CN119193479B

CN119193479B - 一种间充质干细胞培养多孔微载体及其制备方法和应用

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Publication number: CN119193479B
Application number: CN202411712401.XA
Authority: CN
Inventors: 胡波; 袁俊锋; 高海利
Original assignee: Sichuan Baikemei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Baikemei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-11-27
Filing date: 2024-11-27
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2044-11-27
Also published as: CN119193479A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞培养多孔微载体及其制备方法和应用，包括以下步骤，S1.将重组胶原蛋白、泊洛沙姆407、海藻酸与水搅拌混合均匀，配置成的溶液；S2.加入乙酸乙酯溶液，调整溶液pH；S3.在搅拌条件下添加pH值稳定剂；S4.降温后在搅拌条件下滴加到钙离子溶液中，形成可悬浮微球，过滤，离心收集微球，纯化洗涤至溶液呈中性，即得。本发明的间充质干细胞培养微载体具备温敏特性，可以避免使用胰酶消化，回收干细胞，降低了细胞损伤，提升了干细胞的回收率，利于大规模干细胞培养应用。

Description

一种间充质干细胞培养多孔微载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞培养多孔微载体及其制备方法和应用。

背景技术

细胞培养分为两大类：贴壁培养（adherentculture）又称单层培养或平面培养，以及悬浮培养（suspensionculture）。通过细胞培养，可以生产治疗疾病的干细胞、免疫细胞和基因修饰细胞等细胞治疗产品，以及病毒载体、疫苗、抗体、多肽药物、外泌体和微囊泡等细胞来源生物制品。人类、哺乳动物和昆虫等物种来源的很多细胞需要贴附在材料的表面才能生长和增殖，这类细胞可称为贴壁细胞或粘附细胞（adherentcells）。组织培养皿、组织培养瓶和细胞工厂（CellFactory）等容器能让贴壁细胞贴附在聚苯乙烯等平坦材料的表面、进行分裂增殖。然而这些培养容器只能为贴壁细胞提供十分有限的生长表面，限制扩增培养后的细胞数量。另外、由天然高分子或/和合成高分子制备而来的微载体可为贴壁细胞提供生长表面。用于细胞培养的微载体一般为直径100-300微米的微球或近似球形的微颗粒，它们可以是实心或具有多孔结构。

ChristianWeber报道了使用多种微载体培养人间充质干细胞的细胞系后，采用胰蛋白酶（Trypsin）、Accutase、胶原酶（Collagenase）或它们的混合溶液消化和回收细胞。其结果显示从葡聚糖微载体Cytodex1和Cytodex3上回收细胞的效率极低，只有5%-25%的细胞可以从微载体表面被回收。我们也发现利用这些蛋白酶很难把间充质干细胞分离开来，即使延长酶处理时间，细胞回收率低于50%。

综上所述，目前市场上的各种微载体虽然能支持贴壁细胞的扩增，但是存在以下一个或多个问题。（1）细胞扩增后从微载体回收细胞的效率低下；（2）微载体的残留物质以及微载体中的动物来源物质增加细胞产品或由细胞产生的生物制品的安全风险；

水凝胶因其独特的三维(3D)网络结构、多功能性(孔隙率、渗透性、机械性能)，可以模拟类似于体内细胞外基质环境(ECM)调节细胞增殖和分化，已成功用于干细胞培养和扩增。在过去的几十年中，已经开发了各种各样的基于水凝胶的3D微载体(MCs)，提供更高的比表面积用于干细胞扩增以满足迅速增长的临床需求。然而，作为干细胞粘附培养介质，材料的结构、物化性质以及表面微环境都有可能影响细胞粘附、生长、增殖及分化行为。目前市面上的微载体大多存在工艺复杂、功能单一且无法对其进行改性，比如微结构、机械性能和力学性能等。因此，设计合适的微载体至关重要，选择最优的材料、最简便的工艺以及大规模扩增技术，以满足对质量、安全性、功效和商业可行性的期望。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞培养多孔微载体及其制备方法和应用，解决现有技术中微载体虽然能支持贴壁细胞的扩增，但是细胞扩增后从微载体回收细胞的效率低下的技术问题。

本发明公开了一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，包括以下步骤，

S1.将重组胶原蛋白、泊洛沙姆407、海藻酸和水搅拌混合均匀，配置成溶液；

S2. 加入乙酸乙酯溶液，均质搅拌均匀后，调整溶液pH；

S3.在搅拌条件下添加pH值稳定剂；

S4.降温后在搅拌条件下滴加至钙离子溶液中，形成可悬浮微球，过滤，离心收集微球，纯化洗涤至溶液呈中性，干燥即得。2~8度可以实现逆凝胶化，具备流动性。

具备温敏特性的细胞培养水凝胶微载体。可以避免使用胰酶消化，回收干细胞，降低了细胞损伤，提升了干细胞的回收率。利于大规模干细胞培养应用。

进一步的，所述步骤S1中重组胶原蛋白5.8~6.2wt%，泊洛沙姆407含量为16.5~17.5wt％，海藻酸含量为0.028~0.032wt％，其余为水。

进一步的，所述步骤S2具有步骤为在维持搅拌下，加入乙酸乙酯溶液，所述乙酸乙酯溶液与步骤S1得到溶液体积比为1：1-4，强制均质搅拌均匀后，向溶液中滴加NaOH溶液。

进一步的，所述步骤S2中将溶液的pH值调节为6.8~7.4。

进一步的，步骤S3中pH值稳定剂，添加方式为每分钟0.04wt％，50~60分钟加完。

进一步的，步骤S3中pH值稳定剂中包含硼砂和磷酸根。

进一步的，步骤S3中pH值稳定剂添加完毕后，溶液中硼砂+磷酸根的浓度为1M，硼砂与磷酸根的摩尔比为1：8-12，使得溶液的pH范围为6.5±1。

进一步的，步骤S4中降温为将S3获得溶液降温至2℃±2。

进一步的，步骤S4中含钙离子溶液为质量浓度为0.06%的氯化钙溶液。

进一步的，步骤S4中滴加加采用微量注射泵滴加，液滴直径不超过1mm。滴加溶液溶度和速率及液滴大小，影响多空微球的直径及孔径大小。

一种间充质干细胞培养多孔微载体，使用上述方法制得。

进一步的，所述可悬浮微球粒径为200~600um，孔径为20~100um。

进一步的，可悬浮微球具备记忆温敏特性。

进一步的，所述可悬浮微球在30~42度可以形成三维多孔可悬浮微球，

进一步的，所述可悬浮微球在2~8度可以实现逆凝胶化，具备流动性。

一种间充质干细胞培养多孔微载体的应用，用于回收干细胞。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1.本发明的间充质干细胞培养微载体具备温敏特性，可以避免使用胰酶消化，回收干细胞，降低了细胞损伤，提升了干细胞回收质量，避免收获过程中的蛋白酶消化与高速离心，可以在最大程度上减少对干细胞造成的损伤，保证干细胞的质量。利于大规模干细胞培养应用；

2.本发明解决了传统乳化法无法制备均匀微球的技术问题，提供了第一种可稳定制备均匀大小多孔温敏微球的工艺，海藻酸和钙作为网络骨架，重组胶原蛋白作为造孔剂的同时能够提供营养；

3.本发明适合细胞培养，可有效促进细胞贴附和细胞增殖，细胞培有效细胞收获率为85%以上，细胞收获细胞损伤比率小于4%；

4.本发明工艺简单，可重复性极强，可获得粒径大小的均匀球形微载体，具有极大的工业化应用前景；

5.泊洛萨姆407即是一种温变性材料，又具有乳化性能，其选择乙酸乙酯作为溶剂，形成了乳化体系，才具备制备微球分相乳化作用，加入硼砂+磷酸根稳定，才能实现乳化分相。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅表示出了本发明的部分实施例，因此不应看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它相关的附图。

图1为本发明实施例1的SEM形貌图。

图2为本发明实施例2的SEM形貌图。

图3为本发明对比例1制备的微球SEM图。

图4为hUCMSCs在实施例2上分布观察(40×)图，其中A：荧光显微镜下观测分别观察收集细胞7D情况；B：倒置相差显微镜下观测实施例2培养时间 7D微载体细胞分布情况；C:倒置相差显微镜下观测实施例2低温相变微载体细胞分布情况(DAPI 染色)。

图5为不同条件下收获细胞损伤比率结果图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

实施例1

本实施例中所采用上述装置的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，包括以下步骤：

S1将重组胶原蛋白6wt%，泊洛沙姆407含量为17wt％，海藻酸含量为0.03wt％，其余为水拌混合均匀，得到溶液。

S2具体步骤为在维持搅拌下，加入乙酸乙酯溶液，添加比例为1：1，强制均质搅拌均匀后，向溶液中滴加NaOH溶液。pH值调节为7.2。

S3在搅拌条件下添加pH值稳定剂硼砂+磷酸二氢钠，添加方式为每分钟0.04wt％，60分钟加完。其中硼砂+磷酸根的浓度为1M，其摩尔比为1：10，使得溶液的pH范围为6.5±1。

S4 将S3获得溶液保持2℃±2，慢滴加到含钙离子溶液质量浓度为0.06%的氯化钙溶液，要求滴加滴加采用微量注射泵均匀缓慢滴加液滴直径不超过1mm。

过滤，离心收集微球，纯化洗涤3次至溶液呈中性，35±2℃度鼓风干燥缓慢即得。

实施例2

在本实施方式作为本发明的一较佳实施例，一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，包括以下步骤：

S1重组胶原蛋白6%，泊洛沙姆407含量为17wt％，海藻酸含量为0.03wt％，其余为水拌混合均匀，得到溶液。

S2具体步骤为在维持搅拌下，加入乙酸乙酯溶液，添加比例为1：4，强制均质搅拌均匀后，向溶液中滴加NaOH溶液。pH值调节为7.2。

S4 将S3获得溶液保持2℃±2，慢滴加到含钙离子溶液质量浓度为0.06%的氯化钙溶液，温度为35±2℃，要求滴加滴加采用微量注射泵均匀缓慢滴加液滴直径不超过1mm。

过滤，离心收集微球，纯化洗涤3次至溶液呈中性，-40±2℃度极速冷冻干燥即得

对比例1

在本实施方式作为本发明的一对比例，公开了一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，在实施例1的基础上改变仅为海藻酸含量为1wt％,所得颗粒偏大，且无微孔。不利于细胞长入，因过度交联无法实现温敏相变。

对比例2

在本实施方式作为本发明的一对比例，公开了一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，在实施例2的基础上含钙离子溶液质量浓度为0.2%的氯化钙溶液,未形成颗粒。形成了大片交联物，无法后续应用，失败案例。

产品表征与测试：

1、表征

实施例1所得微球载体的SEM图像参见图1，实施例2所得微球载体的SEM图像参见图2可以看出，本发明所得温敏微球载体产品为粒度在200~600μm左右的球形结构，且具有多孔特征，孔径约20~100um。

对比例1所得微球载体的SEM如图3，颗粒均匀度差，且粒径基本超过600um，且有粘连，无多孔特征。

2、细胞吸附和脱附测试，细胞脱附质量测试

实验采用人脐带间充质干细胞在二维孔板平板组、对比例1、实施例1与实施例2上培养扩增的特点。传代培养人脐带间充质干细胞，流式细胞术鉴定免疫表型，将 hUCMSCs以 4×10⁴/ml 的密度分别接种至孔板、含有 2g / L对比例1载体、含有 2g / L实施例1载体的转瓶以及含有 2g / L 实施例2载体的转瓶中，连续培养 7 天，期间取样，描电镜观察微载体表面结构及细胞贴附，DAPI 染色观察细胞在微载体上的生长分布，得到图4。

通常需要将细胞与生长支持物，如平皿、微载体等进行分离，以得到单纯的细胞悬液,一般需要借用胰蛋白酶等进行消化从而收获细胞。实施例1和2是一种温敏相变材料，因此可以直接采用降温相变收获细胞作为细胞治疗的种子，不需要胰酶消化收获细胞。

二维孔板平板组与对比例1上的细胞采用 0.25 %胰酶-EDTA 消化，温度为 37℃。二维孔板平板组与上的 hUCMSCs 在经过 3~4 min 的消化后，细胞从平皿上脱落，500g离心收集；对比例1 直接500 g离心收集；而实施例1 和实施例2经过温度相变，500 g低速离心，可直接收获细胞。

四种情况收获细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的表达量见图5。结果显示，不同方法收获的细胞损伤率存在明显差异。经胰蛋白酶处理的平皿细胞与对比例1 上细胞的LDH 释放率高于未经胰蛋白酶处理的实施例2上的细胞。即胰酶消化造成的细胞损伤大于未进行胰酶消化组的细胞。上述结果表明，胰酶收获细胞过程会对细胞本身造成不可逆的损伤，进而影响到细胞质量。

细胞培养7d长满微载体时，转移至2-4℃低温放置，在60分钟后取10μL细胞悬液计数，即得温敏降温脱落细胞数。再用胰酶消化法收集降温后未脱落细胞，即得胰酶法收获细胞数。

按以下公式计算有效细胞收获率：

总细胞数＝温敏降温脱落细胞总数+胰酶法收获细胞数；

细胞增殖倍数=总细胞收获数/初始细胞接种数

温敏细胞脱附率＝温敏降温脱落细胞数/总细胞收获数。

有效细胞脱附率=温敏细胞脱附率×(1-细胞损伤比率%)

实施例1～2所得温敏微载体均进行上述测试，测试结果，平板组、对比例1、实施例1实施例2所得的细胞脱附率分别为98％、48.8%、89％、93%；收获细胞损伤比率为13.4%、4.7%、3.9%、2.4%；实际有效细胞收获率分别为：84.8%、46.5%、85.5%、90.7%；平板组、对比例1、实施例1、实施例2 细胞增殖倍数分别是：13.2、6.6、19.8、24.5。

以上即为本实施例列举的实施方式，但本实施例不局限于上述可选的实施方式，本领域技术人员可根据上述方式相互任意组合得到其他多种实施方式，任何人在本实施例的启示下都可得出其他各种形式的实施方式。上述具体实施方式不应理解成对本实施例的保护范围的限制，本实施例的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims

1.一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

S2.加入乙酸乙酯溶液，均质搅拌均匀后调整溶液pH；

S3.在搅拌条件下添加pH值稳定剂，所述pH值稳定剂中包含硼砂和磷酸根；

S4.降温后在搅拌条件下滴加到钙离子溶液中，形成可悬浮微球，过滤，离心收集微球，纯化洗涤至溶液呈中性，干燥即得；

所述步骤S1中重组胶原蛋白5.8~6.2wt%，泊洛沙姆407含量为16.5~17.5wt％，海藻酸含量为0.028~0.032wt％；

所述钙离子溶液质量浓度为0.06%。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，其特征在于：所述步骤S2中将溶液的pH值调节为6.8~7.4。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，其特征在于：步骤S3中pH值稳定剂，添加方式为每分钟0.04wt％，50~60分钟加完。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法，其特征在于：步骤S3中pH值稳定剂添加完毕后，溶液中硼砂+磷酸根的浓度为1M，硼砂与磷酸根的摩尔比为1：8-12，溶液的pH范围为6.5±1。

5.一种间充质干细胞培养多孔微载体，其特征在于：使用权利要求1-4任一项所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法制得。

6.根据权利要求5所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体，其特征在于：所述可悬浮微球粒径为200~600um，孔径为20~100um。

7.根据权利要求1-4任一项所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体制备方法制得的间充质干细胞培养多孔微载体或权利求5-6任一项所述的一种间充质干细胞培养多孔微载体的应用，其特征在于：用于回收干细胞。