CN119220608A - 一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，涉及预防用生物制品研发技术领域。本发明提供的水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，包括重组病毒或其灭活病毒；所述重组病毒由重组病毒载体及辅助质粒经反向遗传技术拯救病毒得到；所述重组病毒载体是以VSV为载体，将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因得到的。失去表面囊膜蛋白的水泡性口炎病毒其毒性极大降低，非常适合用作病毒载体。经实验验证，本发明的重组疫苗具有良好的安全性和有效性，对小鼠不具有神经毒性，同时产生较高的血清中和抗体效价。在仔猪免疫试验中也产生了良好的中和抗体效价。本发明为进一步针对PEDV疫苗的研究和开发奠定了坚实的基础，为养猪业提供一种安全、有效的防控PEDV的新策略。

Description

一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗

技术领域

本发明涉及预防用生物制品研发技术领域，尤其涉及一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是一种尤其针对仔猪的急性、高传染性的肠道传染病，可发生于任何日龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率高。成年猪虽然感染后症状较轻，但仍然可以传播病毒。猪群一旦有猪发病便会迅速蔓延，造成巨大经济损失。

引起该病的病原PEDV为冠状病毒科(Coronaviridae)α冠状病毒属(Alphacoronavirus)的正链RNA病毒，其基因组编码4种结构蛋白：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳(N)蛋白。其中，S蛋白是PEDV宿主保护性抗原，具有负责病毒附着、受体结合、细胞膜融合和进入的功能，在病毒致病机制中发挥重要作用，其外部结构域中存在介导宿主细胞产生中和抗体的抗原表位及与宿主细胞结合的受体结合位点。

目前，对抗PEDV的主要方法是通过生物安全措施和接种疫苗。1994年起，CV777株的灭活和减毒活疫苗的研发和推广对控制PEDV感染起到了重要作用。然而，随着病毒的变异，现有PEDV灭活疫苗保护力有限。

水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)属于水泡病毒属(Rhabdoviridae)弹状病毒科(Vesiculovirus)，能感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛(羊)、猪。由于其可以在神经节间顺向跨突触的传播，因此具有潜在的神经毒性。在克服神经毒性保证安全性条件下，VSV能够高效表达外源蛋白，同时诱导宿主产生高水平的免疫应答，是一种具有潜力的疫苗载体，且已经得到很好应用。

鉴于VSV作为疫苗载体所具备的诸多优点，以及目前PEDV灭活疫苗保护力不足的问题，本申请拟利用其研制针对猪的PEDV疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前PEDV疫苗研制和应用存在的诸多问题，提供一种以水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，该疫苗具有1.安全性高；2.生产便捷等优点。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种重组病毒载体，所述重组病毒载体的基因组包括将水泡性口炎病毒的基因组中的表面囊膜蛋白编码基因替换为PEDV病毒的刺突蛋白编码基因；

或者，所述重组病毒载体的基因组包括将水泡性口炎病毒的基因组中的表面囊膜蛋白编码基因替换为PEDV病毒的刺突蛋白编码基因，并在水泡性口炎病毒基因组中插入外源蛋白编码基因。

研究发现，当水泡性口炎病毒失去其表面囊膜蛋白G蛋白或G蛋白被其他病毒的囊膜蛋白取代时，仍可以完成细胞出芽的过程。而失去G蛋白的水泡性口炎病毒其毒性极大降低，非常适合用作病毒载体。本发明构建的重组病毒载体以VSV为载体，通过将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因，经实验验证，替换了VSV囊膜蛋白的重组VSV能够有效诱导特异性免疫反应。

进一步地，所述PEDV病毒来源于G1谱系的病毒或G2谱系的病毒。

进一步地，所述G1谱系的病毒包括PEDV SD-M株，所述G2谱系的病毒包括NH-TA2020株。

所述PEDV病毒为PEDV SD-M株，GeneBankAccessionno.AFX98013.1、或者NH-TA2020株，GeneBankAccession no.ON168803等。

进一步地，所述PEDV病毒的刺突蛋白包括刺突蛋白的截短体，所述截短体选自刺突蛋白C端氨基酸缺失对应的蛋白，所述C端缺失氨基酸个数为5个到19个。

例如，针对PEDV SD-M株，其刺突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3具有至少95％同一性的同功能序列。

针对NH-TA2020株，其刺突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或与SEQ ID NO.4具有至少95％同一性的同功能序列。

根据上述氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员可以获得所述PEDV病毒的刺突蛋白(包括截短体)的核苷酸序列，由于密码子的简并性，编码上述刺突蛋白的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述PEDV病毒的刺突蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

例如，所述PEDV SD-M株的刺突蛋白的截短体编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，或与SEQ ID NO.5具有至少95％同源性的同功能序列。

所述NH-TA2020株的刺突蛋白的截短体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，或与SEQ ID NO.6具有至少95％同源性的同功能序列。

在具体实施方案中，本发明将缺失末尾5-19个氨基酸的PEDV病毒的S蛋白对应编码基因序列通过同源重组的方式(Uniclone One Step Seamless Cloning Kit)克隆到VSV病毒中的G蛋白基因位置并替换G蛋白基因的ORF区域，构建得到的用于预防PEDV的病毒载体。

进一步地，本发明的重组病毒载体还包括在水泡性口炎病毒基因组中引入外源蛋白编码基因，所述外源蛋白为示踪蛋白或抗原蛋白。引入示踪蛋白编码基因以便于通过检测荧光等信号示踪病毒扩增及方便中和抗体的检测，引入抗原蛋白有利于多价多联苗的开发。

进一步地，所述示踪蛋白包括绿色荧光蛋白GFP。

外源蛋白编码基因的引入，只会进一步降低重组病毒载体的毒性，增加重组病毒的安全性。所述外源蛋白编码基因插入在所述水泡性口炎病毒基因组中的核蛋白N编码基因与磷蛋白P编码基因之间；或者所述外源蛋白编码基因插入在所述水泡性口炎病毒基因组中的基质蛋白M编码基因与PEDV病毒的刺突蛋白S编码基因(或刺突蛋白S的截短体编码基因)之间。

第二方面，本发明提供一种重组病毒，由第一方面所述的重组病毒载体及辅助质粒经反向遗传技术拯救病毒得到；

所述重组病毒包含水泡性口炎病毒核蛋白、水泡性口炎病毒磷蛋白、水泡性口炎病毒基质蛋白、水泡性口炎病毒RNA聚合酶以及PEDV病毒的刺突蛋白，且不包含水泡性口炎病毒表面囊膜蛋白；

所述重组病毒在细胞中不添加胰酶情况下具有复制增殖能力。

本发明提供的重组病毒，经病毒拯救后，能够有效诱导免疫反应，在细胞中不用添加胰酶具有复制增殖能力。

进一步地，所述细胞包括非洲绿猴肾(Vero)细胞及其衍生细胞株，如Vero-E6，以及仓鼠肾成纤维细胞(BHK21)细胞。

需要说明的是，以上所述的替换是指将水泡性口炎病毒基因组中的表面囊膜蛋白编码基因的ORF区域替换为PEDV病毒株的刺突蛋白编码基因。

进一步地，所述重组病毒安全性高，对小鼠不具有神经毒性。

本发明还提供所述的重组病毒的制备方法，包括：将所述的重组病毒感染敏感细胞株，并收获释放的病毒。

所述敏感细胞株包括非洲绿猴肾(Vero)细胞及其衍生细胞株，以及BHK21细胞。

进一步地，所述重组病毒的制备方法，在重组病毒感染宿主细胞过程中不需要添加胰酶。

在常规PEDV灭活疫苗的生产过程中，需要胰酶的辅助PEDV才能够正常在细胞中感染和扩增，而胰酶的添加会使得后续纯化时间和经济成本增加，本发明提供的重组病毒的制备方法中，不需要添加胰酶即可收获高滴度的病毒，大大节省了病毒的生产纯化成本。

本发明还提供一种利用所述重组病毒载体制备得到的疫苗株。

第三方面，本发明还提供一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，所述疫苗包括第二方面所述的重组病毒；上述的疫苗株；

或者，所述疫苗包括第二方面所述的重组病毒的灭活病毒。

本发明还提供所述的重组病毒载体、所述的重组病毒或所述的疫苗株或所述的疫苗的以下任一种应用：

(1)在制备表达PEDV病毒刺突蛋白的重组水泡性口炎病毒中的应用；

(2)在制备用于预防和/或治疗PEDV感染或由PEDV感染引起疾病的药物中的应用；

(3)在制备预防猪传染性腹泻病毒传播和感染疫苗中的应用。。

与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

本发明提供的重组病毒载体通过分子生物学技术，将水泡性口炎病毒的基因组中的表面囊膜蛋白编码基因替换为PEDV病毒的刺突蛋白基因，失去表面囊膜蛋白的水泡性口炎病毒其毒性极大降低，非常适合用作病毒载体。

本发明提供的重组病毒的制备方法，将重组病毒感染宿主细胞，不需要添加外源胰酶重组病毒即可完成复制增殖，收获高滴度的病毒，在产业化生产过程中将有效缩减生产纯化病毒的成本。

本发明提供的水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，以VSV为载体，将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因，利用反式遗传技术构建得到的用于预防PEDV的重组疫苗，经实验验证，本发明的重组疫苗具有良好的安全性和有效性。

本发明提供的水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗以VSV为载体，将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因，或将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因并插入外源蛋白编码基因GFP，利用反式遗传技术构建得到，重组病毒在细胞水平具有良好的生长特性，连续传代后表现良好的遗传稳定性和生长特性。在安全性评价方面，通过采用Balb/C小鼠作为动物模型进行研究。结果表明该疫苗通过肌肉及颅内途径给药后，小鼠未表现出不良反应及临床症状，体重变化平稳，显示出该疫苗的良好安全性。在有效性方面，实验证明，本发明提供的猪传染性腹泻病疫苗的初步研究结果表现优良，血清中和抗体效价均显著高于对照组小鼠血清中和抗体水平：在仔猪上进行免疫后，本发明提供的猪传染性腹泻病疫苗能够诱导仔猪产生较高抗体水平。首免后33d，仔猪血清中和抗体水平显著高于从临床阳性血清中测得的抗体水平。这一结果不仅证明了本发明提供的猪传染性腹泻病疫苗的潜在有效性，也为进一步针对PEDV疫苗的研究和开发奠定了坚实的基础。我们期待该疫苗能在未来为养猪业提供一种安全、有效的防控PEDV的新策略。

附图说明

图1为本发明实施例提供的用VSV载体构建PEDV疫苗的结构示意图；

图2为本发明另一实施例提供的用VSV载体构建PEDV疫苗的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的重组病毒在敏感细胞系中的传代扩增显微镜荧光及白光拍照结果，红色圆圈为标记的病变细胞；

图4为本发明实施例提供的重组病毒的生长动力曲线图；

图5为本发明实施例提供的重组疫苗采用肌注途径给药免疫后的小鼠体重变化结果；

图6为本发明实施例提供的重组疫苗免疫采用颅内接种后的小鼠体重变化结果；

图7为本发明实施例提供的重组疫苗免疫采用颅内接种后的小鼠存活率结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

可以理解地，根据PEDV全基因组构建系统发育树，猪传染性腹泻病毒可将其分为两组：以CV777为代表的“经典毒株”和2010年后发现的“变异毒株”，二者之间的亲缘关系较远。根据其抗原蛋白S构建基因系统发育树，则可将PEDV分为G1和G2两个基因群。其中G1主要包括早期发现毒株(如CV777)和一些经典毒株(如LZC和SM98)，以及来自中国和韩国的疫苗适应株，G2涵盖了2010年后的大部分变异毒株。

以下实施例以G1谱系PEDV SD-M株、G2谱系NH-TA2020株为例，以VSV中的G蛋白基因替换为上述病毒株的S蛋白基因(S蛋白截短体基因)，构建PEDV疫苗，验证安全性和有效性，可以预期采用其他PEDV病毒株采用本发明的方法构建的PEDV疫苗同样具有安全性和有效性。本领域技术人员将上述PEDV SD-M株、NH-TA2020株替换为其他PEDV病毒株，利用本发明的方法构建的重组病毒或PEDV疫苗都属于本发明保护的范围。

实施例1

VSV载体PEDV疫苗候选株的制备方法(病毒构建与拯救)

参见图1，其为本发明用VSV载体构建PEDV疫苗的结构示意图。本实施例以VSV为载体，将其G蛋白基因替换为猪传染性腹泻病毒的S蛋白基因，利用反式遗传技术构建得到的用于预防PEDV的重组疫苗。

进一步参见图2，本发明另一实施例在上述实施例的基础上，进一步在水泡性口炎病毒基因组中插入绿色荧光蛋白GFP的编码基因，以便于通过检测荧光信号示踪病毒扩增及方便中和抗体的检测。

本实施例的S蛋白序列来源于PEDV SD-M株(GeneBank Accessionno.AFX98013.1)以及NH-TA2020株(GeneBankAccessionno.ON168803)，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，将其C端截短(得到的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)并经密码子优化后合成基因，经过密码子优化后的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。

本实施例的水泡性口炎病毒株为Indiana株。

基因合成后，对以上合成片段和VSV载体分别按照Primer Star酶说明书进行PCR扩增，扩增的引物序列信息见表1。

将上述缺失末尾19个氨基酸的S蛋白SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4对应编码基因序列通过同源重组的方式(Uniclone One Step Seamless Cloning Kit)分别克隆到病毒载体VSV中G蛋白基因位置并替换G蛋白基因的ORF区域，形成VSV携载PEDV-S蛋白的重组病毒全长质粒，分别命名为pVSV-G1S_Δ19和pVSV-G2S_Δ19。在此基础上，本发明另一实施例将绿色荧光蛋白GFP基因通过同源重组的方式克隆到上述病毒载体的VSV-M编码基因和PEDV-S编码基因之间，形成VSV携载GFP和PEDV-S蛋白编码基因的重组病毒全长质粒，分别命名为pVSV-GFP-G1S_Δ19和pVSV-GFP-G2S_Δ19。

表1扩增引物序列

具体质粒构建过程：一、利用DNA聚合酶(Primer Star)进行PCR扩增得到相应片段；二、各片段利用同源重组酶(Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒)进行重组并转化到感受态细胞中；三、挑取单菌落并使用通用载体引物及Taq酶进行菌液PCR，送测正确条带大小的PCR产物；四、对测序正确的菌落克隆提取质粒。

病毒拯救方法如下：将表达T7聚合酶的痘病毒感染BHK-21细胞，随后转染全长质粒以及表达VSV-N，VSV-P，VSV-L，VSV-G的辅助质粒，48h后收集细胞及上清液，0.22μm过滤器过滤后取上清液备用。将病毒原液接种新的Vero细胞(不需要添加胰酶)，观察培养细胞是否出现病变或荧光，如果出现病变或荧光，再次收集细胞反复冻融三次，0.45μm过滤器过滤分装后-80℃冻存，即可获得病毒储液，将收集到的重组病毒分别命名为VSV-G1S_Δ19和VSV-G2S_Δ19，VSV-GFP-G1S_Δ19和VSV-GFP-G2S_Δ19并测量重组病毒滴度。

重组病毒滴度测量采用Reed-Muench法，将病毒按照10倍梯度稀释后接种于铺有Vero细胞的96孔板，培养48h后观察细胞病变或荧光，分别记录阳性孔和阴性孔数目，计算病毒TCID₅₀。经测量，本发明实施例的的重组病毒传代稳定后病毒滴度均可达到10^6.5TCID₅₀/ml及以上。可见，本发明不含VSV-G囊膜蛋白的重组病毒可通过病毒反向遗传技术拯救得到。

实施例2重组病毒稳定性传代及生长动力曲线测定

1.稳定性传代验证

将Vero细胞铺于6孔板中，每孔接毒100μl，病毒可连续传代复制，可见实施例1中收获的重组病毒可在Vero细胞中稳定传代。为验证重组病毒在敏感细胞系的复制能力，将Vero细胞，Vero-E6细胞，BHK-21细胞铺于12孔细胞板中，37℃，5％CO₂培养12-24小时，显微镜下观察其生长密度达90-100％时，将重组病毒以MOI＝0.1剂量接种接毒。72h后观察细胞荧光表达情况及病变情况。

结果如图3所示，与对照组相比，在接种重组病毒VSV-G1S_Δ19和VSV-G2S_Δ19的细胞中，可以观察到细胞不同形式的病变，在Vero细胞和Vero-E6细胞中，表现为细胞聚团变圆，在BHK-21细胞中，可观察到细胞形态由长条形变为圆形。重组病毒VSV-GFP-G1S_Δ19和VSV-GFP-G2S_Δ19感染的细胞，可观察到荧光的表达以及细胞病变。由结果可知，以上重组病毒可在Vero细胞，Vero-E6细胞，BHK-21细胞中稳定传代复制。

2.生长动力曲线

为了验证重组病毒VSV-G1S_Δ19和VSV-G2S_Δ19，VSV-GFP-G1S_Δ19和VSV-GFP-G2S_Δ19在细胞内的复制动力学，我们在Vero细胞中建立了生长曲线。具体步骤如下：将重组病毒及对照VSV野生型病毒(VSV-WT)均以MOI＝0.1剂量接种至Vero单层细胞的6孔细胞板，感染细胞在37℃条件下培养，在感染后在12、24、48、72、96h，反复冻融相应细胞板三次，收取病毒液。于-80℃冻存。将各时间点的病毒液进行10倍梯度稀释后接种于铺有Vero细胞的96孔板，按Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，以时间为横轴，病毒滴度为纵轴绘制病毒一步生长曲线。

重组病毒的生长动力曲线如图4，VSV-G1S_Δ19、VSV-G2S_Δ19、VSV-GFP-G1S_Δ19、VSV-GFP-G2S_Δ19与VSV-WT生长动力整体趋势接近，亲本病毒VSV-WT感染后24h，病毒生长滴度最高，为10^8.8TCID₅₀/ml；VSV-G1S_Δ19和VSV-GFP-G1S_Δ19于感染后48h病毒生长滴度最高，为10^6.8TCID₅₀/ml；VSV-G2S_Δ19生长动力曲线接近VSV-GFP-G2S_Δ19，于感染后72h病毒生长滴度最高，为10^6.5TCID₅₀/ml。VSV-GFP-G1S_Δ19和VSV-GFP-G2S_Δ19携带报告基因GFP，可用于后续血清中和假病毒试验。

实施例3小鼠模型安全性及有效性评价

接种试剂为实施例1收获的病毒储液。

1.Balb/C小鼠肌肉注射后体重变化：

采用肌注途径接种小鼠，接毒剂量为原液组10^6TCID₅₀/50μl只、原液稀释10倍组10^5TCID₅₀/50μl只，连续14天对Balb/C小鼠体重及状态进行监测，绘制出体重变化如图5。由结果可知，免疫后14天各个试验组小鼠体重变化平稳，均未出现体重较大幅度下降及异常行为状态，说明了重组病毒VSV-G1S_Δ19及VSV-G2S_Δ19作为潜在疫苗株在小动物试验中的安全性良好。

2.Balb/C小鼠颅内接种体重及神经症状观察

由于VSV病毒具有潜在的神经毒性，为了验证本发明方法所制得的重组病毒株VSV-G1S_Δ19及VSV-G2S_Δ19具有良好的安全性，本实验通过颅内接种法，将野生型VSV-WT和VSV-G1S_Δ19及VSV-G2S_Δ19直接接种于小鼠脑内，接种剂量为10^4TCID₅₀/只，该剂量野生型VSV接种可以使小鼠形成实验性中枢神经系统感染症状，同时设立阴性对照(注射用水组)。攻毒后记录小鼠神经症状，从而评价病毒安全性。

攻毒后小鼠体重变化结果如图6，结果表明，VSV-G1S_Δ19组及VSV-G2S_Δ19组小鼠颅内注射后，小鼠未出现任何神经症状，且体重变化平稳，说明该疫苗对小鼠无致病性；而阳性对照VSV-WT组小鼠体重下降明显，并出现明显的呆滞，炸毛、蜷缩和颤抖症状，在接毒后第4天出现了死亡(图7)，阴性对照PBS组小鼠体征表现平稳。

3.Balb/C小鼠免疫试验

采用肌肉注射形式，分两次免疫小鼠，免疫程序为“0+14”免疫，设4组试验组，分别为VSV-G1S_Δ19原液免疫组、VSV-G2S_Δ19原液免疫组、由VSV-G2S_Δ19制备而成的灭活疫苗免疫组以及PBS对照组。各试验组中每只小鼠注射50μl，原液滴度为10^6TCID₅₀/ml。免疫后，眼球采血取14天、21天、28天的小鼠血清，检测血清针对重组病毒的中和抗体效价。

中和实验具体方法如下：

1.细胞准备：将Vero细胞铺至96孔细胞板，待其汇合度达到80％即可使用。

2.血清处理：将待检血清56℃灭活30min。

3.使用含2％FBS的DMEM培养基，将VSV-GFP-G1S_Δ19假病毒及VSV-GFP-G2S_Δ19假病毒稀释至200TCID₅₀/100μL，即为检测用病毒稀释液。

4.将待检血清按3倍倍比稀释，每稀释梯度加入等体积病毒稀释液，振荡混匀，放入37℃5％CO₂培养箱中孵育60min。

5.取96孔细胞板，用PBS溶液洗涤2次，去除漂浮细胞，向细胞板内加入孵育后的血清-病毒混合液，每稀释梯度做3个对照孔，100μl/孔。同时以病毒稀释液作为病毒对照，以2％FBS的DMEM培养基作阴性对照。

6.细胞板放入37℃5％CO₂培养箱中培养72h。

7.培养完毕后，在显微镜下观察细胞荧光表达百分比，根据Reed-Muench法计算中和抗体效价。

各试验组的中和抗体效价结果见表2，由结果可知，与对照组相比，试验组小鼠血清均产生了高水平中和效价，其中，原液组VSV-G2S_Δ19免疫28天中和效价可达到537，以重组病毒进行灭活所形成的灭活疫苗，首次免疫后21天血清中和效价高达2148。由以上试验结果可知，以本发明方法所拯救得到的重组疫苗株VPSQ及VPSQ1均具有良好的免疫原性及安全性。

表2各试验组的中和抗体效价结果

备注：VSV-G1S_Δ19组及VSV-G2S_Δ19为原液免疫组，灭活苗是由VSV-G2S_Δ19经β-丙内酯灭活后加入佐剂制备而来的。

实施例4仔猪免疫实验

选择PEDV中和抗体水平低于检出限的5只4日龄仔猪进行动物实验：将实施例1收获的病毒(VSV-G1S_Δ19)储液灭活后，以佐剂制备灭活疫苗，以10^6.5TCID₅₀/只剂量接种，通过肌肉注射进行免疫。首次免疫14d后加强免疫。采集初次免疫后第14d、21d及33d血清，通过中和试验检测各时间点的血清抗体水平。

检测结果如下表3。根据检测结果，本发明提供的DIFF-PEDV重组灭活疫苗能够刺激4日龄仔猪体内产生高水平中和抗体。在首次免疫和两周后的加强免疫的方案下，首次免疫后21d、33d的血清中和抗体滴度均高于1：214，是优秀的重组灭活疫苗候选株。

表2仔猪免疫实验结果

仔猪编号	免疫前	14d抗体滴度	21d抗体滴度	33d抗体滴度
					1	0	1:163	1:677	1:515
2	0	1:214	1:2142	1:3910
					3	0	0	1:1627	1:1627
4	0	1:708	1:677	1:391
					5	0	1:22	1:214	1:1627

综上，本发明提供的水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗具有良好的安全性和有效性。在仔猪上进行免疫后，只需进行两次免疫的方案，就能够诱导仔猪产生较高抗体水平。首免后33d，仔猪血清中和抗体水平显著高于从临床阳性血清中测得的抗体水平。这一结果不仅证明了本发明提供的猪传染性腹泻病疫苗(例如VSV-G1S_Δ19以及VSV-G2S_Δ19)的潜在有效性，也为进一步针对PEDV疫苗的研究和开发奠定了坚实的基础。我们期待该疫苗能在未来为养猪业提供一种安全、有效的防控PEDV的新策略。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体的基因组包括将水泡性口炎病毒的基因组中的表面囊膜蛋白编码基因替换为PEDV病毒的刺突蛋白编码基因；

或者，所述重组病毒载体的基因组包括将水泡性口炎病毒的基因组中的表面囊膜蛋白编码基因替换为PEDV病毒的刺突蛋白编码基因，并在水泡性口炎病毒基因组中插入外源蛋白编码基因。

2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述PEDV病毒包括来源于G1谱系的病毒或G2谱系的病毒。

3.如权利要求2所述的重组病毒载体，其特征在于，所述G1谱系的病毒包括PEDV SD-M株，所述G2谱系的病毒包括NH-TA2020株。

4.如权利要求1-3任一项所述的重组病毒载体，其特征在于，所述PEDV病毒的刺突蛋白包括刺突蛋白的截短体，所述截短体选自C端氨基酸缺失对应的蛋白，所述C端缺失氨基酸个数为5个至19个。

5.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白GFP。

6.重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由权利要求1-5所述重组病毒载体的基因组及辅助质粒经反向遗传技术拯救病毒得到；

所述重组病毒包含水泡性口炎病毒核蛋白、水泡性口炎病毒磷蛋白、水泡性口炎病毒基质蛋白、水泡性口炎病毒RNA聚合酶以及PEDV病毒的刺突蛋白，且不包含水泡性口炎病毒表面囊膜蛋白；

所述重组病毒在细胞中不添加胰酶情况下具有复制增殖能力。

7.如权利要求6所述的重组病毒，其特征在于，所述细胞包括仓鼠肾成纤维细胞细胞、非洲绿猴肾细胞或非洲绿猴肾细胞衍生的细胞。

8.如权利要求6-7任一项所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求6-7任一项所述的重组病毒感染敏感细胞株，并收获释放的病毒。

9.一种水泡性口炎病毒为载体的猪传染性腹泻病疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求6-7任一项所述的重组病毒或者权利要求8所述制备方法制得的重组病毒；或者，所述疫苗包括权利要求6-7任一项所述的重组病毒的灭活病毒。

10.权利要求1-5任一项所述的重组病毒载体或权利要求6-7任一项所述的重组病毒、权利要求8制备的重组病毒或权利要求9所述的疫苗的以下任一种应用：

(1)在制备表达PEDV病毒刺突蛋白的重组水泡性口炎病毒中的应用；

(2)在制备用于预防和/或治疗PEDV感染或由PEDV感染引起疾病的药物中的应用；

(3)在制备预防猪传染性腹泻病毒传播和感染疫苗中的应用。