CN119219708A - 一种四价铂类自噬诱导剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有通式I结构的四价铂类自噬诱导剂及其制备方法与应用。本发明化合物对细胞自噬具有诱导作用，并通过自噬降解免疫抑制性蛋白腱糖蛋白‑C(Tenascin‑C)，改善肿瘤免疫抑制微环境。本发明四价铂类配合物通过其独特的结构特点，诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡，同时促进免疫杀伤细胞浸润肿瘤免疫微环境，可用于制备具有多重抗肿瘤机制的新型化学免疫治疗药物，以解决传统治疗效果不佳和缺少小分子免疫治疗剂的问题。

Description

一种四价铂类自噬诱导剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种四价铂类自噬诱导剂及其制备方法与应用。具体地说，本发明四价铂类自噬诱导剂具有降解免疫抑制性蛋白Tenascin-C的作用。

背景技术

癌症发病率和死亡率正迅速增长，是威胁人类健康的主要公共卫生问题。

由于肿瘤异质性和缺乏生物标志物，治疗手段相对局限，以顺铂为代表的铂类药物是主要治疗手段，但是仍有患者出现预后较差、晚期患者生存率较低等问题，这些问题亟待解决。近年来，免疫治疗的发展为突破肿瘤的治愈难点带来了希望，但免疫单药在治疗中的结果对于提升患者长期生存率仍有不足。化疗与免疫联合治疗方案现已进入临床研究，并展现出可接受的安全性以及突出的抗肿瘤活性。因此，开发出能够有效激活免疫系统与化疗发挥协同作用的铂类药物对于肿瘤的治疗具有潜在价值。

免疫抑制性蛋白腱糖蛋白-C(Tenascin-C，简称TNC)是一种细胞外基质糖蛋白，在健康组织中几乎不表达，在肿瘤组织中高表达，尤其是自噬水平较低的肿瘤。Tenascin-C由肿瘤细胞分泌至细胞基质中后在基质中沉积，会与前来杀伤肿瘤的CD8⁺T细胞相互作用，与其结合并将其保留在肿瘤细胞外基质中，使CD8⁺T细胞无法浸润肿瘤细胞影响其功能发挥。Tenascin-C的沉积不仅为癌细胞的黏附、迁移、增殖和血管生成提供了理想的微环境，还可促进肿瘤细胞的生长和发展，降低药物的有效输送；此外，Tenascin-C对T细胞的免疫抑制作用已在乳腺癌、前列腺癌中得到认证。一方面，Tenascin-C通过TLR4诱导并结合CXCL12，将CD8⁺T细胞保留在基质中，使CD8⁺T无法抵达肿瘤靶部位，使其功能受阻，抑制T细胞介导的肿瘤杀伤作用；另一方面，Tenascin-C还可通过TLR4促进乳腺癌肺转移，使巨噬细胞向M2型极化，形成免疫抑制环境以支持肿瘤发展。基于Tenascin-C在肿瘤中所发挥的功能，可见Tenascin-C是受自噬调控的关键免疫抑制分子，在逆转肿瘤的T细胞免疫耐受中具有潜在靶向价值。

免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)是一种特殊的癌细胞死亡方式。当肿瘤细胞受到外界刺激发生死亡时，会产生三类主要的损伤相关分子特征(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，包括垂死细胞表面暴露钙网蛋白、细胞释放ATP分子、分泌高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)。此时垂死的肿瘤细胞有非免疫原性向免疫原性转变，从而导致机体产生抗肿瘤免疫应答。

因此，开发具有ICD诱导能力的化疗药物，在发挥控制肿瘤生长和转移基础抗癌作用外，还能够触发体内免疫反应，招募“正向”免疫细胞在微环境中富集，将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，拮抗免疫逃逸，对于持久有效地抗击肿瘤、降低肿瘤复发率具有重要意义，这也为临床的抗肿瘤研究提供了一种新策略。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种四价铂类自噬诱导剂及其制备方法与应用，尤其是在肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明自噬诱导剂为四价铂类配合物，具有诱导肿瘤细胞自噬能力，能够通过自噬降解免疫抑制蛋白Tenascin-C，同时诱导肿瘤发生免疫原性细胞死亡，对三阴性乳腺癌细胞展现出优异的活性。本发明四价铂类配合物通过其独特的结构优势，集合诱导癌细胞自噬与诱导免疫响应作用，可用于制备具有多重抗肿瘤机制的新型化疗免疫药物，以解决传统治疗效果不佳和缺少小分子免疫治疗剂的问题。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种具有通式I的四价铂类自噬诱导剂：

其中，

的结构为以下任意一种：

本发明所述的四价铂类自噬诱导剂，优选以下化合物：

本发明还提供了所述的四价铂类自噬诱导剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将二价铂配合物与双氧水H₂O₂反应制得四价铂配合物；

其中，所述二价铂配合物选自以下任意一种化合物：

(2)将步骤(1)制得的四价铂配合物与酮咯酸CAO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、三乙胺(TEA)共同溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下搅拌，至反应结束：

(3)离心，上清液浓缩，得到浓缩液；加入适量甲醇，与浓缩液混合均匀后，加入至异丙醇中沉淀出固体，离心，弃去上清液，沉淀用异丙醇、乙醚反复洗涤，干燥即得目标产物。

本发明一种优选地实施方式是，步骤(2)中，将步骤(1)制得的四价铂配合物与酮咯酸CA溶解于DMF中，缓慢加入TBTU和TEA，搅拌溶解，室温反应48h。

优选地，步骤(3)中，所述干燥方式为真空干燥。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述的四价铂类自噬诱导剂以及药学上可接受的载体或辅料。

本发明的药物组合物可以采用各种已知的方式施用，例如口服、胃肠外施用、通过吸入喷雾施用或经由植入的贮库施用。本发明的药物组合物可单独给药，也可与其他药物联合用药。口服组合物可以是任何口服可接受的剂型，包含但不限于片剂、胶囊剂、乳剂以及混悬剂、分散物和溶液。

常用的药学上可接受的载体或辅料包括稳定剂、稀释剂、表面活性剂、润滑剂、抗氧化剂、粘合剂、着色剂、填充剂、乳化剂等。

无菌可注射组合物可按照本领域已知的技术使用适合的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。可以使用的药学上可接受的载体和溶剂包括水、甘露醇、氯化钠溶液等。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得对特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗响应、对患者无毒的活性成分的量。所选择的的剂量水平取决于多种因素，包括所用的具体的本发明的化合物或其盐的活性、施用途径、施用时间、所用的具体组合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况和既往病史以及医学领域中公知的类似因素。

本发明还提供了所述的四价铂类自噬诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明一种具体地优选实施方式是，所述四价铂类自噬诱导剂用于制备肿瘤免疫治疗药物。

所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、头颈部癌或胶质细胞瘤。

本发明还提供了一种化学免疫抗癌剂，其有效成分为PCA。

有益效果：

(1)本发明制备的四价铂类自噬诱导剂具有激活免疫效果，在血浆及正常组织中保持低活性，在肿瘤细胞还原性环境中被还原为二价铂配合物和酮咯酸，并发挥药效。研究发现，PCA既可以通过DNA损伤、细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡等化疗作用发挥肿瘤杀伤活性；又可以诱导肿瘤的免疫原性死亡，同时通过诱导肿瘤细胞自噬降解免疫抑制蛋白Tenascin-C，促进肿瘤免疫微环境中细胞毒性T细胞、M1型巨噬细胞的增加，M2型巨噬细胞减少，从而实现肿瘤的免疫抑制。

(2)本发明通过将酮咯酸(CA)连接到顺铂衍生物上得到四价铂配合物，该制备方法简单易行，合成原料易得。

(3)本发明制备的四价铂类自噬诱导剂是以自噬为主导的新型作用机制的化学免疫抗癌剂，具有化疗和触发免疫双重抗肿瘤作用，在免疫联合治疗方面具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCA的¹H-NMR谱图(DMSO-d₆，500MHz)；

图2为本发明实施例1中PCA的¹³C-NMR谱图(DMSO-d₆，126MHz)；

图3为本发明实施例1中PCA的¹⁹⁵Pt-NMR谱图(DMSO-d₆，86MHz)；

图4为本发明实施例1中PCA的HR-ESI-MS(CH₃OH)谱图；

图5为PCA对MDA-MB-231细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达影响；其中，图5A为对γ-H2AX蛋白表达影响的效果图；图5B为γ-H2AX蛋白表达WB条带灰度分析统计图；

图6为PCA对MDA-MB-231细胞周期阻滞的影响效果；

图7为PCA对MDA-MB-231细胞凋亡的影响效果；

图8为PCA对MDA-MB-231细胞的死亡方式诱导情况；

图9为PCA对MDA-MB-231细胞超微结构中自噬溶酶体和自噬小体的影响情况；

图10为PCA对MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白LC3、p62的影响；其中，图10A为蛋白表达变化的条带图；图10B为LC3-II蛋白表达灰度分析图，图10C为p62蛋白表达灰度分析图。

图11为PCA对MDA-MB-231细胞自噬相关蛋白LC3(图11A)与p62(图11B)蛋白变化免疫荧光图。

图12为PCA对MDA-MB-231细胞免疫原性细胞死亡分子标志的影响；其中，图12A为给药后细胞表面CRT免疫荧光图，图12B为细胞表面CRT流式检测荧光分布图；图12C为细胞表面CRT流式平均荧光强度统计图；图12D为培养基中ATP释放量；图12E为培养基中HMGB1释放量检测；

图13为化合物PCA的体内抑瘤实验结果；其中，图13A为给药处理后取下的皮下移植瘤图片；图13B为肿瘤体积变化情况；图13C为肿瘤重量差异情况；图13D为小鼠体重变化情况；

图14为PCA对Balb/c小鼠4T1乳腺癌移植肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3、p62以及免疫抑制性蛋白Tenascin-C的表达情况的影响(图14A)；PCA给药后，流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中辅助T细胞(CD4⁺T细胞)、细胞毒性T细胞(CD8⁺T细胞)、M1型巨噬细胞(CD86⁺)、M2型巨噬细胞(CD206⁺)变化情况(图14B)；肿瘤组织中Tenascin-C和CD8⁺T细胞的荧光强度变化(图14C)以及血清中炎症细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10的变化情况(图14D)；

图15为本发明PCA的作用机制示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

本发明具体实施例中使用的起始原料、反应试剂等均为市售。本发明可以采用本领域常用的成盐方法制备成盐的形式，例如：室温下，将化合物溶于盐酸乙醇中进行反应，生成盐酸盐；或者向其中加入苯磺酸进行反应生成苯磺酸盐。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。

实施例1四价铂配合物PCA的合成

(1)将1g顺铂(Cisplatin)置于烧瓶中，加入40ml水搅拌至溶解，再缓慢滴加30％双氧水50mL，加热至75℃，避光搅拌5h后，趁热过滤，4℃冰箱放置两天，真空干燥即可得到四价的Oxoplatin淡黄色晶体，产率为76％。

(2)称取100mg Oxoplatin、229.24mg CA、289mg TBTU置于圆底烧瓶中，加入约20mL DMF使其溶解，搅拌下向反应体系内缓慢滴入125μL TEA，室温避光反应48h。

(3)反应结束后，反应液离心，收集上清液进行旋蒸，以除去溶剂DMF，待液体浓缩至1～2mL，停止旋蒸，加入约3mL甲醇分散均匀，缓慢滴入30mL异丙醇中，析出灰白色絮状物。离心保留沉淀，加入少量的异丙醇、乙醚反复清洗3次，抽真空干燥，所得灰色固体即为四价铂配合物PCA，产率：43％。

四价铂配合物PCA的¹H-NMR谱图(DMSO-d6，500MHz)见图1、¹³C-NMR谱图(DMSO-d6，126MHz)见图2、¹⁹⁵Pt-NMR谱图(DMSO-d6，86MHz)见图3、高分辨质谱(CH₃OH)见图4。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ(ppm)7.77-7.75(d 4H),7.62-7.59(t,2H),7.54-7.51(t,4H),6.78-6.77(d,2H),6.56(s,6H),6.21 -6.20(d,2H),4.44 -4.42(m,2H),4.26-4.24(m,2H),4.20-4.17(t,2H),2.79-2.73(m,2H),2.71-2.67(m,2H)。

¹³C-NMR(126MHz,DMSO-d₆,ppm):183.92,178.61,145.58,139.55,131.86,128.90,128.83,126.34,124.89,104.25,47.90,46.32,43.94,31.57,25.99,9.15。

¹⁹⁵Pt-NMR(86MHz,DMSO-d₆,ppm):1214.34。

ESI-MS(negative,m/z):804.09795,805.11215,806.11415,807.11249,808.11232,809.11225,810.11349,812.11544。

实施例2化合物PCA的细胞毒活性测试

对本发明实施例1制备的化合物PCA进行肿瘤细胞抑制增殖试验，试验方法采用CCK-8法。

分别选用肿瘤细胞株MDA-MB-231、A549、A549/DDP、Huh7、SGC7901、Panc-1，以及正常细胞株HK-2，细胞系均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

培养条件如下：

MDA-MB-231：10％ FBSDMEM完全培养基；

A549：10％ FBS RPMI-1640完全培养基；

A549/DDP：10％ FBS RPMI-1640完全培养基；

Huh7：10％ FBSDMEM完全培养基；

SGC7901：10％ FBSDMEM完全培养基；

Panc-1：10％ FBS RPMI-1640完全培养基；

HK-2：10％ FBSDMEM完全培养基。

上述胎牛血清及培养基购于Gibco公司。

以PCA和顺铂(CDDP)为待检测药物，将待检测物作用于细胞48h后，观察细胞的存活情况，计算测试细胞半数抑制浓度，具体操作步骤如下：

(1)收集上述对数期细胞，用上述完全培养基重悬，调整细胞悬液的浓度为3×10³个/mL，接种于96孔板中，每个孔200μL，设置3个复孔；

(2)将上述实验细胞置于CO₂浓度为5％的细胞培养箱中，37℃培养24h至细胞贴壁；

(3)药物溶液配制：将PCA与顺铂分别用DMSO配制母液，按200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625μM浓度用无血清培养基(Gibco)进行梯度稀释，加入上述铺满细胞的96孔板中，每个浓度设3个复孔，孵育48h；

(4)将CCK-8试剂(购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)用无血清培养基稀释10倍，每孔加入含有10μL CCK-8试剂的培养基100μL，继续孵育1h；

(5)酶标仪450nm处检测每个孔的吸光度值；

(6)按以下公式计算细胞存活率：

其中，Abs(sample)为样品组细胞的吸光度值；Abs(blank)为不含细胞、仅含CCK-8培养基溶液的空白组中液体的吸光度值；Abs(control)为未经过药物处理的对照组细胞的吸光度值；

(7)作出细胞存活率-浓度曲线，计算化合物的半抑制浓度(IC₅₀)，结果见表1。

表1PCA、顺铂对不同细胞的IC₅₀值(μM，48h)

表1中结果显示，PCA对各种测试的肿瘤细胞株均表现出了较高的毒性，且效果显著优于顺铂。对于顺铂活性较弱的人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，PCA仍然表现出了高毒性，约是顺铂的26倍。这说明PCA可能具有治疗三阴性乳腺癌的潜力。并且PCA具有一定的选择性，对正常细胞毒性较小。

实施例3化合物PCA对肿瘤细胞DNA损伤研究

通过Western blot技术测试细胞内γ-H2AX的蛋白表达水平，检测PCA对MDA-MB-231肿瘤细胞造成的DNA损伤。

具体实施方式如下：

(1)收集对数期细胞，接种于6孔板上，每孔细胞数量约20万个，在37℃，5％ CO₂条件下孵育过夜。吸弃旧培养基，用无血清培养基将CDDP稀释成2μM，PCA稀释成0.5、1、2μM三个不同浓度，每孔加入1mL，培养箱内继续孵育24h；

(2)蛋白提取：收集细胞，通过蛋白酶抑制剂(美国Thermo公司)、磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司)和RIPA裂解液(碧云天)提取全蛋白，冰上裂解30min，高速离心，12000rpm15min，取上层清液通过BCA法测定蛋白浓度；

(3)样品制备：通过加水和5×Loading buffer(碧云天)把各个样品的蛋白浓度稀释成1μg/μL，金属浴100℃孵育15min，获得蛋白样品；

(4)在电泳缓冲液(3.03g Tris、18.77g甘氨酸、1g SDS定容至1000mL去离子水)进行电泳，每孔中加入10μL各蛋白样品，电泳条件为浓缩阶段电压80V，30min，分离阶段120V，60min，电泳结束后，进行转膜，转膜的条件为0.32A，60min；

(5)封闭液(5％BSA稀释，购于南京生兴生物技术有限公司)在室温条件下封闭1h后，用相应一抗γ-H2AX(武汉爱博泰克生物科技有限公司)孵育PVDF条带4℃过夜，用1×TBST洗涤三次，每次7min；

(6)选用HRP标记山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)室温孵育1h，1×TBST洗涤三次，化学发光仪进行曝光，结果见图5。

由图5结果可知：与未经药物处理的Control组相比，PCA能够引起MDA-MB-231细胞中γ-H2AX的显著上调，且诱导上升的程度显著高于CDDP，说明PCA对DNA造成显著损伤，DNA损伤信号通路正在活化。

实施例4化合物PCA对肿瘤细胞周期阻滞的研究

本实施例通过流式细胞术测试细胞周期阻滞情况。

具体实施方式如下：

(1)将MDA-MB-231细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板上，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清培养基(Gibco)将CDDP稀释成2μM，PCA稀释成0.5、1、2μM三个不同浓度，每孔加入1mL，37℃，5％ CO₂继续培养24h。

(2)孵育结束后，将含药培养基弃去，PBS清洗两遍，用胰酶(Gibco)消化后，1000rpm离心3min，再用PBS重悬离心清洗2次，然后每管加入1mL预冷的70％乙醇，用移液器轻轻吹打使细胞成单个细胞并均匀悬浮，4℃过夜固定(12h)。

(3)将固定好的细胞离心，用预冷PBS清洗2次，提前将PI试剂与RNA酶A按9:1的体积比混合制成工作液，每个样品加入500μL混合好的工作液，37℃避光孵育30min，将孵育好的样品于流式细胞仪上样(使用的PI试剂、RNA酶A以及工作液均来自细胞周期检测试剂盒，购于江苏凯基生物技术股份有限公司)。实验结果见图6。

由图6可知，与未经药物处理的Control组相比，0.5、1、2μM的PCA作用于MDA-MB-231后，对细胞周期产生阻滞作用，G0/G1期细胞减少，S期和M期细胞增加，即主要影响了细胞DNA复制和有丝分裂，并且其阻滞程度具有浓度依赖性。

实施例5化合物PCA诱导肿瘤细胞凋亡的研究

通过流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法测试给药后肿瘤细胞凋亡的情况。

具体实施方式如下：

(1)将MDA-MB-231细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板上，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清培养基(Gibco)将CDDP稀释成2μM，PCA稀释成0.5、1、2μM三个不同浓度，每孔加入1mL，37℃，5％ CO₂继续培养48h。

(2)孵育结束后，将含药培养基弃去，PBS清洗两遍，用不含EDTA的胰酶(Gibco)消化细胞，终止消化后收集细胞，1000rpm、4℃离心5min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在1000rpm、4℃离心5min，弃上清。

(3)每个样品先加入100μl 1×Binding Buffer，再加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI Staining Solution，轻轻吹匀，室温避光孵育10min；最后加入400μl 1×BindingBuffer，轻轻混匀。染色后样品在1h内用流式细胞仪检测(使用的Annexin V-FITC、PIStaining Solution以及1×Binding Buffer均来自细胞凋亡检测试剂盒，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。结果如图7所示。

由图7结果可知，与未经药物处理的对照组相比，顺铂诱导肿瘤细胞凋亡能力较弱，2μM时仅有19％细胞发生凋亡。而PCA在低、中、高浓度下诱导细胞凋亡能力均强于顺铂，在0.5μM时能够引起30％的细胞凋亡，且凋亡率随给药浓度升高而增加，但凋亡率在2μM浓度时为39％，与其IC₅₀浓度(0.9μM)不符，提示PCA也诱导了除凋亡之外的其他死亡方式。

实施例6化合物PCA诱导肿瘤细胞死亡方式的研究

通过加入不同死亡方式抑制剂采用CCK-8法探究给药后肿瘤细胞存活的情况。

具体实施方式如下：

(1)将MDA-MB-231细胞以5×10³/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，弃去旧培养基。设置空白对照组、PCA组浓度为2μM、抑制剂组分别为凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD，10μM)、自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA，100μM)、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Ferr-1，10μM)、坏死抑制剂Necrostatin-1(Necro-1，10μM)、焦亡抑制剂Disulfiram(DSF，10μM)，以及PCA和抑制剂混合组。

(2)每孔加入100μL含有PCA、抑制剂或PCA与抑制剂混合的培养基，空白对照组加入无血清培养基，待药物作用48h后，弃去旧培养基。每孔加入含有10μL CCK-8试剂(购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司)100μL，继续孵育1h；

(3)酶标仪450nm处检测每个孔的吸光度值；

(4)按以下公式计算细胞存活率：

其中，Abs(sample)为样品组细胞的吸光度值；Abs(blank)为空白组(不含细胞，仅含有CCK-8的无血清培养基)中液体的吸光度值；Abs(control)为未经过药物处理的对照组细胞的吸光度值，结果见图8。

由图8结果可知，与单独给药PCA组相比，PCA与3-MA联用后细胞存活率由56％回升到93％(图8B)，3-MA能高效抑制PCA诱导的细胞死亡，说明PCA通过调控自噬信号通路影响肿瘤细胞存活。另外，PCA与Z-VAD联用细胞存活率提升到75％(图8A)，说明PCA也能够诱导细胞凋亡。而其余焦亡、坏死、铁死亡抑制剂对细胞存活率无明显影响(图8C-E)。因此，经PCA处理的MDA-MB-231细胞发生以自噬性死亡为主，凋亡为辅的多类型死亡方式。

实施例7化合物PCA诱导肿瘤细胞自噬的研究

对本发明实施例1制备的PCA处理肿瘤细胞后，细胞内自噬水平进行探究，试验方法采用透射电镜法、Western blot法、免疫荧光法。细胞株选用MDA-MB-231。

透射电镜法：收集对数期生长的MDA-MB-231细胞，细胞贴壁后，弃去原培养基，分别加入含有2μM顺铂或2μM PCA的含药培养基(Gibco公司)，设置对照组(加入无血清培养基)，37℃，5％CO₂继续培养6h。样品组预冷PBS洗2次，胰酶消化后加入1mL电镜固定液，经脱水、渗透、包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察，结果见图9。

由图9结果可知，对照组与顺铂组可见少量自噬溶酶体产生，说明在正常情况或经顺铂处理后，细胞内自噬水平较低，顺铂几乎不诱导细胞自噬；胞浆中线粒体形态结构呈圆形或椭圆形，嵴清晰平整、排列整齐，说明线粒体结构较为正常，损伤不明显。而PCA组的细胞质中可见大量自噬溶酶体和自噬小体，说明PCA处理后的细胞发生大量自噬。另外，胞浆中大部分线粒体体积明显缩小，呈现球状、杆状，发生明显固缩，嵴变粗、减少甚至消失，嵴间腔明显增宽，说明PCA会导致线粒体损伤。

Western blot法：

(1)将MDA-MB-231细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板上，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清培养基(Gibco)将CDDP稀释成2μM，PCA稀释成0.5、1、2μM三个不同浓度，每孔加入1mL，37℃，5％ CO₂继续培养6h。

(2)蛋白提取：收集细胞，通过蛋白酶抑制剂(美国Thermo公司)、磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司)和RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)提取全蛋白，冰上裂解30min，高速离心，12000rpm 15min，取上层清液通过BCA法测定蛋白浓度；

(3)样品制备：通过加水和5×Loading buffer(中国上海碧云天生物技术有限公司)把各个样品的蛋白浓度稀释成1μg/μL，金属浴100℃孵育15min，获得蛋白样品；

(4)在电泳缓冲液(3.03g Tris、18.77g甘氨酸、1g SDS定容至1000mL去离子水)中进行电泳，每孔中加入10μL各蛋白样品，电泳条件为浓缩阶段电压80V，30min，分离阶段120V，60min，电泳结束后，进行转膜，转膜的条件为0.32A，60min；

(5)封闭液(5％ BSA稀释)在室温条件下封闭1h后，用相应一抗LC3(武汉三鹰生物科技有限公司)和p62(武汉三鹰生物科技有限公司)分别孵育PVDF条带4℃过夜，用1×TBST洗涤三次，每次7min；

(6)选用HRP标记山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)室温孵育1h，1×TBST洗涤三次，化学发光仪进行曝光，结果见图10。

由图10结果可知，与对照组相比，顺铂组LC3-II有轻微增加，p62下调不明显；而PCA组LC3-II显著增加，p62明显下调。为了放大LC3、p62蛋白变化情况，加入30μM氯喹(CQ)阻断自噬，发现PCA组诱导的自噬小体膜上的LC3-II蛋白稍有增加。

免疫荧光法：

将MDA-MB-231细胞以8×10⁴/孔的密度接种于爬片上，细胞贴壁后，弃去原培养基，设置仅加入无血清培养基的对照组，以及含药培养基，分别为顺铂组2μM、以及PCA药物浓度为2μM。经药物处理6h后，弃去含药培养基，PBS洗3次，每次5min，每孔加入500μL 4％多聚甲醛15min，PBS润洗3次，加入0.1％Triton-100破膜，PBS清洗，加入5％山羊血清(美国Gibco公司)室温孵育1h进行封闭，吸干封闭液，4℃过夜孵育一抗LC3(武汉三鹰生物科技有限公司)和p62(武汉三鹰生物科技有限公司)，孵育结束后，PBS洗3次，加入对应二抗(Goatanti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody，HRP购于美国Thermo公司)孵育1h，PBS洗去二抗，DAPI(上海碧云天生物技术有限公司)染色5min，用激光共聚焦显微镜拍摄荧光，结果见图11。

由图11结果可知，免疫荧光结果显示PCA处理后LC3荧光强度增强(图11A)、p62荧光强度降低(图11B)，说明PCA能够诱导自噬。

实施例8PCA诱导肿瘤细胞免疫原性死亡分子标志检测

对本发明实施例1制备的PCA处理细胞后发生免疫原性死亡的早期分子机制进行研究，试验方法采用免疫荧光、流式细胞术、ELISA法。细胞株选用MDA-MB-231，将PCA作用于细胞24h后，检测细胞表面的钙网蛋白(CRT)、胞外分泌的ATP和后期释放到胞外的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)含量，具体操作步骤如下：

(1)将MDA-MB-231细胞接种于24孔板的爬片上培养，在37℃培养24h，加入含药无血清培养基(Gibco公司)继续培养24h；

(2)孵育结束后，用冷PBS洗2次，4％多聚甲醛固定15分钟，用3％BSA稀释的5％山羊血清白蛋白(Gibco公司)封闭1小时，加入CRT抗体(美国Abcam公司)(1:50，5％BSA稀释)并在4℃下孵育过夜；

(3)用冷PBS洗三次，将细胞与FITC荧光二抗(Cell Signaling Technology公司)(1:500，TBST稀释)避光孵育1h，再用PBS洗后，用DAPI染色5分钟，用PBS清洗后，通过激光扫描共聚焦显微镜拍摄细胞荧光，结果见图12A。

(4)将MDA-MB-231细胞以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板，放置于培养箱中，细胞贴壁后，弃去原培养基，加入含药培养基，设置对照组(加入无血清培养基)、顺铂组8μM、以及PCA药物浓度分别为2μM、4μM、8μM。经药物处理24h后，弃去含药培养基，预冷PBS洗2次，胰酶消化收集至离心管，离心800rpm，5min，PBS洗2次，每管加1％ BSA封闭30min，PBS洗2次，加入CRT抗体(美国Abcam公司)(1:50，5％BSA稀释)室温孵育30min，立即用流式细胞仪检测，结果见图12B、图12C。

(5)将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，数量为2×10⁵个细胞/孔，培养24小时后，弃去培养基，分别加入1mL含有8μM顺铂和1μM、2μM、4μM、8μM PCA的无血清培养基，继续培养24h，仔细收集上层清液，并根据制造商提供的说明书，使用增强型ATP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，S0027)检测上层清液中的ATP浓度。结果见图12D。

(6)将MDA-MB-231细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板上，待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入1mL含有8μM顺铂和1μM、2μM、4μM、8μM PCA的无血清培养基，继续培养36h，收集上层清液，根据制造商提供的说明书，使用ELISA检测试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，NOV-NB-S11133)对上层清液中的HMGB1进行检测。结果见图12E。

图12中结果显示，与未经药物处理的Control组相比，PCA作用于MDA-MB-231细胞后，有较明显的CRT暴露，并且CRT呈斑点状、不均匀地分布在细胞的表面，细胞膜表面CRT明显增加(见图12A-C)；释放的ATP(图12D)和HMGB1(图12E)显著增加。通过对这些标志的验证，进一步证实PCA具有良好的诱导ICD潜能。

实施例9化合物PCA的体内抑瘤实验

(1)皮下瘤移植：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，调整细胞浓度至2×10⁶个/mL，取0.1mL细胞悬液注射于Balb/c小鼠(雌性、6周龄、18～20g，购于杭州子源实验动物科技有限公司)左腋下方皮下。观察肿瘤生长情况，肿瘤长至5mm×5mm时移植瘤造模成功。每日测量肿瘤长、宽，根据体积＝长*宽*宽/2计算肿瘤体积。

(2)待肿瘤体积达到100mm³后，将以上18只小鼠随机分为3组(Control组、CDDP组和PCA组)，两个给药组尾静脉分别注射给予5mg/kg顺铂、13.5mg/kg PCA，对照组给予等体积生理盐水，每两天注射1次，给药结束后，取瘤并称重拍照，记录并观察给药期间皮下瘤的体积。

(3)数据处理：数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prime 8.0软件进行分析；两组间比较采用非配对的双侧t检验。结果见图13。

由图13可知，与对照组相比，给予顺铂后，肿瘤体积有所降低，但降低幅度减小，肿瘤生长抑制率为13.88％，说明顺铂对于三阴性乳腺癌的治疗效果较弱；给予PCA治疗后，小鼠肿瘤重量明显减小，肿瘤生长抑制率为57.71％，约为顺铂的4.2倍，治疗效果显著优于顺铂。

实施例10化合物PCA的体内诱导自噬促进免疫杀伤细胞浸润

通过Western blot对给药后小鼠肿瘤的自噬相关蛋白LC3、p62以及免疫抑制性蛋白Tenascin-C变化进行检测；通过流式细胞术对给药后小鼠肿瘤微环境中细胞毒性T细胞(CD8⁺T细胞)、辅助T细胞(CD4⁺T细胞)、M1型巨噬细胞(CD86⁺细胞)、M2型巨噬细胞(CD206⁺细胞)的变化进行检测；通过免疫荧光对给药后小鼠肿瘤中Tenascin-C和CD8⁺T表达进行检测；通过ELISA技术对小鼠血清中的炎症细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10)水平进行检测。

具体实施方案如下：

(1)将实施例9中的Balb/c小鼠处死后，收集肿瘤加入500μL RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)、蛋白酶抑制剂(美国Thermo公司)、磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司)，匀浆仪研磨后冰上裂解30min，高速离心12000rpm、15min，取上层清液通过BCA法测定蛋白浓度；

(2)样品制备：通过加水和5×Loading buffer(中国上海碧云天生物技术有限公司)把各个样品的蛋白浓度稀释成5μg/μL，金属浴100℃孵育15min，获得蛋白样品；

(3)在电泳缓冲液(3.03g Tris、18.77g甘氨酸、1g SDS定容至1000mL去离子水)中进行电泳，每孔中加入10μL各蛋白样品，电泳条件为浓缩阶段电压80V，30min，分离阶段120V，60min，电泳结束后，进行转膜，转膜的条件为0.32A，60min；

(4)封闭液(5％ BSA稀释)在室温条件下封闭1h后，用相应一抗LC3(武汉三鹰生物科技有限公司)和p62(武汉三鹰生物科技有限公司)、Tenascin-C(武汉三鹰生物科技有限公司)分别孵育PVDF条带4℃过夜，用1×TBST洗涤三次，每次7min；

(4)选用HRP标记山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)室温孵育1h，1×TBST洗涤三次，化学发光仪进行曝光，结果见图14A。

(5)将肿瘤制备为单细胞悬液。在37℃将肿瘤剪碎并用酶混合物(I型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶I，sigma公司)消化1h。消化过程中每隔15min颠倒混匀一次，消化完成后，将混合物轻轻研磨并通过200目筛网过滤，以获得单细胞悬浮液。

(6)用红细胞裂解液(sigma公司)去除单细胞悬液中的红细胞，并使用1×PBS洗涤两次。

(7)收集的细胞用抗小鼠CD16/32(美国BioLegend公司)阻断，根据制造商提供说明书用APC抗小鼠CD3(CD3-APC)、FITC抗小鼠CD4(CD4-FITC)、PE抗小鼠CD8a(CD8a-PE)、Brilliant Violet 421^TM抗小鼠CD86(CD86-Brilliant Violet 421^TM)、PE抗小鼠CD206(CD206-PE)、PE/Cyanine7抗小鼠F4/80(F4/80-PE/Cyanine7)(美国BioLegend公司)进行染色。最后，通过流式细胞术分析染色细胞，结果见图14B。

(8)将肿瘤冰冻切片室温放置30分钟，4％多聚甲醛固定10分钟，PBS洗3次，5分钟/次，加入封闭液(5％ BSA稀释)在室温条件下封闭1h后，用Tenascin-C(武汉三鹰生物科技有限公司)和CD8⁺T(美国BioLegend公司)孵育4℃过夜，PBS洗3次后吸干液体，加入AlexaFluor^TM 647山羊抗鼠IgG2a(美国Thermo公司)孵育1h，PBS洗3次，加入含DAPI抗荧光淬灭剂(上海碧云天生物技术有限公司)封片，共聚焦显微镜下观察荧光，结果见图14C。

(9)将小鼠进行摘除眼球采血，取得的血液室温放置1h，待其凝固分层，3500rmp离心15min，小心吸取收集上层血清，通过ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)检测血清中细胞因子IL-6、IFN-γ和IL-10的水平，结果如图14D所示。

图14中结果显示，在治疗结束时，与注射生理盐水的对照组相比，顺铂组LC3-I向LC3-II转化略有增加、p62、Tenascin-C有所降低，但均不显著。而PCA组的肿瘤组织LC3-II明显增加，p62和Tenascin-C蛋白表达显著减少，说明体内肿瘤经PCA治疗后，肿瘤组织中发生大量自噬，造成Tenascin-C降解(图14A)。经PCA治疗后，小鼠体内的肿瘤免疫微环境发生了显著变化。首先，小鼠肿瘤组织中CD8⁺T和CD4⁺T比例显著增加，CD4⁺T增加了5倍，CD8⁺T增加了8倍，这说明PCA在体内可以增加免疫细胞浸润肿瘤以达到协同杀伤肿瘤的作用。其次，M1型巨噬细胞大约增加了2倍；M2型巨噬细胞降低了5倍，说明PCA促进了巨噬细胞从M2型向M1型的极化(图14B)。相比于对照组，顺铂给药组CD8⁺T细胞表面标志物CD8和Tenascin-C荧光强度无明显变化。在PCA治疗组中观察到CD8荧光增强，Tenascin-C荧光减弱，说明给药PCA一段时间后，PCA能刺激小鼠肿瘤部位Tenascin-C减少，从而增加CD8⁺T细胞的浸润，进而发挥更好的抗癌作用(图14C)。另外，血清中的促炎细胞因子IL-6、IFN-γ升高；抗炎细胞因子IL-10降低，进一步证明Pt-FFA可以激活强大的免疫反应(图14D)。

综上所述，如图15所示，PCA具有多重抗肿瘤的活性。PCA能够通过诱导自噬进而导致更多的Tenascin-C被降解，从而增加CD4⁺T、CD8⁺T细胞的浸润，促进M2型巨噬细胞向M1型转化，重塑肿瘤免疫微环境；还能够诱导肿瘤免疫原性死亡，具有化疗-免疫治疗协同的抗肿瘤特性。因此，本发明提供的四价铂类自噬诱导剂能够用于制备抗肿瘤药物，在化疗免疫抗癌药物开发方面具有较大的应用前景。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (8)

1.一种具有通式I的四价铂类自噬诱导剂：

其中，

的结构为以下任意一种：

2.根据权利要求1所述的四价铂类自噬诱导剂，其特征在于选自：

3.一种权利要求1～2任一项所述的四价铂类自噬诱导剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将二价铂配合物与双氧水H₂O₂反应制得四价铂配合物；

其中，所述二价铂配合物选自以下任意一种化合物：

(2)将步骤(1)制得的四价铂配合物与酮咯酸CAO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯TBTU、三乙胺共同溶解于二甲基甲酰胺DMF中，室温下搅拌，至反应结束；

(3)离心后浓缩上清液，得到浓缩液；加入甲醇，与浓缩液混合均匀后，加入至异丙醇中沉淀出固体，离心，弃去上清液，沉淀用异丙醇、乙醚反复洗涤，干燥即得目标产物。

4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的四价铂类自噬诱导剂以及药学上可接受的载体或辅料。

5.权利要求1～2任一项所述的四价铂类自噬诱导剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述四价铂类自噬诱导剂用于制备肿瘤免疫治疗药物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌、前列腺癌、头颈部癌或胶质细胞瘤。

8.一种化学免疫抗癌剂，其特征在于，其有效成分为PCA。