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CN119161477A - 抗l1-cam抗体及其用途 - Google Patents

抗l1-cam抗体及其用途 Download PDF

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CN119161477A
CN119161477A CN202411020658.9A CN202411020658A CN119161477A CN 119161477 A CN119161477 A CN 119161477A CN 202411020658 A CN202411020658 A CN 202411020658A CN 119161477 A CN119161477 A CN 119161477A
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cam
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cells
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N·K·张
H·许
M·铃木西岛
B·奈米波卡
J·刘易斯
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Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Abstract

本申请总体上涉及可以与L1‑CAM蛋白结合并中和其活性的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)。本申请的抗体可用于检测和治疗有需要的受试者中L1‑CAM阳性癌症的方法。

Description

抗L1-CAM抗体及其用途
本发明申请是基于申请日为2018年6月14日，申请号为201880052266.7(国际申请号为PCT/US2018/037645)、名称为“抗L1-CAM抗体及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月15日提交的美国临时申请号62/520,382的优先权，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2018年6月14日创建的所述ASCII副本被命名为115872-0375_SL.txt并且大小为147,283字节。
技术领域
本技术总体上涉及特异性地结合L1-CAM蛋白的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)的制备以及所述免疫球蛋白相关组合物的用途。具体地，本技术涉及L1-CAM中和抗体的制备以及所述抗体在检测和治疗L1-CAM相关癌症中的用途。
背景技术
下文提供对本技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本技术，并且不承认该说明描述或构成针对本技术的现有技术。
嵌合抗原受体(CAR)技术的出现(Sadelain M等人,Cancer Discov3:388-98(2013))正在迅速扩展抗L1-CAM重定向的经基因修饰的T细胞的治疗研究，其中使用经L1-CAM-CAR修饰的T细胞进行了一些临床试验：NCT00889954(所有L1-CAM(+)癌症)、NCT01935843(L1-CAM(+)实体瘤)。参见Hong H等人,J Immunother 37:93-104(2014)。虽然T细胞可以有效地靶向具有低水平L1-CAM的肿瘤，但是存在关于在具有低水平L1-CAM表达的正常组织中潜在的旁观者毒性的问题。
除了毒性之外，淋巴细胞疗法的细胞收获、加工、储存、运输和产品释放调节也可能具有挑战性，尤其是当必须对细胞进行基因修饰时。尽管输注数十亿个这些细胞，但T细胞消耗、存活和归巢是次最优的。此外，经CAR修饰的T细胞对于免疫抑制性肿瘤微环境也不例外，其中Treg、肿瘤相关巨噬细胞和髓样抑制细胞协同工作以规避经CAR修饰的T细胞的抗肿瘤特性。此外，经CAR修饰的T细胞受到经典T细胞所面临的相同的免疫抑制限制，包括在肿瘤细胞上CTLA4被B7衔接或PD-1被PD-L1(B7-H1)衔接后的无反应性。因此，用于治疗癌症的经CAR修饰的T细胞疗法的临床上有效的替代方案是必要的。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH包含GYTFTSYWMQ的VH-CDR1序列(SEQ ID NO:53)、EINPSNGRTNYNEMFKS的VH-CDR2序列(SEQ ID NO:54)和YDGYYAMDY的VH-CDR3序列(SEQ ID NO:55)；和/或(b)所述VL包含KSSQSLLYSSNQKNYLA的VL-CDR1序列(SEQ ID NO:56)、WASTRES的VL-CDR2序列(SEQ ID NO:57)和QQYHSYPFT的VL-CDR3序列(SEQ ID NO:58)。在所述抗体或抗原结合片段的一些实施方案中，所述VH包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。另外地或可替代地，所述抗体可以进一步包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。在一些实施方案中，所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与L1-CAM蛋白的表位结合，所述表位包含L1-CAM的第2Ig样结构域(SEQ ID NO:74)的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在另一个方面，本公开文本提供了一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51的重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，和/或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52的轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。在某些实施方案中，所述抗体包含选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13(huE71H1/L1)；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14(huE71 H1/L2)；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(huE71H2/L1)；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14(huE71 H2/L2)；SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22(huE72H1/L2)；SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:21(huE72 H2/L1)；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22(huE72 H2/L2)；SEQ ID NO:26和SEQID NO:25(chE71IgG1)；SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29(chE72 IgG1)；SEQ ID NO:42和SEQID NO:41(chE71IgG4)；SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:45(huE71IgG4)；SEQ ID NO:49和SEQID NO:50(huE71 BsAb)；和SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72 BsAb)。
在一个方面，本公开文本提供了一种抗体，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
在另一个方面，本公开文本提供了一种抗体，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的LC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的LC序列；和/或(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的HC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的HC序列。
在上述实施方案中的任何一个中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。在某些实施方案中，本技术的抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。在上述实施方案中的任何一个中，所述抗体与L1-CAM蛋白的表位结合，所述表位包含L1-CAM的第2Ig样结构域(SEQ ID NO:74)或L1-CAM的第6Ig样结构域(SEQ ID NO:75)的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在一个方面，本公开文本提供了编码本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列选自：SEQ ID NO:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。
在另一个方面，本公开文本提供了包含本文公开的任何重组核酸序列的宿主细胞或载体。
在一个方面，本公开文本提供了一种组合物，所述组合物包含本技术的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
在本技术的双特异性抗体的一些实施方案中，所述双特异性抗体与T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述双特异性抗体与CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原结合。所述小分子DOTA半抗原可以选自DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2 、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2 、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2 ；DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2 、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2 、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2 、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2 、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2 、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2 、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
在另一个方面，本公开文本提供了一种治疗有需要的受试者中的L1-CAM相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的本文公开的任何一种抗体。在某些实施方案中，所述抗体包含选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:9和SEQID NO:13(huE71 H1/L1)；(ii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14(huE71 H1/L2)；(iii)SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:13(huE71 H2/L1)；(iv)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14(huE71
H2/L2)；(v)SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；(vi)SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22(huE72 H1/L2)；(vii)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21(huE72 H2/L1)；(viii)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22(huE72 H2/L2)；(ix)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25(chE71IgG1)；(x)SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29(chE72 IgG1)；(xi)SEQ ID NO:42和SEQID NO:41(chE71IgG4)；(xii)SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:45(huE71IgG4)；(xiii)SEQ IDNO:49和SEQ ID NO:50(huE71 BsAb)；和(xiv)SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72BsAb)，其中所述抗体与L1-CAM特异性地结合并中和L1-CAM活性。
在一些实施方案中，所述L1-CAM相关癌症是白血病、尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、NSCLC、胰腺导管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、胆管癌、类癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、嗜铬细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症、胰腺腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、肿瘤血管、软骨肉瘤、食管腺癌、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、肾上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、毛细血管瘤、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、颌下唾液腺癌或头颈部鳞状细胞癌。
另外地或可替代地，在所述方法的一些实施方案中，将所述抗体与另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予至所述受试者。另外的治疗剂的例子包括以下中的一种或多种：烷基化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂。
在另一个方面，本公开文本提供了一种用于在体内检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗体，其中所述抗体被配置为定位于表达L1-CAM的肿瘤，并用放射性同位素标记；以及(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。可以使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的本技术的抗体。在一些实施方案中，所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇(Auger)发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。在所述方法的一些实施方案中，正常组织中非特异性FcR依赖性结合消除或减少(例如，经由Fc区中的N297A突变，其导致去糖基化)。
本文还公开了用于检测和/或治疗L1-CAM相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能性变体(例如，取代变体)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物与一种或多种可检测标记偶联。在一个实施方案中，所述一种或多种可检测标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含与本文所述的抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物特异性地结合的二抗。在一些实施方案中，所述二抗与选自放射性标记、荧光标记或发色标记的至少一种可检测标记偶联。
附图说明
图1显示了人L1-CAM的分子结构。
图2显示了L1-CAM与整合素的相互作用和细胞信号传导(改编自Gavert等人,Expert opinion Biol Therapy 8:1749,2008)。
图3显示了L1-CAM在正常人组织中的表达(改编自Weidle等人,AnticancerResearch 29:4919-4932,2009)。
图4显示了L1-CAM在人肿瘤中的表达(改编自Rawnaq T等人,J Surg Res173:314-9(2012))。
图5显示了针对L1-CAM的不同鼠抗体和嵌合抗体。
图6显示了鼠抗体E71的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列及其同源人序列(SEQ ID NO:1-4)。鼠E71的重链和轻链及其同源人序列的CDR是带下划线的。
图7显示了鼠抗体E72的VH和VL的氨基酸序列及其同源人序列(SEQ ID NO:5-8)。鼠E72的重链和轻链及其同源人序列的CDR是带下划线的。E72的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列分别是GYWMH(SEQ ID NO:68)、EINPSNGRTNYNERFKS(SEQ ID NO:69)和DYYGTSYNFDY(SEQ ID NO:70)，并且E72的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列分别是KANEDINNRLA(SEQ ID NO:71)、GATNLVT(SEQ ID NO:72)和QQYWSTPFT(SEQ ID NO:73)。
图8显示了E71的人源化重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:9-10)。
图9显示了E71的人源化重链的cDNA序列(SEQ ID NO:11-12)。
图10显示了E71的人源化轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:13-14)。
图11显示了E71的人源化轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:15-16)。
图12显示了E72的人源化重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:17-18)。
图13显示了E72的人源化重链的cDNA序列(SEQ ID NO:19-20)。
图14显示了E72的人源化轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:21-22)。
图15显示了E72的人源化轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:23-24)。
图16显示了嵌合chE71的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:25-26)。
图17显示了嵌合chE71的重链和轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:27-28)。
图18显示了嵌合chE72的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:29-30)。
图19显示了嵌合chE72的重链和轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:31-32)。
图20显示了huE71的重链的氨基酸和cDNA序列(SEQ ID NO:33-34)。
图21显示了huE71的轻链的氨基酸和cDNA序列(SEQ ID NO:35-36)。
图22显示了huE72的重链的氨基酸和cDNA序列(SEQ ID NO:37-38)。
图23显示了huE72的轻链的氨基酸和cDNA序列(SEQ ID NO:39-40)。
图24显示了嵌合IgG4即chE71-IgG4的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:41-42)。
图25显示了嵌合IgG4即chE71-IgG4的重链和轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:43-44)。
图26显示了人源化IgG4即huE71-IgG4的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:45-46)。
图27显示了人源化IgG4即huE71-IgG4的重链和轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:47-48)。
图28显示了人源化E71或E72 IgG1和BsAb结合的动力学。
图29显示了使用SPR(Biacore T100)在L1-CAM-Fc上测定的huE71的人源化IgG变体的结合动力学。
图30显示了使用SPR(Biacore T100)在L1-CAM-Fc上测定的huE72的人源化IgG变体的结合动力学。
图31显示了使用SPR(Biacore T100)在L1-CAM-His上测定的huE72的人源化IgG变体的结合动力学。
图32显示了使用小鼠E71和MOPC21(作为对照)通过流式细胞术对间皮瘤细胞系进行的细胞表面染色。
图33显示了使用人源化huE71-IgGn和瑞图宣(Rituxan)(作为对照)通过流式细胞术对白血病、乳腺癌和尤文氏肉瘤细胞系进行的细胞表面染色。
图34显示了使用人源化huE71-IgGn和瑞图宣(Rituxan)(作为对照)通过流式细胞术对黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌(SCLC)和头颈癌进行的细胞表面染色。
图35显示了针对huE71和huE72二者的T细胞衔接双特异性抗体(BsAb)的构建。
图36显示了T细胞衔接双特异性抗体(BsAb)huE71-BsAb和huE72-BsAb的氨基酸序列(VH和VL)(SEQ ID NO:49-52)。
图37显示了使用SPR(Biacore T100)测得的在L1-CAM-Fc上人源化huE71或huE72IgG及其BsAb的结合动力学。
图38(A)显示了人源化E71-BsAb和人源化E72-BsAb与L1-CAM(+)肿瘤细胞的结合。图38(B)显示了人源化E71-BsAb和人源化E72-BsAb与T细胞的结合。
图39(A)显示了在存在或不存在L1-CAM(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的IL-6细胞因子释放测定的结果。图39(B)显示了在存在或不存在L1-CAM(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的IL-10细胞因子释放测定的结果。图39(C)显示了在存在或不存在L1-CAM(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的IFN-γ细胞因子释放测定的结果。图39(D)显示了在存在或不存在L1-CAM(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的IL-2细胞因子释放测定的结果。图39(E)显示了在存在或不存在L1-CAM(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的TNF-α细胞因子释放测定的结果。
图40显示了51铬释放测定的结果。将人源化E71-BsAb或人源化E72-BsAb与T细胞和IMR-32萤光素酶细胞系(E:T比率＝10:1)一起孵育4小时。
图41显示了人源化E71-BsAb或人源化E72-BsAb的细胞毒性(EC50)以及肿瘤细胞系的L1-CAM表达(平均荧光指数或MFI)。
图42(A)显示了人源化E71-BsAb的细胞毒性(EC50)与肿瘤细胞系的L1-CAM表达(MFI)呈逆相关。图42(B)显示了人源化E72-BsAb的细胞毒性(EC50)与肿瘤细胞系的L1-CAM表达(MFI)呈逆相关。
图43显示了在人源化小鼠模型中huE71-BsAb和huE72-BsAb对神经母细胞瘤肿瘤的作用。将L1-CAM(+)神经母细胞瘤患者来源的异种移植物(PDX)皮下移植到DKO小鼠中。在第15天当肿瘤可测量时开始HuE71-BsAb或huE72-BsAb治疗，使用每周两次注射的给药时间表，持续五周。在第16天开始静脉内给予PBMC(7.5×106)，然后每周注射一次，持续3周。每周测量一次肿瘤的大小。用huE72-BsAb和PBMC治疗的小鼠的肿瘤生长与对照相等。HuE71-BsAb与PBMC显著抑制了肿瘤生长。
图44显示了在人源化小鼠模型中huE71-BsAb和huE72-BsAb对神经母细胞瘤肿瘤的作用。将L1-CAM(+)神经母细胞瘤细胞系IMR32与人PBMC混合，并将其皮下植入DKO小鼠中。在第5天当肿瘤可测量时开始HuE71-BsAb或huE72-BsAb治疗，使用每周两次注射的给药时间表，持续五周。每周测量一次肿瘤的大小。用huE72-BsAb或对照(去糖基化huE71-IgG1+去糖基化huOKT3)治疗的小鼠具有相等的肿瘤生长。HuE71-BsAb或huE71-IgGn显著抑制了肿瘤生长。
图45显示了89Zr-HuE71-IgGn(MAGE)的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤和淋巴结活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuE71-1 MAGE(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的192-197μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。选择性肿瘤吸收早在24小时开始，并直到96小时持续增加。
图46显示了89Zr-HuE72-IgGn(MAGE)的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤和淋巴结活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuE72-IgGn(MAGE)(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的约200μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。选择性肿瘤吸收在24小时处是次最优的；它确实随着时间的推移增加。
图47显示了本技术的人源化抗L1-CAM抗体的特征的总结表。
图48(A)至图48(E)显示了本技术的89Zr放射性标记的L1-CAM抗体的免疫反应性。将放射免疫缀合物针对与表达抗原的细胞(SKOV-3)的结合进行了功能上的表征，并经由Lindmo测定确定免疫反应性分数(Ben QW等人,Ann Surg Oncol 17:2213-21(2010))。将每种放射免疫缀合物的等分试样即50μL的1μCi/mL原液添加至在500μL PBS、1％ BSA(pH 7.4至终体积550μL)中含有5.0×105-5.0×106个细胞/mL(一式三份)的试管中。对细胞结合活性进行计数，并将数据绘制在双倒数图上。将免疫反应性分数表示为一式三份样品的平均百分比±SEM。
图49显示了89Zr-HuE71-1 WT抗体的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤、肝脏和淋巴结活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下L1-CAM阳性SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuE71-1WT(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的194-201μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。
图50显示了89Zr-去糖基化HuE71-1抗体的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤和极低背景活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下L1-CAM-SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-去糖基化HuE71-1(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的207-214μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。
图51显示了89Zr-HuE71-4 WT抗体的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤和肾脏活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下L1-CAM阳性SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuE71-4 WT(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的198-204μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。
图52显示了89Zr-HuE71-4突变体抗体的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示高的肿瘤和背景组织活性，而肾脏活性显现最小。在荷载异种移植于右肩上的皮下L1-CAM阳性SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuE71-4突变体(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的206-212μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。
图53显示了89Zr-HuCtrl-4 WT抗体的连续PET成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物PET成像揭示低的肿瘤活性但高的肾脏活性。在荷载异种移植于右肩上的皮下L1-CAM-阳性SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中89Zr-HuCtrl-4WT(经由尾静脉注射的在150μL PBS中的200-211μCi)的代表性最大强度投影(MIP)PET图像。
图54显示了示踪剂注射后96小时的IgG1抗体的离体生物分布。放射性免疫缀合物在SKOV-3荷瘤小鼠中的急性生物分布。经由尾静脉注射给予IgG1放射免疫缀合物(17-24μCi，3-6μg)后，来自无胸腺裸小鼠(每组n＝4)的生物分布数据。针对阻断组共注射50倍过量。％ID/g值在图55中列出。星号指示P<0.05。
图55显示了注射后96小时的IgG1抗体的离体生物分布。
图56显示了示踪剂注射后96小时的IgG4抗体的离体生物分布。放射性免疫缀合物在SKOV-3荷瘤小鼠中的急性生物分布。经由尾静脉注射给予IgG4放射免疫缀合物(21-26μCi，3-6μg)后，从无胸腺裸小鼠(每组n＝4)获得的生物分布数据。针对阻断组共注射50倍过量。％ID/g值在图57中列出。星号指示P<0.05。
图57显示了注射后96小时的IgG4抗体的离体生物分布值。
图58显示了肿瘤和淋巴结组织的离体组织学分析。将注射指定放射免疫缀合物的小鼠的肿瘤和淋巴结组织收集、包埋在石蜡中，并进行常规H&E染色和分析。
图59(A)至图59(C)显示了177Lu-去糖基化HuE71-1成像和离体生物分布的结果。图59(A)：177Lu-去糖基化HuE71-1(150μL PBS中的858μCi)注射后168小时，荷载SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠的SPECT-CT图像。图59(B)：177Lu-去糖基化HuE71-1(150μL PBS中的858μCi)注射后168小时，荷载SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠的Cerenkov图像。图59(C)：177Lu-去糖基化HuE71-1(150μL PBS中的18-26μCi，n＝4)注射后168小时，荷载SKOV-3肿瘤的无胸腺裸小鼠的离体生物分布。
图60显示了进行177Lu-去糖基化HuE71-1放射免疫疗法的动物中的平均肿瘤体积。显示了在PRIT研究的前80天期间每个小鼠群组的平均肿瘤体积图，其中误差条表示标准偏差。黑色箭头指示指定治疗的第一次注射，并且灰色箭头指示分次剂量组中的177Lu-去糖基化HuE71-1的第二剂量。使用手持式TM900扫描仪(Peira，布鲁塞尔，比利时)获取肿瘤体积。在最初的肿瘤测量后，将小鼠随机分组(每组n＝8-9)，以确保所有群组均具有与开始时大致相等的平均肿瘤体积。
图61显示了huE71-IgG1n在LAN-1细胞系中介导ADCC。
图62显示了huE71-IgG1n在NB1691细胞系中介导ADCC。
具体实施方式
应当理解，下文以各种详细程度描述了本方法的某些方面、模式、实施方案、变型和特征以提供对本技术的实质理解。
本公开文本总体上提供了免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述免疫球蛋白相关组合物可与L1-CAM多肽特异性地结合并中和L1-CAM多肽的生物活性。本技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测或治疗有需要的受试者中L1-CAM相关癌症的方法。因此，本方法的各个方面涉及抗L1-CAM抗体的制备、表征和操作。本技术的免疫球蛋白相关组合物可单独使用或与用于治疗癌症的另外的治疗剂组合使用。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
在实践本方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如Sambrook和Russell编(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版；Ausubel等人编(2007)Current Protocols inMolecular Biology丛书；Methods in Enzymology丛书(学术出版社公司，纽约)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(牛津大学出版社的IRL出版社)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,第5版；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription andTranslation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL出版社(1986))；Perbal(1984)APractical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编(1987)Gene TransferVectors for Mammalian Cells(冷泉港实验室)；Makrides等人(2003)Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology(学术出版社，伦敦)；和Herzenberg等人编(1996)Weir’sHandbook of Experimental Immunology。用于检测和测量多肽基因表达产物的水平(即，基因翻译水平)的方法是本领域熟知的并且包括多肽检测方法如抗体检测和定量技术的使用。(还参见Strachan&Read,Human Molecular Genetics,第二版(约翰·威利父子出版公司，纽约，1999))。
定义
除非另外限定，否则在此所使用的所有技术和科技术语一般均具有如本技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域中熟知的和常用的。
除非上下文另外说明或另外明显，否则如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括属于所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用，向受试者“给予”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。给予可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、肿瘤内或局部。给予包括自给予和由另一个人给予。
“佐剂”是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在本文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。可以将佐剂在疫苗的给予之前、与疫苗的给予一起或之后给予至受试者。用作佐剂的化合物的例子包括铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如，维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂苷)、细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白和糖蛋白)、激素、细胞因子和共刺激因子。
如本文所用，术语“抗体”共同地指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合，以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔子和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫应答过程中产生的类似分子(如鲨鱼免疫球蛋白)。如本文所用，“抗体”(包括完整免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性地结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如，对于目的分子的结合常数比对于生物样品中的其他分子的结合常数至少大103M-1、至少大104M-1或至少大105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog和Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,罗克福德，伊利诺伊州)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
更具体地，抗体指至少包含特异性地识别并结合抗原表位的轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，即λ(lambda)和κ(kappa)。有五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)。组合的重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断的“框架”区。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其通过引用特此并入)。Kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区即组成性轻链和重链的组合框架区，主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将CDR以正确取向来进行定位。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常还由特定CDR所在的链来鉴定。因此，VH CDR3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合L1-CAM蛋白的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即对于不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管不同的抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性地结合。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段，其可以单独包含一个或多个可变区或包含一个或多个可变区与以下多肽要素中的全部或部分的组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。所述技术中还包括一个或多个可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本方法中的抗体相关分子，例如是但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“双特异性抗体”或“BsAb”指可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的抗体。多种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分都包括VH和/或VL区；在一些此类实施方案中，VH和/或VL区是在特定单克隆抗体中发现的那些。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，每个均包括来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分中的一个包括具有VH和/或VL区的免疫球蛋白分子，所述VH和/或VL区含有来自第一单克隆抗体的CDR；而另一个抗原结合部分包括具有VH和/或VL区的抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述VH和/或VL区含有来自第二单克隆抗体的CDR。
如本文所用，术语“缀合的”指通过本领域技术人员已知的任何方法使两个分子缔合。合适的缔合类型包括化学键和物理键。化学键包括例如共价键和配位键。物理键包括例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水性相互作用和芳香族堆积。
如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与同一多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更充分地描述在例如EP 404,097；WO 93/11161；和30Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包括具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的接头进行连接，从而将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶切割或化学切割来制备。
任何上述抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选所述片段。
如本文所用，“抗原”指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性地结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原可以是多肽(例如，L1-CAM多肽)。也可以将抗原给予至动物以在动物中产生免疫应答。
术语“抗原结合片段”指整个免疫球蛋白结构的片段，其具有负责与抗原结合的多肽的一部分。可用于本技术中的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab′和F(ab′)2，但不限于此。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与分子的结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结合的抗体。
如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、颊、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿、粪便、汗水、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和眼泪。生物样品也可以从内脏的活检或从癌症获得。生物样品可以从受试者获得以进行诊断或研究；或者可以从未患病的个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法获得，所述标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中，生物样品是通过针吸活检获得的乳房、肺、结肠或前列腺组织样品。
如本文所用，术语“CDR移植抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中“受体”抗体的至少一个CDR被来自具有所需抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中使用重组DNA技术将来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)用来自另一物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)替代。通常参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请0125,023；Better等人,Science 240:1041-1043,1988；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol 139:3521-3526,1987；Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218,1987；Nishimura等人,Cancer Res47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1885；和Shaw等人,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559,1988。
如本文所用，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区域。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所用，“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，如果实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗的功效的相关性，则通常使用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得可预防或减少本文所述疾病或病症或者与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗或预防应用的背景下，给予至受试者的组合物的量将根据组合物，疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。所述组合物也可以与一种或多种另外的治疗化合物组合给予。在本文所述的方法中，可以将治疗组合物给予至具有本文所述疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”指其中疾病或病症的生理作用得到改善或消除的组合物水平。治疗有效量可以按一次或多次给药来给予。
如本文所用，术语“效应细胞”意指涉及与免疫应答的认知阶段和激活阶段截然不同的免疫应答效应阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴起源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括细胞溶解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核白细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀伤并向免疫系统的其他组分呈递抗原，或与呈递抗原的细胞结合。
如本文所用，术语“表位”意指能够与抗体特异性地结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位差别在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。在一些实施方案中，L1-CAM蛋白的“表位”是本技术的抗L1-CAM抗体特异性地结合的蛋白质的区域。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。为了筛选与表位结合的抗L1-CAM抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，如描述于以下文献中的测定：Antibodies,A Laboratory Manual,冷泉港实验室,Harlow和David Lane编(1988)。此测定可用于确定抗L1-CAM抗体是否与本技术的抗L1-CAM抗体结合相同的位点或表位。可替代地或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，可以例如通过丙氨酸扫描诱变抗体序列，以鉴定接触残基。在不同的方法中，对应于L1-CAM蛋白的不同区域的肽可以与多种测试抗体、或与一种测试抗体和一种具有经表征表位或已知表位的抗体一起用于竞争测定中。
如本文所用，“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录为前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及糖基化和/或翻译产物的其他修饰(如果需要适当的表达和功能的话)。
如本文所用，术语“基因”意指含有调节RNA产物生物合成的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较在每个序列中可以用于比较目的比对的位置确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函数。多核苷酸或多核苷酸区域(多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意为，当比对时，在比较两个序列中，所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序确定此比对以及同源性或序列同一性百分比。在一些实施方案中，将默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。生物学上等同的多核苷酸是具有指定同源性百分比并编码具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此具有小于40％的同一性或小于25％的同一性，则它们被视为“无关的”或“非同源的”。
如本文所用，术语非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物)的具有所需的特异性、亲和力和能力的高变区残基(供体抗体)替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv)的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的区域，但所述FR区可以包括改善结合亲和力的一个或多个氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6，并且在L链中不超过3。所述人源化抗体任选地也可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。参见例如Ahmed&Cheung,FEBS Letters 588(2):288-297(2014)。
如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的大约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3))(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)))和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。
如本文所用，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比指相同的两个或更多个序列或子序列或者具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或特定区域上比较和比对以求最大对应时，在指定区域上(例如，编码本文所述抗体的核苷酸序列或本文所述抗体的氨基酸序列)约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用采用下文所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(例如NCBI网站)测量的。然后，此类序列被称为“基本上相同”。此术语也指或可适用于测试序列的互补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的序列。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸，或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。
如本文所用，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人类。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人类。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的自然发生的突变之外，构成所述群体的各个抗体是相同的。例如，单克隆抗体可以是源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而不是产生它的方法的抗体。单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体是针对该抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，所述多种技术包括但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，根据本方法使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)来制备。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版，A.Gennaro,2000,Lippincott编，Williams&Wilkins，费城，宾夕法尼亚州)中。
如本文所用，术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)种不同的产抗体细胞系的抗体的制剂。此术语的使用包括至少两(2)种抗体的制剂，所述制剂含有与抗原的不同表位或区域特异性地结合的抗体。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区域的混合物的RNA以及包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链的或更典型地是双链的或者单链和双链区域的混合物。此外，多核苷酸指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因对骨架进行修饰的DNA或RNA。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，意指包含通过肽键或经修饰的肽键(即肽电子等排体)彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽既指通常称为肽、糖肽或寡聚物的短链，又指通常称为蛋白质的较长链。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸以外的其他氨基酸。多肽包括通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。在基础文本和更详细的专著以及大量的研究文献中都对此类修饰进行了充分的描述。
如本文所用，术语“重组”当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或指示所述材料源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
如本文所用，术语“分开的”治疗使用指通过不同途径同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，术语“顺序的”治疗使用指在不同时间给予至少两种活性成分，给予途径相同或不同。更具体地，顺序使用指所述活性成分中的一种的整个给予在另一种或其他活性成分的给予开始之前。因此，可以在几分钟、几小时或几天内给予所述活性成分中的一种之后给予另一种活性成分或多种活性成分。在这种情况下没有同时进行的治疗。
如本文所用，“特异性地结合”指识别并结合另一个分子(例如抗原)但基本上不识别并结合其他分子的分子(例如抗体或其抗原结合片段)。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性地结合”或“特异于”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)可以例如通过一种分子对于其所结合的分子具有约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的Kd来展现。术语“特异性地结合”也可以指这样的结合，其中分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，L1-CAM多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
如本文所用，术语“同时的”治疗使用指通过相同的途径并且同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生期望的治疗效果的化合物。
如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗受试者如人中的本文所述疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起所述障碍的消退；(iii)减缓所述障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓所述疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与所述疾病相关的症状例如已得到缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的障碍的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗，并且其中获得了一些生物学或医学有关的结果。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是针对急性病症治疗的单次或几次给予。
考虑了本文描述的抗L1-CAM抗体的一种或多种氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗L1-CAM抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目的抗体。所述修饰还包括蛋白质糖基化模式的变化。进行取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑FR改变。“保守取代”显示在下表中。
一个类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。用于生成此类取代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。特别地，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以来自丝状噬菌体粒子的单价形式展示为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选如本文公开的其生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是根据本文详述的技术进行取代的候选物。一旦产生了此类变体，就对这组变体进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有相似或更优特性的抗体进行进一步开发。
L1-CAM
L1-CAM是粘附分子的L1家族的成员，它是免疫球蛋白超家族(IgSF CAM)的一部分，并涉及轴突导向、神经细胞迁移和分化。L1家族包括L1-CAM(CD171)、L1-CAM(CHL1)的近同源物、神经束蛋白和NgCAM相关细胞粘附分子(NR-CAM)。这些蛋白质在神经元中表达，尤其是在它们的轴突和神经胶质细胞(如许旺细胞)上表达。L1-CAM是涉及中枢神经系统发育的神经细胞粘附分子。L1-CAM由28个外显子和27个内含子构成，并且其基因产物的分子量的范围在200与220kDa之间(Coutelle O等人,Gene208:7-15(1998))。胞外结构域(ECM，外显子1至外显子24)具有六个Ig样结构域(图1)和五个纤连蛋白样结构域，其中N糖基化在第一个纤连蛋白结构域中。RGD基序存在于第6个Ig样结构域中。ECM参与同嗜性结合(图2)，并与FGFR共享同源区。细胞质结构域含有五个潜在的磷酸丝氨酸残基，并且可以与细胞骨架、第二信使途径和激酶相互作用。交替剪接两个外显子(2和27)(Coutelle O等人,Gene 208:7-15(1998))。
L1-CAM突变引起称为CRASH的X连锁神经障碍(胼胝体发育不全、发育迟缓、拇指内收、痉挛性截瘫和脑积水)。由L1-CAM突变引起的临床综合征是可变的：已经对CRASH患者中的L1-CAM分子的所有部分中的多于70个L1-CAM突变进行了描述。L1-CAM敲除小鼠显示皮质脊髓束增生和脑室系统异常。L1-CAM以背景相关的方式介导对不同底物的粘附。通过同嗜性(hemophilic)结合，L1-CAM与其他粘附分子(如axonin-1/TAX-1、接触蛋白、神经聚糖、神经毡蛋白1和整合素(如αvβ3、α5β1、αvβ1和αvβ5))相互作用。已经描述了顺式(在同一细胞膜中的分子之间)和反式(在相对膜上的分子之间)相互作用。ECM中的N连接的碳水化合物占L1-CAM分子量的25％。ECM具有两个蛋白水解切割位点：被金属蛋白酶ADAM 10切割的远端位点，从而产生了200和32kDa的片段。显示L1-CAM涉及多种增殖途径、抗细胞凋亡途径和血管生成相关途径。
L1-CAM通常在神经组织中发现(图3)，而包括癌细胞在内的非神经细胞则主要表达缺乏外显子2和27的变体。外显子2(YEGHHV，编码N末端Ig1结构域)对于在体外同嗜性L1-L1结合是重要的，并且是与异嗜性配体的最佳结合所需的。含有由外显子27编码的L1-CAM的RSLE序列(胞质尾区)的内化速度比L1Δ(RSLE)快2-3倍。RSLE依赖性内吞作用是一种调节L1-CAM表面密度的机制，所述表面密度转而控制神经突分支和细胞粘附。卵巢癌细胞系在体外主要表达L1-CAMΔ。通过L1-CAM激活ERK需要由外显子27介导的L1-CAM的内吞作用。这些不同的剪接变体在癌症生物学中可能具有不同甚至相反的功能。
在人癌症中的L1-CAM信号传导。L1-CAM及其切割酶ADAM10当在侵袭前沿发现时，与结直肠癌的转移潜力有关。已知β-连环蛋白-Wnt通过经由L1-CAM的信号传导赋予成纤维细胞和结肠癌细胞中的细胞运动性、侵袭和肿瘤发生。不论是通过同嗜性或异嗜性结合，L1-CAM都能促进细胞运动性并保持侵袭性表型。在存在血清或血小板衍生生长因子的情况下，L1-CAM刺激细胞外信号相关激酶(ERK)途径，从而导致与运动性和侵袭相关的基因产物(如β3整合素亚基、小GTPase和半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶-L和组织蛋白酶-B)的表达。L1-CAM与IGF2R和SCL31A1一起被鉴定为保护肿瘤细胞免于细胞凋亡的存活因子。
卵巢癌上的L1-CAM与间皮细胞上的神经毡蛋白-1结合，形成腹膜的内层，从而通过间皮细胞与肿瘤之间的相互信号传导诱导肿瘤生长。在源于不同肿瘤类型的17种肿瘤细胞系中的16种中发现了L1-CAM的非神经元同种型的表达(Shtutman M等人,Cancer Res66:11370-80(2006))。非神经元L1-CAM的敲低破坏粘附连接并增加乳腺癌细胞系MCF-7中的β-连环蛋白转录活性。全长L1-CAM经受ADAM 10和早老素/γ-分泌酶的顺序切割，然后将L1-CAM的C末端片段转移到细胞核进行基因调节。位于L1-CAM的第6Ig结构域的RGD结合位点显示对于细胞核信号传导是重要的。
金属蛋白酶介导的L1-CAM胞外域脱落为其可溶形式(sL1-CAM)具有生理影响。sL1-CAM可能通过RGD基序连接整合素来介导血管生成。sL1-CAM诱导增殖、基质胶侵袭、牛主动脉内皮细胞的管形成和促血管生成活性。sL1-CAM是几种整合素的配体，并且可以沉积在细胞外基质中。L1-CAM的细胞质结构域通过锚蛋白结合位点调节基底脱落和与细胞骨架的缔合。在卵巢癌患者的腹水和血清中可以发现带有卵巢癌细胞系的L1-CAM的组成型切割产物的外泌体。L1-CAM还可以介导脑转移模型中的血管共选择和转移性生长。组织纤溶酶破坏L1-CAM，从而停止转移过程。源自肿瘤的抗纤溶酶原即神经丝氨酸蛋白酶抑制剂(neuroserpin)可以防止纤溶酶介导的L1-CAM破坏或膜结合的星形细胞FasL(即癌细胞的旁分泌死亡信号)的释放。
L1-CAM也涉及化学抗性。例如，表达L1-CAM的卵巢癌细胞对细胞凋亡更具抗性，部分是通过抗凋亡分子Bcl-2。在L1-CAM(+)HEK-293细胞中，L1-CAM介导ERK、FAK和PAK磷酸化。针对顺铂抗性选择的细胞系上调L1-CAM表达，它的敲低恢复敏感性。
在人组织和肿瘤中的L1-CAM。在正常的人组织中，L1-CAM是在神经组织和周围神经、皮肤基底细胞和小血管中，尤其是在成熟的胎盘中检测到的(图3)。表达L1-CAM的肿瘤包括神经外胚层和神经嵴来源的肿瘤(包括神经母细胞瘤、GIST、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症等)、胰腺腺癌、卵巢和子宫癌、结直肠癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾细胞癌、三阴性乳腺癌和肿瘤血管(图4)。使用小鼠单克隆IgG抗体(UJ127)在128种不同肿瘤类型的组织微阵列(大约5500种不同样品)上进行的IHC揭示了在神经和神经嵴来源的肿瘤中的L1-CAM表达，但在上皮来源的肿瘤中没有那么多(参见图4；阴性(当与非特异性背景染色相比时，未检测到染色)、弱(在<30％的肿瘤细胞中为1+染色或2+染色)或强(在>30％的肿瘤细胞中为3+染色或2+染色))。在神经母细胞瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、GIST、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、副神经节瘤、毛细血管瘤和卡波西肉瘤中发现超过25％的阳性(弱加强)。对于恶性黑色素瘤、软骨肉瘤、食管腺癌、结直肠癌和少突神经胶质瘤发现在10％至25％之间。对于室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、小细胞肺癌、肾上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、星形细胞瘤和子宫内膜癌发现在5％-10％之间。对于良性痣、恶性间皮瘤、宫颈癌、食管鳞状细胞癌、脑膜瘤、粘膜相关淋巴组织、神经纤维瘤以及胰腺腺癌和前列腺癌发现低于5％。一般而言，L1-CAM与常伴有转移的不良分化晚期疾病阶段相关。抗L1-CAM抗体(如CE7(E72))无法与表达L1-CAM转录物的单核细胞反应。这表明与允许优先结合抗L1-CAM抗体的正常组织相比，L1-CAM在肿瘤中可能经历不同的翻译后修饰。
针对L1-CAM的现有抗体。chCE7与肾癌细胞上的人L1-CAM的第6Ig样结构域(具有RGD基序)结合(图1)，并被人神经母细胞瘤细胞内化(Meli ML等人,Int J Cancer 83:401-8(1999)；Novak-Hofer I等人,Int J Cancer57:427-432(1994))。还描述了其他单克隆抗体：5G3、A10-A3、UJ127、L1-14.10、MAB777(R&D systems Inc.，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)和0.N.378(U.S Biological Life Sciences，塞勒姆市，马萨诸塞州)，它们代表各种各样的表位和亲和力(图5)。然而，尚未对针对不同表位的这些L1-CAM抗体中的每一种进行体外和体内特性的系统评价，并且所述抗体的临床影响仍不确定。许多抗L1-CAM抗体(例如chCE7)在引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)方面效率低下。一些抗L1-CAM抗体可能会在患者体内诱导不需要的免疫原性应答。
本技术的免疫球蛋白相关组合物
本技术描述了用于产生和使用抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物(例如，抗L1-CAM抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本公开文本的抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗L1-CAM阳性癌症。在本技术范围内的抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性地结合靶多肽、其同源物、衍生物或片段的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双抗体。本公开文本还提供本文公开的任何抗L1-CAM抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab)'2、Fab’、scFv和Fv。
在一个方面，本技术提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH包含GYTFTSYWMQ的VH-CDR1序列(SEQ ID NO:53)、EINPSNGRTNYNEMFKS的VH-CDR2序列(SEQ ID NO:54)和YDGYYAMDY的VH-CDR3序列(SEQ ID NO:55)；和/或(b)所述VL包含KSSQSLLYSSNQKNYLA的VL-CDR1序列(SEQ IDNO:56)、WASTRES的VL-CDR2序列(SEQ ID NO:57)和QQYHSYPFT的VL-CDR3序列(SEQ ID NO:58)。在所述抗体或抗原结合片段的一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。另外地或可替代地，在一些实施方案中，抗体进一步包含任何同种型的Fc结构域，所述同种型例如但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制性例子包括：
人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:59)
人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:60)
人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:61)
人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:62)
人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:63)
人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:64)
人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:65)
人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:66)
人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:67)
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:59-66至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:67至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物与L1-CAM多肽的表位结合，所述表位包含L1-CAM的第2Ig样结构域(SEQ ID NO:74)的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在另一个方面，本公开文本提供了分离的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述分离的免疫球蛋白相关组合物包含以下的重链(HC)氨基酸序列：
或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含以下的轻链(LC)氨基酸序列：
GDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSG SGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR(SEQ ID NO:52)(huE72-BsAb轻链-huOKT3scFv)、或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13(huE71H1/L1)；SEQ ID NO:9和SEQID NO:14(huE71 H1/L2)；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(huE71 H2/L1)；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14(huE71
H2/L2)；SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:22(huE72 H1/L2)；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21(huE72H2/L1)；SEQ ID NO:18和SEQID NO:22(huE72 H2/L2)；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25(chE71IgG1)；SEQ ID NO:30和SEQID NO:29(chE72IgG1)；SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:41(chE71IgG4)；SEQ ID NO:46和SEQID NO:45(huE71IgG4)；SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(huE71 BsAb)；和SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72 BsAb)。
在所述免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任何一个中，所述HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列形成与L1-CAM多肽的表位结合的抗原结合位点，所述表位包含L1-CAM的第2Ig样结构域(SEQ ID NO:74)或L1-CAM的第6Ig样结构域(SEQ ID NO:75)的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在一些实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分。在其他实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方案中，抗体是全长抗体。
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种L1-CAM多肽特异性地结合。在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物以约10-3M、10-4M、10-5M、10- 6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(Kd)结合至少一种L1-CAM多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体包含人抗体框架区。
在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包括以下特征中的一种或多种：(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。在另一个方面，本文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的LC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的LC序列；和/或(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的HC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的HC序列。
在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
在一些方面，本文描述的抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，本技术的抗L1-CAM免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体)可以在CH2恒定重链区中含有缺失，以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。
在一个方面，本技术提供了编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的核酸序列。本文还公开了编码本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列选自SEQ ID NO:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。在另一个方面，本技术提供了宿主细胞，其表达编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的任何核酸序列。
本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗L1-CAM抗体)可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对一种或多种L1-CAM多肽的不同表位具有特异性，或者可以对一种或多种L1-CAM多肽以及对异源组合物(如异源多肽或固体支持物材料)两者均具有特异性。参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化的。
本技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在N-末端或C-末端与异源多肽重组融合，或者与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本技术的免疫球蛋白相关组合物可以在检测测定中与可用作标记的分子和效应分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或缀合。参见例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 0 396 387。
在本技术的免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施方案中，抗体或抗原结合片段可以任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。对于化学键或物理键，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与药剂上的官能团缔合。可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。
药剂上的官能团和免疫球蛋白相关组合物可以直接缔合。例如，药剂上的官能团(例如巯基基团)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如巯基基团)缔合以形成二硫键。可替代地，官能团可以通过交联剂(即，接头)缔合。交联剂的一些例子描述如下。交联剂可以附接至药剂或免疫球蛋白相关组合物。缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到彼此上存在的官能团数量的限制。例如，与缀合物缔合的药剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地，与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于药剂上存在的官能团的数量。
在又另一个实施方案中，缀合物包含与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施方案中，缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如缀合)的至少一种药剂。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，药剂上的官能团可以直接附接至免疫球蛋白相关组合物上的官能团。合适的官能团的一些例子包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。
也可以通过交联剂(如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等)将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的Pierce Biotechnology,Inc.获得。Pierce Biotechnology,Inc.网站可以提供帮助。另外的交联剂包括美国专利号5,580,990；5,985,566；和荷兰阿姆斯特丹Kreatech Biotechnology,B.V.的6,133,038中描述的铂交联剂。
可替代地，药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂通常用于交联相同的官能团。同双官能交联剂的例子包括EGS(即乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯])、DSS(即二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、DMA(即二甲基己二亚酰胺化物.2HCl)、DTSSP(即3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DPDPB(即1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即双马来酰亚胺己烷)。此类同双官能交联剂也可从Pierce Biotechnology,Inc.获得。
在其他情况下，从免疫球蛋白相关组合物切割药剂可能是有益的。上述PierceBiotechnology,Inc.的网站还可以为本领域技术人员在选择合适的交联剂方面提供帮助，所述交联剂可以通过例如细胞中的酶切割。因此，可以将药剂与免疫球蛋白相关组合物分离。可切割的接头的例子包括SMPT(即4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、LC-SPDP(即琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(例如磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸HCl)。
在另一个实施方案中，缀合物包含与至少一种与免疫球蛋白相关组合物物理键合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理键合。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将免疫球蛋白相关组合物和药剂混合。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关组合物和药剂放置在容器中，并通过例如摇动容器进行搅拌，以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。
免疫球蛋白相关组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，如上所述，可以通过交联剂或官能团来修饰免疫球蛋白相关组合物。
A.制备本技术的抗L1-CAM抗体的方法
总体概述。首先，选择可以产生针对其的本技术的抗体的靶多肽。例如，可以针对全长L1-CAM蛋白或针对包含六个Ig样结构域和五个纤连蛋白样结构域的L1-CAM蛋白的胞外结构域的一部分产生抗体(参见图1)。用于产生针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员熟知的。此类技术的例子包括但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠、杂交瘤等的技术。在本技术范围内的靶多肽包括源自L1-CAM蛋白的任何多肽，所述L1-CAM蛋白含有能够引发免疫应答的胞外结构域。实施例1、2和5中说明了对L1-CAM蛋白具有特异性的抗体的制备。
应当理解，针对L1-CAM蛋白及其片段的重组工程化抗体和抗体片段(例如抗体相关多肽)适合于根据本公开文本的用途。
可以经受本文所述技术的抗L1-CAM抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv)、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产量产生含抗体Fv的多肽例如Fab′和F(ab′)2抗体片段的方法。参见美国专利号5,648,237。
通常，抗体是从起源物种获得的。更特别地，获得了对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于产生本技术的抗体或抗体文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔子、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是可用于衍生本技术抗体的技术。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员熟知的。编码本技术的抗体的序列的表达可以在大肠杆菌中进行。
由于编码核酸的序列的简并性，编码与天然存在的蛋白质的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的其他序列可用于本技术的实践中。这些序列包括但不限于包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列在内的核酸序列，所述核酸序列通过编码序列中功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代而改变，从而产生沉默变化。应当理解，根据本技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容许如通过标准方法计算的高达25％的序列同源性变化(“CurrentMethods in Sequence Comparison and Analysis,”Macromolecule Sequencing andSynthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1998,Alan R.Liss,Inc.)，只要这种变体形成识别L1-CAM蛋白的有效抗体即可。例如，多肽序列中的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸充当功能等同物，从而导致沉默改变。序列中氨基酸的取代基可以选自所述氨基酸所属的类别的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本技术范围内还包括蛋白质或其片段或衍生物，所述蛋白质或其片段或衍生物在翻译过程中或翻译后，例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等进行不同的修饰。另外，编码免疫球蛋白的核酸序列可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或者在编码区产生变化和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的位点，以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域中已知的任何诱变技术，包括但不限于体外定点诱变(J.Biol.Chem.253:6551,use of Tab linkers(Pharmacia))等。
多克隆抗血清和免疫原的制备。产生本技术的抗体或抗体片段的方法通常包括用纯化的L1-CAM蛋白或其片段或用表达L1-CAM蛋白或其片段的细胞对受试者(通常是非人受试者，如小鼠或兔子)进行免疫。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的L1-CAM蛋白或化学合成的L1-CAM肽。使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可将L1-CAM蛋白的ECM或其部分或片段用作免疫原以产生与L1-CAM蛋白或其部分或片段结合的抗L1-CAM抗体。
全长L1-CAM蛋白或其片段可用作片段，作为免疫原。在一些实施方案中，L1-CAM片段包含氨基酸序列
(L1-CAM的Ig样C2型第2结构域)或
(L1-CAM的Ig样C2型第6结构域)的至少五至八个连续氨基酸残基，并且涵盖所述L1-CAM蛋白的表位，使得针对所述肽的抗体与L1-CAM蛋白形成特异性免疫复合物。
在一些实施方案中，与第2或第6Ig样结构域重叠的抗原性L1-CAM肽包含至少5、8、10、15、20或30个氨基酸残基。取决于用途和根据本领域技术人员熟知的方法，有时需要较长的抗原肽而不是较短的抗原肽。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
如果需要的话，可通过与半抗原(如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA))融合或缀合来提高L1-CAM蛋白(或其片段)的免疫原性。许多此类半抗原是本领域已知的。还可以将L1-CAM蛋白与常规佐剂(如弗氏完全或不完全佐剂)组合使用，以增强受试者对多肽的免疫反应。用于提高免疫应答的各种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人佐剂(如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))或类似的免疫刺激化合物。这些技术是本领域的标准技术。
在描述本技术时，免疫应答可以被描述为“初级”或“次级”免疫应答。初级免疫应答，也称为“保护性”免疫应答，是指由于对于特定抗原(例如L1-CAM蛋白)的某些初始暴露(例如，初始“免疫”)而在个体中产生的免疫应答。在一些实施方案中，可以通过用含有抗原的疫苗为个体接种疫苗来进行免疫。例如，疫苗可以是包含一种或多种L1-CAM蛋白衍生的抗原的L1-CAM疫苗。随着时间的推移，初级免疫应答可能会削弱或减弱，甚至可能消失或至少如此减弱以至于无法检测到。因此，本技术还涉及“次级”免疫应答，在此也称为“记忆免疫应答”。术语次级免疫应答指在已经产生初级免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。
因此，可以引发次级免疫应答，例如以增强已经削弱或减弱的现有免疫应答，或者重新产生已经消失或不再被检测到的先前的免疫应答。刺激或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。在刺激首次出现抗原时产生的记忆B细胞后发生次级或记忆体液应答。迟发型超敏反应(DTH)是CD4+T细胞介导的细胞次级或记忆免疫应答的类型。首次暴露于抗原启动免疫系统，另外的一次或多次暴露导致DTH。
适当的免疫后，可以从受试者的血清制备抗L1-CAM抗体。如果需要，可以从哺乳动物(例如从血液)分离针对L1-CAM蛋白的抗体分子，并通过熟知的技术如多肽A色谱进一步纯化以获得IgG级分。
单克隆抗体。在本技术的一个实施方案中，抗体是抗L1-CAM单克隆抗体。例如，在一些实施方案中，抗L1-CAM单克隆抗体可以是人或小鼠抗L1-CAM单克隆抗体。为了制备针对L1-CAM蛋白的单克隆抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler&Milstein,1975.Nature 256:495-497)；三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor等人,1983.Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可用于本技术的实践中，并可通过使用人杂交瘤(参见例如Cote等人,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030)或通过用EB病毒在体外转化人B细胞(参见例如Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)产生。例如，可以分离编码抗体区域的核酸群。将利用衍生自编码抗体保守区的序列的引物的PCR用于从所述群体扩增编码部分抗体的序列，然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段(如可变结构域)的DNA。此类扩增的序列也可以与编码其他蛋白质-例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白-的DNA融合，以在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后扩增的序列可以进行表达，并基于例如表达的抗体或其片段对存在于L1-CAM蛋白上的抗原或表位的亲和力来进一步进行选择或分离。可替代地，可以通过对受试者进行免疫并随后使用常规方法从受试者的脾脏分离杂交瘤来制备表达抗L1-CAM单克隆抗体的杂交瘤。参见例如Milstein等人,(Galfre和Milstein,Methods Enzymol(1981)73:3-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。可以使用如由杂交瘤表达的具有所需特性(例如，L1-CAM结合)的所选单克隆抗体，可以将其与分子(如聚乙二醇(PEG))结合以改变其特性，或者可将编码所述单克隆抗体的cDNA以各种方式进行分离、测序和操作。可以将合成的树型体(dendromeric)树添加到反应性氨基酸侧链例如赖氨酸，以增强L1-CAM蛋白的免疫原性特性。同样，CPG-二核苷酸技术可用于增强L1-CAM蛋白的免疫原性特性。其他操作包括在储存过程中或给予至受试者后促成抗体不稳定性的特定氨基酰基残基的取代或缺失，以及用于改善L1-CAM蛋白抗体的亲和力的亲和力成熟技术。
杂交瘤技术。在一些实施方案中，本技术的抗体是由杂交瘤产生的抗L1-CAM单克隆抗体，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，所述转基因非人动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的并且在以下文献中传授的那些：Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,349(1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681(1981)。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员熟知的。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生本技术的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗L1-CAM抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体粒子的表面上。通过直接用抗原(通常是结合或捕获到固体表面或珠粒上的抗原)选择，从库或组合抗体文库(例如人或鼠)选择具有所需结合特性的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的fd和M13，所述结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。此外，方法适合于Fab表达文库的构建(参见例如Huse等人,.Science 246:1275-1281,1989)，以快速有效地鉴定对L1-CAM多肽具有所需特异性的单克隆Fab片段，例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物。可用于制备本技术的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括以下文献中公开的那些：Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988；Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070,1990；Brinkman等人,J.Immunol.Methods 182:41-50,1995；Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994；Persic等人,Gene 187:9-18,1997；Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(Medical ResearchCouncil等人)；WO 97/08320(Morphosys)；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)；和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743。Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了用于通过经由二硫键附接多肽而在噬菌体粒子表面上展示多肽的方法。如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且将其用于产生完整抗体(包括人抗体)或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如，也可以使用本领域已知的方法，如WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques 12:864-869,1992；和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995；以及Better等人,Science 240:1041-1043,1988中公开的方法采用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术。
通常，可以针对适当抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒粒子的表面上。参见例如Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。然而，其他载体形式可用于此过程，如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(经修饰的T7或Lambda Zap系统)中进行选择和/或筛选。
重组抗L1-CAM抗体的表达。如上所述，可以通过应用重组DNA技术来产生本技术的抗体。编码本技术的抗L1-CAM抗体的重组多核苷酸构建体通常包括与抗L1-CAM抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，其包括天然相关或异源启动子区域。因此，本技术的另一方面包括含有编码本技术的抗L1-CAM抗体的一种或多种核酸序列的载体。为了重组表达本技术的一种或多种多肽，通过本领域中熟知和如下详述的重组DNA技术将含有编码抗L1-CAM抗体的核苷酸序列的全部或部分的核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即含有用于转录和翻译插入的多肽编码序列的必要元件的载体)中。Lerner等人的美国专利号6,291,160和6,680,192已经描述了用于产生多种载体群体的方法。
一般而言，可用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本公开文本中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本技术旨在包括在技术上不是质粒的、发挥同等功能的此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许受试者的感染并在该受试者中表达构建体。在一些实施方案中，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于高水平表达编码抗L1-CAM抗体的核苷酸序列以及收集和纯化抗L1-CAM抗体(例如交叉反应的抗L1-CAM抗体)的条件下。一般参见U.S.2002/0199213。这些表达载体典型地可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记物，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测那些用所需DNA序列转化的细胞。载体还可以编码可用于引导细胞外抗体片段的分泌的信号肽，例如果胶裂解酶。参见美国专利号5,576,195。
本技术的重组表达载体包含编码具有L1-CAM结合特性的蛋白质的核酸，所述核酸呈适合于所述核酸在宿主细胞中表达的形式，这意味着重组表达载体包括根据用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，所述一种或多种调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意指目的核苷酸序列以一种允许(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)核苷酸序列表达的方式与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel,GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等因素。可用作重组多肽(例如抗L1-CAM抗体)表达的启动子的典型调节序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子包括，尤其是来自醇脱氢酶、异细胞色素C、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。在一个实施方案中，编码本技术的抗L1-CAM抗体的多核苷酸与ara B启动子可操作地连接并且在宿主细胞中是可表达的。参见美国专利5,028,530。可以将本技术的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽(例如，抗L1-CAM抗体等)。
本技术的另一方面涉及表达抗L1-CAM抗体的宿主细胞，其含有编码一种或多种抗L1-CAM抗体的核酸。可以设计本技术的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达抗L1-CAM抗体。例如，抗L1-CAM抗体可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞(例如酵母、酵母细胞)或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)中进一步讨论。可替代地，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。先前已经描述了可用于经由表达随机产生的多核苷酸序列来制备并筛选具有预定特性的多肽(例如抗L1-CAM抗体)的方法。参见美国专利号5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。
多肽在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基末端。此类融合载体通常具有三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；以及(iii)通过充当亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A与靶重组多肽融合的pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,皮斯卡塔韦，新泽西州)。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)60-89)。Pack等人的美国专利号6,294,353；6,692,935已经描述了用于经由多肽融合来靶向组装不同活性肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法。一种最大化大肠杆菌中的重组多肽(例如抗L1-CAM抗体)表达的策略是在以蛋白水解方式切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达所述多肽。参见例如Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)119-128。另一种策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的各个密码子是表达宿主(例如大肠杆菌)中优先使用的密码子(参见例如Wada等人,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118)。本技术的核酸序列的这种改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，抗L1-CAM抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell 30:933-943,1982)、pJRY88(Schultz等人,Gene 54:113-123,1987)、pYES2(Invitrogen Corporation,圣地亚哥，加利福尼亚州)和picZ(Invitrogen Corp,圣地亚哥，加利福尼亚州)。可替代地，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达抗L1-CAM抗体。可用于在培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达多肽(例如抗L1-CAM抗体)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.Virology 170:31-39)。
在又另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达编码本技术的抗L1-CAM抗体的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括例如但不限于pCDM8(Seed,Nature 329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.6:187-195,1987)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于可用于表达本技术的抗L1-CAM抗体的原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989的第16和17章节。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型中的表达(例如组织特异性调节元件)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人,Genes Dev.1:268-277,1987)、淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.43:235-275,1988)、T细胞受体(Winoto和Baltimore,EMBO J.8:729-733,1989)和免疫球蛋白(Banerji等人,1983.Cell33:729-740；Queen和Baltimore,Cell 33:741-748,1983.)的启动子、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science 249:374-379,1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,Genes Dev.3:537-546,1989)。
本方法的另一方面涉及其中已引入本技术的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应当理解，此类术语不仅指特定的主题细胞，而且还指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，抗L1-CAM抗体可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是适合于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的宿主。参见Winnacker,From Genes To Clones,(VCHPublishers,NY,1987)。在本领域中已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白的合适的宿主细胞系，并且所述合适的宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，所述细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子，以及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。说明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,J Immunol.148:1149,1992。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在指用于将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、基因枪或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning)。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989)以及其他实验室手册。取决于细胞宿主的类型，可以通过熟知的方法将含有目的DNA区段的载体转移到宿主细胞中。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些组成部分，通常将编码可选择标记物(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。各种可选择标记物包括赋予对药物(如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的可选择标记物。可以将编码可选择标记物的核酸引入到宿主细胞中的与编码抗L1-CAM抗体的载体相同的载体上，或者可以引入到单独的载体上。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
包括本技术的抗L1-CAM抗体的宿主细胞(如培养中的原核或真核宿主细胞)可以用于产生(即表达)重组抗L1-CAM抗体。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(已向其中引入了编码抗L1-CAM抗体的重组表达载体)，从而产生抗L1-CAM抗体。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离抗L1-CAM抗体的步骤。一旦表达，就从培养基和宿主细胞纯化抗L1-CAM抗体，例如抗L1-CAM抗体或抗L1-CAM抗体相关多肽的收集物。可以根据本领域的标准程序(包括HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等)纯化抗L1-CAM抗体。在一个实施方案中，通过Boss等人的美国专利号4,816,397的方法在宿主生物体中产生抗L1-CAM抗体。通常，抗L1-CAM抗体链连同信号序列被表达，并因此被释放到培养基中。然而，如果抗L1-CAM抗体链不是由宿主细胞自然分泌的，则可以通过用温和的洗涤剂处理来释放抗L1-CAM抗体链。重组多肽的纯化是本领域熟知的，并且包括硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化技术、柱色谱、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982))。
可将编码抗L1-CAM抗体的多核苷酸例如编码抗L1-CAM抗体的序列掺入转基因中，以引入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的核转移到去核卵母细胞中。
单链抗体。在一个实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体是单链抗L1-CAM抗体。根据本技术，技术可适用于产生对L1-CAM蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如美国专利号4,946,778)。可用于产生本技术的单链Fv和抗体的技术的例子包括以下参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88,1991；Shu,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999,1993；和Skerra等人,Science240:1038-1040,1988。
嵌合和人源化抗体。在一个实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体是嵌合抗L1-CAM抗体。在一个实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体是人源化抗L1-CAM抗体。在本技术的一个实施方案中，供体抗体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得的CDR移植抗体称为“人源化”抗体。
包含人和非人部分的重组抗L1-CAM抗体(如嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体)可以使用标准重组DNA技术来制备，并且在本技术范围内。对于某些用途，包括本技术的抗L1-CAM抗体的体内用途以及这些药剂在体外检测测定中的用途，可以使用嵌合或人源化抗L1-CAM抗体。此类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。此类可用的方法包括例如但不限于以下参考文献中所述的方法：国际申请号PCT/US86/02269；美国专利号5,225,539；欧洲专利号184187；欧洲专利号171496；欧洲专利号173494；PCT国际专利号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；5,225,539；欧洲专利号125023；Better等人,1988.Science 240:1041-1043；Liu等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人,1987.J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987.CancerRes.47:999-1005；Wood等人,1985.Nature 314:446-449；Shaw等人,1988.J.Natl.CancerInst.80:1553-1559；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4:214；Jones等人,1986.Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988.Science 239:1534；Morrison,Science 229:1202,1985；Oi等人,BioTechniques 4:214,1986；Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989；美国专利号5,807,715；和Beidler等人,1988.J.Immunol.141:4053-4060。例如，可以使用多种技术将抗体人源化，所述技术包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；EP460167)、镶面或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；PadlanE.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991；Studnicka等人,Protein Engineering7:805-814,1994；Roguska等人,PNAS 91:969-973,1994)和链改组(美国专利号5,565,332)。在一个实施方案中，将编码鼠抗L1-CAM单克隆抗体的cDNA用特异性地选择用于去除编码Fc恒定区的序列的限制酶进行消化，并且编码人Fc恒定区的cDNA的相同部分被取代(参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人(1987)J Immunol 139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res 47:999-1005；Wood等人(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；美国专利号6,180,370；美国专利号6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422。
在一个实施方案中，本技术提供人源化抗L1-CAM抗体的构建，所述人源化抗L1-CAM抗体不太可能诱导人抗小鼠抗体(以下称为“HAMA”)应答，同时仍然具有有效的抗体效应子功能。如本文所用，关于抗体的术语“人”和“人源化”涉及预期在人受试者中引发治疗上可耐受的弱免疫原性应答的任何抗体。在一个实施方案中，本技术提供人源化抗L1-CAM抗体、重链和轻链免疫球蛋白。
CDR抗体。在一些实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体是抗L1-CAM CDR抗体。通常，用于产生抗L1-CAM CDR抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体；通常，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得的CDR移植抗体称为“人源化”抗体。移植物可以具有受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分)，或者可以具有VH和VL之一或两者内的多个CDR(或其部分)。通常，受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR都将被相应的供体CDR替代，但只需要尽可能多的替代，以使所得的CDR移植抗体与L1-CAM蛋白充分结合。用于产生CDR移植和人源化抗体的方法是通过以下参考文献传授的：Queen等人,美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；和Winter U.S.5,225,539；以及EP 0682040。可用于制备VH和VL多肽的方法是通过以下参考文献传授的：Winter等人,美国专利号4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；EP 0368684；EP 0451216；和EP0120694。
选择来自相同家族和/或相同家族成员的合适的框架区候选物后，重链和轻链可变区中的一个或两者都是通过将来自起源物种的CDR移植到杂合框架区中而产生的。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来完成关于以上任一方面的具有杂合可变链区的杂合抗体或杂合抗体片段的组装。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR来产生编码本文所述的杂合可变结构域(即，基于靶物种的框架和来自起源物种的CDR)的DNA序列。也可以使用合适的限制酶从起源物种抗体分离编码CDR区的核酸，并通过用合适的连接酶连接而连接到靶物种框架中。可替代地，可以通过定点诱变来改变起源物种抗体的可变链的框架区。
由于杂合体是从对应于每个框架区的多个候选物之间的选择构建的，因此存在适合于根据本文所述原理构建的许多序列组合。因此，可以组装杂合体的文库，其成员具有各个框架区的不同组合。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的物理集合。
此过程通常不会改变移植CDR侧翼的受体抗体的FR。然而，本领域技术人员有时可以通过替代给定FR的某些残基以使FR与供体抗体的相应FR更相似，来提高所得抗L1-CAMCDR移植抗体的抗原结合亲和力。合适的取代位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如US 5,585,089，尤其是第12-16栏)。或者本领域技术人员可以从供体FR开始并对其进行修饰以使其与受体FR或人共有FR更相似。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。特别是如果所得的FR符合该位置的人共有FR或者与这种共有FR至少90％或更多相同，则与具有完全人FR的相同抗体相比，这样做可能不会显著增加所得经修饰的抗L1-CAM CDR移植抗体的抗原性。
双特异性抗体(BsAb)。双特异性抗体是可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的抗体。BsAb可以例如通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂在其两个结合臂(一个VH/VL对)中的一个结合臂上结合一个抗原(或表位)，并在其第二臂(不同的VH/VL对)上结合不同的抗原(或表位)。通过此定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(特异性和CDR序列两者均不同)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。
本技术的双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)具有与例如L1-CAM特异性结合的至少一个臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一个其他臂。在一些实施方案中，第二靶抗原是B细胞、T细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞的抗原或表位。另外地或可替代地，在某些实施方案中，第二靶抗原选自CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46和KIR。在某些实施方案中，BsAb能够与在细胞表面上表达L1-CAM抗原的肿瘤细胞结合。在一些实施方案中，BsAb已经工程化为通过将细胞毒性T细胞引导(或募集)到肿瘤部位来促进杀死肿瘤细胞。其他示例性BsAb包括具有对L1-CAM具有特异性的第一抗原结合位点和对于小分子半抗原(例如DTP A、IMP288、DOTA、DOTA-Bn、DOTA去铁胺、本文所述的其他DOTA螯合物、生物素、荧光素或Goodwin,D A.等人,1994,Cancer Res.54(22):5937-5946中公开的那些)具有特异性的第二抗原结合位点的那些。
使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。例如，已经构建了BsAb，其利用完整的免疫球蛋白框架(例如IgG)、单链可变片段(scFv)或它们的组合。在一些实施方案中，双特异性融合蛋白是二价的，其包含例如具有针对一种抗原的单一结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段。在其他实施方案中，双特异性融合蛋白是四价的，其包含例如具有针对一种抗原的两个结合位点的免疫球蛋白(例如IgG)和针对第二抗原的两个相同scFv。由两个串联的scFv单元构成的BsAb已被证明是临床上成功的双特异性抗体形式。在一些实施方案中，BsAb包含两个串联的单链可变片段(scFv)，其被设计成使得结合肿瘤抗原(例如L1-CAM)的scFv连接至衔接T细胞的scFv(例如，通过结合CD3)。以这种方式，T细胞被募集到肿瘤部位，使得它们可以介导肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。参见例如Dreier等人,J.Immunol.170:4397-4402(2003)；Bargou等人,Science 321:974-977(2008))。
用于产生BsAb的最新方法包括工程化重组单克隆抗体，其具有另外的半胱氨酸残基，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型更牢固地交联。参见例如FitzGerald等人,Protein Eng.10(10):1221-1225(1997)。另一种方法是工程化重组融合蛋白，其连接具有所需的双重特异性的两种或更多种不同的单链抗体或抗体片段区段。参见例如Coloma等人,Nature Biotech.15:159-163(1997)。使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。
连接两种或更多种不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白以类似的方式产生。重组方法可用于产生多种融合蛋白。在一些特定的实施方案中，根据本技术的BsAb包含含有重链和轻链的免疫球蛋白以及scFv。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何L1-CAM免疫球蛋白的重链的C末端连接。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何L1-CAM免疫球蛋白的轻链的C末端连接。在各个实施方案中，scFv经由接头序列与重链或轻链连接。通过PCR反应，将重链Fd与scFv进行框内连接所必需的适当接头序列引入VL和Vκ结构域中。然后将编码scFv的DNA片段连接至含有编码CH1结构域的DNA序列的分期(staging)载体中。切下所得的scFv-CH1构建体，并将其连接至含有编码L1-CAM抗体的VH区的DNA序列的载体中。所得载体可用于转染合适的宿主细胞，如哺乳动物细胞，以表达双特异性融合蛋白。
在一些实施方案中，接头长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性的三维结构，而是为多肽提供柔性(例如，第一和/或第二抗原结合位点)。在一些实施方案中，基于赋予BsAb的特定的特性，例如稳定性增加，在本文所述的BsAb中采用接头。在一些实施方案中，本技术的BsAb包含G4S接头(SEQ ID NO:76)。在一些特定的实施方案中，本技术的BsAb包含(G4S)n接头，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多(SEQ ID NO:78)。
Fc修饰。在一些实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区(或亲本Fc区)的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对Fc受体(例如FcγR)的亲和力发生了改变，条件是基于Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析(如Sondermann等人,Nature,406:267-273(2000)所公开的那些)，所述变体Fc区在与Fc受体直接接触的位置上没有取代。与Fc受体(如FcγR)直接接触的Fc区内的位置的例子包括氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C7E环)和氨基酸327-332(F/G)环。
在一些实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体对激活和/或抑制性受体具有改变的亲和力，其中变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰是N297取代为丙氨酸或K322取代为丙氨酸。
糖基化修饰。在一些实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体具有含有与亲本Fc区相比的变体糖基化的Fc区。在一些实施方案中，变体糖基化包括不存在岩藻糖；在一些实施方案中，在GnT1缺乏的CHO细胞中表达导致变体糖基化。
在一些实施方案中，本技术的抗体可以具有相对于与目的抗原(例如L1-CAM)结合的适当参考抗体而言的经修饰的糖基化位点，而不改变抗体的功能性，例如与抗原的结合活性。如本文所用，“糖基化位点”包括抗体中与寡糖(即，含有连接在一起的两个或更多个单糖的碳水化合物)特异性和共价附接的任何特定氨基酸序列。
寡糖侧链通常经由N或O连接与抗体的骨架连接。N连接的糖基化指寡糖部分附接至天冬酰胺残基的侧链。O连接的糖基化指寡糖部分附接至羟基氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸。例如，缺乏某些寡糖(包括岩藻糖和末端N-乙酰葡糖胺)的Fc-糖型(huL1-CAM-IgGln)可以在特殊的CHO细胞中产生，并展现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施方案中，通过添加或缺失糖基化位点来修饰本文公开的免疫球蛋白相关组合物的碳水化合物含量。用于修饰抗体的碳水化合物含量的方法是本领域熟知的并且包括在本技术内，参见例如美国专利号6,218,149；EP 0359096B1；美国专利公开号US2002/0028486；国际专利申请公开WO03/035835；美国专利公开号2003/0115614；美国专利号6,218,149；美国专利号6,472,511；所有这些参考文献均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，通过缺失抗体的一个或多个内源性碳水化合物部分来修饰抗体的碳水化合物含量(或其相关部分或组分)。在一些特定的实施方案中，本技术包括通过将位置297的天冬酰胺修饰为丙氨酸来缺失抗体Fc区的糖基化位点。
工程化糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应子功能。工程化糖型可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，所述方法是例如通过使用工程化或变体表达菌株、通过与一种或多种酶(例如DI N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))共表达、通过在各种生物体或来自多种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子、或通过在已经表达包含Fc区的分子后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于以下参考文献中所述的那些：Umana等人,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol.Bioeng.74:288-294；Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:3466-3473；美国专利号6,602,684；美国专利申请序列号10/277,370；美国专利申请序列号10/113,929；国际专利申请公开WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO 02/311140A1；WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GLYCOMABTM糖基化工程化技术(GLYCARTbiotechnology AG,苏黎世，瑞士)；这些参考文献中的每一篇均通过引用以整体并入本文。参见例如国际专利申请公开WO 00/061739；美国专利申请公开号2003/0115614；Okazaki等人,2004,JMB,336:1239-49。
融合蛋白。在一个实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体是融合蛋白。当与第二蛋白质融合时，本技术的抗L1-CAM抗体可以用作抗原标签。可以与多肽融合的结构域的例子不仅包括异源信号序列，还包括其他异源功能区。融合不一定是直接的，而是可以通过接头序列进行。而且，本技术的融合蛋白也可以工程化以改善抗L1-CAM抗体的特征。例如，可以将另外的氨基酸(特别是带电氨基酸)的区域添加至抗L1-CAM抗体的N-末端以改善在从宿主细胞纯化或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加至抗L1-CAM抗体以促进纯化。可以在最终制备抗L1-CAM抗体之前去除此类区域。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟知和常规的技术。可以将本技术的抗L1-CAM抗体与标记序列(如促进融合多肽的纯化的肽)融合。在选择的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQID NO:79)，如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，查茨沃斯(Chatsworth)，加利福尼亚州)中提供的标签以及其他，其中许多是可商购的。如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中描述的，例如六组氨酸(SEQ ID NO:79)提供了方便的融合蛋白纯化。另一个可用于纯化的肽标签即“HA”标签对应于源自流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
因此，任何这些上述融合蛋白可以使用本技术的多核苷酸或多肽进行工程化。同样，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白显示增加的体内半衰期。
与单独的单体分泌的蛋白质或蛋白质片段相比，具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白可以更高效地结合和中和其他分子。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995。
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应案2045869)公开了融合蛋白，其包含免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一种人蛋白或其片段。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可以导致例如改善的药代动力学特性。参见EP-A 0232262。可替代地，可能需要在表达、检测和纯化融合蛋白后缺失或修饰Fc部分。例如，如果融合蛋白被用作免疫的抗原，则Fc部分可以妨碍治疗和诊断。在药物发现中，例如人蛋白(如hIL-5)已经与Fc部分融合，以用于高通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂的目的。Bennett等人,J.Molecular Recognition 8:52-58,1995；Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-9471,1995。
标记的抗L1-CAM抗体。在一个实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体与标记部分即可检测基团偶联。与抗L1-CAM抗体缀合的特定标记或可检测基团不是本技术的关键方面，只要它不显著干扰本技术的抗L1-CAM抗体与L1-CAM蛋白的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测物理或化学性质的任何材料。此类可检测的标记在免疫测定和成像领域已经得到了很好的发展。一般而言，可用于此类方法中的几乎任何标记都可以应用于本技术。因此，标记是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段检测的任何组合物。可用于本技术的实践中的标记包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、其他成像剂如微泡(用于超声成像)、18F、11C、15O(用于正电子发射断层成像)、99mTC、111In(用于单光子发射断层成像)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和量热标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。描述此类标记的用途的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241，其每一个均通过引用以其整体并且处于所有目的并入本文。也参见Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第6版,MolecularProbes,Inc.,Eugene OR.)。
可以根据本领域熟知的方法将标记直接或间接地与测定的所需组分偶联。如上所述，可以使用多种标记，其中根据诸如所需的灵敏度、与化合物缀合的简便性、稳定性要求、可用的仪器以及处置规定等因素选择标记。
非放射性标记通常通过间接方式附接。通常，配体分子(例如生物素)与所述分子共价结合。然后配体与抗配体(例如链霉抗生物素蛋白)分子结合，所述抗配体分子具有固有可检测性或与信号系统(如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。可使用许多配体和抗配体。当配体(例如生物素、甲状腺素和皮质醇)具有天然抗配体时，所述配体可与标记的天然存在的抗配体结合使用。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可与抗体例如抗L1-CAM抗体组合使用。
例如通过与酶或荧光团缀合，分子还可以与信号产生化合物直接缀合。作为标记的目的酶将主要是水解酶、特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或者是氧化还原酶、特别是过氧化物酶。可用作标记部分的荧光化合物包括但不限于例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基、伞形酮等。可用作标记部分的化学发光化合物包括但不限于例如荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。关于可以使用的各种标记或信号生产系统的综述，参见美国专利号4,391,904。
检测标记的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，在标记是放射性标记时，检测手段包括闪烁计数器或照相胶片，如在放射自显影中。如果标记是荧光标记，则它可以通过用适当波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光来检测。可以通过胶卷，使用电子检测器如电荷耦合设备(CCD)或光电倍增管等在视觉上检测荧光。类似地，可通过为酶提供适当底物并检测所得反应产物来检测酶标记。最后可通过观察与标记相关的颜色简单地检测简单的比色标记。因此，在各种油尺测定中，缀合的金经常呈现粉红色，而各种缀合的珠粒呈现珠粒的颜色。
一些测定形式不需要使用标记的组分。例如，凝集测定可用于检测靶抗体例如抗L1-CAM抗体的存在。在这种情况下，通过包含靶抗体的样品将抗原包被的颗粒凝集。以这种形式，不需要标记任何组分，并且可以通过简单的视觉检查来检测靶抗体的存在。
B.鉴定并表征本技术的抗L1-CAM抗体
鉴定和/或筛选本技术的抗L1-CAM抗体的方法。用于鉴定和筛选针对L1-CAM多肽的抗体中具有所需的对L1-CAM蛋白的特异性的抗体的方法包括本领域中已知的任何免疫介导的技术。可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法在体外检测免疫应答的组分。例如，(1)细胞毒性T淋巴细胞可与放射性标记的靶细胞一起孵育，并通过放射性的释放来检测这些靶细胞的裂解；(2)可以将辅助T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞一起孵育，并通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,Immunity,2:373-80,1995)；(3)可以将抗原呈递细胞与全蛋白抗原一起孵育，并通过T淋巴细胞激活测定或生物物理学方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989)；(4)可以将肥大细胞与试剂(交联其Fc-ε受体)一起孵育并通过酶免疫测定来测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983)；(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地，也可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法来检测模型生物体(例如小鼠)或人受试者中免疫应答的产物。例如，(1)可以通过目前用于临床实验室中的标准方法例如ELISA容易地检测响应于疫苗接种的抗体的产生；(2)可以通过划伤皮肤表面并放置无菌容器以将迁移细胞捕获到划痕部位来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；(3)可以使用3H-胸苷测量响应于有丝分裂原或混合淋巴细胞反应的外周血单核细胞(PBMC)的增殖；(4)PBMC中的粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞的吞噬能力可通过将PBMC与标记的颗粒一起置于孔中来测量(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；和(5)可以通过用针对CD分子(如CD4和CD8)的抗体标记PBMC并测量表达这些标记物的PBMC的分数来测量免疫系统细胞的分化。
在一个实施方案中，利用L1-CAM肽在可复制的遗传包装的表面上的展示来选择本技术的抗L1-CAM抗体。参见例如美国专利号5,514,548；5,837,500；5,871,907；5,885,793；5,969,108；6,225,447；6,291,650；6,492,160；EP 585 287；EP 605522；EP 616640；EP1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844 306。已经描述了可用于产生/选择丝状噬菌体粒子的方法，所述丝状噬菌体粒子含有编码具有所需特异性的结合分子的噬菌粒基因组。参见例如EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US 6492160。
在一些实施方案中，利用L1-CAM肽在酵母宿主细胞的表面上的展示来选择本技术的抗L1-CAM抗体。可用于通过酵母表面展示分离scFv多肽的方法已经由Kieke等人,Protein Eng.1997Nov；10(11):1303-10描述。
在一些实施方案中，使用核糖体展示选择本技术的抗L1-CAM抗体。可用于使用核糖体展示鉴定肽中配体的方法已经由Mattheakis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-26,1994；和Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-42,1997描述。
在某些实施方案中，使用L1-CAM肽的tRNA展示来选择本技术的抗L1-CAM抗体。可用于使用tRNA展示进行配体的体外选择的方法已经由Merryman等人,Chem.Biol.,9:741-46,2002描述。
在一个实施方案中，使用RNA展示选择本技术的抗L1-CAM抗体。可用于使用RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Roberts等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-302,1997；和Nemoto等人,FEBS Lett.,414:405-8,1997描述。可用于使用非天然RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Frankel等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,13:506-12,2003描述。
在一些实施方案中，本技术的抗L1-CAM抗体在革兰氏阴性细菌的周质中表达，并与标记的L1-CAM蛋白混合。参见WO 02/34886。在表达对L1-CAM蛋白具有亲和力的重组多肽的克隆中，与抗L1-CAM抗体结合的标记的L1-CAM蛋白的浓度增加，并且允许细胞从文库的其余部分分离，如在Harvey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.22:9193-98 2004和美国专利公开号2004/0058403中所述。
在选择所需的抗L1-CAM抗体之后，预期可以通过本领域技术人员已知的任何技术(例如原核或真核细胞表达等)大量生产所述抗体。可以通过使用常规技术构建表达载体来产生抗L1-CAM抗体(它们是例如但不限于抗L1-CAM杂合抗体或片段)，所述表达载体编码抗体重链，在所述抗体重链中保留原始物种抗体结合特异性所需的CDR以及如果需要的话可变区框架的最小部分(如根据本文所述技术工程化的)源自起源物种抗体，而抗体的其余部分源自靶物种免疫球蛋白，所述靶物种免疫球蛋白可以如本文所述进行操作，从而产生用于表达杂合抗体重链的载体。
L1-CAM结合的测量。在一些实施方案中，L1-CAM结合测定指一种测定形式，其中L1-CAM蛋白和抗L1-CAM抗体在适合于L1-CAM蛋白与抗L1-CAM抗体之间结合和评估L1-CAM蛋白与抗L1-CAM抗体之间的结合量的条件下混合。将结合量与合适的对照进行比较，所述对照可以是在不存在L1-CAM蛋白的情况下的结合量、在存在非特异性免疫球蛋白组合物的情况下的结合量或两者。结合量可以通过任何合适的方法来评估。结合测定法包括例如ELISA、放射免疫测定、临近闪烁测定、荧光能量转移测定、液相色谱、膜过滤测定等。用于直接测量与抗L1-CAM抗体结合的L1-CAM蛋白的生物物理学测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子体共振(BIACORE芯片)等。通过本领域已知的标准测定来测定特异性结合，所述标准测定是例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱法等。如果候选抗L1-CAM抗体的特异性结合比在不存在候选抗L1-CAM抗体的情况下观察到的结合高至少1％，则所述候选抗L1-CAM抗体可用作抗本技术的抗L1-CAM抗体。
L1-CAM中和的测量。如本文所用，“L1-CAM中和”指通过抗L1-CAM抗体的结合降低L1-CAM蛋白的活性和/或表达。可以使用本领域已知的方法在体外或体内评估本技术的抗L1-CAM抗体中和L1-CAM活性/表达的能力。本技术的抗L1-CAM抗体的用途
概述。本技术的抗L1-CAM抗体可用于与L1-CAM蛋白的定位和/或定量有关(例如，用于测量适当的生理样品中L1-CAM蛋白的水平、用于诊断方法、用于多肽成像等)的本领域已知的方法中。本技术的抗体可用于通过标准技术如亲和色谱或免疫沉淀来分离L1-CAM蛋白。本技术的抗L1-CAM抗体可以促进天然免疫反应性L1-CAM蛋白从生物样品例如哺乳动物血清或细胞的纯化，以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性L1-CAM蛋白的纯化。此外，抗L1-CAM抗体可用于检测免疫反应性L1-CAM蛋白(例如，在血浆、细胞裂解液或细胞上清液中)以评价免疫反应性多肽的表达丰度和模式。本技术的抗L1-CAM抗体可以作为临床测试程序的一部分在诊断上用于监测组织中的免疫反应性L1-CAM蛋白水平，例如以确定给定治疗方案的功效。如上所述，可以通过将本技术的抗L1-CAM抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来促进检测。
检测L1-CAM蛋白。用于检测生物样品中是否存在免疫反应性L1-CAM蛋白的示例性方法涉及从测试受试者获得生物样品，并使所述生物样品与本技术的能够检测免疫反应性L1-CAM蛋白的抗L1-CAM抗体接触，从而检测生物样品中免疫反应性L1-CAM蛋白的存在。可以通过附接于抗体的可检测标记来完成检测。
关于抗L1-CAM抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与抗体偶联(即物理连接)来直接标记抗体，以及通过与直接标记的另一化合物(如二抗)的反应性来间接标记抗体。间接标记的例子包括使用荧光标记的二抗检测一抗以及用生物素对DNA探针进行末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。
在一些实施方案中，将本文公开的抗L1-CAM抗体与一个或多个可检测标记缀合。对于此类用途，抗L1-CAM抗体可以通过发色剂、酶剂、放射性同位素剂、同位素剂、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂或其他标记的共价或非共价附接来可检测地标记。
合适的发色标记的例子包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。合适的酶标记的例子包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的例子包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是使用体内成像时的示例性同位素，因为它避免了125I或131I标记的L1-CAM结合抗体被肝脏脱卤的问题。此外，此同位素对于成像具有更有利的伽马发射能(Perkins等人,Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等人,J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，与具有1-(对-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织(特别是肝脏)中展现出很少的吸收，并增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。合适的非放射性同位素标记的例子包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的例子包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸盐标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝素标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的例子包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的例子包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯(acridiniumester)标记、咪唑标记、吖啶盐(acridinium salt)标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的例子包括重金属核，如Gd、Mn和铁。
本技术的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物样品中的免疫反应性L1-CAM蛋白。用于检测免疫反应性L1-CAM蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性L1-CAM蛋白的体内技术包括将标记的抗L1-CAM抗体引入受试者中。例如，可以用放射性标记物标记抗L1-CAM抗体，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。在一个实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的L1-CAM蛋白分子。
免疫测定和成像。使用基于抗体的技术，本技术的抗L1-CAM抗体可用于测定生物样品(例如人血浆)中的免疫反应性L1-CAM蛋白水平。例如，可以用经典的免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记(如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素或其他放射性剂(如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))和荧光标记(如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP))以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性L1-CAM蛋白水平外，本技术的抗L1-CAM抗体也可用于L1-CAM的体内成像。可用于此方法的抗体包括可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的抗体。对于X射线照相术，合适的标记包括放射性同位素，如钡或铯，它们发射出可检测的辐射，但对受试者没有明显的伤害。适用于NMR和ESR的标记物包括具有可检测特征性自旋的标记，如氘，其可以通过标记用于相关scFv克隆的营养素而掺入抗L1-CAM抗体中。
将已用适当的可检测成像部分(如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或通过核磁共振可检测的材料)标记的抗L1-CAM抗体引入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)受试者中。在本领域中将理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者，所注射的放射性的量通常在约5至20毫居里99mTc的范围内。然后，标记的抗L1-CAM抗体将积聚在含有特定靶多肽的细胞位置。例如，本技术的经标记的抗L1-CAM抗体将积聚在受试者体内已定位有L1-CAM蛋白的细胞和组织中。
因此，本技术提供了一种医学病症的诊断方法，其涉及：(a)通过测量本技术的抗L1-CAM抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性L1-CAM蛋白的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性L1-CAM蛋白的量与标准参照物进行比较，其中与标准品相比免疫反应性L1-CAM蛋白水平的升高或降低指示医学病症。
亲和纯化。本技术的抗L1-CAM抗体可以用于从样品纯化免疫反应性L1-CAM蛋白。在一些实施方案中，将抗体固定在固体支持物上。此类固体支持物的例子包括塑料(如聚碳酸酯)、复合碳水化合物(如琼脂糖和琼脂糖)、丙烯酸树脂以及如聚丙烯酰胺和乳胶珠粒。使抗体与此类固体支持物偶联的技术是本领域熟知的(Weir等人,“Handbook ofExperimental Immunology”第4版,Blackwell Scientific Publications,Oxford,England,Chapter 10(1986)；Jacoby等人,Meth.Enzym.34Academic Press,N.Y.(1974))。
将抗原与抗体支持基质结合的最简单方法是将珠粒收集在柱子中，并将抗原溶液沿着柱子向下传递。此方法的效率取决于固定化抗体与抗原之间的接触时间，可以通过使用低流速来延长接触时间。固定化抗体在抗原流过时捕获抗原。可替代地，可以通过以下方式使抗原与抗体支持物基质接触：将抗原溶液与支持物(例如，珠粒)混合并旋转或摇动浆料，从而使抗原与固定化抗体之间的接触最大化。结合反应完成后，将浆料传递至柱子中以收集珠粒。使用合适的洗涤缓冲液洗涤珠粒，然后洗脱纯或基本上纯的抗原。
可以将目的抗体或多肽与固体支持物(如珠粒)缀合。另外，如果需要的话，也可以通过任何合适的手段(包括本文公开的用于将多肽与支持物缀合的手段)将第一固体支持物如珠粒与第二固体支持物缀合，所述第二固体支持物可以是第二珠粒或其他支持物。因此，本文公开的关于多肽与固体支持物的缀合的任何缀合方法和手段也可以用于将第一支持物与第二支持物缀合，其中第一和第二固体支持物可以相同或不同。
用于将多肽与固体支持物缀合的合适的接头(可以是交联剂)包括可以与支持物表面上存在的官能团或与多肽或两者都反应的多种药剂。可用作交联剂的试剂包括均双官能试剂，以及特别是杂双官能试剂。有用的双官能交联剂包括但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以提供多肽与固体支持物之间的选择性可切割键。例如，可以使用光不稳定的交联剂如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸，作为从固体支持物切割多肽的手段。(Brown等人,Mol.Divers,第4-12页(1995)；Rothschild等人,Nucl.Acids Res.,24:351-66(1996)；和美国专利号5,643,722)。其他交联试剂是本领域熟知的。(参见例如Wong(1991)，同上；和Hermanson(1996)，同上)。
可以通过在羧基官能化的珠粒与多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键，或者相反地通过在氨基官能化的珠粒与多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键，将抗体或多肽固定在固体支持物(如珠粒)上。另外，双官能的三苯甲基接头可以经由氨基树脂通过树脂上的氨基或羧基附接于支持物，例如附接于树脂(如Wang树脂)上的4-硝基苯基活性酯。使用双官能三苯甲基方法时，固体支持物可能需要使用挥发酸(如甲酸或三氟乙酸)进行处理，以确保多肽被切割并能够被去除。在这种情况下，多肽能够作为无珠粒的碎块沉积在固体支持物的孔底部或沉积在固体支持物的平坦表面上。添加基质溶液后，可将多肽解吸到MS中。
通过使用挥发酸或适当的基质溶液(例如含有3-HPA的基质溶液)从多肽切割氨基连接的三苯甲基，疏水性三苯甲基接头也可以用作酸不稳定的接头。酸不稳定性也可以改变。例如，可以将三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基改为多肽的适当的对位取代的或更加呈酸不稳定的三苯甲胺衍生物，即可以将三苯甲基醚和三苯甲基胺与多肽键合。因此，可以例如通过在基质如3-HPA用作酸的酸性条件下(包括如果需要的话，在典型的MS条件下)，通过破坏疏水引力或通过切割三苯甲基醚或三苯甲胺键从疏水性接头去除多肽。
正交可切割的接头也可用于将第一固体支持物(例如珠粒)与第二固体支持物结合，或可用于将目的多肽与固体支持物结合。使用此类接头，可以从第二固体支持物选择性地切割第一固体支持物(例如珠粒)，而无需从支持物切割多肽；然后可以稍后从珠粒切割多肽。例如，可以用还原剂如DTT切割的二硫键接头可以用于将珠粒与第二固体支持物结合，并且可以将酸可切割的双官能三苯甲基用于将多肽固定至所述支持物。根据需要，可以首先切割多肽与固体支持物的连接，例如，保持第一与第二支持物之间的连接完整。三苯甲基接头可以提供共价或疏水性缀合，并且无论缀合的性质如何，三苯甲基在酸性条件下均易于切割。
例如，珠粒可以通过连接基团与第二支持物结合，可以选择具有以下长度和化学性质的连接基团，所述长度和化学性质使得促进了珠粒与固体支持物的高密度结合或多肽与珠粒的高密度结合。这种连接基团可以具有例如“树状”结构，从而在固体支持物上的每个附接位点提供多种官能团。这种连接基团的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、penta-erythrole和三羟基氨基甲烷。
非共价结合缔合。通过非共价相互作用，抗体或多肽可以与固体支持物缀合，或第一固体支持物也可以与第二固体支持物缀合。例如，能够被磁化的由铁磁材料制成的磁性珠粒可以被吸引至磁性固体支持物，并且可以通过移除磁场而从支持物释放。可替代地，固体支持物可以具有离子或疏水性部分，这可以允许离子或疏水性部分分别与多肽(例如含有附接的三苯甲基的多肽)或与具有疏水性特征的第二固体支持物相互作用。
固体支持物也可以与特异性结合对的成员一起提供，因此可以与含有互补结合部分的多肽或第二固体支持物缀合。例如，用抗生物素蛋白或用链霉亲和素包被的珠粒可以与其中掺入生物素部分的多肽结合，或者与用生物素或生物素衍生物(如亚氨基生物素)包被的第二固体支持物结合。
应当认识到，本文公开的或本领域已知的任何结合成员都可以颠倒。因此，对应地，例如可以将生物素掺入多肽或固体支持物中，以及相反地，可以将抗生物素蛋白或其他生物素结合部分掺入支持物或多肽中。预期用于本文的其他特异性结合对包括但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及其特异性相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其他此类对。
A.本技术的抗L1-CAM抗体的诊断用途
概述。本技术的抗L1-CAM抗体可用于诊断方法。因此，本技术提供了使用所述抗体诊断受试者中的L1-CAM活性的方法。可以选择这样的本技术的抗L1-CAM抗体，使得它们具有任何水平的表位结合特异性和对L1-CAM蛋白的非常高的结合亲和力。一般而言，抗体的结合亲和力越高，就可以在免疫测定中执行更严格的洗涤条件以去除非特异性结合的材料而不去除靶多肽。因此，可用于诊断测定的本技术的抗L1-CAM抗体通常具有约108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的结合亲和力。此外，期望用作诊断试剂的抗L1-CAM抗体具有足够的动力学缔合速率，以在标准条件下在至少12h、至少五(5)h或至少一(1)小时内达到平衡。
抗L1-CAM抗体可用于在多种标准测定形式中检测免疫反应性L1-CAM蛋白。此类形式包括免疫沉淀、Western印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测量测定。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications,纽约,1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074,3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。可以从受试者的任何组织或体液获得生物样品。在某些实施方案中，受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施方案中，癌症的早期阶段是通过从受试者获得的样品中L1-CAM蛋白的水平或表达方式来确定的。在某些实施方案中，样品选自尿、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检身体组织。
免疫测量测定或夹心测定是本技术诊断方法的一种形式。参见美国专利号4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375。此类测定使用一种固定至固相的抗体(例如抗L1-CAM抗体或抗L1-CAM抗体群体)以及在溶液中的另一种抗L1-CAM抗体或抗L1-CAM抗体群体。通常，溶液抗L1-CAM抗体或抗L1-CAM抗体群体被标记。如果使用抗体群体，则所述群体可以含有针对靶多肽内不同表位特异性而结合的抗体。因此，相同的群体既可用于固相抗体又可用于溶液抗体。如果使用抗L1-CAM单克隆抗体，则将具有不同结合特异性的第一和第二L1-CAM单克隆抗体用于固相和溶液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体能够以任何顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则所述测定称为正向测定。相反，如果首先接触溶液抗体，则所述测定称为反向测定。如果靶标同时与两种抗体接触，则所述测定称为同时测定。使L1-CAM蛋白与抗L1-CAM抗体接触后，将样品孵育一段时间，通常从约10分钟到约24小时不等，并且通常为约1小时。然后执行洗涤步骤以去除样品中未与用作诊断试剂的抗L1-CAM抗体特异性结合的组分。当固相抗体和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在任一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤后，对结合进行定量，通常是通过检测经由标记的溶液抗体的结合而与固相连接的标记来进行。通常对于给定的抗体对或抗体群体和给定的反应条件，从含有已知浓度的靶抗原的样品制作校准曲线。然后通过从校准曲线(即标准曲线)内插来读取正在测试的样品中免疫反应性L1-CAM蛋白的浓度。可以从平衡时结合的标记溶液抗体的量或通过在达到平衡之前在一系列时间点对结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量分析物。这种曲线的斜率是样品中L1-CAM蛋白浓度的量度。
用于上述方法的合适支持物包括例如硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生化尼龙膜，并且还包括颗粒，如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、量油尺、微粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech,皮斯卡塔韦，新泽西州)等。固定可以是通过吸收或通过共价附接。任选地，抗L1-CAM抗体可以与接头分子(如生物素)连接，以附接于表面结合的接头(如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，本公开文本提供了与诊断剂缀合的本技术的抗L1-CAM抗体。诊断剂可以包含放射性或非放射性标记、造影剂(如对于磁共振成像、计算机断层摄影术或超声)，并且放射性标记可以是γ、β、α、俄歇电子或正电子发射同位素。诊断剂是与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段缀合给予的分子，并且可用于通过定位含有抗原的细胞诊断或检测疾病。
有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如采用生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁性离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，诊断剂选自放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了使抗体组分负载放射性金属或顺磁性离子，可能需要使其与具有长尾部的试剂发生反应，所述长尾部附接有多种用于结合离子的螯合基团。这种尾部可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化或可衍生的链，所述聚合物具有可与螯合基团结合的侧基，所述螯合基团是例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。螯合物可以使用标准化学方法与本技术的抗体偶联。螯合物通常通过如下基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的情况下与分子形成键。用于将螯合物与抗体缀合的其他方法和试剂公开在美国专利号4,824,659中。特别有用的金属螯合物组合包括与用于放射成像的诊断性同位素一起使用的2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物。在与非放射性金属(如锰、铁和钆)复合时的相同螯合物与本技术的L1-CAM抗体一起使用时可用于MRI。大环螯合物如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N′,N″-三乙酸)、DOTA和TETA(对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)可与多种金属和放射性金属(分别如镓、钇和铜的放射性核素)一起使用。可以通过使环的大小适合目的金属来稳定此类金属螯合复合物。其他DOTA螯合物的例子包括(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2 ； (ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2 ； (iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2 ； (iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 ； (v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 ； (vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 ； (vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 ； (viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2 ； (ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2 ； (x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2 ； (xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 ； (xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 ； (xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 ； (xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；和(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
还考虑了对于稳定结合核素(如用于RAIT的223Ra)感兴趣的其他环型螯合物，如大环聚醚。
B.本技术的抗L1-CAM抗体的治疗用途
本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)可用于治疗L1-CAM相关癌症。这种治疗可以用于被鉴定为具有病理上高水平的L1-CAM的患者(例如，通过本文所述的方法诊断的患者)或被诊断为已知与这种病理水平相关的疾病的患者。在一个方面，本公开文本提供了一种用于在有需要的受试者中治疗L1-CAM相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的本技术的抗体(或其抗原结合片段)。可通过本技术的抗体治疗的癌症的例子包括但不限于：白血病、尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、NSCLC、胰腺导管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、胆管癌、类癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、嗜铬细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症、胰腺腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、肿瘤血管、软骨肉瘤、食管腺癌、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、肾上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、毛细血管瘤、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、颌下唾液腺癌和头颈部鳞状细胞癌。
本技术的组合物可以与可用于治疗L1-CAM相关癌症的其他治疗剂结合使用。例如，可以将本技术的抗体与选自以下的至少一种另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂和靶向生物治疗剂(例如，US 6306832、WO2012007137、WO2005000889、WO 2010096603等中描述的治疗肽)。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。特定化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、托泊替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素(例如柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin))、贝伐单抗、奥沙利铂、美法仑、依托泊苷、氮芥、博来霉素、微管毒药、番荔枝内酯或其组合。
本技术的组合物可以任选地以单次推注的形式给予至有需要的受试者。可替代地，给药方案可以包括在肿瘤出现后的不同时间多次给予。
给予可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、鞘内或局部。给予包括自给予和由另一个人给予。还应理解，如本文所述的医学病症的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗，并且其中获得了一些生物学或医学有关的结果。
在一些实施方案中，本技术的抗体包含药物配制品，可以将所述药物配制品以一种或多种剂量给予至有需要的受试者。可以调整剂量方案以提供所需反应(例如，治疗反应)。
通常，足以实现治疗效果的本技术的抗体组合物的有效量在每天每公斤体重约0.000001mg至每天每公斤体重约10,000mg的范围内。通常，剂量范围为每天每公斤体重约0.0001mg至每天每公斤体重约100mg。对于给予抗L1-CAM抗体，剂量范围为每周、每两周或每三周0.0001至100mg/kg受试者体重，并且更通常为0.01至5mg/kg受试者体重。例如，剂量可以是每周、每两周或每三周1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，抗体的单次剂量范围为每公斤体重0.1-10,000微克。在一个实施方案中，载体中的抗体浓度范围为0.2至2000微克/递送毫升。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次给予。可以在多个时机给予抗L1-CAM抗体。单个剂量之间的间隔可以是每小时、每日、每周、每月或每年。如通过测量受试者中抗体的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以使受试者中的血清抗体浓度达到约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、约125μg/mL至约175μg/mL或约150μg/mL至约200μg/mL。可替代地，抗L1-CAM抗体可以作为持续释放配制品给予，在这种情况下需要不太频繁的给予。剂量和频率根据受试者中抗体的半衰期而变化。给予的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，以相对不频繁的间隔长时间给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要间隔相对短的相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，或直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者给予预防性方案。
在另一个方面，本公开文本提供了一种用于在体内检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗体(或其抗原结合片段)，其中所述抗体被配置为定位于表达L1-CAM的肿瘤，并用放射性同位素标记；和(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。在一些实施方案中，参考值表示为每克注射剂量(％ID/g)。参考值可通过如下方法来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准偏差。在一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。可以使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的本技术的抗体。在一些实施方案中，所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇(Auger)发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。俄歇发射体的例子包括111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl和203Pb。在所述方法的一些实施方案中，正常组织中非特异性FcR依赖性结合消除或减少(例如，经由Fc区中的N297A突变，其导致去糖基化)。可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来测定这种免疫缀合物的治疗效果。在一些实施方案中，免疫缀合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
毒性。最佳地，本文描述的抗L1-CAM抗体的有效量(例如剂量)将提供治疗益处，而不会引起对受试者的实质性毒性。本文所述的抗L1-CAM抗体的毒性可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来确定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制定对人无毒的剂量范围。本文所述的抗L1-CAM抗体的剂量在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很小或没有毒性的有效剂量。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的给予途径而在这个范围内变化。给予的确切配制品、途径和剂量可由各个医师根据受试者的病症来选择。参见例如Fingl等人,In:The PharmacologicalBasis of Therapeutics,第1章(1975)。
药物组合物的配制品。根据本技术的方法，可以将抗L1-CAM抗体掺入适合于给予的药物组合物中。药物组合物通常包含重组或基本上纯化的抗体和药学上可接受的载体，呈适合于给予至受试者的形式。药学上可接受的载体部分取决于所给予的特定组合物，以及取决于用于给予所述组合物的特定方法。因此，存在用于给予抗体组合物的药物组合物的多种合适配制品(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,PA第18版,1990)。通常将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体，当它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可以互换使用，并表示所述材料能够在没有产生一定程度(所述程度将禁止组合物的给予)上的不希望的生理效应的情况下给予至受试者或给予至受试者上。例如，“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常是安全、无毒并且期望的药物组合物的赋形剂，并且包括对于兽用以及人药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有所需药理特性的盐和酯。此类盐包括可在存在于组合物中的酸性质子能够与无机或有机碱反应时形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属例如钠和钾、镁、钙和铝形成的盐。合适的有机盐包括与有机碱形成的有机盐，所述有机碱如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。此类盐还包括与无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃磺酸和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由抗L1-CAM抗体中存在的羧基、磺酰氧基和膦酸氧基形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或者二盐或酯；并且类似地，当存在多于两个酸性基团时，此类基团中的一些或全部可以被盐化或酯化。以此技术命名的抗L1-CAM抗体可以按未盐化或未酯化形式存在，或以盐化和/或酯化形式存在，并且这种抗L1-CAM抗体的命名旨在包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。另外，本技术的某些实施方案可以按多于一种立体异构体形式存在，并且这种抗L1-CAM抗体的命名旨在包括所有单一的立体异构体以及此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其他形式)。本领域普通技术人员不难确定本技术的特定药物和组合物的给予的适当时间安排、顺序和剂量。
此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如固定油。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或化合物与抗L1-CAM抗体不相容，否则考虑其在组合物中的使用。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。
配制本技术的药物组合物以与其预期的给予途径相容。本技术的抗L1-CAM抗体组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、透皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内；或肌肉内途径，或者作为吸入剂给予。可以将抗L1-CAM抗体任选地与在治疗各种L1-CAM相关癌症方面至少部分有效的其他药物组合给予。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)，以及用于调节张力的化合物(如氯化钠或右旋糖)。可用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，希望在组合物中包含等渗化合物，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的化合物例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将本技术的抗L1-CAM抗体以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将所述抗L1-CAM抗体掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。本技术的抗体可以按积存注射剂或植入制剂的形式给予，可以将所述注射剂或植入制剂积存以允许活性成分持续或脉冲释放的这种方式配制。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装于明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性给予的目的，可以将抗L1-CAM抗体与赋形剂掺杂在一起，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体来制备以用作漱口剂，其中流体载体中的化合物经口施用并漱口，并且吐出或吞下。药学上相容的结合化合物和/或辅助材料可以作为组合物的一部分被包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解性化合物，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；甜味化合物，如蔗糖或糖精；或调味化合物，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入给予，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送抗L1-CAM抗体。
全身性给予也可以是通过经粘膜或透皮方式。对于经粘膜或透皮给予，在配制品中使用适合待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如就经粘膜给药而言，洗涤剂、胆盐、以及梭链孢酸衍生物。经粘膜给予可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮给予，将抗L1-CAM抗体配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
也可以将抗L1-CAM抗体制备为呈栓剂(例如，与常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送的药物组合物。
在一个实施方案中，抗L1-CAM抗体是与载体一起制备的，所述载体如控释配制品将保护抗L1-CAM抗体免于从身体迅速清除，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品的制备方法对本领域技术人员而言是清楚的。所述材料也可以从AlzaCorporation and Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据例如在美国专利号4,522,811中所述的本领域技术人员已知的方法来制备。
C.试剂盒
本技术提供用于检测和/或治疗L1-CAM相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能性变体(例如，取代变体)。任选地，将本技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并进行标记以用于L1-CAM相关癌症的诊断和/或治疗。上述组分可以作为水溶液(优选无菌溶液)或作为冻干(优选无菌)配制品的形式储存在单元剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中以供重构。试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器容纳有适合于将药物组合物稀释至更大体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，试剂盒可以包含用于稀释药物组合物的说明书和/或用于给予药物组合物的说明书，无论是否稀释。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成，并且可以具有无菌的进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或带有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以进一步包含更多容器，所述容器含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。从商业和用户的角度来看，它还可以包含其他材料，包括用于一种或多种合适宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、培养基。试剂盒可以任选地包含说明书，其通常包含在治疗或诊断产品的商业包装中，所述说明书包含关于例如使用此类治疗或诊断产品的适应症、用法、剂量、制造、给药、禁忌症和/或警告的信息。
试剂盒可用于检测生物样品中免疫反应性L1-CAM蛋白的存在，所述生物样品是例如任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊液、尿、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包括体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包含：能够结合生物样品中的L1-CAM蛋白的本技术的一种或多种人源化、嵌合或双特异性抗L1-CAM抗体(或其抗原结合片段)；用于测定样品中L1-CAM蛋白的量的器件；以及用于将样品中的免疫反应性L1-CAM蛋白的量与标准品进行比较的器件。一种或多种抗L1-CAM抗体可以经标记。试剂盒组分(例如试剂)可以被包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包含用于使用所述试剂盒检测免疫反应性L1-CAM蛋白的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包含，例如1)附接于固体支持物的第一抗体，例如本技术的人源化、嵌合或双特异性L1-CAM抗体(或其抗原结合片段)，所述第一抗体与L1-CAM蛋白结合；以及，任选地；2)第二种不同抗体，其与L1-CAM蛋白或所述第一抗体结合并与可检测标记缀合。
试剂盒也可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包含检测所述可检测标记所需的其他组分，例如酶或底物。试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器内，并且所有不同的容器可以与用于解释使用所述试剂盒进行测定的结果的说明书一起放在单个包装中。本技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或试剂盒容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中含有的试剂，例如用于在体外或体内检测L1-CAM蛋白，或用于在有需要的受试者中治疗L1-CAM相关癌症。在某些实施方案中，试剂的使用可以根据本技术的方法。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术，不应将所述实施例视为任何方式的限制。以下实施例展示了本技术的说明性L1-CAM抗体的制备、表征和用途。实施例1-实施例11展示了本技术的嵌合、人源化和双特异性抗体的产生，以及它们的结合特异性和体内生物活性的表征。
实施例1：用于产生和表征本技术的抗L1-CAM抗体的材料和方法
免疫组织化学(IHC)。将人肿瘤和正常组织用于IHC是通过纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)机构审查委员会批准的。将速冻组织的五至七微米切片在丙酮中于-20℃下固定30分钟。通过以下方式封闭内源性生物素结合活性：依次用抗生物素蛋白和生物素(载体抗生物素蛋白-生物素封闭试剂盒；Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)处理20分钟，然后在室温下各自用10％马血清封闭1小时。然后将切片依次分别与一抗、生物素化的马抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories,Inc.，伯林盖姆，加利福尼亚州)和抗生物素蛋白-生物素复合物(Vectastain ABC试剂盒，VectorVector Laboratories,Inc.，伯林盖姆，加利福尼亚州)在室温下反应60分钟，并在每次反应之间洗涤。随后，将切片用染料(DAB过氧化物酶底物试剂盒，Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州)染色2min，洗涤，用Myer苏木精复染，洗涤，在95％乙醇中脱水。
E71和E72嵌合和人源化形式的构建。基于人同源物，将E71和E72的重链和轻链二者的CDR序列移植到人IgG1框架中并进行优化。合成了huE71和huE72基因(Blue HeronBiotechnology，波塞尔，华盛顿州；或Genscript，皮斯卡塔韦，纽约州)，并将其掺入哺乳动物表达载体(尤里卡，加利福尼亚州)中，并转染到DG44细胞或CHO-S细胞中以供稳定生产。类似地，将人VH和VL序列移植到人IgG4框架上，以制备IgG4重组抗体。最后，这些基因被转染到缺乏GnT1酶的DG44细胞中，以制备特殊的IgG1糖型。
嵌合或人源化E71和E72的纯化。在Opticho无血清培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)或PowerCHO-2(Lonza，巴塞尔，瑞士)中培养huE71和huE72生产者系，并收获成熟的上清液。将蛋白A亲和柱用25mM柠檬酸钠缓冲液和0.15M NaCl(pH 8.2)进行预平衡。将结合的huE71或huE72用0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH 3.9)洗脱，并在25mM柠檬酸钠(pH8.5)中碱化(1:10v/v比率)。使它通过Sartobind-Q膜，并在25mM柠檬酸钠、0.15MNaCl(pH 8.2)中浓缩至5-10mg/mL。在非还原或还原条件下，使用4％-15％ Tris-甘氨酸即用型凝胶系统(Bio-Rad，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)通过SDS-PAGE分析2μg的每种蛋白质。Invitrogen SeeBlue Plus2预染标准品(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)用作蛋白质分子量标记物。电泳后，使用GelCode蓝色染色试剂(PierceBiotechnology，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)对凝胶染色。使用Bio-Rad Fluor-S MultiImager(Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)扫描凝胶，并用Quantity One软件(Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)定量条带强度。
根据Biacore T-100生物传感器(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)的体外结合动力学。CM5传感器芯片(研究级)和相关试剂购自Biacore USA(皮斯卡塔韦，新泽西州)。按照制造商的说明书，将抗原L1-CAM-Fc或L1-CAM-His直接固定在CM5传感器芯片上。在分析之前，将纯化的单克隆抗体(MoAb)(E71和E72的小鼠嵌合IgG1和IgG4以及人源化IgG1和IgG4形式，以及它们的IgG1n糖型)在不同浓度(41.7-666.7nM)的HBS-EP缓冲液中稀释。在1min内以30μl/min的流速将样品注入到传感器表面上。缔合时间设置为1min，解离时间设置为5min至15min。在每个循环结束时，将表面在1min内以50μl/min的流速使用50mM NaOH进行再生。使用Biacore T-100评价软件通过针对速率常数的二价分析物模型和默认参数设置对数据进行了分析，并且计算了表观缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(Kd＝koff/kon)。
51铬释放测定。对于ADCC分析，效应细胞是来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。效应细胞:靶细胞(E:T)比率为50:1。对于T细胞细胞毒性测定，将效应T细胞在存在抗CD3和抗CD28的情况下在体外培养约14天，并以10:1的E:T比率使用。用PBS中的2mM EDTA收获所有靶肿瘤细胞，并将其用51Cr(Amersham，阿灵顿高地，伊利诺伊州)在37℃下以100μCi/106个细胞标记1h。在96孔聚苯乙烯圆底板(BD Biosciences，贝德福德，马萨诸塞州)中每孔添加5000个靶细胞以及抗体至最终体积为250μl/孔。添加10单位/ml的IL2用于ADCC测定。将板在37℃下孵育4小时。在γ计数器(Packed Instrument，丹尼森市，伊利诺伊州)中计数上清液中释放的51Cr。使用以下公式计算特异性释放的百分比：(实验cpm-背景cpm)/(总cpm-背景cpm)×100％，其中cpm表示每分钟释放的51Cr计数。通过用10％ SDS(Sigma，圣路易斯，密苏里州)裂解来评估总释放，并且在不存在效应细胞的情况下测量背景释放。使用Sigmaplot或Graphpad Prism软件计算EC50。
MoAb在异种移植小鼠中的生物分布。雌性无胸腺裸小鼠购自Harlan SpragueDawley,Inc(印第安纳波利斯，印第安纳州)。所有程序均按照纪念斯隆-特琳癌症中心机构动物保护和使用委员会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准的方案以及有关动物在研究中的适当和人道使用的机构指南进行。收获肿瘤细胞并将其重悬于基质胶(BD Biosciences，贝德福德，马萨诸塞州)中。使用22号针头将细胞(2-10×106)以0.1ml体积皮下(s.c.)植入到小鼠侧腹。在开始治疗之前，允许肿瘤生长至约200mm3的大小。将具有已建立的肿瘤的小鼠随机分到治疗组中。向每只小鼠静脉内注射100μCi的放射性碘化抗体，并且通常在48小时处死动物，取出它们的器官，并在γ计数器(Packard Instruments，Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中计数。这些器官包括皮肤、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胃、小肠、大肠、膀胱、股骨、肌肉、肿瘤、心脏、肺、脊柱和大脑。基于器官中积累的μCi和器官重量，计算注射剂量％(％ID)/克小鼠。还计算了肿瘤与非肿瘤的％ID/g比率。
huE71-BsAb设计、产生和纯化分析。将huE71-BsAb形式设计为使用15个氨基酸接头(G4S)3(SEQ ID NO:77)huOKT3 scFv与huE71-IgG1的轻链(huE71-huOKT3)的C末端的融合物。在IgG1 Fc区中引入N297A和K322A突变。核苷酸序列由GenScript(皮斯卡塔韦，纽约州)合成为具有适当的侧翼限制性酶切位点，并被亚克隆到标准的哺乳动物表达载体中。将线性化质粒DNA用于转染CHO-S细胞(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，以稳定产生BsAb。将2×106个细胞通过核转染(Lonza，巴塞尔，瑞士)用5μg的质粒DNA转染，然后在6孔培养板中于37℃下在补充有8mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的CD OptiCHO培养基中恢复2d。用500μg/mL潮霉素在大约两周内选择稳定库，然后以有限的稀释度选出单个克隆。分别通过L1-CAM(+)肿瘤细胞和CD3(+)Jurkat细胞ELISA测定huE71-BsAb滴度，并选择表达最高的稳定克隆。将BsAb生产者系在PowerCHO-2培养基中培养，并收获成熟的上清液。将蛋白A亲和柱(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州)用25mM柠檬酸钠缓冲液和0.15M NaCl(pH 8.2)预平衡。将结合的BsAb用0.1M柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH3.9)洗脱，并用25mM柠檬酸钠(pH 8.5，1:10v/v比率)中和。为了储存，将BsAb透析到25mM柠檬酸钠、0.15M NaCl(pH 8.2)中，并以等分试样在-80℃下冷冻。使用4％-15％ Tris-甘氨酸即用型凝胶系统(Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)在还原条件下通过SDS-PAGE分析两微克蛋白质。还通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)评价huE71-BsAb的纯度。将约20μg蛋白质注入TSK-GEL G3000SWXL 7.8mm×30cm，5μm柱(TOSOH Bioscience，东京，日本)中，其中采用0.4M NaClO4、0.05M NaH2PO4(pH 6.0)缓冲液，流速为0.5mL/min并且UV检测在280nm下。平行分析十微升凝胶过滤标准品(Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的MW标记物。
FACS分析。将细胞与不同浓度的一抗(嵌合或人源化huE71和huE72及其IgG4亚类和IgG1n变体，以及BsAb形式)在PBS中于4℃下孵育30分钟，并且在洗掉多余的一抗后使用对于人Fc具有特异性的藻红蛋白标记的二抗。在FACS Calibur细胞仪(BD Biosciences，贝德福德，马萨诸塞州)上分析之前，将细胞用1％多聚甲醛(PFA)固定。对照是与利妥昔单抗或帕利珠单抗一起孵育的细胞，其平均荧光强度(MFI)设置为5。
为了定量，使用Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG试剂盒(邦斯实验室，费希尔，印第安纳州)。简而言之，试剂盒包含五个微球体群体；一个空白，四个标记有渐增量的抗小鼠IgG。然后将珠粒和肿瘤细胞(37℃持续5小时)在冰上用相同的荧光缀合的小鼠E71标记30分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并与标记的珠粒一起，在BD FACS Calibur(BDBiosciences，贝德福德，马萨诸塞州)上分析。与每个试剂盒一起提供的基于Excel的QuickCal分析模板有助于将荧光强度与肿瘤细胞上的抗原密度相关联。每个数据点表示重复的平均值。
体内抗肿瘤测定。为了进行体内研究，使用BALB-Rag2-KO-IL-2R-γc-KO(DKO)小鼠(源自Mamoru Ito博士，CIEA，川崎，日本)。参见Koo GC等人,Expert Rev Vaccines 8:113-20(2009)。皮下植入新鲜培养基/BD基质胶(BD Biosciences，贝德福德，马萨诸塞州)的1:1混合物的肿瘤细胞。对于肿瘤体积测量，对所有肿瘤均使用手持式TM900扫描仪(Peira，布鲁塞尔，比利时)测量。
放射性标记抗体研究的一般实验室程序。除非另有说明，否则所有化学品均获自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)并按原样使用，并且对所有仪器均按照标准程序进行校准和维护。89Zr是在纪念斯隆凯特琳癌症中心在TR19/9回旋加速器(Ebco IndustriesInc.，列治文，不列颠哥伦比亚省，加拿大)上经由89Y(p,n)89Zr反应产生的，并进行纯化以产生具有196-496MBq/mg特定活性的89Zr。使用CRC-15R剂量校准器(Capintec,Inc.，弗洛勒姆帕克，新泽西州)进行活性测量。为了对活性进行定量，在自动Wizard伽马计数器(PerkinElmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)上对样品进行计数。配体的放射性标记使用即时薄层色谱纸(Agilent Technologies，圣克拉拉，加利福尼亚州)来监测，并使用Winscan Radio-TLC软件(Bioscan Inc.，华盛顿特区)在Bioscan AR-2000放射性ITLC读板仪上进行分析。所有的体内实验均根据纪念斯隆凯特琳动物保护与使用委员会批准的方案(方案08-07-013)进行。
细胞培养。将含有细胞的T-75烧瓶(Corning，康宁，纽约州)在保持在37℃和5％CO2浓度下的细胞培养箱中储存。将SKOV3即人上皮卵巢癌细胞系(ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)在RPMI McCoy's 5A培养基(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中培养，所述培养基修饰为含有1.5mM L-谷氨酰胺，均用100单位/mL青霉素G和100μg/mL链霉素以及10％胎牛血清培养。将SKOV3细胞系每周使用不含钙和镁的汉克缓冲盐溶液中的0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA进行一次传代培养，并以1:5传代以用于标准细胞系传代。
异种移植小鼠模型。八至十周大的无胸腺nu/nu雌性小鼠购自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(金斯敦，纽约州)。将动物饲养在通风的笼子中，随意进食和饮水，并使其适应环境约1周，之后接种。通过皮下注射新鲜培养基/BD基质胶(BDBiosciences，贝德福德，马萨诸塞州)的1:1混合物的150μL细胞悬浮液中的5.0×106个细胞，在右肩上诱导SKOV-3肿瘤。在注射癌细胞后约2-3周进行实验。对于肿瘤体积测量，对所有肿瘤均使用手持式TM900扫描仪(Peira，布鲁塞尔，比利时)测量。在最初的肿瘤测量后，将小鼠随机分组(每组n＝8-9)，以确保所有群组均具有与开始大致相等的平均肿瘤体积。
抗体生物缀合。在柠檬酸盐缓冲液(25mM柠檬酸钠，150mM氯化钠)中以平均浓度4-5mg/mL获得抗体。使用分子量截断值为50,000的离心过滤器单元(Amicon Ultra 4离心过滤单元，Millipore Corp.，比勒利卡，马萨诸塞州)将抗体浓缩至最终浓度12-15mg/mL。浓缩后，用0.1M Na2CO3将抗体的pH调节至8.5-9.0，然后添加溶解于DMSO中的10个当量的p-SCN-Bn-DFO或p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics,Inc.，达拉斯，德克萨斯州)。将反应在37℃下孵育1小时，以500rpm不断地摇动。使用分子量截断值为50,000的离心过滤器单元(AmiconUltra 4离心过滤单元，Millipore Corp.，比勒利卡，马萨诸塞州)纯化抗体，以纯化配体抗体缀合物。将最终的生物缀合物等分，并于-80℃下在PBS(pH 7.4)中储存。
放射性标记。在靶标处理后获得作为在1.0M草酸中的89Zr-草酸盐的89Zr。用1.0M碳酸钠中和所述溶液以达到pH约7。将DFO抗体与在PBS(pH7.4)中标记的中和的89Zr在37℃下一起孵育60分钟。获得177LuCl(比活性：170MBq/mg，Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)，并将其在乙酸氨缓冲液(200mmol/L，pH 5.4)中稀释，并与DOTA抗体在42℃下一起孵育1小时。经由放射性ITLC使用硅胶浸渍的玻璃微纤维纸条(ITLC-SG，Varian，森林湖，加利福尼亚州)(通过华盛顿特区的Bioscan Inc.的AR-2000来分析)，使用pH 5的50mM EDTA作为流动相来监测反应的进展。抗体复合物保留在起点，而游离放射性核素被流动相中的EDTA吸收并沿溶剂前沿迁移。使用放射性ITLC数据计算粗放射化学产率。随后使用尺寸排阻色谱(PD10)纯化放射性标记的抗体，然后使用离心过滤来浓缩最终体积以供配制。在使用前，通过放射性ITLC证实最终纯化的放射性标记抗体的放射化学纯度>99％。
血清稳定性。将每种89Zr-抗体复合物(100μL)的等分试样与900μL人血清一起孵育，并在热混合仪上于37℃下不断搅拌。在第0、1、3、5和7天一式三份地从每个微量离心管取样并使用放射性ITLC进行分析。将复合物的稳定性计算为保留在放射性ITLC条的起点的89Zr的百分比，并报告为完整％。
免疫反应性。使用Lindmo细胞结合测定来测定89Zr-DFO-抗体的免疫反应性分数(Ben QW等人,Ann Surg Oncol 17:2213-21(2010))。为此，将SKOV3细胞以5.0×105-5.0×106个细胞/mL的浓度范围悬浮于微量离心管中的500μL PBS、1％ BSA(pH 7.4)中。将89Zr-DFO-抗体的等分试样(50μL的1μCi/mL储备液)添加到每个试管中至最终体积500μL。将样品在热混合仪上于37℃下孵育60min。然后将经处理的细胞经由离心(1400RPM持续4min)沉淀，吸出上清液，并用冷PBS洗涤三次，然后去除上清液并计数与细胞相关的放射性。对活性数据进行背景校正，并与适当对照样品中的计数总数进行比较。通过(总/结合)活性对(1/[归一化细胞浓度])的图的线性回归分析来确定免疫反应性分数。
PET成像。PET成像实验是在Inveon PET/CT扫描仪(Siemens Healthcare Global，马尔文，宾夕法尼亚州)上进行的。经由静脉内尾静脉注射，向在右肩上有SKOV3异种移植物的雌性无胸腺裸小鼠给予89Zr-抗体(192-214μCi，在150μL PBS中)。通过吸入2％异氟烷(Baxter Healthcare，迪尔菲尔德，伊利诺伊州)和医用空气气体混合物来麻醉动物，并将其放置在扫描仪中，并使用2％异氟烷和医用空气气体混合物保持麻醉。在注射后24、48、72和96小时经由静态扫描记录每只小鼠的PET数据。使用的能量窗口为350-700keV，以及符合(coincidence)定时窗口为6ns。通过傅里叶面元重置(rebinning)将数据分类为2D直方图，并通过滤波反投影(FBP)将横向图像重建为128×128×63(0.72×0.72×1.3mm3)矩阵。通过使用系统校准因子将重建图像中的计数率转换为活性浓度(每克组织注射的剂量百分比，％ID/g)，所述系统校准因子源自对含有89Zr的小鼠大小的水等效体模的成像。使用ASIPro VM软件(Concorde Microsystems，诺克斯维尔，田纳西州)对图像进行分析。
生物分布。使用89Zr抗体SKOV3荷瘤雌性无胸腺裸小鼠进行生物分布研究。经由静脉内尾静脉注射，向动物给予150μL PBS中的89Zr-抗体中的每一种(17-26μCi)。在注射后96小时通过CO2窒息使动物安乐死(每组n＝4)。安乐死之后，收集17种器官(血液、肿瘤、心脏、肺、肝脏、脾脏、胃、大肠、小肠、胰腺、卵巢、肾脏、骨骼、肌肉、淋巴、皮肤、尾巴)，将其称重，并在89Zr校准的γ计数器上对放射性进行测定。使用从已知标准品生成的校准曲线将计数转换为活性。计数数据是背景，并且针对注射的时间进行衰减校正，并且通过对注射的总活性进行归一化计算每个组织样品的每克的注射剂量百分比(％ID/g)。本研究中描述的数据表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism 7软件通过未配对的双尾学生t检验来分析统计差异。P值<0.05被认为具有统计学意义，并以星号指示。
实施例2：本技术的人源化抗L1-CAM抗体的结构
产生人源化E71和E72抗L1-CAM抗体。序列设计是基于人IgG同源性计算，同时保留了关键的小鼠氨基酸残基。图6和图7分别显示了鼠E71的VH和VL(表示为SEQ ID NO:1和3)以及鼠E72的VH和VL(表示为SEQ ID NO:5和7)。将鼠E71(参见图6)和E72(参见图7)的重链和轻链的CDR基于它们与人框架的同源性移植到人IgG1框架上。对于E71，针对重链使用的同源人序列为IGHV7-4-1(SEQ ID NO:2)，并且针对轻链使用的同源人序列为IGKV-58(SEQ IDNO:4)(图6)。对于E72，针对重链和轻链使用的同源人序列分别为IGHV1-2*02|66.3|IGHJ4*01|85.7(SEQ ID NO:6)和IGKV1-NL1*01|73.7|IGKJ2*02|81.8(SEQ ID NO:8)(图7)。
将两个不同的重链序列(对于huE71的H1和H2；关于相应的氨基酸序列参见图8，并且关于cDNA序列参见图9)和两个不同的轻链序列(L1和L2；关于相应的氨基酸参见图10，并且关于cDNA序列参见图11)表示为huE71的完整IgG，并测试其结合和稳定性。将两个不同的重链序列(对于huE72的H1和H2；关于相应的氨基酸序列参见图12，并且关于cDNA序列参见图13)和两个不同的轻链序列(L1和L2；关于相应的氨基酸序列参见图14，并且关于cDNA序列参见图15)表示为huE72的完整IgG，并测试其结合和稳定性。
还制备了E71(关于相应的氨基酸序列参见图16，并且关于cDNA序列参见图17)和E72(关于相应的氨基酸序列参见图18，并且关于cDNA序列参见图19)的嵌合形式以供比较。对于huE71和huE72的最终形式，选择最稳定的组合：E71的H1和L1(分别为图20和图21)以及E72的H1和L2(分别为图22和图23)用于其余实验。制备了另外的构建体，用人IgG4框架替代chE71的重链序列(图24中的氨基酸序列和图25中的cDNA序列)，以及用人IgG4框架替代huE71的重链序列(分别为图26中的氨基酸和图27的cDNA)。HuE71被包装到单个载体中(用于平衡的重链和轻链分泌)，将其转导到DG44细胞中。HuE71-IgG1n是在具有由GnT1缺乏引起的变体糖基化的CHO细胞中表达的另一种huE71-IgG1糖型(Jefferis R,Nat Rev DrugDiscov 8:226-34(2009))。使用标准蛋白A亲和色谱纯化HuE71-IgG1、huE71-IgG4和huE71-IgG1n。糖分析证实，huE71-IgG1n具有71.1％(Mol％)甘露糖、26.3％(Mol％)N-乙酰葡萄糖胺和2.6％(Mol％)葡萄糖。在SDS凝胶上，huE71和huE72以具有适当大小的重链和轻链的IgG迁移；并且通过HPLC将它们全部洗脱为完整IgG，其中形成<5％聚集体。
实施例3：HuE71和HuE72及其衍生物的抗原结合
将抗原(L1-CAM-Fc和L1-CAM-His)固定在CM5芯片上，并通过表面等离子体共振(SPR)使用Biacore T-100比较抗体结合的动力学(kon、koff和Kd)(关于L1-CAM-Fc参见图28)。与其他L1-CAM小鼠抗体相比，在L1-CAM-Fc上嵌合抗体和人源化抗体的结合动力学总结在图29和图30中。在L1-CAM-His上嵌合抗体和人源化抗体的结合动力学总结在图31中。
还使用L1-CAM(+)肿瘤细胞通过FACS分析对抗原结合进行了分析。将数据表示为流式细胞术测定的平均荧光强度(MFI)，并归一化为所用最高抗体浓度(1μg/106个细胞):间皮瘤(图32)、白血病、乳腺癌和尤因肿瘤家族(图33)和黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌(图34)的结合百分比。
HuE71-IgG1是稳定的，经过5次冷冻和解冻过程后，其抗原结合的EC50保持为0.03μg/百万个细胞。使用包被在塑料板上的肿瘤细胞作为抗原的ELISA方法也用于测定huE71-IgG1和huE71-IgG1n结合；huE71-IgG1和huE72-IgG1两者显示出可比的与肿瘤细胞的结合。重复冷冻和融化5次后，huE71-IgG1n与肿瘤细胞的结合没有改变。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与L1-CAM特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的L1-CAM蛋白。
实施例4：由HuE71-IgG1n和HuE72-IgG1n介导的ADCC
使用PBMC作为正常志愿者的效应物来评价ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)。与特殊糖型相反，chE71、huE71、chE72和huE72的所有野生型人IgG1形式均不能介导ADCC。测试了两个靶细胞系LAN-1和NB1691。只有huE71-IgG1n能够介导ADCC(LAN-1细胞的EC50为0.06μg/ml，NB1691细胞的EC50为0.1μg/ml)。参见图61和图62。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段可以引发ADCC。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗L1-CAM阳性癌症。
实施例5：HuE71-BsAb和HuE72-BsAb设计以及在CHO-S细胞中的表达
使用IgG-scFv形式(图35)与图36中所示的氨基酸序列设计BsAb。对于huE71-huOKT3形式，重链与huE71 IgG1的重链相同，轻链是通过用C末端(G4S)3接头(SEQ ID NO:77)、接着为huOKT3 scFv来延伸huE71轻链而构建的。HuE72-huOKT3的设计是类似的。对于这两种抗体，均将N297A和K322A突变引入hIgG1 Fc区，以去除糖基化和补体激活。将编码BsAb的重链和轻链的DNA插入哺乳动物表达载体中，转染到CHO-S细胞中，并选择展示出最高表达的稳定克隆。从摇瓶收集上清液，并在蛋白A亲和色谱上纯化。通过尺寸排阻色谱将蛋白质进一步纯化至>90％单体。
在还原性SDS-PAGE条件下，由于huOKT3 scFv与轻链的融合使MW增加至约50KDa，因此两种BsAb均在约50KDa处产生两个条带。SEC-HPLC显示出针对两种抗体而言MW为约210KDa的主峰(通过UV分析测得97％)，以及通过凝胶过滤可去除的多聚体的次峰。当通过SPR在L1-CAM-Fc上进行测定时，BsAb对L1-CAM的亲和力与亲本IgG对L1-CAM的亲和力是可比的(图37)。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与L1-CAM特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的L1-CAM蛋白。
实施例6：本技术的抗L1-CAM BsAb与肿瘤细胞和T细胞两者的结合
图28和图37显示了通过SPR测得的在L1-CAM-Fc上两种BsAb的结合动力学。通过FACS免疫染色测试了huE71-BsAb和huE72-BsAb与靶细胞和效应细胞两者的结合。huE71-BsAb与亲本huE71在结合L1-CAM(+)神经母细胞瘤BE(2)C方面的效率相同，而huE72-BsAb与BE(2)C的结合是在huE71-BsAb的情况下观察到的结合的一半(图38(A))。对于与CD3(+)T细胞的结合，与huOKT3 IgG1相比，huE71-BsAb和huE72-BsAb的效率均较低；比huOKT3弱约20倍(图38(B))。BsAb的轻链锚定scFv对于T细胞的亲合力降低在部分上是归因于这种形式的空间限制，但有利于最小化细胞因子释放，尤其是当不存在靶细胞时。
这些数据表明与CD3的结合在功能上是单价的，从而在没有肿瘤靶标的情况下排除了T细胞的自发激活。
实施例7：HuE71-BsAb或HuE72-BsAb诱导的Th1细胞因子释放
在用细胞系IMR32-萤光素酶激活24小时后，huE71-BsAb和huE72-BsAb两者均可诱导从PBMC释放Th1细胞因子(如TNFα)。IFNγ和IL2水平相对较低。huE71-BsAb和huE72-BsAb两者均诱导Th2细胞因子、IL6和IL10释放。然而，这些细胞因子的水平低于对照hu3F8-BsAb诱导的细胞因子的水平(图39(A)-图39(E))。
实施例8：HuE71-BsAb和HuE72-BsAb重定向的对人肿瘤细胞系的T细胞杀伤
在具有激活的T细胞(E:T比率＝10:1)的标准4小时51Cr释放测定中测试了HuE71-BsAb或huE72-BsAb介导的对L1-CAM阳性癌细胞系的T细胞毒性。两种BsAb均诱导了针对肿瘤细胞的T细胞毒性，并且huE72-BsAb比huE71-BsAb更有效(采用IMR32-萤光素酶细胞系的情况下，EC50分别为50.0pM和62.9pM)(图40)。当测试扩展的人肿瘤细胞系(包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈腺癌)组时，huE71-BsAb或huE72-BsAb介导的T细胞毒性与通过FACS评估的肿瘤L1-CAM表达相关联(图41和图42(A)-图42(B))。
实施例9：HuE71-BsAb和HuE72-BsAb对人源化小鼠中的异种移植物的功效
对于体内疗法研究，使用了BALB-Rag2-KO-IL-2R-γc-KO(DKO)小鼠(Koo GC等人,Expert Rev Vaccines 8:113-20(2009)；Andrade D等人,Arthritis Rheum 63:2764-73(2011))。在单独的人源化小鼠异种移植物模型(皮下(sc)肿瘤加皮下效应细胞，皮下肿瘤加静脉内(iv)效应细胞)中，在存在来自健康供体的PBMC的情况下，静脉内L1-CAM-BsAb对已建立的肿瘤显示出高活性。
对于体内研究，将L1-CAM(+)神经母细胞瘤患者来源的异种移植物(PDX)(图43)皮下移植到DKO小鼠中。在第15天当肿瘤可测量时开始HuE71-BsAb或huE72-BsAb治疗，使用每周两次注射的给药时间表，持续五周。在第16天开始静脉内给予PBMC(7.5×106)，然后每周注射一次，持续3周。每周测量一次肿瘤的大小。用huE72-BsAb和PBMC治疗的小鼠的肿瘤生长与对照相等。因此，尽管huE72-BsAb具有很高的结合亲和力和优异的体外肿瘤杀伤效力，但其在体内的抗肿瘤应答仍然不明显。相反，HuE71-BsAb与PBMC一起显著抑制了肿瘤生长。
在图44中，使用IMR32神经母细胞瘤细胞系代替PDX，并将其与等量的PBMC皮下混合植入。HuE71-BsAb或huE71-IgGn显著抑制肿瘤生长，而huE72-BsAb对肿瘤体积无影响。
实施例10：使用89Zr-huE71-IgG1n和89Zr-huE72-IgG1n的肿瘤成像
用89Zr-huE71-IgG1n和89Zr-huE72-IgG1n对皮下植入SKOV3人卵巢异种移植物的裸小鼠进行成像(分别参见图45和图46)。尽管huE71的亲和力低于huE72，但89Zr-huE71-IgG1n的体内靶向效率更高。
实施例11：L1-CAM抗体Fc变体
以下研究评价人源化抗体的Fc区内的修饰对其体内生物分布的影响。人的IgG抗体有四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，它们可以分解为进一步的亚型。另外，有几种结合IgG抗体的Fc受体，即Fcγ受体。
Fcγ受体进一步细分为在免疫细胞上差异表达的类别，其中Fcγ受体I对IgG抗体的亲和力最高(Nimmerjahn F,Ravetch JV.Nat Rev Immunol 8:34-47(2008))。IgG1抗体在人中最为丰富，并且具有最高的亲和力以激活Fcγ受体(Bruhns P等人,Blood 113:3716-25(2009))。此外，IgG的糖部分或糖基化状态在与Fcγ受体结合方面起重要作用。具体地，对于IgG1抗体，附接于恒定区上N297残基的糖部分与抗体相互作用并改变抗体的Fc结合特征(Sazinsky SL等人,Proc Natl Acad Sci U S A 105:20167-72(2008))。附接于此残基的复合糖部分包括甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以及包括岩藻糖、半乳糖和唾液酸在内的其他分支糖，并且此糖基化位点的改变可极大地影响结合(Maverakis E等人,JAutoimmun 57:1-13(2015)；Arnold JN等人,Annu Rev Immunol 25:21-50(2007))。这些糖全部缺失的IgG抗体显示出Fcγ受体结合显著降低，而不影响其FcR(n)亲和力。另一方面，从糖基化位点去除岩藻糖残基大大地提高IgG对Fcγ受体的亲和力(Maverakis E等人,JAutoimmun57:1-13(2015))。尽管IgG1抗体对Fcγ受体的亲和力最高，但代表人中IgG丰度最低的IgG4抗体对Fcγ受体的亲和力却显著较低，通常被认为是一种作为调节机制抑制免疫应答的抗炎性IgG。不希望受理论的束缚，认为这种现象在部分上是由于IgG4抗体的被称为动态Fab臂交换的固有特性(Van der Neut Kolfschoten M等人,Science 317:1554-7(2007))。
IgG抗体的所有亚类均由两个重-轻链对构成，它们由重链上的位于抗体铰链区中的半胱氨酸残基形成的二硫键结合在一起。取决于IgG的亚类，此铰链区的长度以及二硫键的数量是可变的。这些特征影响铰链区的柔性，并且在与Fcγ受体的结合亲和力方面起作用(Rispens T等人,J Biol Chem289:6098-109(2014))。在IgG4抗体的情况下，两个半分子(重-轻链对)能够在铰链区彼此解离，并与其他半分子自发重组，从而在体外和体内形成双特异性单价抗体(Rispens T等人,J Biol Chem 289:6098-109(2014)；Vidarsson G等人,Front Immunol 5:520(2014))。通过在抗体铰链区内引入丝氨酸到脯氨酸的突变(S228P)，可以在IgG4抗体中禁用这种动态Fab臂交换特性(Silva JP等人,J Biol Chem 290:5462-9(2015))。在本研究中进行的实验在表达小鼠Fcγ受体的小鼠中利用人源化抗体。尽管人和小鼠中的Fcγ受体同源性仅为60％-70％，但最近的研究显示，人IgG以非常相似的亲和力与直系同源的小鼠Fcγ受体结合，从而表明了相似的生物活性(Overdijk MB等人,JImmunol189:3430-8(2012))。
L1-CAM抗体修饰。为了研究Fc区对放射性免疫缀合物的体内生物分布的影响，开发了一组人源化IgG1和IgG4抗体，它们全部具有完全相同的抗原结合位点，但在Fc区具有修饰，从而改变了它们对Fcγ受体的亲和力(图47)。HuE71-1 MAGE是具有缺乏α-1,6-岩藻糖的聚糖的针对L1-CAM的IgG1抗体，所述抗体是在CHO细胞中产生的，所述CHO细胞缺乏酶UDP-N-乙酰氨基葡萄糖:α-3-d-甘露糖苷-β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnT1)，从而增强Fc区(Xu H等人,Cancer Immunol Res 4:631-8(2016))。HuE71-1 WT是在野生型CHO细胞中产生的针对L1-CAM的野生型IgG1抗体，而去糖基化HuE71-1是一种去糖基化的变体，其含有N297A突变从而减少其Fcγ受体结合。HuE71-4 WT是此抗体的IgG4变体，而HuE71-4突变体含有S228P突变，其防止发生动态Fab臂交换。最后，HuCtrl-4是靶向GD2的IgG4野生型抗体，GD2是用于本研究的动物模型中的非特异性抗原。
缀合和放射性标记。为了使本文公开的L1-CAM抗体与功能化异硫氰酸盐去铁胺螯合剂(p-SCN-Bn-DFO)缀合，将溶解于PBS中的每种抗体的浓溶液的pH调节至8.5-9，并与以10:1摩尔过量溶解于DMSO中的螯合剂于37℃下一起孵育1小时。在旋转过滤器纯化抗体(Amicon Ultra 50kDa)之后，将等分试样冷冻，并使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-ToF MS)来评价起始材料(未缀合的抗体)和缀合的抗体的样品，以确定每种抗体的螯合物数量。因为使用了非特异性缀合方法，所以DFO部分有可能在随机分布在抗体上的赖氨酸残基上形成多个硫脲键。缀合前和缀合后抗体的MALDI-ToF MS分析揭示，每个89Zr-HuE71-1 MAGE有2.38个螯合物、每个89Zr-HuE71-1 WT有1.41个螯合物、每个89Zr-去糖基化HuE71-1有1.07个螯合物、每个89Zr-HuE71-4 WT有1.30个螯合物、每个89Zr-HuE71-4突变体有0.63个螯合物并且每个89Zr-HuCtrl-4 WT有1.12个螯合物。这些值表示每个抗体分子的螯合物的平均数量。例如，每个89Zr-HuE71-1 WT的1.41个DFO螯合物分子的值指示每个抗体分子结合了1个或2个螯合剂。然后将每种抗体在PBS中于37℃下用89Zr放射性标记60分钟。
使用即时薄层色谱(ITLC)和EDTA流动相(pH 5.0，50mM)计算放射化学产率和比活性，其中游离89Zr随溶剂前沿迁移，而螯合的89Zr保持在基线。在尺寸排阻色谱纯化(PD-10柱)后，所有抗体的放射化学产率均大于95％，并且所有抗体的放射化学纯度均大于99％。放射标记后，所有抗体(不包括89Zr-HuE71-4突变体)的比活性均在6.18-6.89μCi/μg之间。尽管对放射性标记89Zr-HuE71-4突变体进行了许多优化尝试，但从未实现高于2.14μCi/μg的比活性，这与MALDI-ToF MS数据一致，这表明89Zr-HuE71-4突变体具有最低的平均螯合物数量0.63。
体外表征。为了评估示踪剂的放射化学稳定性，进行了血清稳定性激发。将一小份(100uL)的每种放射免疫缀合物在人血清(900μL)中于37℃下孵育七天。在第0、1、3、5和7天采集样品，并经由放射性即时薄层色谱进行评价，以测定仍与抗体结合的活性百分比。研究表明，所有示踪剂在整整七天的时间内都保持稳定，89Zr-HuE71-1 MAGE的值为97.3％±0.8％、89Zr-HuE71-1 WT的值为97.7％±0.7％、89Zr-去糖基化HuE71-1的值为96.6％±0.8％、89Zr-HuE71-4 WT的值为96.9％±0.3％、89Zr-HuE71-4突变体的值为97.5％±0.3％并且89Zr-HuCtrl-4 WT的值为96.7％±1.1％。这些值在七天之内完整性均高于95％，与89Zr-DFO放射性标记抗体的预期值一致。
为了确定这些抗体在放射性标记后能够结合靶标的程度，进行了免疫反应性测定。简而言之，将89Zr标记的抗体与浓度递增的靶阳性卵巢癌细胞(SKOV3)一起孵育，并且洗涤后，对细胞结合的活性进行计数并用于计算免疫反应性分数。这些实验对所有抗体产生的免疫反应性均大于85％，具体地，对于89Zr-HuE71-1 MAGE为89.5％±1.5％、对于89Zr-HuE71-1 WT为93.1％±2.2％、对于89Zr-去糖基化HuE71-1为85.8％±2.9％、对于89Zr-HuE71-4 WT为86.7％±1.9％并且对于89Zr-HuE71-4突变体为88.6％±2.8％(图48(A)-图48(E))。由于所有示踪剂的免疫反应性都在彼此的范围内，因此可以假定放射性免疫缀合物的成像和生物分布模式中任何可观察到的差异都不是由于它们与靶抗原(L1-CAM)的结合能力不同。
连续PET成像。对在右肩上荷载皮下SKOV3肿瘤的雌性无胸腺裸小鼠进行了连续PET成像研究，以确定对本技术抗体的Fc区的修饰将如何改变这些放射性免疫缀合物的生物分布模式。经由尾静脉注射放射性标记的免疫缀合物，并在注射后4个时间点(24、48、72和96小时)获取PET图像。在所有成像图中呈现的是穿过肿瘤组织的小鼠冠状切片(全部在每克0至30％注射剂量的范围内)和代表全身图像的最大强度投影(MIP)。
对于89Zr-HuE71-1 MAGE(图45)，在注射后24小时观察到肿瘤组织中示踪剂的高放射性浓度(白色箭头)，在非靶向器官中放射性最低。由于看不到心脏或大血管，因此示踪剂迅速从血池中清除。有趣的是，动物上部的四个双边结构(灰色箭头)也显现出具有高放射性浓度。收获这些PET阳性组织，并将它们鉴定为下颌下和腋窝淋巴结。此外，注射放射性示踪剂后，淋巴结对89Zr-HuE71-1 MAGE的吸收持续了96小时。注射89Zr-HuE71-1 WT的SKOV-3异种移植物的PET图像揭示，在24小时肿瘤组织内的示踪剂吸收很高，这持续积累长达96小时(图49)。肝脏放射性浓度很高，在24小时相当强烈，然后在96小时内逐渐被洗掉。再次，将小鼠上部的四个淋巴结以及下部的淋巴结在24小时用PET照亮，但在96小时内它们显现出轻微消失。
在89Zr-去糖基化HuE71-1图像(图50)中，在24小时观察到肿瘤组织内示踪剂的高放射性浓度，这持续积累长达96小时。在24小时此示踪剂的血池活性相当高并且在心脏、降主动脉以及左右颈总动脉中清晰可见，但此活性在注射后72小时迅速清除。根据IgG1放射性标记抗体的PET成像数据，89Zr-去糖基化HuE71-1具有最干净的生物分布图谱，因为从注射后24小时到96小时，肿瘤组织的放射性浓度最高，并且非靶向组织活性的数量最少。
对于89Zr-HuE71-4 WT(图51)，在24小时大部分活性在肿瘤组织内，并且在最大强度投影中，可以非常清楚地看到血池活性。在动物的中部也可以看到两个双边结构(灰色箭头)，并且已经确认它们是肾脏。肿瘤组织内的高活性以及肾脏活性一直持续到注射后96小时。
在89Zr-HuE71-4突变体的图像(图52)中，在24小时观察到轻微的肿瘤吸收，在长达96小时的时间内持续逐渐积累。此处，存在血池活性，在这种情况下，在整整96小时内显现出部分降低。然而，最值得注意的是89Zr-HuE71-4突变体没有肾脏吸收，这是对于89Zr-HuE71-4 WT所清楚观察到的。
在本研究中成像的最终示踪剂是非特异性对照抗体89Zr-HuCtrl-4 WT(图53)。在所有时间点，肿瘤组织内的活性都非常低，这与抗体的靶标GD2未被SKOV-3细胞系高度表达这一事实相一致。在所有时间点都可以看到肝脏活性以及活跃的肾脏活性。
除对照抗体(89Zr-HuCtrl-4 WT)外，所有其他示踪剂均具有靶向L1-CAM的完全相同的抗原结合位点。五个L1-CAM示踪剂之间的唯一差异是在Fc区内，这对体内生物分布具有重大影响。根据PET图像，具有较低Fc受体结合的抗体变体(89Zr-去糖基化HuE71-1，89Zr-HuE71-4 WT，89Zr-HuE71-4突变体)未表现出淋巴结吸收。相反，具有正常或增强的Fcγ受体结合的抗体(89Zr-HuE71-1 WT，89Zr-HuE71-1 MAGE)具有强烈的淋巴结吸收。综上所述，数据表明抗原的局部表达在淋巴结吸收中不起作用，因为所有L1-CAM示踪剂的抗原结合区均相同。此外，在免疫反应性测定中，L1-CAM放射性免疫缀合物产生的免疫反应性分数大于85％，这排除了抗原结合的差异作为淋巴结差异吸收的原因。因为正常和增强的Fcγ受体结合抗体(89Zr-HuE71-1MAGE和89Zr-HuE71-1 WT)展现出与低Fcγ受体结合抗体(89Zr-去糖基化HuE71-1，89Zr-HuE71-4 WT，89Zr-HuE71-4突变体)相比统计上显著更高的淋巴结吸收，所以观察到的高淋巴结吸收可能是由于Fc结合的差异。
关于IgG4示踪剂，在野生型变体中观察到高的肾脏吸收。此示踪剂中的S228P突变能够将肾脏吸收降低到任何时候在PET上都无法看到的程度。如前所述，IgG4抗体进行动态Fab臂交换，并且能够在铰链区自发分裂(形成约75kDa构建体)，然后与其他半分子重组。不希望受到理论的束缚，认为在野生型IgG4 L1-CAM抗体中观察到的肾脏吸收可能是动态Fab臂交换特性的次要作用，因为S228P突变阻止了这种肾脏积累的发生。此外，75kDa半抗体可能会进一步减小为25和50kDa的片段，从而使它们通过肾脏内的肾小球。非特异性89Zr-HuCtrl-4 WT IgG4抗体在肾组织内展现出高积累，这与IgG4肾脏吸收理论相一致。
离体生物分布。为了确认PET成像结果并验证示踪剂的特异性，进行了离体生物分布研究(图54和图55)。经由尾静脉将放射性标记的免疫缀合物注射入荷载SKOV3肿瘤的雌性无胸腺裸小鼠中，并在注射后96小时收集各种组织，进行伽马计数分析并进行体重归一化。这些研究的结果与PET成像实验揭示的趋势相匹配。已知具有正常或增强的Fcγ受体结合的抗体(89Zr-HuE71-1 WT，89Zr-HuE71-1 MAGE)展示出高的淋巴结吸收(16.85％±1.39％ ID/g，17.16％±0.41％ ID/g)。相反，抗体的去糖基化变体89Zr-去糖基化HuE71-1显示出淋巴结吸收的基础水平5.59％±0.49％ ID/g。通过离体生物分布获得的值与PET成像数据相关，并进一步证实了这样的假设，即淋巴结吸收增加是由于抗体的Fc区而不是可变区的结合。
对于IgG4抗体，89Zr-HuE71-4 WT显示淋巴结吸收3.98％±0.969％ ID/g，而89Zr-HuE71-4突变体为3.70％±0.975％ ID/g(图56和图57)。淋巴结内的这两种抗体未见明显差异。89Zr-HuE71-4 WT在肾脏中积累，其值为12.06％±1.23％ ID/g，而89Zr-HuE71-4突变体显著较低，为5.83％±0.537％ ID/g。这些数据重演在PET成像数据中所观察到的，并且进一步表明动态Fab臂交换的IgG4特性在示踪剂的肾脏吸收中起作用。
为了评价这些示踪剂对靶标的特异性，将阻断组包括在离体生物分布研究中。经由尾静脉将50倍过量的冷示踪剂与放射性标记的示踪剂共注射。从理论上讲，添加冷示踪剂将显著降低热示踪剂的比活性，并且会观察到显著降低热示踪剂的吸收。对于所有五种L1-CAM靶向抗体都可以观察到这一点。肿瘤组织吸收值对于89Zr-HuE71-1 MAGE从16.15％±0.85％ ID/g降至5.87％±0.76％ ID/g、对于89Zr-HuE71-1 WT从19.67％±1.23％ ID/g降至6.82％±0.809％ ID/g、对于89Zr-去糖基化HuE71-1从32.02％±2.99％ ID/g降至10.58％±1.52％ ID/g、对于89Zr-HuE71-4 WT从27.29％±1.55％ ID/g降至10.65％±0.472％ ID/g,并且对于89Zr-HuE71-4突变体从16.90％±1.21％ ID/g降至9.04±1.42％ID/g。对于此模型中的非特异性抗体89Zr-HuCtrl-4 WT，肿瘤吸收非常低，为6.02％±0.90％ ID/g。肿瘤组织中的这种吸收可归因于增强的渗透性和保留(EPR)作用。参见Heneweer C等人,J Nucl Med 52:625-33(2011)。
离体组织学。收集淋巴结和肿瘤并进行组织学分析，以确定在用IgG1示踪剂进行PET成像研究中观察到的淋巴结吸收是否实际上指示转移性疾病(图58)。肿瘤组织的苏木精和伊红染色证实肿块为未分化癌。肿瘤组织被描述为界限分明、未包囊的致密细胞结节性赘生块，由紧密包裹的小叶和细小血管间隔支撑的赘生性上皮细胞的巢组成。赘生性细胞是多边形至纺锤形，具有不同的细胞边界，偶尔有空泡的大量嗜酸性细胞质，以及具有细颗粒状至囊状染色质的圆核和1-2个明显的品红色核仁。出现严重的红细胞大小不均和细胞核大小不均。每个高倍视野(40×)平均4-6个有丝分裂。存在具有凝固性坏死的多病灶区域。左右腋窝淋巴结和肠系膜淋巴结的苏木精和伊红染色揭示髓窦内有组织细胞增多和浆细胞增多，这是引流反应的常见表现，且没有赘生性细胞征象。
177Lu放射免疫治疗研究。如上所示，89Zr-去糖基化HuE71-1在注射后96小时展现出32.02％±2.99％ ID/g的高肿瘤活性浓度以及低背景组织吸收(尤其是肾脏和血液)。将89Zr-去糖基化HuE71-1用金属放射性核素177Lu标记，因为它具有放射化学特性(半衰期为6.7天；平均范围为0.2mm；％β＝100)，并且177Lu在成像和放射免疫治疗应用中得到广泛使用。将去糖基化HuE71-1抗体与DOTA缀合，用3.94mCi/mg的177Lu比活性标记(放射化学纯度>99％)，并在荷载SKOV-3皮下肿瘤的无胸腺裸小鼠中进行成像研究和离体生物分布研究(图59(A)-图59(C))。这些研究证实了与对于89Zr-去糖基化HuE71-1所观察到的相似的生物分布图谱，如SPECT/CT图像和Cerenkov图像中所见，大部分活性定位于肿瘤组织，并在注射168小时后通过离体生物分布得到证实。
将177Lu-去糖基化HuE71-1作为放射免疫治疗剂的功效在3个剂量(800μCi，800μCi分次剂量(2个剂量，交错14天)和400μCi)下进行了评价，并在相同动物模型中的与冷抗体、800μCi非特异性抗体对照和生理盐水(每组n＝8-9)进行比较(图60)。在经过80天(初始治疗后60天)的平均肿瘤体积之后，在对照组和放射性标记的治疗组之间观察到显著差异的反应。值得注意的是，没有一个对照组展示出超过起始体积的肿瘤消退的迹象。接种后80天，三个177Lu-去糖基化HuE71-1组显示出明显的生长延迟效应。然而，在研究的较晚时间点，177Lu-去糖基化HuE71-1组在肿瘤体积方面无显著差异，这些组的平均肿瘤体积在第80天的误差范围内相等。此外，在治疗后的前2周内，在最高治疗组(800μCi，177Lu-去糖基化HuE71-1)中的4/8小鼠中观察到了毒性迹象(体重减轻>80％且有瘀点)。在注射800μCi非特异性对照抗体的任何小鼠中均未观察到毒性，这很可能是由于示踪剂清除/消除的差异。这些数据表明，单次剂量400μCi 177Lu-去糖基化HuE71-1足以延迟此模型中的肿瘤生长，同时避免毒性问题。
综上所述，这些结果证明，本技术的抗体或抗原结合片段可以检测肿瘤并抑制肿瘤生长和/或转移的进展。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测和治疗有需要的受试者中的L1-CAM阳性癌症。
等同物
本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，意图将所述实施方案作为本发明技术单独方面的单一说明。如本领域技术人员清楚的，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据前述说明将明了，除了本文中列举的方法和装置以外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。所述修改和改变旨在落于本发明技术的范围内。应理解，本发明技术不受限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，而是当然可以改变的。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，而并不旨在是限制性的。
另外，当本公开文本的特征或方面按马库什组(Markush group)来描述时，本领域技术人员将认为，本公开文本也从而按马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别在提供书面描述方面，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。
本文所提到或引用的所有专利、专利申请、待决申请和公开案都是通过引用以其整体并入本文，包括所有图形和表格，结合至其与本说明书的明确教示一致的程度。
综上所述，本发明包括但不限于以下各项：
1.一种包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)所述VH包含GYTFTSYWMQ的VH-CDR1序列(SEQ ID NO:53)、EINPSNGRTNYNEMFKS的VH-CDR2序列(SEQ ID NO:54)和YDGYYAMDY的VH-CDR3序列(SEQ ID NO:55)；和/或
(b)所述VL包含KSSQSLLYSSNQKNYLA的VL-CDR1序列(SEQ ID NO:56)、WASTRES的VL-CDR2序列(SEQ ID NO:57)和QQYHSYPFT的VL-CDR3序列(SEQ ID NO:58)。
2.根据项1所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
3.根据项2所述的抗体，其包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。
4.根据项2所述的抗体，其包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
5.根据项1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。
6.根据项1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与L1-CAM蛋白的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:74的至少五至八个连续氨基酸残基。
7.根据项1至4或6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
8.一种抗体，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51的重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，和/或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52的轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
9.根据项8所述的抗体，其包含选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13(huE71 H1/L1)；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14(huE71 H1/L2)；
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(huE71 H2/L1)；
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14(huE71 H2/L2)；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22(huE72 H1/L2)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21(huE72 H2/L1)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22(huE72 H2/L2)；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25(chE71IgG1)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29(chE72 IgG1)；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:41(chE71IgG4)；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:45(huE71IgG4)；
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(huE71 BsAb)；和
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72 BsAb)。
10.一种抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少95％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少95％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
11.一种抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的LC序列至少95％相同的LC序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的HC序列至少95％相同的HC序列。
12.根据项8至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
13.根据项8至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体与L1-CAM蛋白的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的至少五至八个连续氨基酸残基。
14.根据项8至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。
15.根据项8至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
16.一种编码根据项8至15中任一项所述的抗体的重组核酸序列。
17.一种选自以下的重组核酸序列：SEQ ID NO:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。
18.一种包含根据项16或项17所述的重组核酸序列的宿主细胞或载体。
19.一种组合物，其包含根据项1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
20.一种包含根据项8至15中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体的组合物，其中所述抗体任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
21.根据项1至4、6或7中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
22.根据项8至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
23.根据项7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
24.根据项7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原结合。
25.一种治疗有需要的受试者中L1-CAM相关癌症的方法，其包括向所述受试者给予有效量的抗体，所述抗体包含选自以下的HC氨基酸序列和LC
氨基酸序列：
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13(huE71 H1/L1)；
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14(huE71 H1/L2)；
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(huE71 H2/L1)；
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14(huE71 H2/L2)；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22(huE72 H1/L2)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21(huE72 H2/L1)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22(huE72 H2/L2)；
SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25(chE71IgG1)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29(chE72 IgG1)；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:41(chE71IgG4)；
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:45(huE71IgG4)；
SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(huE71 BsAb)；和
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72 BsAb)，
其中所述抗体与L1-CAM特异性地结合并中和L1-CAM活性。
26.根据项25所述的方法，其中所述L1-CAM相关癌症是白血病、尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、NSCLC、胰腺导管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、胆管癌、类癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、嗜铬细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症、胰腺腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、肿瘤血管、软骨肉瘤、食管腺癌、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、肾上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、毛细血管瘤、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、颌下唾液腺癌或头颈部鳞状细胞癌。
27.根据项25或26所述的方法，其中将所述抗体与另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予至所述受试者。
28.根据项27所述的方法，其中所述另外的治疗剂是以下中的一种或多种：烷基化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂。
29.一种用于在体内检测受试者中肿瘤的方法，其包括
(a)向所述受试者给予有效量的根据项1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体被配置为定位于表达L1-CAM的肿瘤，并用放射性同位素标记；
以及
(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。
30.根据项29所述的方法，其中所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。
31.根据项29或30所述的方法，其中使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
32.根据项29至31中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的根据项1至15中任一项所述的抗体。
33.根据项32所述的方法，其中所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇发射体或其任何组合。
34.根据项33所述的方法，其中所述发射β粒子的同位素选自86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。

Claims (10)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：
所述VL包含与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:52中任一者所示的轻链免疫球蛋白可变结构域序列相同的序列，以及
所述VH包含与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:51中任一者所示的重链免疫球蛋白可变结构域序列相同的序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段与L1-CAM蛋白的第6Ig样结构域结合，其中所述第6Ig样结构域具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含选自由以下项组成的组的重链(HC)氨基酸序列和轻链(LC)氨基酸序列：
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(huE72 H1/L1)；
SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:22(huE72 H1/L2)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21(huE72 H2/L1)；
SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22(huE72 H2/L2)；
SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:29(chE72 IgG1)；和
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(huE72 BsAb)。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含亚型的Fc结构域，所述亚型选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其包含引入N297A和K322A的氨基酸取代的IgG1恒定区，或引入S228P氨基酸突变的IgG4恒定区。
5.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
8.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原结合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
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