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CN119095978A - 使用具有模式化接种的双链dna大小排阻的单克隆聚簇 - Google Patents

使用具有模式化接种的双链dna大小排阻的单克隆聚簇 Download PDF

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CN119095978A
CN119095978A CN202380031840.1A CN202380031840A CN119095978A CN 119095978 A CN119095978 A CN 119095978A CN 202380031840 A CN202380031840 A CN 202380031840A CN 119095978 A CN119095978 A CN 119095978A
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CN
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flow cell
primer
lawn
protein
dsdna
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CN202380031840.1A
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阿扎万·卡鲁纳卡兰
大卫·布拉彻
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Original Assignee
Illumina Inc
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Abstract

本申请涉及单克隆聚簇的方法。在一些实施例中，所述单克隆聚簇利用双链DNA。

Description

使用具有模式化接种的双链DNA大小排阻的单克隆聚簇
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年12月7日提交的美国临时专利申请第63/430,936号，名称为“使用具有模式化接种的双链DNA大小排阻的单克隆聚簇”的优先权，其全部内容通过引用结合于此。
技术领域
本申请涉及单克隆聚簇的方法。
背景技术
由于非优势模板链与来自该簇的初级模板群体的信号的干扰，多克隆群集受到噪声增加和信号降低的影响。所产生的信号降低和噪声增加最终导致降低的碱基识别特性，即使在应用纯度滤波之后。产生更高比例的单克隆簇的能力受到典型接种方法的泊松性质的阻碍。另外，非优势链在最终读出中丢失，使得测序过程在读出流通池上的可用DNA时效率低下。如果以低密度进行接种以提高被占据的单克隆簇的百分比，则总占据百分比降低，从而降低通量。
发明内容
本文提供的实施例涉及用于通过将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上而扩增靶核酸的方法和组合物。在一些实施例中，流通池包括蛋白质，并且dsDNA连接至与蛋白质相互作用的配体。在一些实施例中，流通池包括固定在流通池上的多个草坪(lawn)引物。
本文的一些实施例提供了扩增靶核酸的方法，所述方法包括将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上，所述流通池包括含有蛋白质的第一部分和含有固定在流通池上的多个草坪引物的第二部分，其中所述dsDNA包括靶核酸序列和互补核酸序列，并且其中所述dsDNA与配体连接，所述配体引起配体和蛋白质之间的相互作用；在配体与蛋白质相互作用后，使dsDNA变性以除去互补核酸序列；使用所述草坪引物扩增所述靶核酸序列。
在一些实施例中，所述多种草坪引物在一端用正电荷加帽。在一些实施例中，正电荷导致dsDNA向流通池的含有蛋白质的第一部分扩散。
在一些实施例中，该方法进一步包括在配体与蛋白质之间的相互作用之后从草坪引物去除正电荷。
在一些实施例中，通过裂解除去正电荷。在一些实施例中，通过熔融去除正电荷。
在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素，所述配体是生物素。
在一些实施例中，所述草坪引物包括P5草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括P7草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括P5和P7草坪引物。
在一些实施例中，所述流通池在其表面上不包括任何孔。在一些实施例中，所述流通池在其表面上包括孔。在一些实施例中，所述孔包括大孔内的小孔。
在一些实施例中，将dsDNA接种到流通池上抑制了流通池上的其它的接种事件。
在一些实施例中，所述流通池的第一部分是圆形的。在一些实施例中，所述流通池的第一部分包括在80nm和100nm之间的直径。在一些实施例中，所述流通池的第一部分是圆形垫。
本文的一些实施例提供了将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上的方法，所述方法包括将dsDNA接种到流通池上，所述流通池上包括第一部分和第二部分，所述第一部分包括第一生物分子，所述第二部分包括固定在流通池上的多个草坪引物，其中所述dsDNA包括靶核酸序列，并且其中所述dsDNA与第二生物分子连接，导致所述第二生物分子和所述第一生物分子之间的相互作用。
在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过共价相互作用相互作用。在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过非共价相互作用相互作用。在一些实施例中，非共价相互作用包括蛋白质-配体相互作用。在一些实施例中，蛋白质-配体相互作用包括链霉亲和素-生物素相互作用。
本文中的一些实施例提供了一种流通池，所述流通池包括表面，所述表面包括第一部分，所述第一部分包括垫，所述垫包括蛋白质；和第二部分，所述第二部分包括P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一种。
在一些实施例中，所述第二部分包括P5和P7草坪引物。
在一些实施例中，P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一种用正电荷加帽。
在一些实施例中，所述表面包括图案化表面。在一些实施例中，所述图案化表面包括至少一个孔。在一些实施例中，所述至少一个孔包括包含在至少一个大孔内的至少一个孔。
在一些实施例中，所述图案化表面包括凝胶。在一些实施例中，所述凝胶包括聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
本文的一些实施例提供了一种流通池，其包括涂覆有引物的表面，所述引物被正电荷加帽；和包含蛋白质的垫，其中所述垫具有比用正电荷加帽的引物更高的对dsDNA的结合能。
在一些实施例中，正电荷在流通池的表面处产生较低的能态。
在一些实施例中，所述蛋白质包括链霉亲和素。
在一些实施例中，正电荷是可裂解的，使得它可以从引物中除去。
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其他(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
附图说明
图1示意性地示出了垫的一个实施例，其中中心涂覆有链霉亲和素，并且中心周围的区域涂覆有凝胶并且接枝有P5/P7引物。
图2示意性地示出了含有生物素标签的双链DNA的实施例。
图3A-3C示意性地示出了流通池表面的实施例。图3A示意性地示出了没有孔结构的流通池表面的示例性实施方案。图3B示意性地示出了包括小孔的流通池表面的示例性实施方案。图3C示意性地示出了包括在大孔中的小孔的流通池表面的示例性实施方案。
图4示意性地示出了流通池上的表面引物的实施例，其包括在草坪引物末端的可裂解的正电荷。因为dsDNA具有比ssDNA大的排阻体积，所以多克隆性降低。表面引物上的可裂解正电荷促进dsDNA向流通池的表面迁移。
图5A-5B提供了示例性柱状图，其证明了dsDNA的单克隆级分在纳米孔上的接种。图5A中的柱状图假设发生结合需要模板和孔之间的15％重叠。图5B中的柱状图假设结合发生需要模板和孔之间的30％重叠。
图6示出了使用蒙特卡罗模拟的示例采样。
图7A-7D示意性地示出了示例性制造流程。图7A示意性地示出了缺少孔的示例性制造流程。图7B示意性地示出了其中存在单个孔的示例性制造流程。图7C示意性地示出了其中存在双孔的示例性制造流程。图7D示意性地示出了包括在PZM沉积之前的抛光步骤的示例性制造流程。
图8A-8B示意性地示出了附着在产生结合能漏斗的草坪引物的末端上的示例基团。图8A示意性地说明了用正电荷基团加帽的草坪引物，其中所述正电荷是可裂解的。图8B示意性地示出了用正电荷加帽的草坪引物，所述正电荷可通过熔融去除。
图9A-9C示意性地示出了结合能漏斗的示例性操作。图9A示意性地示出了通过对正电荷的吸引而优先向表面扩散的模板链的实施例。图9B示意性地说明了模板链在链霉亲和素垫上的捕获。图9C示意性地示出了含有正电荷的草坪引物如何在流通池的表面附近产生相对较低的能态。
图10示意性地说明了使用dsDNA的单克隆聚簇方法的实施例。
图11A-11C示意性地说明双链DNA模板接种，其中引物用正电荷加帽。
具体实施方式
本文提供的实施例是与当前文库制备方案相容的单克隆聚簇方法。
例如，如本文所提供的，提供能够聚簇和接种的流通池表面。可在包含蛋白质的垫上进行接种。可在涂覆有凝胶且含有引物的流通池的区域中进行聚簇。引物可以是标准的P5和P7引物。模板双链DNA(dsDNA)可用配体标记，所述配体可与蛋白质结合。dsDNA可通过配体与蛋白质的相互作用附着于垫的表面。因为DNA是dsDNA，而不是单链DNA(ssDNA)，其可潜在地限制垫上的其它接种事件。
术语
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其他形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其他形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含”和“包括”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
贯穿本说明书使用的术语“基本上(substantially)”、“大约(approximately)”、和“约(about)”用于描述和说明如归因于加工中的变化的较小的波动。例如，它们可以指小于或等于±10％、如小于或等于±5％、如小于或等于±2％、如小于或等于±1％、如小于或等于±0.5％、如小于或等于±0.2％、如小于或等于±0.1％、如小于或等于±0.05％。
如本文所用，“杂交(hybridize)”打算意指第一多核苷酸与第二多核苷酸沿那些聚合物的长度非共价缔合以形成双链“双螺旋体(duplex)”。举例来说，两个DNA多核苷酸链可通过互补碱基配对而缔合。第一与第二多核苷酸之间的缔合强度随着那些多核苷酸内核苷酸序列之间的互补性而增加。多核苷酸之间的杂交强度可通过熔融温度(Tm)来表征，在该熔融温度下，50％的双链体具有彼此解离的多核苷酸链。彼此“部分”杂交的多核苷酸是指它们具有彼此互补的序列，但是此类序列仅沿它们的长度的一部分彼此杂交以形成部分双链体。“不能”杂交的多核苷酸包括彼此物理分离的那些多核苷酸，使得它们的碱基的数量不够以彼此杂交的方式彼此接触。
如本文所用，术语“核苷酸(nucleotide)”旨在表示包含糖和至少一个磷酸酯基团，并且在一些示例中还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基(abasic)”的。核苷酸包含脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、经修饰的磷酸糖主链核苷酸、和它们的混合物。核苷酸的示例包含单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、和三磷酸脱氧尿苷(dUTP)。
如本文所用，术语“核苷酸”也打算涵盖任何核苷酸类似物，该核苷酸类似物是包含与天然存在的核苷酸相比经修饰的核碱基、糖、和/或磷酸酯部分的类型的核苷酸。示例性经修饰的核碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。如本领域中已知，某些核苷酸类似物无法并入到多核苷酸中，例如核苷酸类似物诸如5’-磷酰硫酸腺苷。核苷酸可以包含任何适合数目的磷酸酯，例如三个、四个、五个、六个、或多于六个磷酸酯。
如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”是指包含彼此结合的核苷酸序列的分子。多核苷酸为聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、和它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列，如RNA或单链DNA；核苷酸的双链序列，如双链DNA；或可以包含核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链DNA(dsDNA)包含基因组DNA、以及PCR和扩增产物。单链DNA(ssDNA)可以转化成dsDNA并且反之亦然。多核苷酸可以包含非天然存在的DNA，如对映异构体DNA。多核苷酸中核苷酸的精确序列可为已知或未知的。以下为多核苷酸的示例：基因或基因片段(例如探针、引物、表达的序列标签(EST)或基因表达系列分析(SAGE)标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、前述任一者的核酸探针、引物、或扩增复本。
如本文所用，“聚合酶(polymerase)”旨在表示具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合引发的单链靶多核苷酸，并且可以将核苷酸依序添加到生长引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补复制(complementary copy)”多核苷酸。接着，另一聚合酶或相同聚合酶可以通过形成该互补复制多核苷酸的互补复本形成靶核苷酸的复本。此类复本中的任一者可在本文中被称作“扩增子(amplicon)”。DNA聚合酶可以结合到靶多核苷酸并且然后沿靶多核苷酸向下移动，将核苷酸依序添加到生长多核苷酸链(生长扩增子)的3’端处的游离羟基基团。DNA聚合酶可以自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶可以自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶可以称为链移位的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))聚合酶、exo-Klenow聚合酶或测序级T7 exo-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3’核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物”定义为可通过游离3’OH基团向其添加核苷酸的多核苷酸。引物可包括3’封闭基团，该封闭基团能够防止聚合直到去除该封闭基团为止。引物可包括在5’末端处的修饰以允许偶联反应或使该引物偶联到另一部分。引物可包括一个或多个部分，该一个或多个部分可在合适的条件(诸如UV光、化学、酶等)下裂解。引物长度可以是任何适合数目个碱基的长度，并且可以包含天然和非天然核苷酸的任何适合组合。靶多核苷酸可以包含“衔接子(adapter)”，该衔接子可与引物杂交(具有与引物互补的序列)，并且可以扩增以便通过将核苷酸添加到引物的游离3’OH基团来产生互补复制多核苷酸。“捕获引物”旨在表示偶联到基底并且可与靶多核苷酸的第二衔接子杂交的引物，而“正交捕获引物”旨在表示偶联到基底并且可与该靶多核苷酸的第一衔接子杂交的引物。第一衔接子可具有与正交捕获引物的序列互补的序列，并且第二衔接子可具有与捕获引物的序列互补的序列。捕获引物和正交捕获引物可具有彼此不同且独立的序列。另外，捕获引物和正交捕获引物可在至少一种其他特性中彼此不同。例如，捕获引物和正交捕获引物可具有彼此不同的长度；捕获引物或正交捕获引物可包括该捕获引物或该正交捕获引物中的另一者缺乏的非核酸部分(诸如封闭基团或切除部分)；或此类特性的任何合适组合。
如本文所用，术语“基底”是指用作本文所描述的组合物的支撑物的材料。示例性基底材料可包含玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸酯(例如，多面体有机倍半硅氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(CMOS)、或它们的组合。POSS的示例可以是描述于Kehagias等人，《微电子工程改造(MicroelectronicEngineering)》86(2009)，第776-778页中的POSS，该文献以全文引用的方式并入。在一些示例中，本申请中使用的基底包含二氧化硅类基底，如玻璃、熔融硅石、或其他含二氧化硅材料。在一些示例中，基底可以包含硅、氮化硅、或氢化硅酮。在一些示例中，本申请中使用的基底包含塑料材料或组分，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例性塑料材料包含聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、和环烯烃聚合物基底。在一些示例中，基底为或包含二氧化硅类材料或塑料材料或它们的组合。在具体示例中，基底具有至少一个包括玻璃或硅类聚合物的表面。在一些示例中，基底可包含金属。在一些此类示例中，金属为金。在一些示例中，基底具有至少一个包括金属氧化物的表面。在一个示例中，表面包括氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮、或丙烯酸酯也可用作基底材料或组分。其它基底材料可包含但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物、和共聚物。在一些示例中，基底和/或基底表面可以是或包含石英。在一些其它示例中，基底和/或基底表面可为或包含例如GaAs或ITO的半导体。前述列表旨在说明但不限于本申请。基底可包括单一材料或多种不同材料。基底可以是复合物或层合物。在一些示例中，基底包括有机硅酸盐材料。基底可以是平坦的、圆形的、球形的、杆状的、或任何其它适合的形状。基底可以是刚性的或柔性的。在一些示例中，基底为珠粒或流通池。
在一些示例中，基底包含图案化表面。“图案化表面(patterned surface)”是指在基底的暴露层中或上的不同区域的布置。举例来说，区域中的一者或多者可以是其中存在一个或多个捕获引物的特征部。特征部可以由其中不存在捕获引物的间隙区域分隔开。在一些示例中，图案可为成行和成列的x-y形式的特征部。在一些示例中，图案可以是重复布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，图案可为随机布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，基底在表面中包含孔(凹陷)的阵列。孔可由基本上竖直的侧壁提供。孔可如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造，这些技术包含但不限于光刻、压印技术、模制技术、和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道，所使用的技术将取决于阵列底物的组成和形状。
基底的图案化表面中的特征部可包含玻璃、硅、塑料、或其它适合材料上的孔阵列中的孔(例如微孔或纳米孔)，其中具有图案化的共价连接凝胶，如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM或PZM)。该工艺产生用于测序的凝胶垫，该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可为稳定的。聚合物与孔的共价连接可有助于在多种用途期间的结构化基底的整个寿命期间将凝胶保持为结构化特征部。然而，在许多示例中，凝胶不需要共价连接到孔。举例来说，在一些条件下，不共价连接到结构化基底的任何部分的无硅烷丙烯酰胺(SFA)可用作凝胶材料。
在具体示例中，结构化基底可通过以下方法来制造：将适合材料图案化为具有孔(例如，微孔或纳米孔)，用凝胶材料(例如，PAZAM、SFA或它们化学改性的变体，如SFA的叠氮化形式(叠氮-SFA))涂覆图案化材料，并且例如通过化学或机械抛光来抛光已涂覆凝胶的材料的表面，从而将凝胶保持在孔中，但从孔之间的结构化基底的表面上的间隙区域去除基本上所有凝胶或使基本上所有凝胶失活。引物可以连接到凝胶材料。包含多种靶多核苷酸(例如片段化人类基因组或它的部分)的溶液接着可与抛光基底接触，使得个别靶多核苷酸将通过与连接到凝胶材料的引物的相互作用来对个别孔接种；然而，由于不存在凝胶材料或凝胶材料无活性，靶多核苷酸将不占据间隙区域。因为间隙区域中不存在凝胶或凝胶无活性可以阻止生长丛集的向外迁移，所以靶多核苷酸的扩增可以限制于孔中。该工艺可方便地制造、可扩展、且利用常规微型或纳米制造方法。
图案化基底可包含例如蚀刻到载片或芯片中的孔。孔的蚀刻的图案和几何形状可呈多种不同形状和大小，并且此类特征部可在物理上或功能上与彼此分开。具有此类结构特征部的尤其有用的基底包含可以选择如微球体的固体粒子的大小的图案化基底。具有这些特征部的示例性图案化衬底为结合BEAD ARRAY技术(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA)的Illumina公司)使用的蚀刻的衬底。
在一些示例中，本文所述的底物形成流通池的至少一部分，或位于流通池中，或偶联到流通池。流通池可包含划分成多个泳道或多个分区的流动腔室。本文所阐述的方法和组合物中可以使用的示例性流通池和用于制造流通池的基底包含但不限于可购自Illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)的那些。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“固定”旨在表示通过共价键或非共价键直接或间接附接到基底。在某些示例中，可使用共价附接或任何其他合适附接，其中多核苷酸在旨在使用基底的条件下(例如在多核苷酸扩增或测序中)保持固定或附接到基底。待用作捕获引物或用作靶多核苷酸的多核苷酸可被固定，使得3’-端可用于酶促延伸，并且序列的至少一部分能够与互补序列杂交。固定可通过与表面附接的寡核苷酸杂交而发生，在这种情况下，所固定的寡核苷酸或多核苷酸可处于3’-5’取向。替代地，固定可通过除碱基配对杂交之外的方式(诸如共价附接)发生。
如本文所用，术语“阵列”是指可根据相对位置彼此区分的一组基底区域。位于阵列的不同区域处的不同分子(诸如多核苷酸)可根据这些区域在该阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个区域可包括一种或多种特定类型的分子。例如，基底区域可包括具有特定序列的单个靶多核苷酸，或基底区域可包括具有相同序列(或其互补序列)的若干多核苷酸。阵列的区域可分别包括相同基底上的彼此不同的特征部。示例性特征包括但不限于基板中的孔、基板中或基板上的小珠(或其他粒子)、基板的突出部、基板上的脊或基板中的通道。阵列的区域可分别包括彼此不同的基底上的不同区域。可根据基底在与基底相关联的表面上的位置，或者根据基底在液体或凝胶中的位置，来识别附接到单独基底的不同分子。其中单独的基板位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有小珠的那些阵列。
如本文所用，术语“多个(plurality)”旨在表示两个或更多个不同成员的群体。多个数目可在小、中、大到极大的大小范围内。小的多个数目的大小可在例如几个成员到数十个成员的范围内。中等大小的多个数目可在例如数十个成员到约100个成员或数百个成员的范围内。大的多个数目可在例如约数百个成员到约1000个成员、到数千个成员、和多达数万个成员的范围内。极大的多个数目可在例如数万成员到约几十万、一百万、几百万、几千万、和多达或超过数亿成员的范围内。因此，多个的以成员数量来测量的大小范围可从两个到远远超过一亿个成员，以及在上述示例性范围之间和超过上述示例性范围的所有大小。示例性多核苷酸的多个包括例如约1×105或更多、5×105或更多或者1×106或更多个不同的多核苷酸。因此，术语的定义打算包含大于二的所有整数值。多个数目的上限可以例如通过样本中多核苷酸序列的理论多样性来设置。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“双链”旨在表示多核苷酸中的所有核苷酸或基本上所有核苷酸都与互补多核苷酸中的相应核苷酸氢键合。“部分”双链多核苷酸可具有其与互补多核苷酸中的核苷酸氢键合的至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的核苷酸，但少于其与互补多核苷酸中的核苷酸氢键合的所有核苷酸。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“单链”是指多核苷酸中的核苷酸基本上都没有与互补多核苷酸中的相应核苷酸氢键合。“不能”与另一多核苷酸杂交的多核苷酸可以是单链的。
如本文所用，术语“靶多核苷酸(target polynucleotide)”旨在表示是分析或作用的对象的多核苷酸。分析或作用包含使多核苷酸经历扩增、测序、和/或其它程序。靶多核苷酸可以包含待分析的靶序列之外的核苷酸序列。举例来说，靶多核苷酸可以包含一种或多种衔接子，包含充当引物结合位点的衔接子，该衔接子侧接待分析的靶多核苷酸序列。与捕获引物杂交的靶多核苷酸可包括以并非所有靶多核苷酸都易于延伸的方式来延伸超过捕获寡核苷酸的5’端或3’端的核苷酸。在特定示例中，靶多核苷酸可具有彼此不同的序列，但是可具有彼此相同的第一衔接子和第二衔接子。可位于特定靶多核苷酸序列侧翼的两个衔接子可具有彼此相同的序列，或彼此互补的序列，或者这两个衔接子可具有不同的序列。因此，多个靶多核苷酸中的种类可包括已知序列的区域，该区域位于将通过例如测序(例如，SBS)来评估的未知序列区域的侧翼。在一些示例中，靶多核苷酸在单个末端携带衔接子，并且此类衔接子可位于靶多核苷酸的3’端或5’端。可在没有任何衔接子的情况下使用靶多核苷酸，在这种情况下，引物结合序列可直接源自靶多核苷酸中发现的序列。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换地使用。除非另外具体地指示，否则不同术语并不意图表示大小、序列或其他性质的任何具体差异。为了描述清楚起见，当描述包含若干多核苷酸物类的具体方法或组合物时，术语可用于区分一种多核苷酸物类与另一种物类。
如本文所用，术语“扩增子(amplicon)”当关于多核苷酸使用时旨在表示复制多核苷酸的产物，其中产物具有与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制造多核苷酸的扩增子的工艺。靶多核苷酸的第一扩增子可以是互补的复本。额外扩增子为在产生第一扩增子之后从靶多核苷酸或从第一扩增子产生的复本。后续扩增子可具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上一致的序列。应理解，当产生多核苷酸的扩增子时，可出现该多核苷酸的少量突变(例如由于扩增伪影)。
基本上仅包括给定多核苷酸的扩增子的底物区域可称为“单克隆的”，而包括具有彼此不同序列的多核苷酸的扩增子的底物区域可称为“多克隆的”。包括待用于测序的给定多核苷酸的足够数量的扩增子的底物区域可称为“功能上单克隆的”。说明性地，其中具有给定多核苷酸的约60％或更多的扩增子的底物区域可被认为是“功能上单克隆的”。另外地或替代地，来自约60％或更多的信号的底物区域可被认为是“功能上单克隆的”，该信号来自给定多核苷酸的扩增子。底物的多克隆区域可包括其中分别是单克隆的不同子区域。每个此类单克隆区域，无论在较大的多克隆区域内还是单独存在，都可相当于从“种子”生成的“簇”。“种子”可指单个靶多核苷酸，而“簇”可指该靶多核苷酸的扩增子的集合。
如本文所用，术语“生物分子”是在活生物体中发现并且能够进行生物过程的任何化合物。“生物分子”可以是大分子或小分子。“生物分子”可以是能够结合另一种化合物(例如另一种“生物分子”)的分子。这些结合相互作用可包括两(2)个大分子之间的结合、两(2)个小分子之间的结合或大分子与小分子之间的结合。结合事件的实施例包括两(2)个蛋白质之间的结合或蛋白质与配体之间的结合。
本文所述的一些实施例包括含有“小孔”和“大孔”两者的流通池(例如，含有双孔的流通池)。术语“小孔”是指在其中发生双链DNA接种的孔。在一些实施例中，“小孔”的表面长度等于或小于接种在表面上的双链DNA的回转半径长度的约两倍。在一些实施例中，“小孔”可含有在其上进行接种的垫，在一些实施例中，所述垫与所述孔具有大约相同的长度。术语“大孔”是指比流通池中的“小孔”大的孔。所述“大孔”是其中发生聚簇的孔。
使用流动细胞和双链DNA的单克隆聚簇方法
本文的一些实施例提供了扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上，所述流通池包括含有蛋白质的第一部分和含有固定在流通池上的多个草坪引物的第二部分，其中所述dsDNA包括靶核酸序列和互补核酸序列，并且其中所述dsDNA与引起与所述蛋白质相互作用的配体连接；在配体与蛋白质相互作用后，使dsDNA变性以除去互补核酸序列；使用所述草坪引物扩增所述靶核酸序列。
在一些实施例中，将dsDNA接种到流通池上防止了流通池上的其它的接种事件。在一些实施例中，将dsDNA接种到流通池上抑制了流通池上的其它的接种事件。在一些实施例中，正是dsDNA的大小阻止其它接种事件。
在一些实施例中，流通池包括垫，并且dsDNA的接种发生在垫上。在一些实施例中，流通池上的蛋白质在垫上。在一些实施例中，垫涂覆有凝胶。在一些实施例中，所述凝胶包含PAZAM。在一些实施例中，所述凝胶包含本文所述的任何凝胶。
在一些实施例中，所述多种草坪引物在一端用正电荷加帽。在一些实施例中，所述正电荷可逆地结合至所述草坪引物。在一些实施例中，该方法进一步包括在配体与蛋白质之间的相互作用之后从草坪引物去除正电荷。在一些实施例中，通过裂解除去正电荷。在一些实施例中，通过熔融去除正电荷。
在一些实施例中，所述正电荷导致dsDNA向流通池的含有蛋白质的第一部分扩散。
在一些实施例中，所述方法还包括将dsDNA迁移至流通池的表面。在一些实施例中，除去正电荷有利于所述迁移步骤。
在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素。在一些实施例中，所述配体是生物素。在一些实施例中，所述蛋白质是谷胱甘肽-S-转移酶。在一些实施例中，所述配体是谷胱甘肽。在一些实施例中，所述蛋白质是麦芽糖结合蛋白。在一些实施例中，所述配体是麦芽糖。在一些实施例中，所述蛋白质和配体是能够彼此相互作用的任何蛋白质和配体。
在一些实施例中，所述草坪引物包括P5草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括P7草坪引物。在一些实施例中，所述草坪引物包括P5和P7草坪引物。
在一些实施例中，所述流通池在其表面上不包括任何孔。在一些实施例中，所述流通池在其表面上包括至少一个孔。在一些实施例中，所述流通池包括在流通池表面上的至少一个大孔内的至少一个小孔。
在一些实施例中，所述流通池的第一部分是圆形的。在一些实施例中，所述流通池的第一部分包括圆形垫。在一些实施例中，所述圆形垫包括介于约80nm与约100nm之间的直径。在一些实施例中，所述直径小于约80nm。在一些实施例中，所述直径大于约100nm。
图1示出了流通池表面的一个实施例，所述流通池表面包含涂覆有蛋白质10的垫和围绕该垫的包含草坪引物的区域。在一些实施例中，所述蛋白质是受体。在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素。在一些实施例中，所述蛋白质是能够结合配体的任何蛋白质。在一些实施例中，所述草坪引物包括P5引物、P7引物或P5引物和P7引物的组合。图2说明了与配体25连接的双链DNA 20。在一些实施例中，所述配体是能够结合受体的任何配体。在一些实施例中，所述配体包括生物素。
本文的一些实施例提供了将dsDNA接种到流通池上的方法，所述方法包括将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上，所述流通池包括第一部分和第二部分，所述第一部分包括生物分子，所述第二部分包括固定在流通池上的多个草坪引物，其中所述dsDNA包括靶核酸序列，并且其中所述dsDNA与第二生物分子连接，这导致所述第二生物分子和所述第一生物分子之间的相互作用。
在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过共价相互作用相互作用。在一些实施例中，所述第一生物分子和所述第二生物分子通过非共价相互作用相互作用。在一些实施例中，非共价相互作用包括蛋白质-配体相互作用。在一些实施例中，蛋白质-配体相互作用包括链霉亲和素-生物素相互作用。
在一些实施例中，检测第一生物分子和第二生物分子之间的相互作用包括测序反应。在一些实施例中，所述测序反应包括扩增反应。在一些实施例中，所述扩增反应包括桥式扩增或ex-amp。
流通池
本文中的一些实施例提供了一种流通池，所述流通池包括表面，所述表面包括第一部分，所述第一部分包括涂覆有蛋白质的垫。和涂覆有P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一种的第二部分。
在一些实施例中，所述第二部分涂覆有P5和P7草坪引物两者。在一些实施例中，P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一种被正电荷覆盖。
在一些实施例中，所述正电荷具有特定大小，使得其中和负电荷在草坪引物上的排斥力。在一些实施例中，所述正电荷具有特定长度，使得其中和负电荷在草坪引物上的排斥力。
在一些实施例中，所述正电荷包括含有多个正电荷的分子。在一些实施例中，包含多个正电荷的分子是聚赖氨酸、聚精胺、聚乙烯亚胺和类似分子。
在一些实施例中，可通过从引物裂解正电荷来从引物去除正电荷。在一些实施例中，可通过熔融从引物去除正电荷。
在一些实施例中，所述表面由玻璃制成。在一些实施例中，所述表面由硅制成。在一些实施例中，所述表面由塑料制成。在一些实施例中，所述表面包括图案化表面。在一些实施例中，所述图案化表面包括至少一个孔。在一些实施例中，所述至少一个孔包括包含在至少一个大孔内的至少一个小孔。
在一些实施例中，所述图案化表面包括凝胶。在一些实施例中，所述凝胶包括聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。在一些实施例中，所述凝胶包含SFA。在一些实施例中，所述凝胶包含叠氮基-SFA。
在一些实施例中，涂覆在第二部分上的P5和P7引物连接到所述凝胶上。
在一些实施例中，涂覆在第一部分上的蛋白质是链霉亲和素。在一些实施例中，涂覆在第一部分上的蛋白质是能够结合配体的任何蛋白质。
本文的一些实施例提供了一种流通池，其包括(i)涂覆有蛋白质和(ii)涂覆有引物的垫，其中所述蛋白质和引物是分离的。在一些实施例中，所述引物是P5引物、P7引物或P5和P7引物的组合。
图3A表示不包含孔的流通池的示例性实施方案。流通池表面40包含小结合垫35。图3B表示包含一个(1)孔的流通池的示例性实施方案。小结合垫45位于孔结构50内的流通池表面55上。图3C表示流通池的示例性实施方案，所述流通池包含在大孔70内的小孔65。小结合垫75位于小孔内的流通池表面60上。在图3A-3C中示例的任何流通池中，小结合垫可涂覆有蛋白质。所述蛋白质可以是受体，或能够结合配体的任何其它蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素。在图3A-3C中举例说明的任何流通池中，流通池表面涂覆有引物，例如P5引物、P7引物或P5和P7引物的组合。
本文的一些实施例提供了一种流通池，其包括涂覆有引物的表面，所述引物被正电荷加帽；和涂覆有蛋白质的垫，其中所述垫对dsDNA具有比用正电荷加帽的引物更高的结合能。
在一些实施例中，所述垫是圆形的。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少50nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约60nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约70nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约80nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约90nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约100nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约110nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约120nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约130nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约130nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约140nm。在一些实施例中，圆形垫的直径为至少约150nm。在一些实施例中，圆形垫的直径小于约50nm。在一些实施例中，圆形垫的直径大于约150nm。
在一些实施例中，所述蛋白质是链霉亲和素。在一些实施例中，正电荷在用链霉亲和素标记的垫的表面处产生较低的能态。图9C示出了一个实施例，其中正电荷导致涂覆有链霉亲和素的垫(标记的SA垫)的表面处的较低能态。在一些实施例中，正电荷是可裂解的，使得它可以从引物中除去。
如图9A中所示，引物上的正电荷可产生结合能漏斗，其中包括与配体220(例如生物素)结合的模板链200的dsDNA经由对草坪引物210上的正电荷205的吸引而优先扩散至流通池的表面。图9B说明当模板链在表面附近扩散时，dsDNA通过链霉亲和素垫215与配体220的相互作用附着于模板/dsDNA。
制造流程
各种制造流程的方法可用于图案化流通池。
图7A示意性地示出了缺少孔的示例性制造流程。图案化表面95可在诸如玻璃、硅、塑料或任何其它合适材料的材料98上。图案化表面涂覆有链霉亲和素(SA)100或其它合适的蛋白质。该表面可以用链霉亲和素、其它合适的蛋白质，使用液相“浸泡”、旋涂或液滴分配来涂覆。
流通池包含图案化的剥离掩模。掩模可由金属制成，例如铝、钢、铁、铜、黄铜、锌、青铜或镁。金属可以通过光刻和蚀刻来图案化。掩模的厚度可以在大约50nm和大约150nm之间。在一些情况下，掩模的厚度小于50nm。在一些情况下，掩模的厚度大于约150nm。
在剥离步骤之后，蛋白质涂覆的(例如，链霉亲和素涂覆的)图案化表面被留下100。剥离步骤用能够除去金属(例如铝)但不除去蛋白质(例如链霉亲和素)的化学物质进行。然后用PAZAM 105或其它合适的凝胶材料涂覆表面。
图7B示意性地示出了其中存在单个孔111的示例性制造流程。图案化表面110可在诸如玻璃、硅、塑料或任何其它合适材料的材料113上。图案化表面涂覆有蛋白质例如链霉亲和素115，这导致孔111涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)115。可使用液相“浸泡”、旋涂或液滴分配用蛋白质(例如，链霉亲和素)涂覆表面。
流通池包含图案化的剥离掩模。掩模可由金属制成，例如铝、钢、铁、铜、黄铜、锌、青铜或镁。金属可以通过光刻和蚀刻来图案化。掩模的厚度可以在大约50nm和大约150nm之间。在一些情况下，掩模的厚度小于约50nm。在一些情况下，掩模的厚度大于约150nm。
在剥离步骤之后，仅孔111保持涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)115。用能够从孔中除去金属(例如铝)但不除去蛋白质(例如链霉亲和素)的化学品进行剥离步骤。然后用PAZAM 118或其它合适的凝胶材料涂覆图案化表面110和孔111。
图7C示意性地示出了示例制造流程，其中存在双孔、上部孔(大孔)125和下部孔(小孔)128。图案化表面120可在诸如玻璃、硅、塑料或任何其它合适材料的材料123上。图案化的表面涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)，这导致上部孔125涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)126并且下部孔128涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)126。可使用液相“浸泡”、旋涂或液滴分配用蛋白质(例如，链霉亲和素)涂覆表面。
流通池包含图案化的剥离掩模。掩模可由金属制成，例如铝、钢、铁、铜、黄铜、锌、青铜或镁。金属可以通过光刻和蚀刻来图案化。掩模的厚度可以在50nm和150nm之间。在一些情况下，掩模的厚度小于约50nm。在一些情况下，掩模的厚度大于约150nm。
在剥离步骤之后，仅下部孔128保持涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)126。剥离步骤用能够除去金属(例如铝)但不除去蛋白质(例如链霉亲和素)的化学物质进行。然后用PAZAM 130或其它合适的凝胶材料涂覆表面。
图7D示意性地示出包括在PAZAM沉积(或用另一种合适的凝胶材料沉积)之前的抛光步骤的示例性制造流程。图案化表面131涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)，这导致孔132涂覆有蛋白质(例如，链霉亲和素)150。可使用液相“浸泡”、旋涂或液滴分配用蛋白质(例如，链霉亲和素)涂覆表面。
在用链霉亲和素或其它合适的蛋白质涂覆之后，沉积掩模材料140。掩蔽材料的例子是碳硬掩模。然后抛光基底以除去涂覆在孔外的链霉亲和素并除去沉积在孔外的掩模层。
沉积PAZAM层(其它合适的凝胶材料)，并剥离掩模层。用于剥离的化学品将仅除去掩模材料，而将PAZAM 145或其它合适的凝胶材料和蛋白质(例如链霉亲和素)150留在孔上。
桥式扩增
桥式扩增可发生在流通池上。双链模板DNA与流通池中的草坪引物杂交，并且聚合酶用于延伸引物以形成双链DNA。双链DNA变性，DNA分子的原始模板链被洗掉。这导致单链DNA分子结合到流通池的草坪引物上。单链DNA分子通过与邻近的与单链DNA分子序列互补的草坪引物杂交而翻转并形成“桥”。聚合酶延伸杂交的引物，导致DNA分子的桥式扩增和双链DNA分子的产生。然后使双链DNA分子变性，产生单链模板的两个拷贝，其中一个被固定在支持物上，另一个可以被洗掉。作为载体固定的那个拷贝可用于进一步的桥式扩增操作，以便产生随后可被测序的簇。
核酸和模板文库
如技术人员将理解的，双链核酸通常将由两个互补的多核苷酸链形成，所述多核苷酸链由通过磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸组成，但可另外包含一个或多个核糖核苷酸和/或非核苷酸化学部分和/或非天然存在的核苷酸和/或非天然存在的主链键。具体地讲，双链核酸可包括非核苷酸化学部分，例如在一条或两条链的5’端处的接头或间隔区。作为非限制性示例，双链核酸可包括甲基化核苷酸、尿嘧啶碱基、硫代磷酸酯基团，也可包括肽偶联物等。可包括此类非DNA或非天然修饰以便赋予核酸一些期望的特性，例如用于实现对固体载体的共价附接、非共价附接或金属配位附接，或充当间隔子以将裂解位点定位成与固体载体的最佳距离。
典型的双链核酸模板(其可以在这种模板的文库中提供)的实施例显示在图11A中。在一个实施例中，模板的第一条链在5’至3’方向上包括第一草坪引物结合序列(例如P5)、索引序列(例如i5)、第一测序引物结合位点(例如SBS3)、对应于待测序的模板DNA的插入序列、第二测序引物结合位点(例如SBS12’)、第二索引序列(例如i7’)和第二草坪引物结合序列(例如P7的互补序列)。模板的第二条链在3’至5’方向上包括第一草坪引物结合位点(例如P5的互补序列)、索引序列(例如i5’，其与i5互补)、第一测序引物结合位点(例如SBS3’，其与SBS3互补)、对应于待测序模板DNA的互补序列的插入序列、第二测序引物结合位点(例如SBS12，其与SBS12互补)、第二索引序列(例如i7，其与i7互补)和第二草坪引物结合序列(例如P7)。
如图11B中所示，双链可包括生物素标签300，其可用于结合流通池表面上的涂覆有链霉亲和素的垫。在文库制备过程中，双链DNA可以用生物素标签标记。如图11C所示，P5和P7草坪引物可以在其一端含有带正电荷的分子305。
在一些实施例中，衔接子的引物结合序列与流通池表面上存在的短引物序列(或草坪引物)互补。衔接子的适当部分与它们的互补物(P5和P7)在例如流通池的表面上的结合，允许核酸扩增。
允许与扩增(草坪)引物杂交的衔接子中的引物结合序列的长度通常为约20-40个核苷酸，尽管在实施例中，本公开不限于该长度的序列。扩增引物中的精确同一性，并且因此衔接子中的同源序列对于本公开而言一般不重要，只要引物结合序列能够与扩增引物相互作用以便引导扩增即可。扩增引物的序列可对期望扩增的特定靶核酸具有特异性，但是在其他实施例中，这些序列可以是“通用”引物序列，这些通用引物序列能够扩增具有已知或未知序列的任何靶核酸，这些靶核酸已被修饰成能够用通用引物进行扩增。PCR引物的设计标准一般来讲是本领域普通技术人员所熟知的。在本公开中，“引物结合序列”也可称为“聚类序列”、“聚类引物”或“聚簇引物”，并且此类术语可互换使用。
索引序列(也称为条形码或标签序列)是独特的短DNA序列，其在文库制备期间被添加到每个DNA片段中。独特的序列允许许多文库合并在一起并同时测序。在最终数据分析之前，基于它们的条形码，通过计算鉴定并分类来自合并文库的测序读取。当使用小基因组进行工作或靶向感兴趣的基因组区域时，文库多路复用也是有用的技术。与条形码的多路复用可以指数地增加在单次运行中分析的样品的数目，而不显著增加运行成本或运行时间。标签序列的示例存在于WO05068656中，该文献的全部内容以引用方式并入本文。标签可在第一读取结束时被读取，或者同样在第二读取结束时被读取。本公开不受每簇的读取次数的限制，例如每簇两个读取：可简单地通过使第一延伸测序引物去杂交并且在簇再增殖/链再合成步骤之前或之后再杂交第二引物，来获得每簇三个或更多个读取。制备用于索引的合适样品的方法描述于例如在U.S.Pat.No.8,822,150中，该文献的全部内容以引用方式并入本文。还可使用单索引或双索引。使用单索引，可使用多达48个独特的6碱基索引，以产生多达48个独特标记的文库。使用双索引，可组合使用多达24个独特的8碱基索引1序列和多达16个独特的8碱基索引2序列，以产生多达384个独特标记的文库。还可使用索引对，使得每个i5索引和每个i7索引仅使用一次。使用这些独特的双索引，有可能识别和过滤索引的跳读，从而在多路复用样本中提供甚至更高的置信度。
测序结合位点是测序和/或索引引物结合位点，并且指示测序读取的起始点。在测序过程期间，测序引物与模板链上的测序结合位点的一部分退火(即，杂交)。DNA聚合酶与该位点结合，并将互补的核苷酸逐个碱基地掺入到生长的相反链中。在一个实施例中，测序过程包括第一测序读取和第二测序读取。第一测序读取可包括第一测序引物(读取1测序引物)与第一测序结合位点(例如SBS3’)的结合，随后是互补链的合成和测序。这导致插入序列的测序。在第二步中，索引测序引物(例如i7测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12)，从而导致索引序列的合成和测序(例如i7引物的测序)。第二测序读取可包括索引测序引物(例如i5测序引物)与模板上的第一测序结合位点的互补序列(例如SBS3)的结合，以及索引序列(例如i5)的合成和测序。在第二步中，结合到引物(例如i7测序引物)的互补序列的第二测序引物(读取2测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12’)，从而导致在反向方向上的插入序列的合成和测序。
固体载体
本公开可利用由基底或基质(例如，载玻片、聚合物小珠等)组成的固体载体，该基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料层或涂层而被官能化，这些反应性基团允许附接到生物分子诸如多核苷酸。此类载体的示例包括但不限于基底，诸如玻璃。在此类实施例中，生物分子(例如，多核苷酸)可直接共价附接到中间材料，但该中间材料本身可非共价附接到基底或基质(例如，玻璃基底)。术语“共价附接到固体载体”应相应地被解释为涵盖这种类型的布置。另选地，可处理基底(诸如玻璃)以允许生物分子的直接共价附接。在一些实施例中，将包被有链霉亲和素的垫放置在固体支持物上。链霉亲和素能够结合与生物素连接的模板。
模板链的扩增和测序
一旦制备了包含模板核苷酸链的文库，就将模板接种到固体载体上，然后扩增，以产生单模板分子的簇。
作为简单的示例，在附接P5和P7引物后，可在允许模板和固定引物(在本文中也称为“苔引物”)之间进行杂交(或退火——此类术语可互换使用)条件下，使固体载体与待扩增的模板接触。通常在合适的杂交条件下在自由溶液中添加模板，这对于技术人员将是显而易见的。通常，杂交条件是例如在40℃处5xSSC。然后可进行固相扩增。扩增的第一步骤是引物延伸步骤，其中使用模板将核苷酸添加到固定引物的3’端，以产生完全延伸的互补链。然后通常将模板从固体载体上洗掉。互补链将在其3’端包含引物结合序列(即P5或P7的互补序列)，该引物结合序列在一些方法中能够与固定在固体载体上的第二引物分子桥接并结合。在该方法中，另一轮扩增(类似于标准PCR反应)导致形成与固体载体结合的模板分子的簇或集落。因此，在该方法中，通过类似于WO 98/44151或WO 00/18957(该文献的内容以引用方式整体并入本文)的方法进行固相扩增将导致产生包含“桥接”扩增产物的集落的簇阵列。扩增产物的两条链将在5’端处或附近固定到固体载体上，这种附接来源于扩增引物的初始附接。通常，每个集落内的扩增产物将来源于单个模板(靶)分子的扩增。可使用其他扩增程序，并且将是技术人员已知的。例如，扩增可使用链置换聚合酶进行等温扩增；或者可以是如WO 2013/188582中所述的排除扩增，该文献的全部内容以引用方式并入本文。该方法还可涉及通过竞争性固定引物(或苔引物)的多轮侵入以及模板对竞争性引物的链置换。关于扩增的进一步信息可见于WO0206456和WO07107710中，这些文献中的每一篇的全部内容以引用方式并入本文。通过此类方法，形成单模板分子的簇。
通过从溶液中的引物中获得由模板的一条链读取的序列，使用固定引物复制该链，释放第一条链并对第二条复制链进行测序，可从模板双链体的两端获得序列数据。例如，可通过这样一种方法从固定双链体的两端获得序列数据：其中处理双链体以释放可用作延伸引物的3’-羟基部分。然后可使用延伸引物从模板的一条链读取第一序列。在第一次读取后，可延伸该链以完全复制所有碱基直至第一条链的末端。该第二拷贝保持附接到5’端的表面。在从表面去除第一链的情况下，可读取第二链的序列。这给出了来自原始片段的两端的序列读取。该链在第一次读取后再生的过程称为“配对末端再合成”或“PE再合成”。成对测序的典型步骤是已知的并且已描述于WO 2008/041002中，该文献的全部内容以引用方式并入本文。
可使用任何合适的“合成测序”技术进行测序，其中核苷酸连续添加到游离3’羟基基团上，从而导致在5’至3’方向上合成多核苷酸链。优选地在每次添加之后确定添加的核苷酸的性质。一种特定的测序方法依赖于使用可充当可逆链终止子的经修饰的核苷酸。此类可逆链终止剂包含可去除的3’封闭基团。一旦已将此类经修饰的核苷酸掺入与待测序的模板区域互补的生长的多核苷酸链中，就没有游离的3’-OH基团可用于引导进一步的序列延伸，所以聚合酶不能添加另外的核苷酸。一旦已确定掺入生长链中的碱基的性质，就可去除3’嵌段以允许添加下一个连续核苷酸。通过对使用这些经修饰核苷酸衍生的产物进行排序，就可推断出DNA模板的DNA序列。如果经修饰核苷酸中的每一者均已附接了已知对应于特定碱基的不同标记，以有利于区分在每个掺入步骤时添加的碱基，则可在单个实验中完成此类反应。合适的标记描述于PCT申请WO 2007/135368中，该申请的全部内容以引用方式并入本文。另选地，可进行含有单独添加的每种经修饰的核苷酸的单独反应。
经修饰的核苷酸可携带标记以有利于其检测。在具体实施例中，所述标记是荧光标记。每个核苷酸类型可携带不同的荧光标记。然而，可检测标记不需要是荧光标记。可使用允许检测核苷酸掺入DNA序列中的任何标记。一种用于检测荧光标记的核苷酸的方法包括使用对标记的核苷酸具有特异性波长的激光，或使用其他合适的照明源。来自掺入的核苷酸上的标记的荧光可通过CCD相机或其他合适的检测方式来检测。合适的检测方式描述于WO 2007/123744中，该文献的全部内容以引用方式并入本文。
可供选择的测序方法包括连接测序，例如，如US Pat.No.6,306,597或WO06084132中所述，这些文献中的每一篇的全部内容以引用方式并入本文。
使用聚合酶诸如DNA或RNA聚合酶进行延伸反应，其中将核苷酸添加到引物的3’端。在一个实施例中，聚合酶是非热等温链置换聚合酶。根据本公开的合适的非热稳定链置换聚合酶可以例如通过New England BioLabs,Inc.发现，并且包括phi29、Bsu、Klenow、DNA聚合酶I(大肠杆菌)和热敏电阻器。特别优选的聚合酶是Bsu。
提及P5和P7可指不同的引物序列。本公开涵盖任何合适的引物序列组合。
实施例
以下代表性实施例是本文所述的实施方案的代表，并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.在流通池上进行单克隆聚簇的方法
流通池表面用用于聚簇和接种的正交化学物质制备。如图1所示，接种仅可在包被有链霉亲和素10的垫上进行，而聚簇可发生在涂覆有接枝有标准P5/P7化学物质15的PAZAM的区域中。
如图2所示，在文库制备期间用配体如生物素25标记模板DNA 20，以能够接种在链霉亲和素垫上。文库保留为双链DNA(dsDNA)，其具有比单链DNA大得多的回转半径。因为DNA是dsDNA，非特异性和自相互作用被阻断30。
结果，接种导致尺寸排阻，这降低了单个簇发生多个接种事件的概率。即，一旦链霉亲和素垫已被单个dsDNA模板分子接种，该分子的大覆盖区(footprint)倾向于限制在相同垫上的其它接种事件。
dsDNA接种减少(1)ssDNA分子之间的导致文库分子聚束的非特异性相互作用，其可导致偏向多克隆簇的非泊松接种和(2)导致二级DNA结构的非特异性自相互作用，其可阻碍接种或聚簇。
小结合垫可以以多种方式形成。如图3A所示，可以在没有孔结构的流通池表面40上形成小结合垫35。如图3B所示，可以在流通池表面55上的小孔结构50上形成小结合垫45。如图3C所示，可以在流通池表面75上的大孔70内的小孔65内形成小结合垫60。
为了提高接种发生的速度，该方法可以任选地与添加到表面引物末端的可裂解的、带正电荷的分子的使用相结合。图4提供了包含表面引物85的流通池表面80的实施例。每个表面引物含有可裂解的正电荷90，其促进dsDNA向流通池的表面迁移。具体地，正电荷将充当结合漏斗以将带负电的dsDNA模板链吸引至所述表面，从而增加它们经由扩散与链霉亲和素垫相互作用的可能性。
实施例2.dsDNA的回转半径对单克隆级分的影响
已知dsDNA相对于ssDNA具有更大的回转半径。1,000碱基对链的dsDNA产生约70nm半径((Douglas R.Tree,Abhiram Muralidhar,Patrick S.Doyle,and Kevin D.Dorfman,Is DNA a Good Model Polymer？Macromolecules46,20,8369-8382(2013))。由于这种回转半径，相对于ssDNA，dsDNA在接种时具有更大的排阻覆盖区。
在模拟中，在纳米孔的网格上绘制随机接种位置。假设模板链不重叠。发生结合需要模板和孔的某一部分重叠。图5A和5B中所示的柱状图中产生的模拟数据是使用70nm回转半径和100nm垫产生的。假设100nm垫可用于制造，那么较小垫也是可能的。
图5A显示了接种的模拟，其中假设模板和孔之间需要15％的重叠。元素95显示了没有尺寸排阻的接种分布的柱状图。图5B显示了接种的模拟，其中假设需要模板和孔之间的30％重叠。元素100显示了没有尺寸排阻的接种分布的柱状图。
进行模拟直到90％的孔被占据。如果可以制造50nm垫，模拟表明用70nm dsDNA接种可以使80-90+％的占据的孔成为单克隆。
图6说明来自蒙特卡罗模拟的取样，其显示以各种可能参数(例如孔半径、DNA回转半径及DNA重叠)单克隆接种的孔的分数。测试了几千个孔和dsDNA链。在模拟中，假设每个模拟的DNA分子在流通池上在随机位置相互作用。如果DNA的覆盖区(由其假定的回转半径定义)缺乏与细胞的足够重叠，则假设该DNA链在模拟中未被接种。此外，如果该DNA链仅与已经被另一DNA链占据的孔重叠，则假设该DNA链在模拟中未被接种。然而，如果DNA链在先前未接种的位置与孔重叠，则假设该DNA链接种在其重叠的孔中。该接种事件阻止其它DNA链接种在该孔中。
表1显示了如果没有尺寸排阻，如果需要模板和孔之间的15％重叠，以及如果需要模板和孔之间的30％重叠，在该模型系统下的接种百分比。
表1.
1个接种 2个接种 3个接种 4个接种
无尺寸排阻 23.2％ 26.6％ 20.4％ 19.9％
需要15％的重叠 48.8％ 35.8％ 5.4％ 0.1％
需要30％的重叠 59.7％ 28.5％ 1.8％ 0％
实施例3.结合能漏斗
图8A提供了结合能漏斗的实施例，其中可裂解的带正电荷的基团连接至草坪引物。例如，裂解可通过裂解二硫键而发生。图8B提供了结合能漏斗的实施例，其中互补草坪引物与带正电荷的基团连接。带正电荷的基团可通过熔融除去。
实施例4.结合能漏斗的作用机制
图9A和9B提供了结合能漏斗的作用机制的实施例。如图9A所示，由于草坪引物210末端的正电荷205，模板链200扩散(如箭头所示)至流通池的表面。草坪引物上的正电荷可以是各种长度的分子或各种尺寸的分子，使得它们能够充分中和表面引物的负电荷的排斥力。本文描述了分子的各种大小和长度。也可以使用含有多个正电荷的分子如聚赖氨酸。本文描述了含有多个正电荷的其它分子。此外，还可以调节离子强度以减少静电排斥。或者，也可控制缓冲溶液的pH值，从而控制所述表面上的有效正电荷。如图9B所示，当模板链在所述表面附近扩散时，它们通过生物素标签220与链霉亲和素的相互作用被捕获在链霉亲和素垫215上。
生物素和链霉亲和素垫之间的结合能比弱引物电荷相互作用高得多。此外，相对于流通池上的流体通道的其余部分，在草坪引物上的正电荷在流通池的表面附近产生较低的能态(图9C)。
实施例5.使用dsDNA的单克隆聚簇的示例性方法
图10提供了使用dsDNA的单克隆聚簇的示例性方法。该方法包括以下步骤：
1.在流通池表面上产生链霉亲和素垫。
2.将覆盖有温和正电荷的表面引物添加到所述流通池表面。
3.将与生物素结合的双链DNA(dsDNA)接种于所述流通池表面。所述dsDNA含有靶核酸序列和互补核酸序列。相对于较小尺寸的垫，大dsDNA改善了单克隆性。
4.所述温和正电荷从表面引物上除去。
5.熔融DNA以除去互补的核酸序列。
6.对靶核酸进行测序以确定其身份。可以通过examplification或桥式扩增来扩增靶。实施例5描述了可通过ex-amp或桥扩增来扩增的与草坪引物结合的dsDNA。
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其他(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。

Claims (34)

1.一种扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括：
将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上，所述流通池包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含蛋白质，所述第二部分包含固定在所述流通池上的多个草坪引物，
其中所述dsDNA包含靶核酸序列和互补核酸序列，并且其中所述dsDNA与配体连接，导致所述配体与所述蛋白质之间的相互作用；
在所述配体与蛋白质相互作用后，使所述dsDNA变性以除去互补核酸序列；以及
使用所述草坪引物扩增所述靶核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种草坪引物的一端被正电荷加帽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述正电荷导致dsDNA向包含所述蛋白质的流通池的第一部分扩散。
4.根据权利要求2所述的方法，还包括在所述配体与所述蛋白质相互作用后，从所述草坪引物除去所述正电荷。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过裂解除去正电荷。
6.根据权利要求4所述的方法，其中通过熔融除去正电荷。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是链霉亲和素，并且其中所述配体是生物素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括P5草坪引物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括P7草坪引物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述草坪引物包括P5和P7草坪引物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上不包括任何孔。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池在其表面上包括孔。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述孔包括在大孔内的小孔。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述dsDNA接种到所述流通池上抑制了流通池上的其它接种事件。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圆形的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分包括在80nm和100nm之间的直径。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述流通池的所述第一部分是圆形垫。
18.一种将双链DNA(dsDNA)接种到流通池上的方法，所述方法包括：
将所述dsDNA接种到所述流通池上，所述流通池上包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含第一生物分子，所述第二部分包含固定在所述流通池上的多个草坪引物，
其中所述dsDNA包含靶核酸序列，并且其中所述dsDNA与第二生物分子连接，导致所述第二生物分子与所述第一生物分子之间的相互作用。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通过共价相互作用而相互作用。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子通过非共价相互作用而相互作用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述非共价相互作用包括蛋白质-配体相互作用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白质-配体相互作用包括链霉亲和素-生物素相互作用。
23.一种流通池，所述流通池包括：
表面，所述表面包括：
第一部分，其包括含有蛋白质的垫；和
第二部分，其包含P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一种。
24.根据权利要求23所述的流通池，其中所述第二部分包含P5和P7草坪引物两者。
25.根据权利要求23所述的流通池，其中P5草坪引物和P7草坪引物中的至少一个被正电荷加帽。
26.根据权利要求23所述的流通池，其中所述表面包括图案化表面。
27.根据权利要求26所述的流通池，其中所述图案化表面包括至少一个孔。
28.根据权利要求27所述的流通池，其中所述至少一个孔包括包含在至少一个大孔内的至少一个小孔。
29.根据权利要求26所述的流通池，其中所述图案化表面包括凝胶。
30.根据权利要求29所述的流通池，其中所述凝胶包括聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
31.一种流通池，所述流通池包括：
表面，所述表面涂覆有用正电荷加帽的引物；和
垫，所述垫包含蛋白质，其中所述垫对dsDNA具有比用正电荷加帽的引物更高的结合能。
32.根据权利要求31所述的流通池，其中所述正电荷在所述流通池的所述表面处产生较低的能态。
33.根据权利要求31所述的流通池，其中所述蛋白质包括链霉亲和素。
34.根据权利要求31所述的流通池，其中所述正电荷是可裂解的，使得它可以从所述引物中被去除。
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