CN119082058A - 除草剂抗性植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及能够在植物中特别是小麦和/或水稻植物中赋予除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体、原卟啉原氧化酶(PPO)突变体、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变体和/或对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体，以及产生包含所述乙酰乳酸合酶(ALS)突变体和/或原卟啉原氧化酶(PPO)突变体和/或乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变体和/或对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体的除草剂抗性植物特别是小麦和/或水稻植物的方法。
Description
本申请为申请日为2020年9月11日、申请号为202080063995.X、发明名称为“除草剂抗性植物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及能够在植物中特别是小麦和/或水稻植物中赋予除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体、原卟啉原氧化酶(PPO)突变体、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变体和/或对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体，以及产生包含所述乙酰乳酸合酶(ALS)突变体和/或原卟啉原氧化酶(PPO)突变体和/或乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变体和/或对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体的除草剂抗性植物特别是小麦和/或水稻植物的方法。
发明背景
作物例如小麦和水稻生产的一个主要威胁是杂草竞争，这会导致谷物产量降低和质量低劣。虽然可以用耕作来消除杂草，但是经耕种的土地的土壤易受到风和水的侵蚀。由于便于应用和有效性，除草剂处理是控制杂草的首选方法。在减少耕地或设计在土壤表面留下高水平残留物以防止侵蚀的直播种植系统中，除草剂也可以进行杂草控制。
植物中除草剂抗性的开发提供了重要的生产和经济优势；因此，使用除草剂来控制作物中的杂草或不期望的植物几乎成为普遍惯例。然而，此类除草剂的使用也会造成所需作物植物的死亡或生长的降低，这使得除草剂应用的时间和方法相当关键或者在某些情况下根本是不可行的。为了解决这一问题，其中的一个方法是开发抗除草剂的品种。在这个方法中，向作物施用除草剂以控制杂草，而不对抗除草剂的作物造成伤害。
对于农民而言，特别感兴趣的是使用具有更大效力、广杂草谱有效性和快速土壤降解的除草剂。通过允许使用除草剂来控制杂草生长并且没有损害作物的风险，对这些化合物具有抗性的植物、植物组织和种子提供了具有吸引力的解决方案。
广谱除草剂包括那些能抑制植物中乙酰乳酸合酶(ALS)活性、原卟啉原氧化酶(PPO)活性、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性或对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)活性的化合物。然而，小麦对于许多靶向单子叶植物的ALS或PPO抑制性除草剂是易感的，而水稻对于许多靶向单子叶植物的ACCase抑制性除草剂或HPPD抑制性除草剂是易感的，这使得几乎不可能使用这些除草剂来控制禾本科杂草。
因此，本领域仍然需要开发对ALS和/或PPO和/或ACCase和/或HPPD抑制性除草剂具有抗性的作物植物，例如小麦和/或水稻。
附图简述
图1示出小麦A、B和D基因组编码的ALS的氨基酸序列比对。该比对可用于确定例如参考A基因组编码的ALS氨基酸序列的氨基酸位置编号。
图2示出小麦A、B和D基因组编码的PPO的氨基酸序列比对。该比对可用于确定例如参考A基因组编码的PPO氨基酸序列的氨基酸位置编号。
图3示出高效氟吡甲禾灵喷施后存活的水稻抗性突变体。上图中存活的抗性突变体分别为S1866F杂合突变体、A1884P杂合突变体、P2128L纯合突变体；下图存活的抗性突变体为P1927F纯合及杂合突变体。上图和下图中野生型中花11号(WT)心叶均干枯死亡。坐标尺长度为1cm。
图4示出靶向OsACC-S1866、OsACC-A1884、OsACC-P2181、OsACC-P1927四个位点所产生的抗性突变体的突变类型。
发明内容
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“D”表示A、T或G，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for theyear2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
在肽或蛋白中，合适的保守型氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biologyof the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)，例如是体外转录生成的RNA。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。
启动子的实例包括但不限于聚合酶(pol)I、pol II或pol III启动子。当用于植物时，启动子可以是花椰菜花叶病毒35S启动子、玉米Ubi-1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子、玉米U3启动子、水稻肌动蛋白启动子。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”生物体是指用所述核酸或蛋白质转化生物体细胞，使得所述核酸或蛋白质在细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述生物体和其任何连续世代的基因组中。“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进基因组中。
如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plant cutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
植物“后代”包括植物的任何后续世代。
二、赋予除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变体
乙酰乳酸合酶(Acetolactate Synthase，ALS)是植物、微生物和真菌支链氨基酸合成过程中的关键酶。支链氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，是植物体内蛋白质合成及植物生长的必需氨基酸。支链氨基酸的生物合成途径需要四种酶的参与，其中，乙酰乳酸合酶在缬氨酸和亮氨酸的合成的第一步反应中负责催化2分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成过程中负责催化1分子丙酮酸与1分子α丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸和二氧化碳。若ALS活性受到抑制或破坏，将导致三种必需氨基酸的缺乏，进而影响植物正常生长。
ALS抑制性除草剂包括但不限于磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶基硫代苯甲酸类(PTB)和磺酰氨基-羰基-三唑啉酮类(SCT)化合物，或它们的任意组合。合适的磺酰脲化合物包括但不限于氯嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆、甲嘧磺隆、噻吩磺隆、吡嘧磺隆、酰嘧磺隆、烟嘧磺隆等。合适的咪唑啉酮类化合物的实例包括但不限于咪唑乙烟酸(imazethapyr)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草喹(imazaquin)等。其他合适的ALS抑制剂包括但不限于五氟磺草胺、氟唑磺隆、双草醚等。
在本发明中，发明人通过碱基编辑技术，创建并鉴定出对ALS抑制性除草剂具有抗性的新的ALS突变体。
因此，在一方面，本发明提供了一种乙酰乳酸合酶(ALS)突变体或其功能性片段，其相对于野生型ALS在选自第99、98、101和102位的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
如本文所用，“氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”(SEQ ID NO:x为本文所列的某一具体序列)指的是所描述的具体氨基酸的位置编号是该氨基酸在SEQ ID NO:x上对应的氨基酸的位置编号。不同序列中的氨基酸的对应性可以根据本领域公知的序列比对方法确定。例如氨基酸对应性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来确定(https://www.ebi.ac.uk/ Tools/psa/)，其中两个序列可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来对齐。例如，小麦B基因组编码的野生型ALS中从N末端起第98位的丙氨酸与SEQ ID NO:1(小麦A基因组编码的野生型ALS)的第99位的氨基酸在序列比对中对齐，则该丙氨酸在本文中可以被描述为“在小麦B基因组编码的野生型ALS的第99位的丙氨酸，所述ALS氨基酸位置参考SEQ IDNO:1”。
在一些实施方案中，所述ALS突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂的抗性。
在一些实施方案中，所述ALS突变体衍生自小麦野生型ALS。在一些实施方案中，所述小麦野生型ALS是小麦A基因组编码的野生型ALS。示例性的小麦A基因组编码的野生型ALS包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小麦野生型ALS是小麦B基因组编码的野生型ALS。示例性的小麦B基因组编码的野生型ALS包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小麦野生型ALS是小麦D基因组编码的野生型ALS。示例性的小麦D基因组编码的野生型ALS包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第98位的甘氨酸(G)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第101位的甲硫氨酸(M)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第102的谷氨酸(E)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被取代，并且在第98位的甘氨酸(G)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被取代，在第98位的甘氨酸(G)被取代，在第101位的甲硫氨酸(M)被取代，且在第102的谷氨酸(E)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第98位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第101位的甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第102位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代，且在第98位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段在第99位的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代，在第98位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，在第101位的甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，在第102位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段包含选自A99T、G98N、M101I、E102K的一个或多个氨基酸取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
如本文所用，ALS突变体的“功能性片段”指的是至少部分地或全部保留其衍生自的全长ALS突变体的功能的片段。
在一些实施方案中，相对于野生型ALS，所述ALS突变体或其功能性片段还包含一个或多个额外的氨基酸突变，例如保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述ALS突变体或其功能性片段包含与SEQ ID NO:4-8中任一具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、甚至100％序列相同性的氨基酸序列。
三、赋予除草剂抗性的原卟啉原氧化酶突变体
原卟啉原氧化酶(Protoporphyrinogen oxidase，PPO)在叶绿素合成中催化原卟啉原Ⅸ反应形成原卟啉Ⅸ，是叶绿素合成过程中的关键酶。PPO定位于叶绿体内，该酶被抑制后会引起对光敏感的原卟啉原Ⅸ迅速积累，并透过叶绿体膜而渗入叶绿体外的细胞质内。在细胞质中，原卟啉原Ⅸ自动氧化为原卟啉Ⅸ，高浓度的原卟啉Ⅸ在光和氧的作用下会产生有毒的单态氧，从而引起细胞膜的不饱和脂肪酸过氧化，导致膜渗漏，色素破坏，最终叶片死亡。
PPO抑制性除草剂包括但不限于二苯醚类、环状亚胺类、苯基吡唑类、二环三唑酮类化合物，或它们的任意组合。合适的PPO抑制性除草剂包括但不限于三氟羧草醚、唑啶草酮、治草醚、氟丙嘧草酯、唑酮草酯、氟哒嗪草酯、氟烯草酸、氟烯草酸戊酯、丙炔氟草胺、乙羧氟草醚、嗪草酸甲酯、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、丙炔噁草酮、噁草酮、乙氧氟草醚、吡草醚、苯嘧磺草胺、甲磺草胺、唑草酮等。
在本发明中，发明人通过碱基编辑技术，创建并鉴定出对PPO抑制性除草剂具有抗性的新的PPO突变体。
因此，在一方面，本发明提供了一种原卟啉原氧化酶(PPO)突变体或其功能性片段，其相对于野生型PPO在选自第127和129位的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述PPO突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂的抗性。
在一些实施方案中，所述PPO突变体衍生自小麦野生型PPO。在一些实施方案中，所述小麦野生型PPO是小麦A基因组编码的野生型PPO。示例性的小麦A基因组编码的野生型PPO包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小麦野生型PPO是小麦B基因组编码的野生型PPO。示例性的小麦B基因组编码的野生型PPO包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小麦野生型PPO是小麦D基因组编码的野生型PPO。示例性的小麦D基因组编码的野生型PPO包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第127位的精氨酸(R)被取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第129位的苏氨酸(T)被取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第127位的精氨酸(R)和在第129位的苏氨酸(T)被取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQID NO:9。
在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第127位的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第129位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段在第127位的精氨酸(R)精氨酸(R)被半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)取代，且在第129位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段包含选自R127C、R127G、T129I的一个或多个氨基酸取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
如本文所用，PPO突变体的“功能性片段”指的是至少部分地或全部保留其衍生自的全长PPO突变体的功能的片段。
在一些实施方案中，相对于野生型PPO，所述PPO突变体或其功能性片段还包含一个或多个额外的氨基酸突变，例如保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述PPO突变体或其功能性片段包含与SEQ ID NO:12-16中任一具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、甚至100％序列相同性的氨基酸序列。
四、赋予除草剂抗性的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)突变体
乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是催化乙酰辅酶A的羧化以生成丙二酸单酰辅酶A的生物素化酶。这个羧化是一个两步可逆的反应，由如下组成：由生物素羧化酶活性对羧基载体结构域的生物素基团进行ATP-依赖性羧化，然后由羧基转移酶活性将羧基基团从生物素转移至乙酰辅酶A(Nikolau et al.，2003，Arch.Biochem.Biophys.414：211-22)。乙酰辅酶A羧化酶不仅仅是植物体内脂肪酸合成的关键酶(合成过程发生在叶绿体和线粒体中)，ACCase还在长链脂肪酸和黄酮的形成过程中，以及发生在细胞质内的丙二酰化过程中发挥作用。ACCase有两种同工型，其中叶绿体ACCase占总ACCase活性的比例超过80％(Herbertet al.，1996，Biochem.J.318：997-1006)。芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)和环己二酮类(DIM)是已知能选择性抑制杂草中叶绿体ACCase的两类化学物质(Rendina et al.，1990，J.Agric.Food Chem.38：1282-1287)。此外，苯基吡唑啉类(DEN)也能抑制ACCase活性。
在本发明中，发明人通过碱基编辑技术，创建并鉴定出对除草剂例如芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)、环己二酮类(DIM)或苯基吡唑啉类(DEN)除草剂具有抗性的新的ACCase突变体。
因此，在一方面，本发明提供了一种ACCase突变体或其功能性片段，其相对于野生型ACCase在选自第1866、1884、1927或2181的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，所述ACCase突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂的抗性。
本发明各个实施方案所述的除草剂包括能够抑制ACCase活性的除草剂(ACCase抑制剂)，例如芳氧基苯氧基丙酸酯类、环己二酮类或苯基吡唑啉类，或它们的任意组合。合适的芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂的实例包括但不限于炔草酯(clodinafop-propargyl)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草灵(diclofop-methyl)、精恶唑禾草灵(fenoxaprop-p-ethyl)、吡氟禾草灵(fluazifop-b-butyl)、氟吡乙禾灵(haloxyfop-ethoxyethyl)、吡氟甲禾灵(haloxyfop-etotyl)、氟吡甲禾灵(haloxyfop-R-methyl)、恶草酸(propaquizafop)、精喹禾灵(quizalofop-p-ethyl)、高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-P)，或它们的任意组合。合适的环己二酮类除草剂的实例包括但不限于禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、clefoxydim、烯草酮(clethodim)、噻草酮(cycloxydim)、环苯草酮(profoxydim)、烯禾啶(sethoxydim)、吡喃草酮(teproloxydim)和三甲苯草酮(tralkoxydim)，或它们的任意组合。合适的苯基吡唑啉类除草剂的实例包括但不限于唑啉草酯(Pinoxaden)。
在一些实施方案中，所述ACCase突变体衍生自水稻野生型ACCase。示例性的水稻野生型ACCase包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1866位的丝氨酸(S)被取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1884的丙氨酸(A)被取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1927的脯氨酸(P)被取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第2181的脯氨酸(P)被取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1866位的丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ IDNO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1884的丙氨酸(A)被脯氨酸(P)取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第1927的脯氨酸(P)被苯丙氨酸(F)取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段在第2181的脯氨酸(P)被亮氨酸(L)取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段包含选自S1866F、A1884P、P1927、P2181L的一个或多个氨基酸取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
如本文所用，“功能性片段”指的是至少部分地或全部保留其衍生自的全长ACCase突变体的功能的片段。例如，所述功能性片段至少包括ACCase的羧基转移酶(CT)结构域，且包含上文所述的氨基酸突变。示例性的野生型ACCase羧基转移酶(CT)结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
在一些实施方案中，相对于野生型ACCase，所述ACCase突变体或其功能性片段还包含一个或多个额外的氨基酸突变，例如保守氨基酸取代。优选地，所述额外的氨基酸突变位于CT结构域之外。
在一些实施方案中，所述ACCase突变体或其功能性片段包含SEQ ID NO:32-35或37-40中任一所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ACCase突变体或其功能性片段包含与SEQ ID NO:32-35或37-40中任一具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列相同性的氨基酸序列。
五、赋予除草剂抗性的对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)突变体
对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)同时参与酪氨酸分解代谢和质体醌和生育酚的生物合成两条代谢途径。对羟基苯基丙酮酸在HPPD酶催化下转化得到尿黑酸。尿黑酸进一步脱羧、烷基化，生成质体醌和生育酚。质体醌在类胡萝卜素生物合成中作为最终的电子受体以及光合链中的电子传递体，类囊体中质体醌的缺乏将导致类胡萝卜素生物合成减少。对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)抑制剂具有广谱的除草活性，能防除阔叶作物中的阔叶杂草，可以在芽前使用，也可以在苗后使用，具有活性高、残留低、环境相容性好、使用安全的特点。
HPPD抑制性除草剂包括但不限于吡唑类、三酮类、异噁唑类、二酮腈类和二苯酮类化合物，或它们的任意组合。合适的吡唑类化合物包括但不限于苯吡唑草酮(苞卫)、磺酰草吡唑、酸苯偶氮吡胺等。合适的三酮类化合物包括但不限于磺草酮、硝磺草酮、特波三酮、特糠酯酮、双环吡喃酮、苯并双环酮等。合适的异噁唑类化合物包括但不限于异噁唑草酮。合适的二酮腈类化合物包括但不限于2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮。
在本发明中，发明人通过碱基编辑技术，创建并鉴定出对HPPD抑制性除草剂具有抗性的新的HPPD突变体。
因此，在一方面，本发明提供了一种HPPD突变体或其功能性片段，其相对于野生型HPPD至少在选自第365、379、353、354、346、347、369或370位的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
如本文所用，“氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”(SEQ ID NO:x为本文所列的某一具体序列)指的是所描述的具体氨基酸的位置编号是该氨基酸在SEQ ID NO:x上对应的氨基酸的位置编号。不同序列中的氨基酸的对应性可以根据本领域公知的序列比对方法确定。例如氨基酸对应性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来确定(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)，其中两个序列可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来对齐。例如，一多肽从其N末端起第360位的氨基酸与SEQ ID NO:x的第365位的氨基酸在序列比对中对齐，则该多肽中的该氨基酸在本文中也可以被描述为“在该多肽的第365位的丙氨酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体或其功能性片段在植物中表达时，能够赋予所述植物对除草剂例如HPPD抑制性除草剂的抗性。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体衍生自水稻野生型HPPD。示例性的水稻野生型HPPD包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第365位的亮氨酸(L)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第379位的苏氨酸(T)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第353位的谷氨酸(E)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第354位的谷氨酸(E)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第353位的谷氨酸(E)和第354位的谷氨酸(E)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第346的精氨酸(R)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ IDNO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第347位的丙氨酸(A)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第346的精氨酸(R)和在第347位的丙氨酸(A)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第369位的天冬氨酸(D)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第370位的天冬氨酸(D)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第369位的天冬氨酸(D)和在第370位的天冬氨酸(D)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第365位的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第379位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第353位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第354位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第353位的谷氨酸(E)和第354位的谷氨酸(E)分别被赖氨酸(K)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第346的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第347位的丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第346的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代和在第347位的丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第369位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第370位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段在第369位的天冬氨酸(D)和在第370位的天冬氨酸(D)分别被天冬酰胺(N)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段至少包含选自L365F、T379I、E353K、E354K、E353K/E354K、R346C、A347V、R346C/A347V、D369N、D370N、D369N/D370N的一个或多个氨基酸取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
如本文所用，“功能性片段”指的是至少部分地或全部保留其衍生自的全长HPPD突变体的功能的片段。
在一些实施方案中，相对于野生型HPPD，所述HPPD突变体或其功能性片段还包含一个或多个额外的氨基酸突变，例如保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述HPPD突变体包含与SEQ ID NO:46-50中任一具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPPD突变体包含SEQ ID NO:46-50中任一所示的氨基酸序列。
六、相关核酸、构建体和除草剂抗性植物
在另一方面，本发明还提供一种核酸，其包含编码本发明的ALS突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的PPO突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的ACCase突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸是分离的核酸或是重组核酸。
在一些实施方案，所述编码本发明的ALS突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的PPO突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的ACCase突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列可以针对感兴趣的植物进行密码子优化。
在另一方面，本发明还提供一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码ALS突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的PPO突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的ACCase突变体或其功能性片段的核苷酸序列，和/或编码本发明的HPPD突变体或其功能性片段的核苷酸序列。
在另一方面，本发明还提供一种表达构建体，其包含本发明的表达盒。
在另一方面，本发明还提供本发明的ALS突变体或其功能性片段、本发明的PPO突变体或其功能性片段、本发明的ACCase突变体或其功能性片段、本发明的HPPD突变体或其功能性片段、本发明的分离的核酸、本发明的表达盒或本发明的表达构建体在产生除草剂抗性植物中的用途。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，其包含(例如表达)本发明的ALS突变体或其功能性片段，和/或本发明的PPO突变体或其功能性片段，和/或本发明的ACCase突变体或其功能性片段，和/或本发明的HPPD突变体或其功能性片段。
本发明各个方面中所述植物可以是对ALS抑制剂和/或PPO抑制剂和/或ACCase抑制剂和/或HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米等。在一些优选实施方案中，所述植物是小麦。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。
本发明各个方面中所述除草剂抗性可以是对ALS抑制性除草剂和/或PPO抑制性除草剂和/或ACCase抑制性除草剂和/或HPPD抑制性除草剂的抗性。
七、通过转基因产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明还提供一种通过转基因产生除草剂抗性植物的方法，包括将本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体导入植物中。
可以使用本领域已知的各种方法将本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体导入所述植物中。合适的导入方法包括但不限于基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。
在一些实施方案中，本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体整合至所述植物的基因组中。本发明的分离的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体将赋予所述植物对能够抑制ALS活性和/或PPO活性和/或ACCase活性和/或HPPD活性的除草剂的抗性。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物包含本发明的表达盒、本发明的核酸或表达构建体，或由本发明的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体转化。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
本发明各个方面中所述植物可以是对ALS抑制剂和/或PPO抑制剂和/或ACCase抑制剂和/或HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米等。在一些优选实施方案中，所述植物是小麦。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。
八、通过碱基编辑产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明还提供一种通过碱基编辑产生除草剂抗性植物的方法，包括将靶向所述植物基因组中内源ALS编码区和/或内源PPO编码区和/或内源ACCase编码区和/或内源HPPD编码区的碱基编辑系统导入所述植物，由此导致
(i)所述内源ALS在选自第99、98、101和102位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1，和/或
(ii)所述内源PPO在选自第127和129位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9，和/或
(iii)所述内源ACCase在选自第1866、1884、1927或2181的一或多个位置处的氨基酸突变，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31，和/或
(iv)所述内源HPPD在选自第365、379、353、354、346、347、369或370位的一或多个位置处的氨基酸突变，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ALS在第99位的丙氨酸(A)被取代，和/或在第98位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第101位的甲硫氨酸(M)被取代，和/或在第102的谷氨酸(E)被取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ALS在第99位的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代，和/或在第98位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，和/或在第101位的甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，和/或在第102位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ALS包含选自A99T、G98N、M101I、E102K的一个或多个氨基酸取代，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源PPO在第127位的精氨酸(R)被取代，和/或在第129位的苏氨酸(T)被取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源PPO在第127位的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)取代，和/或在第129位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源PPO包含选自R127C、R127G、T129I的一个或多个氨基酸取代，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ACCase在第1866位的丝氨酸(S)被取代，和/或在第1884的丙氨酸(A)被取代，和/或在第1927的脯氨酸(P)被取代，和/或在第2181的脯氨酸(P)被取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ACCase在第1866位的丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第1884的丙氨酸(A)被脯氨酸(P)取代，和/或在第1927的脯氨酸(P)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第2181的脯氨酸(P)被亮氨酸(L)取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源ACCase包含选自S1866F、A1884P、P1927、P2181L的一个或多个氨基酸取代，所述ACCase氨基酸位置参考SEQID NO:31。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被取代，和/或在第379位的苏氨酸(T)被取代，和/或在第353位的谷氨酸(E)被取代，和/或在第354位的谷氨酸(E)被取代，和/或在第346的精氨酸(R)被取代，和/或在第347位的丙氨酸(A)被取代，和/或在第369位的天冬氨酸(D)被取代，和/或在第370位的天冬氨酸(D)被取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第379位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，和/或在第353位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，和/或在第354位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，和/或在第346的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代，和/或在第347位的丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代，和/或在第369位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代，和/或在第370位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统的导入导致所述内源HPPD包含选自L365F、T379I、E353K、E354K、E353K/E354K、R346C、A347V、R346C/A347V、D369N、D370N、D369N/D370N的一个或多个氨基酸取代，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
本发明可用的碱基编辑系统可以是本领域已知的各种碱基编辑系统，只要其能在植物内进行靶向基因组碱基编辑。例如，所述碱基编辑系统包括但不限于WO 2018/056623、WO 2019/120283、WO 2019/120310中记载的那些。
在一些实施方案中，所述碱基编辑系统包含碱基编辑融合蛋白或包含编码其的核苷酸序列的表达构建体，以及至少一种向导RNA或包含编码其的核苷酸序列的表达构建体，例如所述系统包含以下i)至v)中至少一项：
i)碱基编辑融合蛋白，和至少一种向导RNA；
ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和至少一种向导RNA；
iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述碱基编辑融合蛋白包含CRISPR效应蛋白和脱氨酶结构域，所述至少一种向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的内源ALS编码序列和/或内源PPO编码序列和/或内源ACCase编码序列和/或内源HPPD编码序列。
在本文实施方案中，“碱基编辑融合蛋白”和“碱基编辑器”可互换使用，指的是可以以序列特异性方式介导基因组中靶序列的一或多个核苷酸取代的蛋白。
如本文所用，术语“CRISPR效应蛋白”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶(CRISPR核酸酶)或其功能性变体。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现序列特异性靶向的任何效应蛋白。
如本文所用，就CRISPR核酸酶而言的“功能性变体”意指其至少保留向导RNA介导的序列特异性靶向能力。优选地，所述功能性变体是核酸酶失活的变体，即其缺失双链核酸切割活性。然而，缺失双链核酸切割活性的CRISPR核酸酶也涵盖切口酶(nickase)，其在双链核酸分子形成切口(nick)，但不完全切断双链核酸。在本发明的一些优选的实施方案中，本发明所述CRISPR效应蛋白具有切口酶活性。在一些实施方案中，所述功能性变体相对于野生型核酸酶识别不同的PAM(前间区序列邻近基序)序列。
“CRISPR效应蛋白”可以衍生自Cas9核酸酶，包括Cas9核酸酶或其功能性变体。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SaCas9。“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。野生型spCas9的示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:17。
“CRISPR效应蛋白”还可以衍生自Cpf1核酸酶，包括Cpf1核酸酶或其功能性变体。所述Cpf1核酸酶可以是来自不同物种的Cpf1核酸酶，例如来自Francisella novicidaU112、Acidaminococcus sp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。
可用的“CRISPR效应蛋白”还可以衍生自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Csn2、Cas4、C2c1、C2c3或C2c2核酸酶，例如包括这些核酸酶或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的Cas9。Cas9核酸酶的DNA切割结构域已知包含两个亚结构域：HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域。HNH亚结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC亚结构域切割非互补的链。在这些亚结构域中的突变可以使Cas9的核酸酶活性失活，形成“核酸酶失活的Cas9”。所述核酸酶失活的Cas9仍然保留gRNA指导的DNA结合能力。
本发明所述核酸酶失活的Cas9可以衍生自不同物种的Cas9，例如，衍生自化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)，或衍生自金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)。同时突变Cas9的HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域(例如，包含突变D10A和H840A)使Cas9的核酸酶失去活性，成为核酸酶死亡Cas9(dCas9)。突变失活其中一个亚结构域可以使得Cas9具有切口酶活性，即获得Cas9切口酶(nCas9)，例如，仅具有突变D10A的nCas9。
因此，在本发明的一些实施方案中，本发明所述核酸酶失活的Cas9变体相对于野生型Cas9包含氨基酸取代D10A和/或H840A，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些优选实施方式中，所述核酸酶失活的Cas9相对于野生型Cas9包含氨基酸取代D10A，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些实施方式中，所述核酸酶失活的Cas9包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列(nCas9(D10A))。
Cas9核酸酶在用于基因编辑时，通常需要靶序列在3’端具有5’-NGG-3’的PAM(前间区序列邻近基序)序列。然而，也可以使用识别不同的PAM序列的CRISPR效应蛋白，例如具有不同的PAM序列的Cas9核酸酶功能性变体。
在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体。识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体在本文也称为Cas9-NG。在一些实施方案中，Cas9-NG相对于野生型Cas9包含以下氨基酸取代R1335V、L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、T1337R，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体。在一些实施方案中，核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体相对于野生型Cas9包含以下氨基酸取代D10A、R1335V、L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、T1337R，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列(nCas9-NG(D10A))。
在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是识别PAM序列5’-NGA-3’的Cas9变体，即VQR-Cas9。在一些实施方案中，VQR-Cas9相对于野生型Cas9包含以下氨基酸取代：D1135V、R1335Q和T1337R，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，所述CRISPR效应蛋白是核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NGA-3’的Cas9变体。在一些实施方案中，核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NGA-3’的Cas9变体相对于野生型Cas9包含以下氨基酸取代D10A、D1135V、R1335Q和T1337R，其中氨基酸编号参照SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，核酸酶失活的且识别PAM序列5’-NG-3’的Cas9变体包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列(nCas9-VQR(D10A))。
本文所述脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨结构域或腺嘌呤脱氨结构域。
如本文所用，“胞嘧啶脱氨结构域”指的是能够接受单链DNA作为底物，催化胞苷或脱氧胞苷分别脱氨化为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶的结构域。
可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶的实例包括但不限于例如APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G、CDA1、人APOBEC3A脱氨酶，或它们的功能性变体。在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶是人APOBEC3A脱氨酶或其功能性变体。在一些实施方案中，人APOBEC3A脱氨酶包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列。在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶是PmCDA1。在一些实施方案中PmCDA1包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列。
如本文所用，“腺嘌呤脱氨结构域”是指能够接受单链DNA作为底物，催化腺苷或脱氧腺苷(A)形成肌苷(I)的结构域。在一些实施方案中，所述腺嘌呤脱氨酶是大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶TadA(ecTadA)的变体，例如，包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白包含如SEQ ID NO:24或25或89所示的氨基酸序列。
如本文所用，“向导RNA”和“gRNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR效应蛋白形成复合物并由于与靶序列具有一定相同性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。向导RNA通过与靶序列互补链之间的碱基配对而靶向所述靶序列。例如，Cas9核酸酶或其功能性变体所采用的gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够相同性以便与该靶序列的互补链杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的引导序列(也称种子序列)。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。而Cpf1核酸酶或其功能性变体所采用的gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成，其也可称为sgRNA。基于所使用的CRISPR核酸酶和待编辑的靶序列设计合适的gRNA属于本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含所述内源ALS编码区中的靶序列，所述靶序列所编码的氨基酸序列包含所述内源ALS在选自第99、98、101和102位的一或多个位置处的氨基酸，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些具体实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含SEQ ID NO:26-27之一所示的核苷酸序列或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含所述内源PPO编码区中的靶序列，所述靶序列所编码的氨基酸序列包含所述内源PPO在选自第127和129位的一或多个位置处的氨基酸，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。在一些具体实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含SEQ ID NO:28-30之一所示的核苷酸序列或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明所述gRNA包含所述内源ACCase编码区中的靶序列，所述靶序列所编码的氨基酸序列包含所述内源ACCase在选自第1866、1884、1927或2181的一或多个位置处的氨基酸，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。在一些具体实施方案中，本发明所述gRNA包含SEQ ID NO:41-44之一所示的核苷酸序列或其互补序列。
在一些实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含所述内源HPPD编码区中的靶序列，所述靶序列所编码的氨基酸序列包含所述内源HPPD在选自第365、379、353、354、346、347、369或370位的一或多个位置处的氨基酸，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。在一些具体实施方案中，本发明所述至少一种gRNA包含SEQ ID NO:52-88之一所示的核苷酸序列或其互补序列。
在本发明的方法中，所述碱基编辑系统可以本领域技术人员熟知的各种方法导入植物。可用于将本发明的碱基编辑系统导入植物的方法包括但不限于：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。
在本发明的方法中，只需在植物细胞中导入或产生所述碱基编辑融合蛋白和向导RNA即可实现对靶序列的修饰，并且所述修饰可以稳定遗传，无需将所述碱基编辑系统稳定转化植物。这样避免了稳定存在的碱基编辑系统的潜在脱靶作用，也避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合，从而具有更高生物安全性。
在一些优选实施方式中，所述导入在不存在选择压力下进行，从而避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在一些实施方式中，所述导入包括将本发明的碱基编辑系统转化至分离的植物细胞或组织，然后使所述经转化的植物细胞或组织再生为完整植物。优选地，在不存在选择压力下进行所述再生，也即是，在组织培养过程中不使用任何针对表达载体上携带的选择基因的选择剂。不使用选择剂可以提高植物的再生效率，获得不含外源核苷酸序列的除草剂抗性植物。
在另一些实施方式中，可以将本发明的碱基编辑系统转化至完整植物上的特定部位，例如叶片、茎尖、花粉管、幼穗或下胚轴。这特别适合于难以进行组织培养再生的植物的转化。
在本发明的一些实施方式中，直接将体外表达的蛋白质和/或体外转录的RNA分子转化至所述植物。所述蛋白质和/或RNA分子能够在植物细胞中实现碱基编辑，随后被细胞降解，避免了外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物通过本发明的碱基编辑方法产生。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
在本发明的一些实施方式中，所述除草剂抗性植物是非转基因的。
本发明各个方面中所述植物可以是对ALS抑制剂和/或PPO抑制剂和/或ACCase抑制剂和/或HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米等。在一些优选实施方案中，所述植物是小麦。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。
在一些实施方案中，所述植物是小麦，且所述内源ALS和/或内源PPO是由小麦A基因组、B基因组和/或D基因组编码。
九、通过物理或化学诱变产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，包括对所述植物的群体进行物理或化学诱变，并且筛选
(i)内源ALS在选自第99、98、101和102位的一或多个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1；和/或
(ii)内源PPO在选自第127和129位的一或多个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9；和/或
(iii)内源ACCase在选自第1866、1884、1927或2181的一或多个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31；和/或
(iv)内源HPPD在选自第365、379、353、354、346、347、369或370位的一或多个位置处包含氨基酸突变的植物，其中所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，筛选内源ALS在第99位的丙氨酸(A)被取代，和/或在第98位的甘氨酸(G)被取代，和/或在第101位的甲硫氨酸(M)被取代，和/或在第102的谷氨酸(E)被取代的植物，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源ALS在第99位的丙氨酸(A)被苏氨酸(T)取代，和/或在第98位的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代，和/或在第101位的甲硫氨酸(M)被异亮氨酸(I)取代，和/或在第102位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代的植物，所述ALS氨基酸位置参考SEQID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源ALS包含选自A99T、G98N、M101I、E102K的一个或多个氨基酸取代的植物，所述ALS氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，筛选内源PPO在第127位的精氨酸(R)被取代和/或在第129位的苏氨酸(T)被取代的植物，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，筛选内源PPO在第127位的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)或甘氨酸(G)取代，和/或在第129位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代的植物，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，筛选内源PPO包含选自R127C、R127G、T129I的一个或多个氨基酸取代的植物，所述PPO氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，筛选内源ACCase在第1866位的丝氨酸(S)被取代，和/或在第1884的丙氨酸(A)被取代，和/或在第1927的脯氨酸(P)被取代，和/或在第2181的脯氨酸(P)被取代的植物，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，筛选内源ACCase在第1866位的丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第1884的丙氨酸(A)被脯氨酸(P)取代，和/或在第1927的脯氨酸(P)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第2181的脯氨酸(P)被亮氨酸(L)取代的植物，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，筛选内源ACCase包含选自S1866F、A1884P、P1927、P2181L的一个或多个氨基酸取代的植物，所述ACCase氨基酸位置参考SEQ ID NO:31。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被取代，和/或在第379位的苏氨酸(T)被取代，和/或在第353位的谷氨酸(E)被取代，和/或在第354位的谷氨酸(E)被取代，和/或在第346的精氨酸(R)被取代，和/或在第347位的丙氨酸(A)被取代，和/或在第369位的天冬氨酸(D)被取代，和/或在第370位的天冬氨酸(D)被取代的植物，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD在第365位的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代，和/或在第379位的苏氨酸(T)被异亮氨酸(I)取代，和/或在第353位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，和/或在第354位的谷氨酸(E)被赖氨酸(K)取代，和/或在第346的精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代，和/或在第347位的丙氨酸(A)被缬氨酸(V)取代，和/或在第369位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代，和/或在第370位的天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代的植物，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，筛选内源HPPD包含选自L365F、T379I、E353K、E354K、E353K/E354K、R346C、A347V、R346C/A347V、D369N、D370N、D369N/D370N的一个或多个氨基酸取代的植物，所述HPPD氨基酸位置参考SEQ ID NO:45。
在一些实施方案中，所述物理诱变可以通过放射性照射所述植物群体实现。在一些实施方法，所述化学诱变可以通过用甲基磺酸乙酯(EMS)处理所述植物群体(例如处理植物种子)实现。
在一些实施方案中，所述筛选可以通过对所述内源ALS和/或内源PPO和/或内源ACCase和/或内源HPPD的编码序列进行测序实现。
在另一方面，本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物通过本发明的物理或化学诱变方法产生。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
本发明各个方面中所述植物可以是对ALS抑制剂和/或PPO抑制剂和/或ACCase抑制剂和/或HPPD抑制剂敏感的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米等。在一些优选实施方案中，所述植物是小麦。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。
十、植物育种方法
在另一方面，本发明提供一种植物育种方法，包括将通过本发明上述的方法获得的具有除草剂抗性的第一植物与不含有所述除草剂抗性的第二植物杂交，从而将所述除草剂抗性导入第二植物。
本发明各个方面中所述植物可以是对ALS抑制剂和/或PPO抑制剂敏感和/或ACCase抑制剂和/或HPPD抑制剂的植物，包括单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物，例如单子叶作物植物。合适的植物的实例包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米等。在一些优选实施方案中，所述植物是小麦。在一些优选实施方案中，所述植物是水稻。
实施例
实施例1、小麦ALS抗性突变体的产生和鉴定
1.所使用的单碱基编辑工具
使用了融合PmCDA1胞嘧啶脱氨酶的PmCDA1-VQR-PBE单碱基编辑系统。PmCDA1胞嘧啶脱氨酶的序列来自Nishida,K.,等人(2016).Targeted nucleoffide editing usinghybrid prokaryoffic and vertebrate adaptive immune systems.Science 353,aaf8729。VQR-Cas9是一种SpCas9的变体，可以识别NGA类型的PAM序列。PmCDA1胞嘧啶脱氨酶、VQR-Cas9(D10A)和UGI部分对谷类植物进行密码子优化，并商业合成(GENEWIZ，Suzhou，China)。通过Gibson组装方法(Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit，Vazyme，Nanjing，China)将各种结构组装进pJIT163骨架。该工作中的PCR使用TransStart FastPfuDNA聚合酶(TransGen Biotech)进行。
2.构建多靶点sgRNA和crRNA表达载体
设计并合成带有同源序列的靶位点引物：
T1(W16-B)-F：GGGACGCGCCGCCAGGGTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
T1(W16-B)-BSF：ATATTGGTCTCTCTTGGGACGCGCCGCCAGGGTAGGGTT
T2(W1)-R：CATCATGCGGCGGGGGACCTGCGCTTCTTGGTGCCGCGCC
T2(W1)-F：GCAGGTCCCCCGCCGCATGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
T3(W16-D)-R：CCCTACCCCGGCGGCGCCTCCCGCCACGGATCATCTGCACAAC
T3(W16-D)-BSR：TTATAGGTCTCTAAACCCTACCCCGGCGGCGCCTCCCGC
根据Xing,H.L.et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editingin plants.BMC Plant Biol.14,327(2014).的方法，构建针对两种靶序列(SEQ ID NO:26和27，分别位于B基因组ALS编码序列和D基因组ALS编码序列)的sgRNA表达载体。
3.基因枪法转化
所用到的小麦(Triticum aestivum L.)品种是冬麦科农199。利用基因枪介导的转化方法将PmCDA1-VQR-PBE质粒与sgRNA质粒按照1：1的摩尔比进行混合，轰击小麦未成熟幼胚，具体过程参考Rasco-Gaunt(2001).Procedures allowing the transformation ofarange of European elite wheat(Triticum aestivum L.)varieties via particlebombardment.J.Exp.Bot.52,865-874.。
4.除草剂筛选体系建立
以已有的抗甲咪唑烟酸的小麦植株作为阳性对照，野生型小麦作为阴性对照。在小麦生根培养基中加入不同浓度的甲咪唑烟酸，摸索出合适的筛选浓度，即1/15的甲咪唑烟酸大田使用浓度。在该药剂浓度下，野生型小麦生根受到明显抑制，而过表达的阳性小麦能够正常生根生长。
5.基因型鉴定
将筛选出的阳性植株取样，利用天根快捷型植物基因组提取试剂盒(天根DP321)小量提取植物基因组DNA，再经过Sanger测序后确定其具体基因型。结果如下表1所示。
表1.TaALS抗性突变体小麦的氨基酸突变类型(A基因组-A99对应于B基因组-A98和D基因组-A96)
实施例2、小麦PPO抗性突变体的产生和鉴定
1.所使用的单碱基编辑工具
使用了融合hAPOBEC3A胞嘧啶脱氨酶的A3A-PBE体系(5.Zong,Y.,et al.(2018)."Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and humanAPOBEC3A."Nat.Biotechnol.36(10):950)。
2.构建多靶点sgRNA表达载体
设计并合成带有同源序列的靶位点引物。
| T1(R98-AD)-F | GAAGCGTTATACTGTTAAGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| T1(R98-AD)-BsF | ATATTGGTCTCTCTTGAAGCGTTATACTGTTAAGGAGTT |
| T2(W1)-R | CATCATGCGGCGGGGGACCTGCGCTTCTTGGTGCCGCGCC |
| T2(W1)-F | GCAGGTCCCCCGCCGCATGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| T3(R98-B)-R | CTTCTTAACAGTATAACGCTTCGCCACGGATCATCTGCACAAC |
| T3(R98-B)-BsR | TTATAGGTCTCTAAACTTCTTAACAGTATAACGCTTCGC |
根据3.Xing,H.L.et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genomeediting in plants.BMC Plant Biol.14,327(2014).的方法，构建针对三种靶序列(SEQID NO:28-30，分别位于A基因组PPO编码序列、B基因组PPO编码序列和D基因组PPO编码序列)的sgRNA表达载体。
3.基因枪法转化
所用到的小麦(Triticum aestivum L.)品种是冬麦科农199。利用基因枪介导的转化方法将A3A-PBE质粒与sgRNA质粒按照1：1的摩尔比进行混合，轰击小麦未成熟幼胚，具体过程参考Rasco-Gaunt等(2001).Procedures allowing the transformation of arange of European elite wheat(Triticum aestivum L.)varieties via particlebombardment.J.Exp.Bot.52,865-874.。
4.除草剂筛选体系建立
以过表达PPO蛋白的小麦植株作为阳性对照，野生型小麦作为阴性对照。在小麦生根培养基中加入不同浓度的乳氟禾草灵药剂，摸索出合适的筛选浓度，即1/6成乳氟禾草灵的大田使用浓度。在该药剂浓度下，野生型小麦生根受到明显抑制，而过表达的阳性小麦能够正常生根生长。
5.基因型鉴定
将筛选出的阳性植株取样，利用天根快捷型植物基因组提取试剂盒(天根DP321)小量提取植物基因组DNA，再经过Sanger测序后确定其具体基因型。结果如下表2所示。
表2.PPO抗性突变体小麦的氨基酸突变类型(A基因组-R127对应于B基因组-R129和D基因组-R133)
实施例3水稻ACCase抗性突变体的产生和鉴定
3.1构建A3A-PBE-NG载体
以pH-A3A-PBE载体(Q.Shan et al.,Targeted genome modification of cropplants using a CRISPR-Cas system.Nature Biotechnology 31,686(2013))为基本骨架，通过Gibson组装方法将nCas9部分替换为含有D10A/R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R突变的nCas9-NG(Y.Zong et al.,Efficient C-to-T baseediting in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A.Nat Biotechnol,(2018))，获得能够识别NG PAM序列的碱基编辑载体A3A-PBE-NG。其中nCas9-NG序列由金唯智公司合成(GENEWIZ,Suzhou,China)。
3.2构建靶向水稻OsACC基因的碱基编辑载体
选择靶向水稻OsACC的羧基转移酶(CT)结构域的4个靶序列(见表3)，根据YuanZong报道文章中sgRNA载体构建方法(同上)，分别构建针对表3中不同位点的碱基编辑载体。
表3
注：下划线为PAM序列
3.3农杆菌转化水稻
将包含针对靶位点的sgRNA编码序列的A3A-PBE-NG载体通过电穿孔转化进农杆菌AGL1菌株。根据Shan等人进行水稻栽培种中花11的农杆菌介导的转化、组织培养和再生。在全部的组织培养过程中使用潮霉素筛选(50μg/ml)。
3.4抗性植株的筛选及鉴定
根据再生植株的生长状态，将培养基上再生的T0代植株置于水中炼苗5～30天，随后直接对植物茎叶进行高效氟吡甲禾灵喷施，药剂喷施浓度范围在所购买商业化制剂推荐浓度的0.1～2倍之间。药剂喷施四周后，共获得5株存活突变体，即除草剂抗性突变体(图3)。
提取存活突变体的DNA，通过PCR扩增包含靶序列的OsACC区域，通过Sanger测序确定抗性突变体突变类型。抗性突变体的测序结果如图4所述，其中OsACC-S1866靶序列的第8位(定义NG PAM为sgRNA靶位点的第21和22位)产生的C到T的突变引起了S1866F的氨基酸变化，尽管OsACC-S1866靶序列的第18位也产生了C到T的突变但未引起氨基酸变化；OsACC-A1884靶序列的第10位产生的G到C的突变引起了A1884P的氨基酸变化；OsACC-P2181靶序列的第11位产生的C到T的突变引起了P2181L的氨基酸变化；OsACC-P1927靶序列的第6、7位产生的C到T的突变引起了P1927F的氨基酸变化。
实施例4水稻HPPD抗性突变体的产生和鉴定
4.1构建水稻HPPD的碱基编辑载体
根据文献记载构建融合hAPOBEC3A胞嘧啶脱氨酶的A3A-PBE(Zong,Y.,et al.(2018)."Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 andhuman APOBEC3A."Nat.Biotechnol.36(10):950)，以及将其中的野生型SpCas9替换成SpCas9-NG变体(Nishimasu,H.et al.(2018).Engineered CRISPR-Cas9 nuclease withexpanded targeting space.Science 361,1259-1262)得到的A3A-NG-PBE。载体构建过程中的PCR使用TransStart FastPfu DNA聚合酶(TransGen Biotech)进行。
针对水稻HPPD的gRNA的靶序列根据水稻HPPD的编码序列(SEQ ID NO:51)设计，具体如下表4所示。
表4.水稻HPPD靶序列，分为：NG PAM靶序列(包括NGG)，即靶序列位于编码链上；CNPAM靶序列(包括CCN)，即靶序列位于反义链上。(下划线标出的是PAM序列)
4.2农杆菌转化水稻
将包含针对靶位点的gRNA编码序列的A3A-PBE或A3A-PBE-NG载体通过电穿孔转化进农杆菌AGL1菌株。根据Hiei等方法(Hiei,Y.,and Komari,T.(2008).Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calliinduced frommature seed.Nat.Protoc.3,824-834)进行水稻栽培种日本晴和中花11的农杆菌介导的转化、组织培养和再生。在全部的组织培养过程中使用潮霉素筛选。
4.3除草剂抗性植物筛选
以过表达HPPD蛋白的水稻组培苗作为阳性对照，以同一时期及品种的野生型水稻植株作为阴性对照，8株一组，分别对每组水稻苗喷施不同浓度梯度的除草剂：硝磺草酮或者苞卫。约两周后，在合适的筛选浓度下，没有抗性的野生型水稻组培苗的叶片变白后慢慢枯萎，过表达的阳性水稻组培苗叶片正常，正常生长。以该除草剂浓度，即1/8的硝磺草酮或者苞卫的大田浓度为合适的筛选浓度。以该筛选浓度处理实施例2获得的水稻植物，获得除草剂抗性植物。
4.4基因型鉴定
将实施例3筛选出的阳性植株取样，利用天根快捷型植物基因组提取试剂盒(天根DP321)小量提取植物基因组DNA，再经过Sanger测序后确定其具体基因型。结果如下表5所示：
表5、抗性水稻及其氨基酸突变类型
| 抗性突变体编号 | 氨基酸突变 |
| M1 | L365F |
| M2 | T379I |
| M3 | E353K&E354K |
| M4 | R346C&A347V |
| M5 | D369N&D370N |
序列表
>SEQ ID NO:1TaALS-A氨基酸序列
MAAATSPAVAFSGAAAAAAAMPKPARQPLPRHQPASRRALPARVVRCCAAPPAAATSAAPPATALR
PWGPSEPRKGADILVEALERCGIVDVFAYPGGASMEIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYAR
ASGRVGVCVATSGPGATNLVSALADALLDSIPMVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNY
LVLDVEDIPRVIQEAFFLASSGRPGPVLVDIPKDIQQQMAVPIWDTPMSLPGYIARLPKPPSTESLEQ
VLRLVGESRRPILYVGGGCAASGEELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYA
NYAVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNA
LLNGSKAQQGLDFGPWHKELDQQKREFPLGFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQM
WAAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIEN
LPVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:2TaALS-B氨基酸序列
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RLVGESRRPILYVGGGCAASGEELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYANY
AVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNALL
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AAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENL
PVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:3TaALS-D氨基酸序列
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VDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNDLLN
GSKAQQGLDFGPWHKELDQQKREFPLGFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQMWA
AQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENLP
VKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:4TaALS-A-A99T
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PWGPSEPRKGADILVEALERCGIVDVFAYPGGTSMEIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYAR
ASGRVGVCVATSGPGATNLVSALADALLDSIPMVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNY
LVLDVEDIPRVIQEAFFLASSGRPGPVLVDIPKDIQQQMAVPIWDTPMSLPGYIARLPKPPSTESLEQ
VLRLVGESRRPILYVGGGCAASGEELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYA
NYAVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNA
LLNGSKAQQGLDFGPWHKELDQQKREFPLGFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQM
WAAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIEN
LPVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:5TaALS-B-A98T
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AVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNALL
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AAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENL
PVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:6TaALS-B-A98T/G97N
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AAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENL
PVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:7TaALS-B-E101K/M100I/A98T/G97N
MAAATSPAVAFSGAAAAAAAIPKPARQPLPRHQPASRRALPARIVRCCAASPAATSVAPPATALRPW
GPSEPRKGADILVEALERCGIVDVFAYPGNTSIKIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYARASG
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VDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNALLN
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AQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENLP
VKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:8TaALS-D-A96T
MAAATSPAVAFSGATAAAMPKPARHPLPRHQPVSRRALPARVVRCCAASPAATSAAPPATALRPWG
PSEPRKGADILVEALERCGIVDVFAYPGGTSMEIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYARASG
RVGVCVATSGPGATNLVSALADALLDSIPMVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVL
DVEDIPRVIQEAFFLASSGRPGPVLVDIPKDIQQQMAVPVWDTPMSLPGYIARLPKPPSTESLEQVLR
LVGESRRPILYVGGGCAASGEELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYANYA
VDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNDLLN
GSKAQQGLDFGPWHKELDQQKREFPLGFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQMWA
AQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENLP
VKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY*
>SEQ ID NO:9TaPPO-A氨基酸序列
MLTSATAPSSSCSSHAPTRFASARGRRLRPVLAMAASDDPRARSVAVIGAGVSGLVAAYRLRKSGVR
VTVFEAEDRAGGKIRTNSDGGFLWDEGANTMTESALEASRLIDDLGLEDRLQYPNSQHKRYTVKD
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EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNDQYLFTTFIGGSHNRDLAGAPTPILKRFVTSDLTKLLGVKG
QPTFVKHIHWRNAFPLYGHDYDSALEAIGKMESDLPGFFYAGNNKDGLAVGNVIASGSNTADLVISYLESGIKQVS*
>SEQ ID NO:10TaPPO-B氨基酸序列
MLTSATAPPSSSSCSSHAPTRFASARGRRLRPVLAMAASDDPRARSVAVVGAGVSGLVAAYRLRKS
GVRVTVFEAEDRAGGKIRTNSDGGFLWDEGANTMTESALEASRLIDDLGLEDRLQYPNSQHKRYT
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VEGQPTFVKHIHWRDAFPLYGHDYDSALEAIGKMESDLPGFFYAGNNKDGLAVGNVIASGSNTADLVISYLESGIKQAS*
>SEQ ID NO:11TaPPO-D氨基酸序列
MLTSATAPSSSSSCAPTRFASSCRPRRSASARGRRPVLAMAASDDPRARSVAVVGAGVSGLVAAYR
LRKSGVRVTVFEAEDRAGGKIRTNSDGGFLWDEGANTMTESALEASRLIDDLGLEDRLQYPNSQH
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>SEQ ID NO:12TaPPO-A-R127C
MLTSATAPSSSCSSHAPTRFASARGRRLRPVLAMAASDDPRARSVAVIGAGVSGLVAAYRLRKSGVR
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>SEQ ID NO:13TaPPO-A-R127G
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>SEQ ID NO:14TaPPO-B-R129C
MLTSATAPPSSSSCSSHAPTRFASARGRRLRPVLAMAASDDPRARSVAVVGAGVSGLVAAYRLRKS
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VKNGAPALIPSDPIALMKSTVLSTKSKFKLFLEPFLYEKSSTRNSKKVSDEHLRESVGSFFERHFGKE
VVDYLIDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPGLWNLEKKYGSLIVGAILSKLTAKGDSAKKGGASSGKGR
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AKNQSFDAVIMTAPLSNVQRMRFTKGGAPFVLDFLPKVDYLPLSLMVTAFKKEDVKRPLEGFGVLI
PFKEQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNDQYLFTTFIGGSHNRDLAAAPTATLKQFVTSDLTKLLG
VEGQPTFVKHIHWRDAFPLYGHDYDSALEAIGKMESDLPGFFYAGNNKDGLAVGNVIASGSNTADLVISYLESGIKQAS*
>SEQ ID NO:15TaPPO-D-R133C
MLTSATAPSSSSSCAPTRFASSCRPRRSASARGRRPVLAMAASDDPRARSVAVVGAGVSGLVAAYR
LRKSGVRVTVFEAEDRAGGKIRTNSDGGFLWDEGANTMTESALEASRLIDDLGLEDRLQYPNSQH
KCYTVKDGAPALIPSDPIALMKSTLLSTKSKFKLFLEPFLYEKSSTRNSKKVSDEHLRESVGSFFERH
FGREVVDYLIDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPGLWNLEKKYGSLIVGAILSKLTAKGDSSKKGGASS
GKGRSKRASFSFHGGMQTLVDALHKEVGDSNVKLGTQVLSLACNCDELSASDGWSIFVDSKDASS
KELAKNQSFDAVIMTAPLSNVQRMRFTKGGAPFVLDFLPKVDYLPLSLMVTAFKKEDVKRPLEGF
GVLIPFKEQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNDQYLFTTFIGGSHNRDLAGAPTAILKQFVTSDLTK
LLGVVGQPTFVKHIHWRNAFPLYGHDYDSALEAIGKMESDLPGFFYAGNNKDGLAVGNVIASGSNTADLVISYLESGIKQVS*
>SEQ ID NO:16TaPPO-D-R133C/T135I
MLTSATAPSSSSSCAPTRFASSCRPRRSASARGRRPVLAMAASDDPRARSVAVVGAGVSGLVAAYR
LRKSGVRVTVFEAEDRAGGKIRTNSDGGFLWDEGANTMTESALEASRLIDDLGLEDRLQYPNSQH
KCYIVKDGAPALIPSDPIALMKSTLLSTKSKFKLFLEPFLYEKSSTRNSKKVSDEHLRESVGSFFERH
FGREVVDYLIDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPGLWNLEKKYGSLIVGAILSKLTAKGDSSKKGGASS
GKGRSKRASFSFHGGMQTLVDALHKEVGDSNVKLGTQVLSLACNCDELSASDGWSIFVDSKDASS
KELAKNQSFDAVIMTAPLSNVQRMRFTKGGAPFVLDFLPKVDYLPLSLMVTAFKKEDVKRPLEGF
GVLIPFKEQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNDQYLFTTFIGGSHNRDLAGAPTAILKQFVTSDLTK
LLGVVGQPTFVKHIHWRNAFPLYGHDYDSALEAIGKMESDLPGFFYAGNNKDGLAVGNVIASGSNTADLVISYLESGIKQVS*
>SEQ ID NO:17野生型spCas9氨基酸序列
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRT
ARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPT
IYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPI
NASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK
DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLL
KALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK
QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKS
EETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGM
RKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKII
KDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLI
NGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIK
KGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRG
KSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH
VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGT
ALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPL
IETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDP
KKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLI
IKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE
QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFD
TTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
>SEQ ID NO:18nCas9(D10A)氨基酸序列
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRT
ARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPT
IYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPI
NASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK
DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLL
KALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK
QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKS
EETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGM
RKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKII
KDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLI
NGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIK
KGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRG
KSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH
VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGT
ALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPL
IETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDP
KKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLI
IKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE
QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFD
TTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
>SEQ ID NO:19nCas9-NG(D10A)氨基酸序列
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRT
ARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPT
IYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPI
NASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK
DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLL
KALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK
QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKS
EETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGM
RKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKII
KDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLI
NGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIK
KGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRG
KSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH
VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGT
ALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPL
IETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESIRPKRNSDKLIARKKDWDP
KKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLI
IKLPKYSLFELENGRKRMLASARFLQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ
HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPRAFKYFDT
TIDRKVYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
>SEQ ID NO:20nCas9-VQR(D10A)氨基酸序列
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRT
ARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPT
IYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPI
NASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK
DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLL
KALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK
QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKS
EETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGM
RKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKII
KDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLI
NGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIK
KGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP
VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRG
KSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH
VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGT
ALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPL
IETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDP
KKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLI
IKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE
QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFD
TTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
>SEQ ID NO:21人APOBEC3A脱氨酶氨基酸序列
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLC
GFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYD
YDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQ
NQGN
>SEQ ID NO:22PmCDA1氨基酸序列
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGI
HAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKN
ARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQ
VKILHTTKSPAVSGSETPGTSESATPESLKMAPKKKRKVGIHGVPAA
>SEQ ID NO:23DNA依赖型腺嘌呤脱氨酶ecTadA7.10氨基酸序列
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALR
QGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNH
RVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
>SEQ ID NO:24PmCDA1-VQR-PBE氨基酸序列
MLTLLFGVTSAKLVDGSMPKKKRKVMTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELK
RRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILE
WYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQ
LNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAVSGSETPGTSESATPESLKMAPKKKRKVGI
HGVPAADKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEAT
RLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYH
EKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLF
EENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAK
LQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH
QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNRE
DLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAW
MTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKY
VTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYH
DLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGR
LSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLA
GSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQ
ILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRS
DKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVET
RQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLN
AVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEI
RKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARK
KDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKE
VKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQK
QLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAA
FKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKKTRDSG
GSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKP
WALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
>SEQ ID NO:25A3A-PBE氨基酸序列
LTLLFGVTSAKLVDGSMEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMD
QHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFL
QENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDG
LDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESLKDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPS
KKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDD
SFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMI
KFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLP
GEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKN
LSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYI
DGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFY
PFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTN
FDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVK
QLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRE
MIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ
LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIE
MARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQ
ELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKL
ITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITL
KSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIA
KSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMP
QVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSK
KLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQK
GNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDK
VLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYET
RIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKKTRDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGN
KPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV
>SEQ ID NO:26B基因组ALS靶序列
CCTACCCTGGCGGCGCGTCC
>SEQ ID NO:27D基因组ALS靶序列
CCTACCCCGGCGGCGCCTCC
>SEQ ID NO:28A基因组PPO靶序列
AAGCGTTATACTGTTAAGGA
>SEQ ID NO:29B基因组PPO靶序列
AAGCGTTATACTGTTAAGAA
>SEQ ID NO:30D基因组PPO靶序列
AAGCGTTATACTGTTAAGGA
>SEQ ID NO:31水稻ACCase全长氨基酸序列
MPMRPWEFIILGRTAPISPPPLGISAFSRPLRLRLRLRLAAVVDAARIQTPPRVAFSAFFFFFFFFSEGL
SREGTAARLPALIYRVPFIPCLLQLQIRAPHADPRPAGFSCAHHFLALAQGLSSSLLSGTISHIWGFIFS
LYGTTHLRNRAILLFGLAGIIDLPNDAASEVDISHGSEDPRGPTVPGSYQMNGIINETHNGRHASVS
KVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHI
RIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPAS
SMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVG
YPAMIKASWGGGGKGIRKVHNDDEVRTLFKQVQGEVPGSPIFIMRLAAQSRHLEVQLLCDQYGNV
AALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYY
FLELNPRLQVEHPVTEWIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQIPEIRRFYGMNHGGGYDLWRKTAALAT
PFNFDEVDSKWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADS
QFGHVFAYGTTRSAAITTMALALKEVQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFRENKIHTGWLDTRIAMRV
QAERPPWYISVVGGALYKTVTANTATVSDYVGYLTKGQIPPKHISLVYTTVALNIDGKKYTIDTVRS
GHGSYRLRMNGSTVDANVQILCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEASGTRLLIDGKTCMLQNDHDPS
KLLAETPCKLLRFLVADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPASGVIHVVMSEGQAMQAGDLIA
RLDLDDPSAVKRAEPFEDTFPQMGLPIAASGQVHKLCAASLNACRMILAGYEHDIDKVVPELVYCL
DTPELPFLQWEELMSVLATRLPRNLKSELEGKYEEYKVKFDSGIINDFPANMLRVIIEENLACGSEK
EKATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFVVKSLFEEYLYVEELFSDGIQSDVIERLRLQHSKDLQK
VVDIVLSHQSVRNKTKLILKLMESLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKAYYKLALKASELLEQTKLSEL
RARIARSLSELEMFTEESKGLSMHKREIAIKESMEDLVTAPLPVEDALISLFDCSDTTVQQRVIETYI
ARLYQPHLVKDSIKMKWIESGVIALWEFPEGHFDARNGGAVLGDKRWGAMVIVKSLESLSMAIRF
ALKETSHYTSSEGNMMHIALLGADNKMHIIQESGDDADRIAKLPLILKDNVTDLHASGVKTISFIV
QRDEARMTMRRTFLWSDEKLSYEEEPILRHVEPPLSALLELDKLKVKGYNEMKYTPSRDRQWHIY
TLRNTENPKMLHRVFFRTLVRQPSVSNKFSSGQIGDMEVGSAEEPLSFTSTSILRSLMTAIEELELHAI
RTGHSHMYLHVLKEQKLLDLVPVSGNTVLDVGQDEATAYSLLKEMAMKIHELVGARMHHLSVCQ
WEVKLKLDCDGPASGTWRIVTTNVTSHTCTVDIYREMEDKESRKLVYHPATPAAGPLHGVALNNP
YQPLSVIDLKRCSARNNRTTYCYDFPLAFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKH
GSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNL
ACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQL
DSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQR
LDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGG
PLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRA
KLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFIL
ANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYA
ERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQL
MPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSH
QPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGL SMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG*
>SEQ ID NO:32水稻ACCase抗性突变体S1866F氨基酸序列
MPMRPWEFIILGRTAPISPPPLGISAFSRPLRLRLRLRLAAVVDAARIQTPPRVAFSAFFFFFFFFSEGL
SREGTAARLPALIYRVPFIPCLLQLQIRAPHADPRPAGFSCAHHFLALAQGLSSSLLSGTISHIWGFIFS
LYGTTHLRNRAILLFGLAGIIDLPNDAASEVDISHGSEDPRGPTVPGSYQMNGIINETHNGRHASVS
KVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHI
RIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPAS
SMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVG
YPAMIKASWGGGGKGIRKVHNDDEVRTLFKQVQGEVPGSPIFIMRLAAQSRHLEVQLLCDQYGNV
AALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYY
FLELNPRLQVEHPVTEWIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQIPEIRRFYGMNHGGGYDLWRKTAALAT
PFNFDEVDSKWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADS
QFGHVFAYGTTRSAAITTMALALKEVQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFRENKIHTGWLDTRIAMRV
QAERPPWYISVVGGALYKTVTANTATVSDYVGYLTKGQIPPKHISLVYTTVALNIDGKKYTIDTVRS
GHGSYRLRMNGSTVDANVQILCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEASGTRLLIDGKTCMLQNDHDPS
KLLAETPCKLLRFLVADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPASGVIHVVMSEGQAMQAGDLIA
RLDLDDPSAVKRAEPFEDTFPQMGLPIAASGQVHKLCAASLNACRMILAGYEHDIDKVVPELVYCL
DTPELPFLQWEELMSVLATRLPRNLKSELEGKYEEYKVKFDSGIINDFPANMLRVIIEENLACGSEK
EKATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFVVKSLFEEYLYVEELFSDGIQSDVIERLRLQHSKDLQK
VVDIVLSHQSVRNKTKLILKLMESLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKAYYKLALKASELLEQTKLSEL
RARIARSLSELEMFTEESKGLSMHKREIAIKESMEDLVTAPLPVEDALISLFDCSDTTVQQRVIETYI
ARLYQPHLVKDSIKMKWIESGVIALWEFPEGHFDARNGGAVLGDKRWGAMVIVKSLESLSMAIRF
ALKETSHYTSSEGNMMHIALLGADNKMHIIQESGDDADRIAKLPLILKDNVTDLHASGVKTISFIV
QRDEARMTMRRTFLWSDEKLSYEEEPILRHVEPPLSALLELDKLKVKGYNEMKYTPSRDRQWHIY
TLRNTENPKMLHRVFFRTLVRQPSVSNKFSSGQIGDMEVGSAEEPLSFTSTSILRSLMTAIEELELHAI
RTGHSHMYLHVLKEQKLLDLVPVSGNTVLDVGQDEATAYSLLKEMAMKIHELVGARMHHLSVCQ
WEVKLKLDCDGPASGTWRIVTTNVTSHTCTVDIYREMEDKESRKLVYHPATPAAGPLHGVALNNP
YQPLSVIDLKRCSARNNRTTYCYDFPLAFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKH
GSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNL
ACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQL
DSGEIRWVIDFVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQR
LDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGG
PLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRA
KLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFIL
ANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYA
ERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQL
MPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSH
QPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGL SMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG*
>SEQ ID NO:33水稻ACCase抗性突变体A1884P氨基酸序列
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SREGTAARLPALIYRVPFIPCLLQLQIRAPHADPRPAGFSCAHHFLALAQGLSSSLLSGTISHIWGFIFS
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KVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHI
RIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPAS
SMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVG
YPAMIKASWGGGGKGIRKVHNDDEVRTLFKQVQGEVPGSPIFIMRLAAQSRHLEVQLLCDQYGNV
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RARIARSLSELEMFTEESKGLSMHKREIAIKESMEDLVTAPLPVEDALISLFDCSDTTVQQRVIETYI
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KLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFIL
ANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYA
ERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQL
MPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSH
QPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGL SMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG*
>SEQ ID NO:34水稻ACCase抗性突变体P1927F氨基酸序列
MPMRPWEFIILGRTAPISPPPLGISAFSRPLRLRLRLRLAAVVDAARIQTPPRVAFSAFFFFFFFFSEGL
SREGTAARLPALIYRVPFIPCLLQLQIRAPHADPRPAGFSCAHHFLALAQGLSSSLLSGTISHIWGFIFS
LYGTTHLRNRAILLFGLAGIIDLPNDAASEVDISHGSEDPRGPTVPGSYQMNGIINETHNGRHASVS
KVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHI
RIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPAS
SMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVG
YPAMIKASWGGGGKGIRKVHNDDEVRTLFKQVQGEVPGSPIFIMRLAAQSRHLEVQLLCDQYGNV
AALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYY
FLELNPRLQVEHPVTEWIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQIPEIRRFYGMNHGGGYDLWRKTAALAT
PFNFDEVDSKWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADS
QFGHVFAYGTTRSAAITTMALALKEVQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFRENKIHTGWLDTRIAMRV
QAERPPWYISVVGGALYKTVTANTATVSDYVGYLTKGQIPPKHISLVYTTVALNIDGKKYTIDTVRS
GHGSYRLRMNGSTVDANVQILCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEASGTRLLIDGKTCMLQNDHDPS
KLLAETPCKLLRFLVADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPASGVIHVVMSEGQAMQAGDLIA
RLDLDDPSAVKRAEPFEDTFPQMGLPIAASGQVHKLCAASLNACRMILAGYEHDIDKVVPELVYCL
DTPELPFLQWEELMSVLATRLPRNLKSELEGKYEEYKVKFDSGIINDFPANMLRVIIEENLACGSEK
EKATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFVVKSLFEEYLYVEELFSDGIQSDVIERLRLQHSKDLQK
VVDIVLSHQSVRNKTKLILKLMESLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKAYYKLALKASELLEQTKLSEL
RARIARSLSELEMFTEESKGLSMHKREIAIKESMEDLVTAPLPVEDALISLFDCSDTTVQQRVIETYI
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WEVKLKLDCDGPASGTWRIVTTNVTSHTCTVDIYREMEDKESRKLVYHPATPAAGPLHGVALNNP
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DSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQR
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KLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFIL
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QPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGL SMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG*
>SEQ ID NO:35水稻ACCase抗性突变体P2181L氨基酸序列
MPMRPWEFIILGRTAPISPPPLGISAFSRPLRLRLRLRLAAVVDAARIQTPPRVAFSAFFFFFFFFSEGL
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KVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHI
RIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPAS
SMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVG
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PFNFDEVDSKWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADS
QFGHVFAYGTTRSAAITTMALALKEVQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFRENKIHTGWLDTRIAMRV
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GHGSYRLRMNGSTVDANVQILCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEASGTRLLIDGKTCMLQNDHDPS
KLLAETPCKLLRFLVADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPASGVIHVVMSEGQAMQAGDLIA
RLDLDDPSAVKRAEPFEDTFPQMGLPIAASGQVHKLCAASLNACRMILAGYEHDIDKVVPELVYCL
DTPELPFLQWEELMSVLATRLPRNLKSELEGKYEEYKVKFDSGIINDFPANMLRVIIEENLACGSEK
EKATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFVVKSLFEEYLYVEELFSDGIQSDVIERLRLQHSKDLQK
VVDIVLSHQSVRNKTKLILKLMESLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKAYYKLALKASELLEQTKLSEL
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WEVKLKLDCDGPASGTWRIVTTNVTSHTCTVDIYREMEDKESRKLVYHPATPAAGPLHGVALNNP
YQPLSVIDLKRCSARNNRTTYCYDFPLAFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKH
GSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNL
ACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQL
DSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQR
LDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGG
PLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRA
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MPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSH
QPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGL SMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG*
>SEQ ID NO:36野生型水稻OsACC的CT结构域氨基酸序列
AFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWT
LKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVK
SCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIH
GSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSH
MQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDP
RAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPAD
PGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGST
IVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEEL
QDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAA
KGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDD
DAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSML
>SEQ ID NO:37水稻OsACC抗性突变体S1866F的CT结构域氨基酸序列AFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDFVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSML
>SEQ ID NO:38水稻OsACC抗性突变体A1884P的CT结构域氨基酸序列AFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAPIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSML
>SEQ ID NO:39水稻OsACC抗性突变体P1927F的CT结构域氨基酸序列AFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQFIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSML
>SEQ ID NO:40水稻OsACC抗性突变体P2181L的CT结构域氨基酸序列AFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINLDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSML
>SEQ ID NO:41OsACC-S1866靶序列
ATTGATTCTGTTGTGGGCAA
>SEQ ID NO:42OsACC-A1884靶序列
TGGAAGTGCTGCTATTGCCA
>SEQ ID NO:43OsACC-P1927靶序列
ACCAGCCTATTATTCTTACA
>SEQ ID NO:44OsACC-P2181靶序列
AAGATAAACCCAGACCGCAT
>SEQ ID NO:45OsHPPD野生型
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
FAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDG
ADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGL
NSVVLANNAETVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTYLDHHGGPGVQHIALASDDVLGTLREMRARSAM
GGFEFLAPPPPNYYDGVRRRAGDVLSEEQINECQELGVLVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS*
>SEQ ID NO:46OsHPPD-M1(L365F)
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
FAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDG
ADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGL
NSVVLANNAETVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTYLDHHGGPGVQHIALASDDVLGTLREMRARSAM
GGFEFLAPPPPNYYDGVRRRAGDVLSEEQINECQELGVFVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS*
>SEQ ID NO:47OsHPPD-M2(T379I)
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
FAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDG
ADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGL
NSVVLANNAETVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTYLDHHGGPGVQHIALASDDVLGTLREMRARSAM
GGFEFLAPPPPNYYDGVRRRAGDVLSEEQINECQELGVLVDRDDQGVLLQIFIKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS*
>SEQ ID NO:48OsHPPD-M3(E353K/E354K)
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
FAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDG
ADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGL
NSVVLANNAETVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTYLDHHGGPGVQHIALASDDVLGTLREMRARSAM
GGFEFLAPPPPNYYDGVRRRAGDVLSKKQINECQELGVLVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS*
>SEQ ID NO:49OsHPPD-M4(R346C/A347V)
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
FAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDG
ADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGL
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GGFEFLAPPPPNYYDGVRRCVGDVLSEEQINECQELGVLVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS*
>SEQ ID NO:50OsHPPD-M5(D369N/D370N)
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAG
RFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARR
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>SEQ ID NO:51水稻HPPD的编码序列
ATGCCTCCCACTCCCACCCCCACCGCCACCACCGGCGCCGTCTCGGCCGCTGCGGCGGCGGGG
GAGAACGCGGGGTTCCGCCTCGTCGGGCACCGCCGCTTCGTCCGCGCCAACCCGCGGAGCGA
CCGGTTCCAGGCGCTCGCGTTCCACCACGTCGAGCTCTGGTGCGCCGACGCCGCGTCCGCCGC
GGGCCGGTTCGCCTTCGCCCTGGGCGCGCCGCTCGCCGCCAGGTCCGACCTCTCCACGGGGAA
CTCCGCGCACGCCTCCCTCCTCCTCCGCTCCGCCTCCGTCGCGTTCCTCTTCACCGCCCCCTAC
GGCGGCGACCACGGCGTCGGCGCGGACGCGGCCACCACCGCCTCCATCCCTTCCTTCTCCCCA
GGCGCCGCGCGGAGGTTCGCCGCGGACCACGGCCTCGCGGTGCACGCCGTGGCGCTGCGCGT
CGCCGACGCGGCCGACGCCTTCCGCGCCAGCGTCGCGGCCGGTGCGCGCCCGGCGTTCCAGCC
CGCCGACCTCGGCGGTGGCTTCGGCCTCGCGGAGGTGGAGCTCTACGGCGACGTCGTGCTCCG
CTTCGTCAGCCACCCGGACGGCGCCGACGCGCCCTTCCTCCCGGGTTTCGAGGGCGTCAGCAA
CCCGGGCGCCGTGGACTACGGCCTCCGCCGGTTCGACCACGTCGTCGGCAACGTGCCGGAGCT
CGCTCCGGTAGCCGCGTACATCTCCGGGTTCACCGGGTTCCACGAGTTCGCCGAGTTCACCGCC
GAGGACGTGGGCACCGCCGAGAGCGGCCTCAACTCGGTGGTGCTCGCCAACAACGCGGAGAC
CGTGCTGCTGCCGCTCAACGAGCCGGTGCACGGCACCAAGCGGCGGAGCCAGATACAGACGT
ACCTGGACCACCACGGCGGCCCGGGGGTGCAGCACATCGCGCTGGCCAGCGACGACGTGCTC
GGGACGCTGAGGGAGATGCGGGCGCGCTCCGCCATGGGCGGCTTCGAGTTCTTGGCGCCGCCG
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Claims (16)
1.一种PPO突变体，其中相对于野生型PPO，所述PPO突变体包含选自R127C、R127G、T129I的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
2.根据权利要求1所述的PPO突变体，其中相对于野生型PPO，所述PPO突变体包含R127C氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:9。
3.根据权利要求1所述的PPO突变体，其中所述PPO突变体在水稻植物中表达时，能够赋予所述水稻植物对除草剂的抗性。
4.根据权利要求1所述的PPO突变体，其中所述除草剂选自二苯醚类、环状亚胺类、苯基吡唑类、二环三唑酮类化合物，或它们的任意组合。
5.根据权利要求1所述的PPO突变体，其中所述除草剂选自芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂。
6.根据权利要求1所述的PPO突变体，其中所述PPO突变体包含SEQ ID NO:12-16中任一所示的氨基酸序列。
7.一种核酸，其包含编码权利要求1-6中任选一项所述的PPO突变体的核苷酸序列。
8.一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码权利要求1-6中任选一项的所述PPO突变体的核苷酸序列。
9.一种表达构建体，其包含权利要求8所述的表达盒。
10.一种通过转基因产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括将权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达盒和/或权利要求9的所述表达构建体导入所述植物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述除草剂为芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物为水稻。
13.一种通过碱基编辑产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括将靶向所述植物基因组中内源PPO编码区的碱基编辑系统导入所述植物，由此导致所述内源PPO包含选自R127C、R127G、T129I的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:9；
所述碱基编辑系统包含碱基编辑融合蛋白或包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，以及至少一种向导RNA或包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体，其中所述碱基编辑融合蛋白包含CRISPR效应蛋白和脱氨酶结构域，所述至少一种向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的内源PPO编码序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述除草剂为芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物为水稻。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述碱基编辑融合蛋白为SEQ ID NO:24或25所示的氨基酸序列，所述至少一种向导RNA为选自SEQ ID NO:28-30的核苷酸序列或其互补序列。
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