CN119040425B

CN119040425B - 一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法及其应用

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Publication number: CN119040425B
Application number: CN202411546631.3A
Authority: CN
Inventors: 苏日娜; 阿荣; 高兴爽; 张佳丽; 顾悦; 张敏; 刘畅; 索佳丽; 曹晨霞
Original assignee: INNER MONGOLIA VOCATIONAL COLLEGE OF CHEMICAL ENGINEERING
Current assignee: INNER MONGOLIA VOCATIONAL COLLEGE OF CHEMICAL ENGINEERING
Priority date: 2024-11-01
Filing date: 2024-11-01
Publication date: 2025-03-04
Anticipated expiration: 2044-11-01
Also published as: CN119040425A

Abstract

本发明涉及功能肽的酶法提取技术领域，尤其涉及一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法及其应用，S1：制备骨渣；S2：制备骨粉；S3：用复合脱脂剂进行第一次脱脂处理，且复合脱脂剂由食品级脂肪酶、甘氨胆酸钠按照1:(0.1‑0.15)的质量比混合而成；S4：用无水乙醇进行第二次脱脂处理；S5：利用第一蛋白酶、第二蛋白酶依次对所得脱脂骨粉B进行酶解处理，且第一蛋白酶为胶原蛋白酶，第二复合蛋白酶由氨肽酶、丝氨酸蛋白酶按照1:(1‑3)的质量比混合而成；S6：将所得含活性肽悬液灭酶、离心、冷冻干燥后，得降糖活性肽。本发明首次以羊骨为原料，经二次脱脂以及两次蛋白酶分段酶解处理，高效提取出小分子降糖活性肽。

Description

一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法及其应用

技术领域

本发明涉及功能肽的酶法提取技术领域，尤其涉及一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法及其应用。

背景技术

糖尿病是一种全球性常见的慢性疾病，其主要特点是血糖水平异常升高。据报道，截至2021年全球共计约5.37亿成年人患有糖尿病，预计到2045年全球患有糖尿病的成年人数量将增加约46%，届时，糖尿病成年患者数量将达到约7.83亿，因此，各类控糖产品具有极高的市场前景，例如，丹麦制药巨头诺和诺德在上半年仅司美格鲁肽的销售额就达到了约129.8亿美元。

近年来，随着高血糖、糖尿病等病症被社会各界广泛关注，降糖活性肽作为一种潜在的治疗糖尿病的生物活性物质，各类天然降糖活性多肽也被广泛开发并应用。例如，申请号为CN202011086514.5的发明专利，公开一种具有DPP-IV抑制活性的羊皮胶原蛋白肽及其制备方法，联合化学水解和酶水解制备羊皮胶原蛋白肽；申请号为CN202110489295.3的发明专利，公开一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽及其制备方法，通过两步酶解法制备牦牛骨肽；申请号为CN202311533246.0的发明专利，公开一种具有DPP-IV抑制活性的苦荞肽及其应用，通过苦荞蛋白制备、酶解、提取、分离纯化等，制得具有DPP-IV抑制活性的苦荞肽。羊骨作为一种富含骨胶原、骨类黏蛋白、弹性硬蛋白及其他活性成分的资源，利用羊骨原料开发降糖活性肽仍是国内外的研究空白，尚未被论文或专利报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，以羊骨为原料，经复合脱脂剂、无水乙醇的二次脱脂以及两次蛋白酶分段酶解处理，最终提取出降糖活性肽。

基于上述目的，本发明提供了一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，包括以下步骤：

S1：将羊骨高压蒸煮至骨关节处可轻易捏碎，去除杂质、洗净后，破碎成骨渣；

S2：将S1所得骨渣烘干后，置于磨粉机中，磨成骨粉，再过60-80目筛，得骨粉；

S3：将骨粉置于纯水中，加入复合脱脂剂，35-50℃磁力搅拌处理2-4h，进行脱脂，过滤、烘干后，得脱脂骨粉A；

所述复合脱脂剂由食品级脂肪酶、甘氨胆酸钠按照1:(0.1-0.15)的质量比混合而成；

S4：将脱脂骨粉A加入无水乙醇中，20-40℃磁力搅拌处理12-24h，进行二次脱脂处理，过滤、水洗、再过滤、烘干后，得脱脂骨粉B；

通过复合脱脂剂、无水乙醇的二次脱脂处理，极大地提高了脱脂效率，脱脂率高达99.4%，无需后续纯化处理，同时，研究发现，在后续S5步骤同样做了两次蛋白酶分段酶解处理的条件下，随着脱脂率的增加，降糖活性肽的提取率也越高，二者呈现一定的正相关关系。

考虑的原因可能是，骨粉中的脂肪在蛋白酶水解过程中易形成乳化液或沉淀，影响蛋白酶与目标蛋白质的接触，降低酶解效率，与此同时，脂肪的存在还可能对蛋白酶的活性位点产生物理阻碍或化学干扰，进一步影响蛋白酶的正常功能，因此，通过对骨粉进行脱脂，避免了脂肪覆盖在骨粉表面，还避免了脂肪的乳化或沉淀作用，使蛋白酶可以更直接地接触到骨粉基质中的骨胶原、骨类黏蛋白、弹性硬蛋白等蛋白质，脱脂处理后也降低了骨粉悬液的粘度（脂肪会增加骨粉悬液的粘度），进而也改善了酶分子的流动作用，进而改善了活性肽的提取率。

发明人还发现，相比于单一脂肪酶，利用脂肪酶和甘氨胆酸钠合理组配的复合脱脂剂可更高效地分解脂肪酶，由于甘氨胆酸钠能够降低水与油脂之间的界面张力，促进脂肪酶更有效地与脂肪分子接触；且在甘氨胆酸钠的存在下，脂肪被分散成更小的微乳滴，并形成甘氨胆酸钠-脂肪分子混合胶束，使脂肪酶更高效地结合到脂肪分子上，从而增强脂肪酶对骨粉中脂肪的催化水解作用。

S5：将脱脂骨粉B置于纯水中，加入第一蛋白酶，调节pH至7.2-8.2，35-39℃磁力搅拌处理1-2h，再加入第二复合蛋白酶，调节pH至8.5-9.5，40-50℃磁力搅拌处理1-3h，经两次分段酶解处理后，得含活性肽悬液；

所述第一蛋白酶为胶原蛋白酶；

所述第二复合蛋白酶由氨肽酶、丝氨酸蛋白酶按照1:(1-3)的质量比混合而成；

通过第一蛋白酶、第二蛋白酶分段酶解骨粉，能有效提高降糖活性肽的提取率，首先，利用第一蛋白酶（胶原蛋白酶）在pH=7.2-8.2、35-39℃条件下水解骨粉，能有效提取骨胶原蛋白中的活性肽成分，而后，再利用第二复合蛋白酶（氨肽酶+丝氨酸蛋白酶）在pH=8.5-9.5、40-50℃条件下水解骨粉，能有效提取非骨胶原类蛋白中的活性肽成分，同时，第一蛋白酶、第二蛋白酶的联合使用，使得酶解体系具有较多的切割位点，使羊骨粉的水解作用更充分，进一步提高活性肽的提取率。

S6：将含活性肽悬液于100℃水浴灭酶15-30min后，-4℃冷却后，以4000-6000r/min的转速离心10-20min后，取上清液，冷冻干燥后，得具有DPP-IV抑制作用的降糖活性肽。

优选的是，所述杂质包括但不限于残肉、筋膜。

优选的是，所述骨粉、纯水、复合脱脂剂的质量比为1:10:(0.03-0.05)。

优选的是，所述食品级脂肪酶的酶活力≥1×10⁶U/g。

优选的是，所述脱脂骨粉A、无水乙醇的质量比为1:(8-12)。

优选的是，所述脱脂骨粉B、纯水、第一蛋白酶、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:(0.05-0.09):(0.1-0.15)。

优选的是，所述胶原蛋白酶的酶活力≥10000U/g。

优选的是，所述氨肽酶的酶活力≥50000U/g。

优选的是，所述丝氨酸蛋白酶的酶活力≥10000U/g。

本发明还进一步提供根据所述的从羊骨中提取降糖活性肽的方法提取出的降糖活性肽在制备降血糖保健食品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次以羊骨为原料，经复合脱脂剂、无水乙醇的二次脱脂以及两次蛋白酶分段酶解处理，提取出小分子降糖活性肽，且降糖活性肽提取率高，具有高DPP-IV抑制活性。

通过复合脱脂剂、无水乙醇的协同脱脂处理极大地提高了骨粉的脱脂效率，无需后续纯化处理，简化程序，还一定程度上提高了蛋白肽的提取率，分析原因可能是，骨粉中的脂肪在蛋白酶水解过程中易形成乳化液或沉淀，影响蛋白酶与目标蛋白质的接触，降低酶解效率，与此同时，脂肪的存在还可能对蛋白酶的活性位点产生物理阻碍或化学干扰，进一步影响蛋白酶的正常功能，因此，通过对骨粉进行脱脂，避免了脂肪覆盖在骨粉表面，还避免了脂肪的乳化或沉淀作用，使蛋白酶可以更直接地接触到骨粉基质中的骨胶原、骨类黏蛋白、弹性硬蛋白等蛋白质，脱脂处理后也降低了骨粉悬液的粘度（脂肪会增加骨粉悬液的粘度），进而也改善了酶分子的流动作用，进而改善了活性肽的提取率。

另外，经脱脂处理后的所提取出的降糖活性肽也表现出更优良地稳定性，一方面，由于脂肪在提取过程中可能产生了一些影响活性肽稳定性的副产物，另一方面，未经脱脂处理的活性肽产品中含有大量脂肪，脂肪的化学性质不稳定，在存储过程中易氧化变质，进而加速了活性肽的变质，因此，通过复合脱脂剂、无水乙醇的协同脱脂处理还可提高降糖活性肽的稳定性、延长保质期。

因此，协同脱脂处理是提取降糖活性肽过程中的重要步骤，有助于提高活性肽提取纯度、改善提取效果、降低后续处理难度以及改善降糖活性肽的稳定性，保证了降糖活性肽的品质和产率。

本发明通过第一蛋白酶、第二蛋白酶分段酶解骨粉，能有效提高降糖活性肽的提取率，首先，利用第一蛋白酶（胶原蛋白酶）在pH=7.2-8.2、35-39℃条件下水解骨粉，能有效提取骨胶原蛋白中的活性肽成分，而后，再利用第二复合蛋白酶（氨肽酶+丝氨酸蛋白酶）在pH=8.5-9.5、40-50℃条件下水解骨粉，能有效提取非骨胶原类蛋白中的活性肽成分，同时，第一蛋白酶、第二蛋白酶的联合使用，增加了酶解体系的切割位点，使羊骨粉的水解作用更充分，进一步提高活性肽的提取率。

本发明的牛骨活性肽的多肽含量高、分子量小、活性高，具有优异的DPP-IV抑制活性，仅1.0mg/mL活性肽即可实现55.8-62.7%的DPP-IV抑制率，可用于制备新型降血糖保健食品。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

本发明下列实施例及对比例所使用的蛋白酶活力及供应商如下：丝氨酸蛋白酶的酶活力为10000U/g，购于江苏华策生物科技有限公司；氨肽酶50000U/g，购于江苏采薇生物科技有限公司；胶原蛋白酶的酶活力为10000U/g，购于河南瑞仁生物工程有限公司；食品级脂肪酶的酶活力为1.0×10⁶U/g，购于江苏采薇生物科技有限公司。

实施例1 制备骨粉

制备骨渣：将羊骨高压蒸煮至骨关节处可轻易捏碎，去除残肉、筋膜等杂质、洗净后，破碎成骨渣；

制备骨粉：将所得骨渣烘干后，置于磨粉机中，磨成骨粉，再过80目筛，得骨粉，并将所得骨粉均分为十等份，其中任一等份的质量记作M0，根据GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定其中一等份骨粉原料中蛋白质含量，记作Md1，根据GB 5009.6-2016索氏抽提法测定另一等份骨粉原料中脂肪含量，记作Md2，其余八等分骨粉依次作为下列实施例2-4、对比例1-5的降糖活性肽的提取原料。

实施例2 提取降糖活性肽

A.第一次脱脂处理：将实施例1中的一等份骨粉置于纯水中，加入复合脱脂剂，且复合脱脂剂由食品级脂肪酶、甘氨胆酸钠按照1:0.1的质量比混合而成，并控制骨粉、纯水、复合脱脂剂的质量比为1:10:0.03，35℃磁力搅拌处理2h，进行脱脂，过滤、烘干后，得脱脂骨粉A；

B.第二次脱脂处理：将脱脂骨粉A加入其8倍质量的无水乙醇中，20℃磁力搅拌处理12h，进行二次脱脂处理，过滤、水洗、再过滤、烘干后，得脱脂骨粉B，并称重记作M1；

C.双酶解法制含活性肽悬液：

C1.备料：

第一蛋白酶：胶原蛋白酶；

第二复合蛋白酶：由氨肽酶、丝氨酸蛋白酶按照1:1的质量比混合而成；

C2.双酶解处理：将脱脂骨粉B置于纯水中，加入第一蛋白酶，调节pH至7.2，35℃磁力搅拌处理1h，再加入第二复合蛋白酶，且脱脂骨粉B、纯水、第一蛋白酶、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:0.05:0.1，并调节pH至8.5，40℃磁力搅拌处理1h，经两次分段酶解处理后，得含活性肽悬液；

D.制备降糖活性肽：将含活性肽悬液于100℃水浴灭酶15min后，-4℃冷却后，以4000r/min的转速离心10min后，取上清液，冷冻干燥后，得具有DPP-IV抑制作用的降糖活性肽，并根据GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定其蛋白含量，记作Mt。

实施例3 提取降糖活性肽

A.第一次脱脂处理：将实施例1中的一等份骨粉置于纯水中，加入复合脱脂剂，且复合脱脂剂由食品级脂肪酶、甘氨胆酸钠按照1:0.125的质量比混合而成，并控制骨粉、纯水、复合脱脂剂的质量比为1:10:0.04，40℃磁力搅拌处理3h，进行脱脂，过滤、烘干后，得脱脂骨粉A；

B.第二次脱脂处理：将脱脂骨粉A加入其10倍质量的无水乙醇中，30℃磁力搅拌处理18h，进行二次脱脂处理，过滤、水洗、再过滤、烘干后，得脱脂骨粉B，并称重记作M1；

C.双酶解法制含活性肽悬液：

C1.备料：

第一蛋白酶：胶原蛋白酶；

第二复合蛋白酶：由氨肽酶、丝氨酸蛋白酶按照1:2的质量比混合而成；

C2.双酶解处理：将脱脂骨粉B置于纯水中，加入第一蛋白酶，调节pH至7.7，37℃磁力搅拌处理1.5h，再加入第二复合蛋白酶，且脱脂骨粉B、纯水、第一蛋白酶、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:0.07:0.125并调节pH至9.0，45℃磁力搅拌处理2h，经两次分段酶解处理后，得含活性肽悬液；

D.制备降糖活性肽：将含活性肽悬液于100℃水浴灭酶20min后，-4℃冷却后，以5000r/min的转速离心15min后，取上清液，冷冻干燥后，得具有DPP-IV抑制作用的降糖活性肽，并根据GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定其蛋白含量，记作Mt。

实施例4 提取降糖活性肽

A.第一次脱脂处理：将实施例1中的一等份骨粉置于纯水中，加入复合脱脂剂，且复合脱脂剂由食品级脂肪酶、甘氨胆酸钠按照1:0.15的质量比混合而成，并控制骨粉、纯水、复合脱脂剂的质量比为1:10:0.05，50℃磁力搅拌处理4h，进行脱脂，过滤、烘干后，得脱脂骨粉A；

B.第二次脱脂处理：将脱脂骨粉A加入其12倍质量的无水乙醇中，40℃磁力搅拌处理24h，进行二次脱脂处理，过滤、水洗、再过滤、烘干后，得脱脂骨粉B，并称重记作M1；

C.双酶解法制含活性肽悬液：

C1.备料：

第一蛋白酶：胶原蛋白酶；

第二复合蛋白酶：由氨肽酶、丝氨酸蛋白酶按照1:3的质量比混合而成；

C2.双酶解处理：将脱脂骨粉B置于纯水中，加入第一蛋白酶，调节pH至8.2，39℃磁力搅拌处理2h，再加入第二复合蛋白酶，且脱脂骨粉B、纯水、第一蛋白酶、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:0.09:0.15，并调节pH至9.5，50℃磁力搅拌处理3h，经两次分段酶解处理后，得含活性肽悬液；

D.制备降糖活性肽：将含活性肽悬液于100℃水浴灭酶30min后，-4℃冷却后，以6000r/min的转速离心20min后，取上清液，冷冻干燥后，得具有DPP-IV抑制作用的降糖活性肽，并根据GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定其蛋白含量，记作Mt。

对比例1与实施例2相同，区别在于：无S4第二次脱脂处理过程，即仅以复合脱脂剂进行脱脂，并称重记作M1。

对比例2与实施例2相同，区别在于：无S3第一次脱脂处理过程，即直接仅以无水乙醇进行脱脂。

对比例3与实施例2相同，区别在于：利用食品级脂肪酶替代复合脱脂剂。

对比例4与实施例2相同，区别在于：利用月桂酰谷氨酸钠替代甘氨胆酸钠。

对比例5与实施例2相同，区别在于：在S5操作过程中，未使用胶原蛋白酶第一蛋白酶进行酶解；具体为：将脱脂骨粉B置于纯水中，加入第二复合蛋白酶，且脱脂骨粉B、纯水、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:0.1，并调节pH至8.5，40℃磁力搅拌处理1h，经两次分段酶解处理后，得含活性肽悬液。

根据公式100%×(M0-M1)/Md2计算实施例2-4及对比例1-5的脱脂率；

根据公式100%×Mt/Md1计算实施例2-4及对比例1-5的蛋白提取率。

表1列出实施例2-4及对比例1-5的脱脂率及蛋白提取率：

表1

由表1可知，实施例2-4的提取降糖活性肽方法的脱脂率及蛋白提取率明显优于对比例1-5，其中，脱脂率高达99.4%、蛋白提取率高达69.3%，同时，观察实施例2-4及对比例1-4数据可知，在实施例及对比例后续S5步骤均做了两次蛋白酶分段酶解处理的条件下，随着脱脂率的增加，蛋白提取率也越高，二者呈现一定的正相关关系，这也说明了本发明通过复合脱脂剂、无水乙醇的协同脱脂处理也一定程度上提高了蛋白肽的提取率。另外，相比于实施例2，未利用胶原蛋白酶处理的对比例5的蛋白提取率最低，这说明了本发明通过胶原蛋白酶和“氨肽酶+丝氨酸蛋白酶”分段酶解对于提高活性肽的提取率具有重要影响，进一步结合对比例1-4数据可以得出，本发明通过特定的“二次脱脂+两次蛋白酶分段酶解”处理，有助于高效提取出小分子降糖活性肽。

对比实施例2、对比例1-2数据可知，通过复合脱脂剂、无水乙醇的二次脱脂处理，极大地提高了脱脂效率；对比实施例2、对比例3-4数据可知，甘氨胆酸钠和月桂酰谷氨酸钠对于脂肪酶的水解脂肪作用均有一定的促进作用，但是甘氨胆酸钠对脂肪酶的催化水解作用优越于月桂酰谷氨酸钠，分析其原因可能是，甘氨胆酸钠将脂肪分散成更小的微乳滴，并形成甘氨胆酸钠-脂肪分子混合胶束，使脂肪酶更高效地结合到脂肪分子上，从而增强脂肪酶对骨粉中脂肪的催化水解作用。

通过测定DPP-IV抑制率以评判实施例1-3制备的活性肽的降糖效果：用pH=8 .0Tris-HCl缓冲液将活性肽冻干粉配制成1.0mg/mL的样品溶液，并以pH=8 .0 Tris-HCl缓冲液作为对照溶液，分别与底物(Gly-Pro-pNA)混合，37℃下孵育后加入DPP-IV酶液，测定在405nm处的吸光度，根据公式100%×(S_对照-S_样品)/S_对照计算DPP-IV抑制率，其中S_对照和S_样品分别表示 Tris-HCl-底物溶液、活性肽-底物溶液随时间变化吸光度变化斜率。

表2列出实施例2-4提取出的降糖活性肽DPP-IV抑制率：

表2

由表2可知，实施例2-4提取出的降糖活性肽具有高DPP-IV抑制活性，仅1.0mg/mL活性肽即可实现55.8-62.7%的DPP-IV抑制率，可用于制备新型降血糖保健食品。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2：将S1所得骨渣烘干后，置于磨粉机中，磨成粗骨粉，再过60-80目筛，得骨粉；

所述第一蛋白酶为胶原蛋白酶；

2.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述杂质包括但不限于残肉、筋膜。

3.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述骨粉、纯水、复合脱脂剂的质量比为1:10:(0.03-0.05)。

4.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述食品级脂肪酶的酶活力≥1×10⁶U/g。

5.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述脱脂骨粉A、无水乙醇的质量比为1:(8-12)。

6.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述脱脂骨粉B、纯水、第一蛋白酶、第二复合蛋白酶的质量比为1:10:(0.05-0.09):(0.1-0.15)。

7.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述胶原蛋白酶的酶活力≥10000U/g。

8.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述氨肽酶的酶活力≥50000U/g。

9.根据权利要求1所述的一种从羊骨中提取降糖活性肽的方法，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶的酶活力≥10000U/g。

10.一种根据权利要求1-9任一项所述的从羊骨中提取降糖活性肽的方法提取出的降糖活性肽在制备辅助降血糖保健食品中的应用。