛋白来源：蓖麻毒素(Ricin)，皂草素(Saporin)，Gelonin毒素；
人类/动物蛋白来源：人降钙素，成纤维细胞生长因子受体，蜂毒素(Melittin)；
人工合成多肽：(R-Ahx-R)(4)AhxB，穿透素(Penetratin(pAntp))，EB1，牛朊蛋白(Bovine prion protein(bPrPp))，甜箭肽(Sweet Arrow Peptide(SAP)),聚L-组氨酸(Poly(L-histidine))，脯氨酸富含肽(Proline-rich)。
在某些实施方案中，所述pH敏感融合肽选自流感病毒HA2(SEQ ID NO:47)或其突变体、蜂毒素(Melittin)(SEQ ID NO:50)，及其任意组合。在某些实施方案中，所述流感病毒HA2的突变体选自INF7(SEQ ID NO:46)、KALA(SEQ ID NO:48)或GALA(SEQ ID NO:49)。
在某些实施方案中，所述pH敏感融合肽包含INF7。在某些实施方案中，所述pH敏感融合肽包含下述序列或由其组成：SEQ ID NO:46。
IV.细胞穿膜肽
在本文中，术语“细胞穿膜肽(cell penetrating peptide，CPP)”又称为“细胞穿透肽”、“蛋白质转导域(protein translocation domain，PTD)、“Trojan horse peptides”或“转导肽(transduction peptide)”等，其是指，能够促进各种分子(例如，各种大分子包括蛋白或核酸)的细胞摄取的多肽。这类多肽是本领域熟知的，并描述于例如，Stewart KM,et al.Org Biomol Chem.2008Jul 7；6(13):2242-55以及中国专利申请CN101490081A(其全部通过引用并入本文)；或者可以通过本领域已知的方法获得，例如详细描述于美国专利申请US2008/0234183中的方法，其全部通过引用并入本文。
能够用于本发明的融合蛋白的CPP包括但不限于：阳离子型:Penetratin、HIV-TAT-47-57、HIV-1Rev 34-50、FHV coat-35-49、低聚精氨酸(Oligoarginines)(R9-R12)、CCMV Gag-7-25、S413-PV、VP22、BP16、DPV3、DPV6、FAH外壳蛋白、鱼精蛋白1(Protamine 1)、人cJun、Engrailed-2、Islet-1、HoxA-13、TP10等；两亲性型：转运肽(transportan)、Transportan10、Pep-1、MPGα、MPGβ、CADY、Pepfect6、Pepfect14、Pepfect15、NickFect、Hel、sC18、pVEC、ARF(1-22)、YTA2、PAR1(Palmitoyl-SFLLRN)、F2Pal10(Palmitoyl-SFLLRN)、BPrPp(1-30)、hLF肽(19-40)、Buforin 2、Crotamine、Azurin p18、hCT肽(18-32)、S413-PVrev等；疏水型：Kaposi's肉瘤成纤维细胞生长因子、源自Caiiman crocodylus的Ig轻链的信号肽、整合素β3片段、Grb2-SH2结构域、HIV-1gp41(1-23)、HBV移位基序(translocation motif)、精卵融合蛋白(89-111)、人降钙素(9-32)、Pep-7、C105Y、K-FGF等。
此外，用作本发明的融合蛋白中的CPP还可以选自与如上所述的任何多肽序列具有大约60、70、80、90、95、99％或100％的序列同一性的多肽序列，只要该多肽序列仍然保留其生物学活性，即，促进分子的细胞摄取。
在某些实施方案中，所述细胞穿膜肽选自穿透素(Penetratin)(SEQ ID NO:51)、Tat衍生肽、Rev(34-50)(SEQ ID NO:53)、VP22(SEQ ID NO:54)、转运肽(transportan)(SEQID NO:55)、Pep-1(SEQ ID NO:56)、Pep-7(SEQ ID NO:57)，及其任意组合。在某些实施方案中，所述Tat衍生肽选自Tat(48-60)(SEQ ID NO:1)或Tat(47-57)(SEQ ID NO:52)。
在某些实施方案中，所述细胞穿膜肽包含Tat衍生肽，例如Tat(48-60)。在某些实施方案中，所述细胞穿膜肽包含下述序列或由其组成：SEQ ID NO:1。
V.蛋白酶识别序列
在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列包含弗林蛋白酶识别序列和/或组织蛋白酶L识别序列。
在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：R-X1-X2-R↓(SEQ ID NO:41)，其中，X1为任意氨基酸，X2为K或R，↓表示切割位点。
在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：R-R-X1-X2-R↓(SEQ ID NO:42)。
在某些实施方案中，X1选自丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)、天冬氨酸(N)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、辅氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。
在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：RRHKR↓(SEQ ID NO:43)。
在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶识别序列包含下述序列或由其组成：QSVASSRRHKR↓FAGV(SEQ ID NO:44)。
在某些实施方案中，所述组织蛋白酶L识别序列包含下述序列或由其组成：NNTHDLVGDVRLAGV(SEQ ID NO:45)。
在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列包含弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列。在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列是单链多肽，其从N端至C端包含弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列，或者其从N端至C端包含组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列。
在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列包含RRHKR(SEQ ID NO:43)和NNTHDLVGDVRLAGV(SEQ ID NO:45)。在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列包含SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45。
VI.连接顺序
在一些实施方案中，所述载体肽从N端至C端包含：所述细胞穿膜肽、pH敏感融合肽、蛋白酶识别序列，并且所述多聚化结构域序列位于所述载体肽的N端或C端，或者位于上述任何两个相邻结构域之间。例如，所述多聚化结构域序列位于所述载体肽的N端，或者位于所述载体肽的C端。
在另一些实施方案中，所述载体肽从N端至C端包含：所述pH敏感融合肽、细胞穿膜肽、蛋白酶识别序列，并且所述多聚化结构域序列位于所述载体肽的N端或C端，或者位于上述任何两个相邻结构域之间。例如，所述多聚化结构域序列位于所述载体肽的N端，或者位于所述载体肽的C端。
在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列。在某些实施方案中，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列。
在某些示例性实施方案中，所述载体肽从N端至C端包含：所述多聚化结构域序列、细胞穿膜肽、pH敏感融合肽、以及蛋白酶识别序列。
在某些示例性实施方案中，所述载体肽从N端至C端包含：所述多聚化结构域序列、pH敏感融合肽、细胞穿膜肽、以及蛋白酶识别序列。
在某些实施方案中，所述载体肽中所包含的任意相邻结构域之间任选地通过肽接头连接。在某些实施方案中，所述肽接头是(GmS)n，其中m选自1-4的整数(例如，1，2，3或4)，n选自1-3的整数(例如，1，2或3)。在某些实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:58。在某些实施方案中，任意相邻结构域之间的肽接头可以相同或不同。
在某些实例性实施方案中，所述载体肽包含SEQ ID NO:3所示的序列或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的变体，所述变体具备与SEQ ID NO:3基本相同的活性(例如胞质递送能力以及与CpG佐剂通过静电作用形成复合物的能力)。
在某些实例性实施方案中，本发明提供了由蛋白组分和核酸组分通过静电作用形成的复合物，其中：
(i)所述蛋白组分包含载体肽(carrier peptide)和货物肽(cargo peptide)；其中，所述载体肽包含SEQ ID NO:3所示的序列或与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的变体，所述变体具备与SEQ ID NO:3基本相同的活性(例如胞质递送能力以及与CpG佐剂通过静电作用形成复合物的能力)；所述货物肽包含抗原肽；
(ii)所述核酸组分包含CpG佐剂。
VII.抗原肽
在一些实施方案中，所述货物肽包含的抗原肽源自肿瘤抗原，或是肿瘤抗原蛋白或其表位肽。
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤新生抗原(neoantigen)。
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原为实体瘤抗原，例如黑色素瘤抗原、结直肠癌抗原、乳腺癌抗原、前列腺癌抗原、膀胱癌抗原、肺癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原为黑色素瘤抗原。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原为结直肠癌抗原。
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原为血液肿瘤抗原，例如淋巴瘤抗原、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性淋巴细胞白血病抗原、慢性骨髓性白血病抗原或急性骨髓性白血病抗原。
在某些实施方案中，所述肿瘤抗原选自RepS1(例如SEQ ID NO:26)、Adpgk(例如SEQ ID NO:27)、HER2、GP100、TRP1、TRP2、M27、M30、WT1、CEA、HVP16 E7、Kras、P53、LCMVgp33、LCMV NP369、InfluenzaNP、HIV gag、MuLV gp70、MCMV IE1、VSV NP、HSV-1gB、HBchelper peptide等。
在某些示例性实施方案中，所述肿瘤抗原选自GP33(例如SEQ ID NO:7)、E738～57(例如SEQ ID NO:18)、CEA567～584(例如SEQ ID NO:19)、Trp1(例如SEQ ID NO:23)、GP100(例如SEQ ID NO:24)、M27(例如SEQ ID NO:25)、RepS1(例如SEQ ID NO:26)、Adpgk(例如SEQID NO:27)。
在某些示例性实施方案中，所述肿瘤抗原选自黑色素瘤抗原，例如Trp1(SEQ IDNO:23)、GP100(SEQ ID NO:24)、M27(SEQ ID NO:25)。
在某些示例性实施方案中，所述肿瘤抗原选自结直肠癌抗原，例如RepS1(SEQ IDNO:26)、Adpgk(SEQ ID NO:27)。
在某些示例性实施方案中，所述肿瘤抗原选自人类肿瘤抗原，例如E738～57(SEQ IDNO:18)、CEA567～584(SEQ ID NO:19)。
在另一些实施方案中，所述货物肽包含的抗原肽源自病原体抗原，或是病原体抗原蛋白或其表位肽。
在某些实施方案中，所述病原体选自、细菌感染、真菌、病毒或寄生虫。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的货物肽任选地还包含与所述抗原肽连接的另外的功能肽。在某些实施方案中，所述另外的功能肽为促溶标签，例如蛋白磷酸酶1B(Ppm1b)。
VIII.多聚体
在某些实施方案中，所述蛋白组分为包含所述载体肽和货物肽的融合蛋白单体。
在某些实施方案中，所述蛋白组分为由包含所述载体肽和货物肽的融合蛋白单体形成的多聚体。
在某些实施方案中，所述多聚体是二聚体、三聚体或四聚体。在某些实施方案中，所述多聚体是二聚体。在某些实施方案中，所述多聚体是三聚体。
在某些实施方案中，所述多聚体是同源多聚体。在某些实施方案中，所述多聚体是同源二聚体。在某些实施方案中，所述多聚体是同源三聚体。
IX.核酸组分
本发明的复合物包含CpG佐剂。CpG佐剂具有本领域技术人员公知的含义，是指含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的DNA片段。它能激活B细胞、NK、DC树突状等细胞，诱导释放IFN-α等细胞因子，从而诱导强Th1型应答和细胞免疫。CpG佐剂是本领域技术人员熟知的，包括但不限于CpG 2395(SEQ ID NO:17)、CpG 1826(SEQ ID NO:22)、CpG 7909(SEQ ID NO:59)、CpG 1018(SEQ ID NO:60)、CpG 1585(SEQ ID NO:61)、CpG 1668(SEQ IDNO:62)、CpG 2007(SEQ ID NO:63)、CpG 2336(SEQ ID NO:64)、CpG 2088(SEQ ID NO:65)、CpG M362(SEQ ID NO:66)等。
在某些示例性实施方案中，所述CpG佐剂为B类或C类CpG。
在某些示例性实施方案中，所述CpG佐剂包含SEQ ID NO:17或22所示的序列。
在某些实施方案中，所述复合物中，以约1:1～10:1摩尔比(根据单体计算，不是多聚体)混合所述蛋白组分和核酸组分。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约1:1～8:1，例如约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约2:1～8:1，例如约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。
试剂盒
在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含在分开的容器中包含的第一方面所述的复合物中的蛋白组分以及核酸组分。
在一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以融合方式连接，也即所述蛋白组分为所述货物肽与载体肽形成的融合蛋白。在此类实施方案中，所述试剂盒包含：含有所述蛋白组分的第一容器以及含有所述核酸组分的第二容器。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以共价方式连接：所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头连接至蛋白质-蛋白质结合对的第一成员形成第一蛋白，所述载体肽任选地通过接头连接至所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由共价键结合。在此类实施方案中，所述试剂盒包含：含有所述蛋白组分中的第一蛋白的第一容器，含有所述蛋白组分中的第二蛋白的第二容器，以及含有所述核酸组分的第三容器。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以非共价方式连接：所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头连接至特异性结合对的第一成员形成第一蛋白，所述载体肽任选地通过接头连接至所述特异性结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由非共价键结合。在此类实施方案中，所述试剂盒包含：含有所述蛋白组分中的第一蛋白的第一容器，含有所述蛋白组分中的第二蛋白的第二容器，以及含有所述核酸组分的第三容器。
在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：
(i)核酸分子或载体，其包含编码第一方面所述的复合物中的蛋白组分的核苷酸序列；以及，
(ii)CpG佐剂。
在一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以融合方式连接，也即所述蛋白组分为所述货物肽与载体肽形成的融合蛋白。在此类实施方案中，(i)所述的核酸分子或载体包含编码所述蛋白组分的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含：含有(i)所述核酸分子或载体的第一容器，以及含有CpG佐剂的第二容器。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以共价方式连接：所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头连接至蛋白质-蛋白质结合对的第一成员形成第一蛋白，所述载体肽任选地通过接头连接至所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由共价键结合。在此类实施方案中，(i)所述的核酸分子或载体包含：编码所述载体肽以及与其连接的蛋白质-蛋白质结合对的第一成员的第一核苷酸序列，以及编码所述抗原肽以及与其连接的蛋白质-蛋白质结合对的第二成员的第二核苷酸序列。在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列存在于相同或不同的核酸分子或载体上。所述蛋白质-蛋白质结合对如第一方面中定义。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种载体(例如表达载体)，所述一种或多种载体包含所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列任选地包含与其可操作连接的调节元件(例如启动子)。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种载体(例如表达载体)，所述一种或多种载体包含所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列任选地包含与其可操作连接的调节元件(例如启动子)。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含：含有包含所述第一核苷酸序列的载体的第一容器，含有包含所述第二核苷酸序列的载体的第二容器，以及含有CpG佐剂的第三容器。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以非共价方式连接：所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头连接至特异性结合对的第一成员形成第一蛋白，所述载体肽任选地通过接头连接至所述特异性结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由非共价键结合。在此类实施方案中，(i)所述的核酸分子或载体包含：编码所述载体肽以及与其连接的特异性结合对的第一成员的第一核苷酸序列，以及编码所述抗原肽以及与其连接的特异性结合对的第二成员的第二核苷酸序列。在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列存在于相同或不同的核酸分子或载体上。所述特异性结合对如第一方面中定义。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种载体(例如表达载体)，所述一种或多种载体包含所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列任选地包含与其可操作连接的调节元件(例如启动子)。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含：含有包含所述第一核苷酸序列的载体的第一容器，含有包含所述第二核苷酸序列的载体的第二容器，以及含有CpG佐剂的第三容器。
复合物制备
第四方面，本发明提供了制备第一方面所述的复合物的方法，其包括：
(1)提供所述复合物中的蛋白组分和核酸组分；
(2)使所述蛋白组分与核酸组分混合并任选地培育以形成复合物。
在某些实施方案中，在混合之前，所述蛋白组分和/或核酸组分经过纯化。蛋白或核酸的纯化可通过本领域熟知的常规纯化程序进行，适当的方法及其使用的基质和缓冲液的选择是本领域熟知的，因此本文不再详细描述。
在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分以约1:1～10:1摩尔比(根据单体计算，不是多聚体)混合。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约1:1～8:1，例如约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约2:1～8:1，例如约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。
核酸组分
本发明的复合物中的核酸组分可以本领域已知的各种方法来制备，例如，通过基因工程方法产生，也可以通过化学合成方法(例如固相合成)产生。本发明的核酸组分不受其产生方式的限定。在某些实施方案中，所述核酸组分优选地由固相合成产生，例如使用寡核苷酸合成仪。
蛋白组分
本发明的复合物中的蛋白组分可以本领域已知的各种方法来制备，例如，通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法(例如Fmoc固相方法)产生。本发明的蛋白组分不受其产生方式的限定。
在一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽以融合方式连接，也即所述蛋白组分为所述货物肽与载体肽形成的融合蛋白。在此类实施方案中，步骤(1)包括：将编码所述蛋白组分的核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收(例如并纯化)所述蛋白组分，其中所述蛋白组分任选地以多聚体形式存在。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽通过蛋白质-蛋白质结合对以共价(例如异肽键)方式连接。在此类实施方案中，步骤(1)包括：(a)提供由所述载体肽以及与其连接的蛋白质-蛋白质结合对的第一成员形成的第一蛋白，和由所述抗原肽以及与其连接的蛋白质-蛋白质结合对的第二成员形成的第二蛋白；(b)将所述第一蛋白与第二蛋白混合并任选地培育以形成异肽键连接，由此提供蛋白组分。
在某些实施方案中，所述第一蛋白通过以下步骤提供：将编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列或包含所述第一核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收(例如并纯化)所述第一蛋白，其中所述第一蛋白任选地以多聚体形式存在。
在某些实施方案中，所述第二蛋白通过以下步骤提供：将编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列或包含所述第二核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收(例如并纯化)所述第二蛋白。
本领域技术人员理解，编码所述第一蛋白和第二蛋白的核苷酸序列可以存在于相同的核酸分子或载体中，也可以存在于不同的核酸分子或载体中。因此，所述第一蛋白和第二蛋白的获得可以同时、分开或以任意顺序相继进行。
在另一些实施方案中，所述蛋白组分中的货物肽与载体肽通过特异性结合对以非共价方式连接。在此类实施方案中，步骤(1)包括：(a)提供由所述载体肽以及与其连接的特异性结合对的第一成员形成的第一蛋白，和由所述抗原肽以及与其连接的特异性结合对的第二成员形成的第二蛋白；(b)将所述第一蛋白与第二蛋白混合并任选地培育以形成由所述第一成员和第二成员的特异性结合介导的非共价连接，由此提供蛋白组分。
在某些实施方案中，所述第一蛋白通过以下步骤提供：将编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列或包含所述第一核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收(例如并纯化)所述第一蛋白，其中所述第一蛋白任选地以多聚体形式存在。
在某些实施方案中，所述第二蛋白通过以下步骤提供：将编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列或包含所述第二核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收(例如并纯化)所述第二蛋白。
本领域技术人员理解，编码所述第一蛋白和第二蛋白的核苷酸序列可以存在于相同的核酸分子或载体中，也可以存在于不同的核酸分子或载体中。因此，所述第一蛋白和第二蛋白的获得可以同时、分开或以任意顺序相继进行。
药物组合物
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第一方面所述的复合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物是疫苗。
在某些实施方案中，所述复合物中，以约1:1～10:1摩尔比(根据单体计算，不是多聚体)混合所述蛋白组分和核酸组分。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约1:1～8:1，例如约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。在某些实施方案中，所述蛋白组分和核酸组分的摩尔比为约2:1～8:1，例如约2:1，约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1。
本发明的复合物或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的复合物或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的复合物或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些示例性实施方案中，本发明的复合物或药物组合物通过皮下注射给予。
本发明的复合物或药物组合物应以有效剂量施用。可根据待治疗或预防的特定疾病或病症、严重程度、对象的年龄以及特定对象的其他个人属性(例如，对象健康的一般状态和对象免疫系统的稳健性)来确定合适的量。有效剂量的确定还通过动物模型研究引导，随后进行人体临床试验，并且通过显著降低对象中目标疾病症状或病症的发生或严重性的施用方案来指导。
用途及方法
第六方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中诱导免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的复合物或药物组合物。还提供了本发明的复合物或药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中诱导免疫应答的制剂(例如药物)中的用途。
在某些实施方案中，本发明的复合物或药物组合物用于在受试者(例如人)中诱导抗原特异性免疫应答。
在某些实施方案中，本发明的复合物中包含的抗原肽源自肿瘤抗原，例如选自肿瘤抗原蛋白或其表位肽。在此类实施方案中，本发明的复合物或药物组合物用于在受试者(例如人)中诱导抗肿瘤免疫应答。
在某些实施方案中，本发明的复合物中包含的抗原肽源自病原体抗原，例如选自病原体抗原蛋白或其表位肽。在此类实施方案中，本发明的复合物或药物组合物用于在受试者(例如人)中诱导针对病原体的免疫应答。
在某些实施方案中，所述免疫应答是细胞介导的应答或体液应答。在某些实施方案中，所述免疫应答包括B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合的增强。
在某些实施方案中，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
在某些实施方案中，所述免疫应答包括T细胞增殖、IL-2生产、IFN-γ生产或其组合的增强。
第七方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的复合物或药物组合物。还提供了本发明的复合物或药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的制剂(例如药物)中的用途。
在某些实施方案中，所述肿瘤为实体瘤，例如黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、头颈癌。本发明的复合物包含与上述肿瘤对应的肿瘤抗原。
在某些实施方案中，所述肿瘤为血液肿瘤，例如淋巴瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病或急性骨髓性白血病。本发明的复合物包含与上述肿瘤对应的肿瘤抗原。
在某些实施方案中，所述肿瘤为转移性肿瘤，例如转移性实体瘤，例如转移性黑色素瘤。
在某些实施方案中，所述受试者是未患肿瘤的受试者或已患肿瘤的受试者。
在某些实施方案中，所述复合物或药物组合物单独施用或与另外的治疗剂(抗肿瘤剂)联合施用。
在某些实施方案中，所述复合物或药物组合物与免疫检查点抑制剂(例如PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体)联合施用。
在某些实施方案中，本发明的复合物或药物组合物可以局部、瘤内、鼻内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、皮肤、静脉内或通过吸入施用于例如可容易到达的肿瘤，如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤；或全身性地用于其它癌症，如肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肾癌、血癌和转移癌等。
对于预防性应用，本发明的复合物或药物组合物在出现任何症状之前，例如未患肿瘤时提供。预防性施用用于预防或改善任何后续相关疾病症状的预期严重性、持续时间或程度。在一些实施方案中，待治疗的对象是未患肿瘤的对象。
对于治疗应用，本发明的复合物或药物组合物在疾病的症状发作时或之后施用，例如在肿瘤的症状发生之后或在诊断出肿瘤之后提供。在一些实施方案中，待治疗的对象是患有肿瘤的受试者。
第八方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的复合物或药物组合物。还提供了本发明的复合物或药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗感染的制剂(例如药物)中的用途。
在某些实施方案中，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。
在某些实施方案中，所述受试者是未患感染的受试者或已患感染的受试者。
对于预防性应用，本发明的复合物或药物组合物在出现任何症状之前，例如在感染之前提供。预防性施用用于预防或改善任何后续感染，以在暴露或怀疑暴露于病毒之后或在实际开始感染之后减弱感染和/或相关疾病症状的预期严重性、持续时间或程度。在一些实施方案中，待治疗的对象可以是有发生感染风险的对象，例如由于暴露于或可能暴露于病原体。
对于治疗应用，本发明的复合物或药物组合物在疾病或感染的症状发作时或之后施用，例如在感染的症状发生之后或在诊断出感染之后提供。在一些实施方案中，待治疗的对象也可以是已感染的受试者。
第九方面，本发明提供了将活性剂靶向递送至受试者中的淋巴器官的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的本发明的复合物或药物组合物，所述活性剂包含所述复合物中的货物肽以及CpG佐剂。还提供了本发明的复合物或药物组合物在制备用于将活性剂靶向递送至受试者中的淋巴器官的制剂中的用途。
在某些实施方案中，所述淋巴器官是次级淋巴器官。在某些实施方案中，所述淋巴器官是淋巴结。
在某些实施方案中，所述方法用于在受试者(例如人)中诱导免疫应答、预防和/或治疗肿瘤、或预防和/或治疗感染。
在某些实施方案中，本发明的复合物具备提高的淋巴结递送效率，例如与不包含本发明所提供的载体肽的复合物(例如以TAT为载体肽的复合物)相比提高至少2倍、至少5倍、或至少10倍。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗原”是诱导免疫应答的物质。“肿瘤特异性抗原(TSA)”是指肿瘤细胞特有的抗原，其不存在于体内其他细胞上。“肿瘤相关抗原(TAA)”并非肿瘤细胞所特有，可能以极低水平存在于正常细胞上，但在肿瘤细胞增殖时高度表达。“肿瘤新抗原”是存在于受试者的肿瘤细胞或组织中但不存在于受试者的相应正常细胞或组织中的新抗原。鉴定新抗原序列的示例性方法描述于Kreiter et al.(2015)Nature 520(7549):692-696,Ott et al.(2017)Nature 547:217-221,and Sahin et al.(2017)Nature 547:222-226，其全部内容通过引用并入本文。
如本文中所使用的，术语“CpG佐剂”是指含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的DNA片段。“CpG基序”是指通过磷酸二酯核苷酸间键或磷酸二酯衍生物核苷酸间键与3’G核苷酸连接的5’C核苷酸。在一些实施方案中，CpG基序包含磷酸二酯核苷酸间键。在一些实施方案中，CpG基序包含磷酸二酯衍生物核苷酸间键。CpG佐剂典型地包括A类CpG ODN、B类CpG ODN和C类CpG ODN。
A类CpG ODN是指：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含在5'、3'或两端处的一或多个poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；或者连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，A类CpG ODN包含在5'、3'或两端处的poly-G序列；包含CpG基序的内部回文序列；以及连接脱氧核苷酸的一或多种磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。A类CpG ODN的实例包含ODN D19、ODN 1585、ODN 2216和ODN 2336。
B类CpG ODN是指：包含寡脱氧核苷酸的CpG基序，所述寡脱氧核苷酸包含一或多个包含CpG基序的6聚体基序；连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，B类CpGODN包含6聚体基序的一或多个拷贝，所述6聚体基序包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物。在实施例中，磷酸二酯衍生物是硫代磷酸酯。在实施例中，B类CpG ODN包含含有CpG基序的6聚体基序的一个拷贝、两个拷贝、三个拷贝或四个拷贝。B类CpG ODN的实例包含ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006和ODN 2007。
C类CpG ODN是指代包含回文序列的寡脱氧核苷酸，所述回文序列包含CpG基序和连接所有脱氧核苷酸的磷酸二酯衍生物(硫代磷酸酯)。C类CpG ODN的实例包含ODN 2395和ODN M362。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。
如本文中所使用的，术语“蛋白质-蛋白质结合对”包含两种蛋白质(例如第一成员(例如第一多肽)和第二同源成员(例如第二多肽))，其在实现或促进异肽键形成的条件下相互作用以形成共价异肽键，其中术语“同源”是指在一起起作用，即在一起反应以形成异肽键的组分。因此，在实现或促进异肽键形成的条件下有效地在一起反应以形成异肽键的两种蛋白质还可称为“互补”肽连接子对。能够相互作用以形成共价异肽键的特异性结合对综述于Veggiani G,Zakeri B,Howarth M.Superglue from bacteria:unbreakablebridges for protein nanotechnology.Trends Biotechnol.2014；32(10):506-512.中，非限制性实例包括，SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、isopeptag:pilinC、SnoopTag:SnoopCatcher等。
术语“异肽键”是指羧基或甲酰胺基与氨基之间的酰胺键，所述基团中的至少一个不衍生自蛋白质主链，或另一种观点，不是蛋白质主链的一部分。异肽键可形成于单一蛋白质内或可出现于两个肽或肽与蛋白质之间。因此，异肽键可分子内地形成于单一蛋白质内，或分子间，即形成于两个肽/蛋白质分子之间，例如两个肽连接子之间。通常，异肽键可出现于赖氨酸残基与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸残基或蛋白质或肽链的末端羧基之间，或可出现于蛋白质或肽链的α-氨基末端与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸之间。
SpyTag:SpyCatcher系统描述于美国专利第9,547,003号和Zakeri等人.Peptidetag forming a rapid covalent bond to a protein,through engineering abacterial adhesin.Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(12):E690-E697(其以全文引用的方式并入本文中)，且衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2域。衍生自CnaB2域的另一特异性结合对为SpyTag:KTag，其在SpyLigase存在下形成异肽键，可参见Fierer JO,Veggiani G,Howarth M.SpyLigase peptide-peptideligation polymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture.ProcNatl Acad Sci U S A.2014；111(13):E1176-E1181，其以全文引用的方式并入本文中。SpyTag002:SpyCatcher002系统描述于Keeble AH等人.Evolving Accelerated Amidationby SpyTag/SpyCatcher to Analyze Membrane Dynamics.Angew Chem Int EdEngl.2017；56(52):16521-16525.中，其以全文引用的方式并入本文中。
SnoopTag:SnoopCatcher系统描述于Veggiani G,Nakamura T,Brenner MD,etal.Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.Proc NatlAcad Sci U S A.2016；113(5):1202-1207.中，其以全文引用的方式并入本文中。RrgA的D4Ig样域(与肺炎链球菌粘附)被分离以形成SnoopTag和SnoopCatcher。
isopeptag:pilin-C特异性结合对衍生自来自酿脓链球菌的主要菌毛蛋白蛋白Spy0128，可参见Zakeri B,Howarth M.Spontaneous intermolecular amide bondformation between side chains for irreversible peptide targeting.J Am ChemSoc.2010；132(13):4526-4527.，其以全文引用的方式并入本文中。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂，稳定剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。
如本文中所使用的，术语“癌症”或“肿瘤”可以互换使用，并且指特征在于不受控制的或失调的细胞增殖、细胞分化降低、不恰当的侵袭周围组织的能力和/或在异位部位建立新的生长能力的细胞疾病。术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语“癌症”包含皮肤、组织、器官、骨骼、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步包含原发性和转移性癌症。实体瘤的非限制性实施例包括：胰腺癌；膀胱癌；结肠直肠癌；乳腺癌；前列腺癌；肾癌；肝细胞癌；肺癌；卵巢癌；宫颈癌；胃癌；食管癌；头颈癌；皮肤癌，包括例如恶性黑色素瘤；神经内分泌癌；脑肿瘤，包括例如胶质瘤、少突胶质瘤、成人多形性胶质母细胞瘤和成人间变型星形细胞瘤；骨癌；软组织肉瘤；以及甲状腺癌。恶性血液病的非限制性实施例包括：急性髓细胞白血病(AML)；慢性粒细胞白血病(CML)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；霍奇金(Hodgkin's)病(HD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤(MM)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明提供了一种新型疫苗递送体系，可以高效地将抗原及佐剂共同递送至淋巴结，并促进抗原的交叉呈递，诱导强效的抗原特异性的免疫反应，且优于临床常用的油式复合佐剂系统，并且所激发的免疫应答还具有强烈的记忆效应，对于肿瘤及感染等疾病的预防及治疗具有重要意义。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了基于eTAT融合表达的模式抗原及其对照抗原的克隆设计。
图2显示了基于eTAT融合表达的模式抗原的特异性T细胞应答水平。
图3显示了基于eTAT融合表达的模式抗原与CpG的相互作用分析。
图4显示了荧光标记的模式抗原与CpG的混合物在DC细胞上的入胞效率评价。
图5显示了荧光标记的模式抗原与CpG皮下共注射小鼠后的淋巴结荧光成像及强度计算。
图6显示了荧光标记的模式抗原与CpG皮下共注射小鼠后的主要器官荧光成像及强度计算。
图7显示了荧光标记的模式抗原与CpG皮下共注射小鼠后淋巴结中的抗原及CpG双阳性细胞的比例。
图8显示了基于eTAT融合表达的模式抗原在有或无CpG佐剂的情况下的免疫应答水平的评价。
图9显示了通用型eTAT疫苗体系的设计方案。
图10显示了eTAT-Catcher及其对照蛋白与SpyTag-GP33的连接及产物纯化的评价。
图11显示了eTAT-Catcher及其连接产物与CpG的相互作用分析。
图12显示了通用型eTAT疫苗体系皮下注射小鼠后淋巴结中的抗原及CpG双阳性细胞的比例。
图13显示了基于模式抗原GP33评价通用型eTAT疫苗体系皮下免疫小鼠后的特异性T细胞应答水平。
图14显示了通用型eTAT疫苗体系用于提升人源相关肿瘤抗原免疫原性的作用。
图15显示了基于CpG 1826的eTAT疫苗体系的CD8+T细胞应答评价。
图16显示了基于模式抗原GP33评价通用型eTAT疫苗体系的黑色素瘤预防效应。
图17显示了基于模式抗原GP33评价通用型eTAT疫苗体系的黑色素瘤治疗效应。
图18显示了基于MC38细胞新生抗原评价通用型eTAT疫苗体系的黑色素瘤治疗效应。
图19显示了基于肿瘤相关抗原及新生抗原的eTAT疫苗体系对皮下恶性黑色素瘤的治疗作用。
图20显示了基于肿瘤相关抗原及新生抗原的eTAT疫苗体系对转移性恶性黑色素瘤的治疗作用。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
实施例
现在于以下非限制性实施例中描述本发明。
本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例涉及的主要试剂的来源如下：
克隆构建相关试剂所需材料如下：DNA聚合酶(TaKaRa,R040A)，DNA回收试剂盒(TianGen,DP214-03)，质粒小提试剂盒(TianGen,DP103-03)，质粒大提试剂盒(QIAGEN,12663)，Gibson装配预混液5管(NEB,E2611L)，DNA marker(ThmeroFisher，SM0331)，琼脂糖(Biowest，BW-R0100)；
蛋白大量表达所需材料如下：蛋白胨(BiSIGMA-ALDRICH，T7293-1KG)，酵母粉(OXOID，LP0021B)，氯化钠(西陇化工，10011012AR)，IPTG(Inalco，1758-1400)；
蛋白纯化所需介质如下：SP SEPHAROSE FAST FLOW(GE Healthcare，17-0729-01)，NI SEPHAROSE(GE Healthcare，17-5268-02)。
蛋白纯化及保存所需试剂如下：甘油/丙三醇/C3H8O3(SIGMA-ALDRICH,G5516),KCl(西陇化工，1002007),NaCl(西陇化工，1001012AR)，Na2HPO4·12H2O(西陇化工，1001067AR)，KH2PO4(西陇化工，1002048AR500)，咪唑(SIGMA-ALDRICH,V900153)，Tris base(Seebio，183995)，葡萄糖(西陇化工，1064008AR500)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(TianGen，PA115-02)；
细胞培养所需试剂：FBS(GIBCO，10099-133)，RPMI 1640(源培，L220KJ)DMEM(GIBCO，11965092)，胰蛋白酶(AMRESCO，0458)；
实验中所用的相关质粒均由公司合成(生工生物及通用生物)。
流式细胞术试剂：试验中所用的流式抗体购自Biolegend(USA)、BD biosciences(USA)以及MBL(北京)公司。
其他试剂：GM-CSF(Sino Biological,51048-MNAH),IL-4(Sino Biological,51084-MNAE),CpG ODN-2395(InvivoGen,tlrl-2395-1)；
细胞系及动物：B16-F10(小鼠黑色素瘤细胞)购自ATCC。DC2.4(小鼠DC细胞系)由本实验室保存。MC38(小鼠结直肠细胞系)购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。B16-GP33(稳定表达LCMV GP33表位的小鼠黑色素瘤细胞)由美国加州大学赠予。C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
实施例1：eTAT融合表达可提高抗原的交叉递呈
在前期研究中已开发了被称为eTAT的胞内递送系统，具有良好的胞质递送能力，eTAT详细描述于中国专利申请CN202011240557.4、国际专利申请WO2021135647A1，以及Yu,S.,Yang,H.,Li,T.et al.Efficient intracellular delivery of proteins by amultifunctional chimaeric peptide in vitro and in vivo.Nat Commun 12,5131(2021).。eTAT从N端至C端包含细胞穿膜肽(TAT，SEQ ID NO:1)、pH敏感肽(INF7，SEQ IDNO:46)、蛋白酶识别序列(组织蛋白酶L识别序列N+弗林蛋白酶识别序列Ne，SEQ ID NO:45+SEQ ID NO:44)、多聚化结构域(亮氨酸拉链，SEQ ID NO:36)。
本申请的发明人出乎意料地发现，eTAT在促进抗原交叉递呈方面具有很大潜力并对其作为疫苗递送载体的免疫增效作用进行了研究。
1.1eTAT-pGP33融合蛋白及其他对照蛋白表达载体构建
构建含有细胞穿膜肽TAT(SEQ ID NO:1)或eTAT(SEQ ID NO:3)、促溶标签蛋白磷酸酶1B(Ppm1b)(SEQ ID NO:5)以及来源于淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的模式抗原表位GP33(SEQ ID NO:7)的重组蛋白表达载体，各重组蛋白的结构示意图如图1所示，从N端到C端各组分氨基酸序列如表2所示。所述构建方法如下：通过PCR扩增得到eTAT、Ppm1b及GP33的核酸序列，并通过多轮PCR将各部分连接，并在最后一轮PCR过程中通过上游引在片段的5’端引入NdeI酶切位点及其与pET-21b(+)对应的NdeI酶切位点上游的重叠序列，通过下游引在片段的3’端引入HindIII酶切位点及其与pET-21b(+)对应的HindIII酶切位点下游的重叠序列。pET-21b(+)质粒通过NdeI，HindIII双酶切处理。通过GIBSON组装方式将带有重叠序列的插入片段连接到酶切载体pET-21b(+)。
表2：递送系统-抗原分子复合物所包含的组分
1.2eTAT-pGP33融合蛋白及其他对照蛋白的表达及纯化
将1.1中所述的表达质粒转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)；从转化的平板上挑选单菌落接种到含氨苄抗性的5ml LB液体培养基中培养过夜，然后取1ml过夜培养的菌液转接到含氨苄抗性的500ml LB液体培养基中，37℃，180rpm培养到菌液OD 600在0.6左右，接着加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，25℃诱导8小时；诱导表达结束后，25℃，7000g离心10分钟后收集菌体；接着用10ml蛋白纯化平衡缓冲液(PBS,5％甘油)重悬菌体，进行超声破碎。接着离心取上清液，纯化分两种方式，首先对于eTAT-pGP33,上样到蛋白纯化系统的SP强阳离子层析柱上；然后利用蛋白纯化系统用蛋白洗脱缓冲液(PBS+0.2M NaCl～PBS+0.8MNaCl去除杂蛋白，PBS+1.2M NaCl收集洗脱产物)洗脱目的蛋白；对于pGP33以及TAT-pGP33，利用NI镍柱进行纯化，含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。利用Detoxi-Gel预装柱去除内毒素。蛋白浓度可以根据分光光度计或BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。每个纯化后的融合蛋白分装后-20℃保存。
1.3eTAT-pGP33融合蛋白及其他对照蛋白的免疫应答研究
2nmol抗原蛋白(分为pGP33、TAT-pGP33以及eTAT-pGP33)皮下免疫C57BL/6小鼠，一周后进行加强免疫，用量与首次免疫相同，在初次免疫之后第14天时，安乐死小鼠后，摘取脾脏，研磨制备单细胞悬液。利用商品化红细胞裂解液裂解红细胞之后，得到的细胞用于检测特异性分泌IFN-γ的T细胞。取上述的得到的细胞5*106个重悬于1ml RPMI1640+10％FBS重悬细胞,加入5μg/ml的刺激多肽(GP33:KAVYNFATM),混匀后在37℃细胞培养箱中培养2小时，之后加入1μl的蛋白转运抑制剂BD GolgiPlugTM，混匀后继续培养4小时。收集细胞到EP管中，400g离心收取细胞沉淀，清洗后使用100μl的PBS+2％FBS进行重悬，加入CD8抗体及死活染料Aqua进行染色，清洗之后对细胞进行固定通透，再次清洗，然后使用IFN-γ抗体染色20分钟，清洗后用于流式分析。结果如图2所示，TAT-pGP33及eTAT-pGP33免疫后的特异性T细胞含量均高于pGP33组，说明了穿膜肽与抗原融合表达确实可以增强抗原的特异性T细胞应答。其中，eTAT-pGP33的T细胞应答水平相较于TAT-pGP33，又有进一步的提升。以上结果充分说明了eTAT优于传统的细胞穿膜肽TAT，显著提升了抗原的交叉递呈。
实施例2：eTAT融合表达的抗原与CpG相互作用分析
在证明eTAT是有效的抗原递送载体的基础上，接下来着手进行佐剂的配合研究。在癌症疫苗应用中，佐剂的选择对于癌症疫苗的抗肿瘤效果至关重要。CpG是一种TLR-9激动剂，在临床上表现出良好的有效性。本申请的发明人发现，带正电的eTAT能够与带负电的CpG结合，当抗原(Ag)与eTAT融合表达，并与CpG混合，能够实现抗原佐剂的共递送。随后发明人通过琼脂糖凝胶电泳移位实验来分析其相互作用。
配制添加万分之一AG-CelRed核酸凝胶染料的3％琼脂糖凝胶，将上述1.2所获得的融合蛋白与CpG(CpG ODN 2395)按不同的摩尔比混合(按单体计算)，混合产物离心后加入凝胶孔中进行电泳。如图3所示，我们发现，即使在融合抗原/CpG摩尔比为8:1的情况下，对照pGP33与CpG相互结合作用也很弱；相比之下，在融合抗原/CpG摩尔比为2:1及以上时，几乎100％的CpG与eTAT-pGP33结合，并且比TAT-pGP33强很多。以上结果说明了与eTAT融合表达后的抗原，可以通过静电相互作用实现与CpG佐剂的高效结合，其结合效率显著优于常规的穿膜肽TAT。
实施例3：基于eTAT融合表达实现抗原与佐剂的胞内共递送
交叉递呈的实现需要抗原入胞，而CpG佐剂发挥作用同样需要入胞，而抗原与佐剂共同递送到同一个细胞中则可以最大化的激活免疫应答。故我们在实施例1的基础上，进一步分析eTAT融合表达并搭配CpG佐剂的胞内共递送情况。
将融合表达的抗原标记Alexa FluorTM 647荧光素，CpG标记TAMRA荧光素，在DC2.4细胞中以抗原:CpG＝2:1的摩尔比将CpG与荧光标记的GP33相关抗原(pGP33、TAT-pGP33、eTAT-pGP33)混合后加入细胞中培养3小时，用流式细胞仪研究抗原和CpG的共同递送情况。如图4A所示，与pGP33与CpG混合的常规配方相比，eTAT的融合表达导致抗原(Ag)和CpG的胞内递送效率提升20倍和18倍，且显著优于TAT融合表达。此外，如图4B所示，以eTAT体系加载的细胞几乎100％表现为Ag+CpG+的双阳性特征，进一步说明了eTAT与抗原的融合表达，可有效促进抗原和CpG佐剂的胞内共递送。
实施例4：eTAT促进融合蛋白和佐剂的淋巴结共递送
在疫苗免疫激活过程中，淋巴结是免疫应答的主要场所，无论是体液免疫还是细胞免疫应答，淋巴结递送是必要条件，递送效率的高低决定着免疫应答的强度。所以我们进一步研究Ag/CpG在体内递送的情况，特别是淋巴结递送的效率。将融合表达的抗原标记Alexa FluorTM 647荧光素，CpG标记TAMRA，然后将2nmol抗原、1nmol CpG混合30分钟后，皮下注射到C57BL/6小鼠体内，24小时后收获腹股沟淋巴结以及其他主要器官进行荧光成像。如图5A及5B所示，与CpG混合的TAT-pGP33制剂在淋巴结中显示出与pGP33+CpG相似的较弱的Ag/CpG信号。相比之下，用eTAT-pGP33和CpG的混合物免疫的小鼠，在淋巴结中(dLNs)中表现出明显增强的Ag和CpG的荧光信号。另外，也对除了淋巴结之外的其他主要器官进行荧光成像观察，如图6所示，显示的为注射24小时后的抗原荧光信号，A图为各器官的荧光成像，B图为相应的荧光强度数值。eTAT-pGP33+CpG组中，淋巴结的信号密度显著高于其他器官，而其他两个对照组免疫后的抗原信号在淋巴结中并无显著提升。进一步通过流式细胞术分析，我们发现，dLNs中Ag+CpG+的双阳性抗原递呈细胞(主要分析DC细胞和巨噬细胞，DC细胞使用CD11c荧光抗体染色20分钟，巨噬细胞使用F4/80荧光抗体染色)的比率比pGP33+CpG组高20倍以上(图7)。这些结果表明，Ag与eTAT的融合表达，使得Ag和CpG能够有效地共同递送到dLNs中。
实施例5：eTAT疫苗体系的细胞免疫应答水平研究
在观察到eTAT疫苗体系的高效的抗原与佐剂淋巴结共递送之后，进一步对eTAT疫苗体系的细胞免疫应答水平进行评价。2nmol抗原(分为pGP33、TAT-pGP33以及eTAT-pGP33)在添加和不添加1nmol CpG的情况下，皮下免疫C57BL/6小鼠，一周后进行加强免疫，用量与首次免疫相同，在初次免疫之后第14天时，安乐死小鼠后，摘取脾脏，研磨制备单细胞悬液，利用商品化红细胞裂解液裂解红细胞之后，得到的细胞用于分析GP33特异性T细胞。分析方法包括两种，第一种是使用识别GP33特异性T细胞的四聚体进行染色，取上述的得到的细胞1*106个重悬于PBS+2％FBS缓冲液中，加入四聚体染色30分钟后，加入CD8抗体进一步染色，最后加入死活染料Aqua进行染色，清洗之后使用0.75μm的筛网过滤用于流式细胞仪分析。另外一种分析方法为检测特异性分泌IFN-γ的T细胞，取上述的得到的细胞5*106个重悬于1ml RPMI 1640+10％FBS重悬细胞，加入5μg/ml的刺激多肽(GP33:KAVYNFATM)，混匀后在37℃细胞培养箱中培养2小时，之后加入1μl的蛋白转运抑制剂BD GolgiPlugTM，混匀后继续培养4小时。收集细胞到EP管中，400g离心收取细胞沉淀，清洗后使用100μl的PBS+2％FBS进行重悬，加入CD8抗体及死活染料Aqua进行染色，清洗之后对细胞进行固定通透，再次清洗，然后使用IFN-γ抗体染色20分钟，清洗后用于流式分析。
结果如图8所示，图8A为四聚体染色的GP33特异性CD8 T细胞的定量分析，图8B为特异性分泌IFN-γ的CD8 T细胞的定量分析。首先，在未添加CpG的组中，eTAT-pGP33免疫后的特异性T细胞应答要高于pGP33以及TAT-pGP33。进一步加入CpG进行免疫后，CpG+eTAT-pGP33组，CD8+IFN-γ+和四聚体染色的GP33特异性CD8+T细胞的数量增加了近300％，明显高于其他两个组(CpG+pGP33组和CpG+TAT-pGP33组)(≤70％)，表明CpG的佐剂效应明显改善。上述结果充分说明了eTAT融合表达可显著提升疫苗的应答水平。
实施例6：通用型eTAT疫苗体系的建立
肿瘤在转化和发展过程中可以获得大量的细胞突变，从而产生多样化的肿瘤抗原。虽然抗原与eTAT的融合可以显著提高癌症疫苗的反应效率，但迎合肿瘤抗原的多样性和异质性并具有灵活性仍然是一个挑战。为了克服这个问题，我们利用了由SpyTag/SpyCatcher分子对组成的蛋白质交联系统。如图9所示，SpyCatcher(Catcher)与eTAT融合表达形成eTAT-Catcher蛋白，而SpyTag标记的表位肽可以通过共价键的形成迅速与eTAT-Catcher共价结合。
6.1eTAT-Catcher融合蛋白及其他对照蛋白表达载体构建
各重组蛋白从N端到C端各组分氨基酸序列如表3所示。所述重组蛋白表达载体构建方法如下：通过PCR扩增得到eTAT、Catcher的核酸序列，并通过多轮PCR将各部分连接，并在最后一轮PCR过程中通过上游引物在片段的5’端引入NdeI酶切位点及其与pET-21b(+)对应的NdeI酶切位点上游的重叠序列，通过下游引在片段的3’端引入HindⅢ酶切位点及其与pET-21b(+)对应的HindⅢ酶切位点下游的重叠序列。pET-21b(+)质粒通过NdeI，HindⅢ双酶切处理。通过GIBSON组装方式将带有重叠序列的插入片段连接到酶切载体pET-21b(+)。
表3：递送系统-抗原分子复合物所包含的组分
6.2eTAT-Catcher融合蛋白及其他对照蛋白的表达及纯化
将6.1中所述的表达质粒转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)；从转化的平板上挑选单菌落接种到含氨苄抗性的5ml LB液体培养基中培养过夜，然后取1ml过夜培养的菌液转接到含氨苄抗性的500ml LB液体培养基中，37℃，180rpm培养到菌液OD 600在0.6左右，接着加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，25℃诱导8小时；诱导表达结束后，25℃，7000g离心10分钟后收集菌体；接着用10ml蛋白纯化平衡缓冲液(PBS,5％甘油)重悬菌体，进行超声破碎。接着离心取上清液，纯化分两种方式，首先对于eTAT-Catcher，上样到蛋白纯化系统的SP强阳离子层析柱上；然后利用蛋白纯化系统用蛋白洗脱缓冲液(PBS+0.2M NaCl～PBS+0.8M NaCl去除杂蛋白，PBS+1.2M NaCl收集洗脱产物)洗脱目的蛋白；对于Catcher以及TAT-Catcher，利用NI镍柱进行纯化，含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。利用Detoxi-Gel预装柱去除内毒素。蛋白浓度可以根据分光光度计或BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。每个纯化后的融合蛋白分装后-20℃保存。
6.3 eTAT-Catcher与SpyTag-Ag的连接效率评价及产物纯化
选择GP33作为模式抗原，将其N端连接SpyTag(SEQ ID NO:9)，形成SpyTag-Ag。将Catcher、TAT-Catcher、eTAT-Catcher与过量SpyTag-GP33混合，4℃孵育30分钟后，利用10kD孔径的超滤离心管进行纯化，去除多余的SpyTag-GP33多肽，取纯化前后的样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图10所示，3种Catcher相关蛋白与SpyTag-GP33的连接均十分彻底，无Catcher相关蛋白剩余。通过超滤管纯化后，能够有效去除剩余的SpyTag-GP33多肽，得到的纯化产物条带单一，纯度高。以上结果说明了eTAT-Catcher与SpyTag-Ag的连接反应快速且完全，可以替代融合表达的方式，实现eTAT与抗原的有效串联。
6.4eTAT-Catcher及其连接产物与CpG的相互作用分析
配制添加万分之一AG-CelRed核酸凝胶染料的3％琼脂糖凝胶，将eTAT-Catcher融合蛋白及其与SpyTag-GP33多肽的连接纯化产物(eTAT-Catcher:SpyTag-GP33)与CpG按照蛋白:CpG的摩尔比为2:1及4:1进行混合，混合产物离心后进行琼脂糖凝胶电泳。如图11所示，与此前结果一致，eTAT-Catcher或其连接产物eTAT-Catcher:SpyTag-GP33与CpG在摩尔比为2:1及以上时，可充分相互结合；而Catcher及其连接产物Catcher:SpyTag-GP33则不能够与CpG进行有效的结合。
6.5基于eTAT-Catcher的通用型疫苗体系的淋巴结递送效率评价
将SpyTag-GP33标记荧光素FAM，通过连接反应及后续超滤管纯化制备带有FAM的Catcher:SpyTag-GP33及eTAT-Catcher:SpyTag-GP33融合抗原，按照2nmol抗原加1nmolCpG-TAMRA的用量，混合后皮下注射C57BL/6小鼠，24小时后取淋巴结。制备单细胞悬液进行流式分析，利用CD11c及F4/80抗体标记DC细胞及巨噬细胞，清洗后利用流式细胞仪进行分析。结果如图12所示，eTAT-Catcher:SpyTag-GP33+CpG组淋巴结中的抗原及CpG佐剂双阳性的细胞量显著高于SpyTag-GP33+CpG及Catcher:SpyTag-GP33+CpG组，说明基于SpyCatcher&SpyTag的通用型疫苗体系与此前融合表达一致，可实现有效的Ag和CpG的淋巴结共递送。
6.6基于eTAT-Catcher的通用型疫苗体系的特异性T细胞应答水平评价
如图13所示的组别设置，按照2nmol抗原+1nmol CpG佐剂的用量配制免疫制剂，间隔1周2针免疫C57BL/6小鼠后，使用肝素锂抗凝剂，采取小鼠眼眶血100微升，使用商品化的红细胞裂解液裂解细胞之后，得到的细胞用于分析GP33表位刺激后特异性分泌IFN-γ及TNF-α的T细胞，过程如上述实施例5中的方法所述。结果如图13所示，基于eTAT的疫苗体系(eTAT-Catcher:SpyTag-GP33+CpG)诱导了大约15％的Ag特异性CD8+T细胞的产生，与常规的多肽配方SpyTag-GP33+CpG相比，增加了10倍，与Catcher:SpyTag-GP33+CpG相比增加了8倍，与TAT-Catcher:SpyTag-GP33+CpG相比增加了4倍。然而，当没有SpyTag标签串联的GP33裸肽与eTAT-Catcher混合而不是连接时，免疫原性明显降低，表明与eTAT的连接是不可缺少的。值得注意的是，基于eTAT的疫苗所诱导的CTL的频率也明显高于基于临床肿瘤疫苗中最强佐剂系统之一的配方，即通过油式佐剂Montanide(Mon)乳化Ag和CpG的体系，即使当表位肽的剂量增加5倍时(SpyTag-GP33(500％)+Mon+CpG)，也显著低于eTAT体系。上述结果充分证明了基于eTAT的通用型疫苗系统与融合表达一致，可显著提升“蛋白+CpG”疫苗体系的T细胞应答水平。
除了GP33模式抗原，还以来源于人类的肿瘤抗原E738～57(SEQ ID NO:18)及CEA567～584(SEQ ID NO:19)作为疫苗体系评价的目标抗原。将这两种抗原与SpyTag串联合成，形成SpyTag-E738～57及SpyTag-CEA567～584，进一步与eTAT-Catcher蛋白混合进行连接，置于4℃孵育30分钟后，利用10kD孔径的超滤离心管进行纯化，去除多余的多肽抗原，取纯化后的样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图14A所示，得到的纯化产物条带单一，纯度高。设置组别包括传统的多肽疫苗体系及eTAT疫苗体系，按照2nmol抗原+1nmolCpG佐剂的用量配制免疫制剂，间隔1周2次免疫C57BL/6小鼠后，使用肝素锂抗凝剂，采取小鼠眼眶血，使用商品化的红细胞裂解液裂解细胞之后，使用对应的T细胞表位多肽进行刺激，表位多肽分别为E749～57(SEQ ID NO:20)及CEA572～579(SEQ ID NO:21)，刺激浓度为5μg/ml，检测特异性分泌IFN-γ及TNF-α的T细胞，过程如上述实施例5中的方法所述。
结果如图14B及图14C所示，对于E738～57抗原，常规的SpyTag-E738～57+CpG多肽疫苗体系的应答较低，细胞因子阳性的CD8+T的比例不足1％。而eTAT:SpyTag-E738～57+CpG体系免疫后的IFN-γ+CD8+T细胞比例约为20％，且IFN-γ+TNF-α+的多功能CD8+T细胞达到10％左右，显著高于常规的多肽体系(P<0.0001)(图14B)。另外，对于CEA567～584抗原，eTAT体系的IFN-γ+CD8+T及IFN-γ+TNF-α+CD8+T细胞也分别超过20％及10％，约为多肽体系的30倍以上(图14C)。以上结果充分说明了基于eTAT-Catcher的疫苗体系具有广泛增强肿瘤抗原免疫原性的作用，可诱导强烈的抗原特异性T细胞应答。
实施例7：基于CpG 1826的eTAT疫苗体系的CD8+T细胞应答评价
在上述实施例中，CpG佐剂的类型为ODN 2395，属于C类CpG。为了研究eTAT疫苗体系递送核酸佐剂是否具有广泛的免疫原性提升效应，接下来评价了基于CpG ODN 1826(B类CpG)(SEQ ID NO:22)的eTAT疫苗体系免疫后的CD8+T细胞应答。以GP33作为评价抗原，组别包括常规多肽疫苗体系(SpyTag-GP33+CpG1826)、基于Montanide(Mon)乳化的临床双佐剂疫苗体系(SpyTag-GP33+CpG1826+Mon)，以及eTAT疫苗体系(eTAT-Catcher:SpyTag-GP33+CpG1826)。按照2nmol抗原+1nmol CpG佐剂的用量配制免疫制剂，免疫时间如图15A所示，间隔12天2次免疫C57BL/6小鼠后，在第19天使用肝素锂抗凝剂，采取小鼠眼眶血，使用商品化的红细胞裂解液裂解细胞之后，使用GP33表位多肽进行刺激，检测特异性分泌IFN-γ及TNF-α的CD8+T细胞，过程如上述实施例5中的方法所述。
结果如图15B及图15C所示，基于CpG1826的eTAT疫苗体系可激活约3％的GP33特异性IFN-γ+CD8+T细胞，该比例为常规疫苗体系及双佐剂疫苗体系的2倍以上；除此之外，eTAT疫苗体系所诱导的IFN-γ+TNF-α+多能性CD8+T细胞比例也显著高于其他两组，约为其4倍左右。以上结果充分说明了eTAT疫苗体系用于递送其他类型的CpG，也可以显著提高疫苗的免疫原性，增强抗原特异性T细胞应答。
实施例8：eTAT疫苗体系在肿瘤预防中的应用
为了评估疫苗的免疫记忆效应，C57BL/6小鼠在免疫2针(2nmol GP33相关抗原+1nmol CpG 2395佐剂，每针间隔1周)之后，在小鼠皮下接种5*105的B16-GP33黑色素瘤细胞(稳定表达GP33表位的B16-F10细胞系)，具体时间点如图16A所示，每组8只小鼠。观察小鼠肿瘤的生长，每2天记录一次肿瘤大小。结果如图16B、C所示，eTAT的疫苗体系(eTAT-Catcher:SpyTag-GP33+CpG)免疫的小鼠荷瘤60天后，8只小鼠中仅有1只生长肿瘤，完全保护率达85％以上，而其他组的小鼠几乎都有肿瘤的生长，充分说明了eTAT疫苗体系在免疫后具有高效的肿瘤预防效应。这与eTAT疫苗体系所诱导的强烈的免疫应答有关。
实施例8：eTAT疫苗体系在肿瘤治疗中的应用
8.1基于肿瘤模式抗原的肿瘤治疗作用评价
在肿瘤预防有效的基础上，进一步评价通用型疫苗体系的肿瘤治疗作用，首先基于模式抗原GP33进行评价。为了阻断免疫抑制性PD-1/PD-L1途径，将疫苗与抗PD-1治疗相结合。具体时间如图17A所示，每只C57BL/6小鼠在背部皮下注射5*105个B16-GP33细胞，每组8只小鼠，疫苗共免疫3针(2nmol GP33相关抗原+1nmol CpG 2395佐剂，每针间隔4天)；PD1抗体通过腹腔注射，每只小鼠100μg，共治疗5针。治疗结果如图17B-D所示，首先在单独使用疫苗治疗时，eTAT疫苗体系(eTAT:SpyTag-GP33+CpG)能够显著抑制小鼠肿瘤生长，且在治疗中段能够有效缩小肿瘤体积。而常规的多肽配方(SpyTag-GP33+CpG)对于肿瘤的生长抑制作用很小。当进一步将eTAT:SpyTag-GP33+CpG和抗PD-1抗体进行联合免疫治疗(eTAT:SpyTag-GP33+CpG+PD-1)，在黑色素瘤这这种侵袭性较高的模型中，可实现25％的小鼠肿瘤完全消退，证明了基于eTAT的疫苗和PD-1抗体治疗具有良好的协同效应。相反，常规的多肽配方联用PD-1抗体(SpyTag-GP33+CpG+PD-1)则收效甚微。以上结果充分证明了eTAT体系能显著提高模式抗原疫苗的免疫原性，大大增强肿瘤疗效。
8.2基于新生抗原的eTAT疫苗体系对MC38肿瘤治疗作用评价
除了对模式抗原进行评价，同时也对免疫原性相对较弱的肿瘤新生抗原进行评价，选择小鼠结直肠细胞系MC38的两个新生抗原RepS1(SEQ ID NO:26)及Adpgk(SEQ IDNO:27)作为免疫原。6周龄的C57BL/6雌性小鼠，背部皮下注射5*105个MC38细胞，之后进行治疗，每组8只小鼠。其中疫苗包括了传统的多肽疫苗Ags+CpG(SpyTag-RepS1+SpyTag-Adpgk+CpG)，以及基于eTAT-Catcher通用型体系制备的eTAT:Ags+CpG(即eTAT:SpyTag-RepS1、eTAT:SpyTag-Adpgk以及CpG三者的混合物)，每针疫苗包括了相当于2nmol Adpgk抗原、2nmol RepS1的抗原和2nmol CpG佐剂，共治疗3针。为了研究疫苗联用免疫检查点抑制剂的效果，故同时研究了联用PD1抗体的治疗效应，抗体采用腹腔注射，每只小鼠100μg，总共治疗5针，具体治疗时间点如图18A所示。首先在治疗过程中第23天时，使用肝素锂抗凝剂采集小鼠眼眶血，裂解红细胞后用于检测抗原特异性T细胞应答。取上述细胞5*106个重悬于1mL RPMI 1640+10％FBS重悬细胞,分别加入5μg/mL的刺激多肽RepS1或Adpgk，混匀后在37℃细胞培养箱中培养2小时，之后加入1μL的蛋白转运抑制剂BD GolgiPlugTM，混匀后继续培养4小时。收集细胞到EP管中，400g离心收取细胞沉淀，清洗后使用100μl的PBS+2％FBS进行重悬，加入CD8抗体及死活染料Aqua进行染色，清洗之后对细胞进行固定通透，再次清洗，然后使用IFN-γ抗体染色20分钟，清洗后用于流式分析。如图18B所示，可以看到，eTAT:Ags+CpG组免疫后，激发的RepS1及Adpgk特异性T细胞的数量均显著高于Ags+CpG组。
肿瘤治疗结果如图18C-F所示，首先在单独使用疫苗治疗时，eTAT疫苗体系(eTAT:Ags+CpG)能够显著抑制小鼠肿瘤生长，且在8只小鼠中有1只小鼠的肿瘤被完全清除。相比之下，常规的多肽疫苗Ags+CpG对于肿瘤的生长抑制作用则微不足道，且没有小鼠能够被完全治愈。进一步联用PD1抗体后，eTAT疫苗组能够完全治愈50％的小鼠，实现肿瘤的彻底清除。而多肽疫苗体系联用PD1抗体则治疗效果有限，对于小鼠肿瘤的生长抑制作用不够显著。
对于eTAT:Ags+CpG+PD1组治愈的小鼠，在第80天时，重新使用MC38细胞进行荷瘤，细胞数量为每只小鼠5*105个。同时将周龄相近的空白小鼠作为对照也进行荷瘤，记录肿瘤体积的大小。结果如图18G、H所示，eTAT:Ags+CpG+PD1组治愈的小鼠的肿瘤体积显著小于对照组，且有50％的治愈小鼠再荷瘤时并无肿瘤生长，说明了eTAT疫苗体系所激发的抗肿瘤免疫应答具有强烈的记忆效应。
8.3基于肿瘤相关抗原及新生抗原的eTAT疫苗体系对恶性黑色素瘤的治疗作用评价
除了MC38肿瘤模型，我们还在恶性程度较高的B16-F10小鼠黑色素瘤中评价eTAT疫苗体系的抗肿瘤作用。选择小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10的两个肿瘤相关抗原Trp1(SEQID NO:23)及GP100(SEQ ID NO:24)，以及一个肿瘤新生抗原M27(SEQ ID NO:25)作为免疫原。将这三种抗原与SpyTag串联合成，形成SpyTag-Trp1、SpyTag-GP100及SpyTag-M27，进一步与eTAT-Catcher蛋白混合进行连接，置于4℃孵育30分钟后，利用10kD孔径的超滤离心管进行纯化，去除多余的多肽抗原，取纯化后的样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图19A所示，得到的纯化产物条带单一，纯度高。疫苗包括了传统的多肽疫苗Ags+CpG(SpyTag-Trp1+SpyTag-GP100+SpyTag-M27+CpG)，以及基于eTAT-Catcher通用型体系制备的eTAT:Ags+CpG(即eTAT-Catcher:SpyTag-Trp1、eTAT-Catcher:SpyTag-GP100、eTAT-Catcher:SpyTag-M27以及CpG 2395的混合物)，每针疫苗包括了相当于2nmol Trp1抗原、2nmol GP100抗原、2nmol M27抗原和3nmol CpG佐剂，总抗原与CpG的摩尔比遵循2:1。
首先是皮下肿瘤的治疗研究。6～8周龄的C57BL/6雌性小鼠，背部皮下注射5*105个B16-F10细胞，之后进行治疗，每组6只小鼠。具体治疗时间点如图19B所示，荷瘤后第5天、第9天和第13天进行疫苗皮下注射治疗，共治疗3针，每两天监测一次肿瘤体积。首先在治疗过程中第17天时，使用肝素锂抗凝剂采集小鼠眼眶血，裂解红细胞后用于检测抗原特异性T细胞应答。取上述细胞5*106个重悬于1mL RPMI 1640+10％FBS重悬细胞，铺于12孔板中，每个孔中分别加入5μg/mL的刺激多肽Trp1、GP100或M27，混匀后在37℃细胞培养箱中培养2小时，之后加入1μL的蛋白转运抑制剂BD GolgiPlugTM，混匀后继续培养4小时。收集细胞到EP管中，400g离心收取细胞沉淀，清洗后使用100μL的PBS+2％FBS进行重悬，加入CD8抗体及死活染料Aqua进行染色，清洗之后对细胞进行固定通透，再次清洗，然后使用IFN-γ抗体染色20分钟，清洗后用于流式分析。如图19C所示，可以看到，eTAT:Ags+CpG组免疫后，激活的Trp1、GP100及M27特异性CD8+T细胞的数量均显著高于Ags+CpG组，总阳性细胞比例约为多肽疫苗组的4倍，说明eTAT疫苗体系显著提升了肿瘤相关抗原及新生抗原的免疫原性，有效增强其CD8+T细胞应答。肿瘤治疗结果如图19D-E所示，常规多肽疫苗体系(Ags+CpG)几乎没有肿瘤抑制作用，而eTAT疫苗体系(eTAT:Ags+CpG)能够显著抑制小鼠肿瘤生长，在前20天内的肿瘤小于100mm3，有效延长小鼠的生存期，体现出强大的恶性黑色素瘤治疗效应。
恶性黑色素瘤侵袭性强，在临床上容易发生肿瘤转移，如何治疗转移性黑色素瘤是一大难点。因此除了皮下黑色素瘤治疗，还研究了上述eTAT疫苗体系用于转移性黑色素瘤治疗，探究其应用潜力。实验时间安排如图20A所示，将5*105个B16-F10细胞通过尾静脉注射到小鼠体内，在第3天、第7天和第11天，使用上述的包含3个抗原的常规多肽疫苗体系(Ags+CpG)及eTAT疫苗体系(eTAT:Ags+CpG)对小鼠进行皮下注射治疗。在第20天时安乐死小鼠，观察其肺部及背部的黑色素瘤转移情况。治疗结果如图20B所示，常规多肽疫苗体系治疗的小鼠，肺部及背部均存在明显的转移性黑色素瘤，与PBS对照组无显著区别。而eTAT疫苗体系治疗的小鼠，肺部及背部均无明显的黑色素瘤出现，说明了其可高效抑制转移性黑色素瘤的发展。
综合以上结果，说明了基于肿瘤相关抗原及新生抗原的eTAT疫苗体系，可有效治疗皮下实体恶性黑色素瘤及血流转移性黑色素瘤，体现出良好的应用潜力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
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Claims (31)

1.复合物，其包含：
(i)蛋白组分，其包含载体肽(carrier peptide)和货物肽(cargo peptide)；其中，所述载体肽包含多聚化结构域序列、细胞穿膜肽、pH敏感融合肽以及蛋白酶识别序列；所述货物肽包含抗原肽；
(ii)核酸组分，其包含CpG佐剂。
2.权利要求1所述的复合物，其中，所述蛋白组分和核酸组分通过静电作用缀合。
3.权利要求1或2所述的复合物，其中，所述蛋白组分中的货物肽任选地通过接头融合至所述载体肽的N端或C端，例如C端。
4.权利要求1或2所述的复合物，其中，所述蛋白组分中的载体肽任选地通过接头连接至蛋白质-蛋白质结合对的第一成员形成第一蛋白，所述货物肽任选地通过接头连接至所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由共价键结合；
优选地，所述共价键为异肽键；
优选地，所述蛋白质-蛋白质结合对选自：(i)SpyTag:SpyCatcher对，(ii)SpyTag:KTag对，(iii)Isopeptag:pilin-C对，(iv)SnoopTag或SnoopTagJr:SnoopCatcher对，(v)SpyTag002:SpyCatcher002对，(vi)RrgATag、RrgATag2或DogTag:RrgACatcher对，(vii)IsopepTag-N:Pilin-N对，(viii)PsCsTag:PsCsCatcher对；
优选地，所述蛋白质-蛋白质结合对是SpyTag:SpyCatcher对；例如，所述SpyTag包含如SEQ ID NO:9所示的序列；例如，所述SpyCatcher包含如SEQ ID NO:10所示的序列。
5.权利要求4所述的复合物，其中，所述蛋白组分由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：
所述第一蛋白包含所述载体肽以及SpyTag:SpyCatcher对的第一成员，所述第一成员任选地通过第一接头与所述载体肽连接(例如连接至所述载体肽的C端)；
所述第二蛋白包含所述货物肽以及SpyTag:SpyCatcher对的第二成员，所述第二成员任选地通过第二接头与所述货物肽连接(例如连接至所述货物肽的N端)；
优选地，所述第一蛋白包含所述载体肽以及SpyCatcher，所述第二蛋白包含所述货物肽以及SpyTag。
6.权利要求1或2所述的复合物，其中，所述蛋白组分中的载体肽任选地通过接头连接至特异性结合对的第一成员形成第一蛋白，所述货物肽任选地通过接头连接至所述特异性结合对的第二成员形成第二蛋白；其中所述第一成员和第二成员由特异性结合形成的非共价键结合；
优选地，所述特异性结合对选自：抗体和其抗原、链霉亲和素和生物素。
7.权利要求1-6任一项所述的复合物，其中，所述多聚化结构域是二聚化结构域、三聚化结构域、四聚化结构域或任何更高级的多聚化结构域；
优选地，所述多聚化结构域选自：亮氨酸拉链、NOE、GCN4-P1、Delta及其任何组合；
优选地，所述多聚化结构域选自亮氨酸拉链；
优选地，所述多聚化结构域序列包含SEQ ID NO:36或37所示的序列。
8.权利要求1-7任一项所述的复合物，其中，所述细胞穿膜肽选自穿透素(Penetratin)、Tat衍生肽(例如，Tat(48-60)或Tat(47-57))、Rev(34-50)、VP22、转运肽(transportan)、Pep-1、Pep-7，及其任意组合；
优选地，所述细胞穿膜肽包含Tat衍生肽，例如Tat(48-60)；
优选地，所述细胞穿膜肽包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
9.权利要求1-8任一项所述的复合物，其中，所述pH敏感融合肽选自流感病毒HA2或其突变体(例如INF7，KALA或GALA)、蜂毒素(Melittin)，及其任意组合；
优选地，所述pH敏感融合肽包含INF7；
优选地，所述pH敏感融合肽包含如SEQ ID NO:46所示的序列。
10.权利要求1-9任一项所述的复合物，其中，所述蛋白酶识别序列包含弗林蛋白酶识别序列和/或组织蛋白酶L识别序列；
优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含R-X1-X2-R(SEQ ID NO:41)，其中，X1为任意氨基酸，X2为K或R；
优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含R-R-X1-X2-R(SEQ ID NO:42)；
优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:43所示的序列；
优选地，所述弗林蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:44所示的序列；
优选地，所述组织蛋白酶L识别序列包含SEQ ID NO:45所示的序列；
优选地，所述蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45；
优选地，所述蛋白酶识别序列包含SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
11.权利要求1-10任一项所述的复合物，其中，所述载体肽从N端至C端包含：所述细胞穿膜肽、pH敏感融合肽、蛋白酶识别序列，或者，从N端至C端包含：所述pH敏感融合肽、细胞穿膜肽、蛋白酶识别序列；并且，所述多聚化结构域序列位于所述载体肽的N端或C端，或者位于上述任何两个相邻结构域之间；
优选地，所述蛋白酶识别序列从N端至C端包含所述弗林蛋白酶识别序列和组织蛋白酶L识别序列，或者从N端至C端包含所述组织蛋白酶L识别序列和弗林蛋白酶识别序列；
优选地，所述载体肽从N端至C端包含：所述多聚化结构域序列、细胞穿膜肽、pH敏感融合肽、以及蛋白酶识别序列；
优选地，所述载体肽从N端至C端包含：所述多聚化结构域序列、pH敏感融合肽、细胞穿膜肽、以及蛋白酶识别序列。
12.权利要求1-11任一项所述的复合物，其中，所述载体肽中所包含的任何两个相邻结构域之间任选地通过肽接头连接；
优选地，所述肽接头是(GmS)n，其中m选自1-4的整数，n选自1-3的整数。
13.权利要求1-12任一项所述的复合物，其中，所述载体肽包含SEQ ID NO:3所示的序列。
14.权利要求1-13任一项所述的复合物，其中，所述货物肽包含的抗原肽源自肿瘤抗原；
优选地，所述肿瘤抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤新生抗原(neoantigen)；
优选地，所述肿瘤抗原为实体瘤抗原，例如黑色素瘤抗原、结直肠癌抗原、乳腺癌抗原、前列腺癌抗原、膀胱癌抗原、肺癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原；
优选地，所述肿瘤抗原为血液肿瘤抗原，例如淋巴瘤抗原、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)抗原、急性淋巴细胞白血病抗原、慢性骨髓性白血病抗原或急性骨髓性白血病抗原；
优选地，所述肿瘤抗原选自RepS1、Adpgk、HER2、GP100、TRP1、TRP2、M27、M30、WT1、CEA、HVP16 E7、Kras、P53、LCMV gp33、LCMV NP369、Influenza NP、HIV gag、MuLV gp70、MCMVIE1、VSV NP、HSV-1gB、HBc helper peptide。
15.权利要求1-13任一项所述的复合物，其中，所述货物肽包含的抗原肽源自病原体抗原；
优选地，所述病原体选自细菌、真菌、病毒或寄生虫。
16.权利要求1-15任一项所述的复合物，其中，所述货物肽任选地还包含与所述抗原肽连接的另外的功能肽；
优选地，所述另外的功能肽为促溶标签，例如蛋白磷酸酶1B(Ppm1b)。
17.权利要求1-16任一项所述的复合物，其中，所述蛋白组分为多聚体；
优选地，所述多聚体是二聚体、三聚体或四聚体；
优选地，所述多聚体是同源多聚体。
18.试剂盒，其包含：在分开的容器中包装的权利要求1-17任一项所述的复合物中的蛋白组分以及核酸组分。
19.权利要求18所述的试剂盒，其中，所述蛋白组分如权利要求3中定义，所述试剂盒包含：含有所述蛋白组分的第一容器以及含有所述核酸组分的第二容器。
20.权利要求18所述的试剂盒，其中，所述蛋白组分如权利要求4-6中定义，所述试剂盒包含：含有所述蛋白组分中的第一蛋白的第一容器，含有所述蛋白组分中的第二蛋白的第二容器，以及含有所述核酸组分的第三容器。
21.试剂盒，其包含：
(i)核酸分子或载体，其包含编码权利要求1-17任一项所述的复合物中的蛋白组分的核苷酸序列；以及，
(ii)CpG佐剂。
22.权利要求21所述的试剂盒，其中，所述蛋白组分如权利要求3中定义，(i)所述的核酸分子或载体包含编码所述蛋白组分的核苷酸序列；
优选地，所述试剂盒包含：含有(i)所述核酸分子或载体的第一容器，以及含有CpG佐剂的第二容器。
23.权利要求21所述的试剂盒，其中，所述蛋白组分如权利要求4-6任一项中定义，(i)所述的核酸分子或载体包含：编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列，以及编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列；
优选地，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列存在于相同或不同的核酸分子或载体上；
优选地，所述试剂盒包含：含有包含所述第一核苷酸序列的载体的第一容器，含有包含所述第二核苷酸序列的载体的第二容器，以及含有CpG佐剂的第三容器。
24.制备权利要求1-17任一项所述的复合物的方法，其包括：
(1)提供所述复合物中的蛋白组分和核酸组分；
(2)使所述蛋白组分与核酸组分混合以形成复合物。
25.权利要求24所述的方法，其中，所述蛋白组分如权利要求3中定义，步骤(1)包括：将编码所述蛋白组分的核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述蛋白组分，其中所述蛋白组分任选地以多聚体形式存在。
26.权利要求24所述的方法，其中，所述蛋白组分如权利要求4-6任一项中定义，步骤(1)包括：(a)提供所述第一蛋白和第二蛋白；(b)将两者混合以形成连接产物，由此提供蛋白组分；
优选地，将编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列或包含所述第一核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述第一蛋白，其中所述第一蛋白任选地以多聚体形式存在；
优选地，将编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列或包含所述第二核苷酸序列的核酸分子或载体引入宿主细胞，在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述第二蛋白。
27.药物组合物，其包含权利要求1-17任一项所述的复合物；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物是疫苗。
28.权利要求1-17任一项所述的复合物或权利要求27所述的药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中诱导免疫应答的制剂中的用途；
优选地，所述制剂用于在受试者(例如人)中诱导抗原特异性免疫应答；
优选地，所述复合物中包含的抗原肽源自肿瘤抗原，所述制剂用于在受试者(例如人)中诱导抗肿瘤免疫应答；
优选地，所述复合物中包含的抗原肽源自病原体抗原，所述制剂用于在受试者(例如人)中诱导针对病原体的免疫应答。
29.权利要求1-17任一项所述的复合物或权利要求27所述的药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的制剂中的用途；
优选地，所述肿瘤为实体瘤，例如黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、头颈癌；
优选地，所述肿瘤为血液肿瘤，例如淋巴瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤或浆细胞骨髓瘤)、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病或急性骨髓性白血病；
优选地，所述肿瘤为转移性肿瘤；
优选地，所述受试者是未患肿瘤的受试者或已患肿瘤的受试者；
优选地，所述复合物或药物组合物单独施用或与另外的治疗剂(抗肿瘤剂)联合施用；
优选地，所述复合物或药物组合物与免疫检查点抑制剂(例如PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体)联合施用。
30.权利要求1-17任一项所述的复合物或权利要求27所述的药物组合物在制备用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗感染的制剂中的用途；
优选地，所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染；
优选地，所述受试者是未患感染的受试者或已患感染的受试者。
31.权利要求1-17任一项所述的复合物或权利要求27所述的药物组合物在制备用于将活性剂靶向递送至受试者中的淋巴器官的制剂中的用途；
优选地，所述淋巴器官是淋巴结；
优选地，所述制剂用于在受试者(例如人)中诱导免疫应答、预防和/或治疗肿瘤、或预防和/或治疗感染。
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