CN119053627A - 抗her2/neu抗体及使用方法 - Google Patents

Abstract

本文中提供了抗HER2单克隆抗体或其结合片段以及其用途。

Description

抗HER2/NEU抗体及使用方法

优先权

本专利申请要求于2022年2月9日提交的美国临时申请序列号63/267,755的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

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背景技术

在过去的20年中，由于例如早期检测、更好的外科技术、多种新的药物和新的成像方法(例如，检测复发)，乳腺癌的治疗已经得到了相当大的改善。

HER2/neu是人表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。这种癌基因的扩增或过表达已显示出在某些侵袭型乳腺癌的发生和进展中发挥作用。该蛋白质已成为用于约30％乳腺癌患者的治疗的生物标志物和靶标。

该HER2/neu蛋白由膜相关丝氨酸蛋白酶进行蛋白水解切割以释放胞外结构域，其随后可在体液中检测和测量到。引入了血液的HER2/neu体外诊断(IVD)免疫测定(描述于例如Carney et al.,2003,Clin.Chem.,49(10):1579-98中)，但该结果通常令人困惑，并将该测试落入临床废用。

发明内容

本文中提供了抗HER2单克隆抗体或其结合片段，所述抗HER2单克隆抗体或其结合片段包含重链可变结构域(heavy chain variabledomain，VH)和轻链可变结构域(lightchain variabledomain，VL)，所述重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列，所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列。一个方面提供了抗HER2单克隆抗体或其结合片段，所述抗HER2单克隆抗体或其结合片段包含重链和轻链，其中：(i)所述重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、6、7或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区；并且(ii)所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8、9、10或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区。另一个方面提供了本文中所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段，其中所述抗体与检测剂缀合。一个方面提供了组合物，其包含本文中所述的抗HER2抗体和载体。

一个方面提供了检测受试样品中HER2多肽或其片段的方法，其包括：a)在允许多肽/抗体复合物形成的条件下使本文中所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段与受试样品接触；以及b)检测a)的多肽/抗体复合物，其中多肽/抗体复合物的检出是HER2多肽存在于样品中的指示。另一个方法提供了监测来自对象的样品中HER2多肽或其片段的方式，其包括：a)在允许多肽/抗体复合物形成的条件下使至少一种本文中所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段与所述样品接触；b)检测a)的多肽/抗体复合物，其中多肽/抗体复合物的检出指示HER2多肽或其片段存在于对象中；以及c)在多个时间点进行步骤a)和b)，以便监测随着时间所述对象中的HER2多肽或其片段。在一个实施方案中，方法还包括使a)的样品与第二抗HER2抗体或其片段接触，所述第二抗HER2抗体或其片段包含重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列，所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列；或者与这样的抗HER2抗体或其片段接触，所述抗HER2抗体或其片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:11、12、13或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区；并且(ii)所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:14、15、16或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区。在一个实施方案中，样品在a)中与以下接触：(i)捕获抗体或其结合片段，以及(ii)检测抗体或其结合片段。在一个实施方案中，捕获抗体和检测抗体与HER2或其多肽结合。在一个实施方案中，捕获抗体被固定。在另一个实施方案中，检测抗体包含检测剂。

在一个实施方案中，对象正在接受治疗剂治疗。在一个实施方案中，治疗剂是曲妥珠单抗(trastuzumab)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或其组合。在另一个实施方案中，对象正在接受曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或其组合的治疗，其中所述曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或其组合不干扰或仅有限干扰捕获抗体和/或检测抗体或者其结合片段的结合。在一个实施方案中，对象是可被治疗癌症的ou，这样的治疗包括小分子、免疫治疗、手术、化学治疗和/或放射治疗。在一个实施方案中，样品是维持在组织培养中的淋巴结或组织抽吸物(例如，乳房)、血清、全血、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊液、来自正常细胞裂解物的上清液、来自瘤前细胞裂解物的上清液、来自肿瘤细胞裂解物的上清液和/或来自癌细胞系的上清液。

在一个实施方案中，b)的检测在使用侧向流测定的情况下来进行。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文中所述的方法和组合物的实施可采用药物化学、分子生物学、药物制备技术、给药方案、免疫学和生物化学的常规技术，所有这些都在本领域技术人员的实践范围内。

本文中提供了与HER2特异性结合的重组兔单克隆抗体，例如与HER2的胞外结构域(例如，人HER2受体)结合。本文中所述的抗体提供了优于其他抗HER2抗体的数项改进，除了它们的结合特异性之外，它们对治疗剂几乎没有干扰，使得基于本文中提供的抗体的免疫测定在向医生/患者提供急需的准确信息方面更有价值。

改变分析物的可测量浓度的物质或改变抗体结合的物质可潜在地导致免疫测定干扰。根据反应中干扰的位置，干扰物质可能导致一个或更多个测定系统中分析物浓度的错误地高或错误地低。免疫测定中的干扰可能导致实验室对患者结果的错误解释，以及医生给出错误的治疗方案。例如，帕妥珠单抗是用于治疗乳腺癌以降低血清中HER2水平的最常用的治疗之一；遗憾的是，帕妥珠单抗干扰了目前临床上使用的许多诊断性测定，这显著降低了那些测定的可靠性。治疗性抗体对诊断性测定的干扰可发生在测定的许多不同的阶段或者发生在测定中涉及的任何组分(例如，捕获抗体和/或检测抗体)的情况下。显著地，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、玛格妥昔单抗、和/或HER2小分子抑制剂(例如，拉帕替尼、来那替尼)对本文中所述的抗体/免疫测定几乎没有干扰，这使得在测试和/或监测正在施用HER2阳性乳腺癌治疗方案的患者时具有更高的准确性。

定义：

为了清楚和简明的描述，本文中可将特征描述为相同或不同的实施方案的一部分；然而，应当理解，本发明的范围可包括具有全部或一些所述特征的组合的实施方案。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。以下定义旨在帮助读者理解本发明，但不旨在改变或另外限制这样的术语的含义，除非特别说明。

除非上下文另有明确说明，否则没有数量词修饰的名词应理解为一个/种和更多个/种。因此，例如，对“抑制剂”的提及是指具有抑制靶分子能力的一种或更多种试剂，并且对“方法”的提及包括对本领域技术人员已知的等同步骤和方法等的提及。

本文中使用的短语“和/或”应理解为意指这样结合的要素中的“任一者或二者”，例如，在一些情况下共同存在而在另一些情况下分开存在的要素。

本文中使用的“或”应理解为具有与以上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将项目列表分开时，“和/或”或者“或”应解释为包括，例如包括多个项目中的至少一个，但也包括多个项目中的多于一个，并且任选地包括另外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当用于权利要求中时“由……组成”将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，本文中使用的术语“或”在前面有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时仅应解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个但并非二者”)。

本文中使用的术语“约”意指指示值的±10％。例如，约100意指90至110。

在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该指定范围内的任何其他指定的值或中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本发明内，但要遵守规定范围内的任何明确排除的限制。当规定范围包含限制之一者或两者时，排除那些被包含的限制之一者、两者的范围也包含在本发明中。

跨膜蛋白HER2(人表皮生长因子受体2)或HER2/neu也被称为受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2、CD340(分化簇340)、原癌基因Neu、Erbb2(啮齿动物)、或ERBB2(人)；在人中由ERBB2(成红细胞癌基因B)基因编码的蛋白质。HER2蛋白的分子量为约185千道尔顿(kiloDalton，kDa)，并且由胞内酪氨酸激酶结构域、跨膜结构域和胞外结构域组成。

扩增，也被称为ERBB2基因的过表达，发生在约15％至30％的乳腺癌中，也被称为HER2阳性乳腺癌。HER2阳性乳腺癌是对被称为人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor 2，HER2)的蛋白质测试为阳性的乳腺癌。该蛋白质促进癌细胞的生长。

约每5例乳腺癌中有1例，癌细胞具有额外拷贝的制造HER2蛋白的基因。HER2阳性乳腺癌倾向于比其他类型的乳腺癌更具侵袭性。其与疾病复发和不良预后的增加相关；然而，在乳腺癌中靶向HER2的药剂已显著积极地改变了HER2阳性乳腺癌的另外的不良预后自然发展。建议测试每例浸润性乳腺癌的HER2存在情况，因为该结果显著影响治疗建议和决策。

本文中使用的“检测”是指识别被检测物(例如样品中的HER2/neu)的存在情况的动作或过程。本文中使用的术语“样品”被定义为维持在组织培养中的血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊液、来自正常细胞裂解物的上清液、来自瘤前细胞裂解物的上清液、来自肿瘤细胞裂解物的上清液、来自癌细胞系的上清液，以及乳房抽吸物或活检物。因此，本文中所述的免疫测定中可使用任意数量的生物样品，包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊液、来自细胞裂解物(例如，正常细胞、瘤前细胞、肿瘤细胞、癌细胞)的上清液，或者乳房抽吸物或活检物。

本文中使用的“监测”是指在一段时间内至少两次识别被检测物的存在情况的动作或过程。

术语“抗体”是指完整的抗体或者与完整的抗体竞争抗原结合的抗原结合部分或其片段。术语“抗体”还包括特异性结合HER2的任何类型的抗体分子或特异性结合分子。本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与HER2蛋白特异性结合的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经遗传改造的多肽、糖蛋白或免疫球蛋白。使用任何合适的标准技术，抗体的抗原结合片段可来源于例如完整抗体分子，所述合适的标准技术例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变和任选的恒定结构域的核酸的重组遗传改造技术。

单克隆抗体是从基本上均质的抗体的组中获得的抗体。基本上均质的抗体的组可包含少量的突变体或变体。单克隆抗体是高度特异性的并与单个抗原位点相互作用。每个单克隆抗体通常靶向单个表位，而多克隆抗体群通常包含靶向多种表位的组的多种抗体。单克隆抗体可通过许多方法产生，包括例如杂交瘤方法(Kohler and Milstein,Nature256:495,1975)、重组方法(美国专利号4,816,567)、以及从噬菌体抗体文库中分离(Clackson et al.,Nature 352:624-628,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597,1991)。

本文中使用的术语“对象”、“哺乳动物”和“哺乳动物对象”是指归类为哺乳动物(包括人、高等非人灵长类、啮齿动物以及家养和农场动物(例如牛、马、狗和猫))的任何动物。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物是人(男性或女性)。

本文中使用的术语“包括/包含”、“具有”、“带有”或其变化形式旨在为包含性的类似于术语“包含”。

本文中使用的所述“含有”、“具有”或“包括/包含”及其变化形式包括“包含”“大体上由……组成”、“基本上由……组成”和“由……形成”；“主要由……组成”、“通常由……组成”和“由……构成”属于“具有”、“包括/包含”或“含有”的一般概念。

术语“包含/包括”及其变化形式等可具有美国专利法(U.S.Patent Law)赋予它们的含义，并且可意指“包括/包含”及其变化形式等。本文中使用的“包括/包含”及其变化形式等意指包括，但不限于此。

除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有如方法和物质组成所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文中描述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料可以在方法和物质组成的实践或测试中使用，但以下描述了合适的方法和材料。另外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而不是旨在限制。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。

兔抗体/多肽

兔单克隆抗体(例如，抗人HER2抗体)可用于许多应用，包括免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞术、western印迹和ELISA测定。与另一些动物模型(例如，小鼠和大鼠)相比，兔提供了用于产生单克隆抗体的更好的系统，因为兔免疫系统响应于更广范围的抗原。此外在物理上，兔是更大的动物，具有更大的脾，其可产生更多的抗体。

兔单克隆抗体类似于传统的小鼠单克隆抗体，但提供更好的特异性和灵敏度。将兔进行免疫接种并将所得脾细胞与伴侣细胞进行融合以制备表达抗体的永生性细胞系。抗体来源于单个克隆，并且特征在于应用中的性能。随后选择一个或更多个克隆用于产生抗体。

由于兔的天然库比小鼠更多样，并且脾更大，因此它们的抗体表现出对抗原更高的亲和力。因此，兔单克隆抗体倾向于在为其筛选克隆的应用中提供更好的灵敏度。兔多样性的额外优势是其允许表位识别，这在其他系统可能是不可行的。另外的优势包括天然多样性、高亲和力和特异性、新的表位识别、对人和小鼠靶标的交叉反应性以及易于人源化。并且，如本文中提供的，可提供对治疗剂几乎不表现出干扰的抗体，例如另外的抗体、肽或小分子。

抗体的轻链可变区或重链可变区具有被三个高变区中断的四个框架区，所述三个高变区被称为互补决定区(complementary determining region，CDR)。CDR决定了抗原结合的特异性。重链和轻链各自具有三个CDR，从N端起命名为CDR1、CDR2、和CDR3，四个框架区侧接在这些CDR上。框架区的氨基酸序列是高度保守的，并且CDR可移植到另外的抗体中。因此，重组抗体可通过将来自一个或更多个抗体的CDR与一个或更多个另外的抗体的框架进行组合来产生。本发明的抗体包括包含本文中所述的任意单克隆抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个(或其组合)CDR的抗体。

本发明的多肽/抗体包含全长兔抗HER2/neu重链可变区、全长兔轻链可变区、其结合片段或变体、以及这些的组合。

1C5(捕获抗体)序列：

重链(SEQ ID NO:1(如下)；CDR1、2和3分别是SEQ ID NO:5、6和7，提供于表A中)。

轻链(SEQ ID NO:2(如下)；CDR1、2和3分别是SEQ ID NO:8、9和10，提供于表B中)。

表A.

重链CDR

表B.

轻链CDR

1B7(经标记抗体)序列：

重链(SEQ ID NO:3(如下)；CDR1、2和3分别＝SEQ ID NO:11、12、13，如表C中所提供)：

轻链(SEQ ID NO:4(如下)；CDR1、2和3分别＝SEQ ID NO:14、15、16，如表D中所提供)：

表C.

重链CDR

表D.

轻链CDR

按照E.Kabat,T.Wu,H.Perry,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,USDepartment of Health and Human Services,National Institutesof Health,Bethesda MD,1992.的CDR识别方法。

多肽变体、抗体变体或变体CDR与SEQ ID NO:1至16或其片段中所示的多肽的不同之处在于例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60个或更多个氨基酸残基(例如，氨基酸添加、替换或缺失)。在这种比较需要比对的情况下，将序列进行最大同源性比对。变异的位点可发生在多肽中的任何位置。在本发明的一个实施方案中，变体多肽具有与SEQ IDNO:1至16中所示的多肽基本上相似的活性。基本上相似的活性意指当将多肽用于构建抗体时，该抗体具有与野生型抗体相同或基本上相同的活性/结合。

使用Karlin and Altschul(PNAS USA 87:2264-2268,1990)(其修改为Karlinand Altschul,PNAS USA 90:5873-5877,1993)的算法来确定本文中使用的两个氨基酸序列的(或两个核酸序列的)同一性百分比。这样的算法被并入到Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索。用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索。为出于比较目的获得空位比对，如Altschul et al.(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。

同一性或相同的意指氨基酸序列(或核酸序列)相似性并且具有本领域公认的含义。具有同一性的序列共享相同的或相似的氨基酸(或核酸)。序列同一性是与抗体的原始氨基酸序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比，是在将序列进行比对并根据需要适当引入空位以使序列同一性最大化之后确定的。因此，与参考序列共享85％氨基酸序列同一性的候选序列需要在候选序列与参考序列进行比对之后，候选序列中85％的氨基酸与参考序列中相应的氨基酸相同，并且/或者构成保守的氨基酸变化。

本发明还包括SEQ ID NO:1至16的多肽变体或CDR变体。SEQ ID NO:1至16的多肽变体或CDR变体可包含一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失。在一个实施方案中，变体多肽或变体CDR包含与SEQ ID NO:1至16所示序列具有至少约75％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，变体多肽或CDR与SEQ ID NO:1至16具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更高的同一性。变体多肽或变体CDR编码变体抗体，其为包含SEQID NO:1至16的氨基酸序列的抗体，其中一个或更多个氨基酸残基被添加、替换或缺失。例如，可修饰抗体的可变区以改善其生物特性，例如抗原结合。这样的修饰可通过例如定点诱变、基于PCR的诱变、盒式诱变来实现。变体抗体包含与SEQ ID NO:1至16的重链或轻链可变区的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更高的同一性的氨基酸序列。

将突变引入氨基酸序列的方法是本领域技术人员公知的。参见例如Ausubel(ed.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harborlaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。可使用市售试剂盒例如“QuikChange^TM定点诱变试剂盒”(Stratagene)引入突变。通过替换不影响多肽功能的氨基酸来产生具有功能活性的变体多肽可由本领域技术人员来完成。

变体多肽在一个或更多个经预测非必需氨基酸残基处可具有保守的氨基酸替换。保守替换是其中氨基酸被替换为具有相似特性的另一个氨基酸使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本不变的替换。一般而言，以下组的氨基酸代表保守变化：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。

本发明的多肽或抗体可与在自然界中通常不与所述多肽或抗体缔合的氨基酸序列共价或非共价连接。另外，本发明的多肽或抗体可与除氨基酸之外的化合物或分子共价或非共价连接。例如，多肽或抗体可与以下连接：指示剂(指示剂可包括显色剂，催化剂例如酶缀合物，荧光化合物例如荧光素和罗丹明，化学发光化合物例如二氧杂环丁烷、吖啶菲啶(phenanthridinium)、钌和鲁米诺，放射性元素，直接视觉标记，以及辅因子，抑制剂，磁性颗粒等；酶缀合物的一些实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、氨基酸间隔区、氨基酸接头、信号序列、停止转移序列、跨膜结构域、蛋白质纯化配体(例如，谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A)、或其组合。在本发明的一个实施方案中，蛋白质纯化配体可以是一个或更多个C氨基酸残基，其位于例如本发明的多肽的氨基端或羧基端处。氨基酸间隔区是在自然界中通常不与本发明的多肽或抗体缔合的氨基酸序列。氨基酸间隔区可包含约1、5、10、20、100或1,000个氨基酸。

本发明的多肽可使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离出来。本发明的多肽还可以化学合成或通过重组DNA技术产生。例如，本发明的多肽可使用常规肽合成仪合成。

本发明的多肽可以重组产生。可将编码本发明的多肽的多核苷酸引入重组表达载体中，其可使用本领域公知的技术在合适的表达宿主细胞系统中表达。多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统都是本领域中可获得的，并且可使用任何这样的表达系统。任选地，编码多肽的多核苷酸可在无细胞翻译系统中进行翻译。

结合

本发明的抗体/其结合部分(抗原结合片段)特异性结合HER2(例如，人HER2)。“特异性结合”意指抗体以与其他不是HER2的非特异性分子结合时相比更大的亲和力识别HER2并与HER2结合。例如，针对抗原(多肽)产生的抗体与该抗原的结合比与非特异性抗原(例如，与HER2不相关或不同源的蛋白质)的结合更具效率，则该抗体可被描述为与抗原特异性结合。可使用本领域公知的方法使用例如酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbant assay，ELISA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)或western印迹测定来测试结合特异性。

制备抗体的方法

本发明的抗体可使用本领域技术人员已知的方法产生。例如，HER2抗原或其片段可用于免疫接种动物，包括兔。HER2或其片段可与载体蛋白缀合和/或与佐剂一起施用于动物。HER2抗原可包含一个或更多个表位(即，抗原决定簇)。表位可以是线性表位、顺序表位或构象表位。本发明的多肽中的表位可通过数种方法识别。参见例如，美国专利号4,554,101；Jameson&Wolf,CABIOS 4:181-186(1988)。例如，HER2可被分离和筛选。共同跨越整个HER2多肽序列的一系列短肽可通过蛋白水解切割来制备。通过从例如100-mer多肽片段开始，可测试每个片段在ELISA中识别的表位的存在情况。例如，在ELISA测定中，HER2抗原(例如100-mer多肽片段)与固体支持物(例如塑料多孔板的孔)连接。在非特异性吸收被阻断以及任何未结合的抗体和其他蛋白质被洗去的条件下，将抗体群进行标记，添加至固体支持物并允许与未标记抗原结合。通过例如将无色底物转换成有色反应产物的反应来检测抗体结合。随后可从识别的100-mer开始测试逐渐变小和重叠的片段以定位目的表位。

从杂交瘤开始制备单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且包括例如标准细胞培养方法和腹水产生方法。通过基因改造产生的重组抗体或其片段可使用本发明的多核苷酸序列来制备。编码抗体或其片段的基因可从本发明的杂交瘤或另外的杂交瘤中分离出来。该基因可被插入到适当的载体中并被引入到宿主细胞中。参见例如，Borrebaeck&Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,Macmillan Publ.Ltd,1990。

在一个方面中，通过免疫接种兔、选择脾细胞并构建商业量的适合于临床使用的单克隆抗体来产生高度特异性单克隆抗体。由于大多数重组兔单克隆抗体仅在研究中使用，所以单克隆兔抗体在临床空间的使用是独特的。另外，出于多种原因，本文中所述的抗体是优异的。例如，相对于重组小鼠mAb，重组兔mAb表现出与其配体更高的结合亲和力，并从而提供更多可重复的结果。此外，本文中提供的兔单克隆抗体在免疫测定中表现出受限的/有限的治疗药物干扰乃至没有治疗药物干扰。

兔单克隆抗体(mAb)因其作为研究和诊断试剂的优势已得到公认：它们具有相比小鼠mAb 10至100倍高的亲和力；可区分甚至单个氨基酸差异以及降低交叉反应性的优异的特异性；增加mAb多样性的广泛的表位识别；一致性能的极好的稳定性；以及由于兔IgG中额外的二硫键而更长的保质期(Feng L.et al.Am J Transl Res.2011；3(3):269-74；Rossi S.et al.American Journal of Clinical Pathology.2005；124(2):295-302；Vilches-Moure JG et al.J Vet Diagn Invest.2005；17(4):346-50)。

为有效地发现特异性mAb，人们可使用本领域可获得的方法，例如基于单个B细胞的SMab^TM平台对特异性目的兔mAb进行有效的高通量筛选。简言之，人们首先使用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)从脾细胞中富集和分选识别蛋白质的B细胞；在1个细胞/孔中培养和刺激所分选的细胞；使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和针对目的蛋白质的另一些所期望测定从单个B细胞中鉴定阳性克隆；收集上清液和RNA用于未来的分析；然后从阳性克隆中克隆天然配对的IgG轻链和重链的基因；并随后表达和验证所选mAb克隆。SMab^TM平台在3至4.5个月内常规地产生300至500个mAb的可测试克隆，比传统的杂交瘤和展示平台快约30％至50％。大的脾细胞库以及可扩展的高通量设计的使用增加了识别目的蛋白质的初始mAb库的多样性。SMab^TM平台使用来自中间步骤的培养上清液递送最早功能表征的蛋白质特异性mAb，以通过去除不必要的工作负荷来减少抗体开发时间。

缀合物

本发明的抗体可与另外的分子共价连接，使得共价连接不影响抗体与HER2结合的能力。例如，抗体可通过以下来修饰：例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团(例如，甲基、乙基、碳水化合物基团)的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接。

缀合的抗体可与多种分子结合，包括例如聚合物、透明质酸、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属螯合物、细胞毒性剂、放射性核素和药物。

检测方法

本发明的一个实施方案提供了检测样品中的HER2多肽的方法。该方法包括使怀疑含有HER2多肽的样品与本发明的抗体或其抗原结合部分接触以形成HER2/抗体复合物。检测HER2/抗体复合物的存在情况，从而检测HER2多肽的存在情况。在一些实施方案中，将两种不同的本发明的抗体或其抗原结合部分用于检测HER2(例如包含SEQ ID NO:5至10的抗体以及与包含SEQ ID NO:11至16的抗体接触的抗体；捕获抗体和标记抗体，包括1C5和1B7)。

受试样品可以是，例如淋巴结或组织抽吸物、血清、全血、血浆、循环肿瘤细胞、肿瘤细胞或组织(例如，组织活检物)或者腹水。多肽/抗体复合物可通过本领域已知的任何方法来检测，所述方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、多重荧光免疫测定(multiplex fluorescent immunoassay，MF或MFIA)、放射免疫测定(RIA)、夹心测定、western印迹、免疫印迹分析、免疫组织化学方法、免疫荧光测定、荧光激活细胞分选(FACS)或其组合。

针对HER2的免疫测定可使用一个抗体或数个不同的抗体。免疫测定方案可基于例如竞争、直接反应或夹心型测定，使用例如经标记抗体。本发明的抗体可用本领域已知的任何类型的标记进行标记，包括例如，荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、胶体金属标记、放射性同位素标记和生物发光标记。

本发明的抗体或其抗原结合部分可与支持物结合并用于检测HER2的存在情况。支持物包括例如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿(magletite)。

本发明的抗体可用于通过从例如疑似患有过度增殖性病症的人或动物中获得受试样品来诊断过度增殖性病症的方法。在使得能够形成抗体-抗原复合物(即，免疫复合物)的条件下使受试样品与本发明的抗体或其抗原结合部分接触。本领域技术人员知道能够并且适合于形成抗原/抗体复合物的条件。抗体-抗原复合物(包括例如，抗体或其抗原结合部分与HER2的复合物)的量可通过本领域已知的方法来确定。高于在对照样品中形成的水平指示存在过度增殖性病症。抗体/抗原复合物的量可通过本领域已知的方法来确定。

HER2阳性过度增殖性病症可以是肿瘤性病症，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、肺腺癌、子宫癌(例如子宫浆液性子宫内膜癌)、胃癌、食管癌、结肠癌以及头和/或颈癌以及/或者涎腺导管癌。

本文中所述的抗体/测定可用于识别和监测具有过表达HER2的肿瘤并因此成为靶向药物治疗候选人的患者。本文中所述的抗体/测定对治疗剂表现出受限的干扰乃至没有干扰。因此，本文中所述的免疫测定填补了乳腺癌护理空间中未满足的需求。

本文中所述的免疫测定可用于测试HER2阳性乳腺癌、监测接受药物治疗的患者中HER2的血清水平、检测复发、或者在经测试组织HER2阴性的女性中检测HER2疾病。本文中所述的免疫测定可用于检测女性中血清HER2的水平升高或提高，这可以指示被认为是HER2阴性(例如，通过组织测试)的女性中出现HER2疾病。本文中所述的免疫测定还可用于与测量循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)结合或者作为辅助来识别，或帮助识别需要或将受益于正电子发射断层成像(positron emission tomography，PET)扫描的患者。

侧向流测定(LateralFlowAssay，LFA)

侧向流测定(LFA)是基于液体样品通过黏附有与分析物相互作用的分子的聚合物带的运动，提供可视觉检出的信号。LFA通常是基于纸的平台，用于对其中经常是复杂混合物的分析物(例如蛋白质、半抗原、核酸和扩增子)进行检测和/或定量，在此处将样品放置于测试装置上并在约5至30分钟(例如5至10分钟)内显示结果。LFA的低开发成本以及易于生产导致其应用扩大到需要快速测试的多个领域，例如生物医学、农业、食品和环境科学。在例如兽医学、质量控制、食品生产中的产品安全以及环境健康和安全，包括筛查动物和人疾病、病原体、化学品、毒素和水污染物等这样的背景下，基于LFA的测试广泛用于医院、医师办公室和临床实验室，用于特定抗原和抗体以及基因扩增产物的定性和定量检测。

对于LFA，含有目的分析物的液体样品(例如尿液、唾液、汗液、血清、血浆、全血和其他流体)在没有外力(毛细管作用)的帮助下运动通过聚合物带的多个区域，在所述聚合物带上黏附有可与分析物相互作用的分子。为了更好的稳定性，典型的侧向流测试带可由安装在背衬卡(backing card)上的重叠膜组成。将样品施加于吸附样品垫上带的一端，该样品垫可负载缓冲剂盐和表面活性剂，使得样品适合与检测系统相互作用。样品迁移通过缀合物释放垫，该缀合物释放垫包含对靶分析物具有特异性并与有色或荧光颗粒(例如胶体金和乳胶微球)缀合的抗体(根据使用的识别要素，可将LFA分为不同类型，例如“侧向流免疫测定”(lateral flow immunoassay，LFIA)，其中抗体被用作识别要素；以及核酸LFA(nucleic acid LFA，NALFA)，其中使用了可在聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)期间形成的扩增子的检测)。样品和与靶分析物结合的经缀合抗体一起沿着带迁移进入了检测区域。这通常是多孔膜(通常由硝酸纤维素构成)，其具有固定在线中的特定生物组分(主要是抗体或抗原)。它们的作用是和与经缀合抗体结合的分析物反应。样品分析物的识别在测试线上引起适当的应答，而对照线上的应答指示合适的液体流通过带。由以不同强度出现的线表示的读出可通过眼或使用专用的读取器(设备)来评估。

本文中提供了即时多个诊断测定，其具有多条测试线，允许样品中存在的多个分析物的快速和同时检测，包括例如HER2阳性过度增殖性病症例如肿瘤性病症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺腺癌、子宫癌(例如子宫浆液性子宫内膜癌)、胃癌和/或涎腺导管癌，为癌症检测和进展提供了巨大的付出(toll)，例如在治疗之前、之后和/或期间。为了在相同条件下同时测试多个分析物，可以以阵列形式将对不同分析物具有特异性的另外的抗体的测试线进行固定。在另一方面中，负载有相同抗体的多条测试线可用于半定量测定。这种“梯形条”测定的原理是基于每条连续线上固定的抗体对比色缀合物-抗原复合物的逐步捕获，其中出现在带上的线的数目与分析物的浓度成正比。由于带材料的毛细管力，液体流动通过该装置，并且为了维持这种运动，可以在带的末端处连接吸收垫。吸收垫的作用是芯吸(wick)过量的试剂并防止液体回流。目前LFA的一个实例是验孕棒。

LFIA的两种形式可分为：直接的和竞争的。直接测试用于较大的分析物(例如用于人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)测试中的p24抗原)，以及具有多个抗原位点的分析物(例如用于妊娠测试中的人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin，hCG))。hCG测试是基于夹心的测定的一个实例，其中靶标被固定在两个互补的抗体之间。在直接测试中，测试线的存在指示阳性结果，并且对照线通常包含物种特异性抗免疫球蛋白抗体，对特定缀合物中的抗体具有特异性。在具有不能同时与两种抗体结合的单一抗原决定簇的小分子情况下，使用竞争性测试。在这种类型的测试中，分析物阻断测试线上抗体的结合位点，防止它们与有色缀合物相互作用。因此，阳性结果由测试线中信号的缺乏来指示，而对照线应该是独立于测试结果可见的。

至于标记，胶体金是商业LFIA中广泛使用的标记。另一种流行的标记是乳胶，它可以用多种检测试剂进行标记，例如有色或荧光染料，以及磁性或顺磁性组分。由于乳胶可以以多种颜色产生，因此它可应用于需要在许多线之间进行区分的多重测定。还使用了碳和荧光标记，或标记的酶修饰。碳纳米管、荧光标签、量子点、上转换磷光体全都可用作标记。另一种可使用的检测系统是FACTT，即敏感蛋白检测系统的首字母缩写，当与T7聚合酶偶联时，检测mAb发生扩增。读取器不是直接测量mAb，而是检测由聚合酶产生的RNA分子，从而极大放大了结果。该测试可导致定性的颜色变化，但也可受益于读取器(设备)。这可能耗费20至30分钟。

使用这样的测定有许多优点，包括例如即时，提供许多行业/国家所期望的廉价、快速和简单的测试，并且由于它们的长保质期以及储存通常不需要冷藏的事实，这些测试非常适用于发展中国家、小的门诊护理环境、偏远地区和战场。此外，由于视觉结果通常是清晰的，因此不需要额外的设备；然而，可使用可选的设备进行读出。

以下实施例仅用于示例的目的，并不旨在限制以上广义描述的本发明的范围。

实施例

实施例I

A.线性

使用线性测定来评价可报告范围。除了测定的标准操作程序(standardoperating procedure，SOP)中指定的1:50稀释之外，将具有合适的HER2水平的两个天然样品35SC和40SC以1:25、1:100和1:200进行稀释。在测量之后，通过将这些值量化为每种测试稀释度的预期HER2浓度的百分比来表明线性。预期值的80％至120％之间的范围表示可接受的线性。

两种经测试天然样品的线性都恰当地在可接受的公差内。对于1:25、1:100和1:200稀释度，血清35SC分别提供了预期浓度的98％、101％和105％的校正值；并且血清40SC分别提供了101％、99％和100％的校正值。参见表1。

表1

标准品的1:50稀释

B.交叉反应性

对于交叉反应性，在与标准曲线一起的测定中将以下四种重组人(recombinanthuman，rh)蛋白(三种与HER2相关的家族成员以及一种不相关的蛋白)以200ng/mL的升高浓度进行单独测试：rhEGFR、rhHER3、rhHER4、和rhPD-L1(每种均由Sino Biological提供)。通过计算测量的重组蛋白浓度相比于负载的200ng/mL的初始浓度的百分比来评估交叉反应性。发现任何重组蛋白产生的值大于HER2预期值的5.0％被认为是交叉反应。

测试的四种重组蛋白在200ng/mL时在HER2 ELISA中均未发生交叉反应，符合可接受性要求。参见表2。

表2标准品的1:50稀释

C.蛋白质干扰

为确定对相关家族蛋白的干扰，将同样升高的200ng/mL浓度的EGFR、HER3和HER4分别添加到浓度为约7ng/mL的中点rhHER2中(被认为是参考样品)。该测定运行之后，将测量的HER2浓度与预期浓度进行比较，并计算恢复百分比。任何产生的测量浓度小于对HER2预期浓度的80％或大于其120％的蛋白质(当存在时)被认为是干扰。

rhEGFR的恢复百分比为96.7％，rhHER3的恢复百分比为99.7％，并且rhHER4的恢复百分比为109.6％。因此，这些相关重组蛋白在200ng/mL时没有对HER2 ELISA表现出干扰，并且结果符合可接受性要求。参见表3。

表3标准品的1:50稀释

D.药物干扰

为确定相关药物的干扰，在血清样品中进行以下三种治疗性抗体的干扰测试：曲妥珠单抗(赫塞汀(Herceptin)；Roche)、帕妥珠单抗(珀吉塔(Perjeta)；Roche)、和派姆单抗(可瑞达(Keytruda)；Merck)。以100μg/mL的生理相关浓度将每种药物添加到内源性样品中，进行已知的测定测量(天然参考点)。确定来自预期浓度的任何变化并表示为干扰百分比。产生的测量浓度的变化大于对于HER2预期变化的10％的治疗性抗体(当存在时)被认为是干扰。

使用两种样品B54和20SC，赫塞汀的平均干扰百分比为6.13％并且珀吉塔的平均干扰百分比为3.72％。使用八种血清和两个实验数据来确定结果，珀吉塔的平均干扰百分比为4.5％。因此，测试的所有三种抗体药物赫塞汀、可瑞达、和珀吉塔在100μg/mL时均未对HER2 ELISA表现出干扰。参见表4。

表4

通过登录号、专利和专利申请确定的所有出版物、核苷酸和氨基酸序列均通过引用并入本文。虽然在上述说明书中，本发明已就其某些优选的实施方案进行了描述，并出于说明的目的阐述了许多细节，但对于本领域技术人员将明显的是，本发明可以有另外的实施方案，并且在不背离本发明的基本原理的情况下，本文中所述的某些细节可以有很大的变化。

本文中所述的具体方法和组合物是代表一些优选实施方案，并且是示例性的并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书后将想到其他目的、方面和实施方案，并且所述目的、方面和实施方案均涵盖在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可对本文中公开的本发明进行多种替换和修改。本文中举例说明性地描述的本发明可在不存在本文中未将其具体公开为必要要素的任何一个或更多个要素或者一个或更多个限制的情况下适当地实践。本文中举例说明性地描述的方法和过程适当地可以以不同的步骤顺序来实践，并且方法和过程不一定限于本文或权利要求书中指出的步骤顺序。除非上下文另有明确规定，否则本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。因此，例如，对“核酸”或“多肽”的提及包括这样的核酸或多肽的复数(例如，核酸或多肽的溶液或者一系列核酸或多肽制剂)等。在本文件中，除非另有说明，否则术语“或/或者”用于是指非排他性的或/或者，使得“A或B”包括“A但没有B”、“B但没有A”以及“A和B”。

在任何情况下，均不能将本专利解释为限于本文中具体公开的具体实例或实施方案或方法。在任何情况下，均不能将本专利解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员所作的任何陈述的限制，除非这样的陈述在申请人的回应性书面文件中明确地且无条件或保留地明确采纳。

已经使用的术语和表述用作描述性而非限制性术语，并且无意使用这样的术语和表述来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但认识到在所要求保护的本发明的范围内可进行多种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选特征具体公开，但由本领域技术人员可对本文中公开的概念进行修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是本发明所附权利要求书和陈述所限定的本发明的范围内。

Claims (16)

1.抗HER2单克隆抗体或其结合片段，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列，所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列。

2.抗HER2单克隆抗体或其结合片段，包含重链和轻链，其中：(i)所述重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、6、7或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区；并且(ii)所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8、9、10或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区。

3.权利要求1或2所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段，其中所述抗体与检测剂缀合。

4.组合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的抗HER2抗体和载体。

5.检测受试样品中HER2多肽或其片段的方法，其包括：

a)在允许多肽/抗体复合物形成的条件下使权利要求1至4中任一项所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段与受试样品接触；以及

b)检测a)的多肽/抗体复合物，其中多肽/抗体复合物的检出是所述HER2多肽存在于所述样品中的指示。

6.监测来自对象的样品中HER2多肽或其片段的方法，其包括：

a)在允许多肽/抗体复合物形成的条件下使至少一种权利要求1至4中任一项所述的抗HER2单克隆抗体或其结合片段与所述样品接触；

b)检测a)的多肽/抗体复合物，其中多肽/抗体复合物的检出指示HER2多肽或其片段存在于所述对象中；以及

c)在多个时间点进行步骤a)和b)，以便监测随着时间所述对象中的HER2多肽或其片段。

7.权利要求5或6所述的方法，其还包括使a)的样品与第二抗HER2抗体或其片段接触，所述第二抗HER2抗体或其片段包含重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列，所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其同一性为至少95％的氨基酸序列；或者与这样的抗HER2抗体或其片段接触，所述抗HER2抗体或其片段包含重链和轻链，其中(i)所述重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:11、12、13或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区；并且(ii)所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:14、15、16或与其同一性为至少95％的氨基酸序列的三个CDR区。

8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述样品在a)中与以下接触：

i)捕获抗体或其结合片段，和

ii)检测抗体或其结合片段。

9.权利要求8所述的方法，其中所述捕获抗体和检测抗体与HER2结合。

10.权利要求8至9中任一项所述的方法，其中所述捕获抗体被固定。

11.权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述检测抗体包含检测剂。

12.权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述对象正在接受治疗剂治疗。

13.权利要求12所述的方法，其中所述治疗剂是曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或其组合。

14.权利要求6至12中任一项所述的方法，其中所述对象正在接受曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或其组合的治疗，其中所述曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗或其组合不干扰或仅有限干扰捕获抗体和/或检测抗体或者其结合片段的结合。

15.权利要求5至6中任一项所述的方法，其中所述样品是维持在组织培养中的淋巴结或组织抽吸物(例如，乳房)、血清、全血、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊液、来自正常细胞裂解物的上清液、来自瘤前细胞裂解物的上清液、来自肿瘤细胞裂解物的上清液和/或来自癌细胞系的上清液。

16.权利要求5至15中任一项所述的方法，其中b)的检测在使用侧向流测定的情况下来进行。