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CN119139545A - 一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与应用 - Google Patents

一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与应用 Download PDF

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CN119139545A
CN119139545A CN202411630342.1A CN202411630342A CN119139545A CN 119139545 A CN119139545 A CN 119139545A CN 202411630342 A CN202411630342 A CN 202411630342A CN 119139545 A CN119139545 A CN 119139545A
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blood vessel
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孙玲
李佳玺
汪淼锋
许鹏赟
任振俶
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Lingbo Biotechnology Hangzhou Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与应用。本发明对静电纺丝的人工血管进行氨解和均匀的肝素偶联，然后通过水平状态下人工血管匀速旋转、活性因子溶液中间部位输注的方式对其进行梯度修饰，进而得到中间活性因子浓度高，两端浓度低的人工血管，可引导临近内皮细胞从两端向中间迁移，得以实现人工血管的快速内皮化。本发明公开了一种梯度修饰促内皮化活性因子，抑制急性血栓、促进内皮细胞迁移和快速内皮化的人工血管，以提高人工血管的通畅率、内皮化速率和再生能力。

Description

一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与应用。
背景技术
心血管疾病（Cardiovascular diseases, CVDs）是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病，已经成为超越其他疾病造成全球死亡的首要原因，对人类健康构成重大威胁。尽管在预防和治疗方面取得了进展，但随着人口老龄化的加剧、吸烟的全球蔓延以及肥胖和糖尿病的日益流行，确保了未来几十年心血管疾病的发病率将不断上升。
血管移植是治疗心血管疾病的有效手段之一，使用自体旁路血管特别是小直径静脉或动脉(< 5mm)进行移植，仍然是治疗冠状动脉疾病的重要治疗手段。然而继发性部位损伤和自体血管可能共存的疾病，限制了它的应用。虽然大口径的人工血管在临床应用中取得了成功，但小口径（内径＜6 mm）人工血管常因血栓（急性血栓）、内膜增生等问题导致术后5年内的成功率较低，难以满足临床需求。
目前的观点认为在心血管材料表面形成完整的内皮层是一种理想的治疗方法，若要实现人工血管的内皮化，需要对人工血管和内皮细胞进行不同的处理，然而以上方法不仅操作繁琐、周期长、易污染、花费高，而且会因多步处理导致细胞和活性物质的丢失或功能丧失。
因此，如何提供一种处理简单、可实现早期抗急性血栓和快速内皮化的人工血管修饰方法是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
有鉴于此，本发明公开提供了一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法与应用。通过对人工血管进行均匀的肝素修饰和梯度的促内皮化活性因子修饰，以提高人工血管的急性抗凝性能和内皮化速率。
需要说明的是，本发明针对小口径人工血管常因血栓（急性血栓）、内膜增生等问题导致移植失败，而提供一种梯度修饰促内皮化活性因子，抑制急性血栓、促进内皮细胞迁移和快速内皮化的人工血管，以提高人工血管的通畅率、内皮化速率和再生能力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个技术目的是提供一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管，所述人工血管上具有均匀的肝素修饰，活性因子采用梯度修饰的修饰方式；且所述人工血管的活性因子浓度从中间向两端逐渐降低。
可选地，所述活性因子包括血管内皮生长因子（Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF），胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factors，IGF-1），C型钠尿肽（C-type Natriuretic Pepitde，CNP）或碱性成纤维细胞生长因子（b-Fibroblast GrowthFactor，b-FGF）。
本发明的第二个技术目的是提供一种如上所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，包括如下步骤：
将基质材料溶解于有机溶液中；待高分子材料完全溶解后形成基质溶液；再利用静电纺丝手段将所述基质溶液制备成普通的人工血管，然后利用共价交联（氨解-交联反应）的方法将活性因子修饰在人工血管上，得到梯度修饰活性因子的人工血管。
可选地，利用己二胺进行氨解处理，所述己二胺的浓度是0.1M-1M，优选0.25M-0.75M，更为优选为0.5M；处理时间为30min。
可选地，所述基质材料采用常见人造血管用高分子材料。
具体地，所述常见人造血管用高分子材料采用聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚乳酸、聚L-丙交酯-己内酯、聚对二氧六环己酮中至少一种或几种的任意比例混合物。优选地，所述常见人造血管用高分子材料采用聚己内酯。
可选地，所述有机溶剂采用氯仿、甲醇的混合物，氯仿与甲醇的体积比为5:1。
可选地，所述的将活性因子修饰在人工血管上的操作为：将氨解-交联后的人工血管材料水平放置并匀速转动，向人工血管的中间部位输送活性因子溶液并保持人工血管持续匀速转动；其中，
所述活性因子溶液的浓度为10-400ng/mL，优选浓度为50-200ng/mL，更为优选浓度为100ng/mL，输送速度为1mL/h，输送时间为30min；且所述人工血管材料水平转速为10rpm。
本发明的第三个技术目的是提供一种如上所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管在组织工程领域中的应用。
具体地，所述人工血管可以改变形状用做血管补片、带瓣血管、心脏瓣膜。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1）本发明对静电纺丝的人工血管进行氨解和均匀的肝素偶联，然后通过水平状态下人工血管匀速旋转、活性因子溶液中间部位输注的方式对其进行梯度修饰，进而得到中间活性因子浓度高，两端浓度低的人工血管，可引导临近内皮细胞从两端向中间迁移，得以实现人工血管的快速内皮化。
2）本发明通过梯度修饰的方式将VEGF负载到人工血管上，不仅氨解方式简单，还不会影响人工血管的力学性能；并且具有浓度梯度的促内皮化活性因子可以促进内皮细胞沿高浓度活性因子方向迁移；负载方式简单，能够有效的保持活性因子的活性；制备的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管既可以抗急性凝血又可以加速血管的内皮化速率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是氨解后的血管轴向力学统计图。
图2是氨解后的血管径向力学统计图。
图3是植入的血管内皮覆盖率统计图。
图4是对比例1与实施例3的接触角测试图。
图5是对比例1和实施例3 CD31免疫荧光染色图。
图6是本发明梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备工艺流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本申请实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本申请中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本申请公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本申请中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
为了更好的说明本申请内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本申请同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本申请的主旨。
在不冲突的前提下，本申请实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本申请实施例公开的内容。
本发明公开了一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管及其制备方法。
本发明首先以修饰VEGF为实验活性因子，进行如下具体操作：
（一）溶液的配制：
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。
（二）静电纺丝
电纺人工血管的制备：
将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min；按照以上设置参数制备电纺人工血管。
（三）人工血管材料的氨解
将电纺人工血管用40%酒精浸泡处理15min，用PBS清洗3次之后，用0.1M-1M（0.1M、0.25M、0.5M、0.75M、1M）己二胺溶液浸泡处理30min得到含有氨基的人工血管。
（四）人工血管材料的氨解-交联
PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液（0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。
（五）人工血管的VEGF梯度修饰
将氨解-交联后的人工血管材料水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送10-400ng/mL（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL）的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min，使VEGF从中间向两端扩散，得到从中间向两端VEGF浓度逐渐降低的人工血管 。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例1
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.1M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡30min，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例2
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.25M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例3
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例4
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.75M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例5
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于1M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例1-5的具体参数见汇总表1
表1 实施例1-5具体参数汇总表
实施例6
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送10ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例7
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送50ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例8
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例9
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送200ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例10
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送400ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
实施例6-10的具体参数见汇总表2
表2 实施例6-10具体参数汇总表
对比例1
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于PBS中30min。
人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送100ng/mL的VEGF溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
对比例2
将体积比为5:1的氯仿-甲醇溶液置于玻璃小瓶，按照0.25g/mL的量加入聚己内酯（PCL）颗粒，拧紧瓶盖并用封口膜封口，之后将小瓶置于磁力搅拌器上室温避光连续搅拌12h。以上述溶液进行静电纺丝，制备电纺PCL人工血管。具体操作和参数如下：将搅拌好的溶液装入10mL玻璃注射器中，倒置注射器排净气泡后安装固定21G针头，使用注射泵进行推进，溶液的流速设置为8mL/h，高压直流电压设置为10kV，接收距离设置为10cm，接收器为直径2mm的接地不锈钢棒，不锈钢棒的转速为150rpm，纺丝时间为4min。
将电纺人工血管浸泡在40%的酒精中15min，PBS清洗3次，然后将其置于0.5M的己二胺中30min。
氨解后的人工血管经PBS清洗5次之后用pH为5.6，浓度为0.05mol/L的MES浸泡0.5h，随后将氨解后人工血管置于含有EDC、NHS和肝素的混合溶液 （0.2%EDC+0.12%NHS+0.12%肝素）中37℃反应4h。待反应结束之后将氨解-交联后的人工血管穿过不锈钢棒，然后水平放置于转动轴上以10rpm匀速转动，向人工血管的中间部位以1mL/h的速度输送PBS溶液并保持血管持续匀速转动30min。30min之后停止输送溶液，让血管以10rpm匀速转动4h，之后取下血管，用PBS清洗6次，最后氮气下晾干备用。
对比例1-2的具体参数见汇总表3
表3 对比例1-2具体参数汇总表
以下通过相关结果的展示与分析来充分说明本发明的有益效果。
对实施例1-10和对比例1-2氨解后的电纺PCL人工血管的轴向拉力、径向拉力、缝合强度、爆破压、接触角和N元素含量进行检测，具体方法如下：
1、轴向拉力表征
用Instron-3345拉力机测试氨解后的电纺PCL人工血管的轴向拉力，测试方法如下：将长度为2.5cm的血管的上端和下端固定到拉力机的上下夹具上，保证上下夹具间的距离控制在1cm，然后输入样品的各项参数，将拉伸速度调至20mm/分钟，将软件的拉力调零，启动拉力机直至样品完全断裂，依据应力-应变曲线获取样品的杨氏模量、应力以及最大断裂伸长率。
2、径向拉力表征
用Instron-3345拉力机测试氨解后的电纺PCL人工血管的径向拉力，测试方法如下：将长度约为5mm的样品通过钢环固定到拉力机上，输入样品的各项参数，将拉伸速度调至10mm/分钟，将软件的拉力调零，启动拉力机直至样品完全断裂，依据应力-应变曲线获取样品的杨氏模量、应力以及最大断裂伸长率。
3、缝合强度表征
按照 ISO7198:2016 A.5.7缝合强度检测标准对实施例1-6和对比例1-2中所制备的人工血管的平端（0°）缝合强度进行测试，测试方法如下：将血管裁成长度约为1 cm的小段，用6-0医用缝合线在距血管水平末端约2 mm处穿过样品管壁，将缝合线打结，形成一个闭合的环，用拉力机的气泵夹将打结的缝合线夹好，用拉力机的气泵夹将血管的另一末端也夹好，对拉力机进行平衡，调零；以8.00 mm/分钟的拉伸速度进行拉伸，直至6-0缝合线穿透样品末端为止。
4、爆破压表征
按照YY0500-2004/ISO7198中8.3.3.3加压破裂强度-球囊法对实施例1-6和对比例1-2中所制备的人工血管进行测试，具体操作方法如下：在球囊上均匀涂抹凡士林润滑剂，小心地将球囊放进人工血管样品中，将血管的一端直接连接到传感器的导管上，另一端封死，以千帕每秒的速度通入CO2气体，直至血管爆破，压力数值的变化过程由传感器另一侧的无纸压力记录仪记录，调取最大压力数值，依据kPa与mmHg的换算标准计算血管的爆破压。
5、接触角表征
将血管材料用双面胶粘平铺在载玻片上，旋转螺旋测微仪使水滴落在材料表面，每间隔 2s拍一张照片，该过程持续 2 min。利用 Image J 软件测试接触角的大小。
6、N元素含量表征
利用X 射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）分析人工血管表面元素，将样品切割成面积大小为 0.50 cm×0.50 cm大小，然后进行XPS检测，分析碳、氮、氧（C、 N、 O）三种元素的含量。
7、数据分析
利用 GraphPad Prism 9.0.0 软件对数据进行分析，所有数据表达方式采用平均值±标准误差。
结果分析：
实施例3和实施例6-10以及对比例2采用了同样的氨解条件，以下的分析重点围绕实施例1-5和对比例1进行。
轴向拉力数据（表4）显示，从实施例1到实施例5，其最大应力、杨氏模量和断裂伸长率均出现降低现象，尤其是从实施例4开始，其轴向的力学开始出现显著性的降低（图1）。
径向拉力数据（表4）显示，从实施例1到实施例5，其最大应力、杨氏模量和断裂伸长率均出现降低现象，和轴向力学相一致的是从实施例4开始，其力学开始出现显著性的降低（图2）。
缝合强度的数据（表4）显示，从实施例1到实施例5，缝合强度也出现降低现象，并且从实施例4开始，其大小开始出现显著性的降低。
爆破压的数据（表4）也出现了类似于拉力和缝合强度的规律。尤其是实施例4和实施例5中的爆破压均低于血管临床移植的最低要求1600mmHg，表明实施例4和实施例5制备的血管不具备临床应用的潜能。
表4. 血管力学、接触角和N元素含量结果(平行实验，n＝3，取平均值±标准误差)
接触角的结果显示，对比例1的接触角大小为122.11±1.85°，相比对比例1，实施例1-5的接触角均出现了降低，表明血管的亲水性增加（图4）。N元素定量结果显示，相比对比例1，从实施例1到实施例5，N的含量逐渐升高，说明血管表明确实引入了氨基基团，表明氨解的方法可行有效，同时也印证了接触角的变化。
对实施例1-10和对比例1-2制备的人工血管的VEGF负载能力、内皮细胞增殖能力、NO的释放水平、内皮细胞迁移能力进行分析，具体方法如下：
1、VEGF的负载
用VEGF Elisa试剂盒测试人工血管中VEGF的负载量，具体操作如下：实施例和对比例均选择中间部位（长为5mm）作为测量样本，之后按照试剂盒的说明进行测试，反应最后按照说明检测反应液在450nm处的吸光值，吸光值越大表示VEGF的负载越多。
2、内皮细胞的增殖
将实施例和对比例中间部位的血管材料平铺于48孔板中，然后用压膜环压住，按照每孔5×103的量向孔中加入HUVEC，培养2天之后利用CCK-8检测上清溶液在450nm处的吸光值，吸光值越大表示细胞的增殖情况越好。
3、NO释放
将实施例和对比例中间部位的血管材料平铺于48孔板中，然后用压膜环压住，按照每孔3×103的量向孔中加入HUVEC，培养2天之后利用Griess Reaction 试剂盒测定上清中NO的含量，最终结果以540nm处的吸光度展示，吸光值越大表示NO的含量越高。
4、内皮细胞的迁移
将实施例和对比例的血管从中间一分为二剪开，在剪的部位做标记，然后将血管材料平铺于6孔板中，之后用带卡槽的压膜环压住，在距血管材料未标记一端1/3位置通过卡槽放置阻水板，然后在1/3的空间中接种1×105的HUVEC，培养箱中放置12h之后，移除阻水板，加入全新的培养基1.5ml，培养12h之后对样品进行固定、染色并测量细胞的迁移效率（迁移效率=迁移的距离/压痕到标记部分的距离*%）。
5、数据分析
利用 GraphPad Prism 9.0.0 软件对数据进行分析，所有数据表达方式采用平均值±标准误差。
结果分析：
表5中VEGF的负载量显示，相比对比例1，实施例1到实施例5，VEGF的负载量逐步升高，表明在VEGF浓度一定的情况下，VEGF的负载量随氨解变化而变化。相比对比例2，从实施例6到实施例10，VEGF的负载量也出现了增加，但实施例8之后就不再出现增加现象，表明在氨解条件一致的情况下，VEGF的负载会存在饱和效应。
表5中增殖数据显示，相比对比例1，实施例1到实施例5的数值出现了逐渐增高的现象，且从实施例2开始均具有显著性。相比对比例2，从实施例6到实施例10，细胞的增值数据均出现了显著性的增加，但实施例8之后就不再变化。
表5中NO释放的数据显示，相比对比例1，从实施例1到实施例5，NO的释放呈现了逐渐增高的现象，且从实施例2开始出现显著性变化。相比对比例2，从实施例6到实施例10，NO的释放均出现了显著性的增加，但实施例8之后就不再有增加的变化。
表5中细胞迁移的数据与细胞增值、NO释放呈现出相似的规律，即相比对比例1，从实施例1到实施例5，数据呈现了逐渐增高的现象，且从实施例2开始出现显著性变化。相比对比例2，从实施例6到实施例10，迁移率出现了显著性的增加，但实施例8之后就不再有增加的变化
表5. 血管的微观表征和力学表征(平行实验，n＝3，取平均值±标准误差)
动物实验研究
基于表4和表5的相关数据可知：实施例3和8是一样的；实施例4和5爆破压小于1600mmHg排除移植；实施例8、9、10的检测数据几乎和实施例3一致；故本着动物实验的3R原则，选择对比例1、对比例2、实施例1-3和实施例6-7进行动物实验。
大鼠腹主动脉移植
250 g的SD大鼠麻醉之后，将人工血管材料裁成1.1 cm，利用9-0缝合线以端端间断缝合的方式将以上血管分别植入大鼠腹主动脉，移植一个月后利用Vevo 2100多普勒超声检测血管的通畅性，之后进行取材，取出的血管组织进行纵切处理，取一条样品置于组织包埋剂OCT中，使用液氮速冻后进行冰冻切片分析，使用CD31抗体进行免疫荧光染色并统计内皮覆盖率，血管内皮覆盖率=血管纵切内腔面CD31阳性长度/血管纵切内腔面总长度×100%。
结果分析：
大鼠体内植入一个月后，对比例1的内皮覆盖率为30.40±2.77%（图5），而实施例的内皮覆盖率均出现了升高，尤其是实施例3的内皮覆盖率达到了93.43±2.36%（图5），显著高于对比例及其它实施例（图3）。
表6. 动物试验研究结果(平行实验，n＝3，取平均值±标准误差)
综合以上体内/外结果，本发明制备的梯度修饰的人工血管具有优异的性能，其既可以抗急性凝血又可以加速血管的内皮化速率。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管，其特征在于，所述人工血管上具有均匀的肝素修饰，活性因子采用梯度修饰的修饰方式，修饰的特点是管状移植物中间浓度高，两端浓度低，且从中间到两端呈现梯度减少；即所述人工血管的活性因子浓度从中间向两端逐渐降低。
2.根据权利要求1所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管，其特征在于，所述活性因子包括血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF），胰岛素样生长因子-1（Insulin-like Growth Factors，IGF-1），C型钠尿肽（C-type NatriureticPepitde，CNP）或碱性成纤维细胞生长因子（b-Fibroblast Growth Factor，b-FGF）。
3.一种如权利要求1所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将基质材料溶解于有机溶剂中；待高分子材料完全溶解后形成基质溶液；再利用静电纺丝手段将所述基质溶液制备成普通的人工血管，然后利用共价交联（氨解-交联反应）的方法将活性因子修饰在人工血管上，得到梯度修饰活性因子的人工血管。
4.根据权利要求3所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，利用己二胺进行氨解处理，所述己二胺的浓度是0.1M-1M，处理时间为30min。
5.根据权利要求3所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，所述基质材料采用常见人造血管用高分子材料。
6.根据权利要求5所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，所述常见人造血管用高分子材料采用聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚乳酸、聚L-丙交酯-己内酯、聚对二氧六环己酮中至少一种或几种的任意比例混合物。
7.根据权利要求3所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂采用氯仿、甲醇的混合物，氯仿与甲醇的体积比为5:1。
8.根据权利要求3所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管的制备方法，其特征在于，所述的将活性因子修饰在人工血管上的操作为：将氨解-交联后的人工血管材料水平放置并匀速转动，向人工血管的中间部位输送活性因子溶液并保持人工血管持续匀速转动；其中，
所述活性因子溶液的浓度为10-400ng/mL，输送速度为1mL/h，输送时间为30min；且所述人工血管材料水平转速为10rpm。
9.一种如权利要求1所述的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管或如权利要求3所述方法制备的梯度修饰促内皮化活性因子的人工血管在组织工程领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述人工血管可以改变形状用做血管补片、带瓣血管、心脏瓣膜。
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