CN119213126A

CN119213126A - 基于rna对镰刀菌属的脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的控制

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Publication number: CN119213126A
Application number: CN202380040655.9A
Authority: CN
Inventors: U·德维塞提; Y·方; A·E·加尔格; C·劳伦斯; S·米什拉; M·L·米尔纳; K·斯里德哈兰
Original assignee: Greenlight Biosciences Inc
Current assignee: Greenlight Biosciences Inc
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2023-04-06
Publication date: 2024-12-27
Also published as: WO2023196934A3; MX2024012399A; WO2023196934A2; EP4504944A2

Abstract

本公开涉及一种使用dsRNA来减少或消除镰刀菌属的真菌病原体禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的DON产生和/或控制所述镰刀菌属的禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的方法。在特定实施例中，描述了通过使用施用于植物的外源性dsRNA施加，通过引起死亡、生长抑制、毒力或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低来控制DON产生和/或控制真菌病原体的方法和组合物，所述植物感染或可感染产生DON或以其它方式与引起赤霉病的镰刀菌复合物相关的镰刀菌属的禾谷镰刀菌或另一成员。

Description

基于RNA对镰刀菌属的脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生的控制

本申请要求于2022年4月6日提交的美国临时申请第63/328,216号、于2023年3月6日提交的美国临时申请第63/488,689号的权益和优先权，所述美国临时申请的内容特此通过引用整体并入。

电子序列表的引用

本申请含有已经以.XML格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2023年4月6日的所述.XML副本命名为“16206022PC0_SequenceListing.xml”并且大小为518,000字节。此.XML文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且特此通过引用整体并入本文。

背景技术

镰刀菌属赤霉病(FHB)是一种小麦、大麦和其它小谷物的疮痂病，由镰刀菌的复合物引起。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是此复合物中分布最广以及经济影响最大的种之一，因为其能够产生高水平的霉菌毒素。感染了镰刀菌属可能导致显著的产率损失和谷物品质下降，以及在动物和人类摄入后还会产生霉菌毒素(Ireta和Gilchrist,1994；Baht等人,1989；Luo,1988；Snidjers,1989；Marasas等人,1988)。特别重要的不仅是真菌感染对小麦和/或大麦叶球造成的坏死性损害，更具体地是相关的霉菌毒素(例如，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol)或“DON”)污染，这通常会导致谷物质量下降，从而影响定价和到终端市场的分销(Foroud等人,2019)。据估计，1993年美国因FHB造成的损失超过10亿美元，并且1994年的损失为5亿美元。据估计，最近，1993-2001年间美国因流行病FHB出现造成的损失为76.7亿美元(Mielniczuk和-Bednarz,2020)。据估计，在中国，在流行病年份，FHB可能会影响至多700万公顷的土地，并且可能损失250万吨谷物。据报道，中国、印度和日本都有人类因摄入霉菌毒素而患病，而据报道，世界许多地方都有动物因摄入霉菌毒素而患病(Dubin等人,1997)。

在开花期通过花药发生感染，随后通过在小花的其它部位定殖，然后进入叶轴的脉管和髓，并从那里向叶球上下扩散(Trail等人综述,2005)。FHB复合物中的许多镰刀菌会产生单端孢霉烯毒素。例如，禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌(F.culmorum)可能产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，并且拟枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)可能产生T-2毒素。已经描述了许多镰刀菌都能生物合成其它霉菌毒素，如伏马菌素和玉米烯酮(ZEA)(Desjardins,2006)，所述镰刀菌包括产生ZEA的禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌两者(Mielniczuk和-Bednarz,2020)。单端孢霉烯生物合成途径的第一关键步骤是由TRI5编码的单端孢霉烯合酶催化的焦磷酸法呢酯向单端孢霉烯的转化(Hohn和Beremand,1989)。TRI5和基因簇中的其它基因的表达与单端孢霉烯在植物体内和体外培养物两者中的产生相关(Brown等人,2004；Kimura等人,2003)。

除了单端孢霉烯在疾病过程中的作用之外，其在谷物中的存在对人类和动物健康也有重要影响。在欧洲和美国，谷物中的这些毒素的浓度正受到越来越严格的审查，目前已准备对谷物和食品中的单端孢霉烯(如DON)的污染实行法律限制(Anonymous,2005；vanEgmond等人,2007)。在哺乳动物系统中，DON已被证明是一种强大的转化抑制剂，并且导致农场动物(如猪)出现急性症状(如呕吐和拒食)，以及生长迟缓、卵巢功能减退和免疫抑制等慢性症状(Bennett和Klich,2003；Rocha等人,2005)。

为了解决这些问题，本发明尤其涉及局部施加双链RNA(“dsRNA”)，所述dsRNA靶向与DON产生途径相关的真菌基因以进行RNA干扰，并且由此减少或消除在用于人类或动物食用的植物或植物部分中引起镰刀菌属赤霉病的禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的DON产生。

发明内容

RNA干扰(RNAi)技术已被证明是一种通过内部生物过程使害虫和病原体的基因表达沉默的高度选择性生物处理。启动RNAi的双链RNA(dsRNA)的外源性施加已用于有效控制某些植物害虫和病原体种。本公开涉及一种使用dsRNA来减少或消除镰刀菌属的真菌病原体禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的DON产生和/或控制所述镰刀菌属的禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的方法。在特定实施例中，描述了通过使用施用于植物的外源性dsRNA施加，通过引起死亡、生长抑制、毒力或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低来控制DON产生和/或控制真菌病原体的方法和组合物，所述植物感染或可感染产生DON或以其它方式与引起赤霉病的镰刀菌复合物相关的镰刀菌属的禾谷镰刀菌或另一成员。此类植物可以包括例如玉米和小谷物，如小麦、大麦、亚麻、荞麦、黑麦和燕麦。

本文所描述的组合物和方法包括重组多核苷酸分子，如单链或双链DNA或RNA分子，本文称为“触发物”，可用于减少或消除禾谷镰刀菌或相关种的DON产生；或重组DNA构建体，其用于制备此类RNA分子或用于制备表达此类RNA分子的转基因植物。在一些实施例中，多核苷酸触发物作为局部施加的药剂提供，以用于控制或防止禾谷镰刀菌在植物上的DON产生和/或引起禾谷镰刀菌的死亡、生长抑制、毒力或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低。在一些实施例中，植物是玉米或小谷物(例如，小麦、大麦、燕麦、亚麻、黑麦或荞麦)，其对禾谷镰刀菌感染具有增加的抗性和/或对禾谷镰刀菌产生的DON的效应具有增加的抗性，如提供了表达多核苷酸触发物的转基因植物(包括种子和可繁殖部分)。在一些实施例中，提供了已经用包含多核苷酸触发物的组合物局部处理的植物(包括种子或可繁殖部分)(例如，已经用dsRNA分子的溶液喷雾的植物)。还提供了局部施加到禾谷镰刀菌或感染或可能感染了禾谷镰刀菌的植物、植物部分或种子的含多核苷酸的组合物。

若干实施例涉及通过多核苷酸触发物抑制禾谷镰刀菌中的靶基因。此类靶基因可以包括与DON产生途径相关的镰刀菌的任何基因。本文提供了此类靶基因的本文称为“靶基因序列组”或“靶基因序列”的核苷酸序列，所述核苷酸序列涉及SEQ ID No:1-16、65-70和87-151。本发明的某些实施例涉及被设计成与靶基因的RNA转录物杂交以产生RNAi的多核苷酸(例如，dsRNA)。还提供了本文称为“触发物序列组”或“触发物序列”的核苷酸序列，所述核苷酸序列涉及SEQ ID NO:17-32、75-78。本文进一步提供了“RNA触发物序列组”或“RNA触发物序列”，其涉及SEQ ID NO:33-48、79-82和153-225。本文还提供了针对RNA触发物序列组的反向补体，称为“RNA触发物序列反向补体组”或“RNA触发物序列反向补体”，所述反向补体涉及SEQ ID No:49-64、83-86和227-299。RNA触发物序列反向补体组是RNA触发物序列组中5'至3'读段的序列的完美补体。根据靶基因序列的对应mRNA转录物设计RNA触发物序列组，以影响此类转录物上的RNAi，从而防止或减少相关蛋白质的翻译。通过减少相关蛋白质的翻译，本发明的触发物序列破坏了镰刀菌属中的DON途径，从而减少镰刀菌属的DON产生。本文所提供的表1和2将各种靶基因序列与其对应触发物序列、RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体序列匹配。SEQ ID NO与SEQ ID列表中提供的序列有关。值得注意的是，随本文提交的SEQ ID列表表明SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和227-299是DNA，这是由于新ST26格式的限制。出于本公开的目的，SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和227-299是RNA序列，其中指示的胸腺嘧啶是尿嘧啶。SEQ ID NO:75-78是SEQ ID NO:79-82的DNA版本。本领域普通技术人员将理解，通过用胸腺嘧啶替代任何尿嘧啶，本文的RNA序列中的任一者都可以被读取为DNA序列，针对此类RNA序列的DNA模板将包含给定RNA序列的DNA碱基补体，与引用的靶基因DNA序列具有同一性的RNA序列将用尿嘧啶替代胸腺嘧啶，并且与引用的靶基因DNA序列具有互补性的RNA将包含给定DNA序列的RNA碱基补体。

一方面，一种用于减少或消除植物上的镰刀菌属的种(例如，禾谷镰刀菌)的DON产生的方法，所述方法包括使镰刀菌与多核苷酸接触，所述多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与DNA、或其DNA补体、或表1或表2中鉴定的任何基因或其同源物的对应片段具有约95％至约100％同一性(例如，将包括具有100％同一性的序列的21个连续核苷酸的区段)的序列，所述DNA具有选自由靶基因序列组组成的组的序列。在一实施例中，用于减少或消除植物上的禾谷镰刀菌的DON产生的方法包括使禾谷镰刀菌与多核苷酸接触，所述多核苷酸包含与靶基因或由靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含与选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组的序列的至少18个连续核苷酸互补或约95％至约100％相同的序列。在一些实施例中，18个或更多个连续核苷酸是21个或更多个连续核苷酸、50个或更多个连续核苷酸、150个或更多个连续核苷酸、200个或更多个连续核苷酸、250个或更多个连续核苷酸、300个或更多个连续核苷酸、350个或更多个连续核苷酸、400个或更多个连续核苷酸、450个或更多个连续核苷酸、500个或更多个连续核苷酸、550个或更多个连续核苷酸或600个或更多个连续核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸被设计成与由靶基因编码的mRNA具有互补性。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA(dsRNA)。在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列。在一些实施例中，与多核苷酸的接触是通过将多核苷酸或含有多核苷酸的组合物或溶液(例如，通过喷雾或撒粉或浸泡)直接局部施加到禾谷镰刀菌或与禾谷镰刀菌接触的表面或基质(例如，植物或土壤)来实现的。在一些实施例中，多核苷酸或含有多核苷酸的组合物或溶液的局部施加是通过将多核苷酸或含有多核苷酸的组合物或溶液喷雾到感染或可能感染了禾谷镰刀菌的叶、叶球、茎、穗、种子、根或其它植物部分上来实现的。在一些实施例中，与多核苷酸的接触是通过提供表达减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的序列的转基因植物来实现的。在一些实施例中，多核苷酸包含两个或更多个靶向与DON产生相关的两个或更多个靶基因的区，包括靶向禾谷镰刀菌中的一个或多个DON基因和/或靶向产生DON的镰刀菌属的另一种中的此类DON基因的一种或多种同源物，由此减少禾谷镰刀菌的DON产生，以及减少镰刀菌属的一个或多个另外的种的DON产生。在一些情况下，禾谷镰刀菌的基因靶标区与存在于镰刀菌属的一个或多个另外的种(如黄色镰刀菌)中的同源物区之间的同一性百分比将足够高以使得多核苷酸中的相同区将在所述一个或多个种中引起RNAi，由此减少所述一个或多个种的DON产生。

若干实施例涉及一种用于通过使禾谷镰刀菌暴露于包含一种或多种调配物或递送药剂和多核苷酸的组合物来减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述多核苷酸产生针对表1或表2中所公开的基因靶标中的一者或多者或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的基因靶标或其DNA补体的RNAi，并且其中药剂在接触或摄入(例如，内部吸收/转染)禾谷镰刀菌时起作用，以抑制禾谷镰刀菌内的生物功能，由此减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生和/或以其它方式控制禾谷镰刀菌。在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体的核苷酸序列，或者多核苷酸包含一个或多个与一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列约95％至约100％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是RNA，并且在一些实施例中，RNA是双链RNA。

在一些实施例中，所述药剂包含以下：

(a)有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由靶基因序列组成的组的核苷酸序列；

(b)有效量的至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含至少一个沉默元件，所述至少一个沉默元件与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约或95％序列同一性，其中所述靶基因具有选自由所述靶基因序列组成的组的核苷酸序列；

(c)有效量的至少一个RNA，所述至少一个RNA包含至少一个区段，所述至少一个区段与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由所述靶基因序列组成的组的核苷酸序列；或者

(d)RNA分子，所述RNA分子在转染到禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌中的DON产生，其中所述RNA分子包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由所述靶基因序列组成的组的核苷酸序列；或者(e)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌中的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段基本上互补，或与其包含至少85％、90％、95％、98％或100％序列同一性，其中所述靶基因具有选自由所述靶基因序列组成的组的核苷酸序列；或者

(f)有效量的至少一个双链RNA，所述至少一个双链RNA包含至少一条链，所述至少一条链包含选自由以下组成的组的序列，或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性的序列：RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体；或者

(g)有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列，或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约100％序列同一性的序列的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个连续核苷酸：RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体；或者

(h)有效量的至少一个RNA，所述至少一个RNA包含至少一个区段，所述至少一个区段与选自由以下组成的组的核苷酸序列的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个连续核苷酸互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体；或者

(i)RNA分子，所述RNA分子在转染到所述禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述RNA分子包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由以下组成的组的核苷酸序列的区段基本上互补，或与其包含至少至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：所述靶基因序列、RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体；或者

(j)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由以下组成的组的核苷酸序列的区段互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体；

(k)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链与选自由以下组成的组的核苷酸序列包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：RNA触发物序列和RNA触发物序列反向补体。

在某些实施例中，含有多核苷酸的组合物被调配用于施加到植物田地，例如呈可喷雾溶液或乳液、罐混合物或粉末的形式。在一些实施例中，药剂是以生物方式产生的，例如呈微生物发酵产物的形式或在转基因植物细胞中表达。本领域已知用于调配施加到植物田地的多核苷酸的各种方法和组合物，并且本发明的多核苷酸可以被调配在任何合适的组合物中。实例是在于2022年11月10日公开为WO2022/0235895的PCT/US/2022/027816中描述的组合物，所述文献通过引用整体并入本文。

任何合适的编码靶向本文所描述的靶基因的RNAi分子的DNA均可以用于本文所描述的组合物和方法中。DNA可以是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。在一些实施例中，DNA包含一个或多个DNA表达盒，其在转录时产生单链RNA(ssRNA)分子(例如，保持单链或折叠成RNA发夹)或互补的ssRNA分子，其粘接以产生双链RNA(dsRNA)分子。

本领域已知用于制备RNA的各种方法，并且本发明的RNA可以通过本领域已知的任何合适的方法制备。产生RNA的方法的实例包括但不限于体外转录(IVT)、化学合成、微生物发酵或无细胞方法，如于2019年5月16日公开的美国专利第10,858,385号(公开第US2019/0144489号)和于2017年10月12日公开的US专利第10,954,541号(公开第US2017/0292138号)中所描述的方法，所述文献中的每个文献通过引用并入本文。用于本发明的内源性递送的RNAi分子的实例包括但不限于以下中描述的那些：于2020年5月14日公开的美国专利第11,142,768号(公开第US2020/0149044号)、于2020年3月26日公开的美国专利第11,185,079号(公开第US2020/0093138号)、于2021年11月18日公开的PCT/US/2021/032334(国际公开第WO 2021/231791号)，所有所述专利均通过引用并入本文。

若干实施例涉及一种提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有增加的抗性的植物的方法，所述方法包含将包含至少一个多核苷酸的组合物局部施加到植物，所述至少一个多核苷酸通过针对DON产生途径ty)中的基因的RNAi防止或减少DON产生，所述至少一个多核苷酸包括表1或表2中鉴定的基因、或其DNA补体，或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列。在一实施例中，提供对禾谷镰刀菌感染具有增加的抗性的植物的方法包含将包含至少一个多核苷酸的组合物局部施加到植物，所述至少一个多核苷酸包含与靶基因或由靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸互补的核苷酸序列，所述靶基因具有选自由靶基因序列组成的组的核苷酸序列。在一些实施例中，所述至少一个多核苷酸包含选自由RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体组成的组的序列，或者包含与RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或约100％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA，其包含一个或多个选自RNA触发物序列的序列和选自RNA触发物序列反向补体的对应序列。在一实施例中，提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有增加的抗性的植物的方法包含以使有效量的多核苷酸转染到感染植物的禾谷镰刀菌中或与所述禾谷镰刀菌接触的方式将包含至少一个多核苷酸的组合物局部施加到植物，所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由靶基因转录的RNA的一部分互补，所述靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包括一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列，或包含与RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％或至少约98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA，其包含一个或多个选自RNA触发物序列的序列和选自RNA触发物序列反向补体的对应序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA。若干实施例涉及包含多核苷酸的组合物，所述包含多核苷酸的组合物被调配用于施加到植物田地，例如呈可喷雾溶液或乳液、罐混合物或粉末的形式。

若干实施例涉及一种用于减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的组合物，所述组合物包含有效量的至少一个多核苷酸分子，所述至少一个多核苷酸分子包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与DNA或其DNA补体的对应片段基本上相同或互补(例如，具有与其具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)，所述DNA具有选自由靶基因序列组组成的组的序列。在一些实施例中，多核苷酸分子包含至少18个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由靶基因转录的RNA的一部分互补，所述靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体触发物的核苷酸序列，或包含与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的核苷酸序列互补或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或约100％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA，其包含一个或多个选自RNA触发物序列的序列和选自RNA触发物序列反向补体的对应序列。在一些实施例中，多核苷酸分子是重组多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸分子是RNA。在一些实施例中，多核苷酸分子是dsRNA。相关实施例包括包含多核苷酸分子的组合物，所述包含多核苷酸分子的组合物被调配用于施加到植物田地，例如呈可喷雾溶液或乳液、罐混合物或粉末的形式，并且任选地包含一种或多种另外的组分，如载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、多核苷酸杀害虫剂、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀真菌剂、非多核苷酸杀真菌剂、多核苷酸杀虫剂、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。

若干实施例涉及一种提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有增加的抗性的植物的方法，所述方法包含在植物中表达至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与DNA或其DNA补体的对应片段基本上相同或互补(例如，具有与其具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)，所述DNA具有选自由靶基因序列组组成的组的序列。在一些实施例中，多核苷酸包括一个或多个选自触发物序列组、RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列，或包含与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％或至少约98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA，其包含一个或多个选自RNA触发物序列的序列和选自RNA触发物序列反向补体的对应序列。

若干实施例涉及一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到DNA元件的异源启动子，所述DNA元件包含用于产生本文所描述的RNA的序列，所述RNA可用于防止或减少镰刀菌属的种的DON产生。在一些实施例中，DNA元件编码双链RNA。在一些实施例中，双链RNA包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体的核苷酸序列。相关实施例包括一种植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体，其包含重组DNA构建体，或包含不含异源启动子的DNA元件。

若干实施例涉及一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA抑制与RNA接触或用所述RNA转染的禾谷镰刀菌中的靶基因的表达，从而消除或减少禾谷镰刀菌的DON产生。在一些实施例中，靶基因是表1或表2中鉴定的靶基因。具体实施例是一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA用于使一个或多个选自靶基因序列组的靶基因沉默。在一些实施例中，RNA包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列，或包含与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或约100％或100％相同的核苷酸序列。

若干实施例涉及一种分离的重组RNA分子，当用禾谷镰刀菌转染或与所述禾谷镰刀菌接触时，所述重组RNA分子减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述重组RNA分子包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与DNA或其DNA补体的对应片段基本上互补(例如，具有与其具有100％互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)，所述DNA具有选自由靶基因序列组组成的组的序列。在一些实施例中，重组RNA分子是双链RNA。具体实施例包括一种分离的重组双链RNA分子，所述重组双链RNA分子的链具有选自由RNA触发物序列组、RNA触发物序列反向补体组或其组合组成的组的序列。其它实施例涉及一种分离的重组双链RNA分子，其包含具有选自由以下组成的组的序列的第一链和与第一链互补的第二链：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294

若干实施例涉及一种提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有增加的抗性的植物的方法，所述方法包含向植物提供至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自靶基因序列组的靶基因的对应片段基本上相同或互补(例如，具有与其具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一实施例中，提供具有禾谷镰刀菌的DON产生的植物的方法包括向植物提供至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含至少一个区段，所述至少一个区段与靶基因或由靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸相同或互补，其中靶基因选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组。在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列，或包含与RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％或至少约98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA。在一些实施例中，dsRNA包含：第一链，所述第一链包含选自RNA触发物序列的一个或多个序列；以及第二链，所述第二链包含一个或多个选自RNA触发物序列反向补体的对应序列。

若干实施例涉及一种通过使禾谷镰刀菌与多核苷酸接触来减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自表1或表2中鉴定的基因的靶基因的DNA序列的一部分的等效长度的对应片段基本上相同或互补(例如，与其具有100％同一性或互补性的序列的21个连续核苷酸的区段)。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。

若干实施例涉及包含至少一个如本文所描述的多核苷酸的人造组合物。在一些实施例中，提供了可用于局部施加到需要保护免受禾谷镰刀菌的DON产生影响的植物或物质的调配物。在一些实施例中，提供了可用于制备转基因植物细胞和转基因植物的重组构建体和载体。在一些实施例中，用于处理植物、植物种子或可繁殖部分的调配物和涂层。在一些实施例中，提供了由此类用如本文所描述的多核苷酸处理或含有所述多核苷酸的植物、种子或可繁殖部分产生的商业产品和食品(特别是具有可检测量的如本文所描述的多核苷酸的商业产品和食品)。若干实施例涉及多克隆或单克隆抗体，其结合由选自靶基因序列组的序列或序列的片段编码的蛋白质。另一方面涉及多克隆或单克隆抗体，其结合由选自RNA触发物序列组或其补体的序列或序列的片段编码的蛋白质。此类抗体是通过本领域普通技术人员已知的常规方法制备的。

本发明的其它方面和具体实施例在以下详细描述中公开。

附图说明

图1提供了展示通过施加本文所公开的触发物序列来减少DON的图。

图2提供了示出特定触发物序列实施例如何减少DON产生的图。

图3提供了示出某些触发物序列实施例如何降低其对应靶基因的表达的图。

图4提供了展示通过施加本文所公开的触发物序列来减少DON的图。

具体实施方式

I.定义

除非另外定义，否则所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。在以单数形式提供术语的情况下，本发明的发明人还设想了以所述术语的复数形式描述的本发明的各个方面。在通过引用并入的参考文献中所使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其它技术术语在其被使用的领域中具有其普通含义，如各种领域特定词典所例示的，例如“《American 科学词典》)”(《美国传统词典(American HeritageDictionaries)》的编辑,2011,波士顿和纽约霍顿米夫林出版公司(Houghton MifflinHarcourt,Boston and New York))、“《麦格劳-希尔科学技术术语词典(McGraw-HillDictionary of Scientific and Technical Terms)》”(第6版,2002,纽约麦格劳-希尔出版公司(McGraw-Hill,New York))或“《牛津生物学词典(Oxford Dictionary ofBiology)》”(第6版,2008,牛津和纽约牛津大学出版社(Oxford University Press,Oxfordand New York))。本发明人不打算限于作用机制或作用模式。对其引用仅用于说明目的而提供的。

除非另有说明，当从左至右阅读时，本说明书文本中的核酸序列以5'至3'方向给出。本领域的技术人员将意识到，应理解，给定的DNA序列定义对应RNA序列，除了用尿嘧啶(U)核苷酸替换DNA中的胸腺嘧啶(T)核苷酸外，所述对应RNA序列与DNA序列相同。因此，提供特定的DNA序列可以理解为定义了精确的RNA等效物。给定的第一多核苷酸序列，无论是DNA还是RNA，都进一步定义了其精确互补体的序列(可以是DNA或RNA)，所述精确互补体即通过形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base-pair)与第一多核苷酸完全杂交的第二多核苷酸。对于DNA:DNA双链体(杂交链)，碱基对为腺嘌呤:胸腺嘧啶或鸟嘌呤:胞嘧啶；对于DNA:RNA双链体，碱基对为腺嘌呤:尿嘧啶或鸟嘌呤:胞嘧啶。因此，只要提供一条链的核苷酸序列(无论是DNA还是RNA)，就可以明确地定义完全杂交的平端双链多核苷酸的核苷酸序列(链之间“100％互补性”或链是“互补的”)。所谓与靶基因或靶基因的片段“基本上相同”或“基本上互补”意味着多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计成与靶基因或靶基因的片段或靶基因或靶基因的片段的转录物杂交(一般是在生理条件下，如植物或真菌细胞中的生理条件)；本领域的技术人员将理解，这种杂交并不一定要求100％序列同一性或互补性。在一些实施例中，触发物可以被设计成与靶基因序列并非100％相同，但仍与靶基因或由此转录的RNA的序列互补。当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列成功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地”连接或“连接”。例如，如果启动子提供DNA的转录或表达，那么所述启动子序列与DNA“可操作地连接”。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的。

术语“多核苷酸”通常指含有多个核苷酸的DNA或RNA分子，并且通常指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和具有26个或更多个核苷酸的更长的多核苷酸两者。多核苷酸还包括含有多个核苷酸的分子，所述多个核苷酸包括非典型核苷酸或本领域通常实践的经化学修饰的核苷酸；参见例如技术手册“RNA干扰(RNAi)和DsiRNA”,2011(爱荷华州科勒维尔的集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies Coralville,Iowa)中公开的化学修饰。通常，如本文所描述的多核苷酸，无论是DNA还是RNA或两者，并且无论是单链还是双链，都包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段(或者，在双链多核苷酸的情况下，至少18个连续碱基对)，所述连续核苷酸与靶基因的DNA或靶基因的RNA转录物的等效大小的片段基本上相同或互补。贯穿本公开，“至少18个连续”意指“约18个至约10,000个，包括其间的每个整数点”。因此，本发明的实施例包括长度为18-25个核苷酸(18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)的寡核苷酸，或长度为26个或更多个核苷酸的中等长度多核苷酸(26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个或约300个核甘酸的多核苷酸)，或者长度大于约300个核苷酸的长多核苷酸(例如，长度介于约300个与约400个核苷酸之间、介于约300个与约700个之间、介于约400个与约500个核苷酸之间、介于约500个与约600个核苷酸之间、介于约600个与约700个核苷酸之间、介于约700个与约800个核苷酸之间、介于约800个与约900个核苷酸之间、介于约900个与约1000个核苷酸之间、介于约300个与约500个核苷酸之间、介于约300个与约600个核苷酸之间、介于约300个与约700个核苷酸之间、介于约300个与约800个核苷酸之间、介于约300个与约900个核苷酸之间或约1000个核苷酸，或者甚至长度大于约1000个核苷酸，例如至多靶基因的整个长度(包括靶基因的编码部分或非编码部分或编码部分和非编码部分两者)的多核苷酸)。当多核苷酸是双链时，其长度可以类似地用碱基对来描述。

本文所描述的多核苷酸可以是单链(ss)或双链(ds)。“双链”是指通常在生理相关条件下，在充分互补的反平行核酸链之间发生的碱基配对，以形成双链核酸结构。实施例包括其中多核苷酸选自由以下组成的组的多核苷酸：有义单链DNA(ssDNA)、有义单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA或反义ssRNA的那些；可以使用这些类型中的任一种的多核苷酸的混合物。在一些实施例中，多核苷酸是长度大于天然存在的调控性小RNA(如内源性产生的siRNA和成熟miRNA)的典型长度的双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸是长度为至少约30个连续碱基对的双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸是长度介于约50个与约600个碱基对之间的双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸可以包括标准核糖核苷酸以外的组分，例如，实施例是包含末端脱氧核糖核苷酸的RNA。

在各个实施例中，本文所描述的多核苷酸包含天然存在的核苷酸，如存在于DNA和RNA中的核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如，主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端双脱氧核苷酸的合成多核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸包含非典型核苷酸，如肌苷、硫代尿苷或假尿苷。在某些实施例中，多核苷酸包含经化学修饰的核苷酸。经化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例在本领域中是众所周知的；参见例如美国专利公开2011/0171287、美国专利公开2011/0171176、美国专利公开2011/0152353、美国专利公开2011/0152346和美国专利公开2011/0160082，所述美国专利公开通过引用并入本文。示例性实例包括但不限于寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯主链，其可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰部分或完全修饰，经修饰的核苷碱基或经修饰的糖可以用于寡核苷酸或多核苷酸合成，并且寡核苷酸或多核苷酸可以用荧光部分(例如，荧光素或罗丹明)或其它标记(例如生物素)标记。

若干实施例涉及一种多核苷酸，所述多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与以下的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列：选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组的靶基因、具有选自靶基因序列组或触发物序列组的序列的靶基因的DNA、或其任何的RNA转录物或前述中的任何项的DNA或RNA补体。在一些实施例中，连续核苷酸的数量为至少18个，例如至少21个，介于18-24个之间，介于20-30个之间，介于20-50个之间，介于20-100个之间，介于50-100个之间，介于50-600个之间，介于100-250个之间，介于250-600个之间，介于400-600个之间，介于200-1000个之间或500-2000个之间或者甚至更多。在一些实施例中，连续核苷酸的数量大于18个，例如，19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30或大于30，例如，约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个或大于500个连续核苷酸。在一些实施例中，连续核苷酸包含数量与RNA触发物序列组的序列中的任一者的数量约相同的核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包含至少18个、19个、20个或21个(如贯穿全文所使用的对至少18个、19个、20个或21个的提及意味着所述组的这些下限中的任一者都可以被个体化)连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与以下的等效长度的片段具有约100％同一性的序列：选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组的靶基因、或其同源物、或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA、或RNA触发物序列组的序列中的任一者的DNA补体、或RNA触发物序列反向补体组、或其任何的RNA转录物或前述中的任何项的DNA或RNA补体。在一些实施例中，多核苷酸是双链核酸(例如，dsRNA)，其一条链包含至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与以下的等效长度的片段具有约100％同一性：选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组的靶基因、或者具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA、或RNA触发物序列组中的任一者的DNA补体、或RNA触发物序列反向补体组、或其任何的RNA转录物或前述中的任何项的DNA或RNA补体；以碱基对表示，这种双链核酸包含至少18个连续完全匹配的碱基对的至少一个区段，所述碱基对对应于以下的等效长度的片段：选自由靶基因序列组中鉴定的基因组成的组的靶基因、具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA、或RNA触发物序列组的DNA补体、或RNA触发物序列反向补体组、或其任何的RNA转录物或前述中的任何项的DNA或RNA补体。在一些实施例中，多核苷酸中含有的每个区段的长度大于天然存在的调控性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，多核苷酸的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于DNA或靶基因的总长度。在一些实施例中，多核苷酸的总长度介于约300个与约650个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施例中，多核苷酸是介于约300个与约650个碱基对之间的dsRNA，如表1或表2或下图中的任何图中所公开的RNA触发物序列中的任一者的长度的dsRNA。

若干实施例涉及多核苷酸，其被设计成通过诱导调控或抑制与DON产生相关的一个或多个镰刀菌属靶基因来调节表达。在一些实施例中，所述一个或多个靶基因选自由表1或表2中鉴定的基因或其同源物组成的组，或者在具体实施例中，选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1和FKPB12。在一些实施例中，多核苷酸被设计成具有核苷酸序列，所述核苷酸序列与禾谷镰刀菌靶基因或cDNA(例如，靶基因序列组)的区段的核苷酸序列、或与由禾谷镰刀菌靶基因转录的RNA的序列基本上相同或基本上互补，其可以是编码序列或非编码序列。这些调节表达的有效多核苷酸分子在本文中可以称为“多核苷酸”、“多核苷酸触发物”、“触发物(trigger或triggers)”。

任何大小的有效多核苷酸可以单独或组合用于本文所描述的各种方法和组合物中。在一些实施例中，单个多核苷酸触发器用于制备组合物(例如，用于局部施加的组合物，或可用于制备dsRNA或转基因植物的重组DNA构建体)。在其它实施例中，使用不同多核苷酸触发物的混合物或池；在这种情况下，多核苷酸触发物可以针对单个靶基因或多个靶基因。在一些实施例中，单个多核苷酸可以靶向与DON产生相关的多于一个靶基因，包括来自相同镰刀菌的基因和/或多于一个相关镰刀菌的基因组。

如本文所使用的，术语“分离的”是指将一个分子与通常以其天然或天然状态与其相关的其它分子分离。因此，术语“分离的”可以指已经从其它DNA分子中分离的DNA分子，所述其它DNA分子通常以其天然或天然状态与所述DNA分子结合。这种DNA分子可以以重组状态存在，如重组DNA分子。因此，与其通常不相关的调控性或编码序列融合的DNA分子，例如作为重组技术的结果，即使作为转基因整合到细胞染色体中或与其它DNA分子一起存在，也被认为是分离的。

若干实施例涉及一种被设计成抑制一个或多个基因(“靶基因”)的多核苷酸。术语“基因”是指核酸中提供转录物表达或编码转录物的任何部分。“基因”可以包括但不限于启动子区、5'非翻译区、可以包括内含子区的转录物编码区、3'非翻译区或这些区的组合。在一些实施例中，靶基因可以包括编码或非编码序列或两者。在其它实施例中，靶基因具有与信使RNA相同或互补的序列，例如，在一些实施例中，靶基因由其对应cDNA表示。在具体实施例中，多核苷酸被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组，或由选自靶基因序列组的DNA序列编码，或者在具体实施例中，选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1和FKPB12。在各个实施例中，多核苷酸被设计成抑制或下调一个或多个靶基因，其中每个靶基因选自由表1和表2中鉴定的基因组成的组，或由选自靶基因序列组的序列编码，并且可以被设计成抑制多个靶基因，或者靶向这些靶基因中的一个或多个靶基因的不同区。在一实施例中，多核苷酸包含21个或更多个连续核苷酸的多个区段，所述连续核苷酸与以下的等效长度的片段具有100％同一性：表1和表2中鉴定的基因或其同源物、具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA或其DNA补体。在这种情况下，每个区段在大小或序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义的或反义的。例如，在一个实施例中，多核苷酸包含串联或重复排列的多个区段，其中每个区段包含21个或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与以下的等效长度的片段具有100％同一性的序列：表1或表2中鉴定的基因或其同源物、靶基因序列组、具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或前述中的任一项的DNA补体。在一些实施例中，区段中的一个或多个区段对应于针对如表1和表2中公开的靶基因的RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体中的一者或多者。在一些实施例中，区段中的一个或多个区段对应于21个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段，所述连续核苷酸来自选自针对如表1和表2中公开的靶基因的RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列。在一些实施例中，区段可以来自靶基因的不同区，例如，区段可以对应于靶基因的外显子区。在一些实施例中，可以任选地在区段之间或邻近区段使用与靶基因不对应的“间隔子”核苷酸。

如本文所使用的，除非上下文另外明确指示，否则术语“植物”是指易受镰刀菌属感染的植物，即禾谷镰刀菌感染。易受镰刀菌属感染的植物的实例包括玉米和小谷物，如小麦、大麦、亚麻、荞麦、黑麦和燕麦。在具体实施例中，植物是小麦。

下文个部分提供了其它定义。

II.用于控制禾谷镰刀菌的DON产生的多核苷酸

本公开的多核苷酸可用于通过RNAi减少植物上的镰刀菌属的真菌病原体的DON产生，并有效控制或防止植物的镰刀菌感染。根据本公开的一些方面，多核苷酸有效地干扰由与DON产生相关的一个或多个禾谷镰刀菌靶基因编码的mRNA。

在一些实施例中，多核苷酸包含以下的至少一个区段，18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、125个或更多个、150个或更多个、200个或更多个、250个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个、或1,000个或更多个、或介于约200个与约400个、或约300个与约700个、或约300个与约500个、或约300个与约600个、或约300个与约650个、或约400个与约700个之间的连续核苷酸，所述连续核苷酸序列具有与以下的等效长度的对应片段具有约75％至约100％同一性、约80％至约100％同一性，约85％至约100％同一性、约90％至约100％同一性、约95％至约100％同一性、约98％至约100％同一性、约100％同一性或完全100％同一性：具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的靶基因的DNA、或其DNA补体或由其转录的RNA。在一些实施例中，靶基因是表1或表2中鉴定的基因或其同源物。在具体实施例中，靶基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。在一实施例中，多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与一个或多个靶基因或其同源物、或其DNA补体或由此类靶基因转录的RNA的至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1,000个、或介于约200个与约400个或约300个与约500个、或约300个与约600个、或约300个与约650、或约400个与约700个之间的连续核苷酸基本上互补，所述一个或多个靶基因在表1或表2中鉴定，或具有选自由靶基因序列组组成的组的核苷酸序列，或者在具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146，或者在另一具体实施例中包含SEQ ID NO:16。在一些实施例中，所述一个或多个靶基因包含表1或表2中鉴定的一个或多个基因或其aa同源物。在具体实施例中，所述一个或多个靶基因包含一个或多个选自由以下组成的组的基因：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。

在一些实施例中，多核苷酸包含至少21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与以下的等效长度的对应片段基本上互补：表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物、或具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列的靶基因、或其DNA补体或由其转录的RNA。在一些实施例中，多核苷酸包含至少300个连续核苷酸，所述连续核苷酸与以下的等效长度的对应片段基本上互补：表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物、或具有选自靶基因序列组的DNA序列的靶基因、或其DNA补体或由其转录的RNA。在具体实施例中，靶基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。在一些实施例中，多核苷酸被设计成与由靶基因编码的mRNA具有互补性。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。并且在一些实施例中，双链RNA包含一条链和与其互补的第二链，所述一条链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:48、80-82、182、188、194、213和220，或者在具体实施例中，包含一条链和与其互补的第二链，所述一条链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:32-38、79-82和268，或者在更具体的实施例中包含一条链和与其互补的第二链，所述一条链包含SEW ID NO:32的序列。

在一些实施例中，多核苷酸包含连续核苷酸的序列，所述连续核苷酸序列与以下的DNA的等效长度的片段基本上互补或完全(100％)相同：表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物、或具有以下序列的靶基因、或其DNA补体或由此转录的RNA，所述序列选自靶基因序列组，或在具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146，或在另一个具体实施方案中包含SEQ ID NO:16。在一些实施例中，多核苷酸具有与以下的等效长度的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列：表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA、或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA、或其DNA补体或由其转录的RNA。在一些实施例中，连续核苷酸的数量大于18个，例如，19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30或大于30，例如，约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个、约750个或大于750个连续核苷酸。在一些实施例中，连续核苷酸介于约200个与约400个、或约300个与约500个、或约300个与约600个、或约300个与约750个、或约300个与约900个之间。在一些实施例中，多核苷酸包含至少18个、19个、20个或21个(如贯穿全文所使用的对至少18个、19个、20个、21个的提及意味着所述组的这些下限中的任一者都可以被个体化)连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与以下的等效长度的片段具有约100％同一性的序列：具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA、或其DNA补体或表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA。

在一实施例中，多核苷酸包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与靶基因、或其DNA补体或由此转录的RNA的对应片段基本上互补或具有100％同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。在一些实施例中，除了与靶基因的对应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的一个或多个区段之外，多核苷酸包含一个或多个“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性的序列)，并且因此多核苷酸整体上与靶基因具有低得多的总体序列同一性。

在一实施例中，多核苷酸包含与一个或多个靶基因或其同源物、或其DNA补体或由此转录的RNA的对应片段互补或具有100％同一性的21个或更多个连续核苷酸的多个区段的组合，所述一个或多个靶基因在表1或表2中鉴定，或具有选自靶基因序列组的DNA序列，或在具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。在一些实施例中，除了与≥1个靶基因的对应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的一个或多个区段之外，多核苷酸包含一个或多个“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性的序列)，并且因此多核苷酸作为整体给定与靶基因具有更低的总体序列同一性。在一实施例中，多核苷酸包含21个或更多个连续核苷酸或更长的多个区段的组合，所述连续核苷酸与在靶基因、或其DNA补体或由其转录的RNA的整个长度上位置分布的对应片段互补或具有100％同一性，所述靶基因具有选自靶基因序列组的DNA序列。在一些实施例中，除了与在靶基因的整个长度上位置分布的对应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的一个或多个区段之外，多核苷酸包含一个或多个“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性的序列)，并且因此多核苷酸作为整体给定与靶基因具有更低的总体序列同一性。

在一些实施例中，多核苷酸包含与以下序列的至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸基本上互补，或与其约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、95％至约100％、约98％至约100％、约100％或100％相同的序列，所述以下序列选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组，或在具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

在一些实施例中，多核苷酸包含与以下序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或完全100％相同的序列，所述以下序列选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体，或在一些具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

若干实施例涉及一种多核苷酸，其包含与选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组的序列具有约95％至约100％同一性的序列。若干实施例涉及一种多核苷酸，其包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组的序列的一部分具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸的数量为至少18个，例如介于18-24个之间，或介于18-28个之间，或介于20-30个之间，或介于20-50个之间，或介于20-100个之间，或介于50-100个之间，或介于50-500个之间，或介于100-250个之间，或介于100-500个之间，或介于200-1,000个之间，或介于500-700个之间，或者甚至更多个。在一些实施例中，连续核苷酸的数量大于18个，例如，19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30或大于30，例如，约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个或大于700个连续核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包含至少18个、19个、20个或21个(如贯穿全文所使用的对至少18个、19个、20个、21个的提及意味着所述组的这些下限中的任一者都可以被个体化)连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与在以下序列中发现的等效长度的片段具有约100％同一性的序列，所述以下序列选自由RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组组成的组。在一些实施例中，多核苷酸包含至少200个、300个、400个、500个、600个或700个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与在以下序列中发现的等效长度的片段具有至少85％同一性的序列，所述以下序列选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组，或者在一些更具体的实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID No:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294，或者在具体实施例中，选自SEQ ID No:48。

在一些实施例中，多核苷酸是双链核酸(例如，dsRNA)，其一条链包含至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或600个或700个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与靶基因的DNA、或其DNA补体、或表1或表2中鉴定的基因或其同源物的等效长度的片段具有约95％至100％同一性的序列，所述靶基因具有选自靶基因序列组的序列。在某些实施例中，此类靶基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。以碱基对表示，这种双链核酸包含至少18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或600个或700个连续完全匹配的碱基对的至少一个区段，所述碱基对对应于靶基因的DNA、或其DNA补体、或表1或表2中鉴定的基因或其同源物的等效长度的片段，所述靶基因具有选自靶基因序列组的序列。在一些实施例中，多核苷酸中含有的每个区段的长度大于天然存在的调控性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，多核苷酸的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因的总序列组长度。在一些实施例中，多核苷酸的总长度介于约50个与约750个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施例中，多核苷酸是介于约200个与约750个碱基对之间的dsRNA，如图和表所公开的RNA触发物序列中的任一者的长度的dsRNA。在一些实施例中，dsRNA包含一条链，所述一条链包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:48、80-82、182、188、194、213和220。在一些实施例中，dsRNA包含一条链，所述一条链包含至少200个、300个、400个、500个、600个或700个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与在以下序列中发现的等效长度的片段具有至少85％同一性的序列，所述以下序列选自由RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组组成的组。在一些实施例中，dsRNA包含一条链，所述一条链包含至少200个、300个、400个、500个、600个或700个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与在以下序列中发现的等效长度的片段具有至少85％相同，所述以下序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

在一些实施例中，多核苷酸被设计成与由靶基因编码的mRNA具有互补性。在一些实施例中，多核苷酸是dsRNA。在一些实施例中，dsRNA包含与由靶基因编码的mRNA结合(例如，基本上互补)的第一链和与第一链互补的第二链。dsRNA可以包含相同长度或不同长度的RNA链。在一些实施例中，dsRNA包含与第二链(例如，有义链)长度相同的第一链(例如，反义链)。在一些实施例中，dsRNA包含长度不同于第二链(例如，有义链)的第一链(例如，反义链)。第一链可以比第二链长约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或超过20％。第一链可以比第二链长1-5个、2-5个、2-10个、5-10个、5-15个、10-20个、15-20个核苷酸或超过20个核苷酸。dsRNA分子还可以由以下组装：茎环结构中的单个寡核苷酸，其中RNA分子的自互补有义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接；以及具有两个或更多个环结构和包含自互补有义链和反义链的茎的环状单链RNA接头，其中环状RNA可以在体内或体外处理，以产生能够介导RNAi的活性RNAi分子。RNAi分子可以在分子的一端处包含3'突出端；另一端可以是平端，或者还具有突出端(5'或3')。当RNAi分子在分子两端处都包含突出端时，突出端的长度可以相同或不同。

在一些实施例中，多核苷酸被设计成与禾谷镰刀菌基因中与DON途径相关的区具有互补性，并且所述禾谷镰刀菌基因的下调减少或消除禾谷镰刀菌中的DON产生并增加死亡，引起生长抑制或生殖能力的降低。在另一实施例中，多核苷酸包含本文所描述的一个或多个用于在转染到禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少禾谷镰刀菌中的DON产生的序列，以及一个或多个在转染到禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时引起禾谷镰刀菌的死亡、生长抑制、毒力或致病性的降低或繁殖/繁殖能力(孢子形成)的降低的序列。其它实施例靶向与另一种镰刀菌的DON途径相关的基因，如产生DON和/或导致植物中的镰刀菌赤霉病的镰刀菌属中的黄色镰刀菌或其它种。

在一些实施例中，dsRNA包含一条链，所述一条链包含一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或完全100％相同。在一些实施例中，dsRNA包含18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个或700个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列的等效部分具有约95％至约100％同一性。此类dsRNA可以进一步包含与第一链互补的第二链。在一些实施例中，dsRNA包含第一链和第二链，所述第一链包含选自RNA触发物序列的核苷酸序列，所述第二链选自对应RNA触发物序列反向补体。具体实施例包括其中多核苷酸是dsRNA的那些，所述dsRNA包含第一链和第二链，所述第一链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294，所述第二链包含与第一链互补的核苷酸。

III.多核苷酸的长度。

如本文所提供的，靶向靶基因的RNAi分子的长度可以变化。应当理解，在一些实施例中，当长RNA(例如，dsRNA或ssRNA)分子被施加(例如，施加到植物上)时，在进入靶真菌(例如，禾谷镰刀菌)的细胞之后，dsRNA被Dicer酶切割成长度为例如15个至25个核苷酸的较短双链RNA片段。因此，本公开的RNAi分子可以作为例如15个至25个核苷酸片段递送，或者可以作为较长的双链核酸(例如，至少100个核苷酸)递送。

本发明的多核苷酸的总长度可以大于或等于18个连续核苷酸，并且可以包括除了连续核苷酸之外的核苷酸，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的靶基因的DNA或其DNA补体或由其转录的RNA的等效长度的片段具有约75％至约100％同一性的序列。类似地，本发明的多核苷酸可以包含一个或多个序列，所述一个或多个序列与以下序列的18个或更多个连续核苷酸约75％至约100％相同，所述以下序列选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组，并且另外可以包含另外无关的序列。换句话说，多核苷酸的总长度可以大于被设计成用于抑制一个或多个靶基因的多核苷酸的部分或区段的长度。

例如，多核苷酸可以具有侧接于抑制靶基因的“活性”区段的核苷酸(例如，“活性”区段可以是与靶基因或由其转录的mRNA的区段基本上互补的序列，或者可以是选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列)，或者在活性区段之间包括“间隔子”核苷酸，或者可以在5'端处、3'端处或5'端和3'端两者处都有另外的核苷酸。在一实施例中，多核苷酸可以包括与本文所公开的用于控制白粉霉病的序列不特异性相关(具有不互补或不相同的序列)的另外的核苷酸。例如，此类多核苷酸可以含有提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸。在一实施例中，多核苷酸可以包括紧邻活性区段定位的另外的核苷酸。在一实施例中，多核苷酸包含一个此类区段，与所述区段相邻的是另外的5'G或另外的3'C或两者。在另一实施例中，多核苷酸是包含另外的核苷酸以形成一个或多个突出端的双链RNA，例如，包含2个脱氧核糖核苷酸以形成3'突出端的dsRNA。在其它实施例中，多核苷酸可以包含本文所叙述的一个或多个活性区段，以及对禾谷镰刀菌的其它靶基因有活性或对镰刀菌属的另一种真菌有活性的另外的区段，如产生DON或与在植物中引起镰刀菌赤霉病的镰刀菌复合物相关的另一镰刀菌。

因此，在各个实施例中，整个多核苷酸的核苷酸序列与RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组不是100％相同或互补的，并且与以下的DNA中的连续核苷酸的序列不是100％相同和互补的：表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物、或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的靶基因或其DNA补体。例如，在一些实施例中，多核苷酸包含各自具有21个连续核苷酸的至少两个区段，所述连续核苷酸与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段由一个或多个间隔子核苷酸分隔开，或(2)所述至少两个区段以与对应片段在具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或其DNA补体中出现的顺序不同的顺序排列。

若干实施例涉及多核苷酸，其被设计成通过诱导下调或抑制禾谷镰刀菌靶基因来调节表达。在一些实施例中，多核苷酸被设计成具有核苷酸序列，所述核苷酸序列与禾谷镰刀菌靶基因或cDNA(例如，靶基因序列组)的核苷酸序列、或与由禾谷镰刀菌靶基因转录的RNA的序列基本上相同或基本上互补，其可以是编码序列或非编码序列。这些调节表达的有效多核苷酸分子在本文中可以称为“多核苷酸”、“多核苷酸触发物”、“触发物(trigger或triggers)”。此类实施例的实例包括包含一个或多个序列的多核苷酸，所述一个或多个序列选自RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组。另外的实例包括一种多核苷酸，其包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列的一部分具有约95％至约100％同一性的序列。

任何大小的有效多核苷酸可以单独或组合用于本文所描述的各种方法和组合物中。在一些实施例中，单个多核苷酸触发器用于制备组合物(例如，用于局部施加的组合物，或可用于制备转基因植物的重组DNA构建体)。在其它实施例中，使用不同多核苷酸触发物的混合物或池；在这种情况下，多核苷酸触发物可以针对单个靶基因或多个靶基因。

IV.允许的错配

如本文所使用的，“基本上相同”或“基本上互补”意味着多核苷酸(或双链多核苷酸的至少一条链)与靶基因或由靶基因转录的RNA(例如，转录物)具有足够的同一性或互补性，以抑制靶基因的表达(例如，影响靶基因转录物和/或经编码的蛋白质的水平或活性的降低)。如本文所描述的多核苷酸不需要与靶基因或由靶基因转录的RNA具有100％同一性或互补性，以抑制靶基因的表达(例如，影响靶基因转录物或经编码的蛋白质的水平或活性的降低，或提供对禾谷镰刀菌的DON产生的控制)。在一些实施例中，多核苷酸或其一部分被设计成与靶基因或由靶基因转录的RNA中的至少18个或19个连续核苷酸的序列基本上相同或基本上互补。在一些实施例中，多核苷酸或其一部分被设计成与靶基因或由靶基因转录的RNA中的21个连续核苷酸的一个或多个序列100％相同或100％互补。在某些实施例中，当与内源性靶基因或由靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸的序列相比时，“基本上相同的”多核苷酸具有100％序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，当与靶基因或由靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸的序列相比时，“基本上互补的”多核苷酸具有100％序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。

序列同一性：如本文在两个多核苷酸或多肽的上下文中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上针对最大对应性进行比对时两个分子的序列中相同的残基。

同一性百分比是通过确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比计算的。与参考序列相比，在每个位置处都相同的序列被称为与参考序列100％相同，并且反之亦然。两个核苷酸序列的同一性百分比可以通过在比较窗口上比较分子的两个最佳比对的序列(例如，核酸序列或多肽序列)来确定，其中在比较窗口中的序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失部分(即缺口)，以实现两个序列的最佳比对。可以通过各种可用的计算机程序使用局部或全局比对来执行比较两个或更多个序列的最佳比对。Smith T.F.和Waterman M.S.(1981)的算法，常见分子子序列的鉴定(Identification of common molecular subsequences),《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》147(1):195-7PubMed:7265238DOI:10.1016/0022-2836(81)90087-5是一种合适的局部比对策略，并被如EMBOSS Water等工具所采用(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)。Needleman S.B.和Wunsch C.D.(1970)的算法，“可适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列中的类似性的一般方法(A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequence of twoproteins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48(3):443-53PubMed:5420325DOI:10.1016/0022-2836(70)90057-4是一种合适的全局比对策略，并被如EMBOSS Needle等工具所采用(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。根据要比较的序列和相关参数，局部或全局比对策略可能更有可能找到最佳比对，但这两种策略都可以用来确认最佳比对，从而提供最准确的同一性百分比。

关于序列长度的数值，术语“约”意指所述值的至多1％-5％的+/-变化。例如，约30个连续核苷酸意指27-33个连续核苷酸的范围，或其间的任何范围。关于序列同一性百分比的数值，术语“约”意指所述百分比值的至多1％-3％四舍五入到最接近的整数的+/-变化。例如，约90％序列同一性意味着87-93％的范围。然而，序列同一性的百分比不能超过100％。因此，约98％序列同一性意味着95-100％的范围。

含有与靶基因或转录物错配的多核苷酸可以用于本文所描述的组合物和方法的某些实施例。在一些实施例中，本文所提供的变体含有随机放置的突变，其中对于给定突变，以大约相等的概率选择四个核苷酸(A、U、G、C)。在一些实施例中，这些突变可能分布在序列的一个小区域上，或者可能广泛分布在序列长度上。在一些实施例中，多核苷酸包括至少18个、或至少19个或至少21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或靶基因的转录物中的等效长度的区段基本上相同或基本上互补。在某些实施例中，与靶基因或靶基因的转录物的等效长度的区段基本上相同或基本上互补的18个、19个、20个或21个或更多个连续核苷酸的多核苷酸可以与靶基因或者转录物具有1个或2个错配(即，多核苷酸的21个连续核苷酸与靶基因或靶基因的转录物的等效长度的区段之间有1个或2个错配)。在某些实施例中，含有与靶基因或靶基因的转录物中的等效长度的区段具有同一性或互补性的连续18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸的约50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个或更多个核苷酸的多核苷酸可以与靶基因或者转录物具有1个或2个或更多错配。

在设计具有与内源性靶基因或由靶基因转录的RNA的错配的多核苷酸时，可以使用某些类型和某些位置的更有可能被耐受的错配。在某些实施例中，使用腺嘌呤与胞嘧啶或鸟苷与尿嘧啶残基之间形成的错配，如Du等人,(2005),《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》,33:1671-1677中所描述的。在一些实施例中，19个碱基对重叠区中的错配定位于低耐受位置5、7、8或11处(从19个核苷酸靶标的5'端开始)、中耐受位置3、4和12-17处(从19个核苷酸靶标的5'端开始)和/或互补区的任一端处的高耐受位置，即位置1、2、18和19(从19个核苷酸靶标的5'端开始)，如Du等人,(2005),《核酸研究》,33:1671-1677中所描述的。在常规测定中，可以根据经验确定可容忍的错匹配。

V.在中性序列中嵌入沉默元件

在一些实施例中，将包含与靶基因相对应的序列并负责观察到的靶基因抑制的沉默元件嵌入在“中性”序列中，即插入到与靶基因没有序列同一性或互补性的另外的核苷酸中。中性序列可能是理想的，例如，以增加多核苷酸的总长度或赋予期望的特性，如增加与沉默复合物的结合。例如，出于稳定性、制造成本效益或有效的生物活性(如沉默效率)的原因，多核苷酸具有特定大小可能是理想的。在一些实施例中，中性序列还可以用于形成有利的二级结构，如发夹触发器中的环或作为触发器区之间的间隔子。

因此，在一个实施例中，将21个碱基对dsRNA沉默元件嵌入在另外39个碱基对的中性序列中，因此形成约60个碱基对的多核苷酸，所述沉默元件与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物，或具有选自靶基因序列组的DNA序列并发现控制禾谷镰刀菌中的DON产生的靶基因相对应。在一些实施例中，dsRNA触发物包括介于约60个与约500个或介于100个与约450个碱基对之间的中性序列，其中嵌入了21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列。在另一实施例中，发现具有与靶基因的等效长度的片段具有100％同一性或100％互补性的序列的单个21个碱基对沉默元件在嵌入在中性序列的较大部分时是有效的，例如，在多核苷酸总长度为约60个至约300个碱基对的情况下。在多核苷酸包括中性序列的区的实施例中，与靶基因相比，多核苷酸将具有相对较低的总体序列同一性；例如，总长度为210个碱基对的dsRNA，含有嵌入在另外的189个碱基对中性序列中的单个21个碱基对触发物(与靶基因的21个核苷酸片段具有100％同一性或互补性)，将与靶基因具有约10％总体序列同一性。

VI.相关的技术

如本文所描述的多核苷酸和核酸分子的实施例可以包括另外的元件，如启动子、转录起始元件、转录延伸元件、转录终止元件、小RNA识别位点、适体或核酶、用于表达编码序列(例如，以表达转基因，如杀真菌蛋白或可选择标志物)或非编码序列(例如，以表达另外的抑制元件)的另外和另外的表达盒。例如，本发明的一方面提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含具有转录起始序列的异源启动子，所述异源启动子与包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA可操作地连接，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。本发明的另一方面提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含具有转录起始序列的异源启动子，所述异源启动子与编码RNA发夹的DNA可操作地连接，所述RNA发夹具有反义区域，所述反义区域具有选自以下的序列或序列的片段：选自RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组的组。在另一实施例中，将包含可操作地连接到DNA的启动子的重组DNA构建体稳定地整合到其中包括RNA适体和RNA沉默元件的RNA转录物在植物细胞中被表达的植物基因组中，所述DNA编码：(a)用于抑制选自靶基因序列组的靶基因的RNA沉默元件，和(b)适体；所述适体用于将RNA沉默元件引导到细胞中的期望的位置。在另一实施例中，包括被小RNA(例如，被仅在特定的细胞或组织中表达的miRNA或siRNA)结合和切割的一个或多个识别位点允许植物中更精确的表达模式，其中重组DNA构建体的表达在表达小RNA的地方被抑制。此类另外的元件描述如下。

VII.通过与多核苷酸接触来控制禾谷镰刀菌的DON产生。

本文提供了用于减少或消除产生DON和/或导致镰刀菌赤霉病的镰刀菌属中的禾谷镰刀菌或其它真菌病原体的DON产生的方法。此类方法包括使禾谷镰刀菌与本文所描述的任何多核苷酸和其它组合物接触。一些实施例涉及通过使植物与例如本文第II章节或第VIII章节或其它地方所描述的任何多核苷酸或其它组合物接触来减少或消除植物上的禾谷镰刀菌的DON产生的方法。一些实施例涉及用于通过将植物上的禾谷镰刀菌与多核苷酸接触来减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自由表1或表2中鉴定的基因或与镰刀菌属的DON产生相关的另一种基因组成的组的靶基因的DNA的对应片段具有约95％至约100％同一性或互补性。在一实施例中，用于通过使植物上的禾谷镰刀菌与包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸接触来减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述连续核苷酸与具有SEQ ID NO:16的DNA序列的靶基因或其DNA补体的对应片段具有100％同一性。在其它实施例中，用于通过使植物上的禾谷镰刀菌与包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸来减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述连续核苷酸与具有选自由以下组成的组的DNA序列的靶基因或其DNA补体的对应片段具有100％同一性：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。在具体实施例中，靶基因选自由以下组成的组：禾谷镰刀菌的FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12或其同源物，或在更具体的实施例中为FGP1或其同源物。

在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学地或酶促地合成的，或者是通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。实施例包含其中多核苷酸是dsRNA的实施例，所述dsRNA包括具有选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列的链。实施例进一步包含其中多核苷酸包括18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的实施例，所述连续核苷酸具有与选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列的一部分具有约95％至约100％同一性的序列。在所述方法中使用的多核苷酸可以被设计成用于多个靶基因。本发明的相关方面包括在所述方法中使用分离的多核苷酸。具体实施例包含其中多核苷酸是dsRNA或其补体的实施例，所述dsRNA包括以下的序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

在一些实施例中，连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA或其DNA补体的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，多核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。在一些具体实施例中，靶基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。

在一实施例中，多核苷酸包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与靶基因或其DNA补体的对应片段具有100％同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。在一些实施例中，除了与靶基因的对应片段具有100％同一性的21个连续核苷酸的一个或多个区段之外，多核苷酸包含“中性”序列(与靶基因没有序列同一性或互补性的序列)，并且因此多核苷酸整体上与靶基因具有低得多的总体序列同一性。

在一些实施例中，用于此方法的多核苷酸以分离的DNA或RNA片段提供。在一些实施例中，用于此方法的多核苷酸不是表达构建体的一部分，并且缺少另外的元件(如启动子或终止子序列)。此类多核苷酸可以相对较短，如介于约18个与约300个或介于约50个与约750个核苷酸之间(对于单链多核苷酸)或介于约18个与约300个或介于约50个与约750个碱基对(对于双链多核苷酸)之间的单链或双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是介于约100个与约750个碱基对之间的dsRNA，如SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294的任何dsRNA触发物的长度的dsRNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包括在重组载体中，例如被包括在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包括另外的元件，如用于表达所关注的基因(例如，杀真菌蛋白)的表达盒。

若干实施例涉及一种用于通过使植物上的禾谷镰刀菌与多核苷酸接触来减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述多核苷酸包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自由表1或表2中鉴定的基因组成的组的靶基因的DNA的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，多核苷酸包含dsRNA，所述dsRNA带有具有选自由RNA触发物序列组组成的组的序列的链。在一些实施例中，本发明提供了一种用于通过使植物上的禾谷镰刀菌与有效量的溶液接触来减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述溶液包含来自RNA触发物序列组的双链RNA，并且所述溶液进一步包含有机硅酮表面活性剂。

在所述方法的各个实施例中，所述接触包含将包含本文所描述的任何多核苷酸(例如，第II章节中所述的多核苷酸、第VIII章节中所描述的dsRNA或第IX章节或本文其它地方所描述的组合物)的合适组合物施加到感染或可能感染禾谷镰刀菌的植物的表面；此类组合物可以例如以固体、液体(包括均质混合物，如可溶性液体浓缩物和非均质混合物，如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾剂、胶囊化或微囊化调配物的形式提供在微珠或其它载剂微粒中或在其上，在薄膜或涂层中，或在基质上或在其内，或作为叶、种子、根或茎处理剂提供。可用于促进将dsRNA施加到植物以接触害虫或病原体的杀害虫剂(包括dsRNA杀害虫剂)调配物的组合物是本领域已知的，并且任何合适的调配物都可以与本发明的多核苷酸一起使用。在一实施例中，表面是植物的叶、叶球、茎、穗、花或果实。在此类实施例中，可以通过喷雾植物的叶、叶球、茎、穗、花或果实来实现施加。接触也可以呈种子处理剂的形式。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包括在组合物中，如杀害虫剂和种子处理剂的调配物领域的技术人员已知的。在一些实施例中，接触包括在组合物中提供多核苷酸，所述组合物进一步包含一种或多种载剂和/或一种或多种表面活性剂(例如，有机硅酮、有机硅酮表面活性剂)、非多核苷酸杀真菌剂、多核苷酸除草分子、多核苷酸杀虫剂、非多核苷酸杀虫剂、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀害虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。在一个实施例中，接触包含在组合物中提供多核苷酸，所述多核苷酸可以被转染到镰刀菌属的真菌中或被其内部吸收。

VIII.双链RNA分子

本发明的另一方面提供了双链RNA分子，其中当所述双链RNA分子转染到植物上的镰刀菌属的一种或多种真菌病原体(例如，禾谷镰刀菌)中或与其接触时减少或消除所述一种或多种真菌病原体的DON产生。此类dsRNA分子包含上文第II章节或本文其它地方所描述的如可用于控制禾谷镰刀菌的DON产生的任何多核苷酸的核苷酸序列。在另一实施例中，dsRNA可以进一步包含一个或多个序列，当所述一个或多个序列转染到禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时引起所述禾谷镰刀菌的死亡、生长抑制、毒性或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低。本发明的某些实施例提供了一种双链RNA分子，所述双链RNA分子当转染到植物上的禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述至少一个区段与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的区段基本上相同或基本上互补。在具体实施例中，靶基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，或者在更具体的实施例中包含FGP1。在一些实施例中，dsRNA包含第一链，所述第一链包含一个或多个选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列。在一些实施例中，dsRNA包含第一链，所述第一链包含与以下序列的至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个或至少700个连续核苷酸基本上互补，或与其约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、95％至约100％、约98％至约100％、约100％或100％相同的序列：所述以下序列选自由RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体组成的组，或在具体实施例中选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。在一些实施例中，dsRNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与选自由RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组组成的组的序列的一部分具有约95％至约100％同一性。在一些实施例中，dsRNA包含第一链，所述第一链包含与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或完全100％相同的序列。在一些实施例中，dsRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ IDNO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。在一些实施例中，dsRNA进一步包含与第一链互补的第二链。在一些实施例中，dsRNA包含包括选自RNA触发物序列的核苷酸序列的第一链，并且进一步包含包括选自对应RNA触发物序列反向补体的序列的第二链。在一些实施例中，dsRNA包含包括选自由以下组成的组的核苷酸序列的第一链：SEQ ID NO:48、80-82、182、188、194、213和220，并且进一步包含选自对应互补序列的序列的第二链，所述对应互补序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

dsRNA的一条链的总长度可以大于或等于18个连续核苷酸，并且可以包括除了连续核苷酸之外的核苷酸，所述连续核苷酸具有与选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体或选自由以下组成的组的序列的一部分约95％至约100％的序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。包含选自RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组的核苷酸序列的dsRNA可以包括除了选自RNA触发物序列组和RNA触发物序列反向补体组的序列的核苷酸之外的核苷酸。换句话说，dsRNA链的总长度可以大于选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列或所述序列的部分的长度。例如，dsRNA可以具有侧接于抑制靶基因的“活性”区段的核苷酸，或者在活性区段之间包括“间隔子”核苷酸，或者可以在5'端处或在3'端处或在5'端和3'端两者处具有另外的核苷酸。在一实施例中，dsRNA可以包括与由给定触发物靶向的靶基因非特异性地相关(具有与所述靶基因不互补或不相同的序列)的另外的核苷酸，例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸。在一实施例中，dsRNA可以包括紧邻选自RNA触发物序列组或RNA触发物序列反向补体组的序列或所述序列的部分定位的另外的核苷酸。在一实施例中，dsRNA包含一个此类区段，与所述区段相邻的是另外的5'G或另外的3'C或两者。在另一实施例中，dsRNA进一步包含另外的核苷酸以形成突出端，例如，包含2个脱氧核糖核苷酸以形成3'突出端的dsRNA。因此，在各个实施例中，完整dsRNA的核苷酸序列与RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体序列并不100％相同或互补。例如，在一些实施例中，dsRNA包含各自具有21个连续核苷酸的至少两个区段，所述连续核苷酸具有与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列的部分具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段被一个或多个间隔子核苷酸分隔开，或(2)所述至少两个区段以与其中对应片段出现在靶基因中的顺序不同的顺序排列。

在一些实施例中，双链RNA分子的长度介于约50个与约750个碱基对之间。在一些实施例中，双链RNA分子包含18个或更多个连续核苷酸的多个区段，所述连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的区段基本上相同或基本上互补，并且任选地包括18个或更多个连续核苷酸的至少第二区段，所述连续核苷酸与表1或表2中鉴定的第二靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的区段基本上相同或基本上互补。在一些实施例中，双链RNA分子包含18个或更多个连续核苷酸的多个区段，所述连续核苷酸与靶基因的等效长度的区段基本上相同或基本上互补，其中所述区段来自靶基因的不同区(例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区，并且与靶基因不对应的“间隔子”核苷酸可以任选地用于区段之间或相邻区段)，或者来自不同的靶基因。在一些实施例中，双链RNA分子包含18个或更多个连续核苷酸的多个区段，所述连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的区段基本上相同或基本上互补，其中所述区段来自靶基因的不同区，并且以与所述区段在靶基因中天然存在的顺序不同的顺序排列在所述双链RNA分子中。在一些实施例中，双链RNA分子包含各自具有18个连续核苷酸的多个区段，所述连续核苷酸与具有与表1或表2中鉴定的靶基因或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因的等效长度的区段具有100％同一性或100％互补性的序列，其中所述区段来自靶基因的不同区，并且以与所述区段在靶基因中天然存在的顺序不同的顺序排列在所述双链RNA分子中。在一些实施例中，双链RNA分子包含一条链，所述一条链包含选自由RNA触发物序列组或其补体组成的组的序列。

双链RNA分子可以局部施加到植物，以减少或消除产生DON和/或导致镰刀菌赤霉病的镰刀菌属中的禾谷镰刀菌或另一真菌中的DON产生。双链RNA分子可以以适于与禾谷镰刀菌的转染或直接接触的形式提供，例如以喷雾剂或粉末的形式。用于提供双链RNA分子的其它方法和合适的组合物类似于本发明其它方面的前述段落中所描述的那些。

若干实施例涉及包含一个或多个多核苷酸和水或其它溶剂(任选地包括有机硅酮表面活性剂)的罐混合物。适于将dsRNA和其它多核苷酸局部施加到植物以保护植物免受害虫或病原体侵害的组合物是本领域众所周知的。此类组合物包括PCT/US/2022/027816中描述的任何组合物。实施例包括多核苷酸和任选地至少一种杀虫剂的罐混合物调配物。此类组合物的实施例包括其中一个或多个多核苷酸提供在活的或死的微生物如细菌或真菌或酵母细胞中的实施例，或作为微生物发酵产物提供的实施例，或提供在活的或死的植物细胞中的实施例，或作为合成的重组多核苷酸提供的实施例。在一实施例中，组合物包括含有如本文所描述的多核苷酸的微生物的非致病菌株；微生物的摄入减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生和/或引起所述禾谷镰刀菌的生长抑制、毒性或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低或死亡；合适的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌(E.coli)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、光杆状菌(Photorhabdus sp.)、异短杆菌(Xenorhabdus sp.)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)和相关的沙雷氏菌(Serratia sp.)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、金龟子芽胞杆菌(B.popilliae)、双酶梭状芽胞杆菌(Clostridiumbifermentans)和其它梭菌属(Clostridium)种或其它形成孢子的革兰氏阳性细菌。在一实施例中，组合物包括植物病毒载体，所述植物病毒载体包含如本文所描述的多核苷酸；用植物病毒载体处理植物上的禾谷镰刀菌感染引起所述禾谷镰刀菌的生长抑制、死亡、毒性或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)降低。在一实施例中，组合物包括杆状病毒载体，所述杆状病毒载体包括如本文所描述的多核苷酸；所述载体的摄入减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生和/或引起禾谷镰刀菌的生长抑制、死亡、或毒性或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低。在一实施例中，如本文所描述的多核苷酸被包封在合成基质(如聚合物)中，或附着到微粒上，并且被局部施加到植物的表面；局部处理的植物上的禾谷镰刀菌感染减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生、引起生长抑制、死亡、或毒性或致病性的降低或繁殖/生殖能力(孢子形成)的降低。在一实施例中，如本文所描述的多核苷酸以表达所述多核苷酸的植物细胞(例如，本发明的转基因植物细胞)的形式提供；禾谷镰刀菌对所述植物细胞或植物细胞的内含物的感染减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生。

在一些实施例中，如本文所描述的一个或多个多核苷酸与高效叶面覆盖所需的合适的粘着剂和湿润剂，以及保护多核苷酸如dsRNA免受UV损伤的UV保护剂一起提供。在一些实施例中，如本文所描述的一个或多个多核苷酸进一步与以下一起提供：载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、非多核苷酸杀真菌剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀害虫剂、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。在一些实施例中，组合物进一步包括至少一种杀害虫剂或杀真菌剂。

此类组合物以任何方便的方式施加，例如，通过对禾谷镰刀菌直接喷雾或撒粉，或对其中期望控制禾谷镰刀菌的DON产生的植物(包括例如植物的叶、茎或叶球)或环境喷雾或撒粉，或通过将涂层施加到植物的表面，或通过将涂层施加到准备进行种子种植的种子，或通过在期望控制禾谷镰刀菌的DON产生的植物的根部周围施加土壤浸液。

如本文所描述的多核苷酸的有效量是足以减少或消除镰刀菌属的真菌病原体，例如禾谷镰刀菌的DON产生的量；多核苷酸的有效量使用常规测定来确定。虽然对可用于本文提供的方法和组合物中的多核苷酸的浓度和剂量没有上限，但通常为了效率和经济性而寻求较低的有效浓度和剂量。多核苷酸的有效量的非限制性实施例包括以液体形式喷雾在植物上的在每毫升约10纳克至每毫升约100微克范围内的多核苷酸，或施加到植物田地的每英亩约10毫克至每英亩约100克的多核苷酸。在如本文所描述的多核苷酸局部施加到植物的情况下，可以考虑施加到植物叶或叶球或其它植物部分表面如花瓣、茎、果实、花药、花粉、叶、叶球、穗、根或种子的喷雾剂或处理剂的体积来调节浓度。在一个实施例中，使用如本文所描述的25聚体多核苷酸对草本植物的有用处理剂是每株植物约1纳摩尔(nmol)多核苷酸，例如每株植物约0.05至1nmol多核苷酸。草本植物的其它实施例包括每株植物约0.05至约100nmol或约0.1至约20nmol或约1nmol至约10nmol的多核苷酸的有用范围。在某些实施例中，施加约40至约50nmol的ssDNA多核苷酸。在某些实施例中，施加约0.5nmol至约2nmol的dsRNA。在某些实施例中，施加含有约0.5至约2.0毫克/毫升，或约0.14毫克/毫升的dsRNA或ssDNA(21聚体)的组合物。在某些实施例中，施加约0.5至约1.5毫克/毫升的本发明的具有约50个至约200个或更多个核苷酸的dsRNA多核苷酸的组合物。在某些实施例中，将约1nmol至约5nmol的本发明dsRNA施加到植物。在某些实施例中，局部施加到植物的多核苷酸组合物含有至少一个本发明的浓度为约0.01至约10毫克/毫升、或约0.05至约2毫克/毫升或约0.1至约2毫克/毫升的多核苷酸。在一些实施例中，每公顷施加约5g至约100g浓度的多核苷酸活性成分非常大的植物、树木或藤本植物可能需要对应更大量的多核苷酸。当使用本发明的可以处理成多个寡核苷酸的长dsRNA分子(例如，由本发明的单个重组DNA分子编码的多个触发物)时，可以使用较低的浓度。有效的多核苷酸处理剂方案的非限制性实例包括每株植物约0.1至约1nmol多核苷酸分子，或介于每株植物约1nmol与约10nmol多核苷酸分子之间，或介于每株植物约10nmol至约100nmol多核苷酸分子之间的处理剂。

当将本发明的组合物和多核苷酸如以喷雾剂的形式局部施加到植物时，施加可以在植物生长的任何合适阶段进行。对谷物的示例性施加可在抽穗期(Feekes 10.1-10.5)和/或开花期(Feekes 10.5.1-10.5.3)进行，并且如果使用另外的施加，可以晚至Feekes10.5.4施加。

在一些实施例中，一个或多个多核苷酸与“转移剂”一起提供，所述“转移剂”是使局部施加的多核苷酸能够进入生物体细胞的药剂。此类转移剂可以作为包含如本文所描述的多核苷酸的组合物的一部分并入，或者可以在施加多核苷酸之前、同时或之后施加。在一些实施例中，转移剂是提高禾谷镰刀菌对本发明的多核苷酸的摄取的药剂。在一些实施例中，转移剂是调节植物组织(例如，种子、叶、叶球、穗、茎、根、花或果实)的表面以使多核苷酸渗透到植物细胞中的药剂。在一些实施例中，转移剂使多核苷酸能够通过角质层蜡屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入到植物细胞中。

合适的转移剂包括增加生物体外部的渗透性或增加生物体的细胞对多核苷酸渗透性的药剂。合适的转移剂包括化学药剂、物理药剂或其组合。用于调节或转移的化学药剂包括(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或含水混合物，(c)氧化剂，(d)酸，(e)碱，(f)油，(g)酶，或其任何组合。在一些实施例中，多核苷酸和转移剂的施加任选地包括温育步骤、中和步骤(例如，以中和酸、碱或氧化剂，或使酶失活)、冲洗步骤或其组合。合适的转移剂可以呈乳液、反相乳液、脂质体或其它胶束状组合物的形式，或者可以使多核苷酸采取乳液、反相乳液、脂质体或其它胶束状组合物的形式。转移剂的实施例包括抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其它分子，例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺如精胺、亚精胺或腐胺，以及其它阳离子。转移剂的实施例包括有机溶剂，如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇，或与水混溶的或在非水性系统中溶解磷酸核苷酸的其它溶剂(如在合成反应中使用的溶剂)。转移剂的实施例包括含有或不含表面活性剂或乳化剂的天然衍生的或合成的油，例如植物来源的油、农作物油(如在《除草剂佐剂(Herbicide Adjuvants)》的第9版目录中列出的那些，可在herbicide.adjuvants.com上在线公开获得)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或多胺如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷改性的短链分子的油。

转移剂的实施例包括有机硅酮制剂。例如，合适的转移剂是可作为以下商购获得的有机硅酮制剂：SILWET 牌表面活性剂(具有CAS号27306-78-1和EPA号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA)，并且目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团(Momentive Performance Materials,Albany,N.Y.)获得。BREAK-THRU S240牌聚醚改性的聚硅氧烷(CASRN专有)表面活性剂，目前可从弗吉尼亚州霍普韦尔的Goldschmidt化学公司(Goldschmidt Chemical Corporation,Hopewell,VA)获得。BREAK-THRU S279封端的聚醚三硅氧烷表面活性剂，其组分列于以下化学品名录中：EINECS、TSCA、ENCS、AICS、ECL、PICCSCHINA、NDSL。INDUCE牌佐剂NMFC，第42652项，第60类，目前可从田纳西州科利尔维的Helena化学公司(Helena Chemical Company,Collierville,TN)获得。与牌表面活性剂(具有CA REG号34704-50065，目前可从科罗拉多州格里利的Loveland产品公司(Loveland Products,Inc.Greely,CO.)获得。一个实施例包括一种组合物，所述组合物包含多核苷酸和BREAK-thru301。一个实施例包括一种组合物，所述组合物包含多核苷酸和转移剂，所述转移剂包括在约0.015至约2重量％(wt％)范围内(例如，约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的有机硅酮制剂，如Silwet L-77、Break-thru S240、Break-thru S279、Induce或Franchise。一个实施例包括一种组合物，所述组合物包含本发明的多核苷酸和转移剂，所述转移剂包含在约0.3至约1重量％(wt％)或约0.5至约1重量％(wt％)范围内的SILWET BREAK-THRU S240、BREAK-THRU S279、Induce或Franchise牌表面活性剂。

可用作用于本发明中的转移剂的有机硅酮化合物包括但不限于包括以下的化合物：(a)共价连接的三硅氧烷头基，(b)共价连接的烷基接头，包括但不限于正丙基接头，(c)共价连接的聚乙二醇链，(d)末端基团。此类有机硅酮化合物的三硅氧烷头基包括但不限于七甲基三硅氧烷。烷基接头可以包括但不限于正丙基接头。聚乙二醇链包括但不限于聚乙二醇或聚丙二醇。聚乙二醇链可以包含提供约“7.5”的平均链长“n”的混合物。在某些实施例中，平均链长“n”可以在约5至约14之间变化。末端基团可以包括但不限于烷基，如甲基。可用作转移剂的有机硅酮化合物包括但不限于三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷。用于本发明的转移剂的实例是化合物I：

(化合物I：聚环氧烷七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。

可用作转移剂的有机硅酮化合物例如，新鲜制备的有机硅酮化合物以在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内(例如，约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的浓度使用。

转移剂的实施例包括一种或多种盐，如氯化铵、溴化四丁基鏻和硫酸铵，在包括多核苷酸的组合物中提供或与所述包括多核苷酸的组合物一起使用。在一些实施例中，氯化铵、溴化四丁基鏻和/或硫酸铵以约0.5％至约5％(w/v)或约1％至约3％(w/v)或约2％(w/v)的浓度使用。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括浓度大于或等于300毫摩尔的铵盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括浓度为约0.015至约2重量％(wt％)的有机硅酮转移剂以及浓度为约80至约1200mM或约150mM至约600mM的硫酸铵。

转移剂的实施例包括磷酸盐。可用于包括多核苷酸的组合物的磷酸盐包括但不限于磷酸钙盐、磷酸镁盐、磷酸钾盐或磷酸钠盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔或至少约20毫摩尔的磷酸盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物，在约1mM至约25mM范围内或在约5mM至约25mM范围内的磷酸盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物，浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔或至少约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括浓度为约5毫摩尔、约10毫摩尔或约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括在约1mM至约25mM范围内或在约5mM至约25mM范围内的磷酸钠盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括在约10mM至约160mM范围内或在约20mM至约40mM范围内的磷酸钠盐。在某些实施例中，包括多核苷酸的组合物包括pH为约6.8的磷酸钠缓冲液。

转移剂的实施例包括其中含有的表面活性剂和/或有效分子。其中含有的表面活性剂和/或有效分子包括但不限于脂肪酸(如牛油或牛油脂肪胺或磷脂)的钠盐或锂盐以及有机硅酮表面活性剂。在某些实施例中，将包括多核苷酸的组合物与抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其它分子一起调配。非限制性实例包括四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子和多胺，如聚乙烯亚胺、精胺、亚精胺或腐胺。在某些实施例中，将包括多核苷酸的组合物与非多核苷酸除草剂一起调配，所述非多核苷酸除草剂例如草甘膦、生长素样苯甲酸除草剂，包括麦草畏(dicamba)、草灭平(chloramben)和TBA、草铵膦、生长素样除草剂，包括苯氧羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂和苯那唑林-乙基除草剂、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯(dalapon)、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶抑制除草剂。

IX.用于控制禾谷镰刀菌的DON产生的组合物

本发明的另一方面提供了一种用于减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的组合物，所述组合物包含有效量的至少一个RNA。此类RNA可以是本文第II章节、第VIII章节或其它地方所描述的任何RNA。在一实施例中，RNA包含18个或更多个、或19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、125个或更多个、150个或更多个、200个或更多个、250个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个或1,000个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的靶基因的DNA、或其DNA补体或由其转录的RNA的对应片段具有约75％至约100％同一性、约80％至约100％同一性、约85％至约100％同一性、约90％至约100％同一性、约95％至约100％同一性、约98％至约100％同一性、约100％同一性或完全100％同一性。在一实施例中，RNA包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的靶基因、或其DNA补体或由此类靶基因转录的RNA的至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900或至少1,000个连续核苷酸基本上互补：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。

在一些实施例中，RNA包含与选自由以下组成的组的序列的至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个或至少500个连续核苷酸基本上互补或约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、95％至约100％、约98％至约100％、约100％或100％相同的序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。在一些实施例中，多核苷酸包含与选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体的序列基本上互补或至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或完全100％相同的序列。在一些实施例中，多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:48、80-82、182、188、194、213和220。

“有效量”意指在真菌病原体中有效诱导生物变化从而消除或减少真菌病原体的DON产生的药剂的量；在一些实施例中，将有效量的RNA施加到植物改进了植物对来自禾谷镰刀菌的损害的抗性。RNA可以比其含有的一个或多个区段更长(即RNA可以含有所述区段的另外的核苷酸3'和/或5')，但是每个区段和靶基因的对应片段具有等效长度。在所述方法中使用的RNA可以针对多个靶基因进行设计。实施例包括其中组合物包含以下的实施例：有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的核苷酸序列的靶基因或由此类靶基因转录的RNA的一部分互补的至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸；或有效量的至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含至少一个沉默元件，所述至少一个沉默元件与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少21个连续核苷酸基本上互补或基本上相同，其中所述靶基因具有选自靶基因序列组的核苷酸序列；或有效量的至少一个RNA的实施例，所述至少一个RNA包含至少一个区段，所述至少一个区段与具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸相同或互补；或RNA分子，所述RNA分子当转染到植物上的禾谷镰刀菌中或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述RNA分子包含与具有选自SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146的核苷酸序列的靶基因或由所述靶基因转录的RNA的一部分互补的至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸；或有效双链RNA分子，所述有效双链RNA分子当转染到禾谷镰刀菌中或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的，其中有效双链RNA分子的至少一条链包含与靶基因的一部分或由所述靶基因转录的RNA互补的21个连续核苷酸，其中所述靶基因具有选自由靶基因序列组成的组的序列；或有效量的至少一个双链RNA，所述至少一个双链RNA包含选自RNA触发物序列组的序列。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸(例如，双链RNA)是化学地或酶促地合成的，或者是通过在微生物中表达或通过在植物细胞中表达而产生的。实施例包括包含dsRNA的组合物，所述dsRNA具有选自RNA触发物序列组、RNA触发物序列反向补体的序列。

在各个实施例中，用于消除或减少禾谷镰刀菌中的DON产生的组合物呈选自由以下组成的组的至少一种的形式：固体、液体(包括均质混合物，如可溶性液体浓缩物和非均质混合物，如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、气溶胶、胶囊化或微囊化调配物，在微珠或其它载剂微粒中或在其上，在薄膜或涂层中，或在基质上或在其内，或作为叶、种子、根、叶球、穗或茎处理剂。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包括在含多核苷酸的组合物中，如杀真菌剂和种子、茎、穗、叶球、果实或叶面处理剂的调配物领域的技术人员已知的。此类组合物可以包括于2022年11月10日以WO2022/0235895公开的PCT/US/2022/027816中所描述的任何组合物，所述文献通过引用整体并入本文。在一些实施例中，组合物是至少一种植入式调配物，所述至少一种植入式调配物选自由在植入植物中的微粒、团粒或胶囊组成的组；在此类实施例中，所述方法包含在植物中植入植入式调配物。在一个实施例中，组合物可以被禾谷镰刀菌转染或以其它方式被其内部吸收。在一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀害虫剂和安全剂、病原体生长调节剂。在一个实施例中，组合物进一步包含非离子有机硅酮表面活性剂，如牌表面活性剂，例如SILWET 牌表面活性剂，具有CAS号27306-78-1和EPA号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团获得。一个实施例包括一种组合物，所述组合物进一步包含BREAK-thru301。其它表面活性剂包括例如BREAK-THRU S240牌聚醚改性的聚硅氧烷(CASRN专有)表面活性剂，目前可从弗吉尼亚州霍普韦尔的Goldschmidt化学公司获得；BREAK-THRUS279封端的聚醚三硅氧烷表面活性剂，其组分列于以下化学品名录中：EINECS、TSCA、ENCS、AICS、ECL、PICCS CHINA、NDSL；INDUCE牌佐剂NMFC第42652项，第60类，目前可从田纳西州科利尔维的Helena化学公司获得。与LECI-牌表面活性剂(具有CA REG号34704-50065，目前可从科罗拉多州格里利的Loveland产品公司获得。可替代地，用组合物以及用单独(之前、之后或同时)施加改进组合物的功效的物质对植物进行局部处理。例如，可以通过首次局部施加含有非离子有机硅酮表面活性剂(如牌表面活性剂，例如SILWET BREAK-THRU S24、BREAK-THRU S279、INDUCE或FRANCHISE牌表面活性剂)的溶液，随后二次局部施加组合物来喷雾植物，或者反之亦然。

当与单独使用RNA和杀真菌RNA和/或非多核苷酸杀真菌剂获得的DON减少或消除效果相比时，预期在此方法中使用的某些RNA(例如，在工作实例中描述的dsRNA触发物)与一种或多种杀真菌多核苷酸和/或一种或多种非多核苷酸杀真菌剂的组合将产生增强的植物保护。

在各个实施例中，组合物包含微生物细胞或在微生物中产生。例如，组合物可以包括细菌或酵母细胞或者可以在所述细菌或所述酵母细胞中产生。在类似的实施例中，组合物包含转基因植物细胞或在植物细胞(例如，瞬时表达多核苷酸的植物细胞)中产生；此类植物细胞可以是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。

在一个实施例中，组合物以受到禾谷镰刀菌感染的任何植物的形式提供，其中在所述植物中或在其上含有RNA。此类植物可以是表达RNA的稳定转基因植物，或者是瞬时表达RNA的非转基因植物，或者是已经用RNA处理(例如，通过喷雾或涂覆)的非转基因植物。稳定转基因植物通常含有整合到其基因组中的编码RNA的重组构建体。

用于组合物的RNA可以是单链(ss)的或双链(ds)的。实施例包括其中RNA是选自由以下组成的组中的至少一种的实施例：有义单链RNA(ssRNA)、反义单链(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)；可以使用这些类型中的任一种的RNA的混合物。在一个实施例中，使用双链DNA/RNA杂交体。RNA可以包括除标准核糖核苷酸外的组分，例如，一实施例是包含末端脱氧核糖核苷酸的RNA。

组合物中的RNA具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一实施例中，RNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的靶基因的等效长度的片段基本上相同或互补。在一些实施例中，连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，RNA具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。

组合物中的RNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，RNA包含18个或更多个，例如，介于18-24个之间，或介于18-28个之间，或介于20-30个之间，或介于20-50个之间，或介于20-100个之间，或介于50-100个之间，或介于50-500个之间，或介于100-250个之间，或介于100-500个之间，或介于200-1000个之间，或介于500-2000个之间，或者甚至更多个连续核苷酸的至少一个区段。在一些实施例中，所述区段包含多于18个连续核苷酸，例如19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个，例如约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约650个、约700个或超过700个连续核苷酸。在特定实施例中，RNA包含至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定实施例中，RNA是双链核酸(例如，dsRNA)，其中一条链包含至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包含至少18个、19个、20个或21个连续的完全匹配的碱基对的至少一个区段，所述碱基对对应于具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段。在特定实施例中，RNA中含有的每个区段的长度大于天然存在的调控性小RNA的典型长度，例如，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，RNA的总长度或RNA中含有的每个区段的长度小于所关注的序列(具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，RNA的总长度介于约50与约500个核苷酸(对于单链RNA)或碱基对(对于双链RNA)之间。在一些实施例中，RNA包含至少一条长度介于约50与约750个核苷酸之间的RNA链。

组合物中的RNA通常被设计成抑制一个或多个基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包括编码序列或非编码序列或两者。在具体实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各个实施例中，RNA被设计成抑制一个或多个基因，其中每个靶基因选自表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自这些组的多个基因，或靶向这些基因中的一个或多个基因的不同区。在一实施例中，RNA包括多个部分或区段，所述多个部分或区段中的每一者包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小上或在序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，RNA可以包括串联或重复排列的多个部分，其中每个部分包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列；所述区段可以来自靶基因的不同区，例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区，并且不对应于靶基因的“间隔子”核苷酸可以任选地用于区段之间或相邻区段。

组合物中RNA的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包括除了连续核苷酸之外的核苷酸，所述连续核苷酸具有与表1或表2中标识的靶基因或其同源物或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。换句话说，RNA的总长度可以大于被设计成用于抑制一个或多个靶基因的RNA的部分或区段的长度，其中每个靶基因选自由表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物组成的组或者具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。例如，RNA可以具有侧接于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段的核苷酸，或者在活性区段之间包括“间隔子”核苷酸，或者可以在5'端处或在3'端处或在5'端和3'端两者处具有另外的核苷酸。在一实施例中，RNA包含与靶基因的DNA非特异性地相关(具有与其不互补或不相同的序列)的另外的核苷酸，例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸。在一实施例中，RNA包含紧邻18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段定位的另外的核苷酸，所述一个或多个区段具有与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一实施例中，RNA包含一个此类区段，与所述区段相邻的是另外的5'G或另外的3'C或两者。在另一实施例中，RNA是包含另外的核苷酸以形成突出端的双链RNA，例如，包含2个脱氧核糖核苷酸以形成3'突出端的dsRNA。因此，在各个实施例中，完整RNA的核苷酸序列与靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，RNA包含各自具有21个连续核苷酸的至少两个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段被一个或多个间隔子核苷酸分隔开，或(2)所述至少两个区段以与其中对应片段出现在具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体中的顺序不同的顺序排列。

在各个实施例中，组合物中的RNA包含天然存在的核糖核苷酸。实施例包括例如完全由核糖核苷酸组成或主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成RNA。在某些实施例中，RNA包含非典型核苷酸，如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施例中，RNA包含经化学修饰的核苷酸。组合物中的RNA可以通过本领域技术人员已知的合适方法提供。

在一些实施例中，RNA作为不是表达构建体的一部分的分离的RNA提供。在一些实施例中，RNA作为缺乏另外的元件如启动子或终止子序列的分离的RNA提供。此类RNA可以相对较短，如介于约18个与约300个或介于约50个与约750个核苷酸(对于单链RNA)之间或介于约18个与约300个或介于约50个与约750个碱基对(对于双链RNA)的单链或双链RNA。可替代地，RNA可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包括在重组载体中，例如被包括在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在一些实施例中，此类重组表达构建体或载体被设计成包括另外的元件，如包括编码适体或核酶的另外的RNA或用于表达所关注的基因(例如，杀真菌蛋白)的表达盒。

X.提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的植物的方法，以及由此提供的植物、植物部分和种子

若干实施例涉及提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的植物的方法，所述方法包含向植物提供本文所描述的有效减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的至少一个多核苷酸，包括例如第II章节或第VIII章节所描述的多核苷酸或本文所描述的组合物。

在相关方面，本发明涉及对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的植物，所述改进的抗性通过在所述植物中表达本文所描述的有效减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生的至少一个多核苷酸(包括例如第II章节或第VIII章节中所述的多核苷酸)来提供。

在又另一方面，本发明涉及由如由所述方法提供的对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的植物产生的种子或可繁殖部分(尤其是转基因子代种子或可繁殖部分)。还设想了由如由所描述的方法提供的由对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的植物产生的商品产品，以及由此类植物的转基因子代种子或可繁殖部分产生的商品产品。

在所述方法中使用的多核苷酸可以针对多个靶基因进行设计。实施例包括其中组合物包含dsRNA的实施例，所述dsRNA带有具有选自由RNA触发物序列组组成的组的序列的链。本发明的相关方面包括用于局部施加的组合物和在所述方法中使用的分离的多核苷酸，以及通过所述方法提供的对禾谷镰刀菌中的DON产生具有改进的抗性的植物。

如贯穿本文所使用的“局部施加”意指施加到物体的表面或外部，如植物的表面或外部，如施加到植物部分(如叶、茎、穗、叶球、花、果实、芽、根、茎、种子、花、花药或花粉)的表面，或施加到整个植物，或施加到植物的地上部分或地下部分。局部施加可以在非活体表面上进行，如施加到土壤，或施加到禾谷镰刀菌可以通过其触碰到多核苷酸的表面或基质。在所述方法的各个实施例中，将包含至少一个多核苷酸的组合物以合适的形式局部施加到植物，例如作为固体、液体(包括均质混合物，如溶液和非均质混合物，如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾剂、胶囊化或微囊化调配物，提供在微珠或其它载剂微粒中或在其上，在薄膜或涂层中，或在基质上或在其内，或作为叶、种子、根、穗、叶球或茎处理剂提供。在所述方法的一些实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施加到植物的地上部分，例如喷雾或撒粉到植物的叶、穗、叶球、茎和开花部分上。

所述方法的实施例包括局部施加叶面喷雾剂(例如，将含多核苷酸的液体组合物喷雾在植物的叶上)或叶面撒粉(例如，用呈粉末形式或载剂微粒形式的含多核苷酸的组合物对植物进行撒粉)。在其它实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施加到植物的地下部分，如施加到根，例如通过土壤浸液。在其它实施例中，将含多核苷酸的组合物局部施加到生长成植物的种子。局部施加可以是对植物果实或植物果实的种子进行局部处理的形式。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以任选地包括在含多核苷酸的组合物中，如杀真菌剂和种子或茎处理剂的调配物领域的技术人员已知的。

在一些实施例中，含多核苷酸的组合物是至少一种局部植入式调配物，所述至少一种局部植入式调配物选自由局部植入在植物中的颗粒、团粒或胶囊组成的组；在此类实施例中，所述方法包含在植物中局部植入局部植入式调配物。在一个实施例中，含多核苷酸的组合物可以被禾谷镰刀菌转染或以其它方式被其内部吸收。在一些实施例中，含多核苷酸的组合物进一步包含载剂和/或表面活性剂(例如，非离子表面活性剂)。非离子有机硅酮表面活性剂的实例包括牌表面活性剂BREAK THRU S240、BREAK THRU S279、BREAK THRU 301、nduce和Franchise，例如SILWET 牌表面活性剂。首次局部施加表面活性剂之后可以是二次局部施加含多核苷酸的组合物，或者反之亦然。在一些实施例中，用含多核苷酸的组合物以及用单独(之前、之后或同时)施加改进含多核苷酸的组合物的功效的物质对植物进行局部处理。例如，可以通过首次局部施加含有非离子有机硅酮表面活性剂(如牌表面活性剂，如牌表面活性剂BREAK THRU S240、BREAKTHRU S279、BREAK THRU 301、Induce和Franchise，例如SILWET 牌表面活性剂)的溶液，然后二次局部施加含多核苷酸的组合物来喷雾植物，或者反之亦然。

当与用单独的多核苷酸或单独的非多核苷酸药剂获得的效果相比时，预期可用于含多核苷酸的组合物中的某些多核苷酸(例如，在工作实例中描述的多核苷酸触发物)与一种或多种非多核苷酸药剂的组合将在减少或消除镰刀菌属的DON产生方面引起增强的改进。

在一些实施例中，可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸作为分离的DNA或RNA片段提供。在一些实施例中，可用于含多核苷酸的组合物中的多核苷酸不是表达构建体的一部分，并且缺少另外的元件(如启动子或终止子序列)。此类多核苷酸可以相对较短，如介于约18个与约300个或介于约50个与约700个核苷酸之间(对于单链多核苷酸)或介于约18个与约300个或介于约50个与约700个碱基对(对于双链多核苷酸)之间的单链或双链多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是介于约100个与约700个碱基对之间的dsRNA，如图和表中所公开的dsRNA触发物中的任一个的长度的dsRNA。可替代地，多核苷酸可以在更复杂的构建体中提供，例如作为重组表达构建体的一部分，或者被包括在重组载体中，例如被包括在重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。此类重组表达构建体或载体可以被设计成包括另外的元件，如用于表达所关注的基因(例如，杀真菌蛋白)的表达盒。

XII.用于控制禾谷镰刀菌的DON产生的重组DNA构建体。

本发明的另一方面提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与DNA元件可操作地连接的异源启动子，所述DNA元件包含与本文所描述的有效控制禾谷镰刀菌的DON产生的序列相对应的序列，包括例如包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA元件，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA、或其DNA补体、或表1或表2中鉴定的靶基因的DNA的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，重组DNA构建体包含与以下可操作地连接的异源启动子：(a)包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个连续核苷酸互补，所述靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，或在更具体的实施例中，具有选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:16、68-70、108、114、120、139或146；或(b)包含18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个或更多个连续核苷酸的DNA，所述连续核苷酸与具有选自由以下组成的组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性：靶基因序列组或在更具体的实施例中SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146；或(c)编码至少一个沉默元件的DNA，所述至少一个沉默元件与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个连续核苷酸互补，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：靶基因序列组，或在更具体的实施例中，SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146；或(d)编码至少一个沉默元件的DNA，所述至少一个沉默元件包含至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个连续核苷酸，所述连续核苷酸与的靶基因或由所述靶基因转录的RNA的一部分互补，所述靶基因选自表1或表2中鉴定的基因或其同源物，或在更具体的实施例中选自FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12，；或(e)编码包含至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个连续核苷酸的RNA的DNA，所述连续核苷酸与选自RNA触发物序列组的核苷酸序列或其补体或来自镰刀菌属的种的同源核苷酸序列互补，其中所述同源核苷酸序列与选自RNA触发物序列组的核苷酸序列具有至少95％序列同一性，其中所述序列同一性百分比是在相同长度上计算的；或(f)编码包含至少一个双链RNA区的RNA的DNA，所述至少一个双链RNA区的至少一条链包含至少18个、19个、20个、21个、50个、150个、250个、300个、400个、500个、600个或650个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自RNA触发物序列组的核苷酸序列或其补体或来自镰刀菌属的种的同源核苷酸序列互补，其中所述同源核苷酸序列与选自由RNA触发物序列组组成的组的核苷酸序列具有至少95％序列同一性，其中所述序列同一性百分比是在相同长度上计算的；或(g)编码包含选自RNA触发物序列组的核苷酸序列的RNA的DNA或其补体。实施例包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码RNA的DNA元件可操作地连接的异源启动子，所述RNA具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:48、80-82、182、188、194、213和220或其组合、或其补体。

实施例包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码dsRNA的DNA可操作地连接的异源启动子，所述dsRNA具有选自由RNA触发物序列组组成的组的序列。重组DNA构建体可用于例如通过在植物中表达此类重组DNA构建体的转录物来提供对禾谷镰刀菌中的DON产生具有改进的抗性的植物。重组DNA构建体还可用于制备多核苷酸，所述多核苷酸可用于制备组合物，所述组合物可施加到需要保护免受DON影响的植物、种子、可繁殖植物部分、土壤或田地或表面。本发明的相关方面包括：包含重组DNA构建体的组合物；包含重组DNA构建体的植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体；在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，以及包括此类转基因植物细胞的转基因植物或所述转基因植物的果实、种子或可繁殖部分；以及对镰刀菌属的真菌(例如，禾谷镰刀菌)的DON产生具有改进的抗性的植物，以及具有害虫或病原体抗性(所述抗性通过重组DNA构建体或其中编码的RNA的表达或用重组DNA构建体或其中编码的RNA处理来提供)的植物。

重组DNA构建体包含与DNA可操作地连接的异源启动子，所述DNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA或具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。在一些实施例中，18个或更多个连续核苷酸的区段具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的序列。在一些实施例中，连续核苷酸与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段完全(100％)相同。在一些实施例中，DNA具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的总体序列。

因此，重组DNA构建体包含与DNA可操作地连接的异源启动子，所述DNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述DNA被设计成抑制具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或其DNA补体的表达。在一些实施例中，DNA包含18个或更多个，例如，介于18-24个之间、或介于18-28个之间、或介于20-30个之间、或介于20-50个之间、或介于20-100个之间、或介于50-100个之间、或介于50-500个之间、或介于100-250个之间、或介于100-500个之间、或介于200-650、500-1000个之间、或介于500-2000个之间，或者甚至更多个连续核苷酸的至少一个区段。在一些实施例中，所述区段包含多于18个连续核苷酸，例如19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个，例如约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个或超过650个连续核苷酸。在特定实施例中，DNA编码RNA，所述RNA含有至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的靶基因或其DNA补体或表1或表2中鉴定的靶基因或其同源物的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定实施例中，DNA编码双链核酸(例如，dsRNA)，其中一条链包含至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包含至少18个、19个、20个或21个连续的完全匹配的碱基对的至少一个区段，所述碱基对对应于具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段。在特定实施例中，DNA中含有的每个区段的长度大于天然存在的调控性小RNA的典型长度。在一些实施例中，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施例中，DNA的总长度或多核苷酸中含有的每个区段的长度小于所关注的序列(具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因)的总长度。在一些实施例中，DNA的总长度介于约50与约650之间。在一些实施例中，DNA编码具有选自RNA触发物序列或RNA触发物序列反向补体或其组合或其补体组成的组的序列的RNA。

重组DNA构建体包含与DNA可操作地连接的异源启动子，所述DNA通常被设计成抑制一个或多个基因(“靶基因”)。此类靶基因可以包括编码序列或非编码序列或两者。在具体实施例中，重组DNA构建体被设计成抑制一个或多个靶基因，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组的DNA序列。在各个实施例中，重组DNA构建体被设计成抑制一个或多个基因，其中每个基因具有选自由靶基因序列组组成的组的序列，并且可以被设计成抑制来自此组的多个基因，或靶向这些基因中的一个或多个的不同区。在一实施例中，重组DNA构建体包含与多个部分或区段可操作地连接的异源启动子，所述多个部分或区段中的每一者包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在此类情况下，每个部分在大小上或在序列上可以相同或不同，并且相对于靶基因可以是有义或反义的。例如，在一个实施例中，重组DNA构建体可以包括与串联或重复排列的多个部分可操作地连接的异源启动子，其中每个部分包含21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列；所述区段可以来自靶基因的不同区，例如，所述区段可以对应于靶基因的不同外显子区，并且不对应于靶基因的“间隔子”核苷酸可以任选地用于区段之间或相邻区段。

重组DNA构建体包含与DNA可操作地连接的异源启动子，所述DNA的总长度可以大于18个连续核苷酸，并且可以包括除了18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的区段之外的核苷酸，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。换句话说，DNA的总长度可以大于被设计成抑制一个或多个靶基因的DNA的区段的长度，其中每个靶基因具有选自由靶基因序列组组成的组或选自其同源物的DNA序列。例如，DNA可以具有侧接于抑制靶基因的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的“活性”区段的核苷酸，或者在活性区段之间包括“间隔子”核苷酸，或者可以在5'端处或在3'端处或在5'端和3'端两者处具有另外的核苷酸。在一实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包含与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因、或其DNA补体非特异性地相关(具有与其不互补或不相同的序列)的另外的核苷酸，例如，提供稳定二级结构或便于克隆或制造的核苷酸)。在一实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包含紧邻18个或更多个连续核苷酸的一个或多个区段定位的另外的核苷酸，所述一个或多个区段具有与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性或互补性的序列。在一实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包含一个此类区段，与所述区段相邻的是另外的5'G或另外的3'C或两者。在另一实施例中，异源启动子与编码包含另外的核苷酸以形成突出端的双链RNA的DNA可操作地连接。因此，在各个实施例中，与异源启动子可操作地连接的整个DNA的核苷酸序列与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA或靶基因中的连续核苷酸的片段不是100％相同或互补的。例如，在一些实施例中，异源启动子与DNA可操作地连接，所述DNA包含各自具有21个连续核苷酸的至少两个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有100％同一性的序列，其中(1)所述至少两个区段被一个或多个间隔子核苷酸分隔开，或(2)所述至少两个区段以与其中对应片段出现在具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体中的顺序不同的顺序排列。

在重组DNA构建体中，异源启动子与编码转录物的DNA可操作地连接，所述转录物可以是单链(ss)的或双链(ds)的或两者的组合。所述方法的实施例包括其中DNA编码转录物的实施例，所述转录物包含有义单链RNA(ssRNA)、反义ssRNA或双链RNA(dsRNA)或这些中的任一种的组合。

重组DNA构建体由本领域技术人员已知的合适方式提供。实施例包括其中重组DNA构建体在体外合成、通过在微生物或细胞培养物(如在培养物中生长的植物细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或通过微生物发酵产生的实施例。

用于重组DNA构建体的异源启动子选自由以下组成的组：在植物中起作用的启动子、在原核生物中起作用的启动子、在真菌细胞中起作用的启动子和杆状病毒启动子。启动子的非限制性实例在标题为“启动子”的章节中描述。

在一些实施例中，重组DNA构建体包含也与DNA可操作地连接的第二启动子。例如，包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA可以侧接有两个启动子，所述两个启动子被排列成使得启动子以相反的方向并以会聚的方式转录，产生DNA的彼此互补并能够彼此杂交以形成双链RNA的相反链转录物。在一个实施例中，DNA定位于两个根特异性启动子之间，这使得DNA能够沿相反方向转录，导致dsRNA的形成。

在一些实施例中，除了异源启动子之外，重组DNA构建体还包含其它DNA元件，所述异源启动子与包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段的DNA可操作地连接，所述转录物的实施例具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有约95％至约100％同一性的序列。此类DNA元件是本领域已知的，并且包括但不限于内含子、重组酶识别位点、适体或核酶、以及用于表达编码序列(例如，以表达转基因如杀真菌蛋白或可选择标志物)或非编码序列(例如，以表达另外的抑制元件)的另外的表达盒。包括用于被小RNA(例如，被仅在特定细胞或组织中表达的miRNA或siRNA)结合和切割的一个或多个识别位点允许植物中更精确的表达模式，其中重组DNA构建体的表达在表达小RNA的地方被抑制。

在一些实施例中，重组DNA构建体提供在重组载体中。“重组载体”意指用于将遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞的重组多核苷酸分子。适于本发明的实施例包括但不限于重组质粒、重组粘粒、人工染色体和重组病毒载体，如重组植物病毒载体和重组杆状病毒载体。替代性实施例包括重组质粒、重组粘粒、人工染色体和重组病毒载体，如包含DNA元件但不含异源启动子的重组植物病毒载体和重组杆状病毒载体。与本发明一起使用的质粒的实例包括例如于2021年6月10日公开为WO2021/113774的PCT/US2020/063490中所描述的质粒，所述文献通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，重组DNA构建体提供在植物染色体或质体中，例如提供在转基因植物细胞或转基因植物中。因此，本发明还涵盖在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，以及包括此类转基因植物细胞的转基因植物或部分转基因植物。部分转基因植物包括例如嫁接到包括转基因植物细胞的转基因根茎上的非转基因接穗。实施例包括有包括转基因植物细胞的转基因番茄根茎。植物可以是受到禾谷镰刀菌感染的任何植物。实施例包括其中植物是未发芽的植物种子、处于营养阶段的植物或处于生殖阶段的植物的实施例。在又另一方面，本发明涉及由在其基因组中具有如本文所描述的重组DNA构建体的转基因植物产生的种子(尤其是转基因子代种子)。还设想了由此类转基因植物产生的商品产品，以及由此类转基因植物的转基因子代种子产生的商品产品。

重组DNA构建体可以以组合物的形式提供，以用于局部施加到植物或植物种子、根或茎的表面，或用于局部施加到需要保护免受禾谷镰刀菌产生的DON影响的任何物质。同样，重组DNA构建体可以在用于局部施加到禾谷镰刀菌的组合物中提供，或者提供在用于被禾谷镰刀菌内部吸收(例如，转染)的组合物中。在各个实施例中，含有重组DNA构建体的此类组合物以选自由以下组成的组的至少一种的形式提供：固体、液体(包括均质混合物，如溶液和非均质混合物，如悬浮液、胶体、胶束和乳液)、粉末、悬浮液、乳液、喷雾剂、胶囊化或微囊化调配物，提供在微珠或其它载剂微粒中或在其上，在薄膜或涂层中，或在基质上或在其内提供，或作为叶、种子、根或茎处理剂提供。局部施加可以是对植物果实或植物果实的种子进行局部处理的形式。合适的粘合剂、惰性载剂、表面活性剂等可以包括在含有重组DNA构建体的组合物中，如杀害虫剂和种子处理剂的调配物领域的技术人员已知的。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的用于局部施加的组合物是至少一种局部植入式调配物，所述少一种局部植入式调配物选自由局部植入在植物中的微粒、团粒或胶囊组成的组；在此类实施例中，所述方法包含在植物中植入局部植入式调配物。在一个实施例中，用于局部施加的含有重组DNA构建体的组合物可以被禾谷镰刀菌内部吸收(例如，转染)。在一些实施例中，含有重组DNA构建体的组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀害虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。在一个实施例中，含有重组DNA构建体的组合物进一步包含非离子有机硅酮表面活性剂，如牌表面活性剂，例如SILWET 牌表面活性剂，具有CAS号27306-78-1和EPA号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，目前可从纽约奥尔巴尼的迈图高新材料集团获得。BREAK-THRU S240牌是聚醚改性的聚硅氧烷(CASRN专有)表面活性剂，目前可从弗吉尼亚州霍普韦尔的Goldschmidt化学公司获得。BREAK-THRU S279是封端的聚醚三硅氧烷表面活性剂，其组分列于以下化学品名录中：EINECS、TSCA、ENCS、AICS、ECL、PICCS CHINA、NDSL。INDUCE牌佐剂NMFC，第42652项，第60类，目前可从田纳西州科利尔维的Helena化学公司获得。与LECI-牌表面活性剂(具有CA REG号34704-50065，目前可从科罗拉多州格里利的Loveland产品公司获得。一个实施例包括一种组合物，所述组合物进一步包含BREAK-thru 301。

当与用单独的重组DNA构建体或单独的非多核苷酸杀害虫剂获得的效果相比时，预期如本文所描述的某些重组DNA构建体(例如，包括工作实例中所描述的多核苷酸触发物的重组DNA构建体)(无论是转基因表达的还是局部施加的)与一种或多种非多核苷酸杀害虫剂(无论是转基因表达的还是局部施加的)的组合将在减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生和害虫/病原体侵染方面引起增强的改进。在一实施例中，发现用于表达一个或多个多核苷酸以及一个或多个编码非多核苷酸杀害虫剂的基因的重组DNA构建体在表达所述重组DNA构建体的植物中提供了对禾谷镰刀菌的DON产生和害虫/病原体侵染的改进的抗性。一实施例涉及用于表达RNA的重组DNA构建体，所述RNA包含具有选自触发物序列组的序列的区段以及编码非多核苷酸杀害虫剂的一个或多个基因。

在各个实施例中，含有重组DNA构建体的组合物包含微生物细胞或在微生物中产生。例如，用于含有重组DNA构建体的组合物可以包括细菌或酵母细胞或可以在所述细菌或所述酵母细胞中产生。在类似的实施例中，含有重组DNA构建体的组合物包含转基因植物细胞或在植物细胞(例如，瞬时表达重组DNA构建体的植物细胞)中产生；此类植物细胞可以是植物中的细胞或在组织培养物或细胞悬浮液中生长的细胞。

XIII.转基因植物细胞

若干实施例涉及表达多核苷酸的转基因植物细胞，所述多核苷酸可用于本文所描述的方法和组合物中以用于抑制禾谷镰刀菌或镰刀菌属的其它种中的靶基因的表达，或用于减少或消除禾谷镰刀菌或镰刀菌属中的其它种的DON产生。一方面，本发明提供了一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA包含18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体的片段具有约95％至约100％同一性的序列。一方面，本发明提供了一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA或其DNA补体，所述RNA包含与禾谷镰刀菌的靶基因序列的片段基本上相同或基本上互补的至少一个沉默元件，其中所述靶基因序列选自靶基因序列组。一方面，本发明提供了一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA抑制接触或内部吸收所述RNA的禾谷镰刀菌中的靶基因的表达，其中RNA包含至少一个沉默元件，所述至少一个沉默元件具有与靶基因的片段互补的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段，并且其中靶基因选自由靶基因序列组中的基因组成的组。具体实施例是一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA抑制接触或内部吸收所述RNA的禾谷镰刀菌中的靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，所述至少一个沉默元件具有与一个或多个靶基因序列组的片段互补的18个或更多个连续核苷酸的至少一个区段。一方面，本发明提供了一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA，所述RNA具有选自触发物序列组的序列。当与缺乏此类植物细胞的对照植物相比时，此类转基因植物细胞可用于提供对禾谷镰刀菌的DON产生具有改进的抗性的转基因植物。转基因植物细胞可以是分离的转基因植物细胞，或在培养物中生长的转基因植物细胞，或受到禾谷镰刀菌感染的任何转基因植物的转基因细胞。

在一实施例中，重组DNA被稳定地整合到转基因植物的基因组中，由此其可以在转基因植物的一个或多个细胞中被表达。在标题为“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”的章节中提供了提供稳定转化的植物的方法。

若干实施例涉及一种转基因植物细胞，所述转基因植物细胞在其基因组中具有编码RNA的重组DNA或其补体，所述RNA抑制接触或内部吸收RNA的禾谷镰刀菌中的靶基因的表达，其中RNA包含与靶基因互补的至少一个沉默元件，并且其中靶基因序列选自靶基因序列组。在一些实施例中，沉默元件包含至少一个18个或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与具有选自由靶基因序列组组成的组的序列的DNA的等效长度的片段具有约95％至约100％互补性的序列。在一些实施例中，沉默元件包含至少一个18或更多个连续核苷酸，所述连续核苷酸能够在体内或在生理条件下(例如，如通常在禾谷镰刀菌的细胞中发现的生理条件下)与具有选自靶基因序列组组成的组的序列的DNA的等效长度的片段杂交。连续核苷酸的数量为至少18个，例如，介于18-24个之间，或介于18-28个之间，或介于20-30个之间，或介于20-50个之间，或介于20-100个之间，或介于50-100个之间，或介于50-500个之间，或介于100-250个之间，或介于100-500个之间，或介于200-1000个之间，或介于500-2000个之间，或者甚至更多个。在一些实施例中，连续核苷酸的数量多于18个，例如19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个，例如约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个或超过500个连续核苷酸。在特定实施例中，沉默元件包含至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或其DNA补体或靶基因的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在特定实施例中，RNA是双链核酸(例如，dsRNA)，其中一条链包含至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸的至少一个区段，所述连续核苷酸具有与具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段具有100％同一性的序列；以碱基对表示，此类双链核酸包含至少18个、19个、20个或21个连续的完全匹配的碱基对的至少一个区段，所述碱基对对应于具有选自靶基因序列组的序列的DNA或靶基因或其DNA补体的等效长度的片段。在特定实施例中，RNA中含有的每个沉默元件的长度大于天然存在的调节性小RNA的典型长度。在一些实施例中，每个区段的长度为至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在特定实施例中，RNA的长度介于约50个与约500个核苷酸之间。在特定实施例中，RNA具有选自RNA触发物序列组的序列。

在一些实施例中，转基因植物细胞进一步能够表达另外的异源DNA序列。在特定实施例中，转基因植物细胞在其基因组中稳定整合了(i)编码至少一个具有选自RNA触发物序列组的序列的RNA的重组DNA和(ii)编码至少一种杀真菌剂的DNA。

在相关的方面，本发明涉及一种转基因植物，所述转基因植物包括转基因植物细胞、由所述转基因植物和转基因子代、植物种子或转基因植物的转基因可繁殖部分产生的商品产品。还设想了由转基因植物产生的商品产品，以及由此类转基因植物的转基因子代种子产生的商品产品。

XIV.产生针对RNAi的多核苷酸的方法

所要求保护的方法和组合物的多核苷酸可以通过本领域已知的任何合适的方法产生。用于产生本公开的RNA分子的方法的实例包括但不限于体外转录(IVT)(如使用T7聚合酶或其它聚合酶的转录)、化学合成、在生物体(例如，植物或微生物)中表达、或在细胞培养物(例如，植物细胞培养物)中表达、以及微生物发酵。在一些实施例中，本文所描述的RNA是通过美国专利第10,858,385号或美国专利第10,954,541号中所描述的用于无细胞产生RNA的方法中的任一种方法制备的，所述两个美国专利均通过引用并入本文。

XV.启动子

用于本发明中的启动子在其中构建体旨在被转录的细胞中起作用。通常，这些启动子是异源启动子，如在重组构建体中使用的，即在自然界中没有发现它们与在本文所描述的构建体中使用的其它核酸元件可操作地连接。在各个实施例中，启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。在许多实施例中，启动子是在植物中起作用的启动子，例如pol II启动子、polIII启动子、pol IV启动子或pol V启动子。

适于与本发明的重组DNA构建体一起使用的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包括细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子(例如，分别用于在质体、根、花粉或种子中表达的质体特异性启动子、根特异性启动子、花粉特异性启动子或种子特异性启动子)。在许多情况下，种子特异性启动子、胚胎特异性启动子、糊粉特异性启动子或胚乳特异性启动子是特别有用的。时间特异性启动子可以包括旨在在植物的生长周期中的某些发育阶段期间，或在白天或夜晚的不同时间期间，或在一年中的不同季节促进表达的启动子。诱导型启动子包括由化学品或由环境条件诱导的启动子，所述环境条件如但不限于生物或非生物胁迫(例如，缺水或干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光水平或害虫或病原体感染)。微小RNA启动子是有用的，尤其是那些具有时间特异性、空间特异性或诱导型表达模式的启动子；在美国专利申请公开2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329提供了miRNA启动子的实例，以及用于鉴定具有特异性表达模式的miRNA启动子的方法，所述美国专利申请公开特别地通过引用并入本文。表达特异性启动子还可以包括通常组成型表达但表达的程度或“强度”不同的启动子，包括通常被认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。

所特别关注的启动子包括以下实例：从农杆菌属(Agrobacterium)的T-DNA分离的蛋白胭脂碱合酶启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；增强的启动子元件或嵌合启动子元件，如与增强子元件(来自玉米(Zea mays)的热休克蛋白70的内含子)连接的增强的CaMV 35S启动子；根特异性启动子，如公开于美国专利第5,837,848号、第6,437,217号和第6,426,446号中的根特异性启动子；玉米L3油质蛋白启动子，其公开于美国专利第6,433,252号中；编码质体定位的醛缩酶的植物核基因的启动子，其公开于美国专利申请公开2004/0216189中；冷诱导型启动子，其公开于美国专利第6,084,089号中；盐诱导型启动子，其公开于美国专利第6,140,078号中；光诱导型启动子，其公开于美国专利第6,294,714中；病原体诱导型启动子，其公开于美国专利第6,252,138中；和缺水诱导型启动子，其公开于美国专利申请公开2004/0123347A1中。公开了启动子和其用途，尤其是在植物中起作用的重组DNA构建体中的用途的所有上述专利和专利公开通过引用并入本文。

所关注的植物维管或韧皮部特异性启动子包括例如发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA启动子、根癌农杆菌(A.tumefaciens)T-DNA基因5的启动子、水稻蔗糖合酶RSs1基因启动子、鸭跖草属(Commelina)黄色斑驳杆状DNA病毒启动子、椰子叶腐烂病毒启动子、水稻东格鲁杆状病毒启动子(rice tungro bacilliform viruspromoter)、豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因的启动子、马铃薯转化酶基因的invCD111和invCD141启动子、从拟南芥(Arabidopsis)分离的启动子(根据Kertbundit等人,(1991)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》,88:5212-5216，其示出在烟草中具有韧皮部特异性表达)、VAHOX1启动子区、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子、硫酸盐转运蛋白基因Sultr1的启动子；植物蔗糖合酶基因的启动子和植物蔗糖转运蛋白基因的启动子。

适于与本发明的重组DNA构建体或多核苷酸一起使用的启动子可以包括聚合酶II(“pol II”)启动子和聚合酶III(“pol III”)启动子。RNA聚合酶II转录长度通常短于400个核苷酸的结构或催化RNA，并将T残基的简单运行识别为终止信号；所述RNA聚合酶II已经被用来转录siRNA双链体(参见，例如，Lu等人,(2004)《核酸研究》,32:e171)。因此，在某些实施例中，Pol II启动子是其中从本发明的重组DNA构建体产生短RNA转录物的启动子。在一个实施例中，重组DNA构建体包含pol II启动子以表达侧接有自切割核酶序列(例如，自切割锤头状核酶)的RNA转录物，导致经处理的RNA(如与禾谷镰刀菌靶基因的转录物结合的单链RNA)具有确定的5'端和3'端，没有潜在干扰侧接序列。替代性方法使用pol III启动子来产生具有相对确定的5'端和3'端的转录物，即转录具有最小5'和3'侧接序列的RNA。在一些实施例中，Pol III启动子(例如，U6或H1启动子)用于添加短的富含AT的转录终止位点，所述转录终止位点在经转录的RNA中产生2个碱基对突出端(UU)；这对于例如siRNA型构建体的表达是有用的。已经报道了使用pol III启动子来驱动siRNA构建体的表达；参见van deWetering等人,(2003)《欧洲分子生物学组织报告(EMBO Rep.),4:609-615，和Tuschl(2002)《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》,20:446-448。杆状病毒启动子如杆状病毒多角体蛋白和p10启动子是本领域已知的并且是可商购获得的；参见例如Invitrogen的“杆状病毒表达载体系统(BEVS)和昆虫细胞培养技术指南(Guide to BaculovirusExpression Vector Systems(BEVS)and Insect Cell Culture Techniques)”,2002(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,Calif.))和F.J.Haines等人,“杆状病毒表达载体(Baculovirus Expression Vectors)”，未注明日期(英国牛津的牛津表达技术公司(Oxford Expression Technologies,Oxford,UK))。

启动子元件可以包括不是天然存在的启动子或启动子元件或其同源物但可以调节基因的表达的核酸序列。此类“基因非依赖性的”调控序列的实例包括天然存在或人工设计的RNA序列(其包括配体结合区或适体(参见下文“适体”)和调控区(其可以是顺式作用的))。参见例如Isaacs等人,(2004),《自然生物技术》,22:841-847，Bayer和Smolke(2005),《自然生物技术》,23:337-343，Mandal和Breaker(2004),《自然综述：分子细胞生物学(Nature Rev.Mol.Cell Biol.)》,5:451-463，Davidson和Ellington(2005),《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》,23:109-112，Winkler等人Winkler,(2002)《自然(Nature)》,419:952-956，Sudarsan等人,(2003)《RNA》,9:644-647，以及Mandal和Breaker(2004)《自然结构与分子生物学(Nature Struct.Mol.Biol.),11:29-35。可以针对特定的空间或时间特异性来选择或设计此类“核糖调节剂”，例如，以仅在存在(或不存在)给定浓度的适当配体的情况下调控编码用于抑制禾谷镰刀菌靶基因的沉默元件的DNA的翻译。一个实例是一种核糖调节剂，其当在胁迫(例如，非生物胁迫如水、温度或营养物胁迫，或生物胁迫如由害虫或病原体附着)下时对由植物产生的内源性配体(例如，茉莉酸或水杨酸)做出应答；在胁迫下，内源性配体的水平增加到足以使核糖调节剂开始编码用于抑制禾谷镰刀菌靶基因的沉默元件的DNA的转录的水平。

XVI.重组酶位点

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含编码一个或多个位点特异性重组酶识别位点的DNA。在一个实施例中，重组DNA构建体包含至少一对loxP位点，其中loxP位点之间的DNA的位点特异性重组由Cre重组酶介导。选择loxP位点的位置和相对取向以实现期望的重组；例如，当loxP序列处于相同方向时，loxP位点之间的DNA以环状形式被切除。在另一实施例中，重组DNA构建体包含编码一个loxP位点的DNA；在存在Cre重组酶和另个具有loxP位点的DNA的情况下，两个DNA被重组。

XVII.转基因转录单元

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含转基因转录单元。转基因转录单元包含编码所关注的基因的DNA序列，例如天然蛋白质或异源蛋白质。所关注的基因可以是来自任何种(包括但不限于非真核生物，如细菌和病毒真菌、原生生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物)的任何编码序列或非编码序列。转基因转录单元可以进一步包括转基因的转录所需的5'或3'序列或两者。

XVIII.内含子

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含编码可剪接内含子的DNA。“内含子”通常意指位于外显子(DNA的蛋白质编码区段或对应转录的RNA)之间的DNA(或由此类区段转录的RNA)的区段，其中在信使RNA的成熟期间，所存在的内含子被酶促“剪接”出来或通过在真核生物的细胞核中发生的切割/连接过程从RNA链中去除。术语“内含子”也应用于非编码DNA序列，所述非编码DNA序列被转录成RNA区段，所述RNA区段可以从成熟的RNA转录物中剪接出来，但不是存在于蛋白质编码外显子之间的内含子。这些中的一个实例是具有增强下游编码序列在植物中(在一些情况下，尤其是在单子叶植物中)表达的能力的可剪接序列；这些可剪接序列天然定位于一些植物基因的5'非翻译区以及一些病毒基因中(例如，由Gallie和Walbot(1992),《核酸研究》,20:4631-4638描述为增强植物基因中的表达的烟草花叶病毒5'前导序列或“omega”前导序列)。这些可剪接序列或“增强表达的内含子”可以人工插入在植物基因的5'非翻译区，插入在启动子之间，但插入在任何蛋白质编码外显子之前。此类增强表达的内含子的实例包括但不限于玉米醇脱氢酶(Zm-Adh1)、增强玉米Bronze-1的表达内含子、水稻肌动蛋白1(Os-Act1)内含子、Shrunken-1(Sh-1)内含子、玉米蔗糖合酶内含子、热休克蛋白18(hsp18)内含子和82千道尔顿热休克蛋白(hsp82)内含子。美国专利第5,593,874号和第5,859,347号(特别地通过引用并入本文)描述了通过将源自70千道尔顿玉米热休克蛋白(hsp70)的增强表达的内含子包括在定位于从基因启动子开始的3'和从第一蛋白编码外显子开始的5'的非翻译前导中来改进用于植物的重组DNA构建体的方法。

XIX.核酶

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含编码一种或多种核酶的DNA。所特别关注的核酶包括自切割核酶、锤头状核酶或发夹状核酶。在一个实施例中，重组DNA构建体包含编码一种或多种核酶的DNA，所述核酶用于切割经转录的RNA以提供RNA的确定区段，如用于抑制禾谷镰刀菌靶基因的沉默元件。

XX.基因抑制元件

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含编码另外的基因抑制元件的DNA，所述另外的基因抑制元件用于抑制DON途径中除禾谷镰刀菌靶基因以外的靶基因，如禾谷镰刀菌的另一个基本代谢功能所必需的靶基因或镰刀菌属的另一种真菌的靶基因。要被抑制的靶基因可以包括编码序列或非编码序列或两者。

合适的基因抑制元件在美国专利申请公开2006/0200878(中进行了详细地描述，所述美国专利申请公开的公开内容特别地通过引用并入本文，并且包括以下中的一者或多者：

o(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，所述至少一个反义DNA区段与要被抑制的基因的至少一个区段是反义的；

o(b)包含至少一个反义DNA区段的多个拷贝的DNA，所述至少一个反义DNA区段与要被抑制的基因的至少一个区段是反义的；

o(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，所述至少一个有义DNA区段是要被抑制的基因的至少一个区段；

o(d)包含至少一个有义DNA区段的多个拷贝的DNA，所述至少一个有义DNA区段是要被抑制的基因的至少一个区段；

o(e)DNA，所述DNA通过形成双链RNA而转录成RNA以抑制要被抑制的基因，并且包含与要被抑制的基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段以及作为要被抑制的基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段；

o(f)DNA，所述DNA通过形成单个双链RNA而转录成RNA以抑制要被抑制的基因，并且包含与要被抑制的基因的至少一个区段反义的多个串联的反义DNA区段以及作为与要被抑制的基因的至少一个区段的多个串联的有义DNA区段；

o(g)DNA，所述DNA通过形成RNA的多个双链而转录成RNA以抑制要被抑制的基因，并且包含与要被抑制的基因的至少一个区段反义的多个反义DNA区段以及作为要被抑制的基因的至少一个区段的多个有义DNA区段，并且其中所述多个反义DNA区段和所述多个有义DNA区段被排列成一系列反向重复序列；

o(h)包含源自植物miRNA的核苷酸的DNA；

o(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；

o(j)转录成能够与配体结合的RNA适体的DNA；以及

o(k)转录成能够与配体结合的RNA适体的DNA，以及转录成能够调控要被抑制的基因的表达的调控RNA的DNA，其中所述调控依赖于调控RNA的构象，并且所述调控RNA的构象受到RNA适体的结合状态的变构影响。

在一些实施例中，在没有任何蛋白质编码外显子(编码序列)的情况下，内含被用于递送基因抑制元件。在一个实例中，通过在内含子内嵌入基因抑制元件来中断内含子，如增强表达的内含子，其中在转录时，从内含子中切除基因抑制元件。因此，不需要蛋白质编码外显子来提供本文所公开的重组DNA构建体的基因抑制功能。

XXI.转录调控元件

在一些实施例中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包含编码转录调控元件的DNA。转录调控元件包括调控本发明的重组DNA构建体的表达水平的元件(相对于其在没有此类调控元件的情况下的表达)。合适的转录调控元件的实例包括核糖开关(顺式或反式作用)、转录稳定序列、转录起始位点、转录延伸序列、转录终止元件和miRNA识别位点，如美国专利申请公开2006/0200878中详细描述的，所述美国专利申请公开特别地通过引用并入本文。

XXII.制备和使用转基因植物细胞和转基因植物

植物的转化可以包括若干种熟知的方法和组合物中的任一种。用于植物转化的合适的方法实际上包括可以将DNA引入到细胞中的任何方法。一种植物转化方法是微粒轰击，例如，如在以下所展示的：美国专利第5,015,580号(大豆)、美国专利第5,538,880号(玉米)、美国专利第5,550,318号(玉米)、美国专利第5,914,451号(大豆)、美国专利第6,153,812号(小麦)、美国专利第6,160,208号(玉米)、美国专利第6,288,312号(水稻)、美国专利第6,365,807号(水稻)、和美国专利第6,399,861号(玉米)和美国专利第6,403,865号(玉米)，所有所述美国专利通过引用并入，以用于能够实现转基因植物的产生。

另一种有用的植物转化方法是农杆菌属介导的，通过含有二元Ti质粒系统的农杆菌属进行，其中所述农杆菌属携带第一Ti质粒(经常是去武装的)和第二嵌合质粒，所述第二嵌合质粒含有野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界、在经转化的植物细胞中起作用并与本发明的多核苷酸或重组DNA构建体可操作地连接的启动子。参见例如在美国专利第5,159,135号(其通过引用并入)中描述的二元系统。还参见De Framond(1983)《生物技术(Biotechnology)》1:262-269；和Hoekema等人,(1983)《自然》303:179。在此类二元系统中，含有一个或多个T-DNA边界的较小质粒可以方便地在合适的替代性宿主如大肠杆菌中构建和操纵，并且然后转移到农杆菌中。

农杆菌属介导的植物(尤其是作物植物)的转化的详细程序包括以下中所公开的程序：美国专利第5,004,863号、第5,159,135号和第5,518,908号(棉花)；美国专利第5,416,011号、第5,569,834号、第5,824,877号和第6,384,301号(大豆)；美国专利第5,591,616号和第5,981,840号(玉米)；第5,463,174号(芸苔(brassicas)，包括油菜)、第7,026,528号(小麦)和第6,329,571号(水稻)，以及美国专利申请公开2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)，所有所述专利都通过引用特此并入，以用于能够实现转基因植物的产生。美国专利申请公开2011/0296555在实例5中公开了用于转化玉米、大豆、油菜、棉花和甘蔗的转化载体(包括载体序列)和详细方案，并且特别地通过引用并入，以用于能够实现转基因植物的产生。类似的方法已经被报道用于许多植物种(双子叶植物和单子叶植物两者)，其中包括花生(Cheng等人,(1996)《植物细胞报告(Plant Cell Rep.)》,15:653)；芦笋(Bytebier等人,(1987)《美国国家科学院院刊》,84:5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)《植物生理学(Plant Physiol.)》,104:37；水稻(Toriyama等人,(1988)《生物/技术(Bio/Technology)》,6:10；Zhang等人,(1988)《植物细胞报告》,7:379)；小麦(Vasil等人,(1992)《生物/技术》,10:667；Becker等人,(1994)《植物杂志(Plant J.)》,5:299)，苜蓿(Masoud等人,(1996)《转基因研究(Transgen.Res.)》,5:313)；和番茄(Sun等人,(2006)《植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.),47:426-431)。还参见美国专利申请公开2003/0167537A1中对载体、转化方法和经转化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的产生的描述，其中转录因子由CaMV35S启动子组成型表达，所述美国专利申请公开通过引用并入。对植物特别有用的转化方法是本领域众所周知的。参见例如公开描述的用于以下的转化方法：番茄(Sharma等人,(2009),《生物科学杂志(J.Biosci.)》,34:423-433)，茄子(Arpaia等人,(1997)《理论和应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)》,95:329-334)，马铃薯(Bannerjee等人,(2006),《植物科学(Plant Sci.)》,170:732-738；Chakravarty等人,(2007)《美国马铃薯研究杂志(Amer.J.Potato Res.)》,84:301-311；S.Millam“农杆菌属介导的马铃薯的转化(Agrobacterium-mediated transformation of potato)”,第19章(第257-270页)，“世界转基因作物：基本协议(Transgenic Crops of the World:Essential Protocols)”,IanS.Curtis(编辑),Springer,2004))和胡椒(Li等人,(2003)《植物细胞生理学》,21:785-788)。稳定的转基因马铃薯、番茄和茄子已经在商业上被引入到各个地区；参见例如K.Redenbaugh等人,“经基因工程改造的水果和蔬菜的安全性评估：FLAVR SAVR番茄的病例研究(Safety Assessment of Genetically Engineered Fruits and Vegetables:A CaseStudy of the FLAVR SAVR Tomato)”,CRC出版社(CRC Press),博卡拉顿(Boca Raton),1992，以及GM作物数据库中大量可公开获得的商业性经基因修饰的作物的文献；参见：CERA.(2012),GM作物数据库.环境风险评估中心(CERA),ILSI研究基金会,华盛顿特区，可在cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database电子获得。其它植物种的各种转化方法在本领域中是熟知的，参见例如由Chittaranjan Kole和Timothy C.Hall编辑的百科参考,“《转基因作物植物简编(Compendium of Transgenic Crop Plants)》”,布莱克威尔出版有限公司(Blackwell Publishing Ltd.),2008；ISBN 978-1-405-16924-0(可在mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc电子获得)，其描述了以下的转化程序：谷物和牧草(水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠粟、指形粟、冷季型牧草和大麦草)、油籽作物(大豆、油籽芸苔、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆类谷物和草料(普通豆、豇豆、豌豆、蚕豆、扁豆、花菜豆、亚洲豆、木豆、野豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、苜蓿和三叶草)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李子、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏仁和波斯胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柑橘、柚子、香蕉和大蕉、菠萝、木瓜、芒果、鳄梨、猕猴桃、西番莲和柿子)、蔬菜作物(番茄、茄子、辣椒、甘蓝、萝卜、胡萝卜、葫芦、蒜、芦笋和叶菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜叶菊、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草坪草(烟草、咖啡、可可、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草坪草)以及森林树种。

提供含有稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选地在培养基上的组织培养中和在受控环境中实施。“培养基”是指用于在体外，即在完整的活生物体之外使细胞生长的多种营养混合物。受体细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚胎或胚胎的各部分，以及配子细胞，如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可以从中再生可育植物的任何细胞被设想为用于实施本发明的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种组织来源启动，包括但不限于未成熟胚胎或胚胎的各部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。那些能够作为愈伤组织增殖的细胞可以作为用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，以及随后可育转基因植物的再生)公开于例如美国专利第6,194,636号和第6,232,526号以及美国专利申请公开2004/0216189中，所述文献特此通过引用并入。

在一般的转化实践中，在任何一个转化实验中，DNA仅被引入到一小部分靶细胞中。标志物基因通常用于提供一种高效的系统，以用于鉴定那些通过接收并将转基因DNA构建体整合到所述细胞的基因组中而被稳定转化的细胞。优选的标志物基因提供选择性标志物，选择性标志物赋予对选择性药剂如抗生素或除草剂的抗性。植物细胞对其有抗性的任何抗生素或除草剂都可能是可用于选择的药剂。将潜在转化的细胞暴露于对应于标志物的选择性药剂。在存活细胞的群体中，通常是那些整合了赋予抗性的基因(选择性标志物)并以足以允许细胞在存在选择性药剂的情况下存活的水平被表达的细胞。可以进一步测试细胞以确认重组DNA的稳定整合。常用的选择性标志物基因包括那些赋予对抗生素，如卡那霉素(kanamycin)或巴龙霉素(paromomycin)(nptll)、潮霉素B(hygromycin B)(aph IV)和庆大霉素(gentamycin)(aac3和aacC4)具有抗性或对除草剂，如草铵膦(glufosinate)(bar或pat)和草甘膦(glyphosate)(EPSPS)具有抗性的基因。有用的选择性标志物基因和选择药剂的实例阐述于美国专利第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号和第6,118,047号，所有美国专利特别地通过引用并入。也可以采用可筛选的标志物或报告基因，如提供视觉鉴定转化体的能力的标志物。有用的可筛选的标志物的实例包括例如表达通过作用于生色底物(例如，β葡糖苷酸酶(GUS)(uidA)或荧光素酶(luc)而产生可检测颜色的蛋白质的基因，或其本身可检测的基因，如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本领域的技术人员将认识到许多其它有用的标志物或报告基因可供使用。

检测或测量转基因植物细胞中的重组DNA构建体的转录可以通过任何合适的方法实现，包括蛋白质检测方法(例如，蛋白质印迹、ELISA和其它免疫化学方法)、酶促活性的测量或核酸检测方法(例如，Southern印迹、northern印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。

用于检测或测量本发明的靶向禾谷镰刀菌靶基因的重组多核苷酸在植物细胞中的转录的其它合适方法包括相对于在不存在重组多核苷酸的情况下观察到的表达水平测量作为禾谷镰刀菌中的靶基因的表达水平的直接或代替性指示的任何其它性状(例如禾谷镰刀菌的生长速率、死亡率或生殖或募集速率)或测量被禾谷镰刀菌感染的植物或植物田地中的损伤(例如，根损伤)或产量损失。一般而言，用于检测或测量所关注的重组多核苷酸在植物细胞中的转录的合适的方法包括，例如大体或显微形态性状、生长速率、产量、生殖或募集速率、对害虫或病原体的抗性或对生物或非生物胁迫(例如，缺水胁迫、盐胁迫、营养胁迫、热或冷胁迫)的抗性。此类方法可以使用表型性状的直接测量或代替性测定(例如，在植物中，这些测定包括植物部分测定，如叶或根测定，以确定对非生物胁迫的耐受性)。此类方法包括对禾谷镰刀菌的抗性的直接测量(例如，对植物组织的损害)或代替性测定(例如，植物产量测定或生物测定)。

本发明的重组DNA构建体可以与其它重组DNA堆叠，用于例如通过表达或抑制其它基因来赋予另外的性状(例如，在经转化的植物的情况下，性状包括除草剂抗性、害虫抗性、冷发芽耐受性、缺水耐受性等)。在美国专利申请公开2004/0126845A1中公开了用于基因表达的协同减少和增加的构建体，所述美国专利申请公开特别地通过引用并入。

可以采集可育转基因植物的种子并用于生长本发明的转基因植物的子代，包括杂交后代，所述转基因植物在其基因组中包括重组DNA构建体。因此，除了用本发明的重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物可以通过将具有重组DNA的第一植物与缺乏所述构建体的第二植物杂交来制备。例如，可以将重组DNA引入到适于转化的植物系中以产生转基因植物，所述转基因植物可以与第二植物系杂交以将重组DNA渗入到所得的子代中。本发明的转基因植物可以与具有赋予一个或多个另外的性状(如但不限于除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境胁迫抗性、提高的营养物含量和产量提高)的其它重组DNA的植物系杂交，以产生具有赋予期望的靶序列表达行为和另外的性状两者的重组DNA的子代植物。

在此类用于组合性状的育种中，提供另外的性状的转基因植物可以是雄系(传粉者)，并且携带基础性状的转基因植物可以是雌系。这种杂交的子代分离，使得一些植物将携带两种亲本性状的DNA，并且一些将携带一种亲本性状的DNA；此类植物可以通过与亲本重组DNA相关的标志物来鉴定携带两种亲本性状的DNA的子代植物可以多次杂交回母本系，例如，通常6至8代，以产生与一个原始转基因亲本系以及另一个转基因亲本系的重组DNA具有基本上相同的基因型的纯合子代植物。

本发明的又另一方面是由本发明的转基因种子生长的转基因植物。本发明设想了直接从含有重组DNA的转基因种子生长的转基因植物，以及通过将直接从转基因种子生长的转基因植物与不是从同一转基因种子生长的第二植物杂交而产生的植物的子代，包括近交植物系或杂种植物系。杂交可以包括例如以下步骤：

o(a)第一亲本植物(例如，非转基因或转基因)和根据本发明转基因的第二亲本植物的植物种子或茎插条；

o(b)使第一亲本植物和第二亲本植物的种子或茎插条生长成开花的植物；

o(c)用来自第二亲本的花粉给来自第一亲本的花授粉；以及

o(d)采集携带有已受精的花的亲本植物上产生的种子。

通常期望将重组DNA渗入到优良品种中，例如通过回交，以将具体的期望的性状从一个来源转移到缺乏所述性状的近交植物或其它植物中。这可以例如通过首先将优良近交系(“A”)(轮回亲本)与供体近交系(“B”)(非轮回亲本)杂交来完成，所述供体近交系携带所讨论的性状的适当基因，例如根据本发明制备的构建体。首先在所得的子代中选择此杂交的子代，以使期望的性状从非轮回亲本“B”转移，并且然后将所选的子代交配回到优良的轮回亲本“A”。在对期望的性状进行选择的五个或更多回交世代之后，对于控制所转移的特性的基因座，子代基本上可以是半合子，但对于大多数或几乎所有其它基因，子代类似于优良亲本。最后的回交世代将进行自交，以产生对于被转移的基因(例如，一个或多个转化事件)而言是纯育种的子代。

通过一系列的育种操作，可以将选定的DNA构建体从一个系移到完全不同的系中，而不需要进一步的重组操纵。因此，可以产生对一种或多种DNA构建体来说是真正育种的近交系植物。通过杂交不同的近交系植物，可以产生大量具有不同DNA构建体的组合的不同杂种。以这种方式，可以产生具有通常与杂种相关的期望的农艺特性(“杂种优势”)以及由一种或多种DNA构建体赋予的期望的特性的植物。

在本发明的某些转基因植物细胞和转基因植物中，有时期望同时表达所关注的基因，同时还调节禾谷镰刀菌靶基因的表达。因此，在一些实施例中，转基因植物含有重组DNA，所述重组DNA进一步包含用于表达至少一种所关注的基因的基因表达元件，并且本发明的重组DNA构建体的转录受到基因表达元件的同时转录的影响。

本发明还提供了由本发明的转基因植物细胞、植物或种子产生的商品产品，包括但不限于所采集的叶、叶球、穗、根、芽、茎、果实、种子或植物的其它部分、油、提取物、发酵或消化产物，或任何食物或非食物产品，包括由本发明的转基因植物细胞、植物或种子产生的此类商品产品。在本文设想的一种或多种商品或商品产品中检测本发明的重组DNA构建体的一个或多个核酸序列是商品或商品产品含有或源自本发明的转基因植物细胞、植物或种子的事实证据。

通常，携带本发明的重组DNA构建体或其部分的转基因植物的基因组对通过感染禾谷镰刀菌造成的DON产生表现出增加的抗性。在各个实施例中，例如，在转基因植物表达本发明的重组DNA构建体(所述重组DNA构建体与其它重组DNA堆叠以赋予另外的性状)的情况下，相对于缺乏重组DNA构建体的植物，转基因植物具有至少一种另外的改变的性状，所述另外的改变的性状选自由以下组成的组：

o(a)改进的非生物胁迫耐受性；

o(b)改进的生物胁迫耐受性；

o(c)经改良的初级代谢物组成；

o(d)经改良的次级代谢物组成；

o(e)经改良的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

o(f)提高的产量；

o(g)改进的使用氮、磷或其它营养物的能力；

o(h)经改性的农艺特性；

o(i)经改性的生长或生殖特性；以及

o(j)改进的收获、储存或加工质量。

在一些实施例中，转基因植物的特征在于：对非生物胁迫的改进的耐受性(例如，对缺水或干旱、热、冷、非最佳营养物或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或对生物胁迫(例如，拥挤、植化相克或伤害)的改进的耐受性；经改良的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；经改良的次级代谢物(例如，生物碱、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽和混合的生物合成来源的次级代谢物)组成；经改良的微量元素(例如，铁、锌)、类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如，生育酚)组成；提高的产量(例如，在非胁迫条件下提高的产量或在生物或非生物胁迫下提高的产量)；改进的使用氮、磷或其它营养物的能力；经改性的农艺特性(例如，延迟成熟；延迟衰老；较早或较晚成熟；改进的耐荫性；改进的对根或茎秆倒伏的抗性；改进的对茎的“绿梢”的抗性；经改良的光周期应答)；经改性的生长或生殖特性(例如，故意矮化；故意雄性不育，可用于例如改进的杂交程序)；改进的营养生长率；改进的发芽情况；改进的雄性或雌性生育能力)；改进的采集、储存或加工质量(例如，改进的储存期间对害虫的抗性，改进的对破损的抗性，改进的对消费者的吸引力)；或这些性状的任何组合。

在另一实施例中，转基因种子或由转基因植物产生的种子具有经改良的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成、经改良的次级代谢物组成、经改良的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成、改进的采集、储存或加工质量或这些的组合。在另一实施例中，可能期望改变转基因植物或转基因植物的种子的天然组分的水平，例如，降低过敏蛋白或糖蛋白或毒性代谢物的水平。

通常，对各自从转基因植物细胞再生的转基因植物的群体进行筛选以鉴定发育成具有期望的性状的转基因植物的转基因植物细胞。测定转基因植物以检测增强的性状，例如增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白和增强的种子油。筛选方法包括在温室或田间试验中直接筛选性状，或筛选替代性状。此类分析涉及检测植物的化学组成、生物量、生理性质或形态的变化。通过分析种子组成以及蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉、生育酚或其它营养物的含量，可以检测到化学组成的变化。通过测量植物高度、茎直径、节间长度、根和枝叶干重来检测生长或生物量特性的变化。通过评估对胁迫条件的应答，例如在强加的胁迫条件(如缺水、氮或磷缺乏、冷或热生长条件、病原体或昆虫攻击、光缺乏或植物密度增加)下的测定来鉴定生理特性的变化。其它选择特性包括开花天数、花粉脱落天数、果实成熟天数、果实质量或产量、叶伸展率、叶绿素含量、叶温度、林分、幼苗活力、节间长度、植物高度、叶数量、叶面积、分蘖、支撑根、保持绿色、茎秆倒伏、根倒伏、植物健康、生育能力、绿梢和害虫抗性。另外，可以评估所采集的果实或种子的表型特性；例如在植物中，这可以包括所采集的果实的总数或重量，或此类果实的颜色、酸度、含糖量或口感。

以下实例是出于说明的目的而呈现的并且不应被解释为限制。

实例

概要

本发明实例旨在突出显示开发dsRNA的外源性施加以控制植物上的禾谷镰刀菌的DON产生。

简介

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的天然存在的细胞防御系统。响应于dsRNA的RNAi机制的第一组分是RNA酶III核酸内切酶Dicer-2，所述RNA酶III核酸内切酶Dicer-2将dsRNA切割成短的(通常19-21个核苷酸长)干扰RNA(siRNA)。Dicer-2在dsRNA结合蛋白的帮助下促进siRNA转移到RNA诱导的沉默复合物中。RNAi促进基因沉默，从而影响宿主遗传物质的翻译。因为RNAi是一种抑制所靶向的基因的表达的序列特异性方法，并且因为每个种由其基因序列的独特性来定义，所以RNAi可以以种特异性的方式来设计。通过靶向病原体的DON产生所必需的基因，RNAi可以选择性地用于控制禾谷镰刀菌和禾谷镰刀菌中的DON产生，而不会对非靶向的有益种产生不利影响。表1和表2示出了内部参考号、相关起始序列登录号以及靶基因序列、触发物序列和触发物RNA反向补体的列表。

表1

表2

实例1

DON减少：

用禾谷镰刀菌孢子接种具有DON培养基(富含营养的M9培养基加DON诱导剂胍丁胺(Agmatine))的体外96孔板，并且然后用dsRNA进行处理。在将板温育5天后，收集来自每个孔的液体培养物，并使用液相色谱法-质谱法(LC-MS)进行分析，以对总脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON和ADON)霉菌毒素进行定量。通过将每项处理中的总DON与未经处理的对照(UTC)进行比较来计算平均DON减少百分比。误差条指示三次独立运行之间的一个标准偏差。结果示出于图1和图4中，示出了与未经处理的对照相比，每个测试序列示出了DON的减少。表3和表4示出了另外的结果，指示了多次运行的平均DON减少％和标准偏差。在表3和表4中，评分为++的序列的平均DON减少％大于阴性对照(GS5797)的一个标准偏差，并且标准偏差小于20％。评分为+的序列示出平均DON减少％大于阴性对照。

表3

表4

实例2

离体小麦叶球上的禾谷镰刀菌的平均DON产生：

用禾谷镰刀菌孢子接种离体小麦叶球，并且然后用dsRNA处理。在12天之后，收集小麦叶球并使用液相色谱法-质谱法(LC-MS)进行分析，以对总脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON和ADON)霉菌毒素进行定量。平均DON以小麦叶球的干重的百万分率(ppm)绘制。误差条指示两次独立运行之间的一个标准偏差。结果示出于图2中，示出了与阴性对照相比，每个测试序列的DON产生减少。

实例3

靶基因的相对表达

收集如实例1所描述的测试的来自禾谷镰刀菌样品的菌丝体，并使用Zymo研究公司(Zymo Research)的Quick RNA Miniprep提取RNA。用寡核苷酸dT引物逆转录RNA，并且使用qPCR通过相对于镰刀菌属管家基因的相对定量来估计基因表达。使用ΔΔCt方法计算靶基因的变化倍数，并相对于相应阴性对照处理绘图。使用非参数双边T测试确定统计显著性。误差条指示95％置信区间。结果示出于图3中，表明与阴性对照相比，所测试的序列显著降低了相关靶基因的表达。

Claims

1.一种用于控制禾谷镰刀菌(F.graminearum)中的DON产生的组合物，所述组合物包含：

(a)有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含至少18个、19个、20个、21个、

25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(b)有效量的至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含至少一个沉默元件，所述至少一个沉默元件与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个、19个、

20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约或95％序列同一性，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ IDNO:1-16、65-70和87-151；或者

(c)有效量的至少一个RNA，所述至少一个RNA包含至少一个区段，所述至少一个区段与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(d)RNA分子，所述RNA分子在转染到禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌中的DON产生，其中所述RNA分子包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约100％或100％序列同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(e)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌中的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个或650个连续核苷酸，所述连续核苷酸与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的区段基本上互补，或与其包含至少85％、90％、95％、98％或100％序列同一性，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(f)有效量的至少一个双链RNA，所述至少一个双链RNA包含至少一条链，所述至少一条链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列，或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性的序列：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299；或者

(g)有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列，或与其具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性的序列的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个或600个连续核苷酸：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299；或者

(h)有效量的至少一个RNA，所述至少一个RNA包含至少一个区段，所述至少一个区段与选自由以下组成的组的核苷酸序列的至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299；或者

(i)RNA分子，所述RNA分子在转染到植物上的禾谷镰刀菌或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述RNA分子包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由以下组成的组的核苷酸序列的区段基本上互补，或与其包含至少至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299；或者

(j)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到植物上的禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链包含至少18个、19个、20个、21个、25个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个连续核苷酸，所述连续核苷酸与选自由以下组成的组的核苷酸序列的区段基本上互补，或与其包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299；或者

(k)双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到或接触到植物上的禾谷镰刀菌时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子的至少一条链与选自由以下组成的组的核苷酸序列包含至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％序列同一性：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈至少一种选自由以下组成的组的形式：固体、液体、粉末、悬浮液、乳液、喷雾剂、包封剂、微珠、载剂微粒、薄膜、基质、种子处理剂、土壤浸液和植入式调配物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一种选自由以下组成的组的组分：载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀害虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。

4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸、或所述RNA或所述dsRNA包含双链RNA分子，所述双链RNA分子在转染到禾谷镰刀菌中或与所述禾谷镰刀菌接触时减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生，其中所述双链RNA分子包含至少一个区段，所述至少一个区段与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少21个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少95％序列同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:1-16、65-70和87-151，并且其中所述双链RNA分子的长度为至少300个碱基对或长度介于约350个与约600个碱基对之间。

5.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸、或所述RNA或所述dsRNA包含dsRNA，所述dsRNA包含第一链，所述第一链包含与选自由以下组成的组的序列至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约100％或100％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和226-299。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第一链包含与选自由以下组成的组的序列约至少98％相同的核苷酸序列：SEQ ID No:33-64、79-86、153-225和226-299。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸、或所述RNA或所述dsRNA进一步包含与所述第一链互补的第二链。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中(f)、(g)、(h)、(i)、(j)或(k)的所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中(f)、(g)、(h)、(i)、(j)或(k)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:48。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中(a)-(e)中叙述的所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中(d)或(i)的所述RNA分子或(e)、(j)或(k)的所述dsRNA分子进一步减少或消除镰刀菌属(genus Fusarium)的一种或多种另外的真菌病原体中的DON产生，任选地其中所述一种或多种另外的真菌病原体包含黄色镰刀菌(F.culmorum)。

12.一种dsRNA，其抑制禾谷镰刀菌靶基因的表达，其中所述dsRNA的第一链包含长度为至少300个核苷酸的RNA序列，并且与由选自由以下组成的组的序列编码的RNA 85％至100％互补：SEQ ID NO:16、68-70、108、114、120、139和146。

13.根据权利要求12所述的dsRNA，其中所述dsRNA的第二链与所述第一链互补。

14.根据权利要求12或13所述的dsRNA，其中所述RNA序列包含与选自由以下组成的组的序列至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少95％相同、至少约98％相同、约100％相同或100％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

15.根据权利要求14所述的dsRNA，其中所述RNA序列包含与选自由以下组成的组的核苷酸序列至少约98％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

16.根据权利要求14或15中任一项所述的dsRNA，其中所述核苷酸序列为SEQ ID NO:48。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA进一步抑制镰刀菌属的一个或多个另外的种的靶基因的表达，任选地其中所述镰刀菌属的所述一个或多个另外的种包含黄色镰刀菌。

18.一种dsRNA，其抑制禾谷镰刀菌靶基因的表达，其中所述dsRNA的第一链包含与选自由以下组成的组的序列至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少95％相同、至少约98％相同、约100％相同或100％相同的RNA序列：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

19.根据权利要求18所述的dsRNA，其进一步包含与所述第一链互补的第二链。

20.根据权利要求18和19中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA的所述第一链包含与选自由以下组成的组的序列至少约98％相同的RNA序列：48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

21.根据权利要求20所述的dsRNA，其中所述dsRNA的所述第一链包含与SEQ ID NO:48至少约98％相同的RNA序列。

22.一种组合物，其包含根据权利要求12至21中任一项所述的dsRNA，所述组合物被调配用于以选自由以下组成的组的形式施加：可喷雾溶液、乳液、罐混合物和粉末。

23.根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含一种或多种另外的组分，所述一种或多种另外的组分选自由以下组成的组：载剂、表面活性剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、多核苷酸杀害虫剂、非多核苷酸杀害虫剂、多核苷酸杀真菌剂、非多核苷酸杀真菌剂、多核苷酸杀虫剂、非多核苷酸杀虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。

24.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中(a)-(e)、(g)-(j)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少300个连续核苷酸。

25.一种用于减少或消除镰刀菌属的一种或多种真菌的DON产生的方法，所述方法包含使所述一种或多种真菌与包含多核苷酸的组合物接触，所述多核苷酸引起针对与DON产生相关的一个或多个基因的RNA干扰，从而减少所述真菌的DON产生。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一个或多个基因选自由以下组成的组：FGP1、ELP3、SPT7、MAF1、MVD1、HEP1、SET1、FKPB12。

27.根据权利要求25或26中任一项所述的方法，其中所述接触包含将所述组合物施加到被或可被所述真菌感染的植物的表面。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述施加包含将所述组合物喷雾到所述植物的叶、叶球、茎、穗、花或果实上。

29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述植物选自由玉米和小谷物组成的组。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物是小麦。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述组合物包含根据权利要求1至23所述的组合物中的任一种。

32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述镰刀菌属的所述一种或多种真菌包含禾谷镰刀菌，任选地其中所述镰刀菌属的所述一种或多种真菌进一步包含一种或多种另外的真菌种，任选地其中所述一种或多种另外的真菌种包含黄色镰刀菌。

33.一种用于减少或消除植物上的禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述方法包含将根据权利要求1至21所述的组合物中的任一种局部施加到所述植物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述局部施加包含将所述组合物喷雾到所述植物的叶、叶球、花、茎、穗或果实上。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述局部施加包含将所述组合物喷雾到所述植物的叶、叶球或穗上。

36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：小麦、大麦、燕麦和玉米。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物是谷物。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中诱导RNA干扰，并且减少或消除禾谷镰刀菌的DON产生。

39.一种用于减少或消除植物上的禾谷镰刀菌的DON产生的方法，所述方法包含：

(a)使所述禾谷镰刀菌与至少一个多核苷酸接触，所述至少一个多核苷酸包含与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的核苷酸序列，所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(b)将包含至少一个多核苷酸的组合物局部施加到所述植物，所述至少一个多核苷酸包含与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的核苷酸序列，所述靶基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(c)在所述植物中表达至少一个多核苷酸，所述至少一个多核苷酸包含至少一个区段，所述至少一个区段与DNA的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性，所述DNA具有选自由以下组成的组的序列：SEQID NO:1-16、65-70和87-151；

(d)使所述禾谷镰刀菌与有效量的双链RNA接触，所述双链RNA的至少一条链包含与选自由以下组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的区段：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和227-299；或者

(e)将有效量的双链RNA局部施加到所述植物，所述双链RNA的至少一条链包含与选自由以下组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的区段：SEQ ID NO:33-64、79-86、153-225和227-299。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述多核苷酸是双链RNA。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述双链RNA是化学地或酶促地合成的，或者是通过在微生物中表达或在植物细胞中表达而产生的。

42.根据权利要求39、40或41中任一项所述的方法，其中所述双链RNA包含包括与选自由以下组成的组的序列包括至少90％序列同一性的核苷酸序列的链：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

43.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述双链RNA包含包括SEQ ID NO:48的至少21个连续核苷酸的链。

44.根据权利要求39至43中任一项所述的方法，其中权利要求39(d)或(e)的所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

45.根据权利要求39至44中任一项所述的方法，其中所述方法包含将包含至少一个多核苷酸的组合物局部施加到所述植物，所述至少一个多核苷酸包含与SEQ ID NO:48的至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的核苷酸序列。

46.根据权利要求39至45中任一项所述的方法，其中所述方法包含使所述禾谷镰刀菌与有效量的包含双链RNA的溶液接触，其中所述双链RNA的至少一条链与基因的至少200个、300个、400个、500个或600个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性，所述基因具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-16、65-70、87-151；并且其中诱导RNA干扰，并且减少或消除所述禾谷镰刀菌的DON产生。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述双链RNA的所述至少一条链包含与核苷酸序列的至少200个、300个、400个、500个或600个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性的序列，所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:48、64、80-82、84-86、182、188、194、213、220、256、262、268、287和294。

48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述溶液进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的组分：有机硅酮表面活性剂、载剂、有机硅酮、有机硅酮表面活性剂、多核苷酸除草分子、非多核苷酸除草分子、多核苷酸杀害虫剂、非多核苷酸杀害虫剂、安全剂和病原体生长调节剂。

49.根据权利要求39至48中任一项所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：小麦、大麦、燕麦和玉米。

50.根据权利要求39至49中任一项所述的方法，其中(a)-(e)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少400个连续核苷酸。

51.一种植物或所述植物的果实、种子或可繁殖部分，所述植物具有通过根据权利要求39至50中任一项所述的方法提供的增加的对禾谷镰刀菌的DON产生的抗性。

52.根据权利要求51所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：小麦、大麦、燕麦和玉米。

53.一种重组DNA构建体，其包含与以下可操作地连接的异源启动子：

(a)包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性，所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(b)包含18个或更多个连续核苷酸的DNA，所述连续核苷酸与DNA或其DNA补体的等效长度的片段具有至少85％、90％或95％同一性，所述DNA具有选自由以下组成的组的序列：SEQID NO:1-16、65-70和87-151；或者

(c)编码至少一个沉默元件的DNA，所述至少一个沉默元件与靶基因或由所述靶基因转录的RNA的至少18个连续核苷酸基本上互补，或与其包含至少85％、90％或95％序列同一性，其中所述靶基因具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:

1-16、65-70和87-151；或者

(d)编码RNA的DNA，所述RNA包含选自由以下组成的组的序列或与其具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列：SEQ ID NO:33-64、79-86和153-225、

227-299。

54.一种植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体，其包含根据权利要求53所述的重组DNA构建体。

55.一种转基因植物细胞，其基因组中具有根据权利要求53所述的重组DNA构建体。

56.一种转基因植物或所述转基因植物的果实、种子或可繁殖部分，所述转基因植物包含根据权利要求55所述的转基因植物细胞。

57.根据权利要求55或56中任一项所述的植物，其中(a)-(d)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少18个、19个、20个或21个连续核苷酸。

58.一种DNA，其编码根据权利要求1至52中任一项所述的多核苷酸、RNA或dsRNA。

59.根据权利要求53所述的重组DNA构建体，其中(a)-(d)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少300个连续核苷酸。

60.根据权利要求54所述的植物染色体或质体或重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体，其中(a)-(d)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少300个连续核苷酸。

61.根据权利要求55所述的转基因植物细胞，其中(a)-(d)中叙述的所述至少18个连续核苷酸是至少300个连续核苷酸。