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CN119081983A - 一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用 - Google Patents

一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用 Download PDF

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CN119081983A
CN119081983A CN202411435311.0A CN202411435311A CN119081983A CN 119081983 A CN119081983 A CN 119081983A CN 202411435311 A CN202411435311 A CN 202411435311A CN 119081983 A CN119081983 A CN 119081983A
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CN
China
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genetically engineered
seq
liars
iturin
yield
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Withdrawn
Application number
CN202411435311.0A
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刘天波
张亮
邱丽婷
陈武
张阳
滕凯
周向平
巢进
余贝
黄琪
段淑辉
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Hunan Co Of China National Tobacco Corp
Original Assignee
Hunan Co Of China National Tobacco Corp
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用，属于基因工程和微生物技术领域。本发明公开的一种基因工程菌，以野生型短短芽孢杆菌X23为出发菌株，构建双组份调控因子LiaRS敲除载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23(X23‑WT)中的双组份调控因子LiaRS进行敲除，得到相应的高产伊短菌素的工程菌ΔliaR/S。通过本发明定向遗传改造的基因工程菌能够提高伊短菌素的产量，培养方式便捷、得率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

Description

一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物技术领域，更具体的说是涉及一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用。
背景技术
芽孢杆菌是一种多功能生防细菌，在工业、农业和医药行业中具有广泛的应用。特别是在植物病虫害的生物防治和增强作物的抗逆性方面表现出色。
伊短菌素(edeines)由四种非蛋白氨基酸残基(β-Tyr/β-Phe、Isoserine、DAPA和DAHAA)、一个甘氨酸和一个聚胺组成，包含四种组分(即edeine A、B、D和F)，各组分又有α(A)和β(B)两种同分异构体，区别在于β-异丝氨酸(Isoserine)中的羧基跟2,3-二氨基丙酸(DAPA)中的α位氨基还是β位氨基形成肽键。伊短菌素对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌都具有强烈抑菌活性，还具有免疫抑制活性。其作用方式与浓度密切有关，当浓度小于15μg/mL时，它能抑制DNA的合成，而当浓度超过150μg/mL时，就变成了广谱抑制剂(DNA合成、蛋白质翻译和合成)。因此，伊短菌素具有开发为农用或医用抗生素的良好潜力。
野生型短短芽孢杆菌X23是烟草根际土壤分离到的广谱拮抗细菌，但野生型X23菌株中edeines的产量较低，限制了其生防效果以及作为农用抗生素的应用。
因此，提供一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用，该基因工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传改造，能有效提高伊短菌素的产量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基因工程菌，以短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23为原始菌株，敲除双组份调控子LiaRS；
所述双组份调控子LiaRS基因编号分别为A616_RS05710(sensorhistidinekinase)和A616_RS05715(response regulatortranscription factor)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，一种基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用LiaRS的上下游同源臂、抗性基因和载体骨架，构建同源重组敲除载体；
所述抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗性基因是ApraR；
所述LiaRS的上游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；下游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述载体骨架，以pE194质粒为模板，引物pE194-F/pE194-R扩增得到；
(2)利用同源重组技术将短短芽孢杆菌X23基因组中LiaRS进行组合敲除，得到基因工程菌。
进一步，引物pE194-F/pE194-R序列如下：
pE194-F：cagctgcctcgcgcgtttcggtga；SEQ ID NO.6；
pE194-R：gttaagggatgcataaactgcatc；SEQ ID NO.7。
进一步，所述的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。
进一步，所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。
进一步，所述的方法构建的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。
进一步，所述的方法构建的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基因工程菌及其在高产伊短菌素中的应用，本发明通过构建同源重组敲除载体，将野生型短短芽孢杆菌基因组中双组份调控因子LiaRS(基因编号号：A616_RS05710和A616_RS05715)进行组合敲除，成功构建了能够高产伊短菌素的工程菌；本发明构建的短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S，发酵后伊短菌素的产量与野生型短短芽孢杆菌X23相比分别提高了1.3倍；工程菌为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明利用敲除载体构建基因工程菌株的流程图；
其中，A为Red/ET同源重组技术构建的敲除载体(四个线性片段重组成环状敲除质粒)，LLHR是线线重组的缩写；B为体内同源重组敲除LiaRS示意图(敲除载体包含的LiaRS上下游同源臂与相应基因组位置发生双交换)，ApraR将LiaRS进行替换，以获得基因工程菌ΔliaRS；
图2附图为本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌的菌落PCR双引物鉴定图；
其中，A为敲除载体转入野生型X23的转化子鉴定示意图，CK为阴性对照；B为发生双交换后的双引物鉴定示意图；M：DL5000 Marker；泳道1-3为三个转化子；
图3附图为本发明短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S和野生型短短芽孢杆菌X23-WT的生长曲线；
图4附图为本发明短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S中edeP相对表达的动态变化；
图5附图为本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S发酵液对青枯病菌的抑制图；
其中，A：X23-WT和ΔliaR/S在12、24、36、48、60和72h的发酵上清液对青枯病菌的抑制能力；
B：X23-WT和ΔliaR/S抑菌圈半径统计和显著性分析；
注：***，P<0.001，**，P<0.01；
图6附图为本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S与X23-WT生成的伊短菌素HPLC-MS检测图；
其中，A：比较了野生型X23和工程菌株的伊短菌素产量；HPLC-MS分析表明，伊短菌素保留时间为0.3min(红色虚线表示)；
B：伊短菌素A和伊短菌素B质谱图谱，伊短菌素A和伊短菌素B分子离子[M+H]+分别为755.4417和797.4631；
C：野生型X23和基因工程菌株的伊短菌素的产量变化；数据以三个独立实验的平均值表示；误差条表示标准偏差(SD)；百分数表示提高倍数。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中用到的生物材料来源如下：野生型短短芽孢杆菌X23(参见专利201910834175.5)：由湖南农业大学植物保护学院提供；载体pE194(参见专利201910834175.5)，即pBR322-ErmB-194ori由湖南省微生物研究院保存；抗性基因ApraR：含有阿伯拉霉素抗性基因ApraR的质粒pSET152由湖南省微生物研究院保存。
限制性内切酶BstZ17I和SmaI购自NEB公司。
实施例1
利用Red/ET同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23基因组中的双组份调控子LiaRS(基因编号：A616_RS05710和A616_RS05715)进行敲除。
A616_RS05710核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
atgcgtcgacagcgattggcaagtattcagtggcaatacgtgcgctatggcatgttactggccgtcagtgcaattactgccgcgtttatttgtttcttttggctatactttttatggagagatcaccccgggattcatcggtggtacaacgaaatgattagcgaccgcaacttcatgtggtggcttcaagaatatataggcatcaatctgcctgccgatccagagggcttgattcagcttgctgcttttgttgtctctttgcctgcaggtgtcttagtggcattgatcatttcctatatcattggcaatttgttgaaaaagagactcagtgtattgtgggaagctgccatgaagcttgggcgcgggatgctgtcgtatcgggttccagaattgggcgtcgatgaagtcggcgaattaggatggcagatcaatcgcttggcttcacaatgggaagagcaagtggcatctttgcagcggctgtcgaaccacaatgcggctctcgcagaacaattgaagcatgcagcggtaacagaggagcgacagagattggcgagagaactgcatgatgcagtcagtcagcagctgttcgccatcgcgatgacgactgcggcgatgaaacggcttgtagaaaaaaatccgcaacgtgcagcacaacagattgaattggtcgaagagatggcagcagcagcacaagcggagatgagggcatt gctcttgcatcttcgcccggctacgttacaaaacaagtcattgaaggaagccattctggaacttttagatgagctgacgcgtaaaaataccatgcagctttcttgggagatcgaagacgtcgaaggcttgccgagtggaattgaggatcatttgttccgtattttgcaggagtccttgtccaatacattgcggcatgccagagctacccagattacagtgaagctgtttacgctgcaagagcaggtccgcctgcgagtaacggatgacggtgttggttttgatccggatggggagaaaatgacgtcctacggtttgcgcagcatgcaagagcgcgtagcagaggtcggaggctccatggagatttactcggcaattgggaaggggacgcaaattgaggtccgtattcctctaatgtcacagacggaacgggaagggtga；SEQ ID NO.1。
A616_RS05715核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
gtgattcgggtactactggtagatgatcacgaaatggttcggatgggtctggctgcttatttgtctacagaggacgatattgaagtcgtagcagaggcaggcagtggagaagaaggggtgcggatgacgcaagaactgcgcccggatgtcgttttgatggatttagttatggaaggcatcggcggtgtggaagcgactcggcgtattcgtgaaagctgtccatccagtaaggttatcgtcttgaccagctttattgatgacgaaaaggtatatccggtcattgaagcgggggcattcagctacttgctgaagacttcgcgtgcagccgagattgcaaaggcaatccgctctgctgcggcgggtgagccagttttggaatcgagggtagcaggaaaaatcatggcccgtttccgtcacggtcaagagtcccatccccatgagcaactgacaccccgcgagttggaggttttgaagctgatcggtcagggcaagtccaaccaggagattgcagatgagctgattatcgggatcaaaacggtcaagactcatgtgagtaacattcttgccaagctgaatgtggaggatcgcacgcaagcggccatttacgtgcatacgcgtagcttaggctaa；SEQ ID NO.2。
利用野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23作为原始菌株，构建同源重组敲除载体，将LiaRS进行敲除，以实现伊短菌素的高效表达。
(1)PCR扩增筛选标记ApraR(Apramycin抗性)和载体骨架
以质粒pSET152为模板，引物Apra-F1/Apra-R1扩增抗性基因片段(ApraR，含抗性基因ApraR的启动子序列)；抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
抗性基因ApraR的核苷酸序列：
gatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggcatatcaaatgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttg cggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctga；SEQ ID NO.3。
以pE194质粒为模板，引物pE194-F/pE194-R扩增载体骨架(pE194)。
引物序列如下：
Apra-F1：taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatgatctgcaatttgaataataacc；SEQID NO.4；
Apra-R1：taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagccaatcgactggcgagcg；SEQID NO.5；
pE194-F：cagctgcctcgcgcgtttcggtga；SEQ ID NO.6；
pE194-R：gttaagggatgcataaactgcatc；SEQ ID NO.7。
PCR反应体系(以10μL体系为例)：2×PrimerSTAR Max(Takara)5μL，上游引物(10μM)0.3μL，下游引物(10μM)0.3μL，模板(浓度约20ng/μL)0.3μL，灭菌双蒸水(ddH2O)4.1μL。
反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
(2)PCR扩增LiaRS上下游两端同源臂：
以短短芽孢杆菌X23菌株总DNA为模板，设计引物LiaRS-F1和LiaRS-R1扩增1kb左右上游同源臂；LiaRS-F2和LiaRS-R2扩增1kb左右下游同源臂，引物序列如下所示：
LiaRS-F1：
ataggcacacgaaaaacaagttaagggatgcagtttatgcatcccttaaccattccgcctgcattcatc；SEQ ID NO.8；
LiaRS-R1：
tcaaattgcagatcataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtacttgccaatcgctgtcgacgc；SEQ ID NO.9；
LiaRS-F2：
agtcgattggctgaataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaatttacgtgcatacgcgtagc；SEQ ID NO.10；
LiaRS-R2：
atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgctcagcggcgtatccgttaag；SEQ ID NO.11。
PCR反应体系：同上。
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。用PCR回收试剂盒回收，得到上游同源序列片段HAF(如SEQ ID NO.12所示)和下游同源序列片段HAR(如SEQ ID NO.13所示)。
上游同源序列片段核苷酸序列：
cattccgcctgcattcatctatacatgtcgtaatggtcaaagtgaaaacgatcagcatggggcgtgagagaggagacttttgtgaaactgtcccgtttgcacaaaatgttggctggtatcctgattatttttacgggaatcggccttttattagacagtttgggtatcatttcgttcggtctgtttgatttgtggccgatggtgcttatttatttcggccttcgtttgtgggggcagaaaaatcggattggcggagggattctattctctctggggaccatcatcgcgatggatatgtggtttggtgtcggggttgatgatttgttccagattgcagtgccaatcgtgtttatttatttcgggtttcagttgattcggggcaagaacagcagacgagatcaccgtgtgaatcaaccattgggtgatacggggaccccatctgctgcggagacgattgtgacaagtgatgcgagtattccgagtgacgtgaaggtttccacggaggagcgcccttggatagacagctggaacaaatggaagcatgttggtggcaaaattccacatcacgaaagaatgtcttcatcacctgacgacacgttgccaaaagattcccgcagttctctgattggagattatcacctgacctcggggcgttttgaactgaatcacttgcatgtctggcatggaatcggggatgttgtgattgatctttcccgggcagtgctgatgcgggatgaggcagttcttgtcgtagagggctggataggcgatgtgacgatttatgtccctgtggatcttcctgtatcggtaacggcagggttgagtattggtgacctggtggtgctaagccaccgtcagggaggtatcaatcgcagtgttaagattcgttcagatcagtatgatgaagcattgcaaaaagtaaacttgcatatctcgctgcttgtcggcgatataaaagtcaagtacatctaggaggtactggcggatgcgtcgacagcgattggcaag；SEQ ID NO.12。
下游同源序列片段核苷酸序列：
atttacgtgcatacgcgtagcttaggctaatcacatagcatcatgtataagtaaacgcgccaaaaagctcctcggtaaataggggctctttcgcgcgtttacttgtttaaacagttttcttgtatacaaaccgtgagtttttttcgtagatgtggtaaagatagtaagtaacgaatgagagattacggaaaggagggacgggttatgaggcacaaacctcaaacacgctccaaggtgctttcggctgacgatggtgtggatatcgttggagatgttcacggctgttacgacgaatttatagaattgctcaaacgctt gggatatgaacaaaccccagacgggacctatcgccatccccacggccgaaagctcctttccctcggtgatatcacgagtcgtggaccttactcaatcaaaatgctgcaattttttcaccatcatgtcacggcaggcctggctgagatggtggatagtaatcatgggtggaaagtagcccgctggttggatggcagaccagtgacattggcacatggagatgaaaaggtagaagaggagattcggctgtatcagcaagaatacgggccgaagaaggcctccttgctacgagagcagagtcgcagattgctattttcttctccttcgcacatgatcatcaaacggaatgaaaaaatagtagcagtcgccgttcatgcggggattcgtgatgattacatagggatggattcacctgcggtctatacgttttgccgatatggcgatgtggcagggacgggaccagatgggcgcccgatccgcagagagtgggcaaaagagagaaaagtgacctcgcccattattgtatggggacatgatccgcatccagaaccaaaacgaaaaaatggcaccatcaacatcgaccaaggatgtgtgttcggcggaatgttaaccgcctaccgctacccagaggacgaattggtgagtgtgccagcaaagagaaattattcgggcttaacggatacgccgctga；SEQ ID NO.13。
(3)同源重组敲除载体的构建：
如图1A所示，将HAF、ApraR、HAR和载体骨架pE194片段进行混合(各组分终浓度为30ng/L)，加入0.5μL T4 DNA polymerase和2μL缓冲液(NEBuffer，B7202S)；通过程序：30℃、20min，75℃、20min，50℃、30min进行体外连接；然后连接产物进行过膜去除盐离子，再将产物通过电击转入E.coli GB05-dir细胞，ApraR抗性筛选阳性转化子，转化子经BstZ17I和SmaI酶切鉴定和测序鉴定，得到敲除载体pE194-liaR/S-ko-HAF-aprA-HAR。
(4)基因重组短短芽孢杆菌工程菌的构建：
制备短短芽孢杆菌感受态细胞：从-80℃冰箱中取适量野生型短短芽孢杆菌X23甘油菌液，划线于LB平板，30℃培养24h；挑取单菌落接种于1mL的LB培养基中，放置于恒温振荡器上，30℃，900r/min，培养过夜；取40μL过夜培养菌液，转接到1.3mL新鲜LB液体培养基中，900r/min，培养4h，OD600约2.0；将培养液在4℃，9000r/min，离心1分钟，去上清，获得感受态细胞。
将步骤(3)中正确构建的同源重组敲除载体，参考Brevibacillus ExpressionSystemII&#x2d(宝生物工程：短短芽孢杆菌表达系统II宝生物工程)的方法转入野生型短短芽孢杆菌X23中。
抗性片段整合到短短芽孢杆菌染色体上稳定遗传的示意图见图1B。将转化子在含有ApraR(10μg/mL)的固体LB上筛选，30℃倒置培养1d；挑取转化子利用引物Apra-F2和Apra-R2进行菌液PCR，并采用ApraR抗性基因的引物(Apra-F2和Apra-R2)作为探针检测同源重组质粒已经成功转入短短芽孢杆菌X23中，PCR结果如图2A所示(理论条带为774bp，不包含抗性基因ApraR的启动子序列)。
Apra-F2和Apra-R2的序列如下：
Apra-F2：tgcaatacgaatggcgaaaagc；SEQ ID NO.14；
Apra-R2：tcagccaatcgactggcgagcg；SEQ ID NO.15。
将正确的转化子，接种于37℃、不含抗生素的LB培养基中培养14h，以丢失敲除载体，然后在LB平板上划线，长出单菌落后，挑取单菌落分别划线到阿伯拉霉素(10μg/mL)平板和红霉素(1.5μg/mL)平板上，筛选只能在阿伯拉霉素抗性上生长、不能在红霉素平板上生长的转化子，即有可能是正确敲除的转化子；将筛选得到的转化子于1mL含Apra的LB培养基中进行双引物(TF\Q2和TR\Q3)的菌液PCR检测，结果都能检测出理论大小的条带(分别为1473bp和1302bp)，PCR检测结果如图2B，说明短短芽孢杆菌X23中双组份调控因子LiaRS被成功敲除，得到短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S。
引物序列如下：
TF：gcagcaattctggacgaagt；SEQ ID NO.16；
TR：caatggcgtaagcagcctgac；SEQ ID NO.17；
Q2：gttgagaagctgaccgatgag；SEQ ID NO.18；
Q3：aggaaggtccagtcggtcat；SEQ ID NO.19。
测试例1
在固体LB平板上活化X23-WT和ΔliaR/S菌株，然后将每个菌株的单个菌落在1.0mL液体LB培养基中以30℃培养过夜，再转移到50mL新鲜液体NB发酵培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖10g/L)中，达到初始的密度(OD600)为0.1，于30℃，180r/min条件下振荡培养。发酵周期为72h，每间隔12h进行一次取样，测定样品OD600值，绘制生长曲线，每个样品3次生物学重复。通过在NB液体培养基中连续培养的方法比较liaR/S缺失对X23生长速率的影响。菌株生长曲线测定结果表明两个菌株生长趋势基本一致(图3)，接种后发酵培养至18h，ΔliaR/S的OD600高于X23-WT，但24h后均低于X23-WT菌株。尽管突变菌株的生长趋势没有因为敲除liaR/S而发生改变，但liaR/S的敲除不利于菌体生物量的积累。结果还表明，抑菌活性的提高不是由于生物量改变。
测试例2
分别收集培养12、24、36、48、60和72h的菌体提取RNA(试剂盒：全式金RNA Kit)；用TransScript All-in-One单链合成试剂盒将mRNA反转录成cDNA。以edeP作为目标基因(edeP为edeine生物合成基因簇中的第一个基因)，16S rRNA作为内参基因，每个样品3次生物学重复，分别对各个样品进行RT-qPCR检测。检测edeP基因所用引物为RT-edeP-F/R；检测16S rRNA基因所用引物为RT-16S-F/R。
具体引物序列如下：
RT-edeP-F：CGCAGGAAGAACAGGAGAGT；SEQ ID NO.20；
RT-edeP-R：ACCGTCCACAACCAGATGAT；SEQ ID NO.21；
RT-16S-F：ATGCGTAGAGATGTGGAGGAA；SEQ ID NO.22；
RT-16S-R：GCGGAGTGCTTATTGCGTTA；SEQ ID NO.23。
反应体系(30μL)及程序：15μL SYBR Greenmixture(Abclonal,2X UniversalSYBR Green FastFor qPCR Mix)，上下游引物各0.5μL，cDNA 1.5μL，加水至30μL。滞留阶段：50℃2min，95℃10min；PCR阶段：95℃30s，55℃30s，72℃30s，循环40次；熔解曲线阶段：95℃15s，60℃1min，95℃1s；95℃1s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后进行荧光定量PCR产物溶解曲线分析。
RT-qPCR结果(图4)表明，ΔliaR/S菌株中edeP的表达量在24h达到最高，是X23-WT的2.3倍，但36h时edeP的表达量显著下降。伊短菌素的生物合成起始于对数生长早期，至24h时达到合成的高峰。敲除liaR/S有助于突变株在24h时合成更多的伊短菌素。
测试例3
抑菌试验：工程菌ΔliaR/S和X23-WT分别活化，使用NB发酵培养基培养，调初始OD600≈0.1，每12h取样一次，发酵培养至72h，各个时期取样得到的菌液离心后取上清过0.22μm微孔滤膜后于-20℃低温下保存备用。取100μL发酵液上清加入青枯菌拮抗平板的孔中，以无菌NB液体培养基作为空白对照(CK)，将点样后的平板置于30℃培养箱，恒温培养18h后十字交叉法测量抑菌圈直径，抑菌能力强弱通过抑菌圈半径大小表示，实验设置3次重复。结果显示(图5)，X23和ΔliaR/S在0-12h时均无抑菌圈，说明在12h，两个菌株此时无抑菌活性，24h以后，ΔliaR/S各个时期的抑菌活性均显著高于野生型。结果表明敲除liaR/S促进了伊短菌素的合成，增强了菌株的抑菌活性。
拮抗平板的制作如下：
a)在LB平板上活化靶标菌R.solanacearum GMI1000，挑单菌落接种于1ml LB液体培养基，30℃，900r/min培养14h；
b)取过夜菌(108cfu/mL)与融化冷却至55℃的LB固体培养基混合后倒平皿(定量：每52.5mL LB培养基加10μL菌液，每个平皿约17.5mL)；
c)含菌平皿凝固后用已灭菌的打孔器(孔径为7mm)打孔备用。
测试例4
菌株活化后使用NB发酵培养基进行发酵培养，调初始OD600≈0.1，培养条件为30℃，180r/min。发酵培养至48h时取发酵菌液样品，样品经高速离心后保留上清液，使用0.22μm孔径的过滤器进行除菌处理。样品通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用仪进行检测分析edeine A(m/z 755.44[M+H]+)和edeine B(m/z 797.46[M+H]+)峰面积的变化，以此来反映伊短菌素总产量的变化。每个样品设置3个生物学重复。色谱条件：使用2.1mm*100mm，3μm粒径的色谱柱(岛津AQ-C18 HP)，流动相为A：0.1％甲酸-水；B：乙腈；梯度为：0-3min 2％B，3-5min 30％B，5-11min 100％B，11-13min 2％B，13-16min 2％B；流速为0.3mL/min；柱温：40℃，检测波长278nm，上样量为1μL。质谱条件：采用MRM扫描模式，正离子，分子量扫描范围100m/z-1000m/z，雾化器流量为3L/min，加热气流量为10L/min，接口温度为200℃，DL温度为200℃，加热块温度为350℃，干燥器流量为10L/min。通过HPLC-MS比较edeine A(m/z755.44[M+H]+)和edeine B(m/z 797.46[M+H]+)峰面积的变化。使用配有定性分析软件的四极飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF；Agilent 6545)进行HPLC-MS分析。处理结果见图6，本发明得到的短短芽孢杆菌工程菌ΔliaR/S与X23-WT相比，伊短菌素产量(峰面积)提高了约1.3倍。因此，本发明的短短芽孢杆菌工程菌能够通过发酵实现高效生产伊短菌素。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种基因工程菌，其特征在于，以短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23为原始菌株，敲除双组份调控子LiaRS；
所述双组份调控子LiaRS基因编号分别为A616_RS05710和A616_RS05715，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)利用LiaRS的上下游同源臂、抗性基因和载体骨架，构建同源重组敲除载体；
所述抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述LiaRS的上游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；下游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述载体骨架，以pE194质粒为模板，引物pE194-F/pE194-R扩增得到；
(2)利用同源重组技术将短短芽孢杆菌X23基因组中LiaRS进行组合敲除，得到基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，引物pE194-F/pE194-R序列如下：
pE194-F：cagctgcctcgcgcgtttcggtga；SEQ ID NO.6；
pE194-R：gttaagggatgcataaactgcatc；SEQ ID NO.7。
4.权利要求1所述的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。
5.权利要求1所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。
6.权利要求2或3所述的方法构建的基因工程菌在高产伊短菌素中的应用。
7.权利要求2或3所述的方法构建的基因工程菌在抑制青枯菌中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107532140A (zh) * 2015-03-25 2018-01-02 赛斯爱普有限公司 用于微生物蛋白质分泌检测和定量的传感器

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张亮等: "转录调控因子AbrB对生防短短芽胞杆菌X23中抗生素edeines生物合成的影响", 中国生物防治学报, no. 04, 29 April 2020 (2020-04-29), pages 564 - 574 *
邱丽婷等: "双组分因子LiaRS调控短短芽胞杆菌X23伊短菌素生物合成的研究", 中国生物防治学报, vol. 40, no. 05, 8 October 2024 (2024-10-08), pages 1036 - 1044 *

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