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CN119176859A - 呼吸道合胞病毒f蛋白突变体及其应用 - Google Patents

呼吸道合胞病毒f蛋白突变体及其应用 Download PDF

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CN119176859A CN202411699509.XA CN202411699509A CN119176859A CN 119176859 A CN119176859 A CN 119176859A CN 202411699509 A CN202411699509 A CN 202411699509A CN 119176859 A CN119176859 A CN 119176859A
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Abstract

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体及其应用，涉及生物技术领域。该呼吸道合胞病毒F蛋白突变体含有至少一个重组F2‑F1多肽，每个重组F2‑F1多肽分别独立的含有F0多肽的突变后片段，突变包括：（Ⅰ）位置104~144缺失并被连接肽取代；（Ⅱ）155C取代、289C取代、149C取代、458C取代；155C和289C之间组成二硫键，149C和458C组成二硫键；和，（Ⅲ）373R取代。该呼吸道合胞病毒F蛋白突变体具有优异的免疫原性、抗原性、稳定性和耐受性。

Description

呼吸道合胞病毒F蛋白突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体及其应用。
背景技术
如下陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
呼吸道病毒感染是全球最重要的公共卫生负担之一，每年导致全世界数百万人住院治疗。呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是2岁以下儿童和65岁以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管RSV感染引起的呼吸道疾病危害严重，但目前仍缺乏有效预防RSV的手段。
主流疫苗抗原的选择主要集中在F蛋白，尤其是融合前构象的F蛋白（PreF）。融合前构象的F蛋白相比融合后构象的F蛋白可以暴露更多具有中和活性的潜在表位，如仅在PreF中存在的表位Φ。针对表位Φ产生的抗体具有优秀的中和活性，与融合前构象的F蛋白结合后，可以阻断通过F蛋白构象变化介导的病毒膜融合。同时，抗原三聚体的纯度与抗原免疫原性存在一定程度的正相关性。尽管目前有两种专门针对RSV的重组蛋白疫苗上市，但抗原制备过程中的三聚体产量较低，导致收率低。
因此，提供一种具有更高三聚体收率，从而增强免疫原性和改善稳定性的RSV抗原，以及包含其的疫苗成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，以改进现有RSV抗原的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
第一方面，提供了一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，该呼吸道合胞病毒F蛋白突变体含有至少一个重组F2-F1多肽，每个所述重组F2-F1多肽分别独立的含有F0多肽的突变后片段，所述突变包括：
（Ⅰ）位置104~144缺失并被连接肽取代；
（Ⅱ）含有以下用于组成二硫键的位置的取代：155C取代、289C取代、149C取代、458C取代；155C和289C之间组成二硫键，149C和458C组成二硫键；和，
（Ⅲ）373R取代；
所述位置对应于SEQ ID NO.1所示野生型F0多肽的氨基酸序列。
第二方面，还提供了一种生物材料，包括多核苷酸、载体或细胞；其中，所述多核苷酸编码上述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体；所述载体携带所述多核苷酸；所述细胞携带所述多核苷酸、或含有所述载体或能够表达所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
第三方面，还提供了第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或第二方面所述的生物材料在如下（X1）~（X4）中的应用：
（X1）制备结合呼吸道合胞病毒抗原表位的抗体；
（X2）制备预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗；
（X3）制备呼吸道合胞病毒诊断产品；
（X4）非诊断和治疗目的的检测呼吸道合胞病毒。
第四方面，还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，所述预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗含有第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或第二方面所述的生物材料。
第五方面，还提供了一种呼吸道合胞病毒诊断试剂或试剂盒，所述呼吸道合胞病毒诊断试剂或试剂盒含有第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白突变体，通过特定的氨基酸突变改造，使得重组F2-F1多肽有利于形成高纯度的三聚体结构，并在宿主细胞中实现高表达量。这些突变体展现出了良好的抗原性和免疫原性，同时在热稳定性、pH稳定性以及渗透压稳定性方面表现出色。本发明提供的RSV F蛋白突变体在免疫接种中能够诱导产生中和抗体，显示出优异的免疫保护效果。综上所述，本发明的RSV F蛋白突变体在多个稳定性方面表现优异，为疫苗开发提供了重要的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4序列K007蛋白的SDS-PAGE结果，M1为Marker，R代表还原条带，NR代表非还原条带；
图2为实施例4序列K015蛋白的SDS-PAGE结果，M1为Marker，R代表还原条带，NR代表非还原条带；
图3为实施例4序列K016蛋白的SDS-PAGE结果，M1为Marker，R代表还原条带，NR代表非还原条带；
图4为实施例4序列DS-Cav1蛋白的SDS-PAGE结果，M1为Marker，R代表还原条带，NR代表非还原条带。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本文中，除非另有说明，任意编号是用以区分一个实体或行为与另一个实体或行为，而非必须要求或暗示这些实体或行为之间的任何实际的这种关系、顺序或重要程度，例如编号（Ⅰ）~（Ⅲ），（ⅰ）~（ⅳ），（A1）~（A5），（B1）~（B4）和（X1）~（X4）等。
本文中，除另有说明，“任选地”“任选”、“可选的”或“可选”是指意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
本文中，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
本文中，“每个…独立地选自”与“…分别独立地选自”和“…独立地选自”可以互换，均应做广义理解，其指的是一组变量或组分中的每个成员可以独立选择的范围或选项，即每个变量或组分的选择是独立的，不受其他变量或组分选择的影响。
本文中，术语“F0多肽”、“F0蛋白”或“F0”是指RSV F蛋白的前体多肽，天然F0多肽由信号多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列和F2多肽序列组成。极少例外，已知野生型RSV毒株的F0多肽由574个氨基酸组成。
本文中，术语“F1多肽”、“F1蛋白”或“F1”是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F1多肽包括RSV F0前体的近似残基137~574且由（从N-末端至C-末端）细胞外区域（近似残基137~524）、跨膜结构域（近似残基525~550）和细胞质结构域（近似残基551~574）组成。
本文中，术语“F2多肽”、“F2多肽”或“F2”是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F2多肽包括RSV F0前体的近似残基26~109。
本文中，术语“天然”或“野生型”蛋白、序列或多肽是指未通过选择性突变人工修饰的天然存在的蛋白、序列或多肽。
本文中，术语“F0多肽”、“F1多肽”、和“F2多肽”包含来自天然序列的多肽或经修饰的多肽，人工改造包括但不限于氨基酸取代、插入或缺失。所述修饰例如被设计以稳定F突变体或增强F突变体的免疫原性的修饰。在天然RSV F蛋白中，F2多肽通过两个二硫键连接至F1多肽以形成F2-F1异二聚体。
本文中，术语“F蛋白”、“F多肽”“RSV F蛋白”泛指任意状态下的“F0多肽”、“F1多肽”、和“F2多肽”中的一种或全部。
本文中，术语“pep27多肽”或“pep27”是指在RSV F蛋白成熟期间从F0前体切除的27个氨基酸的多肽。pep27的序列侧接两个弗林蛋白酶切割位点，所述弗林蛋白酶切割位点在F蛋白成熟期间通过细胞蛋白酶切割以生成F1多肽和F2多肽。
本文中，术语“DS-Cav1”是指RSV F蛋白的具有McLellan等人，Science, 342(6158), 592-598, 2013中所述的氨基酸序列的形式，氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
本文中，术语“D25”是指WO 2008/147196 A2中所述的抗体，特异性识别表位Φ，其具有包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的轻链可变结构域。
本文中，术语“AM14”是指WO 2008/147196 A2中所述的抗体，识别的融合前三聚体特异性四元表位，其具有包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ IDNO.9的氨基酸序列的轻链可变结构域。
本文中，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸包括由遗传密码编码的氨基酸及其经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。常见的天然氨基酸例如：丙氨酸（Ala；A）、精氨酸（Arg；R）、天冬酰胺（Asn；N）、天冬氨酸（Asp；D）、半胱氨酸（Cys；C）；谷氨酸（Glu；E）、谷氨酰胺（Gln；Q）、甘氨酸（Gly；G）；组氨酸（His；H）、异亮氨酸（Ile；I）、亮氨酸（Leu；L）、赖氨酸（Lys；K）、甲硫氨酸（Met；M）、苯丙氨酸（Phe；F）、脯氨酸（Pro；P）、丝胺酸（Ser；S）、苏氨酸（Thr；T）、色氨酸（Trp；W）、酪氨酸（Tyr；Y）和缬氨酸（Val；V）。
本文中，取代使用如下方式表示：“取代位置X2”或“X1取代位置X2”，X1表示取代前该位置的氨基酸残基，X2表示取代后的氨基酸残基；当采用“取代位置X2”表示，则意味着不限制取代前该位置的具体氨基酸残基种类。例如155C表示取代后第155是C，A149C表示第149位取代前是A，取代后是C。
本文中，如无特别说明，本文中RSV F0多肽氨基酸位置参照SEQ ID NO.1所示RSVF0蛋白的氨基酸序列。
天然RSV F蛋白在RSV亚型间展现显著序列保守性。例如，RSV亚型A和B共享90%序列同一性。在RSV亚型内，F0序列同一性甚至更高；例如在RSV A、B亚型各自内，RSV F0前体蛋白具有约98%序列同一性。几乎所有鉴定的RSV F0前体序列都由574个氨基酸长度组成，且长度通常由于C-末端胞质尾区的长度而有微小差异。各种天然RSV F蛋白间的序列同一性是本领域已知的。为了进一步说明F蛋白的序列保守水平，来自代表性RSV A毒株和RSV B毒株的F0前体多肽序列间的非共有氨基酸残基分别提供于表1和2中。
表1 来自所选RSV A株的F蛋白序列间的非共有氨基酸残基。
表2 来自所选RSV B株的F蛋白序列间的非共有氨基酸残基
鉴于RSV F序列的实质性保守性，本领域普通技术人员可容易地比较不同天然RSVF序列之间的氨基酸位置以鉴定不同RSV毒株和亚型之间的相应RSV F氨基酸位置。例如，在几乎所有鉴定的天然RSV F0前体蛋白间，弗林蛋白酶切割位点落在相同氨基酸位置中。因此，天然RSV F蛋白序列在毒株和亚型间的保守性容许使用参照RSV F序列来比较RSVF蛋白中特定位置的氨基酸。
本文中，如无特别说明，本文中RSV F0蛋白氨基酸位置参照SEQ ID NO.1中所述F0前体多肽的序列（RSV A2毒株的全长天然F前体多肽的氨基酸序列；对应于GenInfo标识符GI 138251和Swiss Prot标识符P03420）给出。因此取代位置是对应于SEQ ID NO.1所示野生型F0蛋白的氨基酸序列中的位置。
然而，应注意到，且本领域技术人员将理解，例如，如果与SEQ ID NO.1相比添加或移除额外氨基酸残基，则不同RSV F0序列可以具有不同编号系统。因此，应理解，在通过其编号提及特定氨基酸残基时，该说明不仅限于当从给定氨基酸序列开始计数时精确地位于该编号位置的氨基酸，而还是指任何和所有RSV F序列中的等效/相应氨基酸残基，即使该残基不在相同精确编号位置，例如如果RSV序列短于或长于SEQ ID NO.1，或与SEQ ID NO.1相比具有插入或缺失。
本文中，术语“同一性（identity）”百分比是指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等效位置相同的程度。氨基酸序列同一性百分比的比对可以采用所属技术领域中各种方式进行，例如本领域熟知的BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN（DNASTAR）、CLUSTALW或CLUSTAL OMEGA等软件。本领域技术人员可确定比对序列的适当参数，包括要实现比较序列全长的最大比对所需的任何算法。
本文中，术语“保守氨基酸取代”指的是将一种氨基酸残基替换为另一种在物理化学性质上相似的氨基酸残基，且替换后使整个多肽或蛋白的性质和功能不发生或几乎不发生改变，保守氨基酸取代是本领域普通技术人员所熟知的。以下是彼此视为保守取代的氨基酸的实例：A、S和T相互替换取代；D和E互替换取代；N和Q互替换取代；R和K互替换取代；I、L、M和V互替换取代；以及F、Y和W互替换取代。
本文中，术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。当核酸分子编码蛋白或多肽，编码可选地为编码正义链或反义链。核酸分子可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可任意互换使用。
本文中，术语“载体”是指可将遗传元件（例如前述核酸分子）操作性地插入其中并使该遗传元件获得表达的一种运载工具，例如产生由该遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA，或者复制所述遗传元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、附加体质粒、微环DNA、噬菌粒、柯斯质粒（cosmid）、人工染色体如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1衍生的人工染色体（PAC）、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，本公开提供的载体（例如表达载体）含有本公开所述的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子（例如，SV40、CMV、EF-1α），以及至少一个选择标记。
第一方面，提供了一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，该呼吸道合胞病毒F蛋白突变体含有至少一个重组F2-F1多肽，每个所述重组F2-F1多肽分别独立的含有F0多肽的突变后片段，所述突变包括：
（Ⅰ）位置104~144缺失并被连接肽取代；
（Ⅱ）含有以下用于组成二硫键的位置的取代：155C取代、289C取代、149C取代、458C取代；155C和289C之间组成二硫键，149C和458C组成二硫键；和，
（Ⅲ）373R取代；
所述位置对应于SEQ ID NO.1所示野生型F0多肽的氨基酸序列。
可选的实施方式中，155C取代是S155C取代；和/或，289C取代是M289C取代；和/或，149C取代是A149C取代；和/或，458C取代是Y458C取代。
可选的实施方式中，所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体是多聚体，含有至少两个或至少三个所述重组F2-F1多肽，优选是含有三个重组F2-F1多肽的多聚体。
可选的实施方式中，所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体是三聚体，所述重组F2-F1多肽通过T4 Fibritin的多聚化结构域或GCN4的多聚化结构域形成三聚体。
可选的实施方式中，T4 Fibritin的多聚化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.14。
可选的实施方式中，GCN4的多聚化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15。
可选的实施方式中，所述突变还包括填充空腔的氨基酸取代，所述填充空腔的氨基酸取代选自（A1）或（A2）或（A3）：
（A1）190F、190I、207L、54H、296I和488W中的至少一种；
（A2）190F和207L取代；
（A3）54H、296I和488W取代。
可选的实施方式中，所述突变还包括静电突变的氨基酸取代，所述静电突变的氨基酸取代选自（B1）或（B2）或（B3）：
（B1）46G、465Q、92D、486S、486H、487Q和489H中的至少一种；
（B2）46G、465Q和92D取代；
（B3）486H、487Q和489H取代。
可选的实施方式中，每个所述重组F2-F1多肽由N端至C端分别独立的含有如下结构：
[F2多肽片段]-[连接肽1]-[F1多肽片段]-[连接肽2]-[多聚化结构域]；
所述F2多肽片段是F0多肽位置的第26至103位；
所述F1多肽片段是F0多肽位置的第145至（510~524）位，例如可以为但不限于为F0蛋白位置的第145至510位、145至513位、145至515位、145至518位、145至520位、145至521位、145至522位或145至524位，优选为第145至524位。
可选的实施方式中，结构[F2多肽片段]-[连接肽1]-[F1多肽片段]-[连接肽2]-[多聚化结构域]还满足如下（ⅰ）~（ⅳ）中的一项或多项：
（ⅰ）多聚化结构域是三聚化结构域；
（ⅱ）多聚化结构域选自T4 Fibritin的多聚化结构域或GCN4的多聚化结构域；
（ⅲ）连接肽1选自GS、GG或SAIG；
（ⅳ）连接肽2选自SAIG。
可选的实施方式中，所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体还连接有凝血酶识别序列和/或至少一个纯化标签。纯化标签选自本领域已知的、常规的纯化标签，示例性的纯化标签包括但不限于组氨酸标签、组氨酸标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、FLAG标签、链霉素标签或Avi标签。
第一方面提供的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体中的用于作为突变基础的F0多肽的氨基酸序列可以选自本领域已知的、任选的各亚型的野生型F0多肽的氨基酸序列或经这些野生型氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列。来自不同RSV亚型的众多种天然RSV F蛋白的氨基酸序列以及编码此类蛋白的核酸序列是本领域已知的。例如，几种亚型A、B RSV F0前体蛋白的序列如SEQ ID NO.1（毒株A2）、SEQ ID NO.2（毒株B18537）、SEQ ID NO.3（毒株Ontario）、SEQ ID NO.4（毒株Buenos Aires）、SEQ ID NO.10（毒株ON 1）和SEQ ID NO.11（毒株BA 9）所示。
可选的实施方式中，所述F0多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、2、3、4、10、11或12所示序列。
可选的实施方式中，所述F0多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、2、3和4所示序列。
可选的实施方式中，所述F0多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.12，优选为SEQ ID NO.12。
可选的实施方式中，每个所述重组F2-F1多肽的氨基酸序列分别独立的选自SEQID NO.24~33所示序列。
第一方面提供的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体可采用本领域已知的、任选的方法进行制备。可选地应用基因工程技术通过重组表达获得，例如通过中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、肿瘤细胞系、BHK细胞、HEK293细胞系等哺乳动物细胞或细菌、酵母、真菌、昆虫细胞等，或转基因动物，或转基因植物重组表达。可选地应用如通过病毒载体形式将所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变递送至目标宿主细胞中，例如使用腺病毒(人的和黑猩猩的)、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒载体等。可选地应用如通过裸露或包封后的核酸载体形式将所述呼吸道合胞病毒F蛋白递送至目标宿主细胞中，例如使用线性RNA、环状RNA、dsDNA、cDNA等。可选地应用本专业领域常用或已知的形式获得所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
第二方面，还提供了一种生物材料，包括多核苷酸、载体或细胞；其中，所述多核苷酸编码上述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体；所述载体携带所述多核苷酸；所述细胞携带所述多核苷酸、或含有所述载体或能够表达所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
第三方面，还提供了第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或第二方面所述的生物材料在如下（X1）~（X4）中的应用：
（X1）制备结合呼吸道合胞病毒抗原表位的抗体；
（X2）制备预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗；
（X3）制备呼吸道合胞病毒诊断产品；
（X4）非诊断和治疗目的的检测呼吸道合胞病毒。
第四方面，还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，所述预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗含有第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或第二方面所述的生物材料。
可选的实施方式中，所述疫苗还包含本领域可接受的任选的辅料，包括但不限于佐剂，例如铝盐（如磷酸铝、氢氧化铝或硫酸铝钾），油乳佐剂（如弗氏佐剂、白油Span佐剂、MF-59、ISA 206、ISA 720、佐剂-65或SAF），核苷酸佐剂（CpG ODN、dsRNA或IL-12 DNA）；稳定剂，例如糖（如乳糖或蔗糖）、氨基酸（如甘氨酸）、明胶和蛋白质（如重组人血白蛋白）；表面活性剂；和稀释剂，例如水中的一种或多种。
可选的实施方式中，所述预防呼吸道合胞病毒感染包括预防RSV A亚型和/或B亚型。
可选的实施方式中，所述预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗是重组蛋白疫苗，含有第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
可选的实施方式中，所述预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗是核酸疫苗，含有编码所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体的DNA或整合有所述编码所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体DNA的载体。
可选的实施方式中，所述预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗是RNA疫苗，含有编码所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体的RNA，例如mRNA或环状RNA。
第五方面，还提供了一种呼吸道合胞病毒诊断试剂或试剂盒，所述呼吸道合胞病毒诊断试剂或试剂盒含有第一方面所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒还任选地包括本领域用于检测反应使用的，本领域技术人员熟知的试剂和/或耗材，包括但不限于缓冲试剂、盐、二抗、显色底物、封闭液、洗涤液、溶剂、洗脱液、偶联剂、阴性对照、阳性对照、标准品、质控品和标记物中的一种或多种。
可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒可用于本领域可接受的、一般的免疫检测方法中，包括但不限于免疫荧光染色、流式分选、免疫印记、免疫组化、ELISA、免疫层析或免疫磁珠中，本领域技术人员可根据对应的检测手段配制试剂或试剂盒中的其他试剂，本发明对此不做限制。
可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒中的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体用于检测样本中是否存在抗呼吸道合胞病毒抗原抗体，以检测受试者是否感染呼吸道合胞病毒。
可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒中的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体作为标准品和/或质控品。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
制备例1
本制备例提供了一种RSV Pre-F蛋白突变体的制备方法，包括：设计目标RSV Pre-F蛋白突变体的DNA序列，进行序列优化及DNA合成。将完整序列克隆到pcDNA3.1载体上。对质粒进行抽提。在37°C、5% CO2条件下培养CHO-S细胞。转染前一天接种适当浓度的细胞，转染当天，将质粒与转染剂混合，加入细胞中。转染后约24小时，向细胞中DMEM+10%FBS。培养5天后，对细胞上清液进行离心和过滤。用AmMagTMNi Magnetic Beads对过滤后的细胞上清液进行第一次纯化，结合Buffer和洗脱Buffer分别为25 mM Tris-HCl，300 mM NaCl（pH=8.0）以及25 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，500 mM Imidazole（pH=8.0），用PBS（pH=7.2）进行透析。用HiLoad 16/600 Superdex 200pg 120ml进行第二次纯化，用PBS（pH=7.2）进行透析（若进行一步纯化，则不进行该步骤）。对产物进行含量检测和/或SDS-PAGE检测。
处理例
处理例1：温度应激相关处理
将蛋白在60°C下孵育1小时，或在4°C下孵育2周，或进行10次反复冻融。
处理例2：高、低pH应激相关处理
用柠檬酸（pH=1.4）将蛋白突变体（pH=7.2）的pH调节至3.5，室温下孵育1小时，再用甘氨酸/氢氧化钠缓冲液 (pH=12) 将pH调回至7.2。
用甘氨酸/氢氧化钠缓冲液 (pH=12) 将蛋白突变体（pH=7.2）的pH调节至10，室温下孵育1小时，再用柠檬酸（pH=1.4）将pH调回至7.2。
处理例3：高、低渗透压应激相关处理
用蒸馏水稀释蛋白突变体（原始渗透压为137mM），使其渗透压降至10 mM，室温下孵育1小时，再用NaCl 溶液将其渗透压调回至137mM。
向蛋白突变体溶液（原始渗透压为137mM）中加入MgCl2，使蛋白溶液的渗透压升高至3 M，室温下孵育1小时，再用PBS缓冲液将其渗透压调回至137mM。
处理例4：小鼠免疫
BALB/c小鼠6~8周，体重16~20g，10只/组，D0、D21天肌肉注射50μL 10μg蛋白突变体+50μg Al(OH)3，D35天采血，分离血清。
检测例
检测例1：RSV Pre-F蛋白突变体的抗原性检测
采用ELISA方法检测RSV Pre-F蛋白突变体的抗原性。
检测方法具体为：
用CBS缓冲液将目标抗体稀释至2.0ug/mL，在酶标板上每孔加100μL，使其固相吸附在酶标板上，4℃过夜。第二天洗板，每孔加300μL的2% BSA，37℃封闭1.5h。将1:400倍稀释的RSV Pre-F蛋白突变体加入板孔中，每孔加100μL，37℃孵育1.0h。加入HRP二抗，每孔100μL，37℃孵育1.0h。每孔加100μL的TMB显色底物，37℃孵育20min。用2N 硫酸终止液终止，用酶标仪在450nm和630nm双波长进行读数。
检测例2：RSV Pre-F蛋白突变体的抗原性检测
采用ForteBio Octet进行抗原性检测。
检测方法具体为：
将HIS1K生物传感器在1×PBS，0.02% Tween-20，0.1% BSA中孵育60s，调整基线。用1×PBS，0.02% Tween-20，0.1% BSA将蛋白突变体稀释至10 μg/mL，与传感器孵育一段时间，直至在传感器上固化量至1.0 nm。将生物传感器在1×PBS，0.02% Tween-20，0.1% BSA中运行60 s，调整基线。用1×PBS，0.02% Tween-20，0.1% BSA将目标抗体稀释6个浓度区间（200~6.25 nM），设置零浓度参照组，与传感器孵育60 s，在此过程中传感器上的蛋白突变体可以结合目标抗体。将传感器在1×PBS，0.02% Tween-20，0.1% BSA中孵育120 s，在此过程中抗体从传感器上解离下来。用分析软件计算响应信号值。
检测例3：RSV Pre-F蛋白突变体的结构稳定性
检测方法具体为：
采用Uncle仪器表征纯化的RSV Pre-F蛋白突变体的结构热稳定性。从10℃至80℃以90℃/小时扫描1×PBS（pH=7.2）中0.2~0.5 mg/mL的RSV Pre-F蛋白突变体，采用UNcleClient分析Tm值。
检测例4：RSV F蛋白突变体的免疫原性
检测血清中和抗体IC50。
检测方法具体为：
取对数生长期的HEp-2细胞，消化计数后，100μL/孔，置于37℃、5% CO2培养箱培养过夜。取血清，56℃灭活30min，用DMEM培养基首先进行20倍稀释，然后按3倍梯度进行稀释，稀释成8个梯度，稀释度为20~43740倍。融化病毒液，根据其滴度，稀释后等体积加入到血清稀释液（中和液）中，置于37℃、5% CO2培养箱中和孵育1 h。取96孔细胞板，PBS洗涤2次后加入中和液，放入37℃、5% CO2培养箱，培养24 h。加入100 μL的4%多聚甲醛固定液，-20℃固定30 min后，进行洗涤、PBST封闭、抗F蛋白一抗孵育、洗涤、HRP二抗孵育、洗涤、Trueblue显色、Elispot仪器读数。中和抗体滴度的计算方式为：抑制率=[1-（样本斑点数-细胞对照斑点数）/（病毒对照斑点数-细胞对照斑点数）]×100%；以样本稀释倍数为X轴，抑制率为Y轴，使用GraphPad prism软件进行四参数拟合，计算样本的IC50值。
实施例1
1. 设计骨架序列：截取相对于SEQ ID NO.1具有天然存在P102A、I379V和M447V取代的SEQ ID NO.12中所述的天然RSV A2 F0前体多肽的1-513位氨基酸残基，将第513位氨基酸通过SAIG（SEQ ID NO.13）接头与T4 Fibritin（GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQID NO.14）或GCN4（EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA，SEQ ID NO.15）三聚体化结构域相连，三聚体化结构再通过GG接头与凝血酶识别序列、纯化标签（His标签）相连，纯化标签再通过GS接头与链霉素标签II相连（凝血酶识别序列至链霉素标签II部分的氨基酸序列为：LVPRGSHHHHHHGS WSHPQFEK，SEQ ID NO.16）。
2. 候选位点筛选：检索序列SEQ ID NO.1的二级结构（Swiss Prot标识符P03420），对S55C-L188C、T103C-I148C、S155C-S290C、A149C-Y458C四对二硫键取代在序列SEQ ID NO.1二级结构中的位置进行分析，S55位于51~60位氨基酸（GWYTSVITIE，SEQ IDNO.17）β链结构的中心对称位置，L188位于160~203位氨基酸（LEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTS KVLDLKNYIDKQL，SEQ ID NO.18）螺旋结构中；T103位于100~102位氨基酸转角结构之后的线性结构（TNNRARR，SEQ ID NO.19）中，I148位于145~147位氨基酸螺旋结构与149~158位氨基酸螺旋结构之间；S155位于149~158位氨基酸（ASGVAVSKVL，SEQ ID NO.20）螺旋结构中，S290位于286~293位氨基酸（YSIMSIIK，SEQ ID NO.21）β链结构的中心对称位置；A149位于149~158位氨基酸（ASGVAVSKVL，SEQ ID NO.22）螺旋结构的头端，Y458位于455-458位氨基酸（TLYY，SEQ ID NO.23）β链结构的尾端。因此，形成二硫键以及稳定融合前构象的取代还可能有：V56C-L188C、N104C-I148C、N105C-I148C、S155C-M289C。因此将上述四组形成二硫键以及稳定融合前构象的取代作为候选突变位点。
3. 以步骤1的骨架序列为基础，按表3方式进一步进行工程化改造，获得氨基酸序列CDK001-CDK002、CDK027、K003-K010。序列CDK027、K007-K010与CDK002、K003-K006的区别在于切除第104-144位氨基酸，用GS接头将第103位氨基酸与第145位氨基酸相连，进行L373R取代以及A149C-Y458C取代。表3中K007的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
表3 序列CDK001-CDK002、CDK027、K003-K010的序列特征
按制备例1的方法，在30ml培养体系下，对氨基酸序列CDK001-CDK002、CDK027、K003-K010进行表达和一步纯化，检测蛋白表达量。按检测例1的方法，检测序列CDK001-CDK002、CDK027、K003-K010对D25、AM14的抗原性。检测结果如表4所示：
表4 突变体CDK001-CDK002、CDK027、K003-K010的蛋白表达量和抗原性
结合表4，K003-K006中，只有K003对D25、AM14的抗原性高于CDK002；K006表达量过低，未检测对D25、AM14的抗原性。进一步切除第104-144位氨基酸，用GS接头将第103位氨基酸与第145位氨基酸相连，进行L373R、A149C-Y458C取代后，K008-K009在切除104-144的过程中，分别切除了N104C、N105C工程改造设计，148C与序列中的其他半胱氨酸随机形成二硫键，导致结构不稳定，相对于K004-K005的收率进一步下降，对D25、AM14的抗原性变化不大。K007相对于K003提高了收率，进一步提高了对D25、AM14的抗原性且抗原性优于CDK027，且收率超过CDK027的两倍。
实施例2
以序列K007为骨架，按表5方式进一步进行工程化改造，获得氨基酸序列K011-K014。序列K011与K007的区别为103-GG-145，序列K012与K007的区别为103-SAIG-145，序列K013与K007的区别在于F0蛋白截短长度为1-524，序列K014与K007的区别是三聚化结构域为GCN4。表5中K011~014的氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.25~28所示。
表5 序列K011-K014的序列特征
按制备例1的方法，在30ml培养体系下，对氨基酸序列K011-K014进行表达和一步纯化，检测蛋白表达量。按检测例1的方法，检测序列K011-K014对D25、AM14的抗原性。检测结果如表6所示：
表6 序列K007、K011-K014的蛋白表达量和抗原性
结合表6，序列K007的表达量以及对D25、AM14的抗原性与序列K011-K014差别不大。
实施例3
按处理例1的方法对序列CDK002、K003、K007、K011-K014、CDK027的表达蛋白进行温度应激相关处理，再按检测例1的方法检测对D25、AM14的抗原性，比较处理蛋白与新鲜蛋白的活性。将活性比率定义为蛋白的稳定性，预期更稳定的蛋白具有更高的活性比率。检测结果如表7所示。
表7 序列CDK002、K003、K007、K011-K014、CDK027的稳定性
结合表7，序列K007经过4°C（2周）、60°C（1小时）、10次反复冻融处理后的稳定性优于序列CDK002、K003、CDK027，与序列K011-K014差别不大。
实施例4
以实施例1骨架序列为基础，按表8方式进一步进行工程化改造，获得氨基酸序列，获得氨基酸序列K015-K016以及DS-Cav1。K015、K016相对于K003、K007的区别在于进一步增加了填充空腔的取代S190F-V207L。K015-K016、DS-Cav1的F0蛋白截短长度均为1-513，三聚化结构域均为T4 Fibritin。表8中K016的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
表8 序列K015-K016、DS-Cav1的序列特征
按制备例1的方法，在100ml培养体系下，对氨基酸序列K007、K015-K016以及DS-Cav1进行表达和两步纯化，收主峰，进行SDS-PAGE检测。三聚体蛋白的还原条带预期位于Marker的50-75条带之间，三聚体蛋白的非还原条带预期位于Marker的150-250条带之间。结果如图1~图4所示，K015和DS-Cav1在制备例1培养体系及两步纯化条件下，不能表达出纯度较高的三聚体结构，K007、K016能够表达出纯度较高的三聚体结构。
按检测例2的方法检测序列K007、K015-K016以及DS-Cav1表达蛋白对D25、AM14的响应信号值，响应信号值越高，预期蛋白对抗体的结合活性越高。按处理例2、处理例3的方法对序列K007、K015-K016以及DS-Cav1表达蛋白进行处理，再次按检测例1的方法检测对D25、AM14的抗原性，比较处理蛋白与新鲜蛋白的活性。将活性比率定义为蛋白的稳定性，预期更稳定的蛋白具有更高的活性比率。按检测例3的方法检测序列K007、K015-K016以及DS-Cav1表达蛋白的Tm值，Tm值越高，预期蛋白的热稳定性越好。结果如表9所示。
表9 序列DS-Cav1、K007、K015、K016的响应信号值、不同处理条件下的活性比率以及Tm值。
结合表9，K007、K016的抗原性、耐受pH、渗透压以及热融稳定性优于DS-Cav1，K015与DS-Cav1差别不大。K016相对于K007进行填充空腔改造后，进一步提高了抗原性和稳定性。
实施例5
以实施例1骨架序列为基础，按表10方式进一步进行工程化改造，获得氨基酸序列DS-Cav2、K017-K020。DS-Cav2、K017-K020的F0蛋白截短长度均为1-513，三聚化结构域均为T4 Fibritin。表10中K017~K020的氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.30~33所示。
表10 序列DS-Cav2、K017-K020的序列特征
按制备例1的方法，在100ml培养体系下，对序列DS-Cav1、DS-Cav2、K007、K016-K020进行表达和两步纯化，收主峰。按处理例4的方式，用序列DS-Cav1、DS-Cav2、K007、K016-K020表达的蛋白对小鼠进行免疫，采集血清，分组方式如表11所示。
表11 序列DS-Cav1、DS-Cav2、K007、K016-K020的免疫分组
按检测例4的方式检测组1~8血清中和抗体对RSV A2株的IC50。结果如表12所示。
表12 序列DS-Cav1、DS-Cav2、K007、K016-K020中和抗体IC50的几何平均值
结合表12，K007免疫血清中和抗体IC50的几何平均值高于DS-Cav1、与DS-Cav2相差不大，K016-K020免疫血清中和抗体IC50的几何平均值均高于DS-Cav1、DS-Cav2。K007、K016、K020相比，进行填充空腔、静电突变改造后，进一步提高了免疫血清中和抗体IC50的几何平均值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，含有至少一个重组F2-F1多肽，每个所述重组F2-F1多肽分别独立的含有F0多肽的突变后片段，所述突变包括：
（Ⅰ）位置104~144缺失并被连接肽取代；
（Ⅱ）含有以下用于组成二硫键的位置的取代：155C取代、289C取代、149C取代、458C取代；155C和289C之间组成二硫键，149C和458C组成二硫键；和，
（Ⅲ）373R取代；
所述位置对应于SEQ ID NO.1所示野生型F0多肽的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒F蛋白突变体是多聚体，含有至少两个或至少三个所述重组F2-F1多肽。
3.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述突变还包括：填充空腔的氨基酸取代，和/或，静电突变的氨基酸取代；
所述填充空腔的氨基酸取代选自（A1）或（A2）或（A3）：
（A1）190F、190I、207L、54H、296I和488W中的至少一种；
（A2）190F和207L取代；
（A3）54H、296I和488W取代；
所述静电突变的氨基酸取代选自（B1）或（B2）或（B3）：
（B1）46G、465Q、92D、486S、486H、487Q和489H中的至少一种；
（B2）46G、465Q和92D取代；
（B3）486H、487Q和489H取代。
4.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，每个所述重组F2-F1多肽由N端至C端分别独立的含有如下结构：
[F2多肽片段]-[连接肽1]-[F1多肽片段]-[连接肽2]-[多聚化结构域]；
所述F2多肽片段是F0多肽位置的第26至103位；
所述F1多肽片段是F0多肽位置的第145至（510~524）位。
5.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，且满足至少如下（ⅰ）~（ⅳ）中的一项或多项：
（ⅰ）多聚化结构域是三聚化结构域；
（ⅱ）多聚化结构域选自T4 Fibritin的多聚化结构域或GCN4的多聚化结构域；
（ⅲ）连接肽1选自GS、GG或SAIG；
（ⅳ）连接肽2选自SAIG。
6. 根据权利要求1~5任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，其特征在于，所述F0多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、2、3、4、10、11或12所示序列。
7.生物材料，其特征在于，包括多核苷酸、载体或细胞；
所述多核苷酸编码权利要求1~6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体；
所述载体携带所述多核苷酸；
所述细胞携带所述多核苷酸，或含有所述载体，或表达权利要求1~6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
8.权利要求1~6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或权利要求7所述的生物材料在如下（X1）~（X4）中的应用：
（X1）制备结合呼吸道合胞病毒抗原表位的抗体；
（X2）制备预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗；
（X3）制备呼吸道合胞病毒诊断产品；
（X4）非诊断和治疗目的的检测呼吸道合胞病毒。
9.预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，其特征在于，含有权利要求1~6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体，或权利要求7所述的生物材料。
10.呼吸道合胞病毒诊断试剂或试剂盒，其特征在于，含有权利要求1~6任一项所述的呼吸道合胞病毒F蛋白突变体。
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