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CN119173534A - 靶向Claudin18.2的抗体-药物偶联物 - Google Patents

靶向Claudin18.2的抗体-药物偶联物 Download PDF

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CN119173534A
CN119173534A CN202280083295.6A CN202280083295A CN119173534A CN 119173534 A CN119173534 A CN 119173534A CN 202280083295 A CN202280083295 A CN 202280083295A CN 119173534 A CN119173534 A CN 119173534A
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CN
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antibody
amino acid
solvate
pharmaceutically acceptable
acid sequence
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Application number
CN202280083295.6A
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何开杰
周帅祥
刘晓丹
陆佳
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Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Original Assignee
Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
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Publication date
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Abstract

一种靶向Claudin18.2的抗体‑药物偶联物(ADC)以及含有所述分子的组合物，及其治疗和诊断用途。

Description

靶向Claudin18.2的抗体-药物偶联物
本发明涉及靶向Claudin18.2(CLDN18.2)的抗体-药物偶联物(ADC)以及含有所述分子的组合物。本发明还涉及这些分子的治疗和诊断用途。
发明背景
Claudins是一个蛋白质家族，是构成细胞紧密连接的重要组成部分。它们建立了控制细胞间分子流动的细胞间屏障，可控制细胞之间分子的流动。Claudins家族蛋白具有四次跨膜结构域，其N端和C端均包括在细胞质中。不同的Claudins蛋白在不同的组织上表达，其功能的改变与各个组织的癌症形成有关，比如Claudin-1表达在结肠癌中并且具有预后价值，Claudin-18在胃癌、胰腺癌高表达，Claudin-10表达在肝细胞癌中高表达。Claudins作为细胞膜表面蛋白，是各种治疗策略的有用靶标。
Claudin-18的同种型2(Claudin 18.2或CLDN18.2)是高度选择性的细胞谱系标记物，其在正常组织中的表达严格限于胃粘膜分化的上皮细胞，但不表达于胃干细胞区。CLDN18.2在相当一部分原发性胃癌中表达，并且在胃转移的癌组织中保留了其表达水平。除胃癌以外，在胰腺癌中也发现有CLDN18.2的表达，是治疗这些癌症的理想的靶标分子(Singh,P.,Toom,S.&Huang,Y.Anti-CLDN18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer.J Hematol Oncol 10,105(2017). https://doi.org/10.1186/s13045-017-0473-4)。
关于胃癌，2014年，全国胃癌新发病例约41万和死亡病例约29万例，几乎占全球发病人数和死亡人数的一半，且仍呈增长趋势。但是存在大量的未被满足的临床肿瘤治疗的需求，因此开发靶向Claudin18.2的药物十分必要。
尽管治疗性抗体取得了临床成功，但靶向细胞表面肿瘤抗原的裸露MAb很少独自提供足够功效。为使MAb的低活性增加，新策略集中于使它们结合于毒性分子。植物和细菌毒素以及小化学治疗分子可为良好候选物，因为它们在极小量的情况下非常有效和有活性。
由于在过去数年期间进行的技术进步，用于治疗癌症的抗体-药物偶联物(ADC)的领域近来已经历一场由药物公司进行的日益增长的开发活动，旨在解决它们最初呈现的关于免疫原性、亲和力、特异性、不合需要的毒性、产量、半衰期等的问题。
尽管取得了一些进步，但仍然对用于治疗肿瘤的其它治疗策略，以及对于用于此类治疗策略中的组分存在需要，特别是存在对亲和力高、特异性好和/或免疫原性风险低的抗Claudin18.2的抗体以及对具有较高活性、毒性低、半衰期长、特异性或亲和力好、和/或半衰期或成药性好的ADC分子的需要。
发明概述
本发明提供了靶向Claudin18.2的抗体-药物偶联物(ADC)，所述偶联物具有以下优点：
(1)结合表达人CLDN18.2的靶细胞，与其具有高亲和力；
(2)能够通过内吞作用进入细胞，杀伤靶细胞；在一些实施方案中，本发明的ADC具有高内吞效率；
(3)具有显著的旁杀者效应；
(4)具有高的抗肿瘤药效；
(5)具有低毒性；
(6)具有良好的稳定性；
(7)具有良好的成药性。
在一些实施方案中，CLDN18.2在细胞表面表达或过表达；在一些实施方案中，靶细胞为表达CLDN18.2的CHO细胞或293细胞，例如CHO-S细胞或HEK293细胞；在一些实施方案中，靶细胞为表达CLDN18.2的癌细胞，例如天然表达CLDN18.2或经人工转染表达CLDN18.2或经人工转染具有增加的表达水平的CLDN18.2的细胞，例如表达CLDN18.2的胃癌细胞或胰腺癌细胞系或结肠癌或结直肠癌细胞系。在一些实施方案中，靶细胞为具有中等hCLDN18.2的表达水平的细胞系，例如NUGC-4，SNU620。在一些实施方案中，靶细胞为具有高表达水平的细胞系，例如过表达hCLDN18.2的DAN-G细胞。
附图说明：
图1显示了HB37A6抗体特异性结合细胞表面的CLDN18.2。
图2显示了HB37A6抗体不结合细胞表面的CLDN18.1。
图3显示了HB37A6抗体与胃癌细胞系NUGC-4、胃癌细胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌细胞系DAN-G-hCLDN18.2的结合。
图4显示了HB37A6抗体在胰腺癌小鼠模型的抗肿瘤效果。
图5显示了HB37A6抗体在胃癌小鼠模型的抗肿瘤效果。
图6显示了IEX019分子的细胞结合作用。
图7显示了IEX019分子在DANG-hCLDN18.2细胞上的内吞作用。
图8显示了IEX019分子在低表达hCLDN18.2的细胞系的杀伤效果(图8A)、IEX019分子在hCLDNA8.2中等表达水平细胞系的杀伤效果(图8B)和IEX019分子在高表达hCLDN18.2细胞系的杀伤效果(图8C)。
图9显示了IEX019分子的旁杀者效应。
图10显示了IEX019分子在小鼠中的肿瘤抑制功效(图10A)和体重变化(图10B)。
图11显示了IEX019分子在小鼠中的肿瘤抑制功效(图11A)和体重变化(图11B)。
图12显示了IEX019分子在小鼠中的肿瘤抑制功效(图12A)和体重变化(图12B)。
发明详述
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
本文所用的术语“CLAUDIN”或“CLDN”是决定细胞间紧密连接结构的最重要的骨架蛋白，其参与粘附连接，并且在肿瘤细胞的转移和侵袭中起到重要作用。Claudin蛋白广泛存在于哺乳动物上皮和内皮细胞中，其分布主要是上皮细胞侧面以及基底细胞质膜上。不同的Claudin蛋白在不同组织中具有各自特异性表达，其中Claudin18(CLDN18)基因定位于3q22.3，分子量24kDa，包含261个氨基酸残基，属Claudins超家族成员，其蛋白结构包含2个细胞外环和4个穿膜区。人CLDN18或Claudin18蛋白的两个亚型分别是Claudin18.1或CLDN18.1(UniProt ID:P56856-1)，和Claudin18.2或CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)，在二者蛋白的一级结构序列中，仅N端信号肽至细胞外环1(Loop1)结构的某些位置的氨基酸残基上有所区别，尤其是在细胞外环1上，CLDN18.1和CLDN18.2仅8个氨基酸不同。CLDN18的两种亚型蛋白的种属间序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的细胞外环1在人、小鼠、猕猴等不同物种上序列完全一致，而人与小鼠的CLDN18.2蛋白同源性达到84％，表明CLDN18.2蛋白序列极端保守性(O.Tureci.等人.,Gene 481:83-92,2011)。CLDN18.2或其任何变体和同种型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者使用本领域熟知的技术和/或本文所述的那些技术重组产生。在一个实施方案中，本文所述的CLDN18.2是人CLDN18.2。
本文所用的术语“抗CLDN18.2抗体”、“抗CLDN18.2”、“CLDN18.2抗体”或“结合CLDN18.2的抗体”或“特异性结合CLDN18.2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)CLDN18.2以致所述抗体可以用作靶向(人)CLDN18.2的治疗剂。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体在体外或体内以高亲和力结合(人)CLDN18.2。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体不结合CLDN18.1。在一个实施方案中，所述(人)CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2的细胞结合而不结合表达CLDN18.1的细胞。在一些实施方案中，所述结合例如通过放射性免疫测定(RIA)、生物膜薄层干涉测定法(BLI)、MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术测量的。
可以通过多种方式，例如抗CLDN18.2抗体来确定细胞中CLDN18.2的表达。例如，“高表达CLDN18.2”的细胞与抗CLDN18.2抗体的结合强度(例如通过FACS测定)可以是抗CLDN18.2抗体与不表达CLDN18.2的细胞的结合强度的500、600、700、800、900或优选1000倍以上，例如1100倍、1200、1300、1400倍以上或更高。例如，“中等表达CLDN18.2”的细胞与抗CLDN18.2抗体的结合强度(例如通过FACS测定)可以是抗CLDN18.2抗体与不表达CLDN18.2的细胞的结合强度的5倍-500倍，例如6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、 60、70、80、90、100倍或更高，但是不超过500倍。
术语“完全抗体”、“全抗体”或“全长抗体”在本文中可互换使用，是指具有天然免疫球蛋白分子结构的抗体分子。在常规四链IgG抗体的情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。在仅具有重链而缺乏轻链的重链抗体情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)。
对于常规四链IgG抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成，其中重链恒定区至少包含3个结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成，其中轻链恒定区由一个结构域CL组成。每个重链可变区VH和每个轻链可变区都由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’) 2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，CLDN18.2)中与抗体分子特异性相互作用的部分。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定:
VH CDR1按照AbM规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定。
在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定：VH CDR1按照AbM规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定；且轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在同一指派系统下)。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。在本文中，术语“Fc区”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4，或者IgG1形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG1。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
如本文所用的，“抗体-药物偶联物(ADC)”是指通过连接抗体与药物所得的结构。
本文使用的一般术语“糖”指示单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。本文使用的术语“糖衍生物”表示单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcN)、半乳糖胺(GalN)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖 醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例也包括本文表示为E(A)x的化合物，其中E为糖或糖衍生物，并且其中E包括x个官能团A。
核心-N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)在本文被定义为通过C1键合至抗体的GlcNAc，优选通过和抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链上的酰胺氮原子的N-糖苷键。所述核心-GlcNAc取代基可存在于抗体的天然糖基化位点处，但其也可被引入到抗体的不同位点上。在本文，核心-N-乙酰葡糖胺取代基为单糖取代基，或(如果所述核心-GlcNAc取代基被岩藻糖基化)二糖核心-(Fucα1-6)GlcNAc取代基——也称为GlcNAc(Fuc)。
“糖基化改造”是指糖基化工程而对抗体的糖链进行改变的过程。抗体的糖基化可以为了多种目的而被进一步改造而获得具有新的糖基化的抗体，例如，为了消除FcγR亲和力和补体结合/效应功能而对糖基化进行去除，为了增强Fc介导的ADCC和CDC效应而减少岩藻糖和唾液酸基团并增加二等分N-乙酰葡糖胺，半乳糖和甘露糖。本领域已知糖基化改造的方式，例如可通过改变抗体的糖基化位点来增加或减少抗体表面的糖链、或在体外通过化学或酶法对糖链进行修饰，或者通过对表达系统的糖基化途径(例如由糖苷酶和糖基转移酶等酶组成)进行改变来催化抗体的糖基化，还可以通过细胞培养条件的影响来改变抗体的糖基化。在一些实施方案中，本发明的“糖基化改造”是通过体外的酶法对糖链进行修饰来进行的。优选地，本发明的糖基化改造是通过糖苷酶(例如糖苷内切酶或糖基转移酶)对糖链进行修饰进行的。
本发明的具有改造的糖基化的抗体是指与具有天然糖基化模式的抗体相比，糖基化模式被改造的抗体。优选地，所述具有改造的糖基化的抗体是指在表达系统(例如哺乳动物细胞)中表达后的抗体在体外经酶法对糖链进行修饰(例如通过糖苷酶(例如糖苷内切酶或糖基转移酶)对糖链进行修饰)后获得的抗体。更优选的，本发明的具有改造的糖基化的抗体是指包含核心-GlcNAc以及与其连接的糖衍生物E(A)x的抗体，其中GlcNAc通过C1键合至抗体，优选通过和抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链上的酰胺氮原子的N-糖苷键。如果GlcNAc-E(A)x取代基中的-GlcNAc取代基被岩藻糖基化，通常岩藻糖通过α-1,6连接至-GlcNAc取代基的C6。岩藻糖基化的-GlcNAc取代基是指核心-GlcNAc(Fuc)，岩藻糖基化的GlcNAc-E(A)x取代基是指GlcNAc(Fuc)-E(A)x。
本文所述的术语“位点特异性偶联”是指通过连接子将药物/活性物质特异性连接到抗体的特定位点的偶联。
本文所述的术语“烷基”指完全饱和的支链的或无支链的烃基团。烷基优选包含1-24个碳原子，更优选1-16个碳原子、1-12个碳原子、1-6个碳原子或1-4个碳原子。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
术语"芳基"指在环部分具有6-20例如6-12个碳原子的单环或二环芳香烃基团。优选地，芳基是(C 6-C 10)芳基。非限制性示例包括苯基、联苯基、萘基或四 氢萘基，它们各自可以任选被1-4个取代基取代，所述取代基例如烷基、三氟甲基、环烷基、卤素、羟基、烷氧基、酰基、烷基-C(O)-O-、芳基-O-、杂芳基-O-、氨基、巯基、烷基-S-、芳基-S-、硝基、氰基、羧基、烷基-O-C(O)-、氨基甲酰基、烷基-S(O)-、磺酰基、磺酰氨基、杂环基等，其中R独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、芳基-烷基-、杂芳基-烷基-等。
术语“环烷基”是环状烷基基团，也就是说，具有环状结构的一价的、饱和的或不饱和的烃基。环烷基包括所有饱和或部分饱和(含有1或2个双键)的具有环状结构的烃基。环烷基基团在环中可包含3个或更多个例如3-18、3-10、或3-8个碳原子，并通常根据本发明，包含3到6个原子。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
如本文所用，术语"杂芳基"指含有选自N、O或S的1-8个杂原子的5-20元(例如5-14元、5-8元、5-6元)的单环-或二环-或稠合的多环环系。优选地，杂芳基是5-10元环系。代表性的杂芳基基团包括2-或3-噻吩基、2-或3-呋喃基、2-或3-吡咯基、2-、4-或5-咪唑基、3-、4-或5-吡唑基、2-、4-或5-噻唑基、3-、4-或5-异噻唑基、2-、4-或5-噁唑基、3-、4-或5-异噁唑基、3-或5-1,2,4-三唑基、4-或5-1,2,3-三唑基、四唑基、2-、3-或4-吡啶基、3-或4-哒嗪基、3-、4-或5-吡嗪基、2-吡嗪基、2-、4-或5-嘧啶基。
术语“药学上可接受的盐”表示指保持本发明的ADC偶联物的生物学效应和性能的盐，并且该盐在生物学上或其它方面不是不被期望的。本发明的ADC偶联物可以以它们的药学上可接受的盐形式存在，包括酸加成盐和碱加成盐。在本发明中，药学上可接受的无毒的酸加成盐表示本发明中的ADC偶联物与有机或无机酸形成的盐，有机或无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、高氯酸、乙酸、草酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、水杨酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、丙酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、苹果酸等。药学上可接受的无毒的碱加成盐表示本发明中的ADC偶联物与有机或无机碱所形成的盐，包括但不限于碱金属盐，例如锂、钠或钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；有机碱盐，例如通过与含N基团的有机碱形成的铵盐。
术语“溶剂化物”表示一个或多个溶剂分子与本发明中的ADC偶联物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。
在根据上下文无矛盾的情况下，本文中“药学上可接受的”和“药用”可互换使用。
术语“药物:抗体比率”或“DAR”是指偶联于本文所述的Ab部分的小分子药物部分(D)与Ab部分的比例。在本文所述的一些实施方案中，DAR可由式I中的p和r确定，例如DAR可以为1至20，例如2-18、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。DAR也可被计算为产品中分子群体的平均DAR，即通过检测 方法(例如通过常规方法如质谱法、ELISA测定、电泳和/或HPLC)测得的产品中偶联于本文所述的Ab部分的小分子药物部分(D)与Ab部分的总体比例，此DAR在文中称为平均DAR。在一些实施方案中，本发明偶联物的平均DAR值是1至20，例如2-18、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如1.0-8.0，2.0-6.0，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0，以这些数值中的两个作为端点的范围。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学化合物。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。在一些实施方案中，本发明的免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂或免疫检查点激动剂。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤体积)至少约30％、甚至更优选地至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在 最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体或其他分子(例如ADC分子)是这样的抗体或分子，其已经与其天然环境或表达其的环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体或ADC分子纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和血液肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括胃癌、胰腺癌或胃食管交界癌，包括那些癌症的转移性形式。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的ADC分子、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的本发明的ADC分子和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以 大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
II.抗体-药物偶联物
本发明提供一种具有式(I)的抗体-药物偶联物：
Ab-(L-(D) r) p(I)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中：
Ab是结合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的抗体或其片段；
L是连接子；
D是药物，包括前药，优选抗肿瘤化合物；并且
p是1至10，例如1-9、2-8、3-7、4-6、2-6，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
r是1-5,例如1、2、3、4或5，优选为1或2。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是人抗体或人源化抗体，优选地人抗体。在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是抗体片段，优选地抗原结合片段，例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’) 2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是双特异性抗体或多特异性抗体。
在本发明优选的实施方案中，Ab包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明优选的实施方案中，Ab包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，Ab包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，Ab包含重链可变区(VH)。在一些方面中，Ab包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，Ab包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方 案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，VH
(i)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，VL
(i)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自VH的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3为
(i)如SEQ ID NO:4所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和-HCDR3，或者
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的3个来自VL的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3为
(i)如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，
(ii)相对于(i)的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比具有一个、 两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的重链恒定区HC为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选的IgG1的重链恒定区，例如野生型IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区LC为lambda或Kappa轻链恒定区。
在一些优选的实施方案中，本发明的重链恒定区HC
(i)包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区LC
(i)包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含重链。在本发明的一些具体的实施方案中，，本发明的式(I)中的Ab包含轻链。本发明的一些具体的实施方案中，，本发明的式(I)中的Ab包含重链和轻链。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的重链包含重链可变区和重链恒定区，或由所述重链可变区和重链恒定区组成。在本发明的一些具体的实施方案中，本发明的轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，或由所述轻链可变区和轻链恒定区组成。
在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)中的Ab特异性结合CLDN18.2，且包含如SEQ ID NO:4所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或如SEQ ID NO:9所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含分别如以下 氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：SEQ ID NO:1、2和3，和/或分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:6、7和8。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含
VH，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，和/或
VL，其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含VH和VL，其中VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:4所示，且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:9所示。
在本发明的一些具体的实施方案中，本发明的式(I)中的Ab是IgG抗体，即其包含与CLDN18.2结合的重链和轻链。在一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab是完全抗体。
在一些实施方案中，式(I)中的Ab的重链
(i)包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，式(I)中的Ab的轻链
(i)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些实施方案中，本发明的式(I)中的Ab包含重链和轻链，其中重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:11所示，且轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:12所示。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在抗体重链恒定区的Fc区上。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。在某 些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
本发明的式(I)中的抗体Ab可以是具有改造的糖基化的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是在体外经酶法对糖链进行修饰(例如通过糖苷酶(例如糖苷内切酶或糖基转移酶)对糖链进行修饰)后获得的抗体。在一些实施方案中，所述具有改造的糖基化的抗体是指抗体糖基化位点上的糖链由非均一结构N糖链改造成带有反应性基团(例如能与连接子部分反应的任何反应性基团，例如叠氮基、酮基和炔基)的单一结构N糖链的抗体。在一个优选的实施方案中，抗体的N-糖基化位点为抗体Fc结构域上保守的N-糖基化位点，例如Asn297。
适合于本发明的改造抗体糖基化的方法例如参见PCT/NL2013/050744、PCT/EP2016/059194或PCT/EP2017/052792，所述专利申请以其全文并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的具有改造的糖基化的抗体是包含GlcNAc-E(A) x取代基的抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，其中E(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物，其中A独立地选自叠氮基、酮基和炔基且x为1、2、3或4；其中所述GlcNAc-E(A)x取代基是通过所述GlcNAc-E(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体，其中所述N-乙酰葡糖胺为任选地被岩藻糖基化的。在N-乙酰葡糖胺被岩藻糖基化的情况下，其通过C6键合至岩藻糖(Fuc)。
在一个实施方案中，本发明的具有改造的糖基化的抗体为式(III)的抗体，其中Ab代表抗体，GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Fuc为岩藻糖，b为0或1，y为1至20，其中E(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物，其中A为叠氮基、酮基和炔基，且x为1、2、3或4。在一个优选实施方案中，y为1至10，更优选地，y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地，y为1、2、3或4，最优选地，y为1或2。
具有改造的糖基化的抗体的GlcNAc-E(A)x取代基中的糖衍生物E(A)x例如可通过β(1,4)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C4或通过α(1,3)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C3，优选地通过β(1,4)-糖苷键键合至所述GlcNAc的C4。所述GlcNAc-E(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺是通过C1键合至所述抗体，优选地通过 N-糖苷键键合至所述抗体的天冬酰胺的侧链中的酰胺氮原子(GlcNAcβ1-Asn)。所述GlcNAc-E(A)x取代基上的GlcNAc是任选地被岩藻糖基化的。相应地，抗体-药物偶联物中的GlcNAc-E当存在时也可如前所述那样连接。
在一个优选的实施方案中，所述官能团A为叠氮基。当A为叠氮基时，优选地，A键合至C2、C3、C4或C6。如上所述，E(A)x中的一个或更多个叠氮化物取代基可键合至所述糖或糖衍生物E的C2、C3、C4或C6，替代羟基(OH)。应当理解，官能团A的键合位置对应于含有A的糖与连接子连接的位置。
在一个优选的实施方案，糖衍生物E(A)x源自糖或糖衍生物E。在一个优选的实施方案，E为糖或糖衍生物，选自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，优选Gal、GlcNAc、葡萄糖和GalNAc，最优选的GalNAc。
在另一优选的实施方案中，所述E(A)x为GalNAc-N 3，优选地，E(A)x为6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖。
应当理解，在不相矛盾的情况下，上面对糖的描述和说明(包括但不限于GlcNAc-E(A)x的糖苷键连接方式)同样适用于下面式(II)偶联物中相应糖，例如其中的糖连接方式。本领域技术人员能够理解，尽管在一些实施方案中，反应性基团(例如官能团A)在抗体糖基化改造中被连接到抗体的糖链上，因此“具有改造的糖基化的抗体”被定义为包含该反应性基团的抗体，但是在抗体-药物偶联物形成时，该反应性基团可能与连接子部分进行反应，进而与连接子部分形成新的基团，从而在抗体药物偶联物中，该新的基团被视为连接子的一部分。
优选地，本发明的抗体为单克隆抗体，更优选地为IgG抗体(例如四链IgG抗体)，最优选地为IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体为完全抗体。
当所述经修饰的抗体为完全抗体时，所述抗体优选地包含两个或更多，更优选两个，GlcNAc-E(A)x取代基，所述GlcNAc-E(A)x取代基为任选地被岩藻糖基化的。然而，如果所述经修饰的抗体是抗体片段，例如Fab或Fc片段，该抗体可能只具有一个GlcNAc-E(A)x取代基，其为任选地被岩藻糖基化的。所述GlcNAc-E(A)x取代基可位于抗体的任何位置，条件是所述取代基不妨碍抗原与该抗体的抗原结合位点的结合。在一个实施方案中，所述GlcNAc-E(A)x取代基位于抗体的Fc结构域中，更优选地，位于CH2结构域中。
如上所述，本发明的具有改造的糖基化的抗体，其包含一个以上GlcNAc-E(A)x取代基，例如2个GlcNAc-E(A)x取代基。
在一个优选的实施方案中，GlcNAc-E(A)x取代基存在于所述抗体的天然N-糖基化位点(例如天然保守N-糖基化位点)上，例如Fc区(更优选地CH2结构域)的糖基化位点上。在又一优选实施方案中，所述抗体为IgG抗体且所述 GlcNAc-E(A)x取代基存在于IgG抗体的天然N-糖基化位点(天然保守N-糖基化位点)上。在又一优选实施方案中，所述天然位点为IgG抗体的Asn297-糖基化位点。所述Asn297-糖基化位点存在于IgG抗体的重链的Fc区域中。在一个优选的实施方案中，所述GlcNAc-E(A)x取代基存在于抗体两条重链的Asn297-糖基化位点。
在一些实施方案中，本发明的式(I)中的L是连接子。可以使用本领域已知的任何连接子用来与本发明的抗人CLDN18.2连接，优选地，连接子能够实现ADC的位点特异性偶联。
在一些实施方案中，适用于本发明的连接子可以是能够实现将抗体与药物偶联的任何连接子。在一些实施方案中，连接子可以是能够实现位点特异性偶联的技术中所用的连接子。
在一个优选的实施方案中，本发明的连接子是与抗体寡糖连接的连接子。本文所定义的“与抗体寡糖连接的连接子”是指与抗体糖基化位点处的糖链上的反应性基团连接来将抗体与药物偶联的任何连接子。抗体糖基化位点上的糖链一般为N-糖链，且通常被改造以将非均一结构N糖链改造成带有反应性基团的单一结构N糖链，进而利用该糖链携带的反应性基团与“连接子”连接，实现药物与抗体的位点特异性偶联，得到抗体-药物偶联物。在一个优选的实施方案中，抗体的N-糖基化位点为抗体Fc结构域，优选CH2结构域上保守的N-糖基化位点，例如Asn297。因此，在一个实施方案中，本发明的“与抗体寡糖连接的连接子”特别是与抗体Fc结构域上保守的N-糖基化位点(例如Asn297)处的N-糖链上的反应性基团能够实现位点特异性偶联的任何连接子，例如PCT/NL2013/050744所述的连接子或PCT/EP2021/075401的连接子，其以全文并入引入本文。在一个实施方案中，本发明的反应性基团是叠氮基、酮基或炔基。在一个实施方案中，本发明的连接子是包含炔基基团的连接子。在一个实施方案中，本发明的反应性基团是叠氮基、酮基或炔基，优选地叠氮基，且本发明的连接子是包含炔基基团的连接子。在本发明提及此类连接子时，因反应性基团与连接子的基团反应后形成新的基团，因此也可将抗体-药物偶联物中的反应性基团反应后形成的基团定义为“连接子”的一部分，例如如本发明式(II)中所示的那样。
适用于本发明的连接子还例如包括组织蛋白酶降解的连接子，例如Val-Cit连接子(例如vc-PAB)、cBu-Cit连接子和CX连接子；不可断裂连接子例如SMCC连接子或MD连接子；酸敏连接子、硅脂结构的连接子、disulfide-carbamate连接子、MC-GGFG连接子、TRX连接子、含半乳糖苷的连接子、焦磷酸酯连接子、近红外敏感的连接子、紫外敏感的连接子例如PC4AP(Antibody–drug conjugates:Recent advances in linkerchemistry，Su,Z.,Xiao,D.,Xie,F.,Liu,L.,Wang,Y.,Fan,S.,…Li,S.(2021).Antibody–drug conjugates:Recent advances in linker chemistry.Acta Pharmaceutica Sinica B.)。适用于本发明的连接子还可以是一种或多种连接子的组合，例如组织蛋白酶降解的连接子可以与其它类型的连接子组合，构成新的连接子。因此，本发明所述的“连接子”涵盖单个类型的连接 子，或不同类型连接子的组合，只要其能够将本发明的抗体与药物偶联起来即可。因此，在一个实施方案中，适用于本发明的连接子是MC-VC-PAB、vc-PAB、SMCC或MC-GGFG。
本发明式(I)中的D可以是任何抗肿瘤化合物，只要是具有抗肿瘤效果、且具有能连接于连接子结构的取代基、部分结构的化合物即可，没有特别限制。例如，抗肿瘤化合物可以是对肿瘤有作用的药学活性化合物。对于抗肿瘤性化合物而言，连接子的一部分或全部优选可在肿瘤细胞内被切断，游离出抗肿瘤性化合物部分，从而显示抗肿瘤效果。在与药物的连接部分切断连接子时，以未修饰的结构游离出抗肿瘤性化合物，可发挥其本来的抗肿瘤效果。
在一些实施方案中，抗肿瘤化合物可以是例如细胞毒性剂或化疗剂，例如喜树碱类化合物依喜替康(拓扑异构酶I抑制剂Exatecan)、Dxd(一种新型拓扑异构酶I抑制剂Exatecan衍生物)、澳瑞他汀类化合物例如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或美登素类化合物例如小分子微管抑制剂DM1。本申请的实施例中的结构显示这些抗肿瘤化合物的代表性化合物的结构。
在一个实施方案中，本发明提供(II)的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物
Ab代表文中所定义的抗体，
L 1为连接体；
E为糖或糖衍生物，例如上文所定义的糖或糖衍生物；
并且GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Fuc为岩藻糖；
D、r如上面式I中所定义；
b为0或1，例如为0；
x为1、2、3或4；优选为1或2；
y为1-20；例如y为1至10，更优选地，y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地，y为1、2、3或4。
在一实施方案中，Fuc为岩藻糖，b为0或1，例如为0；和/或x为1或2，更优先地为2，和/或y为1或2，更优选为2。
在一实施方案中，在式(II)中，E选自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(Gcu)、 岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，优选Gal、GlcNAc、葡萄糖和GalNAc，最优选的GalNAc，例如6-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖，其优选通过6位C原子与L 1连接。
在一个优选的实施方案中，与Ab连接的GlcNAc存在于所述抗体的天然N-糖基化位点(例如天然保守N-糖基化位点)上，例如Fc区的糖基化位点上。在又一优选实施方案中，所述抗体为IgG且所述GlcNAc存在于IgG的天然N-糖基化位点(例如天然保守N-糖基化位点)上，例如Fc区的糖基化位点上。在又一优选实施方案中，所述天然位点为IgG的Asn297-糖基化位点。所述Asn297-糖基化位点存在于IgG抗体的重链的Fc区域中。在一个优选的实施方案中，所述GlcNAc基存在于抗体两条重链的Asn297-糖基化位点。
在一实施方案中，在式(II)中，L 1具有如下结构
Q为-N(H)C(O)CH 2-或-CH 2-；
R 1独立地选自氢、卤素、-OR 2、-NO 2、-CN、-S(O) 2R 2、C 1-C 12烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基，且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R 1可连接在一起形成稠合、桥接或螺接的环烷基或者稠合或螺接的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R 2独立地选自氢、卤素、C 1-C 24烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基；
R 3和R 4各自独立地选自氢、卤素、C 1-C 24烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基；
c为0、1、2、3或4；
m为0或1；
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
Y为O、S或NR 1；
L 2和L 3各自独立地为C 1-C 12烷基，该烷基中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选被选自O、N和S的杂原子替换，前提是所述O、N和/或S不直接相互连接；
L 4各自独立地为可裂解的连接子。
应当理解的是，当m为0时，意味着Q不存在，从而三唑的相关氮原子通过共价单键直接与E部分连接。
在一实施方案中，L 4各自独立地为
其中R 5和R 6各自独立地选自氢和C 1-C 12烷基；
Ar选自芳基，优选为苯基；
在一实施方案中，L 4各自独立地为
在一个实施方案中，其中-L 1-具有如下结构
在一实施方案中，所述抗体-药物偶联物具有1-15，例如1-10、2-8、2-6或3-5的平均DAR。
在一个实施方案中，本发明的抗体-药物偶联物选自：
其中Ab是HB37A6；
其中q表示平均DAR，
在IEX019-02、IEX019-04、IEX019-05中，q为2-5例如3-5、3-4或3.5-4.5， 在IEX019-03中，q为5-11例如6-10、7-9或7.5-8.5。
III.本发明的ADC分子的制备
本发明一方面提供了一种制备具有改造的糖基化的抗体的方法，所述方法包括
(1)糖基化抗体制备：在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体，获得包含核心N-乙酰葡糖胺取代基(核心-GlcNAc取代基)的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺和所述核心N-乙酰葡糖胺取代基是任选地被岩藻糖基化的；
(2)制备经修剪的抗体：将步骤(1)中制备的抗体在糖苷内切酶的存在下去糖基化，以获得包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰葡糖胺和所述核心N-乙酰葡糖胺取代基是任选地被岩藻糖基化的；
(3)使(2)中获得的经修剪的抗体与式E(A)x-P的化合物在合适的催化剂的存在下接触，获得包含GlcNAc-E(A)x取代基的抗体，所述GlcNAc-E(A)x取代基是通过该GlcNAc-E(A)x取代基的N-乙酰葡糖胺的C1键合至所述抗体；其中所述催化剂为糖基转移酶，其中P选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)。
为了进行步骤(1)，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体，例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
步骤(2)中的糖苷内切酶可以根据糖基化抗体的性质进行选择，例如选自Endo S、Endo A、Endo F、Endo M、Endo D和Endo H酶和/或其组合，还例如为Endo S、Endo S49、Endo F或其组合。在一个优选的实施方案中，所述糖苷内切酶为PCT/EP2017/052792中所述的糖苷内切酶，最优选为PCT/EP2017/052792中的Endo SH。
步骤(3)中的糖基转移酶优选为或衍生自β-(1,4)-N乙酰半乳糖胺转移酶的糖基转移酶，更优选为PCT/EP2016/059194中所述的任何β-(1,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，所述β-(1，4)-GalNAcT酶为或衍生自无脊椎动物β-(1,4)-GalNAcT酶。β-(1,4)-GalNAcT酶可以为或可以衍生自本领域技术人员已知的任何无脊椎动物β-(1，4)-GalNAcT酶。优选地，β-(1,4)-GalNAcT酶为或衍生自来源于线虫动物门(Nematoda)、优选来源于色矛纲(Chromadorea)或胞管肾纲(Secernentea)，或来源于节肢动物门(Arthropoda)，优选来源于昆虫纲(Insecta)的β-(1,4)-GalNAcT酶。更优选的，β-(1,4)-GalNAcT酶秀丽隐杆线虫、猪蛔虫、粉纹夜蛾、黑腹果蝇、腐生水果线虫、Caeno rhabditis briggsae、吴策线虫、罗阿丝虫、毕氏粗角猛蚁、湿木白蚁、佛罗里达弓背蚁、长牡蛎和大红斑蝶。优选地， 适用于步骤(3)的糖基转移酶是PCT/EP2016/059194中公开的命名为TnGalNAcT的粉纹夜蛾β-(1,4)-GalNAcT酶(例如His-TnGalNacT)。
本发明的另一个方面提供了一种应用本发明的抗体制备ADC的方法。本发明中的“ADC”被定义为通过连接子(L)偶联至具有生物学和/药学活性的活性物质(D)的抗体。所述方法包括将本发明的抗体通过一个或多个本发明定义的连接子(L)偶联至一个或多于一个的活性物质D上。优选地，连接子-活性物质位点特异性偶联至抗体。
在一实施方案中，提供了制备本发明的ADC的方法，所述方法包括使(式III)的糖基化抗体
其中各变量或符号的含义如上文所定义；
与含有炔基基团以及一个或多个(例如1、2、3或4个)药物分子的连接子-药物化合物(linker-payload)反应，
生成(式II)的抗体-药物偶联物
其中各变量或符号的含义如上文所定义。
在一实施方案中，所述连接子-药物化合物具有下式结构：
其中各变量如上文所定义。
IV.药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何ADC分子或其药学上可接受的盐的组合物，优选地组合物为药物组合物或药物制剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的ADC分子，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明还包括包含本发明的ADC分子或其药学上可接受的盐的组合物(包括药物组合物)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的ADC分子与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的ADC的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VII.药物组合和药盒
在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的ADC分子，以及一种或多种其它治疗剂(例如治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等)。
本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含本发明的ADC分子的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。
VIII.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的ADC分子、药物组合物、药物组合或药盒。
在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)CLDN18.2。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤细胞表达CLDN18.2，例如中等表达CLDN18.2，优选的高表达CLDN18.2。
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤以及转移性病灶。在一个实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。
在一个具体的实施方案中，本发明的ADC分子能够杀伤肿瘤细胞，和/或抑制肿瘤细胞增殖，例如表达CLDN18.2的肿瘤细胞，例如消化道肿瘤细胞，例如胃癌细胞或胰腺癌细胞或结肠癌细胞或结直肠癌细胞。
在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症，例如上皮肿瘤，例如消化道肿瘤，例如上皮癌症或消化道癌症，例如胃癌或胃食管交界癌或胰腺癌或结直肠癌或结肠癌。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。
在其他方面，本发明提供ADC分子或药物组合物或药物组合或药盒在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，本发明的ADC分子或药物组合物或药物组合或药盒会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本发明的ADC分子或药物组合物还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。
示例性的其他抗体包括特异性结合免疫检查点的抗体。
本发明的组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的ADC分子的施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。
组合物还可经由植入膜、海绵或其上吸收或胶囊包封所需分子的另一种适当的材料被局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可被植入到任何合适的组织或器官中，并且可经由扩散、定时释放的大丸剂、或连续施用递送所需分子。
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
实施例
实施例1.1、稳定表达细胞株的构建
人源CLDN18.2的过表达细胞株的制备
根据制造商的说明书，使用 试剂盒(Invitrogen,A1369601)构建稳定表达人源Claudin18.2(简称CLDN18.2，以下同)的细胞系。首先将人源CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)的全长基因构建到载体pCHO1.0中，构建质粒，采用化学转染法和电转染法将构建好的质粒分别转入CHO-S细胞(Invitrogen,A1369601)和HEK293细胞(Invitrogen,A14527)中，转染后的细胞经过两轮加压筛选得到分别表达CLDN18.2的细胞池(pool)。然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP，Beckman Coulter)将高表达CLDN18.2的细胞分选出来，通过稀释法获得稳定表达CLDN18.2的单克隆细胞系CHO-hCLDN18.2和HEK293-hCLDN18.2。
人源CLDN18.1的过表达细胞株的制备
根据制造商的说明书，使用 试剂盒(Invitrogen,A1369601)构建稳定表达人源Claudin18.1(简称CLDN18.1，以下同)的细胞系。首先将 人源CLDN18.1(UniProt ID:P56856-1)全长基因构建到载体pCHO1.0(Invitrogen,A1369601)中，形成质粒，采用化学转染法将构建好的质粒转入CHO-S细胞(Invitrogen,A1369601)中，转染后的细胞经过两轮加压筛选得到分别表达CLDN18.1的细胞池(pool)。然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP,Beckman Coulter)将高表达CLDN18.1的细胞分选出来，通过稀释法获得稳定表达CLDN18.1的单克隆细胞系CHO-hCLDN18.1。
过表达CLDN18.2的肿瘤细胞系的构建
将人源CLDN18.2(UniProt ID:P56856-2)的全长基因构建到载体pWPT-GFP(Addgene,12255)中，替换其中的GFP序列，与慢病毒的包装载体psPAX2(Addgene,12260)和pMD2.G(Addgene,12259)共同转染到HEK293T(ATCC,CRL-3216)细胞中，进行病毒的包装。分别收集培养了48小时和72小时后的培养上清，使用PEG8000进行慢病毒的浓缩。用浓缩后的病毒转染胰腺癌DAN-G细胞(CLS Cell Lines Service GmbH,300162)和胃癌KATO III细胞(ATCC,HTB-103)，然后利用流式细胞分选仪(MoFlo XDP,Beckman Coulter)将表达CLDN18.2的细胞分选出来，获得稳定转染CLDN18.2的肿瘤细胞系DAN-G-hCLDN18.2和KATO III-hCLDN18.2。
实施例1.2、CLDN18.2单克隆的产生
本发明采用杂交瘤技术，通过实施例1获得的细胞(CHO-hCLDN18.2)免疫小鼠H2L2全人源抗体转基因小鼠(购自Harbour BioMed)。然后获取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行电融合。之后收集上清液通过流式细胞仪(FACS)筛选出特异性表达抗CLDN18.2抗体的杂交瘤细胞，且分泌的抗体不与CLDN18.1结合。将实施例1获得的待检测细胞(HEK293-hCLDN18.2)计数，并稀释至1×10 6个细胞/ml,向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，离心，去除细胞培养基。将杂交瘤96孔板培养上清加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，冰上静置30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。每孔加入100μl抗鼠Fab的FITC标记的二抗(1:500稀释于PBS中)，阳性对照抗体加入100μl抗人Fab的FITC标记的二抗。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。将阳性克隆，再用上述同样方法进行CHO-hCLDN18.1的复筛。经过两轮筛选，获得了全人源抗体克隆HB37A6。
实施例1.3、重组CLDN18.2单克隆抗体的制备
将抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6(参见CN202010570517.X)以及对照抗体zolbetuximab(简称Zmab，序列来源于INN117)以全长单克隆抗体的形式表达在HEK293细胞(Invitrogen,A14527)中。
首先构建表达载体，分别将HB37A6和对照抗体的重链可变区和轻链可变区(参见序列表信息)放置在人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:5)和轻链kappa 恒定区(SEQ ID NO:10)的N端。之后构建到带有N端信号肽的pcDNA3.1表达载体中，获得轻重链表达载体。将所获得的轻、重链表达载体通过PEI(Polysciences Inc,23966)共转染到HEK293细胞中，培养7天后收集培养基上清。上清通过Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)进行纯化，之后超滤并换液到PBS(Gibco，70011-044)中，采用A280法检测浓度并用SEC-HPLC法测定纯度，获得纯度大于95％的抗体溶液，得到重组CLDN18.2单克隆抗体HB37A6。
具体转染和纯化过程如下：
根据所需转染体积传代Expi293细胞(Invitrogen,A14527)，转染前一天将细胞密度调整至1.5×10 6个细胞/ml。转染当天细胞密度约为3×10 6个细胞/ml。取终体积1/10的Opti-MEM培养基(Gibco，31985-070)作为转染缓冲液，按1.0μg/ml转染细胞加入适当的质粒，混匀。加合适的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，23966)到质粒中(质粒与PEI的比例在293F细胞中为1:3)，混匀后室温孵育20min，获得DNA/PEI混合物。将DNA/PEI混合物缓慢加入细胞中，边加边轻轻晃动摇瓶，然后置于36.5℃，8％的CO 2培养箱中培养，七天后获得细胞料液，收集细胞上清进行纯化。
将纯化使用的Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE，11-0034-95)使用0.1M NaOH处理2h，玻璃瓶等用蒸馏水洗净后在180℃干烤4h。纯化前将收集的细胞料液4500rpm离心30min，将上清使用0.22μm的滤器过滤。使用10个柱体积的结合缓冲液(磷酸钠20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡Protein A柱。将过滤后的上清加入纯化柱后使用10个柱体积的结合缓冲液平衡。加5ml洗脱缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠0.1M,pH3.5)，收集洗脱液，每1ml的洗脱液加入80μl浓度为2M Tris-HCl。将收集的抗体超滤浓缩交换到PBS(Gibco，70011-044)中，并检测浓度。
实施例1.4、SPR法测定CLDN18.2抗体亲和力
采用表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定HB37A6结合人CLDN18.2的平衡解离常数(K D)。根据制造商的说明，使用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，将人Claudin18.2(GenScrip，P50251802)偶联在CM5芯片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶联后注入1M乙醇胺，对剩余的活化位点进行封闭。根据制造商的说明，通过Biacore(GE Healthcare，T200)检测芯片表面抗原与流动相中的抗体之间的结合与解离获得亲和力及动力学常数。将梯度稀释后的抗体(0-100nM)，由低浓度到高浓度的顺序流过芯片表面，结合时间180s，解离时间600s。最后使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)对芯片进行再生。数据结果使用Biacore T200分析软件，以1:1结合模型进行动力学的分析。如表1所示：HB37A6亲和力优于对照抗体Zmab。
表1.SPR法检测CLDN18.2抗体的亲和力常数(平衡解离常数)
实施例1.5、CLDN18.2抗体与CLDN18细胞的结合特异性
通过流式细胞术(FACS)测定上述抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6以及对照抗体Zmab分别与实施例1获得的稳定转染了人源CLDN18.2和人源CLDN18.1的CHO-S细胞系(即如实施例1所述制备的CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)的结合。
具体而言，将实施例1获得的待检测细胞(CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)计数，并稀释至1×10 6个细胞/ml,向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，离心，去除细胞培养基。将抗CLDN18.2单克隆抗体HB37A6以及对照抗体Zmab加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，抗体的起始浓度为900nM，然后依次3倍稀释，共10个浓度点。冰上静置30min。500g5min去除上清，PBS洗细胞1遍。每孔加入100μl山羊抗人Fc的PE标记的二抗(SouthernBiotech,J2815-5H87B)。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。使用GraphPad Prism软件分析实验数据，得到图1和图2。如图1和图2所示，所述抗体均特异地结合人CLDN18.2(图1)，而不与人CLDN18.1结合(图2)。
实施例1.6、CLDN18.2抗体与肿瘤细胞系的结合
参照实施例1.5，通过FACS测定HB37A6与胃癌细胞系NUGC-4(JCRB，JCRB0834)、胃癌细胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌细胞系DAN-G-hCLDN18.2的结合。图3显示全人源抗体HB37A6均具有较好的肿瘤细胞特异性结合，优于对照抗体Zmab。
实施例1.7、CLDN18.2抗体的体内抗肿瘤效果
1、抗体对DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型的活性
应用HB37A6抗体测试其在带有人胰腺癌的NOD-SCID小鼠(雌性NOD-SCID小鼠(15-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司)内的抗肿瘤效果。将实施例1构建的人胰腺癌细胞DAN-G-hCLDN18.2进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散DAN-G-hCLDN18.2，获得细胞密度为12×10^5个/ml的悬液。将细胞悬液与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为6×10^5个/ml细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOD-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型。
肿瘤细胞接种5天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在43.36mm 3～89.47mm 3范围内的小鼠按瘤体积大小蛇形分组(每组8只小鼠)分组。
对每只小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批号160308-02)和HB37A6及对照抗体Zmab，给药剂量为每次10mg/kg，分别在接种后第5、9、12、16天给药，每周2-3次监测小鼠瘤体积。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W 2/2。采用电子天平测定体重。
2、抗体对NUCG-4荷瘤小鼠模型的活性
选取HB37A6抗体测试其在带有人胃癌的NOG小鼠(雌性NOG小鼠(15-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司)内的抗肿瘤效果。将PBMC细胞(Allcells)复苏，离心收集细胞，以PBS(1×)分散PBMC细胞，细胞密度为 2.5×10^6个/ml细胞悬液，在第0天取0.2ml细胞悬液用于NOG小鼠眼静脉注射，建立NOG人源化小鼠模型。
将NUGC-4细胞进行常规复苏传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散NUGC-4细胞，细胞密度为12×10^6个/ml与matrigel胶1:1混合制备成细胞浓度为6×10^6个/ml细胞悬液。在第5天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOG人源化小鼠右侧腹部区域中来建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。
肿瘤细胞接种后第1天随机分组，每组7只，对每只小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批号160308-02，对照组)和HB37A6(治疗组)及阳性对照抗体Zmab(治疗组)，给药剂量为每次10mg/kg，分别在接种后第1、5、8、12天给药，每周2-3次监测小鼠瘤体积与体重。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W 2/2。采用电子天平测定体重。在接种第26天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：
TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。
3、结果
结果如图4所示，HB37A6及对照抗体Zmab在人胰腺癌DAN-G-CLDN18.2小鼠模型上都能抑制肿瘤生长，HB37A6的TGI为28％，Zmab的TGI为24％。如图5所示，HB37A6在人胃癌NUGC-4小鼠模型上比对照抗体Zmab展示出更佳的抗肿瘤效果，HB37A6的TGI为31％，Zmab的TGI为0％。
实施例2.1 IEX019ADC分子的合成
IEX019
在HB37A6的基础上，进一步设计合成偶联了不同小分子化合物的ADC。具体过程如下：
实施例2.1.1 IEX019-02的制备
1). 化合物6的制备
在N 2气氛下，向BCN-OH(5,1.5g,10mmol)的DCM(150mL)溶液中加入氯磺酰异氰酸酯(CSI)(0.87mL,1.4g,10mmol)、Et 3N(2.8mL,2.0g,20mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.2mL,1.26g,12mmol)。将混合物搅拌10分钟并通过添加NH 4Cl水溶液(饱和的，150mL)淬灭。分离后，水层用DCM(150mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na 2SO 4)并浓缩。将残留物用柱色谱纯化。获得呈淡黄色稠油状物的产物6(2.06g,5.72mmol,57％). 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ(ppm)6.0(bs,1H),4.28(d,J＝8.2Hz,2H),3.78–3.73(m,2H),3.66–3.61(m,2H),3.61–3.55(m, 2H),3.34(t,J＝4.9Hz,2H),2.37–2.15(m,6H),1.64–1.48(m,2H),1.40(quintet,J＝8.7Hz,1H),1.05–0.92(m,2H).
2 )化合物7的制备
向6(47mg,0.13mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中加入CSI(11μL,18mg,0.13mmol)。30分钟后，加入Et 3N(91μL,66mg,0.65mmol)和二乙醇胺(16mg,0.16mmol)的DMF(0.5mL)溶液。30分钟后，加入氯甲酸对硝基苯基酯(52mg,0.26mmol)和Et 3N(54μL,39mg,0.39mmol)。再过4.5小时后，将反应混合物浓缩并通过梯度柱色谱法(33→66％EtOAc/庚烷(1％AcOH))纯化残留物，得到为无色油状物的7(88mg,0.098mmol,75％). 1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ(ppm)8.28–8.23(m,4H),7.42–7.35(m,4H),4.52(t,J＝5.4Hz,4H),4.30(d,J＝8.3Hz,2H),4.27–4.22(m,2H),3.86(t,J＝5.3Hz,4H),3.69–3.65(m,2H),3.64–3.59(m,2H),3.30–3.22(m,2H),2.34–2.14(m,6H),1.62–1.46(m,2H),1.38(quintet,J＝8.7Hz,1H),1.04–0.92(m,2H).
3).化合物9的制备
将化合物8(163mg,240μmol)添加到甲磺酸依沙替康(125mg,235μmol)和DIPEA(61mg,82μL,0.47mmol)在干燥DMF(0.9mL)中的混合物中。20小时后，将反应混合物稀释至9mL DCM中并通过梯度柱色谱法(0→40％MeOH/DCM) 纯化，得到9(155mg,159μmol,68％)。LCMS(ESI+)C 55H 54FN 6O 10 +(M+H) +的计算值：977.39；实测值：977.80。
4).化合物1的制备
向化合物9(155mg,159μmol)在DMF(1.6mL)中的溶液中加入Et 3N(73mg,101μL,0.72mmol)和化合物7(65mg,72μmol)的DMF(1.4mL)溶液。将反应混合物搅拌24小时，用DCM(20mL)稀释并通过梯度柱色谱法(0→40％MeOH/DCM)纯化，得到为淡黄色固体的化合物1(94mg,44μmol,28％)。LCMS(ESI+)C 102H 118F 2N 16O 29S 2 2+(M/2+H) +的计算值：1066.88；实测值：1067.12。
5)HB37A6酶促重构为HB37A6-(GlcNAc(Fuc) 1-6-N 3-GalNAc) 2
根据实施例1.3在HEK293细胞中表达并纯化HB37A6。将获得的HB37A6(16.4mg/mL)与EndoSH(1％w/w)一起孵育，如PCT/EP2017/052792所述进行，获得修剪的在Asn297位置处具有-GlcNAc或具有GlcNAc(Fuc)的HB37A6。将上述修剪的HB37A6与PCT/EP2016/059194公开的酶His-TnGalNAcT(4.5％w/w)和PCT/EP2016/059194公开的6-叠氮基-GalNAc-UDP(与抗体相比为25eq(当量))(在含有6mM MnCl 2的组氨酸(20mM)+NaCl(150mM)的溶液中)，在30℃，孵育16小时。
接下来，使用50mL protA柱(Hitrap Mabselect Sure，GE，11-0034-95)纯化上述获得的温育混合物。将上述获得的温育混合物上样到柱上，用TBS+0.2％Triton和TBS洗涤柱。接着用0.1M醋酸盐缓冲液pH 2.9洗脱柱并用2.5M Tris-HCl pH 7.2中和。用PBS透析3次后，使用Vivaspin Turbo 15超滤装置(Sartorius)将获得的(修饰的)糖基化抗体浓缩至32.6mg/mL。
对获得的糖基化抗体用质谱进行分析，主要步骤如下：在质谱分析之前，用IdeS处理糖基化抗体，从而可以分析Fc/2片段。将20μg(修饰的)糖基化抗体溶液与IdeS(Fabricator TM)(1.25U/μL)在PBS pH 6.6中以10μL的总体积在37℃下孵育1小时。将样品稀释至80μL，然后在JEOL AccuTOF(ESI-TOF)上进行分析，使用Magtran软件获得解卷积光谱。IdeS消化样品的质谱分析显示主要的产物对应于获得的HB37A6-(GlcNAc(Fuc) 1-6-N 3-GalNAc) 2，，观察到的质量为24330.4。
因此，上述结果证明了获得了两条重链均在Asn297处的GlcNAc被6-叠氮基-GalNAc取代的(4位取代)的HB37A6-(GlcNAc(Fuc) 1-6-N 3-GalNAc) 2。
6).HB37A6-SYNtecan E偶联物(IEX019-02)的制备
根据本发明的生物偶联物IEX019-02通过将作为连接子-偶联物的化合物1(linker-payload)偶联至作为生物分子的叠氮化物修饰的HB37A6-(GlcNAc(Fuc) 1-6-N 3-GalNAc) 2来制备。因此，向HB37A6-(GlcNAc(Fuc) 1-6-N 3-GalNAc) 2(10.8mL，350mg，32.6mg/ml，PBS pH7.4)溶液中加入PBS pH 7.4(808μL)，以及1,2-丙二醇(11.3mL)和化合物1(350μL，40mM DMF溶液)。将反应在室温下孵育过夜，然后过滤和透析至PBS pH 7.4。通过加入木炭(350mg)然后在室温下旋转过夜来去除残留的游离payload。通过离心和过滤去除木炭，并在带有Superdex200 26/600SEC(GE Healthcare)柱的AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上纯化ADC。
IdeS消化样品的质谱分析显示两种主要产物均对应于获得的ADC,即HB37A6-SYNtecan E偶联物。第一个峰：观察到的质量为26469Da(计算质量为26465Da)，对应于偶联的Fc/2片段(payload的2x封闭内酯形式)。第二个峰：观察到的质量26499Da(计算质量26501Da)，对应于结合的Fc/2片段(payload的2x开放羧酸盐形式)。
制得的结构如下。用UV、SEC、RP-HPLC、LC-MS测定ADC产物的浓度、DAR值和SEC纯度。SE-HPLC检测的单体纯度为>99％，浓度为6.12mg/ml。
其中q表示平均DAR，例如为3-5、3.2-4.8、或3.5-4.5，诸如为表2中测定的3.52。
其中Ab是HB37A6。
实施例2.1.2IEX019-03的制备
其中q表示平均DAR，例如为5-11、6-10、7-9或7.5-8.5，诸如为表2中测定的7.9。
其中Ab是HB37A6。
(a)将还原剂溶液(TCEP(Sigma，C4706)，溶于水)加入HB37A6溶液(抗体HB37A6溶于PBS缓冲液(Thermo，10010023)中)，将反应混合物置于振荡器中2-4h，其中
(i)HB37A6的最佳浓度为5-10mg/mL。
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为4.5～6.5。
(iii)反应的最佳温度为20-37℃。
(iv)反应的最佳pH值一般在6.5到8.0之间。
(b)将过量的连接子-毒素MC-GGFG-DXD(购自Levena biopharma，SET0218，结构可如下面所示)溶解在DMSO中，与步骤(a)中还原的抗体的硫醇基团反应。反应混合物放置在振荡器中1-2h，其中
(i)DXD/mAb的最佳摩尔比为10.0～12.0，
(ii)反应的最佳温度为20-37℃，
获得ADC粗产物。
(c)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物IEX019-03。
(d)采用HIC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值和SEC纯度。
实施例2.1.3IEX019-04制备
其中q表示平均DAR，例如为3-5、3.2-4.8或3.0-4.0，诸如为表2中测定的3.5。
其中Ab是HB37A6。
此分子的制备按以下方法进行制备。
(a)将还原剂溶液(TCEP(Sigma，C4706)，溶于水)加入抗体HB37A6溶液(抗体HB37A6溶于PB缓冲液)中，加入完成后，将反应混合物置于振荡器中2-4h，其中
(i)抗体HB37A6的最佳浓度为5-10mg/mL
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为1.9～2.7。
(iii)还原反应的最佳温度为20-37℃。
(iv)反应的最佳pH值一般在6.5到8.0之间。
(b)将过量的带有反应基团(马来酰亚胺连接药物)的连接子-payload MC-VC-PAB-MMAE(购自Levena Biopharma，SET0201)溶解在有机溶剂DMSO中，与第(a)步产生的还原硫醇基团反应。反应混合物放置在振荡器中1-2h。
(i)MC-VC-PAB-MMAE/mAb的最佳摩尔比为8.0～10.0。
(ii)结合反应的最佳温度为20～37℃。
(c)结合反应完成后，加入乙酰半胱氨酸溶液终止步骤(b)的反应。混合后在20-25℃孵育5-15分钟。
(d)所得ADC粗产物通过自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物IEX019-04。
(e)采用HIC、SEC-HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值和SEC纯度。
实施例2.1.4IEX019-05的制备
其中q表示平均DAR，例如为3-5、3.2-4.8、或3.0-4.5，诸如为表2中测定的3.3。
其中Ab是HB37A6。
此分子按以下方法进行制备。
(a)将连接子-payload SMCC-DM1溶液(其购自Levena Biopharma，SET0101，溶解于DMSO等有机溶剂中)加入抗体HB37A6溶液(抗体HB37A6溶于PB缓冲液中)，加入后，将反应混合物置于振荡器中2-5h，其中
(i)抗体HB37A6的最佳浓度为5～10mg/mL；
(ii)连接子-payload/mAb的最佳摩尔比为5.5～6.5；
(iii)反应的最佳pH值一般在6.5到8.0之间；
(iv)反应的最佳温度为20-37℃；
获得ADC粗产物。
(b)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物IEX019-05。
(c)采用紫外分光光度法、SEC高效液相色谱法测定ADC产物的DAR平均值和SEC纯度。
实施例2.1.5IEX019-06的制备
制备过程与IEX019-02类似，只是将HB37A6单抗换成了对照抗体IgG。
实施例2.1.6IEX019-07的制备
制备过程与IEX019-04类似，只是将HB37A6单抗换成了对照抗体IgG。
所有单抗及ADC的信息总结在表2。
*其中IgG的重链为SEQ ID NO:21，轻链为SEQ ID NO:22。
实施例2.2IEX019分子的细胞结合实验
为了检测小分子偶联是否会改变IEX019-01单抗与靶细胞的结合特性，我们利用DAN-G细胞株(hCLDN18.2阴性)以及实施例1制备的DAN-G-hCLDN18.2细胞株(过表达hCLDN18.2)，通过流式细胞技术检测IEX019-01和IEX019-02与靶点的亲和力，实验方法同实施例1.5。
IEX019-01和IEX019-02均不结合非靶细胞DAN-G，而与DANG-hCLDN18.2有很强的亲和力，表明抗体的结合依赖靶点的表达特异性，而且Exatecan的偶联不会影响抗体的结合。同时，对照分子IEX019-06(单抗为IgG的阴性对照，IgG用同样的技术偶联Exatecan毒素)并不结合靶细胞(图6)。
实施例2.3 IEX019分子的内吞实验
强内吞是ADC药物的重要特性之一。当ADC与细胞膜表面的抗原结合后，通过内吞作用使ADC-抗原复合物进入细胞，杀伤靶细胞。因此ADC的内吞效率是决定肿瘤抑制效果的重要指标之一。
为了检测偶联小分子化合物之后抗体的内吞效率，我们通过流式细胞技术检测不同的IEX019分子在DANG-hCLDNA18.2细胞上的内吞。将DANG-hCLDNA18.2细胞消化后，调整细胞密度，以1*10 5个细胞/孔铺至96孔板。500g离心3min，弃上清。取100μl待检测分子重悬细胞(分子浓度为50nM)，每一个样品设置5个重复(即内吞时间:0h,1h,2h,3h,4h)。放置在冰上，孵育1h。1h后，500g离心3min，弃上清。每孔加入200μl FACS buffer(1％FBS,1X PBS)，润洗2次。取其中一组样品，转移至新的96孔板中，37℃孵育4h。其余样品继续在冰上孵育。重复之前的操作，分别取样品在37℃孵育3h,2h,1h,0h。特定孵育时间完成后，500g离心3min，弃上清。每孔加入100μl 1:400稀释的抗hFC-PE抗体(SouthernBiotech)，冰上避光孵育30分钟。二抗孵育完成后，500g离心3min，弃上清。每孔加入200μl FACS buffer润洗2次，最终用100μl PBS重悬细胞，上机检测。
实验结果如图7所示，以37℃孵育0h为内吞的零点，孵育2h后，所有分子均达到内吞最大限度，约60％，说明基于IEX019-01设计合成的ADC分子结合肿瘤细胞之后，保持了和单抗一致的很强的被内吞的能力。
实施例2.4：IEX019分子体外细胞杀伤效果
利用CellTiter-Glo(Promega,G9242)检测试剂盒，检测在表达不同水平hCLDNA8.2的多种细胞系上(表3)，ADCs对细胞存活率的影响。
表3.hCLDN18.2在所用细胞系的表达量
将所用细胞用EDTA/Trypsin消化后，调整密度，均匀铺至96孔板中(表4)，并添加稀释后的特定浓度的样品IEX019分子(IEX019-02、IEX019-03、IEX019-04，稀释起始浓度为100nM，稀释倍数为3)，将未添加IEX019分子的孔作为对照。放置37℃培养箱孵育5天。5天后，每孔加入100μl CellTiter-Glo检测试剂，室温孵育30min，用酶标仪检测。计算相对细胞活率(相对细胞活率＝样品/对照*100％)，并用Graph Pad Prism 8.0拟合曲线。
如图8所示，ADC分子对细胞系的杀伤依赖于表面hCLDN18.2的表达水平。在hCLDNA8.2阴性的DANG中，IEX019分子对细胞活率无显著影响(图8A)；在中表达水平的细胞株(NUGC-4，SNU620)，IEX019分子对细胞有一定程度的杀伤(图8B)；在高表达细胞株DAN-G-hCLDN18.2上，IEX019分子均有显著的杀伤效果(图8C)。表明IEX019分子有良好的选择性和有效性。
表4.细胞种植密度
实施例2.5：旁杀者效应(Bystander killing effect)
在ADC药物的合成过程中，小分子化合物可以通过可切割型(cleavable)连接子连接到抗体上，被内吞进入细胞膜之后，连接子被切割，小分子释放从而杀死靶细胞。靶细胞死亡后，小分子化合物从靶细胞被释放到细胞间隙，进一步杀伤一定范围内的非靶细胞，这种效应被称为旁杀者效应。由于肿瘤内部的细胞在靶标表达水平上会有很大的差异(肿瘤异质性)，因此旁杀者效应对于有效的杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长非常重要。
本发明利用非靶细胞DAN-G和靶细胞DANG-hCLDN18.2，检测IEX019分子的旁杀者效应。
将细胞用EDTA/Trypsin消化后，调整密度，准备六孔细胞培养板，加入DANG细胞以及DANG-hCLDN18.2各7.5×10 4个，将2种细胞共同培养。每孔中加入200μl待测样品(IgG(SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22),IEX019-02,IEX019-05,IEX019-06,Exatecan(Macklin,E881532)，终浓度为50nM，每个样品设置3个重复。将细胞培养板放置37℃培养箱，培养5天。5天后，弃培养液上清，PBS润洗后加入Trypsin-EDTA消化细胞，收集所有被消化后的细胞，转移到96孔板中。按照流式细胞检测技术的抗体孵育流程，分别与一抗(IEX019-01,100nM)，二抗(抗hFc-PE,SouthernBiotech)在4℃进行孵育，各孵育1h和0.5h。PBS润洗后，将live/dead Violet染料(Thermo，L34964)按1:1000稀释，每孔加入100μl，4℃孵育20min。PBS润洗后，用100μl PBS重悬细胞，上机检测。利用live/dead染料分出每个样品中的群体，其中IEX019-01阴性(即hCLDN18.2阴性)的群体为DAN-G细胞，IEX019-01阳性(即hCLDN18.2阳性)的细胞为DAN-G-hCLDN18.2。分别统计每个样品中两种细胞的数目，按下述方程式计算出每种细胞的相对细胞活率，并用Graph Pad Prism 8.0拟合曲线。
DANG细胞相对活率＝样品组DNAG细胞数目/IgG组DNAG细胞数目*100％
DANG-hCLDN18.2细胞相对活率＝样品组DNAG-18.2细胞数目/IgG组DNAG-18.2细胞数目*100％
IgG组细胞活率设置为100％。
如图9所示，阴性对照样品IEX019-06对两种细胞均无杀伤效果；IEX019-05分子通过不可切割的连接子将DM1毒素连接到IEX019-01单抗上，没有杀伤周围非靶细胞的能力，因此只能杀伤DANG-hCLDNA8.2细胞，而对DANG细胞没有影响。只有IEX019-02具有显著地旁杀者效应，可以同时杀死靶细胞和非靶细胞。
实施例2.6：IEX019分子在DAN-G-hCLDN18.2小鼠移植瘤模型上的抗肿瘤药效
为了证明IEX019分子的体内药效，我们采用DANG-hCLDN18.2细胞接种CB-17-SCID小鼠测定本发明的抗体分子的抗肿瘤药效。实验使用SPF等级的雌性CB-17-SCID小鼠(14-17g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证编号为NO.110011201108225246。
将DANG-hCLDN18.2细胞进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散DANG-hCLDN18.2细胞，制备成细胞浓度为3×10 6个/ml的细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB-17SCID小鼠右侧腹部区域中来建立DANG-hCLDN18.2荷瘤小鼠模型。
肿瘤细胞接种第5天将所有小鼠肿瘤体积为50.16-136.68mm 3蛇形分组(每组6只小鼠)，给药剂量和方式如表5所示，在接种后第5天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重，如图10a、10b所示，监测至92天后结束。
接种后第50天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：
TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。
肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：
V＝L*W 2/2。采用电子天平测定体重。
表5.实验设计表(注：单次给药，共1次)
组别 给药剂量 给药次数 给药方式
IEX019-01(对照组) 10mg/kg 单次给药 腹腔注射
IEX019-02(治疗组) 10mg/kg 单次给药 腹腔注射
IEX019-03(治疗组) 10mg/kg 单次给药 腹腔注射
IEX019-04(治疗组) 10mg/kg 单次给药 腹腔注射
肿瘤抑制率结果如表6和图10A所示：在接种后第50天，相对于IEX019-01单抗，IEX019-02单次给药肿瘤抑制率达到103.60％，明显优于IEX019-03和IEX019-04，肿瘤抑制率分别为93.70％和35.20％。在接种82天之后，IEX019-02组的小鼠100％肿瘤完全消退。同时我们对小鼠体重进行检测，结果如图10B所示小鼠体重无显著差异。
表6.第50天肿瘤抑制率
实施例2.7：IEX019分子在NUGC-4小鼠移植瘤模型上的抗肿瘤药效
为了证明IEX019分子的体内药效，我们采用NUGC-4细胞接种CB-17-SCID小鼠测定本发明的抗体分子的抗肿瘤药效。
实验使用SPF等级的雌性CB-17-SCID小鼠(14-17g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证编号为NO.110011201109348141。
将NUGC-4细胞进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散NUGC-4细胞，制备成细胞浓度为3×10 7个/ml的细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB-17SCID小鼠右侧腹部区域中来建立NUGC-4荷瘤小鼠模型。
肿瘤细胞接种第5天将所有小鼠肿瘤体积为72.25-140.50mm 3蛇形分组(每组6只小鼠)，给药剂量和方式如表7所示，在接种后第5给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重，如图11A、11B所示，监测至40天后结束。
接种后第33天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：
TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。
肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：
V＝L*W 2/2。采用电子天平测定体重。
表7.实验设计表(注：单次给药，共1次)
肿瘤抑制率结果如表8和11A所示：在接种后第33天，相对于阴性对照IEX019-06，IEX019-02和IEX019-03单次给药肿瘤抑制率分别为80.04％和54.31％。同时我们对小鼠体重进行检测，结果如图11B所示小鼠体重无显著差异。
表8.第33天肿瘤抑制率
实施例2.8：IEX019分子在SNU620小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤药效
为了证明IEX019分子的体内药效，我们采用SNU620细胞接种CB-17-SCID小鼠测定本发明的分子(IEX019-02)的抗肿瘤药效。实验使用SPF等级的雌性CB-17-SCID小鼠(18-20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证编号为NO.110011211102179364。
将SNU620细胞进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，以PBS(1×)分散SNU620细胞，制备成细胞浓度为3×10 7个/ml的细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB-17SCID小鼠右侧腹部区域中来建立SNU620荷瘤小鼠模型。
肿瘤细胞接种第7天将所有小鼠肿瘤体积为58.1-117.3mm 3蛇形分组(每组6只小鼠)，给药剂量和方式如表9所示，在接种后第7天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重，如图12a、12b所示，监测至39天后结束。
接种后第39天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：
TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。
肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：
V＝L*W 2/2。采用电子天平测定体重。
表9.实验设计表(注：单次给药，共1次)
肿瘤抑制率结果如表10和图12A所示：在接种后第39天，与hIgG对比，IEX019-02 10mg/kg单次给药后肿瘤抑制率为143.77％，100％的小鼠肿瘤完全消退。小鼠体重在各给药组相对于hIgG对照组均没有显著差异(图12B)。
表10.第39天肿瘤抑制率
序列信息：

Claims (28)

  1. 一种具有式I的抗体-药物偶联物：
    Ab-(L-(D) r) p(I)
    或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    其中：
    Ab是结合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的抗体或其片段；
    L是连接子；
    D是药物，例如抗肿瘤化合物；并且
    p是1至10，例如1-9、2-8、3-7、4-6、2-6，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    r是1-5，优选为1或2；
    其中
    式(I)中的Ab包含分别如以下氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：SEQ ID NO:1、2和3，以及分别如以下氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3:SEQ ID NO:6、7和8。
  2. 权利要求1的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab包含重链可变区和/或轻链可变区，其中重链可变区
    (i)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (ii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (iii)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；和/或
    轻链可变区
    (i)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (iii)包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
  3. 权利要求1-2中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
  4. 权利要求1-3中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，式(I)中的Ab为IgG抗体。
  5. 权利要求1-4中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab的重链恒定区来自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4，优选的IgG1。
  6. 权利要求1-5中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab包含重链和轻链，其中重链
    (i)包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
    (ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (iii)包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；且
    轻链
    (i)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
    (ii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
    (iii)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  7. 权利要求1-6中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab是人抗体。
  8. 权利要求1-7中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的Ab是抗原结合片段，例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’) 2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
  9. 权利要求1-8中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中连接子是MC-VC-PAB、vc-PAB、SMCC或MC-GGFG。
  10. 权利要求1-8中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体是具有改造的糖基化的抗体，例如在体外经酶法对糖链进行修饰(例如通过糖苷酶(例如糖苷内切酶或糖基转移酶)对糖链进行修饰)后获得的抗体，优选地，所述具有改造的糖基化的抗体是指抗体糖基化位点上的糖链由非均一结构N糖链改造成带有反应性基团(例如能与连接子部分反应的任何反应性基团，例如叠氮基、酮基和炔基)的单一结构N糖链的抗体，更优选地，所述N-糖基化位点为抗体Fc结构域上保守的N-糖基化位点，例如Asn297。
  11. 权利要求1-8中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述连接子是能够实现位点特异性偶联的连接子，优选地与抗体寡糖连接的连接子，优选地，所述寡糖连接子是包含炔基的连接子，最优选的，所述寡糖连接子是与抗体Fc结构域上保守的N-糖基化位点(例如Asn297)处的N-糖链上的反应性基团(例如叠氮基)能够实现特异性位点偶联的连接子。
  12. 权利要求1-11中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗肿瘤化合物是细胞毒性剂或化疗剂，例如Exatecan、Dxd、MMAE或DM1。
  13. 一种具有式II的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物
    其中
    Ab如权利要求1-8之一中所定义，
    L 1为连接体；
    E为糖或糖衍生物，优选选自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)；
    并且GlcNAc为N-乙酰葡糖胺，Fuc为岩藻糖；
    D、r如权利要求1-8之一的式I中所定义；
    b为0或1；
    x为1、2、3或4；
    y为1-20。
  14. 权利要求13的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    其中x为1或2；且
    y为1至10；
    优选地x为1，y为2。
  15. 权利要求13的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中E为GalNAc。
  16. 权利要求15的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中E为6-脱氧-2-乙酰胺基半乳糖，且其通过6位C原子与L 1连接。
  17. 权利要求13-15中任何一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中与Ab连接的GlcNAc存在于抗体两条重链的Asn297-糖基化位点上。
  18. 权利要求11-17中任何一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 1具有如下结构
    Q为-N(H)C(O)CH 2-或-CH 2-；
    R 1独立地选自氢、卤素、-OR 2、-NO 2、-CN、-S(O) 2R 2、C 1-C 12烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基，且其中所述烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基烷基和杂 芳基烷基为任选地取代的，其中两个取代基R 1可连接在一起形成稠合、桥接或螺接的环烷基或者稠合或螺接的芳烃或杂芳烃取代基，且其中R 2独立地选自氢、卤素、C 1-C 24烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基；
    R 3和R 4各自独立地选自氢、卤素、C 1-C 24烷基、芳基、杂芳基、C 1-C 12烷基芳基、C 1-C 12烷基杂芳基、芳基C 1-C 12烷基和杂芳基C 1-C 12烷基；
    c为0、1、2、3或4；
    m为0或1；
    n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    Y为O、S或NR 1；
    L 2和L 3各自独立地为C 1-C 12烷基，该烷基中的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S的杂原子替换，前提是所述O、N和/或S不直接相互连接；
    L 4各自独立地为可裂解的连接子。
  19. 权利要求18的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 4各自独立地为
    其中R 5和R 6各自独立地选自氢和C 1-C 12烷基；且
    Ar选自芳基。
  20. 权利要求19的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 4各自独立地为
  21. 权利要求13-17中任何一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中-L 1-具有如下结构
  22. 权利要求1至21中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述抗体-药物偶联物具有1-15，例如2-10、2-8或3-5的平均DAR。
  23. 权利要求1或13的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述抗体-药物偶联物选自：
    其中Ab是HB37A6
    其中q表示平均DAR，
    在IEX019-02、IEX019-04、IEX019-05中，q为2-5，例如3-5或3.5-4.5，
    在IEX019-03中，q为5-11，例如7-9或7.5-8.5。
  24. 药物组合物，其包含权利要求1至23中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及任选的一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂，以及任选的药用辅料。
  25. 药物组合，其包含权利要求1至23中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
  26. 预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至23中任一项的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或权利要求24的药物组合物、或权利要求25的药物组合。
  27. 权利要求26的方法，其中所述肿瘤为癌症，优选的，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)CLDN18.2，优选地，所述受试者的肿瘤细胞中等表达或高表达CLDN18.2，所述癌症例如上皮癌症或消化道癌症，例如胃癌或胃食管交界癌或胰腺癌或结直肠癌或结肠癌。
  28. 权利要求26-27中任一项的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
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