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CN119158000A - 一种用于治疗肺纤维化的药物 - Google Patents

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CN119158000A
CN119158000A CN202411327255.9A CN202411327255A CN119158000A CN 119158000 A CN119158000 A CN 119158000A CN 202411327255 A CN202411327255 A CN 202411327255A CN 119158000 A CN119158000 A CN 119158000A
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pulmonary fibrosis
alveolar
idiopathic pulmonary
lung
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CN202411327255.9A
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姚柳笛
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Shanghai Seme Cell Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Seme Cell Technology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物，具体地，本发明提供一种膜联蛋白A5在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的组合物的用途。在本发明中，膜联蛋白A5可以有效地治疗/减缓特发性肺纤维化、降低肺间质病变程度、抑制成纤维细胞的分化及胶原的沉积、降低促炎因子的释放、维持肺泡上皮正常的形态。

Description

一种用于治疗肺纤维化的药物
技术领域
本发明涉及蛋白质药物领域，尤其涉及一种膜联蛋白A5在治疗特发性肺纤维化方面的应用。
背景技术
纤维化是诸多慢性退行性疾病的标志之一，是当前人口致死的重要原因。全球总计有超过300万特发性肺纤维化(IPF)患者，其发生率与胃癌、脑癌相似，且近20年来的发病率成倍增长。研究显示，中老年男性是疾病主要涉及的人群。IPF的早期症状具有隐匿性，随着疤痕的积累，其症状通常需要数年甚至数十年才逐渐出现，常见的症状包括呼吸困难、干咳、疲劳、体重减轻、手指杵状。由于患者存在异质性以及症状缺乏特异性，目前IPF的诊断需要通过胸部HRCT和肺组织病理学联合诊断来排除其他间质性肺病，期间通常需要1-2年的时间。延后的诊断极大的影响了IPF患者的生存，其中位生存期仅2-3年。在中国，目前尚未有已经公开的大型流行病学调查涉及IPF的发病率，但由于庞大的人口基数以及老龄化趋势，IPF给我国个人、家庭、社会以及公共卫生资源造成的负担仍不容小觑。
IPF的治疗方案具有局限性，由于造成的肺功损伤不可逆转，肺移植仍然是唯一能有效延长患者生存的治疗手段。据不完全统计，目前至少有几十种治疗IPF的药物正在开发中，其中少数已经进入了临床II期和III期试验，但其有效性和安全性仍需探索。其中包括重组人穿透素-2(PTX-2)、抗结缔组织生长因子(CTGF)抗体、溶血磷脂酸(LPA)抑制剂、磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂。这些药物直接或间接参与调控肺部炎症因子的释放、上皮细胞的受损与激活、成纤维细胞的聚集和分化，进而维持IPF患者的肺功能。吡非尼酮和尼达尼布是临床上仅有的两种获得FDA批准的药物。这两种药物虽然能够有效延缓肺功能下降和纤维化的进程，但其并不能治愈或逆转特发性肺纤维化，因此对于重度IPF患者疗效不佳。此外，药物市场价格高，服药后不能中断，也给IPF患者及其家庭带来了沉重的经济负担。因此，临床上对新疗法的需求亟待满足。
因此，本领域需要一种治疗特发性肺纤维化的新药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种膜联蛋白A5在治疗肺纤维化，尤其是特发性肺纤维化的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种膜联蛋白A5在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的组合物的用途。
在另一优选例中，所述特发性肺纤维化为选自下组的一种或多种因素引发的特发性肺纤维化：感染、环境暴露、吸烟老龄化、遗传和基因突变。
在另一优选例中，所述特发性肺纤维化为特发性肺间质纤维化。
在另一优选例中，所述特发性肺纤维化为肺泡上皮细胞微损伤导致的特发性肺纤维化。
在另一优选例中，所述特发性肺纤维化为药物治疗特发性肺纤维化。
在另一优选例中，在所述药物治疗特发性肺纤维化中，所述药物选自下组：靶向药物、免疫药物、化学药物、中药，或其组合。
在另一优选例中，所述药物为抗癌药物或抗生素，例如博来霉素。
在另一优选例中，所述纤维化发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺间质、肺小动脉的一种或多种部位或其血管周围。
在另一优选例中，所述预防和/或治疗特发性肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(1)改善肺功能或维持肺正常生理功能，优选改善用力肺活量的降低；
(2)维持正常肺部损伤修复的潜力；
(3)减少炎细胞浸润，其中所述炎细胞浸润发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡、肺间质的一种或多种部位或其血管周围；
(4)减少纤维化，其中所述纤维化发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺间质的一种或多种部位或其血管周围；
(5)减少病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤；
(6)抑制促纤维化生物标志物表达；
(7)抑制促炎因子的释放和/或表达，其中所述促炎因子的释放，发生在肺泡支气管灌洗液、肺组织匀浆一种或多种部位；
(8)抑制肺组织中成纤维细胞分化或成纤维-肌成纤维的转化和分化；
(9)抑制肺组织中胶原的沉积或过度沉积；
(10)维持肺组织中肺泡上皮细胞形态；
(11)维持肺组织中肺泡上皮表型标志物的表达；
(12)降低肺纤维化中肺组织中羟脯氨酸的表达；
(13)抑制肺组织中促纤维化因子表达。
在另一优选例中，所述的细支气管和肺小动脉损伤包括选自下组的一个或多个特征：
(1)减少肺泡出血；
(2)减少肺上皮细胞的增生，其中所述上皮细胞增生发生在细支气管、终末细支气管一种或多种部位；
(3)减少管壁外膜肉芽组织增生，其中所述管壁外膜肉芽组织发生在细支气管、终末细支气管一种或多种部位；
(4)减少炎细胞浸润，其中所述炎细胞浸润发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡、肺间质、肺小动脉的一种或多种部位或其血管周围；
(5)减少水肿，其中所述水肿发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管的一种或多种部位或其血管周围；
(6)减少内皮细胞剥脱，其中所述内皮细胞剥脱生发生在肺小动脉。
在另一优选例中，所述表达包括蛋白和/或mRNA水平上的表达。
在另一优选例中，所述纤维化生物标志物包括纤维连接蛋白1(FN1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA、ACTA2)、I型胶原(COL-1，COL1A1)、III型胶原(COL-3，COL3A1)、V型胶原(COL-5，COL5A1)的一种或多种。
在另一优选例中，所述促炎因子包括白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的一种或多种。
在另一优选例中，所述胶原包括I型胶原(COL-1，COL1A1)、III型胶原(COL3，COL3A1)、V型胶原(COL5，COL5A1)的一种或多种。
在另一优选例中，所述肺泡上皮表型标志物包括肺表面活性蛋白C(SurfactantProtein C，SFTPC)。
在另一优选例中，所述维持肺正常生理功能是指相比正常肺的生理功能下降了不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，例如8％、5％、2％、1％。
在另一优选例中，所述维持肺组织中肺泡上皮细胞形态是指相比正常肺组织的肺泡上皮细胞形态改变了不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，例如8％、5％、2％、1％。
在另一优选例中，所述抑制促炎因子表达包括TNFα、IL-1β在mRNA水平上的表达。
在另一优选例中，所述抑制肺组织中胶原的沉积或过度沉积包括抑制I型胶原(COL1)、III型胶原(COL3)mRNA水平上的表达。
在另一优选例中，所述抑制成纤维细胞分化包括抑制成纤维细胞的分化标志物α-SMA表达。
在另一优选例中，所述特发性肺纤维化中肺泡上皮增生包括肺泡壁增厚和/或形成透明膜。
在另一优选例中，所述预防和/或治疗特发性肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(1)抑制肺泡上皮中的上皮间质转化(EMT)标志物的表达；
(2)抑制肺泡上皮细胞凋亡；
(3)促进肺泡上皮细胞增殖；
(4)促进肺泡上皮细胞迁移；
(5)抑制肺泡上皮中的促纤维化因子表达。
在另一优选例中，所述肺泡上皮为二型肺泡上皮。
在另一优选例中，所述肺泡上皮细胞为二型肺泡上皮细胞(ATII)。
在另一优选例中，所述抑制肺泡上皮中的上皮间质转化(EMT)标志物的表达包括抑制Vimentin的表达和/或促进E-cadherin的表达。
在另一优选例中，所述肺泡上皮中的促纤维化因子包括TNF-α、SP-A、SP-D、TGFβ1、Osteopontin、CXCL12、CCL2、MMP-1、MMP-7的一种或多种。
在另一优选例中，所述预防和/或治疗特发性肺纤维化包括减少肺组织中IL-6，IL-17A促炎症因子的表达和/或增加抑炎因子(如IL-10)的表达。
在另一优选例中，所述预防和/或治疗特发性肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(1)维持正常肺部损伤修复的潜力；
(2)保护正常肺间质结构；
(3)减缓用力肺活量(FVC)的降低；
(4)减缓肺间质病变；
(5)抑制肺组织中胶原的过度沉积；
(6)抑制肺组织中成纤维-肌成纤维的转化；
(7)抑制肺组织中上皮间质的转化；
(8)抑制肺组织中肺泡上皮的凋亡；
(9)促进肺组织中肺泡上皮的迁移；
(10)促进肺组织中肺泡上皮的增殖。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抗光解剂、pH调节剂、乳化剂、抑菌防腐剂、络合剂、填充剂、黏合剂、崩解剂和润滑剂中的一种或多种。
在另一优选例中，所述组合物还包括其它预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物。
在另一优选例中，所述其它预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物选自下组：吡非尼酮、尼达尼布，或其组合。
在另一优选例中，所述组合物的剂型包括固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型包括片剂、含片、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、粉雾剂、气雾剂或喷雾剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为呼吸道给药制剂，例如气道内雾化剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为注射剂，例如静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射制剂、腹腔注射制剂。
在另一优选例中，所述组合物通过注射施用、雾化吸入给药、或口服施用的方式给药。
在另一优选例中，在所述组合物中，所述膜联蛋白A5的质量百分比为0.1-99.9wt％，优选1-99.9wt％，例如10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％。
在本发明的第二方面，提供了一种预防和/或治疗特发性肺纤维化的方法，所述方法包括：对有此需要的对象施用膜联蛋白A5。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括猪、牛、羊、大鼠、小鼠或兔。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了实施例1中各组动物肺泡灌洗液(BALF)中肺促进纤维化因子在mRNA水平上的表达结果。&p<0.05vs.空白对照组；*p<0.05vs.模型对照组。
图2显示了实施例1中各组动物肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数结果。&p<0.05vs.空白对照组；*p<0.05vs.模型对照组。
图3显示了实施例1中各组羟脯氨酸含量检测结果。&p<0.05vs.空白对照组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组。
图4显示了实施例1中各组肺组织匀浆中胶原沉积以及纤维化标志物在mRNA水平上的表达结果。&p<0.05vs.空白对照组；*p<0.05vs.模型对照组。
图5显示了实施例1中各组左肺H&E病理染色及相关评分结果。注：a：细小动脉；b：细支气管；黑色箭头：炎细胞浸润。&&&&p<0.0001vs.空白对照组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组。
图6显示了实施例1中各组左肺H&E病理染色及相关评分结果。注：a：细小动脉；b：细支气管；黑色箭头：炎细胞浸润。&&&&p<0.0001vs.空白对照组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组。
图7显示了实施例1中各组Masson染色染色及相关评分结果。注：绿色箭头：正常肺泡壁；蓝色箭头：纤维组织沉积；黄色箭头：部分肺泡结构消失，残存肺泡壁增厚；棕色结构：肺泡壁结构完整，肺泡壁增厚。&&&&p<0.0001vs.空白对照组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组。
图8显示了实施例2中各组对二氧化硅诱导后人二型肺上皮细胞的细胞形态的影响的结果。&&p<0.01vs.空白对照组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现膜联蛋白A5对于特发性肺纤维化具有治疗作用。本发明通过系统的动物实验与细胞试验证明，本发明公开的膜联蛋白A5通过雾化针吸入对于博来霉素诱导的大鼠特发性肺纤维化模型具有优异的治疗和/或延缓肺纤维化的作用。同时，细胞实验证明，A5对于二氧化硅诱导的肺纤维化过程初始阶段的二型上皮损伤具有保护作用，能有效维持二型上皮细胞形态。因此，膜联蛋白A5有望成为治疗特发性肺纤维化的有效手段。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
对于本发明所述的某一指标的“促进”或“增强”是指与不存在膜联蛋白A5时相比，膜联蛋白A5将该指标提高了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
对于本发明所述的某一指标的“抑制”或“降低”是指与不存在膜联蛋白A5时相比，膜联蛋白A5将该指标降低了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
如本文所用，术语“治疗特发性肺纤维化”并不需要100％治愈，可以包括缓解病症的进展、降低特发性肺纤维化的病变程度。
膜联蛋白A5
膜联蛋白家族annexin(缩写为Anx)是真核生物细胞内钙离子的传感器，在钙离子活化的条件下可与膜磷脂进行可逆的结合。膜联蛋白家族种类繁多，共有12个不同的膜联蛋白基因(ANXA1-ANXA11和ANXA13)，它们散于在整个人类基因组(染色体1、2、4、5、8-10和15)中。膜联蛋白家族具有独特的-COOH核心结构，由4个高度同源的膜联蛋白重复序列组成，每个重复序列包含多个5α螺旋结构，当与短环相连后，形成略微弯曲的平面。膜联蛋白与Ca2+在其凸面上结合，并发生构象变化，使其重复序列中心的亲水位点能与周围细胞膜上带负电荷的磷脂结合，参与细胞膜的受损与修复。研究表明，膜联蛋白在膜修复系统的各个步骤中起着重要作用，通过胞吐(如ANXA2)，内吞(如ANXA1、2、6、8)，微粒脱落(如ANXA1、6、7)等机理介导。
AnxA5目前主要用作检测细胞凋亡的试剂，体外研究发现，虽然其具有抗炎症、促进纤溶、抗血栓等多种功能，但在特发性肺纤维化致病过程中的发挥的功能却不是很清楚。膜联蛋白A5的因其具有维持正常肺部损伤修复的潜力，为缓解纤维化的疾病的进展提供了方向，有望成为治疗的IPF的新制剂。
可用于本发明的膜联蛋白A5并没有特别限制，可以是来源于任何生物体的膜联蛋白A5，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人、猴、大鼠或小鼠。本发明的膜联蛋白还可以是其功能类似物，如与人膜联蛋白具有50％、60％、70％、75％以上，如80％、85％以上，90％以上，或甚至更优选95％或99％以上的同一性的蛋白质。
此外，应理解，“膜联蛋白A5”包括野生型或突变型(包括截断型)的膜联蛋白A5，只要该突变型膜联蛋白A5保留或保持了野生型膜联蛋白A5的解毒活性也可用于本发明。此外，膜联蛋白还可以是天然膜联蛋白的多聚体，融合蛋白，或其经化学修饰的变体(如PEG修饰)，前提是这些变体拥有野生型膜联蛋白的活性。本发明中的膜联蛋白A5为申请人按照以下序列构建提取的，人源的膜联蛋白A5序列为登录号Accession：P08758，Version：P08758.2。
特发性肺纤维化
研究普遍认为，感染、环境暴露、吸烟和基因突变老龄化等多种因素可引发肺泡上皮细胞的微损伤，诱导纤维化的发生。异常激活的肺泡上皮细胞分泌大量的促纤维化因子，这些因子一方面诱导上皮细胞的进一步损伤。另一方面，通过旁分泌通路，促使成纤维细胞聚集到损伤部位并增殖、分化，形成高度收缩的肌成纤维细胞，最终促进细胞外基质(ECM)的沉积。
受损伤后，异常激活的上皮细胞会分泌一些促纤维化调节因子，推动形成高度收缩的肌成纤维细胞。在这种情况下，异常的肺泡上皮有助于细胞外基质沉积和疾病进展。这些促纤维化介质主要包括生长因子、基质金属蛋白酶(MMP)、趋化因子、凝血因子。肺上皮细胞受损伤后炎症因子会高表达，在特发性肺纤维化中广泛被检测到。
但是，与肺炎不同，炎症的高表达在特发性肺纤维化中，却是必要不充分条件，仅抗炎不足以干预特发性肺纤维化的进程。
尽管关于特发性肺纤维化的发病机制仍有争议，但人们普遍认为，IPF疾病的发生发展是由上皮驱动的微损伤诱导的。肺泡上皮细胞微损伤，特别是二型上皮细胞的的损伤，最终导致肌成纤维细胞活化。异常激活的肌成纤维细胞促进细胞外基质的沉积，是目前诊断特发性肺纤维化的唯一标准。
用途
本发明意外地发现，膜联蛋白A5可以有效地治疗/减缓特发性肺纤维化、减少病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤抑制炎症反应、重塑肺功能、降低肺间质病变程度、抑制成纤维细胞的分化及胶原的沉积、抑制上皮间质转化(EMT)、维持肺泡上皮正常的形态、降低肺成纤维细胞的分化以及防止胶原的过度沉积，因此具有预防和/或治疗特发性肺纤维化的效果。
具体地，本发明提供了一种膜联蛋白A5在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物组合物中的用途。
所述的药物组合物为治疗常见特发性肺纤维化类型的药物组合物，具体包括感染、环境暴露、吸烟老龄化、遗传和基因突变等多种因素引发的特发性肺纤维化类型。
所述的缓解特发性肺纤维化的发展的进程，治疗特发性肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(a)改善博来霉素诱导的特发性肺纤维化：改善肺生理功能、减少肺组织匀浆中促纤维化因子的表达、降低纤维化的病变程度、抑制肺组织中的成纤维细胞的分化以及胶原的沉积；
(b)降低了上皮间质转化(EMT)标志物的表达；抑制了二型肺泡上皮细胞(ATII)中促纤维化因子的分泌；减少了ATII细胞的凋亡；增强了ATII细胞的迁移；促进了ATII细胞的增值；
(c)对TGFβ诱导的特发性肺纤维化：抑制了人胚胎肺成纤维细胞(MRC5)细胞的分化；抑制了胶原的表达。
优选地，治疗肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(a)改善博来霉素诱导的肺纤维化：改善肺生理功能、减少肺组织匀浆以及肺泡支气管灌洗液中促炎症因子的表达、降低纤维化的病变程度、降低肺组织匀浆中羟脯氨酸的含量、抑制肺组织中的成纤维细胞的分化以及胶原的沉积；
(b)降低了降低了上皮细胞的损伤以及维持了二型细胞正常的形态。
所述的药物组合物为抑制纤维化的药物组合物。
所述的药物组合物为提高特发性肺纤维化中肺功能的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物为缓解纤维化中用力肺活量降低的药物组合物。
所述的药物组合物为缓解特发性肺纤维化病变程度的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物为降低特发性肺纤维化中肺泡上皮增生(肺泡壁的增厚以及透明膜的形成)、炎细胞浸润(支气管/细支气管/终末细支气管/呼吸性细支气管/肺泡管/肺泡囊/血管周围)、肺泡出血等的药物组合物。
所述的药物组合物为减少促纤维化因子的表达的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物为抑制特发性肺纤维化中IL-6、IL-10、和/或IL-17A等炎症相关因子表达的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物为抑制肺纤维化中IL-1β、TNF-α表达的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制肺组织中的成纤维细胞的分化的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物为抑制特发性肺纤维化中肺组织alpha-SMA表达的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制肺组织中的羟脯氨酸含量的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制肺组织中的胶原的沉积的药物组合物。优选地，所述的药物组合物抑制肺纤维化中I型以及III型胶原的表达。
所述的药物组合物为保护肺泡人二型肺泡上皮稳态的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制肺组织中的胶原的沉积的药物组合物。优选地，所述的药物组合物抑制特发性肺纤维化中胶原的染色。
所述的药物组合物为保护肺泡人二型肺泡上皮稳态的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制人二型肺泡上皮间质转化(EMT)的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物在特发性肺纤维化过程中降低人二型肺泡上皮细胞中Vimentin的高表达和/或促进E-cadherin的表达。
所述的药物组合物为抑制人二型肺泡上皮中促纤维化因子的分泌的药物组合物。
优选地，所述的药物组合物在特发性肺纤维化过程中，降低人二型肺泡上皮细胞中TNF-α、SP-A、SP-D、TGFβ1、Osteopontin、CXCL12、CCL2、MMP-1MMP-7的一种或多种促纤维化因子的分泌。
所述的药物组合物为降低人二型肺泡上皮凋亡的药物组合物。
所述的药物组合物为促进人二型肺泡上皮迁移的药物组合物。
所述的药物组合物为增强人二型肺泡上皮增殖的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制人胚胎肺成纤维细胞分化和/或活化的药物组合物。优选地，所述的药物组合物为抑制人胚胎肺成纤维纤维细胞中alpha-SMA表达的药物组合物。
所述的药物组合物为抑制人胚胎肺成纤维细胞胶原沉积表达的药物组合物。优选地，所述的药物组合物为抑制人胚胎肺成纤维细胞中Type I collagen(COL-1)、Type IIIcollagen(COL-3)、Type V collagen(COL-5)的一种或多种的表达的药物组合物。
优选地，所述药物组合物为具备下述一种或多种功能的组合物：
(1)维持正常肺部损伤修复的潜力；
(2)保护正常肺间质结构；
(3)降低用力肺活量(FVC)降低的速率；
(4)减缓肺间质病变的程度；
(5)抑制肺组织中胶原的过度沉积；
(6)降低肺组织中成纤维-肌成纤维的转化；
(7)抑制肺组织中上皮间质的转化；
(8)抑制肺组织中肺泡上皮的凋亡水平；
(9)增加肺组织中肺泡上皮的迁移和增殖水平。
优选地，所述药物组合物为具备下述一种或多种功能的组合物：
(1)改善肺功能或维持肺正常生理功能；
(2)减少纤维化，其中所述纤维化发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺间质、肺小动脉的一种或多种部位或其血管周围；
(3)减少病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤；
(4)抑制促纤维化生物标志物表达；
(5)抑制促炎因子的释放，其中所述促炎因子的释放，发生在肺泡支气管灌洗液、肺组织匀浆一种或多种部位；
(6)抑制成纤维细胞分化；
(7)抑制肺组织中胶原的沉积；
(8)维持肺组织中肺泡上皮细胞形态；
(9)维持肺组织中肺泡上皮表型标志物的表达；
(10)降低肺纤维化中肺泡上皮增生组织中羟脯氨酸的表达。
组合物和施用
本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、保健组合物、膳食补充剂等。
代表性地，可将本发明的无细胞脂肪提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、注射剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
本发明的组合物还可以包括药学上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用、吸入给药，优选的施用方式为注射施用和吸入给药。
本发明所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。代表性地，用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂。
用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部施用或给药的本发明组合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明的组合物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物联合施用或给药。
施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、羊、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1-1000mg，优选1-600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
本发明首次公开了膜联蛋白A5在预防和/或特发性肺纤维化方面的用途。本发明通过系统的动物实验与细胞实验证实，本发明公开的膜联蛋白A5通过雾化针吸入的方式具有治疗/延缓特发性肺纤维化的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
可用于本发明的膜联蛋白并没有特别限制，可以是来源于任何生物体的膜联蛋白，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人、猴、大鼠或小鼠。本发明的膜联蛋白还可以是其功能类似物，如与人膜联蛋白具有50％、60％、70％、75％以上，如80％、85％以上，90％以上，或甚至更优选95％或99％以上的同一性的蛋白质；应理解，“膜联蛋白”包括野生型或突变型(包括截断型)的膜联蛋白，只要该突变型膜联蛋白保留或保持了野生型膜联蛋白的解毒活性也可用于本发明。此外，膜联蛋白还可以是天然膜联蛋白的多聚体，融合蛋白，或其经化学修饰的变体(如PEG修饰)，前提是这些变体拥有野生型膜联蛋白的活性。本申请中的中膜联蛋白A5,为公司按照一下序列构建提取的。
人源的膜联蛋白A5序列如下：登录号Accession：P08758的膜联蛋白序列
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD(SEQ ID No:1)
实施例1：膜联蛋白A5对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响
1.实验动物：健康雄性SD大鼠35只，试验动物饲养在SPF级屏障系统内，实验时体重为270g-290g。动物使用合格证号：SYXK(自苏)2022-0005，遵循国际标准温、湿、光控制系统。实验动物操作方案经由IACUC委员会联合审批确认。严格遵循相关标准操作规程(SOP)进行管理和操作。
2.实验材料：
实验器材包括：电子天平(NVT1601B/3，OHAUS)、多通道麻醉机(AMS，Gene&I)、电子天平(AUW120D，SHIMADZU)、小动物呼吸机(R407，RWD Life Science)、手术显微镜(XT-X-4A，新诚公司)、全自动血液分析仪(XS800i，希森尔康公司)、纯水仪(arium pro，Sartorius)、低温离心机(Legend Micro17R，Thermo SCIENTIFIC)、数控超声波清洗仪(KQ-100DE，昆山市超声仪器有限公司)、烘箱(DHG-9055A，上海一恒科学仪器有限公司)、显微镜(ECLIPSE E100，Nikon)、切片扫描仪(NANO Zoomer S210，HAMAMATSU)、自动染色机(ST5020，LEICA)、石蜡包埋机(RM2235，LEICA)、石蜡切片机(RM2235，LEICA)、组织脱水机(HistoCore PEARL，LEICA)。
实验试剂包括：生理盐水(浙江都邦药业股份有限公司)、注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社)、甲基纤维素钠(阿拉丁)、Tween 80(Sigma)、PBS缓冲液(Biosharp)、美洛昔康(齐鲁动保)、血细胞分析用溶血剂(浙江鑫科医疗科技有限公司)、血细胞分析用稀释液(浙江鑫科医疗科技有限公司)、血细胞分析用染色液(浙江鑫科医疗科技有限公司)、BIBF1120(Chembest)膜联蛋白A5(上海萨美细胞技术有限公司)、Tissue RNAPurification Kit PLUS(Ezbioscience)、Color Reverse Transcription Kit(EZBioscience)、2×Color SYBR Green qPCR Master Mix(EZBioscience)、大鼠荧光定量PCR引物(COL1A1/COL3A1/ACTA2/ACTB/TNFα/IL-1β)(生工生物工程(上海)股份有限公司)羟脯氨酸Hyp测定试剂盒碱水解法(南京建成)。
3.实验方法：
3.1实验动物分组：实验设置空白对照组、模型对照组、阳性对照组、实验治疗组(低浓度)，实验治疗组(高浓度)每组7只大鼠。
3.2大鼠肺纤维化模型(双侧)模型的建立：Day1，Day8两次造模，以建模当日为Day1，建模前一天称量动物体重，随机分成G1假模型组(n＝7)和模型动物组(n＝28)，模型动物组分为模型对照组(n＝7)、阳性对照组(n＝7)、实验治疗组(低浓度，n＝7)、实验治疗组(高浓度，n＝7)，大鼠用2.5％异氟烷进行吸入麻醉后，进行双盲造模，建立大鼠肺纤维化模型(双侧)；将模型对照组、阳性对照组、实验治疗组(低浓度)、实验治疗组(高浓度)的所有动物打开颈部手术通路，均以气管注射方式给予博来霉素(1.5mg/kg，1mL/kg)进行模型构建，手术后缝合创口。手术完成后，将动物置于37℃电热毯保温至动物完全苏醒，确认能够自由采食和饮水后将动物返回饲养笼正常饲养，并连续三天皮下注射美洛昔康，缓解疼痛。Day8模型动物组(n＝28)再次气管滴注博莱霉素(1.5mg/kg)重复以上所有建模步骤。
3.3药物干预：模拟临床拟用给药途径，根据最近称量的动物体重，D14建模完成后，根据动物体重随机分组，每组7只实验动物，即G1空白对照组、G2模型对照组、G3实验治疗低浓度组、G4实验治疗组高浓度组、G5阳性对照组。分组完成后，所有动物在从第15天开始按照各组的频次和方式进行给药，进行治疗干预，直至第28天。实验期间，每天记录小鼠的体重变化、饮食饮水量，观察小鼠的活动状况、毛色变化、呼吸平喘状态等。其中，G1空白对照组：两天一次(Q2D)，雾化针吸入给予市售生理盐水(250μL/只)；G2模型对照组：两天一次(Q2D)，雾化针吸入给予市售生理盐水(250μL/只)；G3实验治疗低浓度组：两天一次(Q2D)，雾化针给予膜联蛋白A5(1.5mg/kg，250μL/只)；G4实验治疗组高浓度组：每天一次(QD)，雾化针给予膜联蛋白A5(1.5mg/kg，250μL/只)；G5阳性对照组：每天一次(QD)，口服给予尼达尼布BIBF1120(100mg/kg，10mL/kg)。
3.4试验终点：
实验第29天，动物经异氟烷深度麻醉后，打开动物腹腔，打开胸腔，充分暴露肺脏。结扎左侧支气管，用氯化钠注射液反复灌洗右肺4次，收集的右肺灌洗液于离心后，收集上清液，-80℃保存待用。离心后的细胞沉淀用PBS缓冲液重悬，分装2份，其中1份再次离心，弃掉上清液，细胞沉淀进行RNA的提取、逆转录、以及荧光定量PCR检测；另外一份用于白细胞计数及分类。右肺灌洗后，上叶、下叶和副叶组织分开剪取，不脱水，迅速放入液氮中冷冻，-80℃保存，用于后续的检测及羟脯氨酸含量的测定；右肺中叶用超声研磨机匀浆后，进行RNA的提取、逆转录、以及荧光定量PCR检测。左肺使用生理盐水经将血迹冲洗干净后离体灌注10％福尔马林，在固定液中保存48h后进行后续的石蜡包埋、切片染色和病理检测。
3.5实验结果：
1.各组动物肺泡灌洗液(BALF)中肺促进纤维化因子在mRNA水平上的表达：大鼠BALF细胞沉淀，用PBS洗一遍后，离心，根据EZB的操作说明进行RNA的提取、逆转录、以及荧光定量PCR检测其促炎因子(IL-1β、TNFα)的表达。
结果显示，BALF中促炎因子(IL-1β、TNFα)表达均于造模后显著提高(p<0.05)，与模型对照组动物比较，实验组动物BALF中炎性因子表达减少，均具有统计学差异，改善效率与阳性对照组(尼达尼布)相当。具体结果如下：结果如图1所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中促炎因子(IL-1β)在mRNA水平上的表达显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度组、实验治疗高浓度组、以及阳性对照组BALF中其表达显著降低(p<0.05)。与阳性对照组相比，实验治疗组在抑制mRNA水平上IL-1β的表达的能力更佳。结果如图1所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中促炎因子(TNFα)在mRNA水平上的表达显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度以及实验治疗高浓度组BALF中TNFα的表达显著降低(p<0.05)。与阳性对照组相比，实验治疗组在抑制mRNA水平上TNFα的表达的能力更佳。
2.各组动物肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数：试验终点收集BALF灌洗液，离心重悬后进行炎细胞分类计数。
结果如图2所示，与空白对照组相比，BALF中白细胞计数(WBC)均于造模后显著提高(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度组BALF中白细胞计数(WBC)显著降低(p<0.05)、实验治疗高浓度组、以及阳性对照组BALF中WBC数量无明显变化(p<0.05)。与阳性对照组相比，低浓度实验治疗组降低白细胞计数的能力更佳。而阳性对照组甚至相比模型对照组的白细胞计数进一步增加。
3.羟脯氨酸含量检测：右肺灌洗后，取上叶、下叶和副叶部分组织按照羟脯氨酸含量检测试剂盒说明书进行操作和检测肺组织中羟脯氨酸含量检测。
结果显示，各组动物羟脯氨酸的含量促均于造模后显著提高，与模型对照组动物比较，治疗组动物羟脯氨酸含量均值降低，且具有统计学差异，其改善效率与阳性对照组(尼达尼布)相当。具体结果如图3所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度、实验治疗高浓度组以及阳性对照组肺组织中羟脯氨酸的含量达显著降低(p<0.05，p<0.01，p<0.01)。
4.肺组织匀浆中胶原沉积以及纤维化标志物在mRNA水平上的表达：取右肺部分组织按照组织RNA提取试剂盒以及RT-PCR检测试剂盒说明书进行操作，检测肺组织匀浆中典型纤维化生物标志物mRNA水平上的表达(ACTA2/COL1A1/COL3A1)。
结果显示，各组动物肺组织匀浆中在mRNA的水平上的胶原沉积以及纤维化标志物均于造模后显著提高，与模型对照组动物比较，实验组动物能显著抑制mRNA水平上胶原沉积以及纤维化标志物表达，具有统计学差异，其抑制效率与阳性对照组(尼达尼布)相当。
具体结果如图4所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织匀浆中I型胶原COL1A1在mRNA层面上的表达显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度组中其表达显著降低(p<0.05)。与阳性对照组相比，实验治疗组在降低在mRNA层面上COL1A1的表达的效果更佳。
结果如图4所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织匀浆中III型胶原COL3A1在mRNA层面上的表达显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度组中其表达显著降低(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗高浓度组中其表达显著降低(p<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组组中其表达显著降低(p<0.05)。与阳性对照组相比，实验治疗组在降低在mRNA层面上COL3A1的表达的效果相当。
结果如图4所示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织匀浆中纤维化标志物α-SMA(ACTA2)在mRNA层面上的表达显著增加(p<0.05)；与模型对照组相比，实验治疗低浓度组中其表达显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比，实验治疗高浓度组中其表达显著降低(p<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组组中其表达显著降低(p<0.05)。与阳性对照组相比，实验治疗组在抑制mRNA层面上纤维化标志物α-SMA(ACTA2)的表达的效果相当。
5.左肺H&E病理染色：将左肺组织制备石蜡组织块，切片(3～4μm)，进行H&E染色。H&E染色：取肺组织切片脱蜡至水(二甲苯，无水乙醇，90％乙醇脱水，水洗)。然后通过苏木素染色，盐酸分化，水洗以及伊红染色，最后进行脱水和透明处理(95％乙醇，无水乙醇，二甲苯)，处理结束后，在组织处滴加中性树脂，盖上盖玻片封片，次日，染色切片通过NanoZoomer Digital Pathology(S210)切片扫描仪进行整片扫描。在病变区域内和病变区域边缘各随机分散选择5个视野，对终末细支气管以及伴行微小肺动脉的损伤和炎症变化分别进行半定量评分，评分标准如表1、表2所示。评价依据为：肺泡上皮增生(肺泡壁的增厚以及透明膜的形成)、炎细胞浸润(支气管/细支气管/终末细支气管/呼吸性细支气管/肺泡管/肺泡囊/血管周围)、肺泡出血、淤血。
表1终末细支气管损伤和炎症浸润病理评价指标
表2细小肺动脉损伤和炎症浸润病理评价指标
结果显示，实验动物在造模后病灶内和病灶边缘细支气管、终末细支气管上皮细胞存在不同程度的增生，炎细胞浸润，管壁外膜肉芽组织增生，肺小动脉表现为内皮细胞剥脱和炎细胞浸润(图5、图6)；与模型对照组相比，治疗组在病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤上有明显改善作用。
具体结果如图5和图6所示，与空白对照组相比，模型对照组病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤评分均显著升高(p<0.0001，p<0.0001)(图5、图6)；与模型对照组相比，低浓度治疗组、高浓度治疗组、阳性对照组组病灶内细支气管和肺小动脉损伤评分均显著降低(p<0.01，p<0.05，p<0.01)(图5)；与模型对照组相比，低浓度治疗组、高浓度治疗组、阳性对照组组病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤评分均显著降低(p<0.05，p<0.01，p<0.05)(图6)；且治疗组抑制效率与阳性对照组(尼达尼布)相当(图5、图6)。
6.组织病理学检查-Masson染色：取左肺肺组织切片，脱蜡至水(二甲苯，无水乙醇，90％乙醇脱水，水洗)。然后通过Weiger氏铁苏木素，水洗，0.5％盐酸酒精分化，水洗，丽春红酸性品红液染色，水洗，1％磷钼酸水溶液染色，苯胺蓝液或亮绿液复染，1％冰醋酸，最后进行脱水和透明处理(95％乙醇，无水乙醇，二甲苯)，处理结束后，在组织处滴加中性树脂，盖上盖玻片封片，次日通过NanoZoomer Digital Pathology(S210)切片扫描仪进行整片扫描。在病变区域内随机选择10个面积大小为1mm2的视野，根据Ashcroft评分系统在双盲条件下由病理学家进行半定量评分(表3)。
表3肺纤维化病理评价指标
Masson染色结果显示，模型组和各给药组存在不同程度的纤维组织沉积，部分肺泡结构消失，肺泡壁增厚(图7)。Ashcroft评分结果显示，与空白对照组相比，模型对照组组肺纤维化评分显著升高(p<0.0001)，与模型对照组相比，治疗组低浓度组、治疗组高浓度组、阳性对照组肺纤维化评分显著降低(p<0.01，p<0.05，p<0.05)(图7)。与阳性对照组相比，各实验治疗组在降低肺纤维化评分的能力相当(图7)。以Ashcroft评分3分为界，计算3分以下(包含3分)和4分以上(包含4分)的肺纤维化程度的百分比，结果显示模型对照组91.43％的病变区域评分在4分及4分以上，与模型对照组相比，治疗组低浓度组、治疗组高浓度组、阳性对照组纤维化评分≤3分占比显著升高(p<0.001，p<0.01，p<0.01)，≥4分占比显著降低(p<0.001，p<0.01，p<0.01)(图7)。
受损伤后，异常激活的上皮细胞会分泌一些促纤维化调节因子，推动形成高度收缩的肌成纤维细胞。在这种情况下，异常的肺泡上皮有助于ECM沉积和疾病进展。与肺炎相同，肺上皮细胞受损伤后炎症因子的高表达，在肺纤维化中广泛被检测到，但与此同时，炎症的高表达在肺纤维化中，却是必要不充分条件(不同于肺炎)，单一抗炎可能不足以干预肺纤维化的进程。尽管关于肺纤维化的发病机制仍有争议，异常激活的肌成纤维细胞促进细胞外基质的沉积，是目前诊断肺纤维化的唯一标准。因此，结合以上结果，膜联蛋白A5可起到良好的抗纤维化作用，雾化针吸入膜联蛋白A5显著改善博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，其治疗效果与尼达尼布相当，为临床上进一步应用膜联蛋白A5治疗肺纤维化提供可靠依据。
实施例2：
膜联蛋白A5对二氧化硅诱导后人二型肺上皮细胞的细胞形态的影响：
人们普遍认为，IPF疾病的发生发展是由上皮驱动的微损伤诱导的。肺泡上皮细胞微损伤，最终导致肌成纤维细胞活化。对于特发性肺纤维化，二氧化硅诱导的肺纤维化为体外实验，作用于二型肺泡上皮细胞，主要比较肺泡上皮的形态及损伤修复程度。
实验方法：以2×105个/孔的细胞量将人原代二型肺泡上皮细胞(武汉赛奥斯生物科技有限公司)接种于6孔板中，用含有2％ FBS原代上皮细胞培养液(武汉赛奥斯生物科技有限公司)进行培养，置于37℃培养箱中培养24小时。细胞用含有0.5％ BSA的原代上皮细胞培养液饥饿处理8小时后，每孔按照100ug/ml加入二氧化硅混悬液(用PBS溶解)，分别使用不同浓度的膜联蛋白A5处理6孔板细胞，浓度设置为：10μg/ml、200μg/ml，继续培养24小时。待培养结束，用显微镜观察二型肺上皮细胞的细胞形态的影响：比较空白对照组、模型对照组、以及实验组二型肺泡上皮细胞的形态的差别。每组细胞用PBS洗2遍后，按照普通细胞RNA提取试剂盒以及荧光定量PCR检测试剂盒说明书进行操作，检测细胞中上皮表型标志物-肺表面活性蛋白C(Surfactant Protein C,SFTPC)在mRNA水平上的表达的变化。
结果显示，与空白对照组相比，二氧化硅混悬液处理后，模型对照组中人肺泡二型上皮细胞发生明显形态转化，由立方形变成伸长的多角形，提示受损的上皮细胞发生上皮间质转化(图8)。高浓度膜联蛋白A5(200μg/ml)的加入有效维持了细胞的上皮形态，对于二氧化硅诱导的二型上皮细胞形态转变具有保护作用(图8)。二氧化硅混悬液处理后，与空白对照组相比，模型对照组中二型上皮细胞表型标志物SFTPC在mRNA水平上的表达降低(p<0.01)(图8)。低浓度以及高浓度的膜联蛋白A5的加入重塑了mRNA水平上SFTPC的表达(p<0.05，p<0.01)，并且高浓度的治疗效果更加，因此，膜联蛋白A5对于二氧化硅诱导的二型上皮细胞的表型具有保护作用(图8)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.膜联蛋白A5在制备预防和/或治疗特发性肺纤维化的组合物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特发性肺纤维化为选自下组的一种或多种因素引发的特发性肺纤维化：感染、环境暴露、吸烟老龄化、遗传和基因突变。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特发性肺纤维化为肺泡上皮细胞微损伤导致的特发性肺纤维化。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特发性肺纤维化为药物治疗特发性肺纤维化。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述预防和/或治疗特发性肺纤维化包括选自下组的一个或多个特征：
(1)改善肺功能或维持肺正常生理功能；
(2)减少炎细胞浸润，其中所述炎细胞浸润发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡、肺间质的一种或多种部位或其血管周围；
(3)减少纤维化，其中所述纤维化发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺间质的一种或多种部位或其血管周围；
(4)减少病灶内和病灶边缘细支气管和肺小动脉损伤；
(5)抑制促纤维化生物标志物表达；
(6)抑制促炎因子的释放，其中所述促炎因子的释放发生在肺泡支气管灌洗液、肺组织匀浆一种或多种部位；
(7)抑制成纤维细胞分化；
(8)抑制肺组织中胶原的沉积；
(9)维持肺组织中肺泡上皮细胞形态；
(10)维持肺组织中肺泡上皮表型标志物的表达；
(11)抑制肺组织中促纤维化因子表达。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的细支气管和肺小动脉损伤包括选自下组的一个或多个特征：
(1)减少肺泡出血；
(2)减少肺上皮细胞的增生，其中所述上皮细胞增生发生在细支气管、终末细支气管一种或多种部位；
(3)减少管壁外膜肉芽组织增生，其中所述管壁外膜肉芽组织发生在细支气管、终末细支气管一种或多种部位；
(4)减少炎细胞浸润，其中所述炎细胞浸润发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡、肺间质、肺小动脉的一种或多种部位或其血管周围；
(5)减少水肿，其中所述水肿发生在支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管的一种或多种部位或其血管周围；
(6)减少内皮细胞剥脱，其中所述内皮细胞剥脱生发生在肺小动脉。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的剂型包括片剂、含片、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、粉雾剂、气雾剂或喷雾剂。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物通过注射施用、雾化吸入给药、或口服施用的方式给药。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括其它预防和/或治疗特发性肺纤维化的药物。
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