CN119212693A - 用于治疗肌萎缩性侧索硬化的牛磺酸二醇和苯丁酸钠的组合 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗神经退行性疾病(例如ALS)的方法和组合物。所述方法可以包括向受试者施用胆汁酸或其药用盐和苯丁酸化合物。

Description

用于治疗肌萎缩性侧索硬化的牛磺酸二醇和苯丁酸钠的组合

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年5月17日提交的美国申请号17/746,458的优先权，所述美国申请通过引用整体结合于此。

技术领域

本公开内容总体上涉及用于治疗肌萎缩性侧索硬化的组合物和方法。

背景技术

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最普遍的进行性运动神经元疾病。ALS引起运动神经元的进行性退化，从而导致快速进展的肌肉无力和萎缩，其最终导致部分或完全瘫痪。自症状发作的中位生存期为2至3年，其中呼吸衰竭是主要死因。ALS治疗目前集中于症状管理。目前可用的只有两种FDA批准的用于ALS的药物，即利鲁唑(riluzole)和依达拉奉(edaravone)。因此，需要用于治疗ALS的改进疗法。

发明内容

本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的牛磺酸二醇(Taurursodiol，TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约3至约425 µg/mL的C_max，和/或(2)对于苯乙酸(苯乙酸盐，phenylacetate)约5至约50 µg/mL的C_max；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约90至约170 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约110至约150 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯乙酸约10至约45 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，C_max是稳态C_max。

本文还提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约20至约550 μg*h/mL的AUC_0-最后，和/或(2)对于苯乙酸约20至约160 μg*h/mL的AUC_0-最后；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约140至约300 μg*h/mL的AUC_0-最后。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯乙酸约40至约80 μg*h/mL的AUC_0-最后。

本文还提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约25至约545 μg*h/mL的AUC_0-∞，和/或(2)对于苯乙酸约21至约155 μg*h/mL的AUC_0-∞；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约140至约300 μg*h/mL的AUC_0-∞。在一些实施方案中，所述方法还包括确定受试者具有对于苯乙酸约40至约80 μg*h/mL的AUC_0-∞。

本文还提供了向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(i)对于苯丁酸钠约3至约425 µg/mL的C_max，或对于苯乙酸约5至约50 µg/mL的C_max，(ii)对于苯丁酸钠约20至约550 μg*h/mL的AUC_0-最后，或对于苯乙酸约20至约160 μg*h/mL的AUC_0-最后，或(iii)对于苯丁酸钠约25至约545 μg*h/mL的AUC_0-∞，或对于苯乙酸约21至约155 μg*h/mL的AUC_0-∞；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。

在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(a)包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约1天至约40周。在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(a)包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约10周至约26周。在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(a)包括每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(a)包括每天一次施用组合物，持续约3周，随后每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约一小时从受试者获得血液样品。在一些实施方案中，在上述任何方法中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约四小时从受试者获得血液样品。

本文还提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法或向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者中的选自TURSO、UDCA或GUDCA的一种或多种胆汁酸的血浆浓度；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在一些实施方案中，血浆浓度是稳态血浆浓度。在一些实施方案中，步骤(a)包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约1天至约40周。在一些实施方案中，步骤(a)包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约10周至约26周。在一些实施方案中，步骤(a)包括每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，步骤(a)包括每天一次施用组合物，持续约3周，随后每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定血浆浓度。在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约四小时确定血浆浓度。

在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的TURSO的血浆浓度，其中TURSO的血浆浓度为约20至约2570 ng/mL。在一些实施方案中，其中TURSO的血浆浓度为约20至约1045 ng/mL。在一些实施方案中，其中TURSO的血浆浓度为约88至约540 ng/mL。在一些实施方案中，其中步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约四小时确定受试者中的TURSO的血浆浓度，其中TURSO的血浆浓度为约20至约3250 ng/mL。在一些实施方案中，其中TURSO的稳态血浆浓度为约20至约1125 ng/mL。在一些实施方案中，其中TURSO的稳态血浆浓度为约155至约785 ng/mL。

在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的UDCA的血浆浓度，其中UDCA的血浆浓度为约20至约6020 ng/mL。在一些实施方案中，其中UDCA的血浆浓度为约20至约1955 ng/mL。在一些实施方案中，UDCA的血浆浓度为约285至约1125 ng/mL。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定在组合物的最后剂量之后约四小时确定受试者中的UDCA的血浆浓度，其中UDCA的血浆浓度为约20至约7340 ng/mL。在一些实施方案中，UDCA的血浆浓度为约20至约2550 ng/mL。在一些实施方案中，UDCA的血浆浓度为约305至约1395 ng/mL。

在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的GUDCA的血浆浓度，其中GUDCA的血浆浓度为约20至约4600 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的血浆浓度为约65至约2085 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的血浆浓度为约340至约1635 ng/mL。在一些实施方案中，步骤(b)包括在组合物的最后剂量之后约四小时确定受试者中的GUDCA的血浆浓度，其中GUDCA的血浆浓度为约20至约5290 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的血浆浓度为约320至约2315 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的血浆浓度为约530至约1915 ng/mL。

在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)之前确定受试者中的胆汁酸的基线血浆浓度。在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者中的TURSO的基线血浆浓度，并且其中TURSO的基线血浆浓度为约20至约577 ng/mL。在一些实施方案中，TURSO的基线血浆浓度为约20至约125 ng/mL。

在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者中的UDCA的基线血浆浓度，并且其中UDCA的基线血浆浓度为约20至约5970 ng/mL。在一些实施方案中，UDCA的基线血浆浓度为约20至约825 ng/mL。在一些实施方案中，UDCA的基线血浆浓度为约20至约53 ng/mL。

在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者中的GUDCA的基线血浆浓度，并且其中GUDCA的基线血浆浓度为约20至约4540 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的基线血浆浓度为约20至约755 ng/mL。在一些实施方案中，GUDCA的基线血浆浓度为约25至约180 ng/mL。

在以上提及的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)包括在受试者已摄入食物之后超过两小时或在受试者摄入食物之前超过一小时施用一定剂量的组合物。

本文还提供了增加受试者中的胆汁酸的血浆浓度的方法，所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物，其中胆汁酸选自TURSO、UDCA或GUDCA，其中在胆汁酸是TURSO的情况下，血浆浓度为约20至约3250 ng/mL，其中在胆汁酸是UDCA的情况下，血浆浓度为约20至约7340 ng/mL，并且其中在胆汁酸是GUDCA的情况下，血浆浓度为约20至约5290 ng/mL。在一些实施方案中，血浆浓度是稳态血浆浓度。在一些实施方案中，所述方法包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约1天至约40周。在一些实施方案中，所述方法包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约10周至约26周。在一些实施方案中，所述方法包括每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，所述方法包括每天一次施用组合物，持续约3周，随后每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些实施方案中，所述方法包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定胆汁酸的血浆浓度。在一些实施方案中，所述方法包括在组合物的最后剂量之后约四小时确定胆汁酸的血浆浓度。

在以上提及的任何方法的一些实施方案中，组合物经口施用。在以上提及的任何方法的一些实施方案中，组合物通过饲管施用。在以上提及的任何方法的一些实施方案中，组合物通过推注(弹丸注射，bolus injection)施用。在以上提及的任何方法的一些实施方案中，组合物是粉末制剂。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。

应理解的是，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开内容的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开内容的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本公开内容有关的实施方案的所有组合由本公开内容具体地涵盖，并且在本文中公开，就如同各个和每个组合都单个地且明确地公开一样。另外，各个实施方案及其要素的所有子组合也由本公开内容具体地涵盖，并且在本文中公开，就如同各个和每个这样的子组合都单个地且明确地在本文中公开一样。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是例示性的，并且不旨在是限制性的。根据以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将是明显的。

附图说明

图1是实施例1遵循的研究序列的流程图。

图2是示出了在Log₁₀/线性标度上在禁食和进食状态下在AMX0035的单次口服剂量后PB的几何平均(×/÷几何SD)血浆浓度的图表。

图3是示出了在Log₁₀/线性标度上在禁食和进食状态下在AMX0035的单次口服剂量后PAA的几何平均(×/÷几何SD)血浆浓度的图表。

图4是示出了在Log₁₀/线性标度上在禁食和进食状态下在AMX0035的单次口服剂量后TURSO的几何平均(×/÷几何SD)血浆浓度的图表。

图5是示出了在Log₁₀/线性标度上在禁食和进食状态下在AMX0035的单次口服剂量后，UDCA的几何平均(×/÷几何SD)血浆浓度的图表。

图6是示出了在Log₁₀/线性标度上在禁食和进食状态下在AMX0035的单次口服剂量后，GUDCA的几何平均(×/÷几何SD)血浆浓度的图表。

图7是按性别汇集的访问组的TUDCA箱线图。

图8是按性别汇集的访问组的GUDCA箱线图。

图9是按年龄类别汇集的访问组的UDCA箱线图。

图10是按年龄类别汇集的访问组的GUDCA箱线图。

图11是按抗生素使用汇集的访问组的TUDCA箱线图。

图12是按抗生素使用汇集的访问组的UDCA箱线图。

图13是按抗生素使用汇集的访问组的GUDCA箱线图。

图14是按肾小球滤过率类别汇集的访问组的TUDCA箱线图。

图15是按肾小球滤过率类别汇集的访问组的UDCA箱线图。

图16是按肾小球滤过率类别汇集的访问组的GUDCA箱线图。

图17是示出了基于ANOVA结果的CC的变化的通路可视化(第12周)的示意图。

图18是示出了基于ANOVA结果的CC的变化的通路可视化(第24周)的示意图。

具体实施方式

在一个方面，本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约3至约425 µg/mL的C_max，和/或(2)对于苯乙酸约5至约50 µg/mL的C_max；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约20至约550 μg*h/mL的AUC_0-最后，和/或(2)对于苯乙酸约20至约160 μg*h/mL的AUC_0-最后；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约25至约545 μg*h/mL的AUC_0-∞，和/或(2)对于苯乙酸约21至约155 μg*h/mL的AUC_0-∞；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。

本公开内容的另外的方面涉及治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的一种或多种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者中的选自TURSO、UDCA或GUDCA的一种或多种胆汁酸的血浆浓度；(c)向受试者施用另外剂量的组合物。

本公开内容的一个另外的方面涉及增加受试者中的胆汁酸的血浆浓度的方法，所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的包含约3克的苯丁酸钠和约1克的TURSO的组合物，其中胆汁酸选自TURSO、UDCA和GUDCA，其中在胆汁酸是TURSO的情况下，血浆浓度为约20至约3250 ng/mL，其中在胆汁酸是UDCA的情况下，血浆浓度为约20至约7340 ng/mL，并且其中在胆汁酸是GUDCA的情况下，血浆浓度为约20至约5290 ng/mL。

在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一)以及在该记叙范围内的任何其他记叙值或中间值均涵盖在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围内，并且也涵盖在本公开内容内，但是所记叙范围内的任何具体排除的限值除外。在所记叙范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中任一个或两个的范围也包括在本公开内容内。在整个说明书中，应注意的是，µg-h/mL、µg*h/mL和µg.h/ml可互换使用。同样，ng-h/mL、ng*h/mL和ng.h/ml也可互换使用。

本文中给出了某些范围，其中数值前面带有术语“约”。术语“约”在本文中用来对其后面的确切数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体列出的数字时，接近或近似的未列出的数字可以是在其呈现的上下文中与具体列出的数字基本上等效的数字。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞均旨在具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考，在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含这样的定义不应必需地被解释为代表与本领域通常理解的定义存在实质性差异。

I. 肌萎缩性侧索硬化(ALS)

术语“肌萎缩性侧索硬化”和“ALS”在本文中可互换使用，并且包括本领域已知的ALS的所有分类，包括但不限于典型ALS(例如，影响下运动神经元和上运动神经元的ALS)、原发性侧索硬化(PLS，例如仅影响上运动神经元的那些)、进行性延髓麻痹(PBP或延髓发作，一种典型地以吞咽、咀嚼和说话困难开始的ALS形式)和进行性肌萎缩(PMA，典型地仅影响下运动神经元)。这些术语包括散发性和家族性(遗传性) ALS、处于任何进展速度(例如，快速、非缓慢或缓慢进展)的ALS和处于任何阶段的ALS(例如，ALS发作前、发作时和晚期)。

在本文描述的方法中的受试者可以表现出与ALS相关的一种或多种症状，或已被诊断患有ALS。在一些实施方案中，受试者可能被怀疑患有ALS，和/或处于发展ALS的风险。

在本文描述的方法中的受试者可以表现出与良性肌束震颤综合征(BFS)或痉挛-肌束震颤综合征(CFS)相关的一种或多种症状。

本文描述的任何方法的一些实施方案还可以包括确定受试者患有ALS或处于发展ALS的风险、诊断受试者患有ALS或处于发展ALS的风险、或者选择患有ALS或处于发展ALS的风险的受试者。同样，本文描述的任何方法的一些实施方案还可以包括确定受试者患有良性肌束颤动综合征或痉挛肌束颤动综合征或者处于发展良性肌束颤动综合征或痉挛肌束颤动综合征的风险、诊断受试者患有BFS或CFS或者处于发展BFS或CFS的风险、或者选择患有BFS或CFS或者处于发展BFS或CFS的风险的受试者。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者已显示出ALS的一种或多种症状达约24个月或更短时间(例如，约23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个月或者1周或更短时间)。在一些实施方案中，受试者已显示出ALS的一种或多种症状达约36个月或更短时间(例如，约35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25个月或更短时间)。

受试者所表现出的ALS症状的顺序和类型可能取决于身体中的哪些运动神经元首先受损，并且因此身体中的哪些肌肉首先受损。例如，延髓发作型、肢体发作型或呼吸发作型ALS可能呈现相似或不同的症状。一般而言，ALS症状可以包括肌肉无力或萎缩(例如，影响上身、下身和/或言语)、肌束震颤(颤搐)、痉挛或者受影响的肌肉的僵硬。ALS的早期症状可以包括手臂或腿部的症状、清楚说话困难或吞咽困难(例如，在延髓发作型ALS中)。其他症状包括舌头活动性丧失、呼吸困难、喘气困难或肺功能异常、咀嚼困难和/或行走困难(例如，导致跌倒)。受试者可能具有呼吸肌无力作为ALS症状的最初表现。这样的受试者可能具有非常差的预后，并且在一些情况下具有从诊断开始的约两个月的平均生存期。在一些受试者中，呼吸肌无力的发作时间可以用作预后因素。

ALS症状也可以根据神经系统发生退化的部分(即上运动神经元或下运动神经元)进行分类。下运动神经元退化例如表现为在延髓、颈、胸和/或腰骶区域中的一个或多个中的无力或消瘦。上运动神经元退化可以包括肌腱反射增强、痉挛、假性延髓特征、霍夫曼反射(Hoffmann reflex)、跖伸肌反应(extensor plantar response)和过度反射(反射亢进)(包括过度活跃的呕反射)。神经元退化或肌肉无力的进展是所述疾病的标志。因此，本公开内容的一些实施方案提供了一种改善下运动神经元退化的至少一种症状、上运动神经元退化的至少一种症状或者来自下运动神经元退化和上运动神经元退化中的每一者的至少一种症状的方法。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，可以基于来自受试者和/或受试者家庭成员的信息确定症状发作。在一些实施方案中，从症状发作到诊断的中位时间为约12个月。

在一些情况下，受试者已被诊断患有ALS。例如，受试者可以已被诊断患有ALS达约24个月或更短时间(例如，约23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个月或更短时间)。例如，受试者可以已被诊断患有ALS达1周或更短时间，或在施用本公开的治疗的同一天被诊断患有ALS。受试者可以已被诊断患有ALS达超过约24个月(例如，超过约28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或80个月)。诊断ALS的方法在本领域中是已知的。例如，受试者可以基于临床病史、家族史、身体或神经学检查(例如，下运动神经元或上运动神经元退化的体征)进行诊断。受试者可以例如由医疗保健专业人员确认或鉴别为患有ALS。诊断过程中可以包括多方参与。例如，在从受试者获取样品作为诊断的一部分的情况下，第一方可以从受试者获取样品，并且第二方可以测试样品。在本文描述的任何人类受试者的一些实施方案中，受试者由医疗从业者(例如，全科医生)进行诊断、选择或转诊。

在一些实施方案中，受试者满足用于可能或确定的ALS的El Escorial标准，即受试者表现出：

1. 通过临床、电生理学或神经病理学检查发现的下运动神经元(LMN)退化的体征；

2. 通过临床检查发现的上运动神经元(UMN)退化的体征；以及

3. 体征在一个区域内的进行性扩散或体征进行性扩散至其他区域，同时不存在：

可能解释LMN和/或UMN退化的体征的其他疾病过程的电生理学证据；以及

可能解释观察到的临床和电生理学体征的其他疾病过程的神经影像证据。

根据El Escorial标准，评价了四个区域(包括中枢神经系统的脑干、颈、胸和腰骶脊髓)中的LMN和UMN退化的体征。可以确定受试者属于以下类别之一：

A. 临床上确定的ALS，仅通过在三个区域中存在UMN以及LMN体征基于临床证据定义。

B. 临床上可能的ALS，仅通过至少两个区域中的UMN和LMN体征基于临床证据定义，其中一些UMN体征必需位于LMN体征的上侧(上方)。

C. 临床上可能的ALS - 实验室支持的，当UMN和LMN功能障碍的临床体征仅在一个区域中时或当单独的UMN体征在一个区域中存在并且通过EMG标准定义的LMN体征在至少两个肢体中存在时定义的，其中适当应用神经影像和临床实验室方案以排除其他原因。

D. 临床上可能的ALS，当仅在一个区域中一起发现UMN和LMN功能障碍的临床症状时或者在两个或更多个区域中单独发现UMN体征时；或发现LMN症状位于UMN症状的上侧并且诊断为临床上可能的-实验室支持的时定义的。

在一些实施方案中，受试者具有临床上确定的ALS(例如，基于El Escorial标准)。

受试者可以使用修订版的肌萎缩性侧索硬化功能评分量表(ALSFRS-R)进行评价和/或诊断。ALSFRS-R是一种序数评分量表(评分0-4)，用于确定受试者对其在与ALS相关的12项功能活动中的能力和独立性的评估。在诊断时计算的ALSFRS-R得分可以与整个时间内的得分进行比较以确定进展速度。ALSFRS-R得分的变化可以与力量随时间推移的变化相关联，并且可以与生活质量指标(measures)和预测生存期相关联。ALSFRS-R显示线性平均斜率，并且可以用作预后指标(参见例如Berry等人，Amyotroph Lateral SclerFrontotemporal Degener 15:1-8，2014；Traynor等人，Neurology 63:1933-1935，2004；Simon等人，Ann Neurol 76:643-657，2014；以及Moore等人，Amyotroph Lateral SclerOther Motor Neuron Disord 4:42，2003)。

在ALSFRS-R中，由颈肌、躯干肌、腰骶肌和呼吸肌介导的功能各自通过3个项目进行评估。每个项目的得分为0-4，其中4反映不受累于疾病，并且0反映最大受累。将项目得分相加以得出总分。总得分反映ALS的影响，其中示例性分类如下所示：

>40 (最小至轻度)；39-30 (轻度至中度)；<30 (中度至重度)；<20 (晚期疾病)。

例如，受试者的ALSFRS-R得分(例如，基线ALSFRS-R得分)可以为40或更高(例如，至少41、42、43、44、45、46、47或48)、30至39(包括端值)(例如，31、32、33、34、35、36、37或38)或者30或更低(例如，21、22、23、24、25、26、27、28或29)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者的ALSFRS-R得分(例如，基线ALSFRS-R得分)为40或更低(例如，39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更低)。在一些实施方案中，受试者的ALSFRS-R得分(例如，基线ALSFRS-R得分)为20或更低(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更低)。

由于ALS是一种进行性疾病，所以所有患者通常将随着时间的推移而进展。然而，在进展速率方面存在很大程度的受试者间可变性，因为一些受试者在数月内死亡或需要呼吸支持，而其他受试者具有相对延长的生存时间。本文描述的受试者可以具有快速进展型ALS或缓慢进展型ALS。患有ALS的受试者的功能衰退速率可以通过每月的ALSFRS-R得分的变化来测量。例如，得分可以每月下降约1.02 (±2.3)分。

患者进展的一个预测指标是患者先前的疾病进展速率(ΔFS)，其可以计算为：ΔFS = (48 –评价时的ALSFRS-R得分)/从发作到评价时间的持续时间(月)。ΔFS得分表示自症状发作以来每月损失的ALSFRS-R分数，并且可以作为患有ALS的患者中的进展和/或生存的重要预测指标(参见例如Labra等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry 87:628-632，2016，以及Kimura等人，Neurology 66:265-267，2006)。受试者的疾病进展速率(ΔFS)可以为约0.50或更低(例如，约0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15或0.10或更低)；约0.50至约1.20(例如，约0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10或1.15)；或约1.20或更大(例如，约1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95或2.00或更大)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者的ALS疾病进展速率(ΔFS)可以为约0.50或更大(例如，约0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95或2.00或更大)。然而，应注意的是，ΔFS得分是患者进展的一个预测指标，并且在评价时可能低估或高估患者的进展。

在一些实施方案中，自初始评价以来，受试者在3-12个月内每月平均损失约0.8至约2(例如，约0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9)个ALSFRS-R得分。在一些实施方案中，自初始评价以来，受试者在3-12个月内每月平均损失超过约1.2个ALSFRS-R得分。自初始评价以来，受试者在3-12个月内在ALSFRS-R得分方面可能下降了至少3分(例如，至少4、6、8、10、12、14、16、20、24、28或32分)。在一些实施方案中，受试者在过去的3-12个月内每月平均损失约0.8至约2(例如，约0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9)个ALSFRS-R得分。在一些实施方案中，受试者在过去的3-12个月内每月平均损失超过约1.2(例如，超过约1.5、1.8、2.0、2.5或3)个ALSFRS-R得分。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在从受试者获得的样品中标志物的存在或水平可以用于ALS诊断或预后，或用于跟踪疾病活动和治疗反应。合适的样品包括例如细胞、组织或体液(例如血液、尿液或脑脊液(CSF)样品)。例如，CSF和/或血液中的磷酸化神经丝重亚基(pNF-H)或神经丝轻链(NfL)的水平可以用作用于ALS诊断、预后的生物标志物，或用于跟踪疾病活动或治疗结局。pNF-H是神经元细胞骨架的主要组分并且随着神经元损伤而释放到CSF和血流中。pNF-H的水平可能与轴突损失的水平和/或运动神经元功能障碍的负担相关(参见例如De Schaepdryver等人，Journal of Neurology，Neurosurgery &Psychiatry 89:367-373，2018)。

患有ALS的患者的CSF和/或血液中的pNF-H的浓度可能在早期疾病阶段显著增加。血浆、血清和/或CSF中的pNF-H的较高水平可能与较快的ALS进展(例如，较快的ALSFRS-R下降)和/或较短的生存时间有关。血浆中的pNF-H浓度在具有延髓发作的ALS患者中可能高于具有脊髓发作的那些ALS患者。在一些情况下，神经丝重链亚基和轻链亚基的相对表达水平之间的不平衡可以用于ALS诊断、预后或跟踪疾病进展。

检测pNF-H和NfL(例如，脑脊液、血浆或血清中的pNF-H和NfL)的方法在本领域是已知的，并且包括但不限于ELISA和Simoa测定(参见例如Shaw等人，Biochemical andBiophysical Research Communications 336:1268-1277，2005；Ganesalingam等人，Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 14(2):146-9，2013；DeSchaepdryver等人，Annals of Clinical and Translational Neurology 6(10): 1971-1979，2019；Wilke等人，Clin Chem Lab Med 57(10):1556-1564，2019；Poesen等人，FrontNeurol 9:1167，2018；Pawlitzki等人，Front. Neurol. 9:1037，2018；Gille等人，Neuropathol Appl Neurobiol 45(3):291-304，2019)。也可以使用商业化的pNF-H检测测定，诸如由EnCor Biotechnology、BioVendor和Millipore-EMD开发的那些。也可以使用基于Simoa技术的商业NfL测定试剂盒，诸如由Quanterix制造的那些(参见例如Thouvenot等人，European Journal of Neurology 27:251-257，2020)。影响与疾病过程相关的血清或血浆中的pNF-H和NfL水平或其检测的因素可能与CSF中的那些不同。CSF和血清中的神经丝(例如pNF-H和/或NfL)的水平可能是相关联的(参见例如Wilke等人，Clin Chem Lab Med57(10):1556-1564，2019)。

本文描述的受试者的CSF或血液pNF-H水平可以为约300 pg/mL或更高(例如，约350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3200、3500、3800或4000 pg/mL或更高)。在一些实施方案中，血清pNF-H水平可以为约70至约1200 pg/mL(例如，约70至约1000、约70至约800、约80至约600或约90至约400 pg/mL)。在一些实施方案中，CSF pNF-H水平可以为约1000至约5000pg/mL(例如，约1500至约4000或约2000至约3000 pg/mL)。

受试者的CSF或血液NfL水平可以为约50 pg/mL或更高(例如，约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250 pg/mL或更高)。在一些实施方案中，血清NfL水平可以为约50至约300 pg/mL(例如，约50至约280、约50至约250、约50至约200、约50至约150、约50至约100、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约300、约150至约250、约150至约200、约200至约300、约200至约250或约250至约300 pg/mL)。在一些实施方案中，CSF NfL水平可以为约2000至约40,000 pg/mL(例如，约2000至约35,000、约2000至约30,000、约2000至约25,000、约2000至约20,000、约2000至约15,000、约2000至约10,000、约2000至约8000、约2000至约6000、约2000至约4000、约4000至约40,000、约4000至约35,000、约4000至约30,000、约4000至约25,000、约4000至约20,000、约4000至约15,000、约4000至约10,000、约4000至约8000、约4000至约6000、约6000至约40,000、约6000至约35,000、约6000至约30,000、约6000至约25,000、约6000至约20,000、约6000至约15,000、约6000至约10,000、约6000至约8000、约8000至约40,000、约8000至约35,000、约8000至约30,000、约8000至约25,000、约8000至约20,000、约8000至约15,000、约8000至约10,000、约10,000至约40,000、约10,000至约35,000、约10,000至约30,000、约10,000至约25,000、约10,000至约20,000、约10,000至约15,000、约15,000至约40,000、约15,000至约35,000、约15,000至约30,000、约15,000至约25,000、约15,000至约20,000、约20,000至约40,000、约20,000至约35,000、约20,000至约30,000、约20,000至约25,000、约25,000至约40,000、约25,000至约35,000、约25,000至约30,000、约30,000至约40,000、约30,000至约35,000或约35,000至约40,000 pg/mL)。

本文考虑了可用于ALS诊断、预后和疾病进展监测的另外的生物标志物，包括但不限于S100-β、胱抑素C (cystatin C)和壳三糖苷酶(CHIT)的CSF水平(参见例如Chen等人，BMC Neurol 16:173，2016)。尿酸的血清水平可以用作用于ALS预后的生物标志物(参见例如Atassi等人，Neurology 83(19):1719-1725，2014)。Akt磷酸化也可以用作用于ALS预后的生物标志物(参见例如WO2012/160563)。p75ECD和酮的尿液水平可以用作用于ALS诊断的生物标志物((参见例如Shepheard等人，Neurology 88:1137-1143，2017)。肌酐的血清和尿液水平也可以用作生物标志物。其他可用的用于ALS的血液、CSF、神经生理学和神经放射学生物标志物描述于例如Turner等人，Lancet Neurol 8:94-109，2009中。本文描述的任何标志物均可以用于诊断受试者是否患有ALS，或者确定受试者是否处于发展ALS的风险。

还可以基于基因分析将受试者鉴别为患有ALS或处于发展ALS的风险。与ALS相关的遗传变体是本领域已知的(参见例如Taylor等人，Nature 539:197-206，2016；Brown和Al-Chalabi N Engl J Med 377:162-72，2017；以及http://alsod.iop.kcl.ac.uk)。本文描述的受试者可能携带在与家族性和/或散发性ALS相关的一个或多个基因中的突变。与ALS相关的示例性基因包括但不限于：ANG、TARDBP、VCP、VAPB、SQSTM1、DCTN1、FUS、UNC13A、ATXN2、HNRNPA1、CHCHD10、MOBP、C21ORF2、NEK1、TUBA4A、TBK1、MATR3、PFN1、UBQLN2、TAF15、OPTN、TDP-43和DAO。与ALS相关的基因的另外的描述可以在Therrien等人，Curr NeurolNeurosci Rep 16:59-71，2016；Peters等人，J Clin Invest 125:2548，2015以及Pottier等人，J Neurochem，138:Suppl 1:32-53，2016中找到。与ALS相关的遗传变体可能影响受试者中的ALS进展速率、受试者中所施用化合物的药代动力学和/或所施用化合物对受试者的功效。

受试者可能具有在编码CuZn-超氧化物歧化酶(SOD1)的基因中的突变。突变引起SOD1蛋白更易于聚集，从而导致含有错误折叠的SOD1聚集体的细胞内含物的沉积(参见例如Andersen等人，Nature Reviews Neurology 7:603-615，2011)。SOD1中超过100种不同突变与遗传性ALS有关，其中的许多导致蛋白质中的单个氨基酸取代。在一些实施方案中，SOD1突变是A4V(即，位置4处的丙氨酸用缬氨酸取代)。SOD1突变进一步描述于例如Rosen等人，Hum. Mol. Genet. 3，981-987，1994和Rosen等人，Nature 362:59-62，1993中。在一些实施方案中，受试者具有C9ORF72基因中的突变。C9ORF72基因中的重复扩增是ALS的常见原因，其中C9ORF72功能的丧失以及重复的毒性功能的获得都与ALS有关(参见例如Balendra和Isaacs，Nature Reviews Neurology 14:544-558，2018)。本文描述的方法可以包括在施用胆汁酸和苯丁酸化合物之前检测受试者中的SOD1突变和/或C9ORF72突变。用于筛选突变的方法是本领域众所周知的。合适的方法包括但不限于基因测序。参见例如Hou等人，Scientific Reports 6:32478，2016；以及Vajda等人，Neurology 88:1-9，2017。

熟练的从业者将理解的是，某些因素可能影响所施用化合物对于受试者的生物利用度和代谢，并且可以相应地进行调整。这些包括但不限于肝功能(例如肝酶的水平)、肾功能和胆囊功能(例如离子吸收和分泌、胆固醇转运蛋白的水平)。每个受试者对所施用化合物(例如胆汁酸和苯丁酸化合物)的暴露水平可能存在可变性，排泄水平可能存在差异，并且化合物在接受治疗的受试者中的药代动力学可能存在差异。本文描述的任何因素都可能影响受试者的药物暴露。例如，降低的化合物清除率可以导致增加的药物暴露，而改善的肾功能可以减少实际药物暴露。药物暴露的程度可能与受试者对所施用化合物的反应以及治疗的结局相关。

受试者的年龄可以例如大于约18岁(例如18-100、18-90、18-80、18-70、18-60、18-50、18-40、18-30、18-25、25-100、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40、25-30、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-100、60-90、60-80、60-70、70-100、70-90、70-80、80-100、80-90或90-100岁)。受试者的BMI可以为约18.5-30 kg/m²(例如，18.5-28、18.5-26、18.5-24、18.5-22、18.5-20、20-30、20-28、20-26、20-24、20-22、22-30、22-28、22-26、22-24、24-30、24-28、24-26、26-30、26-28或28-30 kg/m²)。具有本文描述的任何ALS相关基因中的突变或呈现本文描述的任何生物标志物可以表明受试者处于发展ALS的风险。这样的受试者可以利用本文提供的方法进行治疗以用于预防目的和预防性目的。

在一些实施方案中，受试者具有良性肌束震颤综合征(BFS)或痉挛-肌束震颤综合征(CFS)的一种或多种症状。BFS和CFS是外周神经过度兴奋病症，并且可以引起肌束震颤、痉挛、疼痛、疲劳、肌肉僵硬和感觉异常。鉴别患有这些病症的受试者的方法是本领域已知的，诸如通过临床检查和肌电图。

II．组合物

本公开内容提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，所述方法包括向受试者施用胆汁酸或其药用盐以及苯丁酸化合物。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含TURSO和苯丁酸钠的组合物。

胆汁酸

如本文中使用的，“胆汁酸”是指天然存在的表面活性剂，其具有被3α-羟基取代并且任选地还被其他羟基取代(典型地在固醇核心的C6、C7或C12位置处)的胆烷酸衍生的核心。胆汁酸衍生物(例如，水溶性胆汁酸衍生物)和与胺缀合的胆汁酸也由术语“胆汁酸”涵盖。胆汁酸衍生物包括但不限于利用其他官能团(包括但不限于卤素和氨基)在胆汁酸的羟基和羧酸基团所连接的碳原子处形成的衍生物。可溶性胆汁酸可以包括胆汁酸的游离酸形式与HCl、磷酸、柠檬酸、乙酸、氨或精氨酸之一组合的水性制备物。合适的胆汁酸包括但不限于牛磺酸二醇(TURSO)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(也称为“鹅胆酸(chenodiol)”或“鹅脱氧胆酸(chenic acid)”)、胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸、7-氧代石胆酸、石胆酸、碘去氧胆酸、碘胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸或者其类似物、衍生物或前药。

在一些实施方案中，本公开内容的胆汁酸是亲水性胆汁酸。亲水性胆汁酸包括但不限于TURSO、UDCA、鹅去氧胆酸、胆酸、猪去氧胆酸、石胆酸和甘氨熊去氧胆酸。还考虑了本文公开的任何胆汁酸的药用盐或溶剂化物。在一些实施方案中，通常用于形成本公开内容的胆汁酸的药用盐的碱包括碱金属(包括钠、钾和锂)的氢氧化物；碱土金属诸如钙和镁的氢氧化物；其他金属诸如铝和锌的氢氧化物；氨、有机胺诸如未取代的或羟基取代的单、二或三烷基胺、二环己胺；三丁胺；吡啶；N-甲基胺、N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单、双或三-(2-OH-(C1-C6)-烷基胺)诸如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；吗啉；硫代吗啉；哌啶；吡咯烷；以及氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸)等。

术语“牛磺熊去氧胆酸”(TUDCA)和“牛磺酸二醇”(TURSO)在本文中可互换使用。

本文描述的胆汁酸可以是TURSO，如式I所示(具有带有标记的碳以协助理解可以在哪里进行取代)。

或其药用盐。

本文描述的胆汁酸可以是UDCA，如式II所示(具有带有标记的碳以协助理解可以在哪里进行取代)。

或其药用盐。

本公开内容的胆汁酸的衍生物可以是生理相关的胆汁酸衍生物。例如，在TURSO或UDCA的式中，3或7位处的氢的取代、3或7位处的羟基的立体化学的位移的任何组合均适合用于本发明组合物。

“胆汁酸”还可以是与氨基酸缀合的胆汁酸。缀合物中的氨基酸可以是，但不限于，牛磺酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、蛋氨酸或羧甲半胱氨酸。可以与本公开内容的胆汁酸缀合的其他氨基酸包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。这样的胆汁酸的一个实例是式III的化合物：

，

其中

R是-H或C₁-C₄烷基；

R₁是-CH₂-SO₃R₃、CH₂COOH或CH₂CH₂COOH，并且R₂是-H；

或者R₁是-COOH并且R₂是-CH₂-CH₂-CONH₂、-CH₂-CONH₂、-CH₂-CH₂-SCH₃、CH₂CH₂CH₂NH(C=NH)NH₂、CH₂(咪唑基)、CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、CH₂COOH、CH₂CH₂COOH、CH₂OH、CH(OH)CH₃、CH₂SH、吡咯烷-2-基、CH₃、2-丙基、2-丁基、2-甲基丁基、CH₂(苯基)、CH₂(4-OH-苯基)或-CH₂-S-CH₂-COOH；并且

R₃是-H或氨基酸的残基，或者其药用类似物、衍生物、前药或它们的混合物。氨基酸的一个实例是碱性氨基酸。氨基酸的其他实例包括甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、蛋氨酸、羧甲半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。

本公开内容的胆汁酸的另一个实例是式IV的化合物：

其中

R是-H或C₁-C₄烷基；

R₁是-CH₂-SO₃R₃，并且R₂是-H；

或者R₁是-COOH并且R₂是-CH₂-CH₂-CONH₂、-CH₂-CONH₂、-CH₂-CH₂-SCH₃或-CH₂-S-CH₂-COOH；并且

R₃是-H或碱性氨基酸的残基，或者其药用类似物、衍生物、前药或它们的混合物。碱性氨基酸的实例包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸。

在一些实施方案中，胆汁酸是TURSO。TURSO是一种两亲性胆汁酸并且是UDCA的牛磺酸缀合物形式。TURSO通过掺入到线粒体膜中、减少Bax易位至线粒体膜、降低线粒体通透性以及增加细胞的凋亡阈值来恢复线粒体生物能量缺陷(Rodrigues等人，Biochemistry42，10: 3070-3080，2003)。它用于治疗胆固醇胆结石，其中通常需要长时间的治疗(例如1至2年)以获得完全溶解。它已被用于治疗胆汁淤积性肝病，包括原发性肝硬化、儿童家族性肝内胆汁淤积和原发性硬化性胆管炎以及由囊性纤维化引起的胆汁淤积。TURSO被禁用于患有胆道感染、频繁胆绞痛的受试者或者具有胆汁酸吸收困难(例如回肠疾病或切除)的受试者。药物相互作用可以包括与抑制胆汁酸吸收的物质(诸如消胆胺(考来烯胺，cholestyramine)以及与增加胆汁中的胆固醇消除的药物(TURSO降低胆汁胆固醇含量)的相互作用。基于相似的物理化学特性，TURSO和UDCA之间存在药物毒性和相互作用的相似性。使用TURSO报告的最常见不良反应(≥1%)为：腹部不适、腹痛、腹泻、恶心、瘙痒和皮疹。存在瘙痒的一些病例以及有限数量的肝酶升高的病例。

在一些实施方案中，胆汁酸是UDCA。UDCA或熊去氧胆酸已用于治疗胆结石，并且由肝脏以牛磺酸(TURSO)或甘氨酸(GUDCA)缀合物的形式内源性地产生和分泌。牛磺酸缀合通过使UDCA更亲水来增加其溶解性。TURSO在主动转运下在回肠远端中被吸收，并且因此可能具有比在回肠更近端地被吸收的UDCA稍微更长的肠道内停留时间。熊去氧胆酸疗法与肝损伤无关。肝酶的异常与Actigall®(熊去氧胆酸USP胶囊)疗法无关，并且Actigall®已被证实降低肝病中的肝酶水平。然而，给予Actigall®的受试者应具有在疗法开始时测量的并且之后如特定临床情形所指示的SGOT (AST)和SGPT (ALT)。先前的研究已表明，胆汁酸螯合剂(诸如消胆胺和考来替泊(colestipol))可以通过减少熊去氧胆酸的吸收来干扰熊去氧胆酸的作用。基于铝的抗酸药已表明在体外吸附胆汁酸，并且可以被预期以与胆汁酸螯合剂相同的方式干扰熊去氧胆酸。雌激素、口服避孕药和氯贝特(clofibrate)(以及可能的其他降脂药物)增加肝脏胆固醇分泌，并且促进胆固醇胆结石形成，并且因此可能抵消熊去氧胆酸的有效性。

苯丁酸化合物

苯丁酸化合物在本文中定义为涵盖作为游离酸(4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid)或苯丁酸(phenylbutyric acid))的苯丁酸(低分子量芳族羧酸)及其药用盐、共晶物、多晶型物、水合物、溶剂化物、缀合物、衍生物或前药。本文描述的苯丁酸化合物还涵盖4-PBA的类似物，包括但不限于三-(4-苯基丁酸)甘油酯、苯乙酸(其为PBA的活性代谢物)、2-(4-甲氧基苯氧基)乙酸(2-POAA-OMe)、2-(4-硝基苯氧基)乙酸(2-POAA-NO2)和2-(2-萘氧基)乙酸(2-NOAA)以及它们的药用盐。苯丁酸化合物还涵盖生理相关的4-PBA物种，诸如但不限于4-PBA结构中用氘对氢的任何取代。本文考虑其他HDAC2抑制剂作为苯丁酸化合物的替代物。

苯丁酸的生理学可接受的盐包括例如钠、钾、镁或钙盐。盐的其他实例包括铵、锌或锂盐，或者苯丁酸与有机胺(诸如赖氨酸或精氨酸)的盐。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，苯丁酸化合物是苯丁酸钠。苯丁酸钠具有下式：

。

苯丁酸化合物(phenylbutyrate)是一种泛-HDAC抑制剂，并且可以通过上调主伴侣调节剂DJ-1和通过募集其他伴侣蛋白来改善ER应激(参见例如Zhou等人，J Biol Chem.286: 14941-14951，2011以及Suaud等人，JBC. 286:21239-21253，2011)。伴侣产生的大量增加降低典型ER应激通路的激活，折叠错误折叠的蛋白质，并且已被证实在体内模型(包括ALS的G93A SOD1小鼠模型)中提高生存期(参见例如Ryu, H等人，J Neurochem. 93:1087-1098，2005)。

在一些实施方案中，胆汁酸(例如，TURSO)或其药用盐与苯丁酸化合物(例如，苯丁酸钠)的组合在以特定比率(例如，本文描述的任何比率)给药时在治疗与ALS相关的一种或多种症状方面具有协同功效。所述组合可以例如通过同时抑制内质网应激和线粒体应激通过线性建模在强氧化性损伤模型(H₂O₂介导的毒性)中诱导神经元活力的数学上协同的增加(参见例如美国专利号9,872,865和美国专利号10,251,896)。

制剂

本文描述的胆汁酸和苯丁酸化合物可以配制为用作药物组合物或在药物组合物中使用。例如，本文描述的方法可以包括施用有效量的包含TURSO和苯丁酸钠的组合物。如本文中使用的，术语“有效量”是指一种或多种药物在一段时间内(包括急性或慢性施用和定期或连续施用)在其施用的背景下有效地引起预期效果或生理结局的量或浓度。组合物可以包含约5%至约15% w/w(例如，约6%至约14%、约7%至约13%、约8%至约12%、约8%至约11%、约9%至约10%或约9.7% w/w)的TURSO和约15%至约45% w/w(例如，约20%至约40%、约25%至约35%、约28%至约32%或约29%至约30%，例如约29.2% w/w)的苯丁酸钠。在一些实施方案中，组合物包含约9.7% w/w的TURSO和29.2% w/w的苯丁酸钠。

苯丁酸钠和TURSO可以以约1:1至约4:1(例如，约2:1或约3:1)的重量比存在于组合物中。在一些实施方案中，苯丁酸钠和TURSO之间的比率为约3:1。

本文描述的组合物可以包含任何药用载体、佐剂和/或赋形剂。术语“药用载体或佐剂”是指这样的载体或佐剂，其可以与本文公开的化合物一起施用至患者，并且当以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时不会破坏其药理活性并且是无毒的。如本文中使用的，措辞“药用载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物组合物可以含有任何常规的无毒药用载体、佐剂或赋形剂。在一些情况下，制剂的pH可以用药用酸、碱或缓冲剂调节以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。

本公开内容的组合物可以包含约8%至约24% w/w的葡萄糖结合剂(葡聚糖结合剂，dextrates)(例如，约9%至约23%、约10%至约22%、约10%至约20%、约11%至约21%、约12%至约20%、约13%至约19%、约14%至约18%、约14%至约17%、约15%至约16%或约15.6% w/w的葡萄糖结合剂)。本文考虑了无水和水合的葡萄糖结合剂二者。本公开内容的葡萄糖结合剂可以包括由淀粉的受控酶促水解产生的糖的混合物。本文描述的任何组合物的一些实施方案包括水合的葡萄糖结合剂(例如，NF级，从JRS Pharma、Colonial Scientific或Quadra获得)。

本公开内容的组合物可以包含约1%至约6% w/w的糖醇(例如，约2%至约5%、约3%至约4%或约3.9% w/w的糖醇)。糖醇可以衍生自糖并且含有与各碳原子连接的一个羟基(-OH)。二糖和单糖均可以形成糖醇。糖醇可以是天然的或通过糖的氢化产生的。示例性糖醇包括但不限于山梨糖醇、木糖醇和甘露糖醇。在一些实施方案中，组合物包含约1%至约6%w/w(例如，约2%至约5%、约3%至约4%或约3.9% w/w)的山梨糖醇。

本公开内容的组合物可以包含约22%至约35% w/w的麦芽糊精(例如，约22%至约33%、约24%至约31%、约25%至约32%、约26%至约30%或约28%至约29% w/w，例如约28.3% w/w的麦芽糊精)。麦芽糊精可以形成柔性螺旋，从而能够使活性成分(例如，本文描述的任何苯丁酸化合物和胆汁酸)在溶解到溶液中时被俘获，由此掩盖活性成分的味道。本文考虑了由任何合适来源产生的麦芽糊精，包括但不限于豌豆、大米、木薯、玉米和马铃薯。在一些实施方案中，麦芽糊精是豌豆麦芽糊精。在一些实施方案中，组合物包含约28.3% w/w的豌豆麦芽糊精。例如，可以使用从Roquette (KLEPTOSE® LINECAPS)获得的豌豆麦芽糊精。

本文描述的组合物还可以包含糖替代品(例如三氯蔗糖)。例如，组合物可以包含约0.5%至约5% w/w的三氯蔗糖(例如，约1%至约4%、约1%至约3%或约1%至约2%，例如约1.9%w/w的三氯蔗糖)。本文考虑的其他糖替代品包括但不限于阿斯巴甜(aspartame)、纽甜(neotame)、乙酰磺胺酸钾、糖精和爱德万甜(advantame)。

在一些实施方案中，组合物包含一种或多种调味剂。组合物可以包含约2%至约15%w/w的调味剂(例如，约3%至约13%、约3%至约12%、约4%至约9%、约5%至约10%或约5%至约8%，例如约7.3% w/w)。调味剂可以包括赋予另一种物质风味或通过影响其味道来改变组合物特性的物质。调味剂可以用于掩盖令人不快的味道而不影响物理和化学稳定性，并且可以基于要掺入的药物的味道进行选择。合适的调味剂包括但不限于天然调味物质、人工调味物质和仿制风味剂。也可使用调味剂的共混物。例如，本文描述的组合物可以包含两种或更多种(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)调味剂。调味剂可以是在水中可溶的且稳定的。合适的调味剂的选择可以基于味道测试。例如，可以将多种不同的调味剂分别添加到组合物中，对其进行味道测试。示例性调味剂包括任何水果风味粉末(例如，桃、草莓、芒果、橙、苹果、葡萄、覆盆子、樱桃或混合浆果风味粉末)。本文描述的组合物可以包含约0.5%至约1.5% w/w(例如，约1% w/w)的混合浆果风味粉末和/或约5%至约7% w/w(例如，约6.3% w/w)的掩盖风味剂。合适的掩盖风味剂可以从例如Firmenich获得。

本文描述的组合物还可以包含二氧化硅(silicon dioxide)(或二氧化硅(silica))。向组合物中添加二氧化硅可以防止或减少组合物中的组分的聚集。二氧化硅可以用作抗结块剂、吸附剂、崩解剂或助流剂。在一些实施方案中，本文描述的组合物包含约0.1%至约2% w/w的多孔二氧化硅(例如，约0.3%至约1.5%、约0.5%至约1.2%或约0.8%至约1%，例如0.9% w/w)。与气相二氧化硅相比，多孔二氧化硅在约20%或更高(例如，约25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高)的相对湿度下可以具有更高的H₂O吸收能力和/或更高的孔隙率。多孔二氧化硅在约50%的相对湿度下可以具有按重量计约5%至约40%(例如约20%至约40%或约30%至约40%)的H₂O吸收能力。与气相二氧化硅相比，多孔二氧化硅在约20%或更高(例如约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的相对湿度下可以具有更高的孔隙率。在一些实施方案中，多孔二氧化硅的平均粒度为约2 µm至约10 µm(例如约3 µm至约9 µm、约4 µm至约8 µm、约5 µm至约8 µm或约7.5 µm)。在一些实施方案中，多孔二氧化硅的平均孔体积为约0.1 cc/gm至约2.0 cc/gm(例如约0.1 cc/gm至约1.5 cc/gm、约0.1 cc/gm至约1 cc/gm、约0.2 cc/gm至约0.8 cc/gm、约0.3 cc/gm至约0.6 cc/gm或约0.4 cc/gm)。在一些实施方案中，多孔二氧化硅的堆密度为约50 g/L至约700 g/L(例如约100 g/L至约600 g/L、约200 g/L至约600 g/L、约400 g/L至约600 g/L、约500 g/L至约600 g/L、约540 g/L至约580 g/L或约560 g/L)。在一些实施方案中，本文描述的组合物包含约0.05%至约2% w/w(例如，本文描述的这个范围的任何子范围)的Syloid®63FP (WR Grace)。

本文描述的组合物还可以包含一种或多种缓冲剂。例如，组合物可以包含约0.5%至约5% w/w的缓冲剂(例如，约1%至约4% w/w、约1.5%至约3.5% w/w或约2%至约3% w/w，例如约2.7% w/w的缓冲剂)。缓冲剂可以包括在添加另一种酸或碱后将组合物的酸度或pH维持在选定值附近的弱酸或弱碱。合适的缓冲剂是本领域已知的。在一些实施方案中，本文提供的组合物中的缓冲剂是磷酸盐，诸如磷酸钠(例如，无水磷酸氢二钠)。例如，组合物可以包含约2.7% w/w的磷酸氢二钠。

组合物还可以包含一种或多种润滑剂。例如，组合物可以包含约0.05%至约1% w/w的润滑剂(例如，约0.1%至约0.9%、约0.2%至约0.8%、约0.3%至约0.7%或约0.4%至约0.6%，例如约0.5% w/w的润滑剂)。示例性润滑剂包括但不限于硬脂酰富马酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸、金属硬脂酸盐、滑石、具有高熔点的蜡和甘油酯、胶体二氧化硅、聚乙二醇、烷基硫酸盐、山嵛酸甘油酯和氢化油。另外的润滑剂是本领域已知的。在一些实施方案中，组合物包含约0.05%至约1% w/w(例如，本文描述的这个范围的任何子范围)的硬脂酰富马酸钠。例如，组合物可以包含约0.5% w/w的硬脂酰富马酸钠。

在一些实施方案中，组合物包含约29.2% w/w的苯丁酸钠、约9.7% w/w的TURSO、约15.6% w/w的葡萄糖结合剂、约3.9% w/w的山梨糖醇、约1.9% w/w的三氯蔗糖、约28.3% w/w的麦芽糊精、约7.3% w/w的调味剂、约0.9% w/w的二氧化硅、约2.7% w/w的磷酸钠(例如磷酸氢二钠)和约0.5% w/w的硬脂酰富马酸钠。

组合物可以包含约3000 mg的苯丁酸钠、约1000 mg的TURSO、约1600 mg的葡萄糖结合剂、约400 mg的山梨糖醇、约200 mg的三氯蔗糖、约97.2 mg的二氧化硅、约2916 mg的麦芽糊精、约746 mg的调味剂(例如约102 mg的混合浆果风味剂和约644 mg的掩盖风味剂)、约280 mg的磷酸钠(例如磷酸氢二钠)和约48.6 mg的硬脂酰富马酸钠。

组合物还可以包含另外的合适的甜味剂或掩味剂，诸如但不限于木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、右旋糖、蔗糖、麦芽糖、甜菊糖苷(steviol glycosides)、部分水解淀粉和玉米糖浆固体。本文考虑了水溶性人工甜味剂，诸如可溶性糖精盐(例如，钠或钙糖精盐)、环拉酸盐(cyclamate salts)、乙酰磺胺酸钾(安赛蜜(acesulfame K))以及基于游离酸形式的糖精和阿斯巴甜的甜味剂诸如L-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯、Alitame®或Neotame®。甜味剂或掩味剂的量可以随着针对特定最终组合物所选择的甜味剂或掩味剂的所需量而变化。

除了上述那些之外，还考虑了药用粘合剂。实例包括：纤维素衍生物，包括微晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素(例如 LH 22、LH 21、LH 20、LH 32、LH 31、LH30)；淀粉，包括马铃薯淀粉；交联羧甲基纤维素钠(即交联的羧甲基纤维素钠盐；例如Ac-Di-Sol®)；藻酸或藻酸盐；不溶性聚乙烯吡咯烷酮(例如 Polyvidon® CL、Polyvidon® CL-M、Kollidon®CL、Polyplasdone® XL、Polyplasdone® XL-10)；以及羧甲基淀粉钠(例如Primogel®和Explotab®)。

可以掺入另外的填充剂、稀释剂或粘合剂，诸如多元醇、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、Erythritol®、Tagatose®、乳糖(例如，喷雾干燥乳糖、α-乳糖、β-乳糖、Tabletose®、各种等级的Pharmatose®、Microtose或Fast-Floc®)、微晶纤维素(例如，各种等级的Avicel®，诸如Avicel® PH101、Avicel® PH102或Avicel® PH105、Elcema® P100、Emcocel®、Vivacel®、Ming Tai®和Solka-Floc®)、羟丙基纤维素、L-羟丙基纤维素(低取代的)(例如 L-HPC-CH31、L-HPC-LH11、LH 22、LH 21、LH 20、LH 32、LH 31、LH30)、糊精、麦芽糊精(例如Lodex® 5和Lodex® 10)、淀粉或改性淀粉(包括马铃薯淀粉、玉米淀粉和大米淀粉)、氯化钠、磷酸钠、硫酸钙和碳酸钙。

本文描述的组合物可以配制为或调整为经由任何途径(例如，美国食品和药品管理局(FDA)批准的任何途径)施用至受试者。FDA的CDER数据标准手册(版本号004)(其可在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.html获得)描述了示例性方法。

药物组合物典型地被配制成与其预期的施用途径兼容。施用途径的实例包括肠胃外(皮下、皮内、静脉内、真皮内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术)、口服(例如，吸入或通过饲管)、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。

药物组合物可以为用于吸入和/或经鼻施用的溶液或粉末形式。在一些实施方案中，药物组合物被配制为粉末填充小袋。合适的粉末可以包括基本上可溶于水的那些粉末。药物组合物可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(诸如例如吐温80(Tween 80))和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的赋形剂和溶剂之中有甘露糖醇、水、林格溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然药用油也是如此，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂或者羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于药用剂型诸如乳剂和/或混悬剂的配制。其他常用的表面活性剂(诸如吐温或司盘(Span))和/或通常用于制造药用固体、液体或其他剂型的其他类似的乳化剂或生物利用度增强剂也可以用于配制的目的。

组合物可以以任何口服可接受的剂型经口施用，所述剂型包括但不限于粉剂、胶囊、片剂、乳剂和水性混悬剂、分散体和溶液。在用于经口施用的粉剂的情况下，粉剂可以在施用前充分溶解在水中。在用于经口使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。可以添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的经口施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当经口施用水性混悬剂和/或乳剂时，活性成分可以悬浮或溶解在油相中(与乳化剂和/或悬浮剂组合)。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

备选地或另外地，组合物可以通过鼻气雾剂或吸入施用。这样的组合物根据药物制剂领域众所周知的技术制备，并且可以制备为盐水中的溶液，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以增强生物利用度、氟碳化合物和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。

在一些实施方案中，本文公开的治疗组合物可以被配制用于在美国销售、进口到美国和/或从美国出口。药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。在一些实施方案中，本发明提供了包括胆汁酸和苯丁酸化合物的试剂盒。试剂盒还可以包括医生用说明书和/或患者用说明书、注射器、针头、盒、瓶、小瓶等。

III. 治疗的方法/药代动力学

在一个方面，本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的至少一种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，其中所述方法包括：(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者具有对于苯丁酸钠的特定水平的C_max、AUC_0-最后和/或AUC_0-∞，和/或对于代谢物苯乙酸的特定水平的C_max、AUC_0-最后和/或AUC_0-∞；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。

所述方法可以包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约3至约425 µg/mL(例如约10至约425、约20至约425、约30至约425、约40至约425、约50至约425、约60至约425、约70至约425、约80至约425、约100至约425、约150至约425、约200至约425、约300至约425、约90至约170或约110至约150 µg/mL) 的C_max。

苯丁酸钠可以通过代谢(肝脏和肾脏中的β-氧化)为主要代谢物苯乙酸(PAA)而迅速清除。因此，所述方法可以包括确定受试者具有对于苯乙酸约5至约50 µg/mL(例如约9至约45、约9至约40或约15至约35 µg/mL)的C_max。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，C_max是稳态C_max(例如，稳态平均C_max)。

所述方法可以包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约20至约550 μg*h/mL(例如约40至约500、约60至约450、约80至约400、约100至约350或约140至约300 μg*h/mL)的AUC_0-最后。所述方法还可以包括确定受试者具有对于苯乙酸约20至约160 μg*h/mL(例如约30至约150、约40至约120或约40至约80 μg*h/mL)的AUC_0-最后。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，AUC_0-最后是稳态AUC_0-最后(例如，稳态平均AUC_0-最后)。

在一些情况下，所述方法包括确定受试者具有(1)对于苯丁酸钠约25至约545 μg*h/mL的AUC_0-∞，和/或(2)对于苯乙酸约21至约155 μg*h/mL的AUC_0-∞。例如，所述方法可以包括确定受试者具有对于苯丁酸钠约40至约500、约60至约450、约80至约400、约100至约350或约140至约300 μg*h/mL的AUC_0-∞。所述方法还可以包括确定受试者具有对于苯乙酸约30至约150、约40至约120或约40至约80 μg*h/mL的AUC_0-∞。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，AUC_0-∞是稳态AUC_0-∞(例如，稳态平均AUC_0-∞)。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)可以包括每天一次或每天两次施用组合物，持续约1天至约40周(例如约3天至约38周、约1周至约34周、约3周至约32周、约4周至约32周、约6周至约32周、约8周至约32周、约10周至约32周、约10周至约26周或约12周至约24周)。例如，可以每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。在一些情况下，每天一次施用组合物，持续约3周，随后每天两次施用组合物，持续约9周至约21周。

本文描述的方法的步骤(b)可以包括在组合物的最后剂量之后约30分钟至约8小时(例如约1、2、3、4、5、6或7小时)从受试者获得血液样品。

在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，或向具有ALS的至少一种症状的受试者施用TURSO和苯丁酸钠的方法，所述方法包括(a)向受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；(b)确定受试者中的一种或多种胆汁酸的血浆浓度；以及(c)向受试者施用另外剂量的组合物。例如，所述方法可以包括确定TURSO、UDCA、GUDCA、胆酸(CA)、CDCA(鹅去氧胆酸)、DCA(去氧胆酸)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)或牛磺去氧胆酸(TDCA)的血浆浓度。在一些实施方案中，血浆浓度是稳态血浆浓度。在一些实施方案中，步骤(b)可以包括在组合物的最后剂量之后约30分钟至约8小时(例如约1、2、3、4、5、6或7小时)确定血浆浓度。

在以上方面的一些实施方案中，所述方法包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的TURSO的血浆浓度，其中TURSO的血浆浓度为约20至约2570 ng/mL(例如约20至约2000、约20至约1800、约20至约1500、约20至约1100、约20至约1045、约40至约800、约60至约700或约88至约540 ng/mL)。TURSO的血浆浓度也可以在组合物的最后剂量之后约4小时确定，其中血浆浓度为约20至约3250 ng/mL(例如约20至约2800、约20至约2500、约20至约2000、约20至约1800、约20至约1500、约20至约1200、约20至约1125、约50至约1000、约80至约900、约100至约800或约155至约785 ng/mL)。

在以上方面的一些实施方案中，所述方法包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的UDCA的血浆浓度，其中UDCA的血浆浓度为约20至约6020 ng/mL(例如约约20至约5500、约20至约5000、约20至约4500、约20至约4000、约20至约3500、约20至约3000、约20至约2500、约20至约2000、约20至约1955、约50至约1800、约80至约1500或约285至约1125 ng/mL)。UDCA的血浆浓度也可以在组合物的最后剂量之后约4小时确定，其中血浆浓度为约20至约7340 ng/mL(例如约20至约7000、约20至约6000、约20至约5000、约20至约4000、约20至约3000、约20至约2550、约50至约2000、约100至约1500或约305至约1395 ng/mL)。

在以上方面的一些实施方案中，所述方法包括在组合物的最后剂量之后约一小时确定受试者中的GUDCA的血浆浓度，其中GUDCA的血浆浓度为约20至约4600 ng/mL(例如约20至约4000、约20至约3500、约20至约3000、约40至约2500、约65至约2085或约340至约1635ng/mL)。GUDCA的血浆浓度也可以在组合物的最后剂量之后约4小时确定，其中血浆浓度为约20至约5290 ng/mL(例如约40至约4500、约80至约4000、约150至约3500、约320至约2315ng/mL或约530至约1915 ng/mL)。

在以上方面的一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)之前确定受试者中的胆汁酸的基线血浆浓度。例如，所述方法可以包括确定受试者中的TURSO的基线血浆浓度，其中TURSO的基线血浆浓度为约20至约577 ng/mL(例如约20至约400、约20至约300、约20至约200或约20至约125 ng/mL)。所述方法可以包括确定受试者中的UDCA的基线血浆浓度，其中UDCA的基线血浆浓度为约20至约5970 ng/mL(例如约20至约5000、约20至约4000、约20至约3000、约20至约2000、约20至约1000、约20至约825、约20至约500或约20至约52 ng/mL)。所述方法可以包括确定受试者中的GUDCA的基线血浆浓度，其中GUDCA的基线血浆浓度为约20至约4540 ng/mL(例如约20至约4000、约20至约3000、约20至约2000、约20至约755或约25至约180 ng/mL)。

在本文描述的任何方法的一些实施方案中，受试者在接受一定剂量的组合物之前已禁食一段时间。例如，所述方法的步骤(a)可以包括在受试者已摄入食物之后超过两小时或在受试者摄入食物之前超过一小时施用一定剂量的组合物。在一些实施方案中，受试者在接受组合物的施用的两小时内(例如一小时内或30分钟内)已摄入食物。

在另一个方面，本文提供了增加受试者中的胆汁酸(例如本文描述的任何胆汁酸)的血浆浓度的方法，所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的包含约3克的苯丁酸钠和约1克的TURSO的组合物。组合物可以根据本文公开的任何合适的给药方案施用。在一些实施方案中，胆汁酸选自TURSO、UDCA和GUDCA。例如，胆汁酸可以是TURSO，并且在施用组合物之后TURSO的血浆浓度为约20至约3250 ng/mL(例如本文描述的这个范围内的任何子范围)。胆汁酸可以是UDCA，并且在施用组合物之后UDCA的血浆浓度为约20至约7340 ng/mL(例如本文描述的这个范围内的任何子范围)。胆汁酸也可以是GUDCA，并且在施用组合物之后GUDCA的血浆浓度为约20至约5290 ng/mL(例如本文描述的这个范围内的任何子范围)。

本文还提供了向已禁食24小时的受试者(例如健康受试者)施用包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物并且测量一个或多个药代动力学参数(诸如T_max、C_max和AUC_0-最后)的方法。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约0.25小时至约0.50小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约64.4 µg/mL至约260 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约73.5 µg*h/mL至约423 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约74.8 µg*h/mL至约425 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约1.50小时至约10.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约0.219 µg/mL至约1.74 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约1.18 µg*h/mL至约11.6 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约1.80 µg*h/mL至约6.67 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在上述任何实施方案中，T_max可以是稳态T_max(例如，稳态平均T_max)。在上述任何实施方案中，C_max可以是稳态C_max(例如，稳态平均C_max)。在上述任何实施方案中，AUC_(0-最后)可以是稳态AUC_(0-最后)(例如，稳态平均AUC_(0-最后))。在上述任何实施方案中，AUC_(0-∞)可以是稳态AUC_(0-∞)(例如，稳态平均AUC_(0-∞))。

本文还提供了向已禁食24小时的受试者(例如健康受试者)施用包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物并且测量苯丁酸钠和/或TURSO的一种或多种代谢物的一个或多个药代动力学参数(诸如T_max、C_max和AUC_0-最后)的方法。具体地，苯乙酸被认为是苯丁酸钠的代谢物。此外，在生理条件下，肠肝再循环导致TURSO通过肠道菌群主动脱缀合为UDCA，并且在肝脏中将UDCA与甘氨酸或牛磺酸重新缀合(分别为GUDCA和TURSO)。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约1.50小时至约3.50小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约13.3 µg/mL至约42.3 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约43.8 µg*h/mL至约141 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约45.2 µg*h/mL至约142 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约0.25小时至约20.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约195 ng/mL至约1380 ng/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约1970ng*h/mL至约14900 ng*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约11300ng*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约6.00小时至约20.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约143 ng/mL至约1420 ng/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约1840 ng*h/mL至约12000 ng*h/mL的AUC_(0-最后)。在上述任何实施方案中，T_max可以是稳态T_max(例如，稳态平均T_max)。在上述任何实施方案中，C_max可以是稳态C_max(例如，稳态平均C_max)。在上述任何实施方案中，AUC_(0-最后)可以是稳态AUC_(0-最后)(例如，稳态平均AUC_(0-最后))。在上述任何实施方案中，AUC_(0-∞)可以是稳态AUC_(0-∞)(例如，稳态平均AUC_(0-∞))。

本文还提供了向已摄入高脂肪膳食的受试者(例如健康受试者)施用包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物并且测量一个或多个药代动力学参数(诸如T_max、C_max和AUC_0-最后)的方法。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约0.25小时至约1.50小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约12.9 µg/mL至约70.5 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约34.6 µg*h/mL至约198 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于苯丁酸钠约76.2 µg*h/mL至约200 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约4.50小时至约10.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约0.435 µg/mL至约2.16 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约2.45 µg*h/mL至约22.4 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于TURSO约3.09 µg*h/mL至约5.83 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在上述任何实施方案中，T_max可以是稳态T_max(例如，稳态平均T_max)。在上述任何实施方案中，C_max可以是稳态C_max(例如，稳态平均C_max)。在上述任何实施方案中，AUC_(0-最后)可以是稳态AUC_(0-最后)(例如，稳态平均AUC_(0-最后))。在上述任何实施方案中，AUC_(0-∞)可以是稳态AUC_(0-∞)(例如，稳态平均AUC_(0-∞))。

本文还提供了向已摄入高脂肪膳食的受试者(例如健康受试者)施用包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物并且测量苯丁酸钠和/或TURSO的一种或多种代谢物的一个或多个药代动力学参数(诸如T_max、C_max和AUC_0-最后)的方法。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约2.00小时至约4.50小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约8.39 µg/ml至约36.5 µg/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约30.6 µg*h/mL至约128 µg*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于苯乙酸约31.3 µg*h/mL至约130 µg*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约6.00小时至约24.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约181 ng/mL至约6250 ng/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约1590 ng*h/mL至约33400 ng*h/mL的AUC_(0-最后)。在一些实施方案中，受试者具有对于UDCA约8580 ng*h/mL的AUC_(0-∞)。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约0.50小时至约24.00小时的T_max。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约114 ng/mL至约2430 ng/mL的C_max。在一些实施方案中，受试者具有对于GUDCA约900 ng*h/mL至约18400 ng*h/mL的AUC_(0-最后)。在上述任何实施方案中，T_max可以是稳态T_max(例如，稳态平均T_max)。在上述任何实施方案中，C_max可以是稳态C_max(例如，稳态平均C_max)。在上述任何实施方案中，AUC_(0-最后)可以是稳态AUC_(0-最后)(例如，稳态平均AUC_(0-最后))。在上述任何实施方案中，AUC_(0-∞)可以是稳态AUC_(0-∞)(例如，稳态平均AUC_(0-∞))。

实施例

将通过具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例仅为了说明性目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键参数，这些参数可以改变或修改以产生基本上相同的结果。应理解的是，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。

实施例1：药代动力学研究

AMX0035的药代动力学基于来自以下两项研究的血浆浓度数据：在健康志愿者中的单剂量PK研究，以及在临床功效和安全性研究中对患者的稀疏取样。

方案

1.方案AMX3500：AMX0035(苯丁酸(PB)和牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的一种固定组合)用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的安全性、耐受性、功效和活性的评价。

•28周的多中心、随机、双盲、安慰剂对照的II期试验，考查AMX0035的安全性、耐受性、功效、药代动力学和生物活性。

•群体：年龄为18至80岁的132名男性或女性，患有散发性或家族性ALS，肺活量>预测值的60%，并且在过去18个月内有ALS症状发作。

•治疗：受试者按2:1的比率随机分配以接受口服(或饲管)AMX0035(大约88名受试者)或安慰剂(大约44名受试者)。治疗以每天一小袋施用，持续最初3周，然后如果耐受的话，则增加到每天两次一小袋。活性治疗组中的小袋含有1 g TUDCA和3 g PB。

•药代动力学取样：在基线访问(给药前)以及12周和24周治疗访问时采集单个血液样品，用于PB、苯乙酸(PAA)、TUDCA、UDCA和GUDCA血浆浓度的分析。取样时间随机分配为在12周访问时的给药后1小时或4小时进行，以及在24周访问时的另一个时间进行。

•治疗持续时间：24周。

2.方案A35-002：在健康志愿者中在禁食和进食状态下单剂量口服AMX0035的I期研究，以评价血浆药代动力学。

•健康成年志愿者中的AMX-0035的I期、开放标签、两期交叉单剂量试验，考查在具有和不具有食物的情况下在AMX-0035的单次口服剂量施用后PB、TUDCA和主要代谢物的药代动力学。

•群体：年龄为40至65岁并且体重指数为18.5至32 kg/m2的14名男性或女性健康志愿者。

•治疗：受试者在禁食(过夜和给药后4小时)和进食(给药前30分钟的标准高脂肪早餐)条件下接受单个剂量的一小袋(1 g TUDCA和3 g PB)的AMX0035，其中在治疗之间具有最少4天的洗脱期(washout)。在具有或不具有食物的情况下的施用的顺序是随机确定的。

•药代动力学取样：在给药前以及在两个研究日中在AMX0035的单个剂量后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、10、12、16、20和24小时采集血液样品，用于PB、PAA、TUDCA、UDCA和GUDCA血浆浓度的分析。另外，在AMX0035的第一个剂量的前一天获得连续血浆样品，以表征TUDCA和代谢物的内源性浓度。

药代动力学数据特性

•方案AMX3500：对87名患有ALS的患者进行稀疏取样。在12和24周的治疗后在给药后1或4小时对每位患者采集大约2个样品。

•方案A35-002：对14名健康成人进行丰富取样。在两种情形下为每位受试者在24小时内采集大约21个样品，一次是在高脂肪餐后并且另一次是在禁食条件下。

结果

苯丁酸钠(PB)的主要代谢物是苯乙酸(PAA)。PAA作为苯丙氨酸代谢物内源性地出现。群体PK分析表明，PAA具有非线性(可饱和)消除。

群体PK分析已显示出在PAA暴露与体重之间的反比关系。就增加的PAA暴露而言，存在禁食至低体重的潜在相加作用。

TURSO、UDCA(熊去氧胆酸(ursodiol))和GUDCA(甘氨熊去氧胆酸)是天然存在的亲水性胆汁酸，并且代表人体中总胆汁酸池的一小部分。所有这三种物质都经历广泛的肠肝循环。TURSO的经口施用导致所有这三种物质的血浆水平升高。

在健康受试者中在禁食条件下在ALBRIOZA的单个剂量之后对于苯丁酸和主要代谢物PAA的药代动力学参数在表1中示出，并且对于熊去氧胆酰牛磺酸(牛磺熊去氧胆酸，ursodoxicoltaurine)及其代谢物的药代动力学参数在表2中示出。

表1：在禁食条件下在n=14健康受试者中在ALBRIOZA (3 g苯丁酸和1 g熊去氧胆酰牛磺酸)的单个口服剂量之后苯丁酸(PB)和苯乙酸(PA)的几何平均(CV%)药代动力学参数

Cmax=最大血浆浓度；Tmax=到最大浓度的时间；T1/2=半衰期；AUC(0-inf)=从时间0到无穷大的浓度-时间曲线下面积；CL/F =口服清除率；Vz/F=表观分布容积。

*中值(范围)。

**终末期T1/2，基于群体PK分析，代谢物看起来具有非线性(可饱和)消除。

NA：不适用。

表2：在禁食条件下在n=14健康受试者中在ALBRIOZA (1 g熊去氧胆酰牛磺酸和3g苯丁酸)的单个口服剂量之后熊去氧胆酰牛磺酸(TURSO)及衍生物UDCA和GUDCA的几何平均(CV%)药代动力学参数*

Cmax=最大血浆浓度；Tmax=到最大浓度的时间；T1/2=半衰期；AUC(0-最后)=从时间0到最后测量浓度的浓度-时间曲线下面积(样品采集于给药后24小时)；CL/F=口服清除率；Vz/F=表观分布容积。

*来源于时间匹配、基线校正的血浆浓度以考虑内源性水平的PK参数。

**中值(范围)。

***由于在终末消除阶段中采集的样品数量不足，对PK参数值有贡献的受试者的数量减少。

NC=由于终末消除阶段中采集的样品数量不足而没有计算。

NA=不适用。

表3示出了在ALS患者中在每日两次施用ALBRIOZA之后熊去氧胆酰牛磺酸、UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度。TURSO的经口施用导致所有这三种物质的血浆水平升高。

表3：在ALS患者中在每日两次施用AMX0035之后TURSO、UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度

*将作为低于可测量水平(<20 ng/ml)记录的血浆水平设定在20 ng/ml。对于除给药前(基线)以外的所有血浆浓度值：具有低于可测量水平的样品的最大数量为10个。

吸收：

在禁食条件下在健康受试者中在经口施用AMX0035的单个剂量后(如以上实施例2中所述)，苯丁酸钠被快速吸收，并且经过1小时的中值时间达到188 µg/mL的平均C_max(范围为64.4至260)。基于群体PK，对于ALS患者，苯丁酸钠的估算稳态平均C_max为131 µg/mL(范围为3.8至423)。

在生理条件下，肠道中的胆汁酸主要在远端部分(回肠)经由被动扩散(未缀合的胆汁酸)以及通过顶端钠依赖性转运蛋白(ASBT)的主动吸收(缀合的胆汁酸)被吸收。肠道肠细胞中的特定转运蛋白确保胆汁酸经由门静脉被引导到肝脏，在那里它们经历广泛的肠肝再循环。胆汁酸可以每天在肝脏中的肝细胞和肠道中的肠细胞之间循环4至12次。在禁食条件下在健康受试者中在经口施用AMX0035的单个剂量后，经过4.5小时的中值时间，TURSO达到871 ng/mL的平均C_max(范围为219至1740)。许多受试者中的TURSO血浆浓度分布曲线具有2至3个峰值，与餐食/零食后的胆汁酸储存和释放一致。

食物的影响

在高脂肪、高热量餐食(大约800-1000卡路里：500-600、250和150卡路里分别来自脂肪、碳水化合物和蛋白质)的情况下向健康志愿者施用单个剂量的3 g苯丁酸钠和1 gTURSO降低了苯丁酸钠的吸收速率和程度(Cmax和AUC分别下降75%和55%)。高脂肪、高热量餐食不影响TURSO的Cmax，但是暴露(AUC)增加了46%。在II期安全性和功效研究中，建议患者在餐前服用药物。

分布

在体外共同施用时，苯丁酸钠和熊去氧胆酰牛磺酸的血浆蛋白结合分别为82%和98%。

在生理条件下，总胆汁酸池中少于10%到达全身循环，因为肝脏从肝循环中清除大部分以供再利用。胆汁酸的血清浓度反映了肠道输入和肝脏提取之间的平衡，其中已知缀合胆汁酸的肝脏提取比未缀合胆汁酸更有效。

代谢：

苯丁酸钠通过代谢(肝脏和肾脏中的β-氧化)为主要代谢物苯乙酸(PAA)而迅速清除，所述主要代谢物苯乙酸(PAA)可能具有药理活性。在所有13名给药受试者中，健康受试者中的代谢物PAA的血浆浓度自0.25小时起是明显的，经过2.5小时的中值时间达到26.44µg/mL的平均C_max(范围为13.3至42.3)。基于群体PK分析，ALS患者的估算稳态平均C_max为24.1 µg/mL(范围为9.08至46.3)。

苯乙酸在肝脏和肾脏中经由乙酰化迅速与谷氨酰胺缀合，以形成苯乙酰谷氨酰胺，其由肾脏排泄。

在生理条件下，肠肝再循环导致TURSO通过肠道菌群主动脱缀合为UDCA，并且UDCA在肝脏中与甘氨酸或牛磺酸重新缀合(分别为GUDCA和熊去氧胆酰牛磺酸)；肠道中约95%的胆汁酸被(重新)吸收进入肠肝循环。在体外在人肝细胞中检测到的所有归因于TURSO的代谢物也在大鼠和小型猪肝细胞中检测到。

消除

苯乙酸表现出特征在于可饱和代谢的非线性药代动力学。在给药后6小时，苯丁酸和苯乙酸均从全身循环中消除，其中估算的终末半衰期分别为0.46 h和0.81 h。基于PB和PA的这种迅速消除，在患者中每天一次或两次给药后，在血浆中不存在蓄积。已鉴别了苯丁酸的其他次要代谢物。施用的苯丁酸钠中的大部分(~80-100%)在24小时内作为缀合产物苯乙酰谷氨酰胺在尿液中排泄。

在大多数受试者中无法可靠地确定胆汁酸的终末半衰期，这主要是由于在终末消除阶段中取样持续时间不足(也参见上表6和7)。跨研究的比较(单剂量药代动力学研究，以及来自II期安全性和功效研究的稀疏取样数据)表明，在每天两次给药后看起来熊去氧胆酰牛磺酸的蓄积很少，而UDCA和GUDCA的蓄积相当多。

未在肠道中(重新)吸收的胆汁酸(在生理条件下为5%)通过细菌进一步改性，然后主要在粪便中排泄。粪便中发现的胆汁酸是未缀合的，并且主要由疏水性次级胆汁酸石胆酸和去氧胆酸以及其他成分的复杂混合物组成。在施用熊去氧胆酰牛磺酸的情况下，已知粪便中的UDCA水平会升高。

特殊群体和病况

•老年病学

基于模型的分析表明，在年龄为65至76岁的ALS患者与年龄小于65岁的ALS患者(数据集中包括的患者数量分别为：n=18与n=39)中，在苯丁酸钠或其代谢物苯乙酸的药代动力学方面不存在显著差异。在年龄为65至76岁的ALS患者与年龄小于65岁的ALS患者(数据集中包括的患者数量分别为：n=24-27与n=78-82)中，在熊去氧胆酰牛磺酸或其主要衍生物UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度方面不存在差异。

•性别

在向健康志愿者单次经口施用ALBRIOZA后，在男性(N=8)和女性(N=6)之间观察到在对苯丁酸钠和苯乙酸的暴露方面的差异，其在进食和禁食条件下是一致的，当与男性相比时，女性中的暴露水平分别高了约35%和31%。然而，由于受试者之间的中等可变性，发现这种差异并不具有统计学显著性。类似地，在健康受试者和ALS患者(N=26名女性和56名男性对数据集有贡献)中的跨研究的药物计量学分析中，性别未被鉴别为影响苯丁酸钠或苯乙酸PK参数的显著协变量。

在向健康志愿者单次经口施用ALBRIOZA后，在男性(N=8)和女性(N=6)之间观察到在对熊去氧胆酰牛磺酸和UDCA的暴露方面的差异，其在两种食物条件下是一致的：当与男性相比时，看到女性对于熊去氧胆酰牛磺酸的暴露高了约55%，而女性对于UDCA的暴露低了约29%。这种影响仅对熊去氧胆酰牛磺酸AUC(0-最后)具有统计学显著性。对于GUDCA并未看到这样的影响。在ALS患者(N=34名女性；75名男性)中，性别对熊去氧胆酰牛磺酸、UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度不存在一致的可辨别的影响。

•肝功能不全

由于苯丁酸钠和熊去氧胆酰牛磺酸在肝脏和肾脏中代谢，因此在肝损伤的情况下，预期血浆水平升高。熊去氧胆酰牛磺酸及其衍生物(诸如UDCA和GUDCA)是胆盐，并且通过肠肝再循环被循环并且储存在胆囊中。石胆酸(肠道中的胆汁酸代谢的产物之一)已知具有强毒性。虽然在2期安全性和功效研究中并未观察到，但是据报道在TURSO施用的情况下石胆酸的血清水平升高，并且预期肝功能不全促进潜在危害。

•肾功能不全

II期安全性和功效研究包括32名患有轻度肾损伤(估算的肾小球滤过率(eGFR)为60-90 mL/分钟)的ALS患者。基于模型的分析表明，在健康受试者以及具有正常肾功能和轻度肾功能不全(eGFR大于60 mL/分钟)的ALS患者中，在苯丁酸钠或其代谢物苯乙酸的药代动力学方面不存在显著相关性。在具有轻度肾功能不全(eGFR大于60 mL/分钟且小于90mL/分钟=71-76名)的ALS患者之间，在熊去氧胆酰牛磺酸或其主要代谢物UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度方面不存在可辨识差异。然而，这些数据是非决定性的，因为i)有限数量的患者(N=8)的eGFR<75，并且ii) eGFR是对ALS患者中的肾功能的高估。

主要终末代谢物苯乙酰谷氨酰胺通过肾脏排泄，并且另外地苯丁酸及其主要代谢物苯乙酸在肾脏和肝脏中代谢。因此，在肾损伤的情况下，预期苯丁酸及代谢物的血浆水平升高。此外，由于与ALBRIOZA的高蛋白结合(~ 99%)，肾功能不全可能改变TURSO的分布和功效。

实施例2：健康志愿者中在禁食和进食状态下单剂量口服AMX0035的1期研究

目的

研究的主要目的是确定在年龄>40岁的男性和女性受试者群体中在单个口服剂量施用AMX0035之后苯丁酸钠(PB钠，sodium PB)、TURSO和主要代谢物的血浆水平和PK参数。

研究的次要目的是评价在健康受试者中高脂肪标准化早餐对PB、TURSO和活性代谢物的吸收程度和速率的影响；评价在健康受试者中性别对PB、TURSO和活性代谢物的吸收程度和速率的影响；以及在健康受试者中对PB和TURSO及活性代谢物的血浆浓度与单剂量AMX0035的QT/校正QT间期(QTc)延长和致心律失常潜力之间的关系进行量化。

总体研究设计和计划

这是在健康受试者中的AMX0035的I期、开放标签、2个序列、2个时间段、交叉单剂量试验。招募了总计14名健康受试者，以便有不少于12名受试者完成试验。选择预先限定的性别组合。受试者在两种情况下接受AMX0035的单个口服剂量，其中在平衡的两期交叉设计中，在禁食条件下或在高脂肪标准化餐食后，在不少于4天的时间段之间具有洗脱期。

在治疗时间段1之前，在一些时间点进行24 h匹配取样，以确认每个受试者中的TURSO的内源性水平。

每个研究时间段都遵循相同的研究设计(图1)。在给药前多达28天对受试者进行筛选以纳入研究。在时间段1的第-2研究日和时间段2的第-1研究日期间允许受试者进入临床单位，并且在第1天的早上给药。在时间段1的前一晚，按禁食/进食或进食/禁食序列的受试者在给药前禁食最少10小时。

根据研究方案，受试者留在临床单位，并且直到在第2天出院(discharge)才离开。时间段之间的最短洗脱期为4天。在最后剂量之后7天进行电话随访，以确保受试者的持续健康。

每个受试者接受以下治疗(表4)：

表4 给药方案

研究设计

AMX0035是两种小分子PB和TURSO的固定剂量组合，其被设计为通过同时抑制ER和线粒体细胞应激来阻断神经元死亡和神经毒性炎症。PB和TURSO以独特的作用模式对两个独立的细胞通路起作用。

当前研究被设计为确定AMX0035的PB和TURSO以及主要代谢物的血浆水平和PK参数，以及评估食物和性别对吸收程度和速率的影响。AMX0035制剂预期同时靶向ER应激和线粒体生物能量通路。

研究群体的选择

受试者选自由Quotient Sciences招募的志愿者小组，并且在给药前多达28天内进行筛选以纳入研究。

纳入标准

为了有资格进入研究，受试者必须满足所有以下标准：

1.年龄为40至65岁(包含端值)的健康男性或女性受试者。

2.体重指数为18.5至32.0 kg/m²(包含端值)。

3.因手术(双侧输卵管结扎、子宫切除术+/-卵巢切除术、双侧卵巢切除术、双侧输卵管切除术)或绝经后(至少12个月无月经期，并且在筛选时以卵泡刺激素水平>40 IU/L确认绝经)而不具有生育能力的女性。

4.所有受试者同意在参与研究的持续时间以及最后剂量之后30天内使用一种可接受的避孕方法。可接受的避孕方法为：

a.对受试者进行手术绝育(输精管切除术，在有记录的精子缺乏的情况下)；

b.对受试者的女性伴侣使用非激素子宫内避孕器(IUD)，其每年的失败率低于1%，由合格医生在研究药物施用前至少一个月插入，并且在研究药物的最后剂量之后保持原位达至少30天；

c.屏障方法，诸如男用避孕套或帽、隔膜或带有杀精剂的海绵，

d.不育男性(输精管切除术后至少3个月)、真正禁欲异性性交或纯同性恋生活方式无需使用两种避孕方法，但是需要在研究持续时间和最后剂量后30天内坚持这种生活方式。

5.在筛选时对于乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝抗体(HCV Ab)或人类免疫缺陷病毒(HIV) 1和2抗体测试呈阴性。

6.受试者在准入该研究之前已被提供书面知情同意书。

除了上述标准以外，受试者还同意以下限制：

•在剂量施用前48小时直至出院后24小时期间不饮酒。

•在剂量施用前24小时直至出院后24小时期间不摄入含有咖啡因或黄嘌呤产品的食物或饮料(例如咖啡、茶、可乐饮料、能量饮料和巧克力)。

•在准入前7天直至出院后24小时不摄入含有葡萄柚、葡萄柚汁、塞维利亚橙(Seville orange)、塞维利亚橙果酱和塞维利亚橙汁的食物或饮料或者含有葡萄柚或塞维利亚橙的其他产品。

•在给药前72小时直至从研究出院后24小时期间不进行不习惯的剧烈运动。

•建议受试者在最后剂量施用后至少3个月内不要献血或血浆。

•受试者根据其个体情况遵守所有避孕要求。

排除标准

如果适用以下陈述中的一项或多项，则受试者被排除在研究之外：

1.受试者患有临床上显著的持续性疾病或病症，包括例如：心血管疾病；高血压；癌症或肿瘤；糖尿病；肝脏、内分泌、代谢、呼吸、肾脏、胃肠道(阑尾切除术除外)(包括胆道疾病或胆囊切除术)、血液学或者第一或第二轴向精神病症。

2.在筛选或准入时研究人员认为的临床上显著的实验室测试异常。

3.在筛选或准入时研究人员认为的临床上显著的感染或炎症。

4.在筛选或准入时出现急性胃肠道症状(例如恶心、呕吐、腹泻)，或根据ROME标准临床诊断为肠易激综合征(IBS)。

5.受试者从筛选和首次准入心电图(ECG)中获取的用Fridericia公式校正的平均QT间期(QTcF)>450毫秒，或在此后的任何时间点出现任何临床上显著的QTcF延长。

6.任何当前或以前的A类药物诸如阿片类药物、可卡因、摇头丸、LSD和苯丙胺(amphetamine)(B类)的非法使用。承认过去偶尔使用大麻的受试者不被排除在外，只要他们在筛选和准入时药物滥用测试呈阴性并且已戒断至少3个月即可。

7.每周酒精摄入量大于14个单位或不愿在研究持续时间内停止饮酒。注：1个单位=8 g乙醇(250 mL的啤酒或大约10 oz、1杯葡萄酒[100 mL或大约3 oz]、1量度(measure)的烈酒[30 mL或大约1 oz])。

8.准入的14天内或所考虑药物的5个消除半衰期内(以较长者为准)使用药物(包括非处方药[OTC])。

9.从准入起28天内使用处方的中枢活性或精神活性药物。

10.在首次施用考察产品之前3周内使用具有酶诱导特性的药物，诸如圣约翰草(St John’s Wort)。

11.要求在研究期间需要继续使用任何药物。

12.在该研究开始前3个月内使用任何考察药物，或计划在该研究过程期间接受考察药物。

13.在筛选前30天内已参与另一项临床研究。

14.在过去2个月内有血浆/血液捐献史。

15.严重过敏史或多种不良药物反应史，包括青霉素和头孢菌素(cephalosporin)。

16.损害完成该研究所需的知情同意或与研究人员沟通的能力的任何状况。

17.不愿意遵守协议所规定的所有生活方式考虑因素和限制条件。

18.受试者先前已在该研究中服用AMX0035。

19.受试者在准入前7天内已摄入葡萄柚、葡萄柚汁、塞维利亚橙、塞维利亚橙果酱和塞维利亚橙汁或者含有葡萄柚或塞维利亚橙的其他产品。

受试者从研究中的移出

如果受试者希望随时离开研究，则他们被允许这样做。Quotient Sciences将尽一切合理努力以完成最终评估/出院程序。Quotient Sciences将通知主办方任何受试者从研究中退出的情况。

提前退出日期被定义为决定让受试者从研究中退出的日期。受试者完成日期被定义为对该受试者进行最后程序或最后联系(即电话)的日期。

如果受试者请求比计划出院时间更早地离开临床单位，例如由于不可预见的个人情况，但是打算返回单位以完成研究，则这应记录为受试者自行出院和方案偏离。受试者必须在从临床单位出院之前完成计划的评估/出院程序，并且按计划返回以进行接下来的研究时间段/评估。

受试者因以下原因从一种或多种研究药物中退出：

•经历严重或重度AE，包括但不限于：

a.临床上显著的QTc(F)>500毫秒或QTc(F)从基线的增加>60毫秒(在重复ECG后确认的)，

b.基线被视为每个时间段给药前的一式三份ECG中的最接近QTcF，

c.丙氨酸氨基转移酶(ALT)浓度>3×参考范围上限并且总胆红素>2×参考范围上限；

•由主办方、监管机构或IRB终止研究；

•根据受试者的请求(同意退出)；

•重大并发疾病或需要使用禁用药物；

•受试者不遵守规定；

•由研究人员酌情决定。

出于退出标准的目的，基线被视为最近的给药前评估。

对于因IMP相关AE而退出的受试者，应尽一切努力确保受试者完成后续(随访，follow-up)程序。因IMP相关AE或研究终止而过早退出或停止研究的任何受试者都应被视为已完成研究，并且不会被替换。

因任何上述原因的提前终止应与受试者同意退出以参与任何进一步活动区分开。

因其他原因退出的受试者可能已由研究人员和主办方酌情替换。

施用的考察药物产品(IMP)

受试者在监督下完全混合并服用饮品。少量粉末未溶解是正常的。受试者应在将粉末加入水中后60分钟内服用。允许受试者用少量水(1 oz)冲洗AMX0035的苦味。

临床数据库中记录以下信息：

•施用的日期和时间

•确认施用整个剂量

考察药物产品的标识

AMX0035作为含有40个单次使用小袋的纸盒由主办方提供给现场药房。活性药物成分是TURSO和PB (AMX0035)，其作为小袋中的白色粉末由主办方提供。每个小袋含有1 gTURSO和3 g PB。

授权的药房人员通过打开一个AMX0035小袋、将粉末倒入容器并且加入大约240mL的室温水来准备受试者研究药物。搅拌溶液直至粉末基本上溶解。

在整个研究过程中，保留使用的责任记录。应主办方的要求，将未使用的IMP销毁。

将受试者分配到治疗组的方法

在准入时(时间段1)，每位入组受试者按1:1的比率随机分配到两个序列中的一个，使得7名受试者被随机分配到序列1并且7名受试者被随机分配到序列2。

•序列1：AMX0035在时间段1中以禁食状态给药并且在时间段2中以进食状态给药；

•序列2：AMX0035在时间段1中以进食状态给药并且在时间段2中以禁食状态给药。

在使用随机化时间表(计划表，schedule)进行给药前生成治疗分配列表。

随机化时间表和治疗分配列表是根据Quotient Sciences的标准操作程序(SOP)生成的。治疗分配列表为给药团队提供关于在每个时间段对每个受试者施用哪种治疗的信息，并且在研究人员站点文件中存档。

研究中的剂量的选择

PB已在患有神经退行性疾病的受试者中的一项剂量递增研究中进行了评价，并且发现在显著高于该研究中评估的剂量下PB通常是安全的且可耐受的。具体地，最常见的AE包括：跌倒或其他意外损伤、头晕、腹泻、水肿、口干、头痛、恶心和皮疹。除了受试者突发头痛外，这些AE相比于安慰剂队列以更高比率发生，并且预期到来自PB的副作用。未观察到在实验室值、ECG或生命体征方面的临床上显著变化，并且未发生死亡、意料外或相关的严重AE。重要地，这些研究评价了9至21 g和12至18 g之间的PB的每日剂量，而该研究每日使用6g (Cudkowicz ME，Andres PL，Macdonald SA等人，苯丁酸钠在ALS中的2期研究(Phase 2study of sodium phenylbutyrate in ALS). Amyotroph Lateral Scler. 2009；10 (2):99-106；Hogarth P，Lovrecic L，Krainc D. 亨廷顿病中的苯丁酸钠：一项剂量探索研究(Sodium phenylbutyrate in Huntington's disease: A dose-finding study). MovDisord. 2007；22 (13): 1962-1964)。

每个受试者的剂量的选择和计时

AMX0035在时间段1和2中在第1天早上以单个剂量经口服用。与预期方案的任何偏离都记录在eCRF中。所有剂量施用均在研究中心中在适当培训的工作人员的监督下进行。

在第1天，需要由临床工作人员控制餐食。餐食在标称时间提供。餐食的开始和结束时间记录在原始资料(source)工作簿中。

对于进食给药

为受试者提供小吃，然后禁食所有食物和饮料(水除外)，直到第二天早上，在那时为他们提供高脂肪早餐。早餐在最多25分钟的时间段内摄入，并且给药在早餐开始后30分钟进行。鼓励受试者在25分钟的时间段内均匀地食用他们的餐食。对于这个试验，如果受试者摄入了>80%的高脂肪标准早餐，则将其视为符合要求。

对于禁食给药

在24小时基线中和在禁食状态时间段中的受试者在给药后多达4小时保持禁食，并且提供标准化餐食以在给药后4.00至5.00小时摄入。进食状态下的受试者禁食过夜，并且在给药前30分钟接受高脂肪标准早餐，然后在给药后4.00至5.00小时保持禁食，然后他们接受标准化餐食。

除了少量(1 oz)冲洗味道，在剂量施用前1小时和剂量施用后1小时之间不允许饮水(除按照指示施用研究药物以外)，在另外的情况下允许随意饮水。鼓励受试者在室内停留期间(包括禁食时间段)定期补水，但是不要求正式的水量标准。

既往及伴随疗法

从IMP施用前14天或5个半衰期(以较长者为准)到给药后7天电话随访以及研究人员认为治疗AE所必需的药物，不允许使用任何药物。使用的任何药物都记录在原始资料工作簿中。

治疗依从性

在研究的所有临床阶段期间，研究工作人员观察受试者以确保遵守所有研究程序(包括剂量施用)。

受试者应在监督下完全混合并服用饮品。少量粉末未溶解是正常的。受试者应在将粉末加入水中后60分钟内服用。受试者可以使用少量水(1 oz)冲洗AMX0035的苦味。

每个受试者给药的日期和时间都记录在受试者原始资料中，以及确认服用了整个剂量。任何违反合规性的行为都需要由研究人员和主办方进行评价，以确定受试者是否可以继续参加研究。

药代动力学和安全性变量

下表5-7示出了评估的时间表，其中显示了PK和安全性程序。

当在同一时间点安排了多于1个程序时，优先的顺序如下所示：

当两项测量安排在同一时间点时，生命体征在ECG之前进行测量。其他评估例如体检在规定的时间窗内进行。ECG和血液样品应在彼此不超过10分钟内采集。

所有安全性评估均相对于给药开始计时并进行。

表5 评估的时间表：24 h基线

表6 评估的时间表：时间段1

表7 评估的时间表：时间段2

药代动力学测量

样品采集

根据表5、表6和表7中呈现的时间表，经由留置插管或通过静脉穿刺抽取静脉血样品。

将大约4 mL的血液样品采集到带有Lavender Hemogard盖的4 mL BD Vacutainer塑料K2EDTA管中，并且轻轻颠倒大约8次。然后立即将这些管存放在冰上，并且在采集后60分钟内通过在2至8°C以1500 g离心10分钟进行处理。将所得血浆等分成2个等分试样，并且转移到2 mL的适当标记的主要和备份聚丙烯冷冻管中。将样品储存于-20°C以下，直到它们被运送到WWCT以进行AMX0035的分析。

分析方法

在Worldwide Clinical处利用经验证的分析方法确定PB钠、PAA、TURSO、熊去氧胆酸(UDCA)和甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)的血浆浓度。定量的下限对于PB钠为1.6 µg/mL、对于PAA为0.8 µg/mL、对于TURSO为0.02 µg/mL并且对于UDCA和GUDCA为20 ng/mL。

安全性测量

不良事件

不良事件(AE)是在施用药物产品的受试者中的任何不良医疗事件，其不一定与这次治疗有因果关系。AE可能是与IMP的施用暂时相关的任何不利或意外体征(包括异常实验室发现)、症状或疾病，无论是否被认为与IMP有关。在研究期间恶化的既有病况应报告为AE。药物不良反应(ADR)是其中与IMP的因果关系至少具有合理可能性(可能相关或者相关)的任何AE。

考虑到任何相关的临床体征和症状以及给药前数值，根据PI的判断，在实验室参数、生命体征或ECG方面的任何临床上显著的异常都可能被报告为AE。

从提供书面知情同意书之时起，直至在最后剂量的研究药物后30天，记录所有AE。在每次研究访问期间，由研究人员或其指定人员询问和/或检查受试者的AE的证据。每个AE都记录在受试者的原始资料工作簿上，说明发作的日期和时间、AE的描述、持续时间、严重性(是/否)、严重程度(轻度[1级]、中度[2级]、严重[3级]、非常严重或危及生命[4级])、采取的行动、结局(outcome)以及研究人员对研究治疗与事件之间的关系的意见。研究人员在研究结束时提供对研究治疗与事件之间的关系(无关、可能相关或者相关)的诊断和最终意见。

对因AE而从研究中退出的受试者进行随访，直至确定结局并且由研究人员提供书面报告。

严重不良事件

严重不良事件是任何这样的不良医疗事件或影响，其在任何剂量下导致死亡、危及生命、需要或延长住院病人的住院治疗、导致持续或重大的残疾/无行为能力、先天性异常/出生缺陷或被PI认定为重要医疗事件。

疑似意外严重不良反应(SUSAR)是对与任何剂量相关的IMP(即IMP和AE之间的因果关系至少有合理可能性)的任何非预期反应，其既是严重的，又与适用的产品信息不一致。所有SUSAR都是快速报告的主题。

实验室参数

在表2、3和4中指定的时间点进行以下实验室评估。

血液学：将血液样品到带有Lavender Hemogard盖的K2EDTA涂覆的管(4 mL)中。进行以下分析：血红蛋白、血细胞比容、红细胞、红细胞分布宽度、红细胞平均血细胞体积、红细胞平均血细胞血红蛋白、红细胞平均血细胞血红蛋白浓度、血小板计数、平均血小板体积、白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。

临床化学：将血液样品采集到含有凝血激活剂和血清凝胶分离器的血清分离管(7.5 mL)中。进行以下分析：钠、钾、氯、血尿素氮、尿酸、肌酐、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、ALT、总蛋白质、白蛋白、乳酸脱氢酶、钙、磷(phosphate)、葡萄糖。

凝血：将血液样品采集到柠檬酸钠管(2.7 mL)中。进行以下分析：凝血酶原时间(PT)、凝血酶原国际标准化比率和活化部分凝血活酶时间(aPTT)。

尿液分析：使用尿液测试条对尿液样品(>20 mL)进行以下分析：pH、比重、葡萄糖、酮、亚硝酸盐、白细胞酯酶、蛋白质、尿胆素原、血和胆红素。

药物筛选：在筛选和准入时对尿液样品(>20 mL)进行药物测试，包括滥用的药物。

病毒学：使用临床化学血液样品进行对于HBsAg、HCV Ab和HIV (1和2)的筛查。

酒精测试：这些测试对于每个研究时间段在筛选和准入时进行。

在其中实验室发现超出正常范围并且研究人员认为结果可能具有临床意义的情况下，请求重复取样，除了阳性病毒学结果的情况外。如果异常发现是临床上显著的，则采取适当的措施，例如不让受试者参加研究或让受试者从研究中退出。受试者被转诊给其全科医生或其他适当的提供者(例如泌尿生殖医学诊所)以进行进一步护理。如果HBsAg、HCVAb或HIV测试的结果呈阳性并且研究人员确保在需要时提供充分的咨询，则同样适用。

如果研究人员认为结果可能具有临床意义，则后续评估中的异常发现也需要重复测试。

生命体征

按照表2、3和4中呈现的时间表，使用与抽血相反的手臂，在受试者已处于仰卧位最少5分钟后，通过自动记录仪测量生命体征(收缩压和舒张压[BP]、心率和口腔温度)。受试者应在测量BP和脉搏前休息5分钟。

•给药前生命体征测量在给药前≤2小时进行。

•给药后生命体征测量在标称给药后时间点±15分钟进行。

•出院生命体征测量在标称时间点±1小时进行。

•对于复诊，生命体征测量在标称复诊时间点±2小时进行。

心电图

如表2、3和4中详述的，在受试者已处于仰卧位最少15分钟后记录数字12导联ECG。一式三份的ECG间隔一到两分钟进行。

对ECG评价QT、QTcF、PR、QRS、RR和HR间期以及临床数据库中收集的数据。研究人员在Quotient解释ECG。

•给药前ECG测量在给药前≤2小时进行。

•给药后ECG测量在标称给药后时间点±15分钟进行。

•出院ECG测量在标称时间点±1小时进行。

•对于复诊，ECG测量在标称复诊时间点±2小时进行。

体检

受试者经历全面体检，包括神经系统检查，如表2、3和4中详述的。记录任何变化。身高收集一次，并且按照评估的时间表测量体重。

怀孕

男性受试者同意如果他们的伴侣在研究期间怀孕将通知PI。任何怀孕情况都应进行跟踪，并且在分娩后尽可能向主办方报告母亲和孩子的状况。

测量的适当性

考虑到化合物的性质及其施用途径，如最终方案中详述的安全性评估的性质和计时被认为适合评估活性药物的安全性。

血液样品和尿液采集间隔的计时被认为适合评估活性药物和代谢物的PK特性(profile)。

数据质量保证

原始资料工作簿中记录的所有研究数据均转录到经验证的数据库(InForm v5.0)中。质量控制、数据验证和查询解析均按照Quotient Sciences SOP进行。在研究期间生成的所有原始文件均可由PI利用，以供主办方、监管机构和适当IRB的代表进行审查和原始数据验证。

统计方法和样品量确定

分析群体

安全性群体包括接受任何量的IMP的所有受试者。

安全性分析集应基于治疗进行限定，并且包括来自包括在已接受该治疗的安全性群体中的受试者的所有相关数据。出于制定受试者倾向、人口统计和基线表格的目的，安全性分析集也应基于序列进行限定(即随机分配到接受至少一个治疗的那个序列的所有受试者)。

PK群体应包括所有这样的受试者，其接受至少1个剂量的IMP并且在关键时间点(例如Cmax附近)没有缺失样品或无效的给药后分析结果，没有可能影响与PK终点相关的研究目标的相关方案偏差(例如，如果受试者摄入>80%的高脂肪标准早餐，则他们被视为合规)，并且没有相关的AE诸如呕吐(表明特定受试者未吸收整个剂量)。

PK分析集应是PK群体的一个子集，并且应基于治疗进行限定，并且包括来自包括在接受该治疗的PK群体中的受试者的所有相关数据。在认为适当的情况下，应将个体受试者特性(即时间段)排除在PK分析集之外，诸如，如果受影响的研究时间段中的受试者不符合上述标准或与PK分析或解释相关的其他研究紧急点。

如果需要，PK分析子集应在与PK群体的相同时间确定并且基于PK分析集(如果需要将另外的受试者排除在统计分析之外)(参见“分析的群体”部分)。

安全性-PK群体/分析集应包括在安全性和PK群体/分析集中包含的所有受试者。

药代动力学分析

应利用Phoenix® WinNonlin软件(v8.0 Certara USA, Inc.，USA)和/或SAS^®版本9.4 (SAS Institute, Inc.，Cary，North Carolina，USA)，通过非房室分析法，在可能且适当的情况下，对于每个入组受试者和时间段估算血浆中的PB和代谢物(苯乙酸[PAA])、TURSO和代谢物(UDCA和GUDCA)的PK参数。在数据库锁定后，应使用从给药开始的实际经过时间来进行最终血浆PK参数计算。

对于PB和PAA的PK参数应从实际浓度(即非基线校正浓度)得出。

在TURSO和代谢物(UDCA和GUDCA)的PK参数得出之前，应在SAS(版本9.4)中使用来自时间段1第-1天的时间匹配基线浓度对每个治疗时间段的血浆浓度进行基线校正。

PK参数不应在TURSO和代谢物(UDCA和GUDCA)的非基线校正浓度上确定。

在可能的情况下应估算以下参数估值：

Tma：最大观察浓度的时间；

Cmax：最大观察浓度；

AUC(0-最后)：从0时间到最后可测量浓度的曲线下面积；

AUC(0-inf)：从0时间外推到无穷大的曲线下面积；

AUCextrap：外推超出最后可测量浓度的AUC(0-inf)的百分比；

T1/2：表观消除半衰期；

λ-z：表观消除期的斜率；

CL/F：在单次经口施用后计算的表观血浆清除率，其中F(吸收剂量的分数)未知(仅限母体)；

Vz/F：在单次血管外施用后计算的基于终末期的表观分布容积，其中F(吸收剂量的分数)未知(仅限母体)；

Frel Cmax：基于Cmax的相对生物利用度；

Frel AUC(0-最后)：基于AUC(0-最后)的相对生物利用度；

Frel AUC(0-inf)：基于AUC(0-inf)的相对生物利用度；

MR Cmax：基于Cmax的代谢物与母体比率；

MR AUC(0-最后)：基于AUC(0-最后)的代谢物与母体比率；

MR AUC(0-inf)：基于AUC(0-inf)的代谢物与母体比率；

在可能的情况下，将按治疗(即食物状态)和时间点对血浆浓度计算汇总统计数据(即n、平均值、标准差[SD]、变异系数[CV%]、中值、最小值、最大值、几何n、几何平均值、几何SD和几何CV%)。

将按治疗(即食物状态)使用PK分析集/子集对所有血浆PK参数计算汇总统计数据(即n、平均值、SD、CV%、中值、最小值、最大值)。对所有PK参数(Tmax除外)均呈现几何n、几何平均值、几何SD和几何CV%。

将对以下各项计算并呈现血浆浓度的汇总统计数据：

• PB和PAA：实际浓度；

• TURSO、UDCA和GUDCA：实际浓度(包括第-1天)和时间匹配的基线校正浓度。

将按性别呈现血浆浓度的另外的汇总数据。

算术平均血浆浓度与时间曲线将以线性/线性标度按治疗生成，并且在图表上包括对于±算术SD的误差棒。

几何平均血浆浓度与时间曲线将以log₁₀/线性标度按治疗生成。在这些图表上包括误差棒，其中误差棒为(几何平均×/÷几何SD)。

按分析物和治疗的意大利面图表(Spaghetti plot)将使用给药后的实际取样时间来展现每个受试者的每个特性的一条线。这些图表将以线性/线性和log₁₀/线性标度生成。图表上将展现鉴别个体受试者特性的图例。

将在相关PK分析数据集内以线性/线性标度(即进食和禁食方案将代表x轴)对每个个体绘制个体Cmax、AUC(0-最后)、AUC(0-inf)和Tmax值。每个受试者的个体点通过一条线连接起来。将为每种分析物提供单独的图表。

药代动力学参数的统计分析

食物效应评估：Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)

将对PB和PAA(基于实际浓度)以及TURSO、UDCA和GUDCA(基于时间匹配的基线校正浓度)的PK参数Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)进行统计分析，以评估食物效应的存在。要测试的零假设是在进食和禁食治疗之间不存在差异。

PK参数将经过自然对数变换，并且将使用混合效应建模技术进行分析。全模型将包括以下项：治疗(即进食或禁食)、时间段、性别、治疗按性别相互作用和作为固定效应匹配的序列以及作为随机效应的序列内的受试者

如果治疗按性别相互作用项在5%水平上不显著(即p>0.05)，则将该项从模型中去除，并且将使用简化模型，并且将仅呈现两种性别的合并结果。如果相互作用项在5%水平上显著(即p<0.05)，则将呈现两种性别的合并结果以及分别对于男性和女性的结果。

与PK参数相关的所有其他统计检验均为2侧的，并且使用10%显著性水平进行，从而得到90% (2侧) CI。调整后的平均值(包括禁食/进食比较的差异和从模型中获得的相关90%置信区间(CI))将以对数标度进行反向转换，以获得调整后的几何平均比率(GMR)和该比率的90% CI。这些将与来自禁食/进食比较的p值和受试者内可变性值(在结果表格中表示为CVw)一起呈现。

统计分析将使用如在随机化时间表上详述的接受的实际治疗和计划顺序进行。模型将使用SAS软件程序PROC MIXED进行拟合，方法将指定为限制最大似然法，并且固定效应的分母自由度将使用Kenward和Roger方法计算。

食物效应评估：Tmax

使用非参数分析考察治疗组之间的Tmax值的比较。为每个受试者得出时间段差异(时间段1减去时间段2)。使用Hodges-Lehmann估算法来估算治疗之间的Tmax的中值差异。还得出相关的90% CI和p值。零假设是治疗组中值之间的差异等于零。备选假设是治疗组中值之间的差异不等于零。不含有零的由p值<0.10支持的90% CI将表明在关于Tmax的治疗中值之间存在统计学上显著的差异。

这个程序将在SAS软件程序PROC NPAR1WAY中执行。

将呈现差异的中值以及相关的90% CI和p值，连同两种治疗的中值Tmax值和n。

安全性参数

安全性参数的评价将包括对AE、实验室变量、生命体征、ECG和体检发现的分析。AE和药物分别使用医学监管活动词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities)(MedDRA；v 22.0)和世界卫生组织药物词典增强版(the World Health OrganizationDrug Dictionary Enhanced)(2019 Q1)进行编码。

治疗中出现的AE (TEAE)(即在利用研究药物给药后开始的那些AE)将按系统器官类别(SOC)对每种治疗进行汇总，并且在SOC内按事件类型、严重程度和与IMP的关系进行汇总。如果AE的严重程度或IMP关系缺失，则应在汇总表中将严重程度/关系列为缺失。列出了TEAE和给药前AE。

实验室参数(包括相对于基线的变化)将按治疗对每个安排时间点进行汇总。还呈现了变迁表(从基线到每个基线后时间点)。

对于每个研究部分的每个安排时间点，将汇总生命体征和ECG数据(包括相对于基线的变化)。将汇总在收缩BP (>20 mmHg)、舒张BP (>10 mmHg)和HR (>15 bpm)方面具有相对于基线的“大幅”增加或减少的受试者的数量。还将汇总具有以下ECG特性的受试者的数量和百分比：QTcF为≤450毫秒、451至480毫秒、481至500毫秒、>500毫秒；QTcF间期相对于基线的增加为<30毫秒、30至60毫秒和>60毫秒；以及QT间期为≤500毫秒和>500毫秒。

对于每个时间点将列出所有实验室参数、生命体征、ECG数据和异常体检发现；在适当的情况下，应标记超出参考范围的值。

ECG数据的统计分析(暴露反应分析)

暴露-反应分析将使用合并安全性-PK分析集进行。

将进行暴露-反应分析以评估在每种母体药物和相关代谢物的时间匹配的基线校正QTcF (ΔQTcF)值与血浆浓度之间的关系。

在每个给药后时间点对于每个受试者将计算基于三次重复值的平均值的相对于基线的时间匹配变化(即ΔQTcF)，如下所示：

∆QTcF=(相关基线后时间点的QTcF)-(相关基线时间点的QTcF)

低于定量限浓度的所有浓度都应输入为零。

将使用线性混合模型来分析每种分析物(即PB、PAA、TURSO、UDCA和GUDCA)的ΔQTcF和AMX0035血浆浓度之间的关系，其中每种分析物的血浆浓度拟合为协变量，时间匹配的基线QTcF拟合为连续协变量，并且ΔQTcF拟合为因变量。利用非结构化协方差矩阵在截距和斜率参数上添加受试者特定随机效应。如果非结构化协方差矩阵得不到数据支持，则应考察其他简单化或简化的结构(例如，方差分量)。

这些模型使用SAS中的PROC MIXED进行拟合，方法将指定为限制最大似然法，并且固定效应的分母自由度将使用Kenward和Roger方法计算。

模型最初用所有分析物拟合。然后将模型进行迭代拟合，在每一步中去除用于模型的具有最不显著斜率(即与基于每个分析物的斜率=0的零假设相关的最大p值)的分析物，直到只剩下单个分析物。作为结果，将拟合总计5个模型，其中5是分析物的数量。使用标准PROC MIXED模型拟合诊断，选择具有最佳拟合的模型作为主要模型，即具有最小赤池信息量准则(Akaike Information Criterion，AIC)的模型。

使用主要模型拟合(即最佳拟合)，对于模型中包括的每种分析物鉴定中值Tmax。将鉴定每种分析物在相应Tmax处的几何平均浓度值，并且用来估计对ΔQTcF (90% CI)的影响，即如果模型中包括3种分析物，则将基于与分析物1的Tmax对应的几何平均浓度使用3组数据来确定对ΔQTcF的影响，对于分析物2的Tmax和分析物3的Tmax也类似。为了推断AMX0035对QTcF的变化没有显著影响，对于如上所述的每个几何平均浓度(即每个分析物的一个浓度)，双侧90% CI的上限(预测的平均变化)应低于10毫秒。

研究执行或计划分析的变化

计划分析的变化

由于24 h基线(第-1天) ECG监测在禁食状态下进行(即在第-1天给药的时间匹配时间未提供高脂肪早餐)，因此基线并不真正代表未用药时的进食状态。因此，暴露反应分析在两种情况下进行：一次仅使用禁食数据，这是主要分析，并且另一次仅使用进食数据作为探索性分析。

研究受试者

十四名受试者进入该研究，其中7名受试者各自随机分配到禁食/进食或进食/禁食治疗序列。所有14名受试者均给药，并且13名(92.9%)受试者完成了研究。一名(14.3%)受试者根据研究人员的判断停止了进食/禁食治疗序列。

方案偏差

研究按照临床方案执行，其中没有重大的方案偏差，但是发生了与方案的轻微偏差(遗漏或迟到的安全性或实验室评估/在时间段1第-1天的3 h时间点期间无意地遗漏了一式三份的ECG中的第三次ECG；数据未显示)。

PI和主办方认为，该方案偏差不会影响研究结果的总体完整性或质量或者导致任何受试者的安全问题。

所有受试者在进行任何研究程序之前都签署了研究特定的ICF，并且符合纳入和排除标准；数据未显示。

分析的群体

总体而言，所有14名受试者均接受了至少1个剂量的IMP；因此，所有14名受试者均被包括在安全性群体中。

所有14名受试者均接受了至少1个剂量的IMP，并且没有缺失样品、无效的给药后分析结果、相关的方案偏差或可能影响至少1种特性的任何PK终点的AE(参见“分析群体”部分)。因此，所有14名受试者均被包括在PK群体中。

包括在每种治疗的安全性、PK和安全性-PK分析集中的受试者如下所示：

•进食状态下的AMX0035由所有14名受试者组成

•禁食状态下的AMX0035仅由13名受试者组成。一名受试者在时间段1和2之间因重大并发疾病或需要使用禁用药物(导致退出IMP的肌肉骨骼疼痛的TEAE)而退出，并且因此仅在进食状态下接受AMX0035的施用。

最后，13名受试者被包括在PK分析子集中；一名受试者因其未完成禁食治疗而被排除在该子集之外。

人口统计学和其他基线特性

人口统计学变量

未提供个体受试者的人口统计学和生活方式细节，下面提供了简要概述。

十四名年龄为45至64岁的健康男性(8名[57.1%])和女性(6名[42.9%])受试者进入研究(表8)。大多数受试者为白种人(12名[85.7%])并且2名(14.3%)受试者为黑色人种或非裔美国人。所有受试者均为西班牙裔或拉丁裔。所有受试者的体重指数均在如协议要求的参考范围(18.5至32.0 kg/m²)内。所有14名受试者均是非吸烟者，并且都不是酒精的消费者。

表8：人口统计学特性：安全性分析集

在人口统计学特性方面，治疗序列之间不存在临床上显著的差异，然而，禁食/进食序列中有2名(28.6%)受试者是黑色人种或非裔美国人，与只有白种人受试者的进食/禁食序列不同。

其他基线特性

个体受试者的医疗和手术史细节并不妨碍纳入研究。

没有受试者报告在给药前服用药物。

一名受试者报告在左脚和上臂上的皮肤擦伤的给药前AE。该事件无需药物即可解决。

所有尿液药物筛选、尿液酒精筛选和血清妊娠测试均呈阴性。血清学测试是非反应性的，并且凝血测试结果均未超出参考范围。根据方案，除一名受试者(其进行了双侧输卵管结扎并且因此没有生育能力)外，所有受试者均为绝经后(FSH >40 IU/L)。

治疗依从性的测量

在研究的所有临床阶段期间，研究工作人员观察受试者以确保遵守所有研究程序(包括剂量施用)。

每位受试者给药的日期和时间都记录在受试者的原始资料工作簿中。个体受试者的给药细节和受试者对餐食要求的依从性均已记录，但是未在本文中提供。

药代动力学评价

PB和PAA的药代动力学

PB

对于图2所示的PK分析集中的所有受试者，PB的平均血浆浓度相对于时间的分布曲线以log₁₀/线性标度按食物条件示出。

对于PK分析集中的所有受试者，PB的关键PK参数在下表9中呈现。

表9：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，PB的血浆药代动力学参数的汇总：药代动力学分析集

在禁食状态下向健康男性和女性受试者单次经口施用AMX0035后，在所有13名给药受试者中，PB的浓度自0.25小时起是明显的。最大血浆浓度出现在给药后0.25至0.50小时。然后浓度以总体上单相的方式下降并且保持可量化直到给药后3.00至5.00小时。对于所有13名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在0.40至0.71小时的范围内。几何平均(几何CV%)半衰期为0.461小时(15.1%)。

几何平均(几何CV%)表观分布容积和表观血浆清除率分别为8.4 L (45.8%)和211mL/min (44.9%)。

在进食状态下单次经口施用AMX0035后，在所有14名受试者中，PB的浓度自0.25小时起是明显的。最大血浆浓度出现在给药后0.25至1.50小时。然后浓度以总体上单相的方式下降并且保持可量化直到给药后3.50至6.00小时。对于13名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在0.36至1.12小时的范围内。几何平均(几何CV%)半衰期为0.599小时(41.4%)。在无法可靠地确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)。在禁食和进食状态下在施用AMX0035后，与该组的其他受试者相比，一名受试者显示出降低的对PB的暴露(就Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)而言)。

几何平均(几何CV%)表观分布容积和表观血浆清除率分别为21.3 L (67.0%)和410 mL/min (28.6%)。

PAA

对于图3所示的PK分析集中的所有受试者，PAA的平均血浆浓度相对于时间的分布曲线以log₁₀/线性标度按食物条件示出。

对于PK分析集中的所有受试者，PAA的关键PK参数在下表10中呈现。

表10：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，PAA的血浆药代动力学参数的汇总：药代动力学分析集

在禁食状态下向健康男性和女性受试者单次经口施用AMX0035后，在所有13名给药受试者中，代谢物PAA的浓度自0.25小时起是明显的。最大血浆浓度出现在给药后1.50至3.50小时。然后浓度以单相/双相方式下降并且保持可量化直到给药后6.00至8.00小时。对于所有13名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在0.69至0.95小时的范围内。几何平均(几何CV%)半衰期为0.813小时(11.5%)。

在禁食状态下施用后，几何平均(几何CV%) PAA/PB代谢物与母体比率对于Cmax为0.168 (40.3%)、对于AUC(0-最后)为0.416 (38.9%)并且对于AUC(0-inf)为0.421(38.5%)。

在进食状态下单次经口施用AMX0035后，在所有14名受试者中，代谢物PAA的浓度自0.25小时至0.50小时起是明显的。最大血浆浓度出现在给药后2.00至4.50小时。然后浓度以单相/双相方式下降并且保持可量化直到给药后6.00至8.00小时。对于所有14名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在0.60至1.04小时的范围内。几何平均(几何CV%)半衰期为0.780小时(16.3%)。

在进食状态下施用后，几何平均(几何CV%) PAA/PB代谢物与母体比率对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别为0.407 (45.6%)、0.626 (49.2%)和0.598 (46.8%)。

TURSO、UDCA和GUDCA的药代动力学

TURSO

对于图4所示的PK分析集中的所有受试者，TURSO的平均血浆浓度相对于时间的分布曲线以log₁₀/线性标度按食物条件示出。

对于PK分析集中的所有受试者，TURSO的关键 PK参数在下表11中呈现。

表11：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，TURSO的血浆药代动力学参数的汇总：药代动力学分析集

在禁食状态下向健康男性和女性受试者单次经口施用AMX0035后，TURSO的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后1.50至10.00小时。对于5名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在2.51至8.71小时的范围内。几何平均(几何CV%)半衰期为4.337小时(49.7%)。在无法可靠地确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)。

几何平均(几何CV%)表观分布容积和表观血浆清除率分别为1600 L (22.1%)和4260 mL/min (58.9%)。

在进食状态下单次经口施用AMX0035后，TURSO的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后4.50至10.00小时。对于6名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在1.53至5.36小时的范围内，其中几何平均值(几何CV%)为3.359小时(45.1%)。在无法可靠地确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)。

几何平均(几何CV%)表观分布容积和表观血浆清除率分别为1000 L (41.2%)和3440 mL/min (24.1%)。

UDCA

对于图5所示的PK分析集中的所有受试者，UDCA的平均血浆浓度相对于时间的分布曲线以log₁₀/线性标度按食物条件示出。

对于PK分析集中的所有受试者，UDCA的关键 PK参数在下表12中呈现。

表12：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，UDCA的血浆药代动力学参数的汇总：药代动力学分析集

在禁食状态下向健康男性和女性受试者单次经口施用AMX0035后，代谢物UDCA的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后0.25至20.00小时。对于2名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期在3.01至7.58小时的范围内。在无法可靠地确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)或Cmax后数据点数量不足的结果。在禁食状态下施用后，UDCA/TURSO代谢物与母体比率的几何平均值(几何CV%)对于Cmax为1.099 (119.9%)并且对于AUC(0-最后)为1.620 (149.3%)。

在进食状态下单次经口施用AMX0035后，代谢物UDCA的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后6.00至24.00小时。对于1名受试者可靠地确定了终末斜率，其中所得的消除半衰期为5.312小时。在无法确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)或Cmax后数据点数量不足的结果。UDCA/TURSO代谢物与母体比率的几何平均值(几何CV%)对于Cmax和AUC(0-最后)分别为1.093 (169.5%)和1.406 (148.8%)。

GUDCA

对于图6所示的PK分析集中的所有受试者，GUDCA的平均血浆浓度相对于时间的分布曲线以log₁₀/线性标度按食物条件示出。

对于PK分析集中的所有受试者，GUDCA的关键PK参数在下表13中呈现。

表13：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，GUDCA的血浆药代动力学参数的汇总：药代动力学分析集

在禁食状态下向健康男性和女性受试者单次经口施用AMX0035后，代谢物GUDCA的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后6.00至20.00小时。对于1名受试者可靠地确定了终末斜率，其中所得的消除半衰期为12.744小时。在无法可靠地确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)或Cmax后数据点数量不足的结果。在禁食状态下施用后，GUDCA/TURSO代谢物与母体比率的几何平均值(几何CV%)对于Cmax为0.571 (107.4%)并且对于AUC(0-最后)为1.056 (114.8%)。

在进食状态下单次经口施用AMX0035后，代谢物GUDCA的时间匹配基线校正最大血浆浓度出现在给药后0.50至24.00小时。对于2名受试者可靠地确定了终末斜率，并且所得的消除半衰期为11.03和24.71小时。在无法确定终末斜率的情况下，这是不可接受的决定系数的结果(即调整后的R²<0.9)或Cmax后数据点数量不足的结果。GUDCA/TURSO代谢物与母体比率的几何平均值(几何CV%)对于Cmax和AUC(0-最后)分别为0.675 (92.9%)和0.918(103.4%)。

统计结果和分析

PB

表14呈现了用于评估PB的食物效应的Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)的统计分析的结果。

表14：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，用于评估PB的食物效应的统计分析结果：药代动力学分析子集

一名受试者对于进食和禁食治疗二者的AUC(0-inf)不具有可靠估算值(由于对于进食状态不可接受的决定系数[即调整后的R²<0.9])，并且因此被排除在AUC(0-inf)的统计分析之外。

治疗按性别相互作用项在5%水平上对于Cmax (p=0.52)、AUC(0-最后)(p=0.21)和AUC(0-inf)(p=0.21)中的每一个均不显著，并且因此将该项从相应模型中去除。

对于进食与禁食治疗的比较，与峰值(Cmax)以及总体(AUC(0-最后)和AUC(0-inf))暴露水平相关的GMR的点估算值从24.35%到45.98%变化，即对于进食治疗的暴露水平平均为对于禁食治疗所看到的暴露水平的大约24%至46%。与GMR相关的每个上界限均小于51%，并且因此可以有信心地排除大于对于禁食治疗所看到的平均暴露水平的51%的对于进食治疗的平均暴露水平。

与每个PK参数相关的进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上具有统计学显著性，其中对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)中的每一个的p值<0.001。作为结果，存在用来拒绝在进食和禁食治疗之间没有差异的零假设的统计学证据。

虽然未观察到统计学上显著的性别效应(即对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别为p=0.17、p=0.11和p=0.14)，但是存在当与男性相比时在女性中更高的PB暴露水平的一些证据，并且这对于进食和禁食方案二者是一致的(数据未显示)。

禁食治疗的Tmax的中值为0.500小时，并且进食治疗的Tmax的中值为1.000小时。进食和禁食中值(即进食-禁食)之间的差异的Hodges-Lehmann估算值为0.500小时，具有90% CI (0.125，0.750)。当与禁食状态相比时进食状态的Tmax的轻微增加在10%水平上具有统计学显著性(p=0.007)(表15)。

表15：使用实际浓度的血浆药代动力学参数：PB

PAA

表16呈现了用于评估PAA的食物效应的Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)的统计分析的结果。

表16：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，用于评估PAA的食物效应的统计分析结果：药代动力学分析子集

治疗按性别相互作用项在5%水平上对于Cmax (p=0.46)、AUC(0-最后)(p=0.77)和AUC(0-inf)(p=0.77)中的每一个均不显著，并且因此将该项从相应模型中去除。

对于进食与禁食治疗的比较，与峰值(Cmax)以及总体(AUC(0-最后)和AUC(0-inf))暴露水平相关的GMR的点估算值从60.34%到70.54%变化，即对于进食治疗的暴露水平平均为对于禁食治疗所看到的暴露水平的大约60%至71%。与GMR相关的每个上界限均小于77%，并且因此可以有信心地排除大于对于禁食治疗所看到的平均暴露水平的77%的对于进食治疗的平均暴露水平。

与每个PK参数相关的进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上具有统计学显著性，其中对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)中的每一个的p值<0.001。作为结果，存在用来拒绝在进食和禁食治疗之间没有差异的零假设的统计学证据。

虽然未观察到统计学上显著的性别效应(即对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别为p=0.24、p=0.18和p=0.18)，但是存在当与男性相比时在女性中更高的PAA暴露水平的一些证据，并且这对于进食和禁食方案二者是一致的(数据未显示)。

禁食和进食治疗二者的Tmax的中值为2.500小时。进食和禁食治疗之间的中值方面的差异的Hodges Lehmann估算值为0.250小时，具有90% CI (0.000，0.750)。当与禁食状态相比时进食状态的Tmax的轻微增加在10%水平上具有统计学显著性(p=0.058)(表17)。

表17：使用实际浓度的血浆药代动力学参数：PAA

TURSO

表18呈现了用于评估TURSO的食物效应的基于时间匹配基线校正浓度的Cmax和AUC(0-最后)的统计分析的结果。

表18：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，用于评估TURSO的食物效应的统计分析结果：药代动力学分析子集

对于两个时间段具有AUC(0-inf)的可靠估算值的受试者的数量少于7人；因此，未进行AUC(0-inf)的正式统计分析。

治疗按性别相互作用项在5%水平上对于Cmax (p=0.74)和AUC(0-最后)(p=0.96)中的每一个均不显著，并且因此将该项从相应模型中去除。

进食/禁食的GMR (90% CI)对于Cmax和AUC(0-最后)分别为101.56% (78.52%，131.36%)和138.81% (105.39%，182.83%)，即如通过进食治疗的Cmax和AUC(0-最后)测量的平均暴露水平比对于禁食治疗所看到的平均暴露水平分别平均高了大约2%和39%。然而，由于相关90% CI的宽度，这些估算值应谨慎看待，例如，小至5%和大至83%的AUC(0-最后)的平均增加不能自信地排除。

与Cmax相关的进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上不具有统计学显著性，即p=0.92。对于跨整个取样时间段的总体暴露的分析，即AUC(0-最后)，进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上具有统计学显著性(p=0.056)，即不存在用来拒绝对于Cmax无食物效应的零假设的统计学证据，并且不存在用来拒绝对于AUC(0-最后)无食物效应的零假设的证据。

存在当与男性相比时在女性中更高的TURSO暴露水平的一些证据，并且这对于进食和禁食方案二者是一致的，即这种效应对于AUC(0-最后)在10%水平上是显著的(p=0.060)，但是对于Cmax不具有统计学显著性(p=0.13)(数据未显示)。

基于时间匹配基线校正浓度的Tmax的中值对于禁食治疗为4.500小时并且对于进食治疗为5.000小时。进食和禁食中值之间的差异的Hodges-Lehmann估算值为2.000小时，具有90% CI (0.250，2.758)。当与禁食状态相比时进食状态的Tmax的增加在10%水平上具有统计学显著性(p=0.052)(表19)。

表19：使用时间匹配基线校正浓度的血浆药代动力学参数：TURSO

UDCA

表20呈现了用于评估UDCA的食物效应的基于时间匹配基线校正浓度的Cmax和AUC(0-最后)的统计分析的结果。

表20：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，用于评估UDCA的食物效应的统计分析结果：药代动力学分析子集

对于两个时间段具有AUC(0-inf)的可靠估算值的受试者的数量少于7人；因此，未进行AUC(0-inf)的正式统计分析。

治疗按性别相互作用项在5%水平上对于Cmax (p=0.45)和AUC(0-最后)(p=0.86)中的每一个均不显著，并且因此将该项从相应模型中去除。

进食/禁食的GMR (90% CI)对于Cmax和AUC(0-最后)分别为112.17% (65.80%，191.21%)和136.34% (88.53%，209.98%)，即如通过进食治疗的Cmax和AUC(0-最后)测量的平均暴露水平比对于禁食治疗所看到的平均暴露水平分别平均高了大约12%和36%。然而，由于相关90% CI的宽度，这些估算值应谨慎看待，例如，小至11%的AUC(0-最后)方面的平均下降和大至110%的AUC(0-最后)方面的平均增加(即超过两倍)都不能自信地排除。

与每个PK参数相关的进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上不具有统计学显著性，即对于Cmax的p=0.71和对于AUC(0-最后)的p=0.22。作为结果，不存在进食和禁食治疗之间的差异的统计学证据，即不存在用来拒绝对于Cmax和AUC(0-最后)中的每一个无食物效应的零假设的证据。

虽然未观察到统计学上显著的性别效应(即对于Cmax和AUC(0-最后)分别为p=0.13和p=0.16)，但是存在当与女性相比时在男性中更高的UDCA暴露水平的一些证据，并且这对于进食和禁食方案二者是一致的(数据未显示)。

基于时间匹配基线校正浓度的Tmax的中值对于禁食治疗为6.000小时并且对于进食治疗为16.000小时。进食和禁食中值之间的差异的Hodges-Lehmann估算值为7.000小时，具有90% CI (2.000，11.500)。当与禁食状态相比时进食状态的Tmax的增加在10%水平上具有统计学显著性(p=0.022)(表21)。

表21：使用时间匹配基线校正浓度的血浆药代动力学参数：UDCA

GUDCA

表22呈现了用于评估GUDCA的食物效应的基于时间匹配基线校正浓度的Cmax和AUC(0-最后)的统计分析的结果。

表22：在禁食和进食状态下向健康男性和女性受试者的AMX0035的单个口服剂量后，用于评估GUDCA的食物效应的统计分析结果：药代动力学分析子集

对于两个时间段具有AUC(0-inf)的可靠估算值的受试者的数量少于7人；因此，未进行AUC(0-inf)的正式统计分析。

治疗按性别相互作用项在5%水平上对于Cmax (p=0.77)和AUC(0-最后)(p=0.83)中的每一个均不显著，并且因此将该项从相应模型中去除。

进食/禁食的GMR (90% CI)对于Cmax和AUC(0-最后)分别为134.45% (95.95%，188.41%)和137.31% (105.64%，178.49%)，即如通过进食治疗的Cmax和AUC(0-最后)测量的平均暴露水平比对于禁食治疗所看到的平均暴露水平分别平均高了大约34%和37%。然而，由于相关90% CI的宽度，这些估算值应谨慎看待，例如，小至4%的Cmax方面的平均下降和大至78%的AUC(0-最后)方面的平均增加都不能自信地排除。

与Cmax相关的进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上不具有统计学显著性(p=0.14)，即不存在用来拒绝对于Cmax无食物效应的零假设的证据。对于跨整个取样时间段的总体暴露的分析，即AUC(0-最后)，进食和禁食治疗之间的差异在10%水平上具有统计学显著性(p=0.053)，即用来拒绝对于AUC(0-最后)无食物效应的零假设的证据(数据未显示)。

基于时间匹配基线校正浓度的Tmax的中值对于禁食和进食治疗二者为16.000小时。进食和禁食方案之间的差异的Hodges-Lehmann估算值为2.000小时，具有90% CI (-4.000，5.000)。这个差异在10%水平上不具有统计学显著性(p=0.66)(表23)。

表23：使用时间匹配基线校正浓度的血浆药代动力学参数：GUDCA

统计/分析问题

统计分析所依据的分布假设看起来满足不同PK参数的分析，其中PAA Cmax可能除外，即来自模型拟合的残差(residuals)不呈正态分布的一些证据。对残差的进一步考查表明，对于这种与基本假设的偏离没有特别的原因，并且结果与其他 PAA PK参数一致。

不存在其他统计分析问题。

药代动力学和统计学结论

PB和PAA

在单次经口施用AMX0035后，基于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)，对PB的血浆暴露相对于禁食状态在进食状态下分别显示出大约76%、55%和54%的统计学显著性下降。

在禁食条件下，对代谢物PAA的峰值暴露为对PB的峰值暴露的大约14%，而基于AUC(0-inf)的总暴露为对PB的该总暴露的大约35%。PAA/PB代谢物与母体比率在进食状态下更高，其中峰值暴露为对PB的峰值暴露的大约34%，并且基于AUC(0-inf)的总暴露为对PB的该总暴露的大约48%。

当与禁食状态相比时，对于进食状态注意到在PB和PAA Tmax方面的显著增加，尽管增加是轻微的，即中值方面的差异为0.5小时或更短。

与禁食状态相比，在进食状态下施用后，代谢物PAA的几何平均Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别显示出大约40%、30%和29%的显著下降。

TURSO、UDCA和GUDCA

在单次经口施用AMX0035后，基于Cmax的对TURSO的峰值血浆暴露相对不变，而基于AUC(0-最后)的总体暴露显示出相对于禁食状态在进食状态下大约39%的统计学显著性增加。

在禁食条件下，TURSO向UDCA的转化是广泛的，其中对代谢物UDCA的峰值暴露为对于TURSO的峰值暴露的大约86%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对于TURSO的该总暴露的大约127%。这在进食状态下基本未变，其中峰值暴露为对于TURSO的峰值暴露的大约86%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对于TURSO的该总暴露的大约110%。

与禁食状态相比，在进食状态下施用后，代谢物UDCA的几何平均Cmax和AUC(0-最后)分别显示出大约12%和36%的增加。然而，由于高可变性，这些变化并未达到统计学显著性。

在禁食条件下，对代谢物GUDCA的峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约51%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约95%。这在进食状态下基本未变，其中峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约61%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约83%。

在进食状态下施用后，代谢物GUDCA的几何平均Cmax和AUC(0-最后)在进食状态下分别显示出大约34%和37%的增加；然而，仅AUC(0-最后)方面的差异达到统计学显著性。

当与禁食状态相比时，对于进食状态注意到基于时间匹配基线校正浓度的UDCATmax方面的显著增加。对于TURSO和GUDCA Tmax观察到类似的趋势(尽管增加较小)，但是仅对于TURSO的这种增加达到统计学显著性。

讨论和总体结论

PB和PAA

在禁食状态下单次经口施用AMX0035后，PB被迅速吸收，其中对于所有受试者，中值Tmax均出现在给药后0.500小时。所得特性的特征在于几何平均分布容积和总清除率分别为8.4 L和211 mL/min。终末消除也是迅速的，其中几何平均血浆半衰期为0.461小时。

与暴露相关的受试者间可变性(通过Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)测量的)是中等的，其中几何平均CV%在39.0%至45.2%的范围内。

与禁食状态相比，与标准化高脂肪早餐一起施用AMX0035导致在PB吸收方面的轻微延迟，与禁食状态相比将中值Tmax延迟了0.500小时，达到1.000小时的中值，这被怀疑是在食物后减慢胃排空的结果。与禁食状态相比，基于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)的峰值和总体血浆暴露分别显示出大约76%、55%和54%的食物后的统计学显著性下降。与暴露相关的受试者间可变性在食物条件之间保持一致，其中Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)几何平均CV%在28.6%至45.4%的范围内。PB的终末消除在进食状态下看起来也没有变化，其中几何平均终末半衰期为0.599小时。

相比之下，当在进食状态下给药时，PB的分布容积和总清除率分别增加至21.3 L和410 mL/min，当与降低的生物利用度相结合时，其可以表明线性动力学。在进食和禁食食物条件下对PB的暴露在男性和女性之间显示出轻微差异；然而，由于受试者之间的中等可变性(其被观察到在男性中比在女性中更高)，这并非结论性的，并且统计分析表明在男性和女性之间不存在统计学上显著的差异。

在禁食条件下施用AMX0035后，对代谢物PAA的峰值暴露是对PB的峰值暴露的0.168倍，而基于AUC(0-inf)的总暴露是对PB的该总暴露的0.421倍。PAA的血浆半衰期与对PB注意到的快速半衰期相当，表明 PAA的消除可能受形成速率限制。

在进食状态下施用AMX0035后，获得PAA的最大浓度所花费的时间是不变的，其中对于两种食物条件的中值均为2.500小时。然而，相比之下，与禁食状态相比，调整后的几何平均Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别显示出大约40%、30%和29%的统计学显著性下降。对PAA的暴露方面的减少小于对母体PB所观察到的；这反映在代谢物与母体比率方面，其据报道在进食状态下略微更高，其中峰值暴露为对PB的峰值暴露的0.407倍，并且基于AUC(0-inf)的总暴露为对PB的该总暴露的0.598倍。估算的几何平均半衰期在0.780小时时按食物条件几乎不变。与PB类似，在两种食物条件下，在男性和女性之间注意到轻微差异；然而，这些差异并不是结论性的，并且统计分析表明并未观察到统计学上显著的差异。

一名受试者在禁食和进食状态下施用AMX0035后，与该组的其他受试者相比，显示出对PB的暴露降低。在禁食和进食状态下，最大血浆PB分别比组几何平均值低2.92倍和3.63倍。在禁食状态下，基于AUC(0-最后)和AUC(0-inf)的总体暴露均比组几何平均值低3.2倍，并且在进食状态下比组几何平均值分别低3.2倍和3.4倍。另外，由于一名受试者出现了曲线，他们的AUC(0-inf)值被认为是不可靠的。

TURSO、UDCA和GUDCA

在禁食状态下单次经口施用AMX0035后，TURSO被吸收，其中中值Tmax出现在给药后4.500小时。所得特性的特征在于几何平均分布容积和总清除率分别为1600 L和4260mL/min。在禁食状态下TURSO的几何平均血浆半衰期为4.337小时。

与暴露相关的受试者间可变性(通过Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)测量的)很高，其中几何平均CV%在58.9%至79.4%的范围内。

与标准化高脂肪早餐一起施用AMX0035导致TURSO的吸收轻微延迟，如通过中值Tmax从禁食状态下的4.500小时增加到进食状态下的5.000小时所证实的。这种延迟被怀疑是在食物后减慢胃排空的结果。在进食状态下，基于Cmax的峰值血浆暴露没有变化；然而，基于AUC(0-inf)和AUC(0-最后)的总体暴露分别显示出大约47%和39%的增加。然而，由于AUC(0-inf)数据的有限可得性，只能对AUC(0-最后)进行统计分析。在进食状态下，与暴露相关的受试者间可变性轻微减少，其中对于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)，几何CV%在24.1%至62.7%的范围内。TURSO的终末消除在进食状态下没有变化，其中几何平均终末T1/2为3.359小时。

当在进食状态下给药时，TURSO的分布容积和总清除率分别降低至1000 L和3440mL/min；当与对于AUC看到的增加的生物利用度相结合时，这可以表明线性动力学。在暴露于TURSO后注意到的受试者间可变性在进食和禁食状态下在男性和女性之间显示出几乎没有差异。作为结果，统计分析表明在男性和女性之间不存在统计学上显著的差异。

在禁食条件下施用AMX0035后，对代谢物UDCA的峰值暴露是对TURSO的峰值暴露的1.099倍，并且基于AUC(0-最后)的总暴露是对TURSO的该总暴露的1.620倍，表明TURSO向UDCA的广泛且完全的代谢。UDCA的血浆半衰期与TURSO的半衰期相当，表明UDCA的消除可能受形成速率限制。

在进食状态下施用AMX0035后，获得UDCA的最大浓度所花费的时间延迟，其中中值为16.000小时(相对于禁食状态下的6.000小时)。然而，相比之下，几何平均Cmax和AUC(0-最后)分别显示出大约12%和36%的增加。对于UDCA的总体暴露方面的增加与对于母体TURSO所观察到的总体暴露方面的增加大致相当。这反映在代谢物与母体比率方面，其在进食状态下保持不变，其中峰值暴露是对TURSO的峰值暴露的1.093倍，并且基于AUC(0-最后)的总暴露是对TURSO的该总暴露的1.406倍。估算的几何平均半衰期在5.312小时时按食物条件也没有变化。在暴露于UDCA后注意到的受试者间可变性在进食和禁食状态下在男性和女性之间显示出几乎没有差异。作为结果，统计分析表明在男性和女性之间并未观察到统计学上显著的差异。

在禁食条件下施用AMX0035后，对代谢物GUDCA的峰值暴露是对TURSO的峰值暴露的0.571倍，并且基于AUC(0-最后)的总暴露是对TURSO的该总暴露的1.056倍，表明TURSO向UDCA、然后向GUDCA的完全且广泛的代谢。GUDCA的血浆半衰期相对于TURSO的半衰期是延长的(12.744小时相对于4.337小时)，表明GUDCA的消除不受形成速率限制。

在进食状态下施用AMX0035后，获得GUDCA的最大浓度所花费的时间没有变化，其中中值为16.000小时。然而，相比之下，几何平均Cmax和AUC(0-最后)在进食状态下分别显示出34%和37%的增加。然而，由于观察到的高可变性，认为仅对于AUC(0-最后)具有统计学显著性。对于GUDCA的总体暴露方面的增加与对于母体TURSO所观察到的总体暴露方面的增加相当。这反映在代谢物与母体比率方面，其在进食状态下基本未变，其中峰值暴露是对TURSO的峰值暴露的0.675倍，并且基于AUC(0-最后)的总暴露是对TURSO的该总暴露的0.918倍。

与TURSO和UDCA类似，在暴露于GUDCA后注意到的受试者间可变性在两种食物条件下仅显示出在男性和女性之间的轻微差异。作为结果，统计分析表明在男性和女性之间并未观察到统计学上显著的差异。

安全性讨论

不存在与禁食或进食状态下施用AMX0035相关的安全性问题。

不存在严重或重度AE或ADR。总体而言，1名受试者经历中度的无关的AE，其导致IMP的退出。

除了进食治疗组中的1名(7.1%)受试者外，没有受试者具有>30毫秒的QTcF从基线的增加。没有受试者在任何时间点记录了≥450毫秒的QTcF值，并且没有受试者在QTcF方面的增加>60毫秒。

没有证据表明在禁食或进食状态下给药AMX0035与所观察到的血浆浓度范围(即在禁食状态下PB高达大约200 µg/mL并且在进食状态下PAA高达大约40 µg/mL)内的任何临床相关QTcF效应有关。

在任何临床实验室评估、生命体征、ECG或体检发现中不存在具有临床意义的发现。

总体结论

药代动力学结论

PB和PAA

在单次经口施用AMX0035后，相对于禁食状态，在进食状态下基于Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)的对PB的血浆暴露分别显示出大约76%、55%和54%的统计学显著性下降。

在禁食条件下，对代谢物PAA的峰值暴露为对PB的峰值暴露的大约14%，而基于AUC(0-inf)的总暴露为对PB的该总暴露的大约35%。PAA/PB代谢物与母体比率在进食状态下较高，其中峰值暴露为对PB的峰值暴露的大约34%，并且基于AUC(0-inf)的总暴露为对PB的该总暴露的大约48%。

当与禁食状态相比时，对于进食状态注意到在PB和PAA Tmax方面的显著增加，尽管增加是轻微的，即中值方面的差异为0.5小时或更短。

与禁食状态相比，在进食状态下施用后，代谢物PAA的几何平均Cmax、AUC(0-最后)和AUC(0-inf)分别显示出大约40%、30%和29%的统计学显著性下降。

TURSO、UDCA和GUDCA

在单次经口施用AMX0035后，相对于禁食状态，在进食状态下基于Cmax的对TURSO的峰值血浆暴露相对没有变化，而基于AUC(0-最后)的总体暴露显示出大约39%的统计学显著性增加。

在禁食条件下，TURSO向UDCA的转化是广泛的，其中对代谢物UDCA的峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约86%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约127%。这在进食状态下基本未变，其中峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约86%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约110%。

与禁食状态相比，在进食状态下施用后，代谢物UDCA的几何平均Cmax和AUC(0-最后)分别显示出大约12%和36%的增加。然而，由于高可变性，这些变化并未达到统计学显著性。

在禁食条件下，对代谢物GUDCA的峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约51%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约95%。这在进食状态下基本没未变，其中峰值暴露为对TURSO的峰值暴露的大约61%，并且基于AUC(0-最后)的总暴露为对TURSO的该总暴露的大约83%。

在进食状态下施用后，代谢物GUDCA的几何平均Cmax和AUC(0-最后)在进食状态下分别显示出大约34%和37%的增加；然而，仅在AUC(0-最后)方面的差异达到统计学显著性。

当与禁食状态相比时，对于进食状态注意到在基于时间匹配基线校正浓度的UDCATmax方面的显著增加。对于TURSO和GUDCA Tmax观察到类似的趋势(尽管增加较小)，但是仅对于TURSO的这种增加达到统计学显著性。

安全性结论

在该研究的条件下，在禁食和进食状态下施用的AMX0035是良好耐受的。

在进食治疗组中一名(7.1%)受试者在施用AMX0035后报告了1次TEAE。肌肉骨骼疼痛的AE具有中度(2级)严重程度，与AMX0035无关，并且导致IMP的退出。

在该研究期间并未报告与IMP相关的AE。

没有证据表明在禁食或进食状态下给药AMX0035与所观察到的血浆浓度范围(即在禁食状态下PB高达大约200 µg/mL并且在进食状态下PAA高达大约40 µg/mL)内的任何临床相关QTcF效应有关。

并未报告在临床实验室评估、生命体征、ECG或体检发现方面的临床上显著的变化。

实施例3：在施用AMX0035以治疗ALS后，苯丁酸(PB)和苯乙酸(PAA)的群体药代动力学

研究的目的是(1)开发群体药代动力学(PK)模型以描述在接受AMX003的ALS患者中的PB及其代谢物PAA的血浆浓度；(2)鉴别解释PB和PAA的PK可变性的人口统计学和临床特性；以及(3)利用最终的群体PK模型进行模拟以考查不同协变量对PB和PAA暴露的影响。

群体PK分析的药代动力学数据从在健康成年志愿者中的1期食物效应研究和在ALS患者中的2期临床试验获得。1期食物效应研究考查了在健康受试者中在具有和不具有食物的情况下单次经口剂量施用AMX0035后PB、TUDCA和主要代谢物的PK。受试者在禁食(过夜和给药后4小时)和进食(给药前30分钟的标准高脂肪早餐)条件下接受单个剂量的1小袋(1 g TUDCA和3 g PB)的AMX0035，其中在治疗之间具有最少4天的洗脱期。在具有和不具有食物的情况下的施用的顺序是随机分配的。在每个剂量后24小时内采集连续的血液样品，用于分析PB、PAA、TUDCA、UDCA和GUDCA血浆浓度。另外，在AMX0035的第一个剂量的前一天获得血浆样品，以表征TUDCA和代谢物的内源性浓度。称为方案A35-002。

2期试验考查了AMX0035的安全性、耐受性、功效和生物活性。将受试者按2:1的比率随机分配以接受AMX0035或安慰剂。治疗以每天1小袋的AMX0035或安慰剂施用，持续最初3周，然后如果耐受的话，则增加到每天两次1小袋。建议受试者在餐前服用药物。将包括在基线访问(给药前)以及在12周和24周治疗访问时采集的单一血浆样品的稀疏取样策略用于分析PB、PAA、TUDCA、UDCA和GUDCA的血浆浓度。称为方案3500。

结果

概述

具有一级吸收、PB到PAA (100%转化)的一级代谢、代谢(转运)隔室的单室模型(用于模拟代谢物血浆浓度出现方面的延迟和PAA的非线性消除)最佳描述了PB和PAA血浆浓度数据。最终模型包括描述食物施用对经口吸收速率常数(Ka)的影响、食物施用对PB到PAA的表观代谢清除率(CL_PB/F)或PB的表观分布容积(V_PB/F)的影响、体重对PAA的最大消除速率(V_max-PAA)的影响以及ALS的诊断对V_maxPAA和PAA的分布容积(V_PAA)的影响的协变量。不包括场合间可变性(IOV)。

表24呈现了用于最终模型和自展分析的参数估算值。基于CLPB/F和VPB/F的典型值，PB终末消除半衰期估算为0.45小时。最终模型展现了当在进食相对于禁食条件下施用PB时在相对生物利用度方面的52.4% (95%置信区间：48.5%至56.3%)下降以及在Ka方面的60% (95%置信区间：56%至64%)下降。

对于1期研究，基于事后(经验贝叶斯(empirical Bayesian)) PK参数估算值预测的个体最大血浆浓度(C_max)和从时间0到无穷大的血浆浓度相对于时间的曲线下面积(AUC_0-∞)值与对于进食和禁食条件的相应的观察到的个体C_max和AUC_0-∞值非常一致。

这一发现以及在多次给药后缺乏蓄积支持使用这种方法来估算ALS患者中稳态下的受试者特定暴露参数。进行模拟以评价最终模型中包括的协变量对PB和PAA的全身暴露的影响。影响PB暴露的唯一协变量是与食物相关的药物施用。相对于禁食下施用时，当与食物一起施用时，模型预测的PB C_max和从时间0到最后可量化血浆浓度(AUC_0-最后)的时间的血浆浓度相对于时间的曲线下面积分别低3.2倍和2.2倍。

食物施用、ALS诊断和体重影响PAA暴露。相对于禁食下施用时，当与食物一起施用时，模型预测的PAA C_max和AUC_0-最后分别低1.5倍和1.3倍。缺乏ALS诊断对PAA C_max和AUC_0-最后仅具有很小的影响(<1.2倍)。基于模型的模拟表明体重对PAA暴露具有显著影响。与70 kg相比，PAA Cmax在50 kg体重下高1.45倍并且在115 kg下低1.47倍，并且与70 kg相比，PAAAUC0-最后在50 kg下高1.87倍并且在115 kg下低1.72倍。

这些结果证实，相对于在禁食状态下施用，与食物一起施用AMX0035降低血浆中的PB暴露并且在较小程度上降低血浆中的PAA暴露。在ALS患者和健康受试者中，PB和PAA PK通常类似。PB暴露不受体重明显影响，而在PAA暴露与体重之间存在反比关系。

表24：来自最终模型和最终模型的自展分析的群体药代动力学参数估算值

*最终模型的平均估算值(相对标准误差)；

**最终模型的平均百分比变异系数(相对标准误差)[收缩率，%]；

Corr=最终模型的etas(相对标准误差)之间的相关系数；PB=苯丁酸；PAA=苯乙酸；

CL_PB/F=苯丁酸到苯乙酸的表观(经口)代谢清除率；V_PB/F=苯丁酸的表观分布容积；

CL_PAA=苯乙酸的消除清除率；V_PAA=PAA的分布容积；

Ka_fast=在禁食条件(或对于ALS患者的空腹)下的PB经口吸收速率常数；V_max=最大消除速率；K_m-PAA=PAA的消除速率为半最大值时的量；平均转运时间-PAA从代谢隔室到血浆隔室的转运时间，表示血浆中的PAA出现的延迟；F_food=当苯丁酸与食物一起施用时(相对于禁食)的相对生物利用度；Ka_food=当苯丁酸与食物一起施用时的经口吸收速率常数。

药物浓度

来自方案35-002的广泛取样设计允许完整地描述志愿者中的血浆浓度特性。在经口施用后，PB被迅速吸收，并且转化为PAA。血浆浓度典型地对于PB在0.5至1小时达到峰值并且对于PAA在2至3小时达到峰值，并且对于PB在给药后4至5小时下降到低于定量下限(LLOQ)，并且对于PAA在给药后6至8小时下降到低于定量下限(LLOQ)。因此，在每天两次(b.i.d.)给药的情况下不会出现药物或代谢物的蓄积。与禁食施用相比，在与高脂肪餐食一起施用后，志愿者中的PB血浆浓度明显更低，并且分布特性更长。在PAA血浆浓度-时间数据方面的与食物相关的变化是可比的。

考查了食物对从ALS临床试验中稀疏采集的血浆浓度的影响。在临床试验患者中，当药物施用在餐后≥2小时或餐前≥1小时进行时，PB施用被归类为空腹施用(禁食施用)。相比于与食物一起，在空腹施用PB之间明显的是存在这样的趋势，在1小时时朝向更高PB和PAA血浆浓度并且在4小时时朝向类似或略低的浓度。

从事后分析得出的PK参数

表25汇总了在ALS患者中从个体贝叶斯参数估算值得出的受试者特定C_max和AUC_0-∞。

表25

数量-表示在禁食(餐前>2小时或餐后>1小时)或进食条件下接受苯丁酸的方案的数量；C_max=最大血浆浓度；AUC_0-最后=从时间零到最后可测量血浆浓度的血浆浓度-时间曲线下面积；AUC_0-∞=从时间零到无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积；%CV=以百分比表示的变异系数。

实施例4：TUDCA药代动力学研究

进行研究以考查方案AMX3500的2期研究的各个子组中的血浆浓度数据。该实施例汇总了TUDCA和2种代谢物(也即相关的酸，UDCA(脱缀合的TUDCA代谢物)和GUDCA (UDCA的甘氨酸缀合物))的血浆浓度。

对于2个治疗组(治疗和安慰剂)中的每一个，将受试者进一步分为2个样品序列组，以安排药代动力学测量：

1.用于第12周访问的给药后1小时和用于第24周访问的给药后4小时

2.用于第12周访问的给药后4小时和用于第24周访问的给药后1小时

在伴随给药中列出的抗生素是用于比较与其访问时间重叠时服用抗生素的受试者和未服用抗生素的受试者的基础。二十四种不同的药物描述被鉴别为含有抗生素。将抗生素使用的日期与访问日期进行比较，并且如果抗生素使用日期范围包含访问日期，则该访问将被标记为该受试者的抗生素使用数据。然而，这种方法不会标记在访问前服用抗生素但在进行访问前结束抗生素施用的受试者，因此可能无法考虑具有长消除半衰期的某些抗生素。如果出现这种情况，这些抗生素可假想地仍在受试者体内。然而，据观察，只有少数受试者在邻近访问日期但不重叠访问日期的情况下服用抗生素。在其他情况下，受试者在一次访问的当天服用抗生素，但在其他访问当天不服用抗生素。因此，一些受试者属于抗生素使用和抗生素未使用两个类别，但是受试者的个体访问不同时计入两个类别。

人种被记录为“黑色人种”或“非裔美国人”的受试者根据用于该人种的标准肾小球滤过率(eGFR)评分进行评价。使用的另一个标准eGFR评分(有时被称为用于其为白种人的人的标准)适用于所有其他人种的受试者。这些速率以mL/min/1.73m2单位并且以以下类别连续分析：

1.小于90 mL/min/1.73m²；

2.等于或大于90 mL/min/1.73m²。

年龄从连续变量转换为2个类别：

1. 65岁以上；

2.小于65岁。

所有箱线图的箱框都以第25和第75百分位数为界，其中须在第10和第90百分位数，超出其的极端值为点，黑线为中值，并且红线为平均值。

结果

结果显示，TUDCA、UDCA和GUDCA血浆浓度看起来到第12周已达到稳态，这支持跨研究访问的汇集血浆浓度数据。在ALS患者中，在施用AMX0035后，TUDCA、UDCA和GUDCA的稳态血浆浓度是极其高度可变的，并且通常至少比内源性水平(其也是高度可变的)高一个数量级。

平均值与标准差比率(MSDR)是用于考查各组中的可变性以及跨酸和组进行比较的一个简单度量。表26示出了AMX0035组的TUDCA水平的MSDR(对于给药后1小时，比较了12周组和24周组(82.1%相对于66.3%)，以及给药后4小时组(97.7%相对于112.7%)，其中所有这些组都具有明显的高可变性)。对于UDCA (86.7%相对于89.6%，102.7%相对于69.1%)(表27)和对于GUDCA (106.7%相对于105.9%，138.1%相对于134.3%)(表28)发现了相同的高可变性模式。可以注意到的是，在用安慰剂治疗的患者中存在显著的UDCA和GUDCA的内源性浓度。按给药后小时数的汇集组具有类似的高变异模式(表29)。图7-16表明极端值有助于表格中发现的高可变性。

图7示出了给药后4小时的女性受试者的TUDCA水平具有更正的偏态分布，其中第75和第90百分位数远高于其他3组。图7中的所有4个组都具有类似的UDCA水平分布。图8示出了具有类似的GUDCA水平分布的3个组，但是在给药后4小时组中的男性受试者具有更大的可变性以及更高的第75和第90百分位数得分。

在年龄类别(给药后1小时(年龄<<65岁相对于年龄>=65岁)和给药后4小时(年龄<<65岁相对于年龄>=65岁)下，TUDCA水平显示出类似的分布模式。在UDCA中，65岁以上组对于给药后4小时显示出与其他3个组不同的模式，具有总体上更高的可变性和更高的水平，如图9所示。图10中的GUDCA水平在3个组中显示出类似的分布模式，但是与65岁以上给药后4小时组相比，65岁以下组具有更大的可变性和更低的中值。

对于每种酸，在抗生素使用图中跨各组的平均水平是可比的。然而，分布有时在TUDCA、UDCA和GUDCA方面具有更高的中值和可变性(分别为图11、12和13)。这些较高中值组由使用抗生素的受试者构成。

当目视检查图14-16中对于TUDCA、UDCA和GUDCA发现的箱线图时，给药后1小时的高GFR组(大于90 mL/min/1.73m²)与其他3个组相比具有更窄的分布连同更低的血浆浓度。

表26：每次访问的TUDCA血浆浓度(ng/mL)汇总统计

表27：每次访问的UDCA血浆浓度(ng/mL)汇总统计

表28：每次访问的GUDCA血浆浓度(ng/mL)汇总统计

表29：对于AMX0035组中的受试者，每个汇集访问的血浆浓度(ng/mL)汇总统计

实施例5：来源于来自CENTAUR试验的ALS患者的PK样品中的胆汁酸的统计分析

研究的目的是评价AMX0035对人血浆胆汁酸特性的影响。TUDCA是一种可以在人体内源性地产生的胆汁酸，其对胆汁酸通路的平衡的影响可能是治疗的功效和潜在毒性两方面的重要因素。采用靶向代谢组学方法，使用biocrates AbsoluteIDQ®胆汁酸测定以通过LC-MS测量20种胆汁酸。

使用以下样品：

•主要分析或完整病例(CC)，仅包括来自所有3个时间点(基线访问、第12周和第24周)可用并且其中未发生提前停药的受试者的样品。

•次要分析或部分病例(PC)，包括来自至少2个时间点(即基线访问和第12周或第24周)可用或所有3个时间点可用的受试者的样品。该分析还包括在第12周或第24周的提前停药(ED)后采集的样品，以便研究治疗的潜在相关的不期望的影响。

•时间过程数据集(TC，270个样品)，包括与利用不同组类别分析的CC数据集相同的样品，以考察治疗和治疗持续时间的相互作用。

•反应强度数据集(SR，108个样品)，包括基于其ALSFRS-R斜率选择的CC数据集的子集。

• SRTC数据集，包括与利用不同组类别分析的SR数据集相同的样品，以考察反应强度和治疗持续时间的相互作用。

单变量统计

在完整病例的主要分析中，使用ANOVA模型来比较在三个时间点的AMX0035组和安慰剂组：基线访问、第12周和第24周。图17和18示出了在第12周和第24周的AMX0035治疗的效果的通路可视化。在基线时在两组之间不存在显著差异。

在第12周和第24周，在AMX0035治疗的受试者中TUDCA、UDCA和GUDCA以及亲水性/疏水性胆汁酸比率增加，这最可能是向这些受试者经口施用TUDCA的直接效果。事实上，尽管是TUDCA在生理条件下的前体，但是UDCA也可以在肠道中通过牛磺酸从TUDCA的脱缀合而产生。另外，UDCA被认为是由肠道菌群排他性地产生的，这进一步支持了其在这些条件下从经口施用的TUDCA合成。最后，在牛磺酸脱缀合后，UDCA可以在TUDCA的肠肝再循环期间经历与甘氨酸重新缀合而形成GUDCA。令人感兴趣地，在相关性分析中发现UDCA(而不是TUDCA)与ALSFRS-R斜率呈负相关(尽管是弱负相关)(表30)。这表明在具有快速疾病进展的受试者中可以预期高的UDCA值，而在具有缓慢疾病进展的受试者中将预期低的UDCA值。

在第12周，在AMX0035治疗的受试者中，甘氨酸和牛磺酸缀合物(GCA(甘氨胆酸)、TCA(牛磺胆酸)、GDCA(甘氨去氧胆酸)、TCDA)以及CDCA(鹅去氧胆酸)、DCA(去氧胆酸)和pBA的甘氨酸和牛磺酸缀合的指标全都降低。在第24周仍存在类似的趋势，但甘氨酸缀合物GCA和GDCA(它们仍然整体降低，但是不显著)除外。反映CA和CDCA的甘氨酸和牛磺酸缀合的pBA缀合比率在两个时间点也都下降。令人感兴趣地，在第12周，缀合的主要胆汁酸的总量显著降低，而在第24周，未缀合的主要胆汁酸的总量增加。

CA(胆酸)和CDCA的水平分别整体降低和增加，尽管差异仅在第24周对于CDCA是显著的。然而，CDCA/CA比率在两个时间点均显著增加。胆汁酸的生物合成典型地被描述为产生CA和CDCA的经典通路与有利于CDCA产生的备选通路的组合效应。

在第12周，12-α-羟基化胆汁酸(CA、DCA及其缀合物)的总量降低。这个指标的增加已与胰岛素抵抗相关。即使此处观察到降低，这也可以表示与糖尿病相关的影响，糖尿病是分析中包含的混杂因素之一。在第24周，甘氨酸缀合胆汁酸的总量显著增加，可能是由于在这个时间点GLCA的增加更为显著。

总体而言，在CC中，AMX0035治疗(包括每日剂量的TUDCA)在第12周和第24周都引起TUDCA及相关代谢物和指标的增加。令人感兴趣地，与甘氨酸和牛磺酸缀合的CA和DCA下游代谢物在两个时间点均降低，这可能是由于代谢资源发生变化以适应高水平的TUDCA和GUDCA。类似地，UDCA前体CDCA的增加可能与由治疗引起的UDCA的获取有关。

来自PC的另外的信息：这个数据集与CC的不同之处在于这样的事实，除了270个CC样品外，它还包括来自仅参与最多12周的受试者的样品，以及来自在第24周提供样品但被迫停止治疗的受试者的样品。如单变量统计文件中所示，整体特性与CC类似。下面讨论了几个差异。

在PC中，在AMX0035治疗的受试者中CDCA水平增加的趋势自第12周起是显著的，并且持续到第24周。缀合pBA的总量也降低，但是并不显著，而甘氨酸缀合胆汁酸的总量的增加在此处是显著的，而其在CC中略高于p值阈值。在第12周的PC的一个独特特征是TDCA自CA合成的比率(TDCA/CA)显著降低，尽管此处在其他比较中同样存在这种趋势，但是并不显著。

在第24周，与CC的主要区别在于，对GCA、GDCA以及12-α-羟基化胆汁酸总量的影响(全都降低)从第12周开始持续，而在CC中，它们直到第24周就已消散。

时间过程分析(TC)：该分析聚焦于时间(或此处治疗持续时间)对治疗效果的影响。为此，CC数据集与不同的“组”类别一起使用，其组合了所有AMX0035或安慰剂样品，而不管时间点如何。然后在专门的相互作用测试中研究不同时间点的影响。

此处研究了三种相互作用效应：(i)治疗与基线和第12周之间的时间点之间的相互作用，(ii)治疗与基线和第24周之间的时间点之间的相互作用，以及(iii)治疗与第12周和第24周之间的时间点之间的相互作用。

此处，同样地，当研究治疗与后期时间点和基线之间的时间之间的相互作用时，增加的TUDCA、UDCA和GUDCA水平以及增加的亲水性/疏水性胆汁酸比率是最引人注目的效果。当与基线相比时，CDCA/CA比率的增加也明显存在，甘氨酸和牛磺酸缀合物和相关指标的降低也是如此。

令人感兴趣地，TDCA/CA比率的降低对于相互作用i和ii是显著的。在CC中，在第12周和第24周都存在朝向降低的趋势，但是并不显著。这表明可能在简单ANOVA分析中被忽略的TDCA通过肠道微生物群从CA合成的总体作用。令人感兴趣地，在PC分析中，这个比率在第12周也降低。在一项关于阿尔茨海默病中血清胆汁酸特性的研究中，这个比率与认知能力下降强烈相关。

然而，该时间过程分析揭示了治疗与第12周和第24周之间的时间点不存在相互作用效果。因此，AMX0035治疗对胆汁酸水平的影响在这两个时间点之间是整体持续的。

相关性分析

针对CC数据集的最相关子组，考察了代谢物浓度和代谢指标与参数“ALSFRS-R斜率”的相关性。ALSFRS-R (ALS功能评分量表-修订版)是广泛使用的ALS患者中的疾病进展的指标。此处，将24周研究内的斜率在经过校正和转换后使用以允许进行相关性分析。ALSFRS-R斜率越高，24周时间段内的病情进展越慢。因此，与ALSFRS-R斜率呈正相关表明该值(代谢物或指标)在具有较慢疾病进展的患者中较高，并且在具有快速疾病进展的患者中较低。相反，与ALSFRS-R斜率呈负相关对应于在具有快速疾病进展的患者中具有较高值，并且在具有较慢疾病进展的患者中具有较低值。

表30：在AMX0035组中与转换后的ALSFRS-R斜率显著相关的代谢物/指标

使用在时间点第24周的CC数据集的不同子组相对于转换后的ALSFRS-R斜率来进行相关性分析。显示与疾病进展指标相关的唯一子组是在第24周的AMX0035治疗患者的完全组(n=61)。如上表30所示，两种代谢物与ALSFRS-R斜率呈弱负相关(CDCA和UDCA)。与甘氨酸和牛磺酸缀合相关的代谢指标显示出弱正相关性，并且未缀合(主要)胆汁酸的总量与ALSFRS-R斜率呈弱负相关。

当基于其他ALS药物(依达拉奉、利鲁唑、两者或全无)将该组分为子组时，没有代谢物/指标与转换后的ALSFRS-R斜率显著相关。请注意的是，对于这些子组，重复的次数非常低(在仅利鲁唑组中，最大n=23)。在第24周来自安慰剂受试者的样品中的类似评价显示出，对于整个组(n=29)和对于ALS治疗子组再次地，具有极低的重复次数)没有与ALSFRS-R斜率的显著相关性。

反应强度

当基于ALSFRS-R斜率将AMX0035治疗的受试者分为反应强度组时，仅在第24周可以在强反应者和弱反应者之间的ANOVA结果中观察到差异。CDCA和TDCA是在这个时间点可以区分这两组的仅有代谢物。CDCA(其是经由经典和备选胆汁酸生物合成通路产生的，而且也是UDCA的前体)在强反应者中较高。发现与认知能力下降相关的TDCA和TDCA/CA比率在弱反应者中都较高。

令人感兴趣地，TUDCA、UDCA、GUDCA的水平或者亲水性/疏水性胆汁酸比率看起来不是区分这两个子组的关键因素。

强反应者对于与甘氨酸和牛磺酸缀合相关的过程具有显著更低的比率，以及更高水平的未缀合胆汁酸和未缀合pBA。在时间过程分析(SRTC)中，研究了三种相互作用效果：(i)反应与基线和第12周之间的时间点之间的相互作用，(ii)反应与基线和第24周之间的时间点之间的相互作用，以及(iii)反应与第12周和第24周之间的时间点之间的相互作用。令人感兴趣地，与在将所有反应者合并为一个组(相对于安慰剂)的CC的时间过程分析中所观察到的情况不同，存在反应强度与第12周和第24周之间的时间点的相互作用效果，而在所测试的其他相互作用中并不存在这种效果，这意味着在强反应者和弱反应者之间的差异不断增加，即使治疗的总体效果看起来在TC分析中不显示较大差异。CDCA是在代谢物水平的唯一显著差异，而鉴于在第12周和第24周之间出现的变化，胆汁酸缀合的指标和TDCA/CA比率仍然区分强反应者与弱反应者。

结论

CC分析显示，除了预期的TUDCA和相关代谢物的循环水平方面的增加以外，还可以观察到对胆汁酸缀合的较大影响。PC分析(包括不得不停止治疗的受试者)显示出类似的胆汁酸特性(不具有引人注目的差异)。TC分析确认了胆汁酸特性已在第12周设定，并且大部分在第24周维持。

CC受试者的ALSFRS-R斜率允许鉴于研究的24周内的疾病进展来研究胆汁酸水平。在AMX0035治疗的受试者中仅可以发现弱相关性，包括与UDCA的弱负相关性。相关性分析指向CDCA(负相关性)和对胆汁酸缀合(主要发生在肝脏中)的影响(正相关性)，但是由于相关性较弱，应谨慎解释这些结果。

SR分析揭示了在基线或第12周在对治疗的强反应者和弱反应者之间没有差异。在第24周，TUDCA、UDCA和GUDCA的水平以及亲水性与疏水性胆汁酸比率在两个组中类似。然而，CDCA (UDCA的经由通过肠道微生物群的代谢的前体)、TDCA/CA比率(认知能力下降的提示性指标)以及与甘氨酸和牛磺酸的胆汁酸缀合的指标看起来是在治疗结束时区分强反应者与弱反应者的主要驱动力。

SRTC分析表明，当在强反应者和弱反应者之间进行区分时，在胆汁酸特性方面的差异仍然在第12周和第24周之间演变。此处，再次地，CDCA、TDCA/CA以及胆汁酸缀合的指标是主要的判别因素。

Claims (62)

1.一种治疗受试者中的肌萎缩性侧索硬化(ALS)的至少一种症状的方法，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的牛磺酸二醇(TURSO)和约3克的苯丁酸钠的组合物；

(b)确定所述受试者具有

(i)对于苯丁酸钠约3至约425 µg/mL的C_max，或对于苯乙酸约5至约50 µg/mL的C_max，

(ii)对于苯丁酸钠约20至约550 μg*h/mL的AUC_0-最后，或对于苯乙酸约20至约160 μg*h/mL的AUC_0-最后，或

(iii)对于苯丁酸钠约25至约545 μg*h/mL的AUC_0-∞，或对于苯乙酸约21至约155 μg*h/mL的AUC_0-∞；以及

(c)向所述受试者施用另外剂量的所述组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯丁酸钠约90至约170 µg/mL的C_max。

3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯丁酸钠约110至约150 µg/mL的C_max。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯乙酸约10至约45 µg/mL的C_max。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯丁酸钠约140至约300 μg*h/mL的AUC_0-最后。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯乙酸约40至约80 μg*h/mL的AUC_0-最后。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯丁酸钠约140至约300 μg*h/mL的AUC_0-∞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述受试者具有对于苯乙酸约40至约80 μg*h/mL的AUC_0-∞。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约1天至约40周。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约10周至约26周。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次施用所述组合物，持续约3周，随后每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时从所述受试者获得血液样品。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时从所述受试者获得血液样品。

15.一种治疗受试者中的ALS的至少一种症状的方法，所述方法包括：

(a)向所述受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物；

(b)确定所述受试者中的选自TURSO、UDCA或GUDCA的一种或多种胆汁酸的血浆浓度；以及

(c)向所述受试者施用另外剂量的所述组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述血浆浓度是稳态血浆浓度。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约1天至约40周。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约10周至约26周。

19.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

20.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括每天一次施用所述组合物，持续约3周，随后每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时确定所述血浆浓度。

22.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时确定所述血浆浓度。

23.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时确定所述受试者中的TURSO的血浆浓度，其中所述TURSO的血浆浓度为约20至约2570 ng/mL。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述TURSO的血浆浓度为约20至约1045 ng/mL。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述TURSO的血浆浓度为约88至约540 ng/mL。

26.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时确定所述受试者中的TURSO的血浆浓度，其中所述TURSO的血浆浓度为约20至约3250 ng/mL。

27.根据权利要求26所述的方法，其中TURSO的稳态血浆浓度为约20至约1125 ng/mL。

28.根据权利要求26所述的方法，其中TURSO的稳态血浆浓度为约155至约785 ng/mL。

29.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时确定所述受试者中的UDCA的血浆浓度，其中所述UDCA的血浆浓度为约20至约6020 ng/mL。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述UDCA的血浆浓度为约20至约1955 ng/mL。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述UDCA的血浆浓度为约285至约1125 ng/mL。

32.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时确定所述受试者中的UDCA的血浆浓度，其中所述UDCA的血浆浓度为约20至约7340 ng/mL。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述UDCA的血浆浓度为约20至约2550 ng/mL。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述UDCA的血浆浓度为约305至约1395 ng/mL。

35.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时确定所述受试者中的GUDCA的血浆浓度，其中所述GUDCA的血浆浓度为约20至约4600 ng/mL。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述GUDCA的血浆浓度为约65至约2085 ng/mL。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述GUDCA的血浆浓度为约340至约1635 ng/mL。

38.根据权利要求15-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时确定所述受试者中的GUDCA的血浆浓度，其中所述GUDCA的血浆浓度为约20至约5290 ng/mL。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述GUDCA的血浆浓度为约320至约2315 ng/mL。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述GUDCA的血浆浓度为约530至约1915 ng/mL。

41.根据权利要求15-40中任一项所述的方法，所述方法还包括，在步骤(a)之前，确定所述受试者中的胆汁酸的基线血浆浓度。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者中的TURSO的基线血浆浓度，并且其中所述TURSO的基线血浆浓度为约20至约577 ng/mL。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述TURSO的基线血浆浓度为约20至约125 ng/mL。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者中的UDCA的基线血浆浓度，并且其中所述UDCA的基线血浆浓度为约20至约5970 ng/mL。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述UDCA的基线血浆浓度为约20至约825 ng/mL。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述UDCA的基线血浆浓度为约20至约53 ng/mL。

47.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法包括确定所述受试者中的GUDCA的基线血浆浓度，并且其中所述GUDCA的基线血浆浓度为约20至约4540 ng/mL。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述GUDCA的基线血浆浓度为约20至约755 ng/mL。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述GUDCA的基线血浆浓度为约25至约180 ng/mL。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括在所述受试者已摄入食物之后超过两小时或者在所述受试者摄入食物之前超过一小时施用一定剂量的所述组合物。

51.一种增加受试者中的胆汁酸的血浆浓度的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个剂量的包含约1克的TURSO和约3克的苯丁酸钠的组合物，其中所述胆汁酸选自TURSO、UDCA或GUDCA，

其中在所述胆汁酸是TURSO的情况下，所述血浆浓度为约20至约3250 ng/mL，其中在所述胆汁酸是UDCA的情况下，所述血浆浓度为约20至约7340 ng/mL，并且其中在所述胆汁酸是GUDCA的情况下，所述血浆浓度为约20至约5290 ng/mL。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述血浆浓度是稳态血浆浓度。

53.根据权利要求51或52所述的方法，所述方法包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约1天至约40周。

54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，所述方法包括每天一次或每天两次施用所述组合物，持续约10周至约26周。

55.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，所述方法包括每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

56.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，所述方法包括每天一次施用所述组合物，持续约3周，随后每天两次施用所述组合物，持续约9周至约21周。

57.根据权利要求51-56中任一项所述的方法，所述方法包括在所述组合物的最后剂量之后约一小时确定所述胆汁酸的血浆浓度。

58.根据权利要求51-56中任一项所述的方法，所述方法包括在所述组合物的最后剂量之后约四小时确定所述胆汁酸的血浆浓度。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物经口施用。

60.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物通过饲管施用。

61.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物通过推注施用。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述组合物是粉末制剂。