CN119233984A - 短载脂蛋白e模拟肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了8‑17个氨基酸长的ApoE模拟肽，包括ApoE受体结合区或其部分，以及连接所述肽的至少两个非连续氨基酸的一个或更多个共价连接。还提供了使用所述肽治疗血脂异常病症，例如高甘油三酯血症或高胆固醇血症，或病毒感染的方法。

Description

短载脂蛋白E模拟肽及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年5月5日提交的美国临时申请No.63/338,654的优先权，该申请的全部内容通过引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及载脂蛋白E(ApoE)模拟肽及其使用方法，特别是用于治疗血脂异常或病毒感染。

背景

载脂蛋白E(ApoE)通过作为低密度脂蛋白受体(LDLR)的配体，促进肝脏清除富含甘油三酯的脂蛋白残余物。此外，它含有几个两亲性螺旋，可以介导胆固醇外流。ApoE包括由铰链区连接的两个结构域。N-末端结构域包括四个α-螺旋。螺旋4负责与受体和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合。C-末端结构域包括与脂质结合并通过ABC Al转运蛋白介导胆固醇外流的两亲性α-螺旋。只有脂质结合的ApoE以高亲和力与LDL相关受体结合，因为受体结合区域在无脂质形式下被屏蔽。

鉴于ApoE的功能，许多ApoE模拟肽已被设计为潜在的治疗药物。这些通常包括受体结合区和脂质结合区(Wolska等人，Cells 10：597，2021)。虽然一些ApoE模拟肽正处于早期临床试验中，但仍然需要具有更好疗效、安全性和其他特性的ApoE模拟多肽。

概述

本文公开了ApoE模拟肽和包括ApoE模拟肽的融合蛋白。在一些实例中,所公开的肽和融合蛋白与之前的ApoE模拟肽相比具有改进的特性。

在一些方面，ApoE模拟肽的长度为8-17个氨基酸，包括ApoE的受体结合区(例如SEQ ID NO:34)或其部分，并包括连接该肽的至少两个非连续氨基酸的一个或更多个共价连接。在一些实例中，该肽包括两亲性螺旋结构域，并且连接至少两个不连续氨基酸的所述共价连接位于所述两亲性螺纹结构域的疏水侧的两个氨基酸之间。一个或更多个共价连接可以是烃钉合(hydrocarbon staple)、烃缝合(hydrocarbon stitch)、内酰胺桥或二硫键。在一些方面，共价连接是烃钉合(hydrocarbon staple)、烃缝合(hydrocarbon stitch)，包含(S)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(S5)、(S)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(S8)、双戊烯基甘氨酸(B5)、(R)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(R5)和(R)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(R8)中的一个或更多个，或其任何组合。

在一些方面，所公开的ApoE模拟肽包括一个或更多个额外的修饰。在一些实例中，所述修饰包括一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失；C-末端酰胺化；N-末端酰化；一种或更多种D-异构体氨基酸；修饰的或非天然氨基酸；N-末端脂肪酸；C-末端脂肪酸；或其两种或更多种的组合。在特定实例中，该肽在N-或C-末端包括辛酸或肉豆蔻酸修饰。

在特定实例中，ApoE模拟肽包含与SEQ ID NO:2-4、7-12、14-21和30-33中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者包含SEQ ID NO:2-4、7-12、14-21和30-33中任一个氨基酸序列或由其组成。

在某些方面，ApoE模拟肽结合脂蛋白(例如低密度脂蛋白(LDL)、中密度脂蛋白(IDL)、高密度脂蛋白(HDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)、脂蛋白(a)(Lp(a))、乳糜微粒和乳糜微粒残留物中的一种或更多种)。在其他方面，ApoE模拟肽与肝素或硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合。

还提供了包括所公开的ApoE模拟肽的融合蛋白，例如与第二肽共价连接的ApoE模拟肽。在一些方面，融合蛋白包含与人新生儿Fc受体(FcRn)IgG结合位点或FcRn-白蛋白结合位点连接的公开的ApoE模拟肽。在一些实例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者融合蛋白包含SEQ ID NO:22-25中任一个中的氨基酸序列或由其组成。

还提供了包含一种或更多种公开的ApoE模拟肽或融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，该组合物配制用于静脉内施用、皮下施用或口服施用。

本文提供了用公开的ApoE模拟肽或融合蛋白治疗受试者的方法。在一些方面，该方法包括治疗患有血脂异常的受试者，例如，通过向受试者施用有效量的公开的ApoE模拟肽或融合蛋白来降低受试者(如患有高甘油三酯血症的受试者)的甘油三酯水平或降低受试者(如患有高胆固醇血症的受试者)的胆固醇水平。在其他方面，该方法包括通过向受试者施用有效量的所公开的ApoE模拟肽或融合蛋白来治疗受试者(例如患有β冠状病毒感染，例如SARS-CoV-2感染的受试者)的病毒感染。在特定实例中，ApoE模拟肽或融合蛋白被静脉内、皮下或口服施用于受试者。

还提供了制备所公开的ApoE模拟肽或融合蛋白的方法。在某些方面，肽或融合蛋白是通过重组产生的，例如通过化学合成。

还提供了减少样品中脂蛋白的方法。在一些方面，该方法包括在足以使脂蛋白与一种或更多种肽结合的条件下，使含有脂蛋白的样品与一种或者多种所公开的ApoE模拟肽接触，从而形成肽/脂蛋白复合物，以及在足以使肽/脂蛋白蛋白复合物与糖胺聚糖结合的条件下使肽/脂肪蛋白复合物和糖胺聚糖(如硫酸葡聚糖、肝素或硫酸乙酰肝素)接触，从而形成肽/脂肪酸/糖胺聚糖复合物。该方法还包括从样品中去除肽/脂蛋白/糖胺聚糖复合物。在一些例子中，样品是血浆，例如来自患有高胆固醇血症受试者的血浆。

通过参考附图进行的以下详细描述，本公开的上述和其他特征将变得更加明显。

附图简述

图1是由ApoE的受体结合区(SEQ ID NO:34)形成的阳离子两亲性α螺旋的示意图。

图2是ApoE受体结合区的一部分的示例性烃钉合(stapled)ApoE模拟肽(SEQ IDNO:2)的示意图。

图3是ApoE受体结合区的示例性烃钉合(stapled)ApoE模拟肽(SEQ ID NO:14)的示意图。

图4是ApoE受体结合区的示例性烃缝合(stitched)的ApoE模拟肽(SEQ ID NO:15)的示意图。

图5是具有N-末端肉豆蔻酸修饰的ApoE氨基酸141-150的烃钉合(stapled)的ApoE模拟肽(SEQ ID NO:29)的示意图。

图6A和6B是显示用所示肽处理的HepG2细胞中LDL摄取的图。

图7A和7B显示用所示肽处理的HepG2细胞中VLDL摄取(图7A)和HDL摄取(图7B)。

图8是显示用所示肽处理的LDLR-ko HepG2细胞中LDL摄取的图。

图9A-9C显示用OctaC-E139-150(图9A)或Octa-N-E139-150(图9B)处理的野生型和LDLR-ko HepG2细胞中的LDL摄取。图9C显示由MyrN-E139-150肽介导的LDLR-KO HepG2细胞中的LDL摄取。

图10A和10B显示用所示肽治疗的小鼠的血浆总胆固醇(图10A)和甘油三酯(图10B)。时间为施用肽之前(预采血，prebleed)或施用肽之后1、3或6小时。*与对照组相比，p<0.01。

图11是显示用所示ApoE肽处理的HeLa mCC1a细胞中小鼠肝炎病毒(MHV)GFP荧光减少的图。

图12是所示肽在20℃、100μM水中的圆二色性(CD)光谱。

图13显示未修饰肽与酰化钉合肽(acylated stapled peptides)对1,2,二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)磷脂囊泡的增溶。

图14A和14B显示野生型HepG2细胞在10μM肽存在下的LDL摄取(图14A)和在5μM肽的存在下的VLDL摄取(图14B)。Ac-hE18A-NH2被纳入作为对照(参见，例如，Datta等人，Biochemistry 39：213-220，2000)。

图15是显示在所示肽和浓度存在下的细胞存活率的图。

图16显示LDL、MyrN-E141-150-amL或预复合的LDL/MyrN-E1 41-150-amL与肝素覆盖的生物层干涉生物传感器表面的结合。

图17显示用LDL或LDL+MyrN-E141-150-amL肽的肝素色谱。在基线时NaCl浓度为0.15M，并施加了从0.15M到2M的线性梯度(由虚线显示)。

图18A-18C显示由OctaC-E139-150肽(图18A和18B)或MyrN-E141-150-amL肽(图18C)介导的肝素酶处理的野生型HepG2细胞(图18A与18C)或LDLR-KO HepG2细胞的LDL摄取(图18B)。

图19显示在MyrN-E141-150-amL肽存在的情况下，肝素对野生型HepG2细胞中LDL摄取的影响。

图20A和20B显示MyrN-E139-150和OctaN-E139-150肽对ApoE KO小鼠血浆胆固醇(图20A)和甘油三酯(图20B)的影响。

图21A和21B显示MyrN-E141-150-amL(图21A)和OctaN-E139-150(图21B)肽对LDLR-KO小鼠血浆胆固醇的影响。

序列表

本文提供的任何核酸和氨基酸序列或所附的序列表使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写来显示，如37C.F.R.§1.822中所定义。在至少一些情况下，仅显示每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为通过对所显示的链的任何引用而包括在内。

SEQ ID NO:1-21是示例性的ApoE模拟肽。

SEQ ID NO:22-25是示例性的ApoE模拟肽融合蛋白。

SEQ ID NO:26是示例性成熟人ApoE蛋白的氨基酸序列：

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

SEQ ID NO:27是示例性的人新生儿Fc受体(FcRn)IgG结合位点：

RF(青霉胺)TGHFG(N-甲基-甘氨酸)(N-甲基-亮氨酸)YPC-6-氨基己酸

SEQ ID NO:28是示例性的人新生儿Fc受体(FcRn)白蛋白结合位点：

VMHCFWDEEFKCDYG-6-氨基己酸

SEQ ID NO:29是示例性肉豆蔻酰化ApoE 141-150肽。

SEQ ID NO:30-33是另外的示例性ApoE模拟肽。

SEQ ID NO:34是示例性ApoE受体结合区(成熟人ApoE蛋白的氨基酸134-150)：RVRLASHLRKLRKRLLR

SEQ ID NO:35是ApoE受体结合区的一部分(成熟人ApoE蛋白的氨基酸139-150)：SHLRKLRKRLLR

SEQ ID NO:36是ApoE受体结合区的一部分(成熟人ApoE蛋白的氨基酸141-150)：LRKLRKRLLR

SEQ ID NO:37是ApoE受体结合区的一部分(成熟人ApoE蛋白的氨基酸141-148)：LRKLRKRL

详细描述

本文提供了ApoE模拟肽。ApoE肽通过螺旋的疏水侧(也含有一个或更多个烃钉合(hydrocarbon staples))和/或连接到N或C末端的酰基链与脂蛋白结合。同时，螺旋亲水侧的带正电残基与硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)和受体，如LDLR和可能的LDLR相关蛋白-1(LRP1)相互作用。

在一些实例中，所公开的肽提供优于先前ApoE模拟物(如Wolska等人，Cells 10:597，2021中描述的那些)的优点。优点包括以下一项或多项：长度更短、效力更强、与ApoE的天然序列更相似、增加的蛋白水解抗性、增加的血浆半衰期和增加的口服生物利用度。如本文所述，所公开的ApoE模拟物降低ApoE-ko小鼠的血浆总胆固醇和甘油三酯，也降低LDLR-ko小鼠的血浆总胆固醇。因此，它们可用于治疗血脂异常病症，如高胆固醇血症或高甘油三酯血症。此外，所公开的肽减少了小鼠肝炎病毒，β冠状病毒(如SARS-CoV-2)的原型的复制，证明了它们作为潜在抗病毒剂的有用性。

I.术语

除非另有说明，技术术语均按惯例使用。分子生物学中许多常见术语的定义可以在Krebs et al.(eds.),Lewin’s genes XII,published by Jones&Bartlett Learning,2017中找到。如本文中所用，单数形式“a”、“an”和“the”既指单数也指复数，除非上下文另有明确说明。例如，术语“肽”包括单数或复数肽，并且可被视为等同于短语“至少一种肽”。如本文中所用，术语“包含”表示“包括”。还应理解的是，除非另有说明，否则为核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且是出于描述目的而提供的。

尽管可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料，但本文描述了特定合适的方法和材料。在冲突的情况下，将以本说明书(包括术语解释)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。

为了便于审阅本公开的各个方面，对特定术语提供如下解释：

烷基：指具有1至25个(C_1-25)或更多碳原子的饱和脂肪族烃基，例如1至10个(C_1-10)碳原子、1至4个(C_1-4)碳原子，1至14个(C_1-14)碳原子或2至22个(C_2-22)碳原子或者6至18个(C_6-18)碳原子。烷基部分可以被取代或未被取代。举例来说，该术语包括直链和支链烃基，如甲基(CH₃)、乙基(-CH₂CH₃)、正丙基(-CH₂CH₂CH₃)、异丙基(-CH(CH₃)₂)、正丁基(-CH₂-CH₂CH₂CH₃)、异丁基(-CH₂CH₂(CH₃)₂)、仲丁基(-CH(CH₃)(CH₂CH₃))、叔丁基(-C(CH₃)₃)、正戊基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、新戊基(-CH₂C(CH₃)₃)、己基(C₆H₁₃)、庚基(C₇H₁₅)、辛基(C₈H₁₇)、癸基(C₁₀H₂₁)、十二烷基(C₁₂H₂₅)、十四烷基(C₁₄H₂₉)、十六烷基(C₁₆H₃₃)、十八烷基(C₁₈H₃₇)或二十烷基(C₂₀H₄₁)。

两亲性：两亲性分子包含疏水(非极性)和亲水(极性)基团。两亲性分子的一个例子是两亲性肽。两亲性肽也可以被描述为螺旋肽，其在螺旋的一个面上具有亲水性氨基酸残基而在相反面上具有疏水性氨基酸残基。在一些实例中，本文所描述的肽将在适当条件下在体外或体内形成两亲性螺旋。

载脂蛋白E(ApoE)：一种299个氨基酸的蛋白质，在清除富含甘油三酯的脂蛋白和胆固醇外流中发挥作用。ApoE存在三种不同的亚型(ApoE2、ApoE3和ApoE4)，它们在氨基酸位置112和158处有所不同。ApoE2与III型高脂蛋白血症相关，而ApoE4是阿尔茨海默病的危险因素。ApoE突变与家族性异常β脂蛋白血症或III型高脂蛋白血症有关，其特征是由于乳糜微粒和脂蛋白的清除受损，导致血浆胆固醇和甘油三酯升高。

除非上下文另有明确说明，否则术语ApoE包括来自任何生物体的任何ApoE基因、cDNA、mRNA或蛋白质。ApoE的核酸和蛋白质序列可公开获得。例如，GenBank登录号NM_000041.4公开了人ApoE核酸序列，并且GenBank注册号NP_000032.1公开了人ApoE蛋白序列，两者都通过引用并入本文，如GenBank于2022年5月5日提供的。在其他例子中，ApoE包括蛋白质的成熟(加工)形式，例如，缺乏信号序列。SEQ ID NO:26是示例性成熟人ApoE蛋白的氨基酸序列。

冠状病毒：一个可以感染人类和非人类动物的正链单链RNA病毒大家族。冠状病毒的名字来源于其表面的冠状刺。病毒包膜由含有病毒膜(M)、包膜(E)和刺突(S)蛋白的脂质双层组成。大多数冠状病毒会引起轻度至中度上呼吸道疾病，如普通感冒。

β冠状病毒是冠状病毒的一个属。已经出现了三种可导致人类严重疾病和死亡的β冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、SAR-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。其他感染人类的β冠状病毒包括人类冠状病毒HKU1(HKU1-CoV)和人类冠状病毒OC43(OC43-CoV)。

结构域：蛋白质的结构域是蛋白质的一部分或片段，具有共同的结构、理化和功能特征；例如，疏水性、极性、球状、螺旋结构域或特性，例如α螺旋结构域，如两亲性螺旋结构域；或受体结合结构域(如ApoE的受体结合结构区)。

血脂异常病症：与血液中任何或所有脂质或脂蛋白含量改变相关的病症。血脂异常病症包括，例如，高脂血症、高脂蛋白血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、HDL缺乏症、apoe缺乏症、apoA-I缺乏症和心血管疾病(如冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和再狭窄)。

家族性高胆固醇血症(FH)：一种导致血浆LDL水平非常高的遗传性病症。FH影响大约每200-250人中的1人。LDLR的突变是FH的主要原因，LDLR是肝脏中负责LDL摄取的主要受体。影响LDLR功能的突变会导致循环中LDL清除率降低。LDL水平极高的FH患者可能需要LDL单采术(LDL-apheresis)治疗。

融合：通过共价键连接。在一些实例中，“融合”是指通过重组方式将两种多肽制成一个连续的多肽分子。例如，融合蛋白是包括连接在一起的两个单独多肽的蛋白质。

烃钉合(hydrocarbon staple)或缝合(stitch)：肽中至少两个部分之间的碳-碳键，在一些实例中，其稳定了α螺旋结构。烃钉合(hydrocarbon staples)都是由α,α-二取代的非天然氨基酸形成的全烃交联，包括末端烯烃链。在一些实例中，非天然氨基酸是不连续的，例如，被3或6个氨基酸隔开。烃缝合(hydrocarbon stitching)是指在中间位置形成具有共同附着点的两个烃钉合(hydrocarbon staples)(例如，使用三种非天然氨基酸形成两个钉合(staples))。可用于形成烃钉合(hydrocarbon staples)或缝合(stitches)的示例性非天然氨基酸包括(S)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(S5)、(S)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(S8)、(R)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(R5)，和(R)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(R8)，以任意组合。此外，双戊烯基甘氨酸(B5)可用于形成烃缝合(hydrocarbon stitches)，例如，允许形成两个以B5为共同的附着点的钉合(见图4中烃缝合(hydrocarbon stitches)的示例)。例如，Walensky和Bird，J.Med.Chem.57:6275-6288，2014和Hilinski等人，J.Am.Chem.Soc.136:12314-12322，2014年。

抑制或治疗疾病：抑制疾病、病症或病况的全面发展，例如，在有血脂异常病症或病毒感染等疾病风险的受试者中。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。如本文所使用的，术语“改善”，关于疾病、病理状况或症状，是指治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可以被证明，例如通过易感受试者中疾病临床症状的延迟发作、疾病部分或全部临床症状的严重程度减轻、疾病进展减缓、疾病复发次数减少、受试者整体健康或福祉的改善，或通过特定疾病特有的其他参数。

分离的：“分离的”生物成分(如核酸分子或蛋白质)是指从该成分所出现的环境中的其他生物成分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本上分离或纯化的成分。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸或蛋白质。

连接子或连接：通过共价键、或通过离子键、范德华键或氢键连接其他两个分子的分子。在特定实例中，连接子包括烃钉合(hydrocarbon staple)或烃缝合(hydrocarbonstitch)。在其他实例中，连接子是肽键。

脂蛋白：含有蛋白质和脂质的生化组合物，与蛋白质结合，使脂肪能够在细胞内外的水中移动。脂蛋白颗粒有五大类，按分子大小从大到小依次为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。HDL中蛋白质与胆固醇的比例最高；其最丰富的载脂蛋白是apoA-I和apoA-II。LDL含有载脂蛋白B，其核心由亚油酸酯组成，包括酯化和非酯化胆固醇分子。LDL颗粒的直径约为22nm，质量约为300万道尔顿。脂蛋白a(Lp(a))是脂蛋白亚类；脂蛋白a由LDL样颗粒和特定的载脂蛋白(a)(apo(a))组成，该载脂蛋白与LDL样颗粒的载脂蛋白B共价结合。

肽、多肽或蛋白质：其中单体是通过例如酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文使用的术语“肽”或“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并且包括修饰的序列。术语“肽”具体旨在用于涵盖天然存在的肽以及重组或合成产生的肽。术语“氨基酸”是指天然存在的α氨基酸、非天然α氨基酸、天然β氨基酸和非天然β氨基酸，以及修饰的氨基酸(例如，通过添加烃基基团、羟基基团、磷酸基团、脂肪酸基团、连接子或官能团进行修饰)。术语“残基”或“氨基酸残基”包括并入肽、多肽或蛋白质中的氨基酸。

非天然氨基酸包括但不限于4-羟基脯氨酸、锁链素(desmosine)、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正缬氨酸、4-(R)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基-L-苏氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、1-氨基-环丙烷甲酸、1-氨基-2-苯基-环丙烷甲酸、1-氨基-环丁烷甲酸、4-氨基-环戊烯甲酸、3-氨基-环己烷甲酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-羧酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨丁酸、2-氨基庚二酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻位、间位和对位取代的苯丙氨酸、二取代的苯丙氨酸、取代的酪氨酸和他汀类。此外，氨基酸可以被衍生化以包括羟基化、磷酸化、磺化、酰化或糖基化的氨基酸残基。

在一些方面，该修饰涉及用一种或更多种氨基酸取代具有相似理化和/或结构特性的氨基酸(例如，“保守”取代)。保守取代的例子如下所示。

保守取代通常保持(a)取代区域中肽骨架的结构，例如，为螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)大部分侧链。

在其他方面，一个或更多个取代可以是非保守的，例如以下变化：其中(a)亲水性残基，例如丝氨酰基或苏酰基取代疏水性残基(或被其取代)，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基(或被其取代)；(c)具有正电性侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酸基，取代电负性残基(或被其取代)，例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有大分子侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代不具有侧链的残基(或被其取代)，例如，甘氨酸。

药学上可接受的载体：本领域普通技术人员已知可用于本公开的药学上可接收的载体。例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Adejare(Ed.)AcademicPress,London,United Kingdom,23^rd Edition(2021)，其描述了适用于本文公开的肽的药物递送的组合物和制剂。

一般而言，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，胃肠外制剂通常包括可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可以包括，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体外，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。

磷脂：磷脂由一个水溶性极性头部和两个不溶于水的非极性尾部(通过带负电荷的磷酸基团)连接组成。两个尾部都由脂肪酸组成，每个尾部约14至约24个碳基团长。当置于水性环境中时，磷脂形成双层或胶束，疏水尾部相对排列。这形成了一个两侧都有亲水头的膜。在一些例子中，磷脂是一种脂质，是动物细胞膜的主要成分。

纯化：术语纯化不需要绝对纯度；相反，它是一个相对的术语。因此，例如，纯化的化合物制剂是其中化合物比在其生成环境中更富集的制剂，例如在细胞内或生化反应室中。在一些方面，化合物制剂被纯化以使得化合物占制剂含量的至少50％。

重组：重组核酸或蛋白质是指具有非天然的序列或由两个分离的序列片段人工组合而成的序列。这种人工组合可以通过化学合成或通过人工操纵分离的核酸片段来实现，例如通过基因工程技术。在一些实例中，重组蛋白是由重组核酸分子编码的蛋白。

受试者：活的多细胞脊椎动物，这一类别包括人、兽医学和实验室受试者，包括人和非人哺乳动物。

治疗有效量：指定试剂(或试剂组合)的量，足以在用该试剂治疗的受试者中实现所需效果，例如，足以预防、治疗、减少和/或改善病症或疾病的症状和/或根本病因的量。在某些方面，“有效量”是指足以降低受试者血浆胆固醇和/或甘油三酯水平和/或治疗或抑制血脂异常病症或病毒感染的量。

II.ApoE模拟肽

本文公开了ApoE模拟肽。该肽包括全部或部分的ApoE受体结合区，长度为8-17个氨基酸，并包括连接该肽的至少两个非连续氨基酸的一个或更多个共价连接。在一些方面，ApoE模拟肽增加细胞脂蛋白摄取，降低受试者的血清甘油三酯水平，降低受试者的血清总胆固醇水平，或其两种或多种的组合。

所公开的ApoE模拟肽包括ApoE的受体结合区(例如，SEQ ID NO:34)、修饰的ApoE受体结合区(例如，SEQ ID NO:34的氨基酸序列，其中一个或更多个氨基酸被非天然氨基酸取代)或其部分。在一些方面，肽的长度为8至17个氨基酸(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸长)。在特定实例中，肽的长度为8、10、12或17个氨基酸。在一些方面，肽的长度为17个氨基酸并且包括SEQ ID NO:34的氨基酸或其修饰形式。在其他方面，该肽的长度为12个氨基酸并且包括SEQ ID NO:35或其修饰形式。在另外的方面，该肽的长度为10个氨基酸并且包括SEQ ID NO:36的氨基酸或其修饰形式。在另外的方面，该肽的长度为8个氨基酸并且包括SEQ ID NO:37的氨基酸或其修饰形式。在任何公开的肽中，序列中的一个或更多个(例如1、2、3、4或更多个)氨基酸可以被能够形成烃钉合(hydrocarbon staple)或缝合(stitch)的非天然氨基酸取代。

肽包括肽中两个不连续氨基酸之间的一个或更多个(例如1、2、3或4个)共价连接。在一些方面，肽包括肽中一对不连续氨基酸之间的一个共价连接。在其他方面，肽包括两个共价连接，每个共价连接位于肽中两对不同的不连续氨基酸之一之间。在又进一步的方面，该肽包括肽中三个不连续氨基酸之间的两个共价连接，其中一个不连续的氨基酸与另外两个不连续的氨基酸中的每一个具有共价连接。在一些方面，共价连接是烃钉合(hydrocarbon staple)、烃缝合(hydrocarbon stitch)、二硫键或内酰胺桥(例如，由赖氨酸ε-氨基与谷氨酸或天冬氨酸侧基羧基环化形成)，或其他稳定螺旋形成的化学键。

当存在两个或多个共价连接时，共价连接可以是相同的或不同的共价连接。在一些具体实例中，所公开的肽包括一个烃钉合(hydrocarbon staple)、两个烃钉合(hydrocarbon staple)、一个烃缝合(hydrocarbon stitch)(包括两个烃缝合)或一个烃钉合(hydrocarbon staple)和一个内酰胺桥。在一些实例中，共价连接为肽提供了一种或更多种改进的性质，包括α螺旋结构的稳定、与脂蛋白结合的改善和对蛋白水解的抗性中的一种或几种。

在具体方面，所公开的肽包括一种或更多种烃钉合(hydrocarbon staple)或烃缝合(hydrocarbon stitch)。烃钉合(hydrocarbon staple)是两个部分之间形成的全烃交联，如包括末端烯烃链的α，α-二取代的非天然氨基酸。烃缝合(hydrocarbon stitch)由两个在中间位置具有共同附着点的烃钉合(hydrocarbon staple)组成。因此，在一些实例中，ApoE肽中的至少两个(例如至少2、3、4或更多个)非连续氨基酸被非天然氨基酸取代，该非天然氨基酸在连接时能够形成烃钉合(hydrocarbon staple)。在一些实例中，非连续氨基酸由3或6个氨基酸分隔。

可用于形成烃钉合(hydrocarbon staples)或缝合(stitches)的示例性非天然氨基酸包括(S)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(S5)、(S)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(S8)、(R)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(R5)、(R)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(R8)、双-戊烯基甘氨酸(B5)、(S)-戊烯基丙氨酸、(S)-辛烯基丙氨酸、(R)-戊烯基丙氨酸和(R)-辛烯基丙氨酸，其任意组合。在一些实例中，选择非天然氨基酸，使其能够形成烃钉合(hydrocarbon staple)。因此，例如，如果两个非天然氨基酸被2或3个氨基酸隔开，则烃钉合(hydrocarbon staple)是“短”的，并且连接是在两个戊烯基修饰的氨基酸之间(例如S5和S5之间、R5和R5之间、S5和R5之间或R5和S5之间)。如果两个非天然氨基酸被6个氨基酸隔开，则烃钉合(hydrocarbonstaple)是“长”的，连接是在戊基修饰的氨基酸和辛烯基修饰的氨基酸之间(例如R8和S5之间或S8和R5之间)。在其他实例中，选择非天然氨基酸使其能够形成烃缝合(hydrocarbonstitch)。在一个具体实例中，烃缝合(hydrocarbon stitch)的形成包括辛烯基修饰的氨基酸与双戊烯基甘氨酸残基隔开6个氨基酸，其又与戊烯基修饰氨基酸隔开3个氨基酸(如R8-B5-R5、R8-B5-S5、S8-B5-S5或S8-B5-R5)。在其他实例中，烃缝合(hydrocarbon stitch)的形成包括戊炔基修饰的氨基酸与双戊烯基甘氨酸残基隔开3个氨基酸，其又与辛烯基修饰氨基酸隔开6个氨基酸(如S5-B5-S8、S5-B5-R8、R5-B5-R8或R5-B5-S8)。在另一个实例中，烃缝合(hydrocarbon stitch)的形成包括辛烯基修饰的氨基酸与双戊烯基甘氨酸残基隔开6个氨基酸，其又与第二个辛烯基修饰的氨基酸隔开6个氨基酸(如R8-B5-S8、S8-B5-R8、R8-B5-R8或S8-B5-S8)。在另一个例子中，烃缝合(hydrocarbon stitch)的形成包括戊炔基修饰的氨基酸与双戊烯基甘氨酸残基隔开3个氨基酸，其又与戊炔基修饰的氨基酸隔开3个氨基酸(如R5-B5-S5、R5-B5-R5、S5-B5-R5或S5-B5-S5)。

本公开内容还涵盖除上述共价连接以及产生这种连接所需的任何修饰之外的一种或更多种额外的修饰的肽。在一些方面，肽包括一种或更多种修饰，包括与天然存在的ApoE氨基酸序列相比，或与非天然存在的氨基酸相比，用另一种天然存在的氨基残基对ApoE模拟肽中的一个或更多个氨基酸进行添加、缺失和/或取代。在一些实例中，亮氨酸(例如对应于SEQ ID NO:26的亮氨酸149的亮氨酸)可以用α-甲基-亮氨酸、N-甲基-亮氨酸或β-亮氨酸代替。在其他实例中，精氨酸(例如对应于SEQ ID NO:26的精氨酸150的精氨酸)可以用高精氨酸取代。在进一步的实例中，肽中的一个或更多个赖氨酸残基可以用精氨酸或高精氨酸取代。在一些实例中，取代可以使肽更能抵抗蛋白水解，增加血浆半衰期，增加生物利用度，或其两种或多种的组合。

除了天然存在的基因编码氨基酸之外，所公开的肽中的一个或更多个氨基酸残基可以被天然存在的非编码氨基酸和/或合成氨基酸取代。在一些方面，取代可以增加脂质结合，增加对蛋白水解的抗性，增加口服生物利用度，或其组合。在一些实例中，此类氨基酸包括赖氨酸ε-氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧基的烷基化；谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺；β-丙氨酸和其他omega-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸；ε-氨基己酸；δ-氨基戊酸；N-甲基甘氨酸或肌氨酸；鸟氨酸；瓜氨酸；青霉胺；叔丁基丙氨酸；叔丁基甘氨酸；N-甲基异亮氨酸；苯基甘氨酸；环己基丙氨酸；正亮氨酸；萘丙氨酸；4-氯苯丙氨酸；2-氟苯丙氨酸；3-氟苯丙氨酸；4-氟苯丙氨酸；α-甲基-亮氨酸；N-甲基-亮氨酸；β-亮氨酸；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸；β-2-噻吩基丙氨酸；蛋氨酸亚砜；高精氨酸；N-乙酰基赖氨酸；α-甲基-赖氨酸；2,4-二氨基丁酸；2,3-二氨基丁酸；对氨基苯丙氨酸；N-甲基缬氨酸；同型半胱氨酸；高苯丙氨酸；高丝氨酸；羟脯氨酸；高脯氨酸；N-甲基化氨基酸；类肽(其中侧链基团附着在肽骨架的氮原子上，而不是附着在α-碳上)；以及β-肽(其中氨基与β碳而不是α碳结合)。在一个具体实例中，肽中的一个或更多个亮氨酸残基(例如对应于SEQ ID NO:26的氨基酸149的亮氨酸)被α-甲基-亮氨酸或N-甲基-亮氨酸取代。

虽然在某些方面，所公开的ApoE模拟肽的氨基酸是L-氨基酸，但在其他方面，一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，或全部)L-氨基酸被D-氨基酸取代(例如L-Leu→D-Leu)。在一些实例中，包括一种或更多种D-氨基酸可以使肽对蛋白水解更具抗性，增加血浆半衰期，和/或增加口服生物利用度。在一些方面，肽中的所有氨基酸都是D-氨基酸。在其他方面，一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)是D-氨基酸。在一些实例中，L-Lys变为D-Arg或D-高精氨酸，或者L-Arg变为D-Lys或D-高精氨酸。在一些实例中，至少1、2或3个C-末端氨基酸是D-氨基酸。具体的非限制性实例包括SEQID NO:7-10、32和33中任一个的肽。在另外的实例中，修饰或非天然存在的氨基酸、非编码氨基酸或合成氨基酸(例如上文所描述的那些)可以是D-氨基酸。

在进一步的方面，所公开的肽可以包括N-末端修饰、C-末端修饰或两者。在一些实例中，肽包括N-末端酰化、C-末端酰胺化或两者。在其他实例中，该修饰包括N-末端或C-末端脂肪酸，例如，以增加肽与脂蛋白的结合。在一些实例中，脂肪酸是C6-C18脂肪酸(从己酸到硬脂酸)。在具体实例中，脂肪酸是辛酸(也称为辛酸)或肉豆蔻酸。

在其他实例中，N-末端修饰包括脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基、受约束烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和N-酰基修饰。示例性的C末端修饰包括酰胺、低级烷基酰胺、受约束烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)烷基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。

在一些方面，所公开的ApoE模拟肽包括与SEQ ID NO:2-4、7-12、14-21和30-33中任一个的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列。在其他实例中，ApoE模拟肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2-4、7-12、14-21和30-33中任一个的氨基酸序列或由其组成。表1中提供了示例性的烃钉合(hydrocarbon stapled)或缝合(stitched)的ApoE模拟肽。

表1.示例性ApoE肽

Ac:N-末端酰化

NH2：C-末端酰胺化

S5：(S)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸

R8：(R)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸

S8：(S)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸

R5：(R)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸

B5：双戊烯基甘氨酸

小写表示D-氨基酸

还提供了融合蛋白，其包括与另外的肽连接或融合的公开的ApoE模拟肽。在一些方面，ApoE模拟肽与可以提高口服生物利用度和/或增加肽血浆半衰期的肽或修饰肽连接。额外的肽可以融合到ApoE模拟肽的N-末端或ApoE模拟多肽的C-末端。在一些方面，ApoE模拟肽和另外的肽是连续的(例如，直接连接)。在其他方面，ApoE模拟肽和附加肽通过接头连接，例如肽接头。在一些实例中，肽接头为1、2、3、4或更多个氨基酸长，例如1-3个甘氨酸残基或脯氨酸残基。在其他实例中，接头是双功能接头(例如琥珀酰亚胺)、二硫键、6-氨基己酸或非编码氨基酸，例如异氨基丁酸。

IgG和白蛋白具有极长的血浆半衰期，而大多数其他人类蛋白质则表现出快速的血液清除率。IgG和白蛋白的这种长半衰期是与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的结果，Fc受体形成细胞内蛋白质库，防止溶酶体降解并且随后再循环到细胞外空间。治疗性蛋白质与IgG的Fc结构域、白蛋白或长而灵活的多肽延伸之间的基因融合已被引入以延长蛋白质循环。FcRn在pH 6时可以结合IgG，但在生理pH(7.4)时不能结合，这种pH依赖性可能是FcRn延长IgG半衰期的机制的关键。认为在将IgG摄取到细胞中后，FcRn可以与酸性内体中的IgG结合，从而避免溶酶体中的降解。IgG分子随后通过胞吐作用返回细胞表面并释放回循环，因为FcRn在细胞外pH 7.4时对IgG的亲和力最小。

在一些实例中，ApoE模拟肽连接至人新生儿Fc受体(FcRn)结合序列，例如IgG结合位点(例如SEQ ID NO:27)、白蛋白结合位点(如SEQ ID NO:28)或非IgG/非白蛋白FcRn结合位点。例如，参见美国专利No 9,527,890；9,012,603；9,574,190；10,046,023；10,316,073；10,588,935；Mezoet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:2337-2342，2008。

融合蛋白可以包括上文讨论的关于ApoE模拟肽的任何修饰。在具体实例中，融合蛋白包括N-末端酰化、C-末端酰胺化、N-末端脂肪酸修饰(如辛酸或肉豆蔻酸)和C-末端脂肪酸改性(如辛酸和肉豆蔻酸)中的一种或更多种。

在一些方面，融合蛋白包括与SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列。在其他实例中，融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列组成。示例性融合蛋白包括表2中提供的那些。

表2.示例性ApoE模拟肽融合蛋白

1：青霉胺

2：N-甲基-甘氨酸

3：N-甲基-亮氨酸

4：6-氨基己酸

Ac：N-末端酰化

NH2：C-末端酰胺化

S5：(S)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸

R8：(R)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸

在一些方面，所公开的ApoE模拟肽或融合蛋白可以从各种来源分离。例如，所公开的肽或融合蛋白可以通过化学合成(例如固相或溶液相合成)，随后在适当条件下反应以在肽的两个或多个非连续氨基酸之间产生一个或更多个共价连接。在一些实例中，共价连接是烃钉合(hydrocarbon staple)或烃缝合(hydrocarbon stitch)，以及烃钉合(hydrocarbon staple)或烃缝合(hydrocarbon stitch)是通过钌催化的复分解或双环闭合复分解产生的。

在一些方面，本文公开的ApoE模拟肽或融合蛋白保留ApoE的一种或更多种活性，包括脂蛋白结合活性、LDLR结合活性、LRP1结合活性、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)结合活性、介导细胞脂蛋白摄取、降低受试者的血清甘油三酯水平、降低受试者的总血清胆固醇水平和/或减少细胞或受试者中的病毒复制。在一些实例中，与对照(例如具有不包含共价连接或无肽/缓冲液的天然ApoE序列的相应肽)相比，所公开的肽或融合蛋白将细胞脂蛋白摄取(如LDL、IDL、HDL、Lp(a)、乳糜微粒、乳糜微粒残余物或VLDL摄取)增加至少约5至40倍。在进一步的实例中，当施用于ApoE-ko小鼠时，与对照组(例如具有不包含共价连接或无肽/缓冲液的天然ApoE序列的相应肽)相比，所公开的肽或融合蛋白在一小时内将血清甘油三酯降低至少约50％(例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。在另外的实例中，当施用于ApoE-ko小鼠时，与对照组(例如具有不包含共价连接或无肽/缓冲液的天然ApoE序列的相应肽)相比，所公开的肽或融合蛋白在1-6小时内将血清胆固醇降低至少约10％(例如，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或更多)。在进一步的实例中，与对照(例如具有不包含共价连接或无肽/缓冲液的天然ApoE序列的相应肽)相比，所公开的肽或融合蛋白将细胞中的病毒复制减少至少约50％。

III、药物组合物和使用方法

在示例性方面，将包含本文公开的一种或更多种ApoE模拟肽或融合蛋白的组合物以治疗有效量施用于患有血脂异常疾病(例如高甘油三酯血症、高胆固醇血症或心血管疾病)的受试者。在其他实例中，将本文公开的治疗有效量的ApoE模拟肽或融合蛋白施用于ApoE遗传缺陷的受试者或患有异常β脂蛋白血症的受试者(例如具有ApoE2/E2等位基因的受试者)。在另外的实例中，将治疗有效量的ApoE模拟肽或融合蛋白施用于因LDLR突变而患有家族性高胆固醇血症的受试者。在其他方面，将治疗有效量的包含本文公开的一种或更多种ApoE模拟肽或融合蛋白的组合物施用于患有病毒感染或疾病的受试者。这些用途的有效剂量将取决于疾病的严重程度和受试者的总体健康状况以及其他因素。该化合物的治疗有效量是提供一种或更多种症状的主观缓解或临床医生或其他合格观察者所指出的客观可识别的改善的量。

ApoE模拟肽或融合蛋白可以通过本领域技术人员已知的任何方式施用(参见，例如，Banga,Therapeutic Peptides and Proteins,Third Edition,Taylor&FrancisGroup,2015)，例如通过肌肉内、皮下或静脉注射，或口服、鼻用、吸入或肛门给药。在一个方面，通过静脉注射施用。另一方面，施用是口服的。为了延长ApoE模拟肽或融合蛋白可用于抑制或治疗血脂异常病症或病毒感染的时间，肽可以作为植入物、油性注射剂或颗粒系统提供。颗粒系统可以是微粒、微胶囊、微球、纳米胶囊或类似的颗粒。在具体方面，施用的ApoE模拟肽包括SEQ ID NO:2-4、7-12、14-21和30-33中任一个的氨基酸序列。在其他方面，给受试者施用包含ApoE模拟肽的融合蛋白，如SEQ ID NO:22-25中的任何一个。

在一些实例中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的公开的ApoE模拟肽或融合蛋白。在一些实例中，受试者是人或兽医学受试者。在特定的例子中，受试者是人。

在一些实例中，受试者患有高甘油三酯血症。人受试者的正常或理想血清甘油三酯低于150mg/dL。临界高甘油三酯范围为150-199mg/dL，高甘油三酯范围为200-499mg/dL，极高的甘油三酯范围是500mg/dL或更高。因此，在一些实例中，接受治疗的受试者的血清甘油三酯为150mg/dL或更高。向受试者施用治疗有效量的一种或更多种所公开的肽或融合蛋白，例如导致血清甘油三酯水平降低约至少5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多)的量，例如，与施用肽或融合蛋白质之前的甘油三酯水平相比。在其他实例中，所公开的肽或融合蛋白的治疗有效量将受试者的血清甘油三酯降低到小于150mg/dL。

在一些实例中，受试者患有高胆固醇血症，包括但不限于家族性高胆固醇血症。成人受试者的正常或理想总胆固醇低于200mg/dL(儿童低于170mg/dL)。成人的临界高总胆固醇范围为200-239mg/dL，高总胆固醇的范围为240mg/dL或更高(儿童分别为170-199mg/dL和200mg/dL或更高)。因此，在一些实例中，接受治疗的受试者是成年人并且具有200mg/dL或更高血清的总胆固醇水平。向受试者施用治疗有效量的一种或更多种所公开的肽或融合蛋白，例如导致血清总胆固醇水平降低约至少5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多)的量，例如，与施用肽或融合蛋白质之前的总胆固醇水平相比。在其他实例中，所公开的肽或融合蛋白的治疗有效量将受试者的血清总胆固醇降低到小于200mg/dL。

在其他方面，受试者患有或疑似患有病毒感染或疾病。在一些实例中，受试者感染或怀疑感染了包膜病毒。示例性包膜病毒包括流感病毒、疱疹病毒(如巨细胞病毒)、痘病毒、嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒)、黄病毒(如登革热病毒或西尼罗河病毒)、冠状病毒(如β冠状病毒)、正粘病毒、副粘病毒(如麻疹或腮腺炎)、丝状病毒(如埃博拉病毒或马尔堡病毒)和逆转录病毒(如艾滋病毒)。在一些实例中，受试者感染(或疑似感染)β冠状病毒，例如SARS-CoV-2。在一方面，给受试者施用治疗有效量的肽，例如抑制病毒复制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的量(与未进行治疗相比)。在另一方面，治疗有效量是将受试者中的病毒滴度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的量(与未进行治疗相比)。在其他实例中，治疗有效量也可以是减少或消除一种或更多种病毒感染的症状所需的量，例如减少或消除发烧、咳嗽或呼吸急促所需的数量，例如在呼吸道病毒如β冠状病毒的情况下。

所提供的ApoE模拟肽或融合蛋白中的一种或更多种可以与一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂组合以用于给人或动物受试者施用。Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Adejare(Ed.),Academic Press,London,United Kingdom,23^rdEdition(2021)，描述了适用于一种或更多种治疗化合物或分子的药物递送的组合物和制剂，例如一种或更多种单独的肽或融合蛋白或与另外的药剂组合。合适的药学上可接受的载体、溶媒(vehicles)或赋形剂的实例包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和/或乳液。非水溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏油或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。其他药学上可接受的载体包括碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、脂质、润湿剂、乳化剂、分散剂和防腐剂。

一般而言，制剂是通过将一种或更多种公开的肽或融合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂均匀且紧密地结合而制备的。适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其中可能含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使制剂与预期接受者的血液等渗；以及可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。制剂可以装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前直接添加无菌液体载体，例如注射用水或生理盐水。即时注射溶液和悬浮液可以由本领域普通技术人员常用的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

在一些方面，所公开的肽或融合蛋白被配制成为与一种或更多种磷脂的复合物。在一方面，在给受试者施用之前，将一种或更多种公开的肽或融合蛋白与磷脂或其他脂质预复合成盘状或球形颗粒。在一个实例中，肽与1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)预复合。制备所公开的肽与磷脂复合物的方法包括Schwendeman et al.,J.LipidRes.56:1727-1737,2015；Yuan et al.,Nanomedicine:Nanotechnology,Biology andMedicine48:102646,2023；和Shu et al.,Aterioscler Thromb Vase Biol.30:2504-2509,2010中所述的方法。

本文提供的肽、融合蛋白和药物组合物，包括用于治疗血脂异常病症或病毒性疾病的那些，可以通过不同的途径施用，例如口服(包括口腔和舌下)、直肠、胃肠外(包括静脉内或腹腔内)、气雾剂、鼻用、肌肉内、皮下、皮内和局部。它们可以以不同的形式给药，包括但不限于溶液、乳液和悬浮液、微球、颗粒、微粒、纳米粒子和脂质体。

有效的肽、融合蛋白或药物组合物的量取决于待治疗的疾病或病症的性质，以及疾病或病症所处的阶段。有效量可以通过标准临床技术确定。制剂中使用的精确剂量也取决于给药途径，并且应根据医疗保健从业人员的判断和每个受试者的情况来决定。这种剂量范围的实例是约0.1mg/kg至约200mg/kg体重(例如，约0.1至约10mg/kg、约1至约25mg/kg、约5至约50mg/kg、约25至约75mg/kg、约50至约100mg/kg、约75至约150mg/kg或约100至约200mg/kg，例如约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg，约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg或约200mg/kg)，以单次或分次剂量给药。剂量范围的另一个例子是单次或分次剂量为1.0至100mg/kg体重。在一些方面，所公开的肽、融合蛋白或药物组合物每天两次、每天、每隔一天、每周或以更低频率施用。在一个具体实例中，每周一次向受试者静脉注射肽、融合蛋白或组合物。在另一个具体实例中，每天一次向受试者口服施用肽、融合蛋白或组合物。治疗可能会无限期地继续，或者当达到目标临床参数时可以停止，例如正常范围的甘油三酯或总胆固醇水平或病毒感染的清除(例如，症状缓解或没有病毒血症)。

任何特定受试者的具体剂量水平和给药频率可能会有所不同，并取决于许多因素，包括特定的疾病或状况、特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、接受治疗的受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合以及病情的严重程度。

所公开的肽、融合蛋白或药物组合物可以在整个治疗期间以大约相同的剂量、递增剂量方案或负荷剂量方案(例如，其中负荷剂量是约为维持剂量的两到五倍)施用。在一些方面，剂量在治疗过程中根据接受治疗的受试者的状况、疾病或状况的严重程度、对治疗的明显反应和/或通过本领域普通技术人员判断的其他因素而变化。

在另外的方面，所公开的肽用于体外或离体方法，以促进或增加从样品例如血浆中去除VLDL、LDL、Lp(a)和/或脂蛋白X(LpX)。在一些方面，所公开的肽用于LDL-单采术的方法(例如用于患有家族性高胆固醇血症的受试者)。在一些方面，所述方法包括在足以使脂蛋白(例如LDL和/或VLDL)与一种或更多种肽结合的条件下，使含有脂蛋白的样品(如来自受试者的生物样品，例如血浆)与一个或更多个公开的肽接触，从而形成肽/脂蛋白复合物。然后，在足以使肽/脂蛋白复合物与糖胺聚糖结合的条件下，使肽/脂蛋白复合物与糖胺聚糖(例如硫酸葡聚糖、肝素或硫酸乙酰肝素)接触，从而形成肽/脂蛋白/糖胺聚糖复合物。在一个具体的例子中，糖胺聚糖是硫酸葡聚糖。从样品中去除肽/脂蛋白/糖胺聚糖复合物，产生脂蛋白耗竭的血浆。在一些方面，糖胺聚糖被固定在固体支持物(例如柱)上或呈浆液形式。在一些实例中，该方法将样品中脂蛋白(例如LDL)的量减少至少约30％(例如至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多)。在另外的实例中，与单独使用糖胺聚糖相比，包含所公开的肽或融合蛋白会增加从样品中去除的脂蛋白(例如LDL)的量。

在一些实例中，该方法可用于通过LDL单采术从受试者(例如患有家族性高胆固醇血症的受试者)的血浆中去除脂蛋白(例如LDL)的方法。LDL单采系统包括级联过滤(或脂质过滤)、免疫吸附、肝素诱导的LDL沉淀、硫酸葡聚糖LDL吸附和LDL血液灌流。在一些方面，这些方法利用肝素诱导的LDL沉淀单采术。在一些实例中，使用血液处理系统(例如系统；Kaneka Pharma America LLC)从受试者移除血液并从血细胞中分离血浆。在足以使脂蛋白(例如LDL和/或VLDL)与一种或更多种肽或融合蛋白结合的条件下，分离的血浆与一种或者多种公开的肽或融合蛋白质接触，从而形成肽/脂蛋白复合物。然后，含有肽/脂蛋白复合物的血浆流过含有硫酸葡聚糖链的柱。肽/脂蛋白复合物保留在柱上，血浆中的脂蛋白量减少。血细胞被添加回血浆中并且血液被返回受试者体内。

实施例

提供以下示例来说明本公开的各方面的特定特征。这些示例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征。

实施例1 ApoE模拟肽的体外测试

如Lucero et al.(J.Lipid Res.63(1),Article 100160,2022)所描述评估野生型和LDLR-ko HepG2细胞中的脂质摄取。简而言之，在实验前48小时，将HepG2细胞或HepG2LDLR ko细胞接种在含有DMEM、10％(v/v)FBS、100IU/ml青霉素G和100pg/ml链霉素的培养基的96孔板中(每孔25000个细胞)。LDL、HDL或VLDL中的蛋白质用氨基反应性荧光染料Alexa Fluor^TM568 NHS酯(琥珀酰亚胺酯)(Invitrogen)标记。将最终总蛋白浓度为50μg/ml的Alexa568-LDL(或-HDL或-VLDL)与不同浓度的不同apoE肽或与相同量的缓冲液在DMEM/0.1％BSA中混合。然后将Alexa568-脂蛋白/肽混合物或Alexa568脂蛋白在37℃下预孵育30分钟。用PBS洗涤细胞，将Alexa568-脂蛋白/肽混合物或DMEM/0.1％BSA中的Alexa568-脂蛋白加入96孔板上的细胞中(一式三份)并孵育1小时或4小时。用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶从孔中解离，并重新悬浮在冰冷的PBS/0.5％BSA/2.5mM EDTA中。通过荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术(BD LRSFortessa(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ))测量荧光来评估细胞对LDL/HDL/VLDL的摄取。

与对照肽相比，ApoE模拟肽增强了野生型HepG2细胞对LDL的摄取(图6A和6B)。这些肽还增强野生型HepG2细胞中VLDL和HDL的摄取(图7A和7B)。在肽浓度较高的情况下，无论是否存在LDLR，LDL摄取都会增加。然而，较低肽浓度下摄取的差异可能表明apoE肽还通过LDLR途径介导LDL摄取(图8和图9A-9C)。

实施例2 ApoE模拟肽的体内测试

在ApoE-ko小鼠身上测试了OctaC-E139-150和OctaN-E139-150肽的效果。小鼠保持正常饮食。在3.5个月龄时，将15只小鼠分为三组，每组5只，如下：1)对照组；2)OctaC-E139-150肽组；和3)OctaN-E139-150肽组。将肽以1.5mg/ml的浓度溶解在PBS中(810μMOctaC-E139-150；849μM OctaN-E139-150)。在肽施用前一天对小鼠称重，计算每只小鼠接受4.6mg/kg肽(2.5μmol/kg)的肽量。将计算出的1.5mg/ml肽量放入注射器中，用PBS标准化至80μl。小鼠接受PBS(对照)或肽的静脉注射。在注射前、注射后1小时、3小时和6小时立即采集血液样本。血液在4℃下以3000rpm离心20分钟，分离血浆(20-30μl)并储存在4℃。第二天，使用L型甘油三酯M测定法和胆固醇E试剂盒(Wako，FUJIFILM Medical Systems USA)测量血浆甘油三酯和总胆固醇。

Octa-E139-150和OctaN-E139-150肽在施用后至少6小时内显著降低小鼠的血浆总胆固醇(图10A)。此外，肽显著降低血浆甘油三酯水平，尽管这种作用是短暂的(图10B)。

实施例3ApoE模拟肽对病毒复制的影响

小鼠肝炎病毒(MHV)是一种β冠状病毒，通过小鼠CEACAM1受体(mCC1a受体)感染小鼠细胞。被修饰以表达mCC1a受体的HeLa(人上皮)细胞可以被MHV感染。本实验中使用的重组MHV已经过修饰，使其含有额外的核衣壳(N)蛋白片段，该片段在N端与绿色荧光蛋白标签(GFP)融合(参见Verheijeet al.,J.Virol.84:11575-1579，2010)。当细胞感染MHV时，MHV复制产生更多的GFP并增强荧光信号。

HeLa mCC1a细胞在96孔板中培养。细胞在37℃下用MHV-GFP感染2小时。将病毒储备溶液稀释40倍。通过用MHV-GFP感染HeLa细胞3天并收集细胞培养基来制备原液。用PBS洗涤细胞并用含有ApoE肽(15μM)的培养基(DMEM加10％FBS，100IU/ml青霉素G，100μg/ml链霉素，0.5mg/ml G418)或不含肽的培养基处理并在37℃下孵育16小时。用PBS洗涤细胞并使用荧光板读数器在板上测量细胞中的总GFP荧光(ex/em 488/520)。

如图11所示，用OctaC-E139-150或缝合的E134-150肽处理显示MHV-GFP荧光显著降低，表明经处理的细胞中病毒复制减少。

实施例4ApoE模拟肽的额外体外表征

研究烃钉合对ApoE模拟肽物理性质的影响。在20℃下，100μM肽在水溶液中的圆二色性表明，烃钉合的肽呈α-螺旋，而未修饰的肽是无序的(图12)。

为了评估未修饰肽与酰化钉合肽的脂质结合特性，进行了DMPC囊泡溶解试验。未修饰的线性肽E139-150不溶解DMPC磷脂囊泡，而酰化的钉合肽溶解DMPC磷脂囊泡(图13)。这表明烃钉合和肽酰化增加了肽的脂质结合亲和力。

最终蛋白浓度为50μg/ml的荧光标记LDL或VLDL(Alexa Fluor 568-NHS酯)在37℃下与或不与apoE肽预孵育30分钟。LDL摄取的肽终浓度为10μM，VLDL摄取研究的肽终浓度为5μM。然后将野生型HepG2细胞与脂蛋白/肽混合物在37℃下孵育1小时。通过流式细胞术评估脂蛋白摄取。如图14A、14B和6B所示，烃钉合肽，特别是酰化钉合肽增加HepG2细胞对LDL和VLDL的摄取。

由于阳离子两亲性肽可能具有细胞毒性，因此还测试了肽对细胞的潜在细胞毒性作用。细胞计数试剂盒-8(Dojindo)用于评估增加肽浓度对野生型HepG2细胞存活率的影响。在脂质摄取研究中使用的条件下，没有肽对WT HepG2细胞具有细胞毒性(图15)。

实施例5ApoE模拟肽促进LDL与肝素结合

据观察，ApoE模拟肽促进LDL与肝素的结合。这已通过生物层干涉术(BLI)和肝素色谱法得到证实。将生物素化肝素固定在BLI链霉亲和素(SA)生物传感器(Sartorius)上。在PBS、0.1％BSA中测量100nM LDL、5μM MyrN-E141-150-amL或预复合100nM LDL和5μMMyrN-E14-150-amL与肝素的结合(图16)。将400μl 1μM LDL或1μM LDL与20μM MyrN-E141-150-amL预复合物注射到1ml HiTrap肝素HP柱中。用10ml缓冲液(10mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH 7.4)洗涤柱，用NaCl的线性梯度(10mM磷酸盐钠，pH 7.4，0.15M-2M NaCl梯度)洗脱LDL或LDL/肽复合物(图17)。

测试了硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)在肽介导的LDL摄取中的参与情况。WT HepG2细胞用肝素酶I、II和III的混合物(IBEXPharmaceuticals)预处理，以降解细胞表面的硫酸乙酰肝素链。接下来，用OctaC-E139-150-S和MyrN-E141-150-amL肽进行LDL摄取研究(图18A-18C)。不添加肽的LDL摄取不受肝素酶处理的影响，但肝素酶处理减弱了低剂量肽对LDL摄取的影响(图18A)。在较高的肽浓度下，肝素酶治疗的效果较低，部分摄取得到恢复。类似地，肝素酶处理减弱了野生型HepG2细胞中MyrN-E141-150-amL介导的LDL摄取(图18C)。这表明在低肽浓度下HSPG在肽介导的LDL摄取中发挥作用，但在高肽浓度下其作用较低。LDLR-KO HepG2细胞的相同实验显示了类似的结果(图18B)，表明在较高的肽剂量下，一些其他受体，例如LRP1，可能参与肽介导的摄取，或者存在一些非特异性肽介导摄取。

将最终蛋白浓度为50μg/ml的荧光标记LDL(Alexa Fluor 568-NHS酯)与或不与10μM MyrN-E141-150-amL肽在37℃下预孵育30分钟(在含0.1％BSA的DMEM(无酚红，无血清)中制备的溶液)。向一些LDL和一些LDL/肽样品中加入肝素(最终浓度为10USP/ml；肝素，来自猪肠粘膜的钠注射液(Fresenius Kabi USA，Lake Zurich，IL))。混合物在37℃下再预孵育5分钟。接下来，将野生型HepG2细胞与LDL/肽/肝素混合物在37℃下孵育1小时。通过流式细胞术评估脂蛋白摄取。肝素降低了MyrN-E141-150-amL肽对野生型HepG2细胞中LDL摄取的影响(图19)。

实施例6ApoE模拟肽的其他体内表征

在单剂量ApoE KO小鼠研究中测试了MyrN-E139-150和OctaN-E139-150肽。ApoEKO小鼠(n＝9)分为3组：对照组(PBS)，n＝3；MyrN-E139-150(2.5μmol/kg；4.6mg/kg)，n＝3；OctaN-E139-150(2.5μmol/kg；4.4mg/kg)，n＝3。在整个研究过程中，小鼠以正常饮食饲养。静脉注射肽，并在注射前和注射肽后1小时、3小时和6小时采集血液样本。血浆总胆固醇和甘油三酯的测量如实施例2所述。肽降低血浆总胆固醇(图20A；3小时时为37％；6小时时为29％)和甘油三酯(图20B；1小时时为30-50％)。

在单剂量LDLR-KO小鼠研究中测试了MyrN-E141-150-amL和OctaN-E141-150。LDLR-KO小鼠(n＝9)分为3组：对照组(PBS)，n＝3；MyrN-E141-150-amL(2.5μmol/kg；4.6mg/kg)，n＝3；OctaN-E141-150(2.5μmol/kg；4.4mg/kg)，n＝3。在整个研究过程中，小鼠以正常饮食饲养。静脉注射肽，并在注射前和注射肽后1小时、3小时、6小时和24小时采集血液样本。血浆总胆固醇的测定如实施例2所述。注射3小时和6小时后，MyrN-E141-150-amL将血浆总胆固醇降低约15-30％(图21A)。

显然，在不脱离本公开所描述方面的精神的情况下，可以变化或修改所描述的方法或组合物的精确细节。我们要求所有这些修改和变化都在以下权利要求的范围和精神之内。

Claims (43)

1.长度为8-17个氨基酸的包含ApoE的受体结合区或其部分的载脂蛋白E(ApoE)模拟肽，其包含连接所述肽的至少两个非连续氨基酸的一个或更多个共价连接。

2.根据权利要求1所述的ApoE模拟肽，其中所述肽包含两亲性螺旋结构域，并且连接至少两个不连续氨基酸的所述共价连接位于所述两亲性螺纹结构域的疏水侧的两个氨基酸之间。

3.根据权利要求1或2所述的ApoE模拟肽，其中所述一个或更多个共价连接是烃钉合(hydrocarbon staple)、烃缝合(hydrocarbon stitch)、内酰胺桥或二硫键。

4.根据权利要求3所述的ApoE模拟肽，其中所述烃钉合(hydrocarbon staple)或烃缝合(hydrocarbon stitch)包含键，所述键包含(S)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(S5)、(S)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(S8)、双戊烯基甘氨酸(B5)、(R)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(R5)和(R)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(R8)中的一个或更多个。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的ApoE模拟肽，其中所述肽包含一个或更多个额外的修饰。

6.根据权利要求5所述的ApoE模拟肽，其中所述修饰包括一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失；C-末端酰胺化；N-末端酰化；一种或更多种D-异构体氨基酸；修饰的氨基酸；N-末端脂肪酸；C-末端脂肪酸；或其两种或多种的组合。

7.根据权利要求6所述的ApoE模拟肽，其中所述脂肪酸是辛酸或肉豆蔻酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的ApoE模拟肽，其中所述肽包含与SEQ ID NO:31、2-4、7-12、14-21、30、32和33中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的ApoE模拟肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:31、2-4、7-12、14-21、30、32和33中任一个的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的ApoE模拟肽，其中所述肽由SEQ ID NO:31、2-4、7-12、14-21、30、32和33中任一个的氨基酸序列组成。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的ApoE模拟肽，其中所述肽长8个氨基酸。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的ApoE模拟肽，其中所述肽结合脂蛋白。

13.根据权利要求12所述的ApoE模拟肽，其中所述肽结合低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、中密度脂蛋白(IDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)、蛋白多糖、LDL受体(LDLR)和LDLR相关蛋白1(LRP1)中的一种或更多种。

14.融合蛋白，其包含与人新生儿Fc受体(FcRn)IgG结合位点或FcRn-白蛋白结合位点连接的权利要求1至13中任一项所述的ApoE模拟肽。

15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:22-25中任一个的氨基酸序列组成。

18.药物组合物，其包含权利要求1至13任一项所述的ApoE模拟肽或权利要求14至17任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，进一步包含磷脂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述磷脂包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物配制用于静脉内施用、皮下施用或口服施用。

22.治疗受试者血脂异常的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1至13中任一项所述的ApoE模拟肽、权利要求14至17中任一项所述的融合蛋白、或权利要求18至21中任一项所述的组合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法降低所述受试者中的甘油三酯水平。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者患有高甘油三酯血症。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述受试者的治疗前血清甘油三酯水平为150mg/dL或更高。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法降低了所述受试者的总胆固醇水平。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有高胆固醇血症。

28.根据权利要求22、26或27中任一项所述的方法，其中所述受试者的治疗前总胆固醇水平为200mg/dL或更高。

29.治疗受试者中病毒感染的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1至13中任一项所述的ApoE模拟肽、权利要求14至17中任一项所述的融合蛋白、或权利要求18至21中任一项所述的组合物，从而治疗病毒感染。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述病毒感染是被包膜病毒感染。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述包膜病毒是β冠状病毒。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述β冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中治疗所述病毒感染包括抑制所述病毒在所述受试者中的复制。

34.权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用、皮下注射、口服施用、鼻施用或气雾剂施用。

35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

36.制备权利要求1至13任一项的ApoE模拟肽或权利要求14至17任一项的融合蛋白的方法，包括重组产生所述肽或融合蛋白。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述ApoE模拟肽或所述融合蛋白是通过化学合成产生的。

38.减少样品中脂蛋白的方法，包括：

在足以使脂蛋白与一种或更多种肽结合的条件下，使含有脂蛋白的样品与权利要求1至13中任一项所述的一种或更多种ApoE模拟肽接触，从而形成肽/脂蛋白复合物；

在足以使肽/脂蛋白复合物与糖胺聚糖结合的条件下，使肽/脂肪蛋白复合物和糖胺聚糖接触，从而形成肽/脂素/糖胺聚糖复合物；和

从样品中去除肽/脂蛋白/糖胺聚糖复合物。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述样品包括血浆。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述样品来自患有家族性高胆固醇血症的受试者。

41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖固定在固体支持物上。

42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述方法是通过单采系统(apheresis system)进行。

43.权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖是硫酸葡聚糖、肝素或硫酸乙酰肝素。