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CN119192381A - 一种能靶向结合pcsk9的单域抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种能靶向结合pcsk9的单域抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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CN119192381A
CN119192381A CN202311569102.0A CN202311569102A CN119192381A CN 119192381 A CN119192381 A CN 119192381A CN 202311569102 A CN202311569102 A CN 202311569102A CN 119192381 A CN119192381 A CN 119192381A
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CN
China
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sequence
pcsk9
domain antibody
library
sdab
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CN202311569102.0A
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崔晓芳
李伟阳
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Original Assignee
JINING MEDICAL UNIVERSITY
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Abstract

本发明提出一种能靶向结合PCSK9的单域抗体及其制备方法与应用。该单域抗体是来源于驼类的重链抗体可变区，其由框架区(FR区)和互补决定区(CDR区)组成，其中包括三个CDR区如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示，以及四个FR区如SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示。该单域抗体制备方法是利用真核表达的PCSK9抗原免疫羊驼，分离单个核细胞，提取总RNA，经过逆转录和巢式PCR建库，获得PCSK9免疫单域抗体文库；再利用噬菌体展示技术进行筛选，并转化至大肠杆菌表达系统中进行表达，获得PCSK9的单克隆单域抗体株。本发明单域抗体与重组PCSK9蛋白的相互作用良好，能够用于研制抗PCSK9蛋白的抗体类药物，还可用于免疫学检测样本中的PCSK9水平。

Description

一种能靶向结合PCSK9的单域抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药中的抗体药物领域，具体涉及一种能靶向结合PCSK9(前体枯草溶菌素转化酶9)的单域抗体，以及该单域抗体的制备方法及应用。
背景技术
目前市面上主要是采用降低胆固醇的药物来治疗心脑血管疾病。用于降低胆固醇的药物主要有他汀类等。尽管他汀类药物在心血管疾病治疗上表现出色，但随着其广泛使用，产生的弊端也渐渐被发现。首先，他汀类药物治疗患者仍有较高心血管事件残余风险；其次，有大量患者无法耐受他汀类药物，尤其是家族性高胆固醇血症患者，即使接受最大剂量的最有效的他汀类药物治疗，仍然不能达到降低低密度脂蛋白胆固醇浓度的目的。最重要的是，他汀类药物存在多种副作用，如引起患者血糖异常、肌肉毒性、记忆和认知障碍等，严重的副作用会导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭，相当一部分患者因不能忍受副作用带来的肌肉疼痛而终止了治疗。
前体枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)属于枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(LDL-R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有关，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在Dallas Heart Study上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL-c水平会比一般人低28％；在2006年，Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。CopenhagenHeart Study发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL-c水平下降11-15％，冠心病患病率下降6-46％。Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL-c水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL-c，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL-c目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。
PCSK9抑制剂除了能阻止LDL-R回收，还可以抑制NF-κB通道，从而减少血栓、炎症、血管内皮细胞激活等急性冠状动脉综合症的风险。目前PCSK9抑制剂这个领域潜在的研究项目有抑制蛋白抗体、siRNA、反意寡核苷酸以及小分子抑制剂等。单克隆抗体药物因具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，是目前PCSK9抑制剂研究的主要领域。在动物水平的研究显示，加入中和抗PCSK9的抗体之后，小鼠肝脏中的LDL-R表达水平显著上升，血液中LDL-c浓度下降30％。对灵长类动物，PCSK9单克隆抗体也表现出显著的效果，LDL-c水平的下降效果可维持数周以上。到目前为止，还没有发现抗PCSK9蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)、安进的Repatha(evolocumab)和信达生物的IBI-306(tafolecimab)是目前全球市场仅有的三个获批的人源化的PCSK9抗体。
抗体药物是目前新药研发的主要方向之一，在传染病的诊断、防治和生物科学研究领域都已得到了广泛的应用。截止目前，已经有100余款抗体药物成功上市，2021年全球销售排名前10的药物中有4个都为抗体药物。自1993年Hamers等在羊驼血液中发现了天然缺失轻链和恒定区I(CH1)区的重链抗体后，重链抗体的可变区区段又称为单域抗体(Single-domain-antibody,sdAb)逐渐取代其他的小型抗体，成为新型抗体药物研发的热点。sdAb通常只有16千道尔顿左右，约传统抗体大小的十分之一，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH有较强的抵抗力。sdAb缺乏Fc段和轻链的性质使其能够识别传统抗体无法识别的隐蔽表位或小表位，且避免了补体反应；此外，单域抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。序列同源性分析显示，羊驼sdAb的sdAb胚系基因序列和人VH3高度同源，但CDR1和CDR3比人稍长，CDR3在三级结构中向外凸出，因而推测有更高的抗原结合的特异性和亲和力。鉴于以上优点，sdAb正被逐步开发为疾病诊断和治疗方面的单抗药物，广泛的应用于酶的抑制剂，肿瘤、感染和炎症等生物抑制剂的开发上。然而，单域抗体微小的体积虽为其治疗功能提供了很多的优势，但小分子蛋白在体内极容易被消除。通过基因工程将sdAb改造成靶点酶、跨膜蛋白或者双价化能够有效的提高抗体活力和稳定性等，以达到研究目的。在对抑制病毒复制的研究中发现，双价单域抗体的有效性至少是单价单域抗体的60倍，并且在动物体内作用时间更长，有效的延迟了动物的死亡时间。抗体药物的前景巨大，但国内抗体药物仍然处于早期阶段。因此，开发国产化低成本的PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。
现有技术对于PCSK9单域抗体的开发集中在鼠源传统抗体，传统抗体无论是大量表达，还是进行抗体人源化都比较困难，耗时长，花费高，并且有效抗体获得率低，严重限制了PCSK9抗体抑制剂的开发，特别是国内抗体药物刚刚处于起步阶段，完全不能满足CVD患者的需求。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提出一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，以及该单域抗体的制备方法与应用。
本发明所采用的技术解决方案是：
一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，该单域抗体包含重链可变区，重链可变区包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3，互补决定区1的序列如序列1所示，互补决定区2的序列如序列2所示，互补决定区3的序列如序列3所示。
上述框架区包括框架区1、框架区2、框架区3和框架区4，框架区1的序列如序列4所示，框架区2的序列如序列5所示，框架区3的序列如序列6所示，框架区4的序列如序列7所示。
上述重链可变区的序列如序列8所示。
一种表达载体，该表达载体包含的多核苷酸序列如序列9所示。
一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，步骤如下：选取表达载体和宿主细胞，所述表达载体包含的多核苷酸序列如序列9所示；将表达载体转化至宿主细胞中，培养，进行能靶向结合PCSK9的单域抗体的表达。
上述表达载体选用pMECS质粒，宿主细胞选用大肠杆菌HB2151亚型菌株；
或表达载体选用pPICZa质粒，宿主细胞选用酵母X33亚型菌株；
或表达载体选用pCDNA3.1质粒，宿主细胞选用HEK293E型细胞株。
进一步的，上述制备方法包括以下步骤：
利用真核表达的PCSK9抗原免疫羊驼，通过分离外周血单个核细胞，提取总RNA；经过逆转录和巢式PCR建库，获得PCSK9免疫单域抗体文库；将PCSK9抗原包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选PCSK9免疫单域抗体文库，再将筛选出的单域抗体转化至宿主细胞中进行表达，获得PCSK9的单克隆单域抗体株。
更为具体地，上述制备方法的步骤如下：
步骤一、PCSK9单域抗体噬菌体展示文库构建
(11)PCSK9免疫羊驼
免疫前从羊驼的耳缘静脉采血；将PCSK9与等体积的弗氏佐剂混合，注射于羊驼颈部皮下3-5点，每月免疫一次，共免疫注射4次；每次免疫时，采取羊驼外周血10mL于EDTA抗凝管中，连续、缓慢摇动，充分混合；
(12)血液淋巴细胞样品分离
对免疫前和每次免疫后采集的血液样本分离淋巴细胞；
(13)总RNA提取及cDNA合成
取冻存的淋巴细胞，加入Trizol，室温静置，加入氯仿，震荡，室温静置，待溶液分层，离心后，收集上层水相；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置，待核酸沉淀，离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μL用于浓度和纯度测定；
取RNA，采用试剂盒进行cDNA合成；
(14)噬菌体展示文库构建
以cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增羊驼重链抗体的V区；
PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即sdAb片段；
用NEB的限制性内切酶Not I和Pst I分别对sdAb片段和载体进行双酶切；将载体和sdAb片段的酶切产物混合，用NEB的连接酶在4℃连接过夜，得到连接产物；
(15)噬菌体展示库的构建
连接产物经纯化后，取1μL转化TG感受态细胞，37℃复苏2h，梯度稀释至101，102，103，分别取300μL涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数；
采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到107以上；将所有克隆用灭菌后LB液体培养基洗脱下来，离心，沉淀用灭菌后LB液体培养基悬浮，加入等体积的甘油，冻存；
(16)文库多样性检测
随机挑取步骤(5)的克隆40个，作为模板，进行克隆PCR反应；用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证构建的PCSK9单域抗体文库的重组率；然后对其测序，分析PCSK9单域抗体文库的多样性；
(17)噬菌体扩增和拯救
采用辅助噬菌体对PCSK9单域抗体的噬菌体展示库进行扩增和拯救；将步骤(5)保存的单克隆文库接入培养基中培养至对数生长期，加入辅助噬菌体，室温，静置，离心后，沉淀用培养基悬起，接入培养基中，培养过夜；次日，离心，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置，离心，沉淀为PCSK9单域抗体噬菌体库；
步骤二、用噬菌体展示技术淘洗PCSK9单域抗体
(21)亲和PCSK9单域抗体噬菌体库淘洗
取PCSK9抗原包被ELISA板，过夜孵育；次日，加入拯救出的PCSK9单域抗体噬菌体，室温孵育；PBST洗孔，加入三乙胺，室温孵育，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的PCSK9单域抗体噬菌体库；
(22)筛选后噬菌体的扩增和拯救
扩增和拯救方法同步骤(17)；
(23)ELISA评价特异性抗体的富集程度
(24)鉴定PCSK9特异性的单域抗体阳性克隆
(25)阳性克隆序列分析
提取步骤(24)中获得的阳性克隆的DNA对插入片段进行PCR验证，经PCR验证为阳性的克隆进行测序分析；测序结果显示，获得两种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中一种序列具有典型的单域抗体的结构，包括框架区和互补决定区，这一株单域抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：
PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12，其氨基酸序列如序列8所示。其中，框架区1的序列如序列4所示，框架区2的序列如序列5所示，框架区3的序列如序列6所示，框架区4的序列如序列7所示；互补决定区1的序列如序列1所示，互补决定区2的序列如序列2所示，互补决定区3的序列如序列3所示；
编码PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12的核苷酸序列如序列9所示；
步骤三、抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达和纯化
(31)PCSK9单域抗体表达菌构建
首先将PCSK9单域抗体单克隆转接培养基，37℃，过夜培养；次日，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有PCSK9单域抗体序列的质粒转化入表达菌HB2151中，涂布平板，37℃，培养过夜；
(32)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达
从平板挑取5个克隆进行克隆PCR验证质粒是否转入表达菌株；挑取阳性克隆37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG进行诱导表达；离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清；
(33)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的纯化
通过Ni柱亲和纯化获得PCSK9单域抗体sdAb-C12。
上述步骤(14)中，Nest-PCR引物的名称及序列如下：
第一轮中，引物名称为CALL001，其序列如序列10所示；引物名称为CALL002，其序列如序列11所示；
第二轮中，引物名称为sdAb-Back，其序列如序列12所示；引物名称为sdAb-For，其序列如序列13所示。
上述能靶向结合PCSK9的单域抗体在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中的应用；或单域抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中的应用。
本发明的有益技术效果是：
本发明通过限定互补决定区序列等，以得到能靶向结合前体枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)的单域抗体，该单域抗体与PCSK9抗原的相互作用良好，具有继续开发的价值。本发明单域抗体还具有稳定性高、毒性低、可溶性强、易于靶点筛选和易于在原核微生物中直接表达，经济性好等诸多优势。本发明的单域抗体与重组PCSK9蛋白的相互作用良好，能够用于研制抗PCSK9蛋白的抗体类药物，还可用于免疫学检测样本中的PCSK9水平。
本发明单域抗体制备方法利用真核表达的PCSK9抗原免疫羊驼，通过分离外周血单个核细胞，提取总RNA，经过逆转录和巢式PCR建库，获得高质量的PCSK9免疫单域抗体文库。将PCSK9抗原包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选PCSK9免疫单域抗体文库，再将筛选出的单域抗体转化至大肠杆菌表达系统中进行大量表达，从而能够在比较短的时间里获得具有高亲和力的PCSK9的单克隆单域抗体株。
附图说明
图1为本发明实施例中用SDS-PAGE蛋白胶电泳检测PCSK9单域抗体纯化后的情况；
图2为本发明实施例中ELISA验证单域抗体与抗原的结合原理图；
图3为本发明实施例得到的单域抗体sdAb-C12的亲和力测定结果；
图4为分析抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的亲和力常数时的数据处理结果。
具体实施方式
本发明提供一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，其包含重链可变区，重链可变区包括框架区和互补决定区。所述互补决定区包括互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3，互补决定区1的序列如序列1所示，互补决定区2的序列如序列2所示，互补决定区3的序列如序列3所示。
序列1(CDR1)：GSTFKRYA(SEQ ID NO：1)；序列2(CDR2)：IERDLVQPSPPFGGLT(SEQ IDNO：2)；序列3(CDR3)：AAGLKYPAPNQLDYDY(SEQ ID NO：3)。
上述框架区包括框架区1、框架区2、框架区3和框架区4，框架区1的序列如序列4所示，框架区2的序列如序列5所示，框架区3的序列如序列6所示，框架区4的序列如序列7所示。
序列4(FR1)：LQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：6)；序列5(FR2)：MAWFRQAPGKEREFVAA(SEQ ID NO：7)；序列6(FR3)：YYAASVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYC(SEQ ID NO：8)；序列7(FR4)：WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：9)。
上述特异性结合PCSK9抗原的单域抗体sdAb-C12，其氨基酸序列如序列8所示。
序列8：
LQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFKRYAMAWFRQAPGKEREFVAAIERDLVQPFPPSGGLTYYAASVKGRFTIS RDNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYCAAGLKYPAPNQLDYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：4)。
抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明要求保护一种特异性结合PCSK9抗原的单域抗体，其包括重链可变区(sdAb)，上述重链可变区(sdAb)由框架区(FR)和互补决定区(CDR)组成。其中互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为GSTFKRYA(SEQ ID NO：1)；互补决定区2(CDR2)，其序列为IERDLVQPSPPFGGLT(SEQ ID NO：2)；互补决定区3(CDR3)，其序列为AAGLKYPAPNQLDYDY(SEQ ID NO：3)。特异性结合PCSK9抗原的单域抗体，其重链可变区(sdAb)的序列如SEQ ID NO：4即序列8所示。
编码PCSK9单域抗体sdAb-C12的核苷酸序列如序列9所示。
5’-
CTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACCTTCAAGAGGTATGCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCCGCTATTGAGCGTGACCTTGTACAACCGTTTCCGCCGAGCGGTGGTTTGACATACTATGCAGCGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGGATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACGCGGCCGTTTATTACTGCGCAGCAGGATTGAAATATCCTGCCCCTAATCAGCTTGACTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCC-3’(SEQ ID NO：5)。
考虑到编码基因的简并性，并同时考虑到抗体的特异性结合特性由互补决定区决定。因此，本发明要求保护一种编码PCSK9单域抗体sdAb-C12的多核苷酸序列，包括编码上述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列。这样的多核苷酸序列，由于编码基因的简并性，碱基序列可以变化，只要是能够编码SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区即可。优选多核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明提供一种表达载体，含有上述多核苷酸序列。
pET系列载体、pMECS、pPICZα、pFUSE系列或pCDNA系列等载体等均可作为本发明的多核苷酸序列的表达载体。优选表达载体是噬菌体展示载体pMECS。
本发明还提供一种宿主细胞，含有上述表达载体，能够表达出特异性结合PCSK9抗原的单域抗体。众多细胞表达系统如大肠杆菌HB2151、乳酸菌NZ9000、酵母菌X33、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞HEK293F等均可作为本发明的表达载体的宿主细胞。优选宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株。
本发明首先利用CHO细胞(中华仓鼠卵巢细胞)表达的PCSK9抗原免疫羊驼，分离免疫后的羊驼外周血细胞(PBMC)，从中扩增出针对PCSK9抗原的重链可变区(sdAb)文库，删除多余的背景干扰，大大地提高了有效抗体的获得效率。其次本发明结合使用了噬菌体展示技术，能够比较直观的获得抗体亲和信息，在较短时间内获得了高亲和力的PCSK9的单域抗体基因。此外，本发明提供了上述PCSK9单域抗体的制备方案，由于pMECS(噬菌体展示载体)在HA标签和M13 GIII基因之间为琥珀终止子(TAG)，普通的表达系统不能有效识别该终止子，从而有效表达单域抗体蛋白。本发明优化了原核表达系统，对PCSK9单域抗体进行了大量表达和纯化，该单域抗体经ELISA和Biacore T200系统验证具有靶向PCSK9的高特异性和高亲和性，表明本发明得到的PCSK9单域抗体具有继续开发价值。
采用CHO细胞中表达的PCSK9抗原免疫羊驼，采集免疫后的羊驼的外周血细胞(PBMC)，从中分离PCSK9的亲和淋巴细胞，提取总RNA，采用Nest-PCR技术克隆羊驼重链抗体的可变区(V区)，将其插入到噬菌体质粒中，构建噬菌体表达文库。接着通过噬菌体展示技术对PCSK9抗原进行多轮筛选。最后将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量表达纯化，并经过ELISA和Biacore T200对所获得的单域抗体的亲和力和结合常数进行验证。
本发明提供一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其步骤如下：选取表达载体和宿主细胞，所述表达载体包含的多核苷酸序列如序列9所示；将表达载体转化至宿主细胞中，培养，进行能靶向结合PCSK9的单域抗体的表达。
上述表达载体选用pMECS质粒，宿主细胞选用大肠杆菌HB2151亚型菌株。或表达载体选用pPICZa质粒，宿主细胞选用酵母X33亚型菌株。或表达载体选用pCDNA3.1质粒，宿主细胞选用HEK293E型细胞株。
具体地，能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其利用真核表达的PCSK9抗原免疫羊驼，通过分离外周血单个核细胞，提取总RNA。经过逆转录和巢式PCR建库，获得高质量的PCSK9免疫单域抗体文库。将PCSK9抗原包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选PCSK9免疫单域抗体文库，再将筛选出的单域抗体转化至大肠杆菌表达系统中进行大量表达，从而能够在比较短的时间里获得具有高亲和力的PCSK9的单克隆单域抗体株。
下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、PCSK9单域抗体噬菌体展示文库构建
(11)PCSK9免疫羊驼
将500μL的PCSK9的(75μg)与等体积的弗氏佐剂混合至1mL，注射于羊驼颈部皮下3-5点，免疫前从羊驼的耳缘静脉采血。每月免疫一次，共免疫注射4次；每次免疫时，采取羊驼外周血10mL。采血时将羊驼头向一侧固定，对动物采血部位的皮肤先剃毛，75％酒精消毒，待干燥后采血，用手指压迫颈静脉沟处，待血管怒张后，于采血部位消毒进针采血，采集血液10mL于EDTA抗凝管中，立即连续、缓慢摇动，充分混合，置于冰上，运回实验室。
(12)血液淋巴细胞样品分离
对免疫前和每次免疫后采集的血液样本分离淋巴细胞，分离方法如下：
i.在15mL离心管中加入7mL淋巴细胞分离液Ficoll。
ii.在已加入抗凝剂(EDTA)的新鲜全血中加入等体积PBS(1×)或生理盐水，稀释血液，充分混匀。
iii.在淋巴细胞分离液的离心管中，用1mL移液器小心地缓慢加入等体积(7mL)的稀释血液，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上(即两种液体不要混合，保留清晰的界面)，3000g离心20min。
iv.用1mL移液枪将上清(血浆样品)小心转移到1.5mL细胞冻存管中，写上动物编号和血浆字样，放入带绳小布袋中，置液氮罐保存。
v.用1mL移液枪小心分离出白细胞层到一个15mL离心管中；加满PBS(1×)到15mL；用PBS(1×)清洗白细胞，离心(3000g离心20min)，小心倾倒掉上清，不要搅动管底的细胞团块，回收白细胞在剩余0.1-0.2mL PBS中。
vi.加5倍体积的RNA later，轻轻混溶细胞团块，分成2份到1.5mL细胞冻存管中，置液氮罐保存。
(13)总RNA提取及cDNA合成
取一份冻存的淋巴细胞，加入1mL Trizol，室温静置10min后，加入0.2mL氯仿，剧烈震荡，室温静置，待溶液分层(约10min)，12,000rpm离心后，收集上层水相。加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1mL的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清。控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μL用于浓度和纯度测定。
取适量(7～20μg)RNA，采用SuperScriptTMIII First-Strand SynthesisSuperMix(Invitrogen)试剂盒进行cDNA合成，逆转录引物用Oligo dT，合成cDNA在-20℃冻存。
(14)噬菌体展示文库构建
PCR扩增：以上述合成的cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增羊驼重链抗体的V区(sdAb)，表1为Nest-PCR引物的名称及序列，即羊驼sdAb片段扩增使用的引物信息及序列信息。
表1
表1中，序列SEQ ID NO：10对应序列10，序列SEQ ID NO：11对应序列11；序列SEQID NO：12对应序列12，序列SEQ ID NO：13对应序列13。
PCR反应体系如下：
第一轮：cDNA 2μL；2×Master Mix 12.5μL；CALL001 0.5μL；CALL002 0.5μL；水补足至25μL。2×Master Mix(购自KAPA Biosystems公司)
反应条件：95℃5min；94℃1min；57℃1min；72℃1min每个循环；72℃7min；扩增35个循环。
第二轮：模板(第一轮产物)40ng；2*Master Mix 25μL；sdAb-For(10μM)1μL；sdAb-Back(10μM)1μL；水补足至50μL。
反应条件：95℃5min；94℃45s；60℃45s；72℃45s每个循环；72℃7min扩增25个循环。
PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即sdAb片段。
用NEB的限制性内切酶Not I和Pst I分别对sdAb片段和载体(pMECS质粒)进行双酶切，反应体系如下：
载体酶切体系：载体20μg；Pst I 10μL；Not I 20μL；Cutsmart(10×buffer，购自NEB公司)50μL；加H2O至500μL。
片段酶切体系：sdAb片段5μg；PstI 7μL；NotI 14μL；Cutsmart(10×buffer)50μL；加H2O至500μL。
37℃，酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；将载体和sdAb片段的酶切产物混合，用NEB的连接酶在4℃连接过夜。
(15)噬菌体展示库的构建
连接产物经PCR Purification Kit(购自北京天根生化)纯化后，取1μL转化TG感受态细胞，37℃复苏2h，梯度稀释至101，102，103，分别取300μL涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数，约105个克隆/平板。
采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到107以上。将所有克隆用灭菌后LB液体培养基洗脱下来，5,000g，离心5min，沉淀用2mL灭菌后LB液体培养基悬浮，加入等体积的30％甘油，-80℃冻存。
(16)文库多样性检测
随机挑取步骤(5)的克隆40个，作为模板，进行克隆PCR反应，用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证构建的PCSK9单域抗体文库的重组率。然后对其测序，分析PCSK9单域抗体文库的多样性，测序结果显示，40个单克隆有35种氨基酸序列，表明构建的文库有较好的多样性。
(17)噬菌体扩增和拯救
采用辅助噬菌体对PCSK9单域抗体的噬菌体库进行扩增和拯救。将步骤(15)保存的单克隆文库接入100mL培养基中培养至对数生长期，加入MOI(multiplicity ofinfection，感染复数)为20的辅助噬菌体M13，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300mL培养基中，培养过夜。次日，3,000g离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000离心30min，沉淀为PCSK9单域抗体噬菌体库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为2.9×1012pfu/mL。
步骤二、用噬菌体展示技术淘洗PCSK9单域抗体
(21)亲和PCSK9单域抗体噬菌体库淘洗
取50ng PCSK9抗原包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入拯救出的PCSK9单域抗体噬菌体，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μL三乙胺，室温，孵育30min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的PCSK9单域抗体噬菌体库。取10μL感染TG1大肠杆菌细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余筛选后的噬菌体的用于扩增。
(22)筛选后噬菌体的扩增和拯救
扩增和拯救方法同步骤(17)，获得的PBS悬浮液即扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选。按上述相同筛选步骤，逐次递减抗原量，筛选3-4轮。
(23)ELISA评价特异性抗体的富集程度
ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃，过夜；次日加5％的BSA室温封闭1h。实验组分别加入每轮淘洗后扩增的噬菌体，对照组加入等量野生型的噬菌体，室温，孵育2h。PBST洗10次，以去除没有结合的噬菌体。加入HRP标记的抗M13抗体，室温孵育1h；加入显色液，避光反应15min，测吸光值，吸光值随着淘洗次数逐渐上升，并在第三轮到第四轮淘洗时趋于稳定，表明特异性的抗体得到了富集。
(24)鉴定PCSK9特异性的单域抗体阳性克隆
ELISA板包被100ng的PCSK9抗原，4℃孵育过夜。取最后一轮筛选获得的噬菌体涂布的平板，随机挑取38个单克隆于1mL培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清。同时取ELISA板，加2％的BSA室温封闭1h。实验组每孔加入单克隆破碎上清，对照组加入空白TG1破碎上清，室温，孵育2h。PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h。PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h。加入底物，根据实际情况反应5～20min，在酶标仪上读取吸光值。当吸光值与对照孔比值大于2.1(Base line)时，判定为阳性克隆。
(25)阳性克隆序列分析
提取步骤(24)中获得的25个阳性克隆的DNA对插入片段进行PCR验证，经PCR验证为阳性的克隆进行测序分析。测序结果显示，获得两种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中一种序列具有典型的单域抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这一株单域抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：
PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12，其氨基酸序列为：
LQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFKRYAMAWFRQAPGKEREFVAAIEREIPGHPAWSGLTYYAASVKGRFTISR DNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYCAAGLKYPAPNQLDYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：4)。其中，框架区1的序列为LQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：6)，框架区2的序列为MAWFRQAPGKEREFVAA(SEQ ID NO：7)，框架区3的序列为YYAASVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYC(SEQ ID NO：8)，框架区4的序列为WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：9)；互补决定区1的序列为GSTFKRYA(SEQ ID NO：1)，互补决定区2的序列为IERDLVQPSPPFGGLT(SEQ ID NO：2)，互补决定区3的序列为AAGLKYPAPNQLDYDY(SEQ ID NO：3)。
编码PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12的核苷酸序列为：
5’-CTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGC ACCTTCAAGAGGTATGCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCCGCTATTGAGCGTGACCTTGTACAACCGTTTCCGCCGAGCGGTGGTTTGACATACTATGCAGCGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGGATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACGCGGCCGTTTATTACTGCGCAGCAGGATTGAAATATCCTGCCCCTAATCAGCTTGACTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCC-3’(SEQ ID NO：5)。
步骤三、抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达和纯化
(31)PCSK9单域抗体表达菌构建
首先将PCSK9单域抗体单克隆转接培养基，37℃，过夜培养；次日，用Plasmid小提试剂盒(购自北京天根生化科技公司)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有PCSK9单域抗体序列的质粒转化入表达菌HB2151中，涂布平板，37℃，培养过夜。
(32)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达
次日，从平板挑取5个克隆进行克隆PCR验证质粒是否转入表达菌株。挑取阳性克隆37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG进行诱导表达。离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清。
(33)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的纯化
通过Ni柱亲和纯化获得PCSK9单域抗体sdAb-C12。Ni柱先用超纯水清洗，然后用裂解液清洗；将上述PCSK9单域抗体表达菌的破碎上清以1mL/min的流速加入Ni柱。用5倍柱体积的亲和A液(20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用等体积的亲和B液(250mM咪唑)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。最后用13％浓度的SDS-PAGE蛋白胶电泳检测PCSK9单域抗体纯化后的情况，如图1所示。分子量标准如图中左侧泳道所示，单位为千道尔顿(KDa)；泳道1和2分别为sdAb-C12在还原条件下和非还原条件的条带位置(～15KDa)。
上述能靶向结合PCSK9的单域抗体可在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中应用；或单域抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中应用。
如可提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的单域抗体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
对PCSK9与其单域抗体sdAb-C12的亲和力测定，具体如下：
(1)ELISA法分析PCSK9单域抗体sdAb-C12的结合性
实验组以50ng的PCSK9蛋白包被酶标板(预留PBS空白对照组)，No-coating对照组为不包被抗原的对照组，25℃孵育2小时。随后加5％的BSA室温封闭1小时；取纯化的PCSK9单域抗体sdAb-C12分别加入实验组，空白组加入PBS，室温，孵育2小时。如图2所示，1×PBST洗8次，加入鼠抗his标签的抗体，室温1小时；1×PBST洗5次；加入底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，反应10分钟左右，在酶标仪上读取OD450nm处的吸光值。ELISA检测结果如图3所示，从图3显示来看sdAb-C12单域抗体对PCSK9具有较好的结合性，结合力远远高于对照组。
(2)Biacore T200分析抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的亲和力常数
活化芯片后，将PCSK9抗原偶联到Biacore机器用的CM5芯片上，进行偶联反应至约800RU的水平后停止。随后加入200μl的1M乙醇胺盐酸洗掉残留的活性羧基基团；接着机器将梯度稀释好的PCSK9的单域抗体sdAb-C12(250nM-125nM-62.5nM-31.25nM-15.6nM-7.8nM-3.9nM)依次泵入流过芯片表面，速率为30μL/min，结合120s，解离180s；获得数据后，进行结果处理，结果如图4所示。单域抗体sdAb-C12与抗原PCSK9相互作用的参数分别是，Kon(1/Ms)＝1.594E+5为结合常数，Koff(1/s)＝0.01063为解离常数，Rmax(RU)＝32.43为最大结合响应值，KD(M)＝6.669E-8M，为抗原抗体相互作用的亲和力数值；表明这个单域抗体与PCSK9抗原的相互作用良好，具有继续开发的价值。
序列1：GSTFKRYA；
序列2：IERDLVQPSPPFGGLT；
序列3：AAGLKYPAPNQLDYDY；
序列4：LQESGGGLVQAGGSLRLSCAAS；
序列5：MAWFRQAPGKEREFVAA；
序列6：YYAASVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYC；
序列7：WGQGTQVTVSS；
序列8：
LQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFKRYAMAWFRQAPGKEREFVAAIERDLVQPFPPSGGLTYYAASVKGRFTIS RDNAKNTVDLQMNSLKPEDAAVYYCAAGLKYPAPNQLDYDYWGQGTQVTVSS；
序列9：
5’-
CTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACCTTCAAGAGGTATGCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCCGCTATTGAGCGTGACCTTGTACAACCGTTTCCGCCGAGCGGTGGTTTGACATACTATGCAGCGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGGATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACGCGGCCGTTTATTACTGCGCAGCAGGATTGAAATATCCTGCCCCTAATCAGCTTGACTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCC-3’；
序列10：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
序列11：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
序列12：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG；
序列13：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT。

Claims (10)

1.一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，其特征在于：该单域抗体包含重链可变区，重链可变区包括框架区和互补决定区；所述互补决定区包括互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3，互补决定区1的序列如序列1所示，互补决定区2的序列如序列2所示，互补决定区3的序列如序列3所示。
2.根据权利要求1所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，其特征在于：所述框架区包括框架区1、框架区2、框架区3和框架区4，框架区1的序列如序列4所示，框架区2的序列如序列5所示，框架区3的序列如序列6所示，框架区4的序列如序列7所示。
3.根据权利要求2所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体，其特征在于：所述重链可变区的序列如序列8所示。
4.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含的多核苷酸序列如序列9所示。
5.一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其特征在于步骤如下：选取表达载体和宿主细胞，所述表达载体包含的多核苷酸序列如序列9所示；将表达载体转化至宿主细胞中，培养，进行能靶向结合PCSK9的单域抗体的表达。
6.根据权利要求5所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其特征在于：所述表达载体选用pMECS质粒，所述宿主细胞选用大肠杆菌HB2151亚型菌株；
或所述表达载体选用pPICZa质粒，所述宿主细胞选用酵母X33亚型菌株；
或所述表达载体选用pCDNA3.1质粒，所述宿主细胞选用HEK293E型细胞株。
7.根据权利要求5所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
利用真核表达的PCSK9抗原免疫羊驼，通过分离外周血单个核细胞，提取总RNA；经过逆转录和巢式PCR建库，获得PCSK9免疫单域抗体文库；将PCSK9抗原包被在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选PCSK9免疫单域抗体文库，再将筛选出的单域抗体转化至宿主细胞中进行表达，获得PCSK9的单克隆单域抗体株。
8.根据权利要求7所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
步骤一、PCSK9单域抗体噬菌体展示文库构建
(11)PCSK9免疫羊驼
免疫前从羊驼的耳缘静脉采血；将PCSK9与等体积的弗氏佐剂混合，注射于羊驼颈部皮下3-5点，每月免疫一次，共免疫注射4次；每次免疫时，采取羊驼外周血10mL于EDTA抗凝管中，连续、缓慢摇动，充分混合；
(12)血液淋巴细胞样品分离
对免疫前和每次免疫后采集的血液样本分离淋巴细胞；
(13)总RNA提取及cDNA合成
取冻存的淋巴细胞，加入Trizol，室温静置，加入氯仿，震荡，室温静置，待溶液分层，离心后，收集上层水相；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置，待核酸沉淀，离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μL用于浓度和纯度测定；
取RNA，采用试剂盒进行cDNA合成；
(14)噬菌体展示文库构建
以cDNA为模板，采用Nest-PCR扩增羊驼重链抗体的V区；
PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，切胶回收目的条带，进行第二轮PCR，目的基因片段在500bp处，切胶回收目的条带，即sdAb片段；
用NEB的限制性内切酶Not I和Pst I分别对sdAb片段和载体进行双酶切；将载体和sdAb片段的酶切产物混合，用NEB的连接酶在4℃连接过夜，得到连接产物；
(15)噬菌体展示库的构建
连接产物经纯化后，取1μL转化TG感受态细胞，37℃复苏2h，梯度稀释至101，102，103，分别取300μL涂布平板，37℃，过夜培养，计算克隆数；
采用上述相同的转化方法，大量转化，直到文库的克隆数达到107以上；将所有克隆用灭菌后LB液体培养基洗脱下来，离心，沉淀用灭菌后LB液体培养基悬浮，加入等体积的甘油，冻存；
(16)文库多样性检测
随机挑取步骤(5)的克隆40个，作为模板，进行克隆PCR反应；用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证构建的PCSK9单域抗体文库的重组率；然后对其测序，分析PCSK9单域抗体文库的多样性；
(17)噬菌体扩增和拯救
采用辅助噬菌体对PCSK9单域抗体的噬菌体展示库进行扩增和拯救；将步骤(5)保存的单克隆文库接入培养基中培养至对数生长期，加入辅助噬菌体，室温，静置，离心后，沉淀用培养基悬起，接入培养基中，培养过夜；次日，离心，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置，离心，沉淀为PCSK9单域抗体噬菌体库；
步骤二、用噬菌体展示技术淘洗PCSK9单域抗体
(21)亲和PCSK9单域抗体噬菌体库淘洗
取PCSK9抗原包被ELISA板，过夜孵育；次日，加入拯救出的PCSK9单域抗体噬菌体，室温孵育；PBST洗孔，加入三乙胺，室温孵育，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的PCSK9单域抗体噬菌体库；
(22)筛选后噬菌体的扩增和拯救
扩增和拯救方法同步骤(17)；
(23)ELISA评价特异性抗体的富集程度
(24)鉴定PCSK9特异性的单域抗体阳性克隆
(25)阳性克隆序列分析
提取步骤(24)中获得的阳性克隆的DNA对插入片段进行PCR验证，经PCR验证为阳性的克隆进行测序分析；测序结果显示，获得两种核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中一种序列具有典型的单域抗体的结构，包括框架区和互补决定区，这一株单域抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：
PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12，其氨基酸序列如序列8所示。其中，框架区1的序列如序列4所示，框架区2的序列如序列5所示，框架区3的序列如序列6所示，框架区4的序列如序列7所示；互补决定区1的序列如序列1所示，互补决定区2的序列如序列2所示，互补决定区3的序列如序列3所示；
编码PCSK9单域抗体蛋白sdAb-C12的核苷酸序列如序列9所示；
步骤三、抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达和纯化
(31)PCSK9单域抗体表达菌构建
首先将PCSK9单域抗体单克隆转接培养基，37℃，过夜培养；次日，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有PCSK9单域抗体序列的质粒转化入表达菌HB2151中，涂布平板，37℃，培养过夜；
(32)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的诱导表达
从平板挑取5个克隆进行克隆PCR验证质粒是否转入表达菌株；挑取阳性克隆37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG进行诱导表达；离心菌液，收集菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体，离心收集破碎后的菌体上清；
(33)抗PCSK9单域抗体sdAb-C12的纯化
通过Ni柱亲和纯化获得PCSK9单域抗体sdAb-C12。
9.根据权利要求8所述的一种能靶向结合PCSK9的单域抗体的制备方法，其特征在于，步骤(14)中，Nest-PCR引物的名称及序列如下：
第一轮中，引物名称为CALL001，其序列如序列10所示；引物名称为CALL002，其序列如序列11所示；
第二轮中，引物名称为sdAb-Back，其序列如序列12所示；引物名称为sdAb-For，其序列如序列13所示。
10.如权利要求1-3中任一权利要求所述能靶向结合PCSK9的单域抗体在制备抗PCSK9蛋白单抗类药物中的应用；或单域抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测PCSK9中的应用。
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