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CN119144571A - 类胡萝卜素φ环合酶及其在构建合成异海绵烯工程菌株中的应用 - Google Patents

类胡萝卜素φ环合酶及其在构建合成异海绵烯工程菌株中的应用 Download PDF

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CN119144571A
CN119144571A CN202411088868.1A CN202411088868A CN119144571A CN 119144571 A CN119144571 A CN 119144571A CN 202411088868 A CN202411088868 A CN 202411088868A CN 119144571 A CN119144571 A CN 119144571A
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孙敬翔
信丰学
姜岷
李昕怡
章文明
蒋羽佳
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Nanjing Tech University
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Nanjing Tech University
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Abstract

本发明公开了类胡萝卜素φ环合酶及其在构建合成异海绵烯工程菌株中的应用，所述菌株通过向巴斯德毕赤酵母GS115中导入香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶CrtYB、八氢番茄红素去饱和酶CrtI、3‑羟基‑3‑甲基戊二酰CoA还原酶tHMGR和类胡萝卜素φ环合酶CrtU的表达盒得到；所述CrtE的编码基因序列如SEQ ID No.1所示；所述CrtYB的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述CrtI的编码基因序列如SEQ ID No.3所示；所述tHMGR的编码基因序列如SEQ ID No.4所示；所述CrtU的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。本发明首次利用类胡萝卜素φ环合酶构建了异海绵烯合成巴斯德毕赤酵母菌株，并且实现在酵母内生物合成异海绵烯。

Description

类胡萝卜素φ环合酶及其在构建合成异海绵烯工程菌株中的 应用
技术领域
本发明属于生物工程和合成生物学领域，涉及类胡萝卜素环合酶及其编码的蛋白和应用，具体涉及在合成异海绵烯(isorenieratene)巴斯德毕赤酵母工程菌株中的应用。
背景技术
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养酵母，具有很强的呼吸代谢能力，因此能在简单培养基中生长到非常高的细胞密度，也可以很容易地从摇瓶扩大到大规模生物反应器。巴斯德酵母的综合特性使该菌株在生产类胡萝卜素等化合物方面具有巨大的潜力。最近的研究已经证明，巴斯德氏菌适合于生产透明质酸、类胡萝卜素和倍半萜(+)-诺卡酮等天然产物。与其他微生物相比，巴斯德毕赤酵母安全可靠，可用于食品、医药等众多行业；菌株生长速度快，抗逆性强，培养简单，适合工业化；分子操作平台成熟且遗传工具完善，发展前景广阔。
异海绵烯是一种含苯环端基的稀有类胡萝卜素，其两端的芳香环能够与对称的异戊二烯碳链形成共轭大π键，该结构赋予其更强的稳定性，并且在具有高抗氧化能力的同时，异海绵烯还可以有效吸收紫外辐射，因此具有细胞光保护作用。作为一种结构更稳定、功能更优的类胡萝卜素，异海绵烯在功能食品以及医药等领域展示出巨大的应用潜力。异海绵烯的生物合成主要是通过类胡萝卜素环合酶(CrtU)，由β胡萝卜素催化而来。目前，异海绵烯目前只在少部分光合细菌、亚麻短杆菌、链霉菌和红球菌中检测到并且产量较低，所以亟需构建一种能够高效合成异海绵烯的工程菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种类胡萝卜素环合酶基因及其编码蛋白；
本发明的另一目的是将类胡萝卜素环合酶应用于异海绵烯的合成；
本发明的再一目的在于合成异海绵烯工程毕赤酵母的构建方法；
本发明的再一目的是提供一种异海绵烯的鉴定方法；
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
类胡萝卜素环合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
编码类胡萝卜素环合酶的基因序列。
编码类胡萝卜素环合酶的基因其核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，该基因(从起始密码子到终止密码子)全长1566bp，编码521个氨基酸。
类胡萝卜素环合酶基因的获得：
通过基因组比对分析的方法来寻找目的基因，首先对食醚红球菌(Rhodococcusaetherivorans)的基因组进行NCBI注释，寻找注释为假定的类胡萝卜素环合酶基因的基因，从食醚红球菌中克隆该基因，本发明通过功能验证确定其具有类胡萝卜素环合酶，将具有类胡萝卜素环合酶功能的基因用于后续合成异海绵烯毕赤酵母工程菌株的构建。
所述类胡萝卜素环合酶在异海绵烯合成中的应用。
将所述类胡萝卜素环合酶基因导入到宿主菌中，发酵生产异海绵烯。
一株生产异海绵烯的菌株，向巴斯德毕赤酵母中导入香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶CrtYB、八氢番茄红素去饱和酶CrtI、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶tHMGR和类胡萝卜素环合酶CrtU的表达盒得到；所述CrtE的编码基因序列如SEQ ID No.1所示；所述CrtYB的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述CrtI的编码基因序列如SEQ ID No.3所示；所述tHMGR的编码基因序列如SEQ ID No.4所示；所述CrtU的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。
本发明中，所述香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶CrtYB、八氢番茄红素去饱和酶CrtI的基因来源于红法夫酵母(Xanthophyllomycesdenrorhous)；所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶的基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述类胡萝卜素环合酶基因CrtU来源于食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)。
所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
作为一种优选的实施方式，所述表达盒的启动子为巴斯德毕赤酵母的pGPM1启动子、pPDC1启动子、pMDH3启动子、pADH2启动子或pGAP启动子；所述终止子为巴斯德毕赤酵母的ScCYC1tt终止子、RPP1Btt终止子、RPS2tt终止子、RPL2Att终止子或RPS3tt终止子。
作为一种优选的实施方式，所述重组巴斯德毕赤酵母还表达1个标记基因；所述标记基因选自质粒BB3aK-AF的硫酸卡那霉素编码基因表达盒。
进一步优选地，CrtI启动子为pGPM1，终止子为ScCYC1tt；crtE的启动子为pPDC1启动子，终止子为RPP1Btt；crtYB的启动子为pMDH3，终止子为RPS2tt；tHMGR的启动子为pADH2，终止子为RPL2Att；CrtU的启动子为pGAP，终止子为RPS3tt该质粒携带的硫酸卡那霉素基因用作巴斯德毕赤酵母的筛选标记。
本发明的另一目的在于提供上述菌株的构建方法，将所述CrtE、CrtYB、CrtI以及tHMGR的表达盒通过质粒形式导入所述巴斯德毕赤酵母GS115，整合在巴斯德毕赤酵母菌株基因组上。
包括：
将所述CrtE、CrtYB、CrtI、tHMGR和CrtU的基因片段通过GoldenGate方法插入质粒BB1-23中，得到质粒BB1-23-CrtE、BB1-23-CrtYB、BB1-23-CrtI、BB1-23-tHMGR和BB1-23-CrtU；
将所述质粒BB1-23-CrtI与质粒BB1-12-pGPM1、质粒BB1-34-ScCYC1tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-AB中，得到质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt；
将所述质粒BB1-23-CrtE与质粒BB1-12-pPDC1、质粒BB1-34-RPP1Btt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-BC中，得到质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt；
将所述质粒BB1-23-CrtYB与质粒BB1-12-pMDH3、质粒BB1-34-RPS2tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-CD中，得到质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt；
将所述质粒BB1-23-tHMGR与质粒BB1-12-pADH2、质粒BB1-34-RPL2Att通过GoldenGate方法插入质粒BB2-DE中，得到质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att；
将所述质粒BB1-23-CrtU与质粒BB1-12-pGAP、质粒BB1-34-RPS3tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-EF中，得到质粒BB2-EF-pGAP-CrtYB-RPS3tt；
将所述质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt、BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt、BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt、BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att和BB2-EF-pGAP-CrtYB-RPS3tt通过GoldenGate方法插入质粒BB3aK-AF中，得到质粒BB3aK-AF-L8CrtU；
将所述质粒BB3aK-AF-L8CrtU导入巴斯德毕赤酵母GS115，获取重组菌株。
使用Bpi1酶和T4连接酶通过GoldenGate方法构建所述BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt、BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt、BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt、BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att、和BB2-EF-pGAP-CrtYB-RPS3tt质粒。
使用Bsa1酶和T4连接酶通过GoldenGate方法构建所述BB3aK-AF-L8CrtU质粒。
生产异海绵烯的重组菌株在生产类胡萝卜素中的应用。
所述重组菌株在生产异海绵烯中的应用。
所述应用包括：在25～35℃条件下，将重组菌接种到营养培养基中，发酵培养3～8天，得到发酵产物；
所述营养培养基为：10g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨和10g/L酵母粉；
所述菌株培养温度优选为30℃，发酵时间为4～5天。
在50ml的摇瓶发酵中，最高可以生产159.41mg/L的异海绵烯产量和9.43mg/g的异海绵烯含量。
采用二甲基亚砜和丙酮萃取所述发酵产物，得到异海绵烯。
提取方法包括如下步骤：取2ml发酵液，12000rpm离心3min，超纯水洗涤两遍，弃掉上清液，加2ml二甲基亚砜，震荡摇匀，55℃水浴15min，加入2ml丙酮，55℃水浴避光静置15min，12000rpm 3min取上清待下一步检测。
本发明还提供了一种鉴定重组菌株的产物以及其产量的方法；
采用二甲基亚砜和丙酮萃取所述发酵产物，得到异海绵烯，采用LC-MS分析对产物异海绵烯定性检测并通过高效液相色谱检测其产量。
液相条件为：
色谱柱：C30色谱柱；紫外吸收波长为450nm；进样量10uL；流动相A为甲醇B为甲基叔丁基醚，流速：1mL/min；洗脱程序：第一阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱30分钟，其中流动相A的体积百分含量由95％变为70％，流动相B的体积百分含量由5％变为30％；第二阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱20分钟，其中流动相A的体积百分含量由70％变为50％，流动相B的体积百分含量由30％变为50％；第三阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱10分钟，其中流动相A的体积百分含量由50％变为95％，流动相B的体积百分含量由50％变为5％。
质谱条件为：
采集模式:MSE(低能量/高能量切换扫描)；电喷雾正离子/负离子分别扫描；毛细管电压2KV；锥孔电压40V；雾化气温度:450℃；雾化气流量900L/h；锥孔反吹气50L/h；离子源温度115℃；扫描范围50～1000m/z；扫描速度0.2s；碰撞能量6eV/20～45eV；在线锁定质量；250pg/uL亮氨酸脑啡肽持续进样，流速10ul/min；采集间隔0.5s；采集时间0.5s。
有益效果：
1.本发明首次证明在毕赤酵母中验证类胡萝卜素环合酶CrtU的功能，该基因为一个新功能的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)全长1566bp，可编码521个氨基酸。
2.本发明首次实现了利用工程巴斯德毕赤酵母利用葡萄糖从头合成异海绵烯。通过利用类胡萝卜素环合酶CrtU来构建了能够从头合成异海绵烯的菌株，这也是首次在非天然菌株中合成异海绵烯的报道。
3.本发明提供了重组巴斯德毕赤酵母菌株中异海绵烯的提取及其检测方法。
附图说明
图1为质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt结构图，CrtI启动子为pGPM1，终止子为ScCYC1tt，该质粒携带的氨苄青霉素基因用作大肠杆菌DH5α的筛选标记。
图2为质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt结构图，crtE的启动子为pPDC1启动子，终止子为RPP1Btt，该质粒携带的氨苄青霉素基因用作大肠杆菌DH5α的筛选标记。
图3为质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt结构图，crtYB的启动子为pMDH3，终止子为RPS2tt，该质粒携带的氨苄青霉素基因用作大肠杆菌DH5α的筛选标记。
图4为质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att结构图，HMGR的启动子为pADH2，终止子为RPL2Att，该质粒携带的氨苄青霉素基因用作大肠杆菌DH5α的筛选标记。
图5为质粒BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt结构图，crtU的启动子为pGAP，终止子为RPS3tt，该质粒携带的氨苄青霉素基因用作大肠杆菌DH5α的筛选标记。
图6为质粒BB3aK-AF-L8CrtU结构图，CrtI启动子为pGPM1，终止子为ScCYC1tt；crtE的启动子为pPDC1启动子，终止子为RPP1Btt；crtYB的启动子为pMDH3，终止子为RPS2tt；tHMGR的启动子为pADH2，终止子为RPL2Att；CrtU的启动子为pGAP，终止子为RPS3tt该质粒携带的硫酸卡那霉素基因用作巴斯德毕赤酵母的筛选标记。
图7为重组巴斯德毕赤酵母生产异海绵烯的液相检测图谱。
图8为重组巴斯德毕赤酵母生产异海绵烯的质谱分析图谱。
图9为重组巴斯德毕赤酵母在摇瓶中发酵生产异海绵烯的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例中使用的巴斯德毕赤酵母原始菌株为巴斯德毕赤酵母GS115菌株，可从商业渠道购买。
实施例中使用的引物序列如下表1所示。
表1构建所需引物序列
实施例1基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
根据NCBI上提供的来自X.denrorhous的香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因crtE的核苷酸序列，八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶编码基因crtYB的核苷酸序列和八氢番茄红素去饱和酶编码基因crtI的核苷酸序列经过密码子优化得到的基因序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示，基因密码子经优化后使得外源的基因与巴斯德毕赤酵母底盘适配性更好。根据NCBI上提供的来自酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因序列，以酿酒酵母基因组为模板进行PCR扩增，tHMGR的基因序列如SEQ ID No.4所示。根据申请人上传在NCBI上的食醚红球菌的基因组，寻找注释为假定的类胡萝卜素环合酶基因的基因，从食醚红球菌中克隆该基因，通过功能验证已确定其具有类胡萝卜素环合酶，将具有类胡萝卜素环合酶功能的基因用于后续合成异海绵烯毕赤酵母工程菌株的构建，该环合酶的核酸序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
(二)重组质粒的构建
1、重组质粒BB1-23-CrtI、BB1-23-CrtE和BB1-23-CrtYB的构建：委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成crtI、crtE、crtYB基因序列；重组质粒BB1-23-tHMGR以酿酒酵母基因组为模板进行PCR扩增，得到tHMGR基因序列；重组质粒BB1-23-CrtU以R.aetherivoransN1的基因组为模板进行PCR扩增得到crtU基因序列，将各基因片段通过GoldenGate方法插入质粒BB1-23中，得到重组质粒BB1-23-CrtI、BB1-23-CrtE、BB1-23-CrtYB、BB1-23-tHMGR和BB1-23-CrtU，重组质粒的结构见图1～5。
以crtI-F和crtI-R为引物，以crtI基因序列为模板，扩增crtI片段，引物序列见表1。
以crtE-F和crtE-R为引物，以crtE基因序列为模板，扩增crtE片段，引物序列见表1。
以crtYB-F和crtYB-R为引物，以crtYB基因序列为模板，扩增crtYB片段，引物序列见表1。
以tHMGR-F和tHMGR-R为引物，以tHMGR基因序列为模板，扩增tHMGR片段，引物序列见表1。
以crtU-F和crtU-R为引物，以crtU基因序列为模板，扩增crtU片段，引物序列见表1。
扩增所使用的PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase。体系如表2所示。
表2
体系 50μL
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL
buffer 25μL
蒸馏水 20μL
DNTP 1μL
上引 1μL
下引 1μL
模板 1μL
对扩增后的crtI、crtE、crtYB、tHMGR和CrtU片段进行回收，琼脂糖凝胶电泳进行纯化和回收。
扩增程序：
使用上海碧云天生物技术有限公司的Bsa1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系如表3所示。
表3
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过硫酸卡那霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB1-23-CrtI、BB1-23-CrtE、BB1-23-CrtYB、BB1-23-tHMGR和BB1-23-CrtU。
2、重组质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt是以质粒BB1-23-CrtI与质粒BB1-12-pGPM1、质粒BB1-34-ScCYC1tt通过GoldenGate方法利用Bpi1酶和T4连接酶插入质粒BB2-AB中，得到质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt；重组质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt是以质粒BB1-23-CrtE与质粒BB1-12-pPDC1、质粒BB1-34-RPP1Btt通过GoldenGate方法利用Bpi1酶和T4连接酶插入质粒BB2-BC中，得到质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt；重组质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt是以质粒BB1-23-CrtYB与质粒BB1-12-pMDH3、质粒BB1-34-RPS2tt通过GoldenGate方法利用Bpi1酶和T4连接酶插入质粒BB2-CD中，得到质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt；重组质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att是以质粒BB1-23-tHMGR与质粒BB1-12-pADH2、质粒BB1-34-RPL2Att通过GoldenGate方法利用Bpi1酶和T4连接酶插入质粒BB2-DE中，得到质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att；重组质粒BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt是以质粒BB1-23-CrtU与质粒BB1-12-pGAP、质粒BB1-34-RPS3tt通过GoldenGate方法利用Bpi1酶和T4连接酶插入质粒BB2-CD中，得到质粒BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt；重组质粒的结构见图1～5。
重组质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt的构建过程如下：
使用南京福麦斯生物技术有限公司的Bpi1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系如表4所示。
表4
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt，质粒结构见图1。
重组质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt的构建过程如下：
使用南京福麦斯生物技术有限公司的Bpi1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系和表3基本一致，仅质粒换为BB2-BC、BB1-12-pPDC1、BB1-23-CrtE和BB1-34-RPP1Btt。
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt，质粒结构见图2。
重组质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt的构建过程如下：
使用南京福麦斯生物技术有限公司的Bpi1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系和表3基本一致，仅质粒换为BB2-CD、BB1-12-pMDH3、BB1-23-CrtYB和BB1-34-RPS2tt。将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt，质粒结构见图3。
重组质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att的构建过程如下：
使用南京福麦斯生物技术有限公司的Bpi1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系和表3基本一致，仅质粒换为BB2-DE、BB1-12-pADH2、BB1-23-tHMGR和BB1-34-RPL2Att。将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att，质粒结构见图4。
重组质粒BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt的构建过程如下：
使用南京福麦斯生物技术有限公司的Bpi1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系和表3基本一致，仅质粒换为BB2-EF、BB1-12-pGAP、BB1-23-CrtU和BB1-34-RPS3tt。将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt，质粒结构见图5。
3、重组质粒BB3aK-AE-CrtIEYBtHMGR是以质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt、BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt、BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt、BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att和BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt通过GoldenGate方法利用Bsa1酶和T4连接酶插入质粒BB3aK-AF中，得到质粒BB3aK-AF-L8CrtU，完成重组质粒BB3aK-AF-L8CrtU的构建。重组质粒BB3aK-AF-L8CrtU的结构见图6。
重组质粒BB3aK-AF-L8CrtU的构建过程如下：
使用Bsa1酶和T4连接酶进行GoldenGate组装，反应体系如表5所示。
表5
体系 10μL
BB3aK-AE 1μL
BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt 1μL
BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt 1μL
BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt 1μL
BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att 1μL
BB2-EF-pGAP-CrtU-RPS3tt 1μL
Bsa1 0.5μL
BSA 1μL
T4连接酶 0.5μL
T4buffer 1μL
蒸馏水 2μL
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过硫酸卡那霉素抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒BB3aK-AF-L8CrtU，质粒结构见图5。
实施例2重组菌的构建
重组菌PP-L8U的构建
将含有crtI-crtYB-crtE-tHMGR-crtU基因表达盒的质粒BB3aK-AF-L8CrtU导入巴斯德毕赤酵母中，crtI-crtYB-crtE-tHMGR-crtU表达盒整合到基因组EGI2位点处，得到重组菌PP-L8U。具体方法如下：
①原始巴斯德毕赤酵母于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母粉和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用电穿孔仪将BB3aK-AE-CrtIEYBtHMGR导入巴斯德毕赤酵母感受态细胞，进行同源重组。
③采用加入硫酸卡那霉素的YPD筛选平板筛选，2～3天长出单菌落，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌PP-L8U。
巴斯德毕赤酵母感受态制备方法：
1、酵母细胞生长到OD600为0.8～1.0；
2、室温，4000rpm离心5min；
3、弃上清，将菌泥重悬于9mL BEDS溶液和1mL 1M苏糖醇；
4、冰上孵育5min；
5、室温，4000rpm离心5min；
6、弃上清，菌泥重悬于1mL BEDS溶液中；
7、1.5mL EP管分装，-80℃保藏。
BEDS溶液：10mM bicine-NaOH，pH 8.3；3％(v/v)乙二醇和1M山梨醇。
实施例3重组菌在生产异海绵烯中的应用
1、工程菌的培养
从平板上挑出单菌落接入YPD培养基，30℃培养24小时后，以1％的接种量接入发酵摇瓶，30℃，180rpm培养120h。
2、异海绵烯的提取
(1)将混匀的发酵液取1mL，12000rpm离心3min(用纯水洗涤两次)。
(2)控干水分后重悬在2mL二甲基亚砜(DMSO)中(60℃预热)并在涡旋震荡仪上震荡均匀，后置于55℃水浴15min。
(3)加入2mL丙酮，55℃水浴15min。
(4)将样品以12000rpm离心3min。取上清液转移到新离心管中避光保存。
摇瓶发酵期间，从第24h开始，每天取样检测菌株生产异海绵烯的产量，在50ml的摇瓶发酵中，最高可以生产159.41mg/L的异海绵烯产量和9.43mg/g的异海绵烯含量(图9)。
异海绵烯的定量分析
本研究使用的液相色谱型号为AgilentTechnologies1200Infinityseries；色谱柱为：C30色谱柱；紫外吸收波长为450nm；流动相为甲醇、甲基叔丁基醚；流速控制为1.0mL/min；柱温为25℃。图7为重组菌株异海绵烯HPLC检测图。
异海绵烯的LC-MS检测
本研究中使用的LC-MS型号为Acquity I-class超高效液相色谱和VION离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪，质谱条件为：采集模式:MSE(低能量/高能量切换扫描)；电喷雾正离子/负离子分别扫描；毛细管电压2KV；锥孔电压40V；雾化气温度:450℃；雾化气流量900L/h；锥孔反吹气50L/h；离子源温度115℃；扫描范围50～1000m/z；扫描速度0.2s；碰撞能量6eV/20～45eV；在线锁定质量；250pg/uL亮氨酸脑啡肽持续进样，流速10ul/min；采集间隔0.5s；采集时间0.5s。图8为异海绵烯的质谱鉴定结果图谱。
SEQ ID No.1
SEQ ID No.2
SEQ ID No.3
SEQ ID No.4
SEQ ID No.5
SEQ ID No.6

Claims (11)

1. 类胡萝卜素 φ 环合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.编码权利要求1所述类胡萝卜素 φ 环合酶的基因序列，其特征在于，基因序列如SEQ ID No.5所示。
3. 权利要求1所述类胡萝卜素 φ 环合酶在异海绵烯合成中的应用。
4. 一株合成异海绵烯的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在巴斯德毕赤酵母中导入香叶基香叶基二磷酸合酶CrtE、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶CrtYB、八氢番茄红素去饱和酶CrtI、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶tHMGR和类胡萝卜素 φ 环合酶CrtU的表达盒得到；所述CrtE的编码基因序列如SEQ ID No.1所示；所述CrtYB的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述CrtI的编码基因序列如SEQ ID No.3所示；所述tHMGR的编码基因序列如SEQ ID No.4所示；所述CrtU的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述表达盒的启动子为巴斯德毕赤酵母的pGPM1启动子、pPDC1启动子、pMDH3启动子、pADH2启动子或pGAP启动子；所述终止子为巴斯德毕赤酵母的ScCYC1tt终止子、RPP1Btt终止子、RPS2tt终止子、RPL2Att终止子或RPS3tt终止子。
6.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组巴斯德毕赤酵母还表达1个标记基因；所述标记基因选自质粒BB3aK-AF的硫酸卡那霉素编码基因表达盒。
7.权利要求4-6中任一项所述重组菌株的构建方法，其特征在于，将所述CrtE、CrtYB、CrtI以及tHMGR的表达盒通过质粒形式导入所述巴斯德毕赤酵母GS115，整合在巴斯德毕赤酵母菌株基因组上。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，包括：将所述CrtE、CrtYB、CrtI、tHMGR和CrtU的基因片段通过GoldenGate方法插入质粒BB1-23中，得到质粒BB1-23-CrtE、BB1-23-CrtYB、BB1-23-CrtI、BB1-23-tHMGR和BB1-23-CrtU；
将所述质粒BB1-23-CrtI与质粒BB1-12-pGPM1、质粒BB1-34-ScCYC1tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-AB中，得到质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt；
将所述质粒BB1-23-CrtE与质粒BB1-12-pPDC1、质粒BB1-34-RPP1Btt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-BC中，得到质粒BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt；
将所述质粒BB1-23-CrtYB与质粒BB1-12-pMDH3、质粒BB1-34-RPS2tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-CD中，得到质粒BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt；
将所述质粒BB1-23-tHMGR与质粒BB1-12-pADH2、质粒BB1-34-RPL2Att通过GoldenGate方法插入质粒BB2-DE中，得到质粒BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att；
将所述质粒BB1-23-CrtU与质粒BB1-12-pGAP、质粒BB1-34-RPS3tt通过GoldenGate方法插入质粒BB2-EF中，得到质粒BB2-EF-pGAP-CrtYB-RPS3tt;
将所述质粒BB2-AB-pGPM1-CrtI-ScCYC1tt、BB2-BC-pPDC1-CrtE-RPP1Btt、BB2-CD-pMDH3-CrtYB-RPS2tt、BB2-DE-pADH2-tHMGR-RPL2Att和BB2-EF-pGAP-CrtYB-RPS3tt通过GoldenGate方法插入质粒BB3aK-AF中，得到质粒BB3aK-AF-L8CrtU;
将所述质粒BB3aK-AF-L8CrtU导入巴斯德毕赤酵母GS115，获取重组菌株。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，使用Bsa1酶和T4连接酶将所述CrtE、CrtYB、CrtI、tHMGR和CrtU的基因片段通过GoldenGate方法插入质粒BB1-23。
10.权利要求4-6中任一项所述重组菌株在生产异海绵烯中的应用。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在营养培养基上培养重组菌株，得到含有异海绵烯的发酵产物，分离得到产物异海绵烯。
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