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CN119040330B - 一种调控AGT基因表达的siRNA及其用途 - Google Patents

一种调控AGT基因表达的siRNA及其用途 Download PDF

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CN119040330B CN202411545710.2A CN202411545710A CN119040330B CN 119040330 B CN119040330 B CN 119040330B CN 202411545710 A CN202411545710 A CN 202411545710A CN 119040330 B CN119040330 B CN 119040330B
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Abstract

本公开提供一种调控AGT基因表达的siRNA及其应用。所述siRNA在细胞实验中被证明对AGT基因表达具有显著抑制作用，可用于开发治疗和/或预防AGT基因的表达相关疾病的药物。

Description

一种调控AGT基因表达的siRNA及其用途
技术领域
本公开属于小核酸药物领域，具体涉及一种调控AGT基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
核酸药物尤其是寡核苷酸药物，由于其合成简单、活性较高而得到广泛应用。寡核苷酸药物通常包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和核酸适配体等。
RNA干涉是一个针对外源基因的自然防御机制。siRNA能够通过对特定序列的识别并分解目标mRNA的方式敲除目标基因。
经典RNA干涉的有效分子由标志性的19 + 2核苷酸聚合结构组成，即一个由21个核苷酸RNA分子与19个对应碱基的核苷酸分子组成的双螺旋结构，包含有2个核苷酸的3’端悬垂。siRNA的一条链，即导引链或反义链，与目标基因的转录物mRNA互补，另一条链标定为乘客链或正义链。siRNA反义链引导阿尔古蛋白与目标转录本互补，并成为RNA引导沉默复合体的一部分。siRNA反义链与目标的完全互补，导致在阿尔古蛋白的催化下反义链10-11点位对面位置的目标转录本发生断裂。
通过对合成的反义寡核苷酸进行化学修饰，可以增加反义寡核苷酸的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。
对寡核苷酸结构进行化学修饰是提高其活性的一种有效方式。经过化学修饰、改造后的寡核苷酸可以提高对核酸酶的稳定性、与RNA的亲和性，并能更好地促进细胞内吞和组织靶向，从而提高其活性。已经上市的寡核苷酸药物，都是经过化学修饰的，从1998年第一个核酸药物Fomivirsen (Vitravene）获批上市至今，核酸药物的化学修饰改造技术不断升级。
依据寡核苷酸的基本结构，即碱基、糖环、磷酸骨架和末端，可以分四个部分进行化学修饰。
碱基的修饰：主要分为嘌呤修饰、嘧啶修饰以及碱基替换三种形式。嘌呤修饰包括N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、7-甲基鸟苷酸修饰；嘧啶修饰包括3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N4 -乙酰胞苷、假尿苷、硫尿核苷、丙炔尿嘧啶核苷和二氢尿嘧啶核苷等修饰。
糖环的修饰：主要分为糖环的修饰和替换。糖环的修饰，包括2’-修饰、4’-修饰、5’-修饰和异构修饰，以及这些修饰的组合修饰。
磷酸骨架的修饰：由于体内核酸酶对寡核苷酸的磷酸二酯键的水解，是寡核苷酸在体内迅速降解的主要原因，因此选择其它合适的类似物来取代磷酸二酯键骨架，可以增加其稳定性。对磷酸骨架主要的修饰方式有：硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯或双硫代磷酸酯；或将核苷之间的磷酸酯基整个替换为不含磷原子的基团，如将P原子替换成C、S以及N原子，形成胍基、S-甲基硫脲等。
末端的修饰：在siRNA的5’或/和3’末端共价偶联特殊的基团，可以增强与细胞的亲和性、组织的选择性和细胞的靶向性。在末端修饰脂溶性小分子，可以提高其与细胞膜的相似相溶而提高入胞效率。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与siRNA的偶联，可以实现寡核苷酸药物的肝靶向递送。
血管紧张素原（AGT）蛋白是一种分泌蛋白，在人体内主要在肝脏中表达，其他有AGT表达的组织还有大脑、胆囊、心脏和肾脏等。AGT蛋白被肾素切割后产生血管紧张素I（Ang I），随后又会被血管紧张素转化酶（ACE）切割产生具有生理活性的血管紧张素II（AngII），而Ang II与血管紧张素受体（ATR）结合，引发血管收缩，升高血压。
尽管目前用于治疗高血压的降压药数量较大，但仍有超过三分之二的患者难以通过一种药物控制血压，需要两种及以上的药物控制血压，这导致疗法依从性下降，潜在的副作用增加，影响了疗法的效果。因此，本领域需要用于患有血管紧张素原相关疾病的患者的替代疗法和组合疗法。
发明内容
为解决现有技术中针对血管紧张素原（AGT）的siRNA的抑制效果不佳的问题，本公开提供了一种siRNA。所述siRNA构建的药物进入血液后，被肝细胞内吞进入细胞，储存在细胞的内体结构中。在siRNA从内体或溶酶体中释放出来进入细胞质后，其与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，并在反义链的介导下与AGT基因转录出的mRNA结合，诱导mRNA降解，从而抑制AGT蛋白的翻译。AGT蛋白作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的上游蛋白，抑制其表达将会从根本上抑制RAAS系统升高血压的作用，从而降低血压。本公开提供的siRNA能够在体外细胞实验中显著降低AGT基因的表达。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：一种siRNA（小干扰核糖核酸），所述siRNA包含正义链和反义链，所述siRNA包含以下任一寡核苷酸双链体：
1)所述正义链具有如SEQ ID NO: 34所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 82所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
2)所述正义链具有如SEQ ID NO: 39所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 87所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
3)所述正义链具有如SEQ ID NO: 23所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 71所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
4)所述正义链具有如SEQ ID NO: 17所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 65所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
5)所述正义链具有如SEQ ID NO: 35所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 83所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
6)所述正义链具有如SEQ ID NO: 45所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 93所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
7)所述正义链具有如SEQ ID NO: 27所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 75所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
8)所述正义链具有如SEQ ID NO: 30所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 78所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
9)所述正义链具有如SEQ ID NO: 22所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 70所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
所述修饰序列包含一个或多个修饰的核苷酸。
在本公开一较佳实施方案中，所述正义链长度为19-27个核苷酸。
在本公开一较佳实施方案中，所述反义链长度为19-27个核苷酸。
在本公开一较佳实施方案中，所述siRNA包含以下任一寡核苷酸双链体：
1)所述正义链具有如SEQ ID NO: 34所示的序列或SEQ ID NO: 34的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 82所示的序列或SEQ ID NO: 82的修饰序列；
2)所述正义链具有如SEQ ID NO: 39所示的序列或SEQ ID NO: 39的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 87所示的序列或SEQ ID NO: 87的修饰序列；
3)所述正义链具有如SEQ ID NO: 23所示的序列或SEQ ID NO: 23的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 71所示的序列或SEQ ID NO: 71的修饰序列；
4)所述正义链具有如SEQ ID NO: 17所示的序列或SEQ ID NO: 17的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 65所示的序列或SEQ ID NO: 65的修饰序列；
5)所述正义链具有如SEQ ID NO: 35所示的序列或SEQ ID NO: 35的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 83所示的序列或SEQ ID NO: 83的修饰序列；
6)所述正义链具有如SEQ ID NO: 45所示的序列或SEQ ID NO: 45的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 93所示的序列或SEQ ID NO: 93的修饰序列；
7)所述正义链具有如SEQ ID NO: 27所示的序列或SEQ ID NO: 27的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 75所示的序列或SEQ ID NO: 75的修饰序列；
8)所述正义链具有如SEQ ID NO: 30所示的序列或SEQ ID NO: 30的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 78所示的序列或SEQ ID NO: 78的修饰序列；
9)所述正义链具有如SEQ ID NO: 22所示的序列或SEQ ID NO: 22的修饰序列，和所述反义链具有如SEQ ID NO: 70所示的序列或SEQ ID NO: 70的修饰序列；
所述修饰序列包含一个或多个修饰的核苷酸。
在本公开一较佳实施方案中，所述修饰的核苷酸包含的修饰为核苷酸核糖的2’-修饰。
在本公开一较佳实施方案中，所述2’-修饰选自以下的修饰：2’-甲氧基、2’-O-甲氧基乙基、2’-氟、2’-O-苄基和2’-O-甲基-4-吡啶。
在本公开一较佳实施方案中，所述2’-修饰为2’-甲氧基和2’-氟代。
在本公开一较佳实施方案中，各核苷酸核糖的2’-修饰为2’-甲氧基和2’-氟代的交替组合。
在本公开一较佳实施方案中，所述正义链和所述反义链中核苷酸单体之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，优选为3’,5’-磷酸二酯键。
在本公开一较佳实施方案中，所述siRNA包含以下任一寡核苷酸双链体：
1)所述正义链具有如SEQ ID NO: 34所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:82所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 130所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 178所示的序列；
2)所述正义链具有如SEQ ID NO: 39所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:87所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 135所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 183所示的序列；
3)所述正义链具有如SEQ ID NO: 23所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:71所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 119所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 167所示的序列；
4)所述正义链具有如SEQ ID NO: 17所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:65所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 113所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 161所示的序列；
5)所述正义链具有如SEQ ID NO: 35所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:83所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 131所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 179所示的序列；
6)所述正义链具有如SEQ ID NO: 45所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:93所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 141所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 189所示的序列；
7)所述正义链具有如SEQ ID NO: 27所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:75所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 123所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 171所示的序列；
8)所述正义链具有如SEQ ID NO: 30所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:78所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 126所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 174所示的序列；
9)所述正义链具有如SEQ ID NO: 22所示的序列且所述反义链具有如SEQ ID NO:70所示的序列；或，所述正义链具有如SEQ ID NO: 118所示的序列且所述反义链具有如SEQID NO: 166所示的序列。
在本公开一较佳实施方案中，所述siRNA的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。
在本公开一较佳实施方案中，所述靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
在本公开一较佳实施方案中，所述靶向配体包含GalNAc（N-乙酰基半乳糖胺）部分。
在本公开一较佳实施方案中，所述GalNac部分为单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：一种药物组合物，所述药物组合物包含如本公开所述的siRNA及药学上可接受的载体。
所述药物组合物可用于治疗与AGT基因的表达或活性相关的疾病或病症，如各种高血压。可基于递送模型配制这类药物组合物。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过静脉内（i.v.）递送来全身性施用或定向递送至肝脏的组合物。一个实例是经配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。
所述药物组合物可以是具有或不具有一种缓冲液的溶液或含有药学上可接受的载体的组合物。这样的组合物包括例如水性或结晶组合物、脂质体配制品、胶束配制品、乳剂以及基因治疗载体。
在本公开一较佳实施方案中，所述脂质体配制品中的脂质体（属于药学上可接受的载体）为LNP。
在本公开一较佳实施方案中，所述药物组合物还包括AGT基因抑制剂和AGT蛋白抑制剂中的一种或两种，所述AGT蛋白抑制剂包括靶向AGT蛋白的抗体，所述AGT基因抑制剂包括靶向AGT基因的剪辑编辑器、靶向AGT基因转录的mRNA的反义寡核苷酸（ASO）和微小RNA（miRNA）中的一种或多种。
在本公开一较佳实施方案中，所述药物组合物还包括治疗高血压的药物，所述治疗高血压的药物包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、钙通道阻滞剂和β受体阻滞剂中的一种或多种。
在本公开的方法中，所述siRNA可以在一种溶液中给予。一种游离siRNA可以在一种非缓冲溶液中、例如在生理盐水中或在水中给予。可替代地，该游离siRNA还可以在一种适合缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个优选实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水（PBS）。可以将包含该iRNA剂的缓冲液的pH与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。
在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含一种用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的试剂，以使得克分子渗透压浓度被保持在一个所希望的值，例如在人血浆的生理值。可以加入到该缓冲溶液以控制克分子渗透压浓度的溶质包括（但不限于）蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质或盐。在一些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是一种盐。在某些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是氯化钠或氯化钾。
本公开的药物组合物可以按足以抑制AGT基因的表达的剂量给予。通常，本公开的siRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。所述siRNA例如可以按每个单剂量约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50mg/kg施用。
可以将所述药物组合物一日给予一次，或者1~365日的不同时间间隔给予多次，或者可以将所述siRNA在一年内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个子剂量中所含的siRNA必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久siRNA释放的常规持续释放配制品。缓释配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本公开的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
在其他实施例中，单一剂量的所述siRNA或所述药物组合物可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3、或4周的间距施用。在本公开的一些实施例中，每周给予一次单剂量的所述药物组合物。在本公开的其他实施例中，每两月给予一次单剂量的所述药物组合物。
本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括（但不局限于）疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本公开涵盖的各个siRNA的有效剂量和体内半衰期。
取决于希望局部还是全身性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本公开的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的（例如通过皮肤药贴）；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，例如，经由植入装置；或颅内的，例如脑实质内的、鞘内的或心室内的给予。
在本公开的药物组合物、方法和用途中使用的所述siRNA可以被配制成用于在膜性分子集合体中递送例如脂质体或胶束。如此处使用的，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层（例如一个双层或多个双层）中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含所述siRNA。该亲脂性材料从典型地不包括所述siRNA的水性外部（尽管在一些实例中，它可能包括）分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜与生物膜结构上类似，当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括siRNA的内部水性内容物被递送到细胞中，其中所述siRNA可以特异性结合到一种靶标RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体也是特异地靶向的，例如将所述siRNA引导到特定的细胞类型。
包含所述siRNA的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将所述siRNA添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与所述siRNA相互作用并在所述siRNA周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到所述siRNA的脂质体制剂。
iRNA，例如本公开的siRNA可以被完全封装在脂质配制品（例如LNP或其他核酸-脂质颗粒）中。
如在此使用的，术语“LNP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。LNP含有一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质（例如一种PEG-脂质缀合物）。LNP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内（i.v.）注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累（例如在与给予位点物理分开的位点）。
在一个实施方案中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与siRNA的比率)将处于从大约1:1至大约50:1，从大约1:1至大约25:1，从大约3:1至大约15:1，从大约4:1至大约10:1，从大约5:1至大约9:1，或大约6:1至大约9:1的范围内。
在本公开一较佳实施方案中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质。
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(I)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为C1～6亚烷基；G2为C2～8亚烷基；G3为C1～3亚烷基；L1为C6～15直链烷基；L2为C12～25支链烷基。例如，式(I-I)结构的YK-009（参见专利CN114044741B）。
(I)
(I-I)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(II)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G1为C2~8亚烷基；G2为C2~8亚烷基；L1为-C(O)O-或-OC(O)-；L2为-C(O)O-或-OC(O)-；R1为C6~25直链或支链烷基；R2为C6~25直链或支链烷基；G3为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；G4为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；L为(CH2)2-或-(CH2)3-或-(CH2)4-。例如，式(II-I)结构的YK-401，式(II-II)结构的YK-402（参见专利CN115784921B）。
(II)
(II-I)
(II-II)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(III)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G1为C1~6亚烷基；G2为C2~8亚烷基；R1为C6~20直链或支链烷基；R2为C12~25支链烷基；G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-。例如，式(III-I)结构的YK-201，式(III-II)结构的YK-202（参见专利CN115677518B）。
(III)
(III-I)
(III-II)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(IV)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为C1~8亚烷基；G2为C2~8亚烷基；R1为C6~25直链或支链烷基；R2为C12~25直链或支链烷基；G3为：HO(CH2)2N(R3)CH2CH(OH)CH2-，其中R3为-CH3或-CH2CH3或-CH2CH2OH。例如，式(IV-I)结构的YK-305，式(IV-II)结构的YK-310（参见专利CN115745820B）。
(IV)
(IV-I)
(IV-II)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(V)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，G1和G2各自独立地为未取代的C6-C10亚烷基；G3为未取代的C1-C12亚烷基；R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3为OR5、N、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；R4为C1-C12烃基；并且R5为H或C1-C6烃基；例如，式(V-I)结构的ALC0315（参见专利CN108368028B）。
(V)
(V-I)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(VI)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-N(R)S(O)2R8和杂环；n是1、2或3；例如，式(VI-I)结构的SM102（参见专利CN110520409A）。
(VI)
(VI-I)
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质是式(VII)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体（参见CN102625696B， DLIN-MC3-DMA），
(VII)。
在本公开一更佳实施方式中，所述阳离子脂质包括YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA。
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1~10:1。
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为1:1~5:1。
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25~65):(5~25):(25~70):(0.5~5)。
在本公开一较佳实施方案中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25~65):(5~25):(25~45):(0.5~5)。
在一些更优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5或49:10:39.5:1.5。
在本公开一较佳实施方案中，所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。
在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DLPC）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱（DMPC）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱（DUPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（18:0 Diether PC）、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（OChemsPC）、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（C16 Lyso PC）、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（ME 16.0PE）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐（DOPG）、二棕榈酰基磷脂酰甘油（DPPG）、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺（POPE）、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺（DSPE）、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺（DMPE）、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺（SOPE）、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱（SOPC）、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）以及其混合物。
在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质是DOPE和/或DSPC。
在本公开一较佳实施方案中，所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和皮质类固醇。
在一些更优选地实施方式中，所述结构性脂质是胆固醇。
在本公开一较佳实施方案中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。
在一些更优选地实施方式中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000），二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺（ALC-0159）。
在本公开一具体实施方案中，所述LNP为Lipofectamine® RNAiMAX。
本公开所述的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症（例如肝癌）时靶向肝脏的配制品。
本公开的药物配制品（可以方便地以单位剂型存在）可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该（这些）药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本公开所述的药物组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本公开所述的药物组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
本公开的某些药物组合物还向配制品中并入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的（即本身不具有生物活性），但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用（一般后一种物质过量）可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4’异硫氰酸茋-2,2’-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少（宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res.Dev.)，1995,5,115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996,6,177-183）。
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂（例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等）；填料（例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等）；润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等）；崩解剂（例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等）；和润湿剂（例如月桂基硫酸钠等）。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本公开所述的药物组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：一种套装药盒，所述套装药盒包含药盒A，所述药盒A包括如本公开所述的siRNA或如本公开所述的药物组合物中的一种或两种；
较佳地，所述套装药盒还包括药盒B，所述药盒B含有以下（1）和（2）中的一者或两者：
（1）AGT基因抑制剂或AGT蛋白抑制剂；
（2）由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的组中的任一者或两者以上的组合。
在本公开一较佳实施方案中，所述AGT蛋白抑制剂包括靶向AGT蛋白的抗体，所述AGT基因抑制剂包括靶向AGT基因的剪辑编辑器、靶向AGT基因转录的mRNA的反义寡核苷酸（ASO）和微小RNA（miRNA）中的一种或多种。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：如本公开所述的siRNA、如本公开所述的药物组合物和如本公开所述的套装药盒中的一种或多种在制备用于治疗或/和预防AGT基因表达相关疾病中的应用。
在本公开一较佳实施方案中，所述AGT基因表达相关疾病包括高血压类疾病或由高血压导致的相关疾病。
在本公开一较佳实施方案中，所述高血压类疾病包括临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压。
在本公开一较佳实施方案中，所述由高血压导致的相关疾病包括高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化和库欣综合征。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：用于治疗或/和预防AGT基因表达相关疾病的如本公开所述的siRNA、如本公开所述的药物组合物或如本公开所述的套装药盒。
在本公开一较佳实施方案中，所述AGT基因表达相关疾病包括高血压类疾病或由高血压导致的相关疾病。
在本公开一较佳实施方案中，所述高血压类疾病包括临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压。
在本公开一较佳实施方案中，所述由高血压导致的相关疾病包括高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化和库欣综合征。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：一种治疗或预防AGT基因表达相关疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如本公开所述的siRNA、如本公开所述的药物组合物和如本公开所述的套装药盒中的一种或多种。所述方法可通过下调AGT基因表达实现治疗或预防。
在本公开一较佳实施方案中，所述AGT基因表达相关疾病包括高血压类疾病或由高血压导致的相关疾病。
在本公开一较佳实施方案中，所述高血压类疾病包括临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压。
在本公开一较佳实施方案中，所述由高血压导致的相关疾病包括高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化和库欣综合征。
本公开所述的SiRNA可以使用本领域中已知的任何给药模式给予给一名受试者，包括（但不限于）皮下、静脉内、肌肉内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在优选实施例中，这些试剂是皮下给予的。
在另外的实施例中，将所述siRNA与另外的治疗剂组合给予。所述siRNA以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中组合地给予，例如，肠胃外给予,或该另外的治疗剂可以作为一个单独的组合物的一部分或通过在此描述的另一种方法给予。
另外的治疗剂的实例包括已知用来治疗高血压的药剂或已知用来治疗心脑血管疾病的药剂。例如，另外的治疗高血压的药剂选自血管紧张素转化酶抑制剂（例如卡托普利、依那普利、贝那普利、培哚普利等）、血管紧张素II受体拮抗剂（例如氯沙坦、氯沙坦氢氯噻嗪、缬沙坦、缬沙坦氢氯噻嗪、替米沙坦、替米沙坦氢氯噻嗪、奥美沙坦酯等）、β受体阻滞剂（例如普萘洛尔、比索洛尔、酒石酸美托洛尔、琥珀酸美托洛尔等）。
在一个实施例中，将所述siRNA剂给予患者，并且随后将另外的治疗剂给予该患者（或反之亦然）。在另一个实施例中，将iRNA剂和另外的治疗剂同时给予。
为解决前述技术问题，本公开提供的一种技术方案为：一种降低AGT基因表达或抑制AGT复制的方法，其特征在于，所述方法包括对样本施用如本公开所述的siRNA、如本公开所述的药物组合物和如本公开所述的套装药盒中的一种或多种。较佳地，所述方法为非治疗目的的。
本发明中，针对的AGT的氨基酸序列例如NCBI Accession No: NM_001384479.1和NM_001382817.3所示，编码AGT的基因的核苷酸序列例如NCBI Accession No: NM_001384479.1和NM_001382817.3所示。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供过的无修饰的siRNA对AGT mRNA的表达具有明显的抑制作用，例如抑制率高于50%。进一步对这些siRNA进行修饰后，部分修饰的siRNA依旧保持了较高的抑制率或提高了抑制率（例如抑制率达到了60%以上）。
附图说明
图1为无修饰的siRNA对AGT的抑制率，对照为NC。
图2为修饰的siRNA对AGT的抑制率，对照为NC。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本公开针对AGT mRNA序列设计了46条小干扰核糖核酸（siRNA）序列，包括46条正义链和46条反义链，并对这些序列进行了2’-F和2’-Me交替修饰。修饰策略具体为：对于siRNA序列的反义链，奇数位（即第1、3、5、7...21、23号位）使用2’-甲氧基修饰，偶数位（即第2、4、6、8...20、22号位）使用2’-氟代修饰。对于与反义链互补配对的正义链，在反义链上使用2’-甲氧基修饰的位置，正义链上的互补配对位置使用2’-氟代修饰；在反义链上使用2’-氟代修饰的位置，正义链上的互补配对位置使用2’-甲氧基修饰。阳性对照为APC（阿尔尼拉姆公司Zilebesiran药物序列），阴性对照为不和AGT mRNA序列重合的NC（NegativeControl）。无修饰寡核苷酸序列见，2’-F和2’-Me交替修饰的寡核苷酸见。
表 无修饰寡核苷酸序列
编号 正义链序列（5’-3’） SEQ ID NO 反义链序列（5’-3’） SEQ ID NO
11 CGAGCACCCCAGUCUGAGAUG 1 UCUCAGACUGGGGUGCUCGCU 49
50 CUGAGGGCCACCAUCCUCUGC 2 AGAGGAUGGUGGCCCUCAGGC 50
128 ACCUCGUCAUCCACAAUGA 3 UCAUUGUGGAUGACGAGGU 51
150 CCUGUGAGCAGCUGGCAAAGG 4 UUUGCCAGCUGCUCACAGGUA 52
187 CCUUCAUACCUGCUCCAAUUC 5 AUUGGAGCAGGUAUGAAGGUG 53
223 GACAUCCCCUGUGGAUGAAAA 6 UUCAUCCACAGGGGAUGUCUU 54
262 GCUGGUGCUAGUCGCUGCAAA 7 UGCAGCGACUAGCACCAGCUG 55
289 GACACCGAAGACAAGUUGA 8 UCAACUUGUCUUCGGUGUC 56
341 GGCUUCCGUAUAUAUGGCAUG 9 UGCCAUAUAUACGGAAGCCCA 57
407 GGCACCCUGGCCUCUCUCUAU 10 AGAGAGAGGCCAGGGUGCCAA 58
478 GGCAAUCCUGGGUGUUCCUUG 11 AGGAACACCCAGGAUUGCCUG 59
490 GGUGUUCCUUGGAAGGACA 12 UGUCCUUCCAAGGAACACC 60
556 CUGCCCUGCAGGCUGUACAGG 13 UGUACAGCCUGCAGGGCAGAC 61
622 GGUGGUGGGCGUGUUCACAGC 14 UGUGAACACGCCCACCACCGU 62
673 GCAGGGCCUGGCUCUCUAUAC 15 AUAGAGAGCCAGGCCCUGCAC 63
720 GGACUUCACAGAACUGGAU 16 AUCCAGUUCUGUGAAGUCC 64
740 GCUGCUGAGAAGAUUGACAGG 17 UGUCAAUCUUCUCAGCAGCAA 65
760 GUUCAUGCAGGCUGUGACAGG 18 UGUCACAGCCUGCAUGAACCU 66
830 UGGCUUUCAACACCUACGU 19 ACGUAGGUGUUGAAAGCCA 67
904 GGUGGACAACAGCACCUCAGU 20 UGAGGUGCUGUUGUCCACCCA 68
994 GACUCAAGUGCCCUUCACUGA 21 AGUGAAGGGCACUUGAGUCAC 69
1030 GCUGAUCCAGCCUCACUAUGC 22 AUAGUGAGGCUGGAUCAGCAG 70
1063 CAAGGUGGAGGGUCUCACUUU 23 AGUGAGACCCUCCACCUUGUC 71
1096 CCUCAACUGGAUGAAGAAACU 24 UUUCUUCAUCCAGUUGAGGGA 72
1155 GGUGCUGCAAGGAUCUUAU 25 AUAAGAUCCUUGCAGCACC 73
1221 CCGAGCUGAACCUGCAAAAAU 26 UUUUGCAGGUUCAGCUCGGUG 74
1267 GGAGGUGCUGAACAGCAUUUU 27 AAUGCUGUUCAGCACCUCCCC 75
1296 GCUUGAAGCGGAUGAGAGA 28 UCUCUCAUCCGCUUCAAGC 76
1323 AGAGUCUACCCAACAGCUU 29 AAGCUGUUGGGUAGACUCU 77
1384 GUUUGCUGUGUAUGAUCAAAG 30 UUGAUCAUACACAGCAAACAG 78
1461 GCCAGGGCCCCAGAACACAGU 31 UGUGUUCUGGGGCCCUGGCCU 79
1494 CUCUGCCCCUGGCCUUUGAGG 32 UCAAAGGCCAGGGGCAGAGGC 80
1530 GAUAACAACCCCGGACAAAUC 33 UUUGUCCGGGGUUGUUAUCUG 81
1583 CUUCUAAUGAGUCGACUUUGA 34 AAAGUCGACUCAUUAGAAGAA 82
1615 GCCGUUUCUCCUUGGUCUAAG 35 UAGACCAAGGAGAAACGGCUG 83
1642 GCAUGGAGUGAGCAGUAGAAG 36 UCUACUGCUCACUCCAUGCAG 84
1675 CAAAUGCACCUCCCAGUUUGC 37 AAACUGGGAGGUGCAUUUGUG 85
1748 GCGGGACUACUGUUCCAAA 38 UUUGGAACAGUAGUCCCGC 86
1812 CCUUUUCAAGUUGAGAACAAAAAUU 39 AAUUUUUGUUCUCAACUUGAAAAGGGA 87
1876 GGUUUGUAUUUAGUGUCUU 40 AAGACACUAAAUACAAACC 88
1912 CCGUGUAGUGUCUGUAAUACC 41 UAUUACAGACACUACACGGAG 89
1934 CUUAGUUUUUUCCACAGAUGCUUGU 42 ACAAGCAUCUGUGGAAAAAACUAAGGU 90
1980 AGAUGCAAGCACCUGAAUUUCUGUU 43 AACAGAAAUUCAGGUGCUUGCAUCUUU 91
2010 GCGGAACCAUAGCUGGUUA 44 UAACCAGCUAUGGUUCCGC 92
2034 CCCUUGUGUUAGUAAUAAA 45 UUUAUUACUAACACAAGGG 93
2059 GCCACAAUAAGCCUCCAAA 46 UUUGGAGGCUUAUUGUGGC 94
APC GUCAUCCACAAUGAGAGUACA 47 UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA 95
NC UAACAUCUCGACGUAGACAUC 48 GAUGUCUACGUCGAGAUGUUACU 96
表 修饰寡核苷酸
编号 正义链序列（5’-3’） 修饰序列SEQ ID NO/对应无修饰SEQ ID NO 反义链序列（5’-3’） 修饰序列SEQ ID NO/对应无修饰SEQ ID NO
A11-AL Cfs-Gms-Af-Gm-Cf-Am-Cf-Cm-Cf-Cm-Af-Gm-Uf-Cm-Uf-Gm-Af-Gm-Af-Um-Gf 97/1 Ums-Cfs-Um-Cf-Am-Gf-Am-Cf-Um-Gf-Gm-Gf-Gm-Uf-Gm-Cf-Um-Cf-Gms-Cfs-Um 145/49
A50-AL Cfs-Ums-Gf-Am-Gf-Gm-Gf-Cm-Cf-Am-Cf-Cm-Af-Um-Cf-Cm-Uf-Cm-Uf-Gm-Cf 98/2 Ams-Gfs-Am-Gf-Gm-Af-Um-Gf-Gm-Uf-Gm-Gf-Cm-Cf-Cm-Uf-Cm-Af-Gms-Gfs-Cm 146/50
A128-AL Afs-Cms-Cf-Um-Cf-Gm-Uf-Cm-Af-Um-Cf-Cm-Af-Cm-Af-Am-Uf-Gm-Af 99/3 Ums-Cfs-Am-Uf-Um-Gf-Um-Gf-Gm-Af-Um-Gf-Am-Cf-Gm-Af-Gms-Gfs-Um 147/51
A150-AL Cfs-Cms-Uf-Gm-Uf-Gm-Af-Gm-Cf-Am-Gf-Cm-Uf-Gm-Gf-Cm-Af-Am-Af-Gm-Gf 100/4 Ums-Ufs-Um-Gf-Cm-Cf-Am-Gf-Cm-Uf-Gm-Cf-Um-Cf-Am-Cf-Am-Gf-Gms-Ufs-Am 148/52
A198-AL Cfs-Cms-Uf-Um-Cf-Am-Uf-Am-Cf-Cm-Uf-Gm-Cf-Um-Cf-Cm-Af-Am-Uf-Um-Cf 101/5 Ams-Ufs-Um-Gf-Gm-Af-Gm-Cf-Am-Gf-Gm-Uf-Am-Uf-Gm-Af-Am-Gf-Gms-Ufs-Gm 149/53
A226-AL Gfs-Ams-Cf-Am-Uf-Cm-Cf-Cm-Cf-Um-Gf-Um-Gf-Gm-Af-Um-Gf-Am-Af-Am-Af 102/6 Ums-Ufs-Cm-Af-Um-Cf-Cm-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Gm-Gf-Am-Uf-Gm-Uf-Cms-Ufs-Um 150/54
A262-AL Gfs-Cms-Uf-Gm-Gf-Um-Gf-Cm-Uf-Am-Gf-Um-Cf-Gm-Cf-Um-Gf-Cm-Af-Am-Af 103/7 Ums-Gfs-Cm-Af-Gm-Cf-Gm-Af-Cm-Uf-Am-Gf-Cm-Af-Cm-Cf-Am-Gf-Cms-Ufs-Gm 151/55
A289-AL Gfs-Ams-Cf-Am-Cf-Cm-Gf-Am-Af-Gm-Af-Cm-Af-Am-Gf-Um-Uf-Gm-Af 104/8 Ums-Cfs-Am-Af-Cm-Uf-Um-Gf-Um-Cf-Um-Uf-Cm-Gf-Gm-Uf-Gms-Ufs-Cm 152/56
A341-AL Gfs-Gms-Cf-Um-Uf-Cm-Cf-Gm-Uf-Am-Uf-Am-Uf-Am-Uf-Gm-Gf-Cm-Af-Um-Gf 105/9 Ums-Gfs-Cm-Cf-Am-Uf-Am-Uf-Am-Uf-Am-Cf-Gm-Gf-Am-Af-Gm-Cf-Cms-Cfs-Am 153/57
A422-AL Gfs-Gms-Cf-Am-Cf-Cm-Cf-Um-Gf-Gm-Cf-Cm-Uf-Cm-Uf-Cm-Uf-Cm-Uf-Am-Uf 106/10 Ams-Gfs-Am-Gf-Am-Gf-Am-Gf-Gm-Cf-Cm-Af-Gm-Gf-Gm-Uf-Gm-Cf-Cms-Afs-Am 154/58
A478-AL Gfs-Gms-Cf-Am-Af-Um-Cf-Cm-Uf-Gm-Gf-Gm-Uf-Gm-Uf-Um-Cf-Cm-Uf-Um-Gf 107/11 Ams-Gfs-Gm-Af-Am-Cf-Am-Cf-Cm-Cf-Am-Gf-Gm-Af-Um-Uf-Gm-Cf-Cms-Ufs-Gm 155/59
A490-AL Gfs-Gms-Uf-Gm-Uf-Um-Cf-Cm-Uf-Um-Gf-Gm-Af-Am-Gf-Gm-Af-Cm-Af 108/12 Ums-Gfs-Um-Cf-Cm-Uf-Um-Cf-Cm-Af-Am-Gf-Gm-Af-Am-Cf-Ams-Cfs-Cm 156/60
A546-AL Cfs-Ums-Gf-Cm-Cf-Cm-Uf-Gm-Cf-Am-Gf-Gm-Cf-Um-Gf-Um-Af-Cm-Af-Gm-Gf 109/13 Ums-Gfs-Um-Af-Cm-Af-Gm-Cf-Cm-Uf-Gm-Cf-Am-Gf-Gm-Gf-Cm-Af-Gms-Afs-Cm 157/61
A622-AL Gfs-Gms-Uf-Gm-Gf-Um-Gf-Gm-Gf-Cm-Gf-Um-Gf-Um-Uf-Cm-Af-Cm-Af-Gm-Cf 110/14 Ums-Gfs-Um-Gf-Am-Af-Cm-Af-Cm-Gf-Cm-Cf-Cm-Af-Cm-Cf-Am-Cf-Cms-Gfs-Um 158/62
A673-AL Gfs-Cms-Af-Gm-Gf-Gm-Cf-Cm-Uf-Gm-Gf-Cm-Uf-Cm-Uf-Cm-Uf-Am-Uf-Am-Cf 111/15 Ams-Ufs-Am-Gf-Am-Gf-Am-Gf-Cm-Cf-Am-Gf-Gm-Cf-Cm-Cf-Um-Gf-Cms-Afs-Cm 159/63
A720-AL Gfs-Gms-Af-Cm-Uf-Um-Cf-Am-Cf-Am-Gf-Am-Af-Cm-Uf-Gm-Gf-Am-Uf 112/16 Ams-Ufs-Cm-Cf-Am-Gf-Um-Uf-Cm-Uf-Gm-Uf-Gm-Af-Am-Gf-Ums-Cfs-Cm 160/64
A740-AL Gfs-Cms-Uf-Gm-Cf-Um-Gf-Am-Gf-Am-Af-Gm-Af-Um-Uf-Gm-Af-Cm-Af-Gm-Gf 113/17 Ums-Gfs-Um-Cf-Am-Af-Um-Cf-Um-Uf-Cm-Uf-Cm-Af-Gm-Cf-Am-Gf-Cms-Afs-Am 161/65
A760-AL Gfs-Ums-Uf-Cm-Af-Um-Gf-Cm-Af-Gm-Gf-Cm-Uf-Gm-Uf-Gm-Af-Cm-Af-Gm-Gf 114/18 Ums-Gfs-Um-Cf-Am-Cf-Am-Gf-Cm-Cf-Um-Gf-Cm-Af-Um-Gf-Am-Af-Cms-Cfs-Um 162/66
A830-AL Ufs-Gms-Gf-Cm-Uf-Um-Uf-Cm-Af-Am-Cf-Am-Cf-Cm-Uf-Am-Cf-Gm-Uf 115/19 Ams-Cfs-Gm-Uf-Am-Gf-Gm-Uf-Gm-Uf-Um-Gf-Am-Af-Am-Gf-Cms-Cfs-Am 163/67
A904-AL Gfs-Gms-Uf-Gm-Gf-Am-Cf-Am-Af-Cm-Af-Gm-Cf-Am-Cf-Cm-Uf-Cm-Af-Gm-Uf 116/20 Ums-Gfs-Am-Gf-Gm-Uf-Gm-Cf-Um-Gf-Um-Uf-Gm-Uf-Cm-Cf-Am-Cf-Cms-Cfs-Am 164/68
A994-AL Gfs-Ams-Cf-Um-Cf-Am-Af-Gm-Uf-Gm-Cf-Cm-Cf-Um-Uf-Cm-Af-Cm-Uf-Gm-Af 117/21 Ams-Gfs-Um-Gf-Am-Af-Gm-Gf-Gm-Cf-Am-Cf-Um-Uf-Gm-Af-Gm-Uf-Cms-Afs-Cm 165/69
A1030-AL Gfs-Cms-Uf-Gm-Af-Um-Cf-Cm-Af-Gm-Cf-Cm-Uf-Cm-Af-Cm-Uf-Am-Uf-Gm-Cf 118/22 Ams-Ufs-Am-Gf-Um-Gf-Am-Gf-Gm-Cf-Um-Gf-Gm-Af-Um-Cf-Am-Gf-Cms-Afs-Gm 166/70
A1063-AL Cfs-Ams-Af-Gm-Gf-Um-Gf-Gm-Af-Gm-Gf-Gm-Uf-Cm-Uf-Cm-Af-Cm-Uf-Um-Uf 119/23 Ams-Gfs-Um-Gf-Am-Gf-Am-Cf-Cm-Cf-Um-Cf-Cm-Af-Cm-Cf-Um-Uf-Gms-Ufs-Cm 167/71
A1096-AL Cfs-Cms-Uf-Cm-Af-Am-Cf-Um-Gf-Gm-Af-Um-Gf-Am-Af-Gm-Af-Am-Af-Cm-Uf 120/24 Ums-Ufs-Um-Cf-Um-Uf-Cm-Af-Um-Cf-Cm-Af-Gm-Uf-Um-Gf-Am-Gf-Gms-Gfs-Am 168/72
A1155-AL Gfs-Gms-Uf-Gm-Cf-Um-Gf-Cm-Af-Am-Gf-Gm-Af-Um-Cf-Um-Uf-Am-Uf 121/25 Ams-Ufs-Am-Af-Gm-Af-Um-Cf-Cm-Uf-Um-Gf-Cm-Af-Gm-Cf-Ams-Cfs-Cm 169/73
A1221-AL Cfs-Cms-Gf-Am-Gf-Cm-Uf-Gm-Af-Am-Cf-Cm-Uf-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Am-Uf 122/26 Ums-Ufs-Um-Uf-Gm-Cf-Am-Gf-Gm-Uf-Um-Cf-Am-Gf-Cm-Uf-Cm-Gf-Gms-Ufs-Gm 170/74
A1267-AL Gfs-Gms-Af-Gm-Gf-Um-Gf-Cm-Uf-Gm-Af-Am-Cf-Am-Gf-Cm-Af-Um-Uf-Um-Uf 123/27 Ams-Afs-Um-Gf-Cm-Uf-Gm-Uf-Um-Cf-Am-Gf-Cm-Af-Cm-Cf-Um-Cf-Cms-Cfs-Cm 171/75
A1296-AL Gfs-Cms-Uf-Um-Gf-Am-Af-Gm-Cf-Gm-Gf-Am-Uf-Gm-Af-Gm-Af-Gm-Af 124/28 Ums-Cfs-Um-Cf-Um-Cf-Am-Uf-Cm-Cf-Gm-Cf-Um-Uf-Cm-Af-Ams-Gfs-Cm 172/76
A1323-AL Afs-Gms-Af-Gm-Uf-Cm-Uf-Am-Cf-Cm-Cf-Am-Af-Cm-Af-Gm-Cf-Um-Uf 125/29 Ams-Afs-Gm-Cf-Um-Gf-Um-Uf-Gm-Gf-Gm-Uf-Am-Gf-Am-Cf-Ums-Cfs-Um 173/77
A1384-AL Gfs-Ums-Uf-Um-Gf-Cm-Uf-Gm-Uf-Gm-Uf-Am-Uf-Gm-Af-Um-Cf-Am-Af-Am-Gf 126/30 Ums-Ufs-Gm-Af-Um-Cf-Am-Uf-Am-Cf-Am-Cf-Am-Gf-Cm-Af-Am-Af-Cms-Afs-Gm 174/78
A1461-AL Gfs-Cms-Cf-Am-Gf-Gm-Gf-Cm-Cf-Cm-Cf-Am-Gf-Am-Af-Cm-Af-Cm-Af-Gm-Uf 127/31 Ums-Gfs-Um-Gf-Um-Uf-Cm-Uf-Gm-Gf-Gm-Gf-Cm-Cf-Cm-Uf-Gm-Gf-Cms-Cfs-Um 175/79
A1494-AL Cfs-Ums-Cf-Um-Gf-Cm-Cf-Cm-Cf-Um-Gf-Gm-Cf-Cm-Uf-Um-Uf-Gm-Af-Gm-Gf 128/32 Ums-Cfs-Am-Af-Am-Gf-Gm-Cf-Cm-Af-Gm-Gf-Gm-Gf-Cm-Af-Gm-Af-Gms-Gfs-Cm 176/80
A1530-AL Gfs-Ams-Uf-Am-Af-Cm-Af-Am-Cf-Cm-Cf-Cm-Gf-Gm-Af-Cm-Af-Am-Af-Um-Cf 129/33 Ums-Ufs-Um-Gf-Um-Cf-Cm-Gf-Gm-Gf-Gm-Uf-Um-Gf-Um-Uf-Am-Uf-Cms-Ufs-Gm 177/81
A1583-AL Cfs-Ums-Uf-Cm-Uf-Am-Af-Um-Gf-Am-Gf-Um-Cf-Gm-Af-Cm-Uf-Um-Uf-Gm-Af 130/34 Ams-Afs-Am-Gf-Um-Cf-Gm-Af-Cm-Uf-Cm-Af-Um-Uf-Am-Gf-Am-Af-Gms-Afs-Am 178/82
A1615-AL Gfs-Cms-Cf-Gm-Uf-Um-Uf-Cm-Uf-Cm-Cf-Um-Uf-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Af-Am-Gf 131/35 Ums-Afs-Gm-Af-Cm-Cf-Am-Af-Gm-Gf-Am-Gf-Am-Af-Am-Cf-Gm-Gf-Cms-Ufs-Gm 179/83
A1642-AL Gfs-Cms-Af-Um-Gf-Gm-Af-Gm-Uf-Gm-Af-Gm-Cf-Am-Gf-Um-Af-Gm-Af-Am-Gf 132/36 Ums-Cfs-Um-Af-Cm-Uf-Gm-Cf-Um-Cf-Am-Cf-Um-Cf-Cm-Af-Um-Gf-Cms-Afs-Gm 180/84
A1675-AL Cfs-Ams-Af-Am-Uf-Gm-Cf-Am-Cf-Cm-Uf-Cm-Cf-Cm-Af-Gm-Uf-Um-Uf-Gm-Cf 133/37 Ams-Afs-Am-Cf-Um-Gf-Gm-Gf-Am-Gf-Gm-Uf-Gm-Cf-Am-Uf-Um-Uf-Gms-Ufs-Gm 181/85
A1748-AL Gfs-Cms-Gf-Gm-Gf-Am-Cf-Um-Af-Cm-Uf-Gm-Uf-Um-Cf-Cm-Af-Am-Af 134/38 Ums-Ufs-Um-Gf-Gm-Af-Am-Cf-Am-Gf-Um-Af-Gm-Uf-Cm-Cf-Cms-Gfs-Cm 182/86
A1812-AL Cfs-Cms-Uf-Um-Uf-Um-Cf-Am-Af-Gm-Uf-Um-Gf-Am-Gf-Am-Af-Cm-Af-Am-Af-Am-Af-Um-Uf 135/39 Ams-Afs-Um-Uf-Um-Uf-Um-Gf-Um-Uf-Cm-Uf-Cm-Af-Am-Cf-Um-Uf-Gm-Af-Am-Af-Am-Gf-Gms-Gfs-Am 183/87
A1876-AL Gfs-Gms-Uf-Um-Uf-Gm-Uf-Am-Uf-Um-Uf-Am-Gf-Um-Gf-Um-Cf-Um-Uf 136/40 Ams-Afs-Gm-Af-Cm-Af-Cm-Uf-Am-Af-Am-Uf-Am-Cf-Am-Af-Ams-Cfs-Cm 184/88
A1912-AL Cfs-Cms-Gf-Um-Gf-Um-Af-Gm-Uf-Gm-Uf-Cm-Uf-Gm-Uf-Am-Af-Um-Af-Cm-Cf 137/41 Ums-Afs-Um-Uf-Am-Cf-Am-Gf-Am-Cf-Am-Cf-Um-Af-Cm-Af-Cm-Gf-Gms-Afs-Gm 185/89
A1934AL Cfs-Ums-Uf-Am-Gf-Um-Uf-Um-Uf-Um-Uf-Cm-Cf-Am-Cf-Am-Gf-Am-Uf-Gm-Cf-Um-Uf-Gm-Uf 138/42 Ams-Cfs-Am-Af-Gm-Cf-f-Am-Uf-Cm-Uf-Gm-Uf-Gm-Gf-Am-Af-Am-Af-Am-Af-Cm-Uf-Am-Af-Gms-Gfs-Um 186/90
A1980-AL Afs-Gms-Af-Um-Gf-Cm-Af-Am-Gf-Cm-Af-Cm-Cf-Um-Gf-Am-Af-Um-Uf-Um-Cf-Um-Gf-Um-Uf 139/43 Ams-Afs-Cm-Af-Gm-Af-f-Am-Af-Um-Uf-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Gf-Cm-Uf-Um-Gf-Cm-Af-Um-Cf-Ums-Ufs-Um 187/91
A2010-AL Gfs-Cms-Gf-Gm-Af-Am-Cf-Cm-Af-Um-Af-Gm-Cf-Um-Gf-Gm-Uf-Um-Af 140/44 Ums-Afs-Am-Cf-Cm-Af-Gm-Cf-Um-Af-Um-Gf-f-Gm-Uf-Um-Cf-Cms-Gfs-Cm 188/92
A2034-AL Cfs-Cms-Cf-Um-Uf-Gm-Uf-Gm-Uf-Um-Af-Gm-Uf-Am-Af-Um-Af-Am-Af 141/45 Ums-Ufs-Um-Af-Um-Uf-Am-Cf-Um-Af-Am-Cf-f-Am-Cf-Am-Af-Gms-Gfs-Gm 189/93
A2059-AL Gfs-Cms-Cf-Am-Cf-Am-Af-Um-Af-Am-Gf-Cm-Cf-Um-Cf-Cm-Af-Am-Af 142/46 Ums-Ufs-Um-Gf-Gm-Af-Gm-Gf-Cm-Uf-Um-Af-f-Um-Uf-Gm-Uf-Gms-Gfs-Cm 190/94
APC-AL Gfs-Ums-Cf-Am-Uf-Cm-Cf-Am-Cf-Am-Af-Um-Gf-Am-Gf-Am-Gf-Um-Af-Cm-Af 143/47 Ums-Gfs-Um-Af-Cm-Uf-Cm-Uf-Cm-Af-Um-Uf-Gm-Uf-Gm-Gf-Am-Uf-Gm-Af-Cms-Gfs-Am 191/95
ANC-AL Ufs-Ams-Af-Cm-Af-Um-Cf-Um-Cf-Gm-Af-Cm-Gf-Um-Af-Gm-Af-Cm-Af-Um-Cf 144/48 Gms-Afs-Um-Gf-Um-Cf-Um-Af-Cm-Gf-Um-Cf-Gm-Af-Gm-Af-Um-Gf-Um-Uf-Ams-Cfs-Um 192/96
注：无修饰序列为数字编号。交替修饰序列在数字编号前加“A”，编号后加“-AL”。例如，无修饰序列1583交替修饰后的序列编号为A1583-AL。
本文核苷酸缩写如下：
A=腺苷-3’-磷酸酯
Am=2’-甲氧基腺苷-3’-磷酸酯
Ams=2’-甲氧基腺苷-3’-硫代磷酸酯
Af=2’-氟腺苷-3’-磷酸酯
Afs=2’-氟腺苷-3’-硫代磷酸酯
G=鸟苷-3’-磷酸酯
Gm=2’-甲氧基鸟苷-3’-磷酸酯
Gms=2’-甲氧基鸟苷-3’-硫代磷酸酯
Gf=2’-氟鸟苷-3’-磷酸酯
Gfs=2’-氟鸟苷-3’-硫代磷酸酯
C=胞苷-3’-磷酸酯
Cm=2’-甲氧基胞苷-3’-磷酸酯
Cms=2’-甲氧基胞苷-3’-硫代磷酸酯
Cf=2’-氟胞苷-3’-磷酸酯
Cfs=2’-氟胞苷-3’-硫代磷酸酯
U=尿苷-3’-磷酸酯
Um=2’-甲氧基尿苷-3’-磷酸酯
Ums=2’-甲氧基尿苷-3’-硫代磷酸酯
Uf=2’-氟尿苷-3’-磷酸酯
Ufs=2’-氟尿苷-3’-硫代磷酸酯
本发明以下实施例中用于比较的实验数据P值<0.05，差异有统计学意义。
实施例1：寡核苷酸的合成
通过化学方法合成了中无修饰寡核苷酸序列SEQ ID NO. 1-48、49-96，及中修饰的寡核苷酸序列SEQ ID NO. 97-144、145-192。
1. 修饰的寡核苷酸的合成
1.1 中修饰的寡核苷酸序列的合成（以A1583-AL为例）
中修饰的寡核苷酸序列A1583-AL所对应的序列为：
5’-Cfs-Ums-Uf-Cm-Uf-Am-Af-Um-Gf-Am-Gf-Um-Cf-Gm-Af-Cm-Uf-Um-Uf-Gm-Af-3’（SEQ ID NO. 130）
反义链序列为：
5’-Ams-Afs-Am-Gf-Um-Cf-Gm-Af-Cm-Uf-Cm-Af-Um-Uf-Am-Gf-Am-Af-Gms-Afs-Am-3’（SEQ ID NO. 178）
正义链奇数点位均采用2’位氟代（2’-F）修饰，偶数点位均采用2’位甲氧基（2’-OMe）修饰；反义链奇数点位均采用2’位甲氧基（2’-OMe）修饰，偶数点位均采用2’位氟代（2’-F）修饰。正义链5’端和反义链5’/3’端各有2个硫代磷酸二酯键。
仪器和试剂：美国GE公司OligoPilot 400合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠（cross-linked polystyrene bead）的通用载体，型号为Primer support 5G Unylinker350（cytiva厂家）。
制备方法：
依照单体浓度为0.15 M，用乙腈分别配制以下核苷酸单体溶液：
DMT-A-OMe亚磷酰胺单体（式1）、DMT-C-OMe亚磷酰胺单体（式2）、DMT-G-OMe亚磷酰胺单体（式3）、DMT-U-OMe亚磷酰胺单体（式4）、DMT-A-F亚磷酰胺单体（式5）、DMT-C-F亚磷酰胺单体（式6）、DMT-G-F亚磷酰胺单体（式7）、DMT-U-F亚磷酰胺单体（式8）和DMT-dT亚磷酰胺单体（式9）。
采用如下步骤制备：
1）脱保护
使用3%的二氯乙酸的甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
2）偶联
使用0.25 M的5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。
（3）氧化/硫化
氧化：使用0.05M的碘的吡啶/水(90/10)溶液作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。
硫化：使用3%的氢化黄原素的吡啶溶液作为硫化剂，进行硫化，之后使用乙腈进行冲洗。
4）羟基保护
使用10%乙酸酐四氢呋喃溶液（CAP A）四氢呋喃/吡啶/氮甲基咪唑 74/10/16(v/v/v)（CAP B）为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。
重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。
5）脱保护
使用3%的二氯乙酸的甲苯溶液为脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
6）氨解及纯化
将固相载体转移至反应器中，加入浓氨水（25-28%），在60℃保持氨解12 h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，过层析柱，浓缩，冻干，得产品。
7）退火
将纯化后的正义链及反义链按1:1比例混合后，加热到95℃并保持3分钟后，缓慢降温至室温，形成双链。
1.2 中修饰的其它序列及阳性对照的合成
按照以上合成方法，合成中其它修饰寡核苷酸及修饰的阳性对照序列，其中对于siRNA序列的反义链，奇数位（即第1、3、5、7...21、23号位）使用2’-甲氧基修饰，偶数位（即第2、4、6、8...20、22号位）使用2’-氟代修饰。对于与反义链互补配对的正义链，在反义链上使用2’-甲氧基修饰的位置，正义链上的互补配对位置使用2’-氟代修饰；在反义链上使用2’-氟代修饰的位置，正义链上的互补配对位置使用2’-甲氧基修饰。
2. 无修饰的寡核苷酸的合成
中序列编号为1583的小干扰核糖核酸的序列为：
正义链：5’- CUUCUAAUGAGUCGACUUUGA -3’（SEQ ID NO. 34）
反义链：5’- AAAGUCGACUCAUUAGAAGAA -3’（SEQ ID NO. 82）
仪器和试剂：擎科192 P型号DNA/RNA自动合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠的通用载体，型号为Primer support 5G Unylinker 350（cytiva厂家）。
制备方法：
依照单体浓度为0.15 M，用乙腈分别配制以下核苷酸单体溶液：DMT-A-2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体（式10）、DMT-C-2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体（式11）、DMT-G-2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体（式12）和DMT-U-2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体（式13）。
式10 式11
式12 式13
采用如下步骤制备：
向合成仪指定位置装入固相载体，经过若干次合成循环得到相应的全保护的产物，合成循环包括（1）脱保护、（2）偶联、（3）氧化/硫化和（4）羟基保护，循环过程及所使用试剂描述如下：
（1）脱保护
使用3%二氯乙酸甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
（2）偶联
使用0.25 M的5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。
（3）氧化/硫化
氧化：使用0.05 M碘的吡啶/水(90/10)溶液作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。
硫化：使用3%氢化黄原素的吡啶溶液作为硫化剂，进行硫化，之后使用乙腈进行冲洗。
（4）羟基保护
使用10%乙酸酐四氢呋喃溶液（CAP A）四氢呋喃/吡啶/氮甲基咪唑 74/10/16(v/v/v)（CAP B）为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。
重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。
（5）使用3%二氯乙酸甲苯溶液为脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
（6）氨解及纯化
将反应完的固相载体转移至反应器中，加入浓氨水（25-28%），在60℃保持氨解12h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，过层析柱，浓缩，冻干，得2’-O-TBDMS保护的产品。
（7）脱TBDMS
向得到的产品中加入DMSO和三乙胺氢氟酸，在60℃下反应2h，然后向反应液中加入醋酸铵水溶液，震荡混匀，加入无水乙醇，震荡混匀后在-20℃下析晶8-12h。离心后倒掉上清液，沉淀用无水乙醇淋洗得无修饰的单链产品。
（8）退火
将得到的无修饰的正义链及反义链按1: 1比例混合后，加热到95℃并保持3 min后，缓慢降温至室温，形成无修饰的双链。
3．其他序列的合成
按上述方法合成中的其他序列。
实施例2：无修饰寡核苷酸对AGT基因的抑制作用
将实施例1中合成的48条无修饰寡核苷酸序列对AGT基因的抑制活性进行了检测。结果表明，无修饰序列1583、1812、1063和740，对HepG2细胞中AGT mRNA的表达具有显著抑制作用。其中抑制率最高的是1583，达到了64.50%，高于阳性对照；1812、1063和740抑制率也均在50%以上。
1．实验材料
无修饰寡核苷酸：中所列无修饰寡核苷酸序列，实施例1中合成
细胞种类：HepG2细胞（赛业，H1-1701）
阳性对照：APC（阿尔尼拉姆公司Zilebesiran药物序列）正义链与反义链（中SEQ ID NO. 47和95），实施例1中合成
药物溶媒：无菌无酶水、gibco Opti-MEM
2．实验方法
采用qRT-PCR检测样品对HepG2细胞系AGT基因mRNA表达的抑制情况。
2.1 细胞培养
取传代培养的HepG2细胞株，将对数生长的细胞用10%胎牛血清DMEM培养液（补充100×青霉素-链霉素10 μL/mL，Gibco，15070063），置于37℃含5% CO2的细胞培养箱中，每天换液一次。用0.25%胰酶消化传代，800 r/min离心3 min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2 细胞转染
转染混合液配制：将Lipofectamine RNAiMAX（赛默飞）和Opti-MEM按体积比2: 98比例混合后涡旋混匀。
转染试剂配制：按照体积比1: 1的比例取60 μL Opti-MEM稀释的siRNA溶液加入60 μL转染混合液，涡旋混匀后室温静置15 min，得到脂质纳米颗粒（LNP）。取12.5 μL用于包封率检测。包封率满足转染需求。
空白对照组转染试剂：在60μL Opti-MEM中加入制备好的转染混合液60 μL。涡旋混匀，室温静置15 min。
将配制好的转染试剂加入24孔细胞培养板中（每孔100 μL），使最终每孔siRNA浓度为0.07 nM。加入500 μL细胞悬液（每毫升含1.5×105个细胞）。使用十字法混匀后，放入37℃，5% CO2细胞培养箱，培养40 h。
2.3 AGT mRNA检测
1）RNA抽提
a．吸去24孔板中的培养液，每孔加入0.5 mL 1 × PBS清洗细胞，吸去PBS。在孔中加入0.5 mL TRIzol试剂，枪头吹打细胞充分裂解，转移至1.5 mL无RNA酶的EP管中，室温静置5 min。
b．每管加入0.1 mL氯仿，剧烈振荡15 sec，室温静置5 min。4 ℃离心，12,000 ×g 15 min，取上清200 μL至新EP管中。
c．加入等体积异丙醇，将管中液体上下颠倒轻轻混匀，-20℃静置10 min，4 ℃ 离心，12,000 × g 15 min，弃上清。
d．加入0.5 mL 75% 乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，4 ℃ 12,000 × g离心5 min，吸去上清。重复漂洗一次，4 ℃ 12,000 × g 离心1 min，用微量枪头将残留乙醇去除干净。
e．室温2-3 min晾干残留乙醇，加入40 μL RNase-free ddH2O进行溶解。
2）RNA浓度检测
使用nanodrop对RNA浓度进行检测。用2 μL RNase-free ddH2O作空白对照，每次用2 μL RNA样本进行检测。记录样本浓度。
3）AGT mRNA反转录
按体积比2:5:3混合反转录试剂（Takara，RR036A）、RNA溶液和水，于PCR仪中以37℃反应15 min、85℃反应5 s，最后维持在4℃。使用无菌无酶水将反应结束获得的cDNA稀释5倍。
4）AGT mRNA定量检测
在15 mL离心管中，按体积比5:0.1:0.1加入qPCR试剂（Takara，RR82WR）、上游引物（GAPDH-F: 5’-AGTATGACAACAGCCTCAAG-3’（SEQ ID NO: 193），AGT-F: 5’-ACTATCTCCCCGGACCATCC-3’（SEQ ID NO: 195））和下游引物（GAPDH-R: 5’-TCATGAGTCCTTCCACGATA-3’（SEQ ID NO: 194），AGT-R: 5’-CCTGATGCGGTCATTGCTCA-3’（SEQID NO: 196））并混匀，标记为A溶液。
标记好1.5 mL EP管，按体积比1:3.8，分别加入稀释的cDNA和水并混匀，标记为B溶液。
在96孔PCR板每孔分别加入A溶液5.2 μL + B溶液4.8 μL。盖上封板膜，3000 rpm离心1 min，上机检测。
*本环节在冰上操作，保持低温条件。
将板放入qPCR仪，按照以下程序运行：
预变性：95℃，30 sec；
循环反应：95℃，5 sec；60℃，34 sec；40个循环；
熔解曲线：95℃，15 sec；60℃，60 sec；95℃，15 sec。
运行时间约为2 h。分析实验结果，计算2-ΔΔCt。
2.4 数据处理
AGT mRNA表达率（%）计算公式为：
表达率 =（AGT mRNA表达量/空白对照组AGT mRNA表达量）×100%；
AGT基因表达抑制率（%）计算公式为：
AGT基因表达抑制率 = 1-表达率（%）。
3．实验结果
合成的无修饰寡核苷酸对AGT基因表达抑制作用具体数据列举见和图1。
1）一些无修饰序列对AGT基因表达具有显著抑制作用，包括1583、1812、1063和740，其中抑制作用最强的是1583和1812组，抑制率分别达到了64.50%和61.04%。
表 无修饰序列对AGT基因表达抑制率
序列名称 抑制率
1583 64.50%
APC 60.65%
1812 61.04%
1063 55.34%
740 50.45%
从可以看出，无修饰序列1583、1812、1063和740，对HepG2细胞中AGT mRNA的表达具有显著抑制作用，抑制作用最强的是1583和1812组，抑制率分别达到了64.50%和61.04%，其中1583抑制率为64.50%高于阳参APC的60.65%；其他组抑制率也均在50%以上。
上述这些化合物对AGT基因表达具有显著抑制作用，抑制率都在50%以上。
2）一些无修饰序列对AGT基因表达抑制作用在0–50%之间，包括1615、2034、1267、1384、1221、904、1030、1748、1155、760、1876、1296、673、994、1642、1912、720、830、2010、50、422、546、622、1323、1096、150、1980、128、1494、1934、167和等双链siRNA。
4）一些序列对AGT基因表达无抑制作用，包括478、289、226、490、2059、262、1530、198、11、341和1461等双链siRNA。其中1461的抑制率低于-20%。这些双链siRNA，对AGT基因表达无抑制作用。
注：NC对AGT基因表达抑制率为0.73%。
本公开设计的无修饰序列1583、1812、1063、740、1615、2034、1267、1384和1221，能够显著抑制AGT基因的表达（抑制率大于30%），进而降低血液中血管紧张素原的浓度，从而降低血压，实现对高血压的治疗。
实施例3：交替修饰策略对寡核苷酸抑制AGT基因作用的影响
本公开对本公开设计的无修饰寡核苷酸序列SEQ ID NO. 1-98采用了2′-F和2′-OMe交替修饰方案，考察此种修饰对无修饰序列活性的影响。
活性检测结果显示，采用2’-OMe与2’-F交替修饰序列A1583-AL、A1812-AL和A1063-AL的双链siRNA，对AGT基因的抑制率均达到了60%以上；A740-AL和A1615-AL抑制率也较高，达到了50%以上。
同时发现，2’-F和2’-OMe交替修饰对不同序列的活性影响不同，有的可以显著提高其抑制率，有的序列修饰后抑制率降低，有的对抑制率基本无影响。由此可知，采用2’-OMe与2’-F交替修饰方案对不同的序列影响不一致，并不是所有的序列经过同样的修饰都可以提高抑制作用。
1. 实验材料
交替修饰寡核苷酸：表3中所列修饰寡核苷酸，采用2’-OMe和2’-F交替修饰方案。其中正义链奇数位和反义链偶数位均为2’-F修饰，正义链偶数位和反义链奇数位均为2’-OMe修饰，实施例1中合成。
细胞种类：HepG2细胞（赛业，H1-1701）
阳性对照药品：交替修饰的APC，其中正义链奇数位和反义链偶数位均为2’-F修饰，正义链偶数位和反义链奇数位均为2’-OMe修饰，实施例1中合成。
药物溶媒：无菌无酶水、gibco DMEM。
2. 实验方法
实验方法同实施例2。
3. 实验结果
交替修饰寡核苷酸对AGT基因表达的抑制作用具体数据见表4和图2。
1）除阳参外的5条交替修饰序列对AGT基因表达具有显著抑制作用，包括A1583-AL、A1812-AL、A1063-AL和A740-AL。其中A1583-AL、A1812-AL和A1063-AL的抑制率均达到了60%。交替修饰序列与无修饰序列相比，抑制作用提升。
表4 交替修饰序列对AGT基因表达抑制率
无修饰序列号 序列编号 抑制率 无修饰序列抑制率 修饰提高抑制率
1583 A1583-AL 70.00% 64.50% 5.50%
APC APC-AL 69.00% 60.65% 8.35%
1812 A1812-AL 67.10% 61.04% 6.06%
1063 A1063-AL 65.10% 55.34% 9.76%
740 A740-AL 57.70% 50.45% 7.25%
从表4中可以看出，采用2’-OMe与2’-F交替修饰序列A1583-AL、A1812-AL、A1063-AL和A740-AL能够显著抑制AGT基因的表达，抑制率均超过50%。其中A1583-AL、A1812-AL和A1063-AL的抑制率均达到了60%。
由此可知，交替修饰序列A1583-AL、A1812-AL、A1063-AL和A740-AL能够抑制AGT基因的表达，进而抑制血液中血管紧张素原的浓度，可以用于治疗高血压。
并且，上述交替修饰序列对应的无修饰序列，即1583、1812、1063和740，对AGT基因的表达也具有显著抑制作用，抑制率都在50%以上。表明本公开设计的这些序列，无论是无修饰还是采用2’-OMe与2’-F交替修饰的序列，都能够抑制AGT基因的表达。
通过与无修饰序列抑制率对比可知，交替修饰对不同序列的活性影响不同，修饰后提高的抑制率在5.01%–9.76%之间。
2）一些交替修饰序列对AGT基因表达抑制率在0-50%之间，包括A1615-AL、A2034-AL、A1267-AL、A1384-AL、A1221-AL、A904-AL、A1030-AL、A1748-AL、A1155-AL、A760-AL、A1876-AL、A1296-AL、A673-AL、A994-AL、A1642-AL、A1912-AL、A720-AL、A830-AL、A2010-AL、A50-AL、A422-AL、A546-AL、A622-AL、A1323-AL、A1096-AL、A150-AL、A1980-AL、A128-AL、A1494-AL、A1934AL和A1675-AL等双链siRNA。通过与无修饰序列相比较可以看出，2’-OMe与2’-F交替修饰对不同序列抑制率影响不同，交替修饰提高的抑制率在2.54%-6.48%之间。
3）一些交替修饰序列对AGT基因表达没有抑制作用，包括A478-AL、A289-AL、A226-AL、A490-AL、A2059-AL、A262-AL、A1530-AL、A198-AL、A11-AL、A341-AL和A1461-AL等双链siRNA。例如，A1461-AL对AGT的抑制率为-26.60%。通过与无修饰序列相比较可以看出，2’-OMe与2’-F交替修饰对不同序列活性影响不同，交替修饰后抑制率提高在-5.99%–2.20%之间。
注：NC对AGT基因表达抑制率为-1.5%。
由此可知，本公开针对AGT mRNA设计的寡核苷酸序列，采用2’-OMe与2’-F交替修饰后，对AGT基因表达具有显著抑制作用，包括A1583-AL、A1812-AL、A1063-AL、A740-AL、A1615-AL、A2034-AL、A1267-AL、A1384-AL和A1030-AL。其中抑制率最高的是A1583-AL、A1812-AL和A1063-AL，抑制率均达到了60%，可用来开发治疗AGT基因相关疾病药物。
并且，采用2’-OMe与2’-F交替修饰方式，对本公开设计的不同无修饰寡核苷酸序列影响不一致，一些序列活性提高，一些序列活性降低，还有一些序列活性无变化，并不是所有的序列经过交替修饰都可以提高其抑制作用，不同序列会有一定差异。
实施例4：本公开设计序列与现有技术公开相近序列抑制率对比
将本公开中对AGT基因表达抑制作用较高的10个序列与现有技术公开的相近序列进行了比较。结果显示，本公开中无修饰序列1812没有相近已公开序列，序列1583、1063、740、1615、2034、1267、1384、1030和994，对HepG2细胞中AGT mRNA表达的抑制作用，在同等浓度下均优于已公开专利中的相似序列。例如，本公开序列1583的抑制率比相近序列1583P提高了13.57%；本公开序列1063的抑制率比相近序列1063P提高了28.14%；本公开序列740的抑制率比相近序列740P提高了12.51%。
1. 实验材料
本公开中序列1583、1063、740、1615、2034、1267、1384、1030和994，以及与这些序列接近的现有技术公开的序列，包括序列1583P、1063P、740P、1615P、2034P、1267P、1384P、1030P和994P，具体见表5。
表5 本公开中序列与现有技术公开的接近序列对比
出处 序列编号 本专利中编号 正义链序列5’–3’ SEQ ID NO. 反义链序列5’–3’ SEQ ID NO.
本公开 1583 1583 CUUCUAAUGAGUCGACUUUGA 34 AAAGUCGACUCAUUAGAAGAA 83
WO2023014765A1 AD-1633958 1583P CUUCUAAUGAGUCGACUUUGU 197 ACAAAGUCGACUCAUUAGAAGAA 206
本公开 1063 1063 CAAGGUGGAGGGUCUCACUUU 23 AGUGAGACCCUCCACCUUGUC 72
CN106574268B AD-60792 1063P CAAGGUGGAGGGUCUCACUUU 198 AAAGUGAGACCCUCCACCUUGUC 207
本公开 740 740 GCUGCUGAGAAGAUUGACAGG 17 UGUCAAUCUUCUCAGCAGCAA 66
WO2023014765A1 AD-1633321 740P GCUGCUGAGAAGAUUGACAGU 199 ACUGUCAAUCUUCUCAGCAGCAA 208
本公开 1615 1615 GCCGUUUCUCCUUGGUCUAAG 35 UAGACCAAGGAGAAACGGCUG 84
CN114763547A 1615P GCCGUUUCUCCUUGGUCUAAG 200 CUUAGACCAAGGAGAAACGGC 209
本公开 2034 2034 CCCUUGUGUUAGUAAUAAA 46 UUUAUUACUAACACAAGGG 95
CN113862268A 2034P CCCUUGUGUUAGUAAUAAACG 201 UUUAUUACUAACACAAGGGAG 210
本公开 1267 1267 GGAGGUGCUGAACAGCAUUUU 27 AAUGCUGUUCAGCACCUCCCC 76
WO2023014765A1 AD-1658955 1267P AGGUGCUGAACAGCAUUUUUU 202 AAAAAAUGCUGUUCAGCACCUCC 211
本公开 1384 1384 GUUUGCUGUGUAUGAUCAAAG 30 UUGAUCAUACACAGCAAACAG 79
WO2023088227A1 AD00255 1384P CUGUUUGCUGUGUAUGAUCAA 203 UUGAUCAUACACAGCAAACAG 212
本公开 1030 1030 GCUGAUCCAGCCUCACUAUGC 22 AUAGUGAGGCUGGAUCAGCAG 71
WO2023014765A1 AD-1633587 1030P GCUGAUCCAGCCUCACUAUGU 204 ACAUAGUGAGGCUGGAUCAGCAG 213
本公开 994 994 GACUCAAGUGCCCUUCACUGA 21 AGUGAAGGGCACUUGAGUCAC 70
WO2023014765A1 AD-1633551 994P GACUCAAGUGCCCUUCACUGU 205 ACAGUGAAGGGCACUUGAGUCAC 214
将表5序列进行合成，具体合成方法同实施例1。
2．实验方法
检测表5中所列寡核苷酸对AGT基因的抑制率，具体实验方法同实施例2。
3．实验结果
本公开中序列与专利公开相近序列对AGT基因表达抑制活性见表6。
表6 本公开设计序列与现有技术公开相近序列活性比较
本公开序列编号 抑制率（%） 相近序列编号 抑制率（%） 提高（%）
1583 64.50 1583P 50.93 13.57
1063 55.34 1063P 27.20 28.14
740 50.45 740P 37.94 12.51
1615 43.42 1615P 38.13 5.29
2034 34.05 2034P 24.98 9.07
1267 33.79 1267P 31.10 2.69
1384 33.62 1384P 28.39 5.23
1030 27.84 1030P 25.81 2.03
994 21.21 994P 20.89 0.32
从表6可以看出，本公开中筛选的无修饰序列1583、1063、740、1615、2034、1267、1384、1030和994，对AGT基因表达的抑制作用，在同等浓度下均优于已公开专利中的相似序列。例如，本公开序列1583的抑率为64.50%，而WO2023014765A1中公开的相近序列1583P的抑制率仅为50.93%，抑制率提高了13.57%；本公开序列1063的抑制率为55.34%，比CN106574268B中公开的相近序列1063P提高了28.14%；本公开序列740的抑制率为50.45%，比WO2023014765A1中公开的相近序列740P提高了12.51%。
由此可知，并不是序列相近的寡核苷酸对AGT基因表达抑制率就一定会接近，而是会很有可能相差非常大。例如，本公开序列1583与已公开序列1583P相比，正义链3’端1个核苷酸不同，反义链5’端少2个核苷酸（AC），但抑制率提高了13.57%；本公开序列1063与已公开序列1063P相比，正义链相同，反义链5’端少2个碱基（AA），但抑制率提高了28.14%；本公开序列740与已公开序列740P相比，正义链3’端1个碱基不同，反义链5’端少2个碱基（AC），但抑制率提高了12.51%。本公开中这些序列虽然与现有技术中公开序列差别很小，但是对AGT基因表达抑制率却显著提升。
本公开针对AGT mRNA序列设计了46条小干扰核糖核酸（siRNA）序列，包括46条正义链和46条反义链，并对这些序列进行了2’-OMe与2’-F交替修饰。通过将无修饰序列和交替修饰序列对AGT基因表达抑制活性检测，筛选出了一些对AGT基因表达具有显著抑制作用的目标序列。
1. 设计的46条无修饰寡核苷酸序列中，不同序列对AGT mRNA表达抑制活性差别非常大。其中一些序列对AGT基因表达具有显著抑制作用，包括1583、1812、1063和740。其中，1583抑制率达到了64.50%，高于阳性对照；1812抑制率也达到了61.04%，1063和740抑制率也均在50%以上。一些序列活性较高，例如1615、2034和1267等在30–50%之间。一些序列活性较低，还有一些序列无抑制作用。
由此可知，并不是所有针对AGT mRNA序列设计的siRNA序列对AGT 基因表达均具有抑制活性，不同序列会有非常大的差异，筛选出对AGT基因表达具有明显抑制作用的siRNA序列要付出大量创造性劳动。
2. 将设计的46条siRNA序列进行了2’-F和2’-Me交替修饰，活性检测结果显示，不同序列应用了相同的交替修饰后对AGT基因表达抑制活性差别非常大。其中，交替修饰序列A1583-AL、A1812-AL、A1063-AL和A740-AL对AGT基因表达具有显著抑制作用，抑制活性超过50%。其他序列活性在50%以下。
由此可知，并不是所有基础序列应用了2’-F和2’-Me交替修饰后对AGT基因表达均具有强的抑制活性，不同序列会有非常大的差异，筛选出可以通过2’-F和2’-Me交替修饰增强或保留对AGT基因表达具有显著抑制作用的siRNA基础序列要付出大量创造性劳动。
3. 设计的46条siRNA序列，2’-F和2’-Me交替修饰后，对不同序列的活性影响不同。
4. 本公开中筛选的无修饰序列1583、1063、740、1615、2034、1267、1384、1030和994，对AGT基因表达的抑制作用，在同等浓度下均优于已公开专利中的相似序列。例如，本公开序列1583的抑率为64.50%，而WO2023014765A1中公开的相近序列1583P的抑制率仅为50.93%，抑制率提高了13.57%；本公开序列1063的抑制率为55.34%，比CN106574268B中公开的相近序列1063P提高了28.14%；本公开序列740的抑制率为50.45%，比WO2023014765A1中公开的相近序列740P提高了12.51%。
结果表明，并不是序列相近的寡核苷酸对AGT基因表达抑制率就一定会接近，而是会很有可能相差非常大。本公开中这些序列虽然与现现有技术中公开序列差别很小，但是对AGT基因表达抑制率却显著提升。

Claims (13)

1.一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，其特征在于，所述siRNA包含以下任一寡核苷酸双链体：
1)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 34所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 82所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 130所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 178所示；
2)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 39所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 87所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 135所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 183所示；
3)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 23所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 71所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 119所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 167所示；
4)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 17所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 65所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 113所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 161所示；
5)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 35所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 83所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 131所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 179所示；
6)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 45所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 93所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 141所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 189所示；
7)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 27所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 75所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 123所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 171所示；
8)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 30所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 78所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 126所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 174所示；
9)所述正义链的序列如SEQ ID NO: 22所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 70所示；或，所述正义链的序列如SEQ ID NO: 118所示且所述反义链的序列如SEQ ID NO: 166所示。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。
3.如权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述靶向配体包含碳水化合物、多肽或脂质。
4.如权利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述靶向配体包含氨基糖或胆固醇。
5.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述靶向配体包含GalNAc。
6.如权利要求5所述的siRNA，其特征在于，所述GalNac为单价GalNAc、二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-6任一项所述的siRNA及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为LNP。
9. 如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述LNP为Lipofectamine®RNAiMAX，包含2,3-二油氧基-N-[2(精氨甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-全氟辛基三氟醋酸盐和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括其他AGT基因抑制剂和AGT蛋白抑制剂中的一种或两种，所述AGT蛋白抑制剂包括靶向AGT蛋白的抗体，所述AGT基因抑制剂包括靶向AGT基因的剪辑编辑器、靶向AGT基因转录的mRNA的反义寡核苷酸和微小RNA中的一种或多种。
11.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、钙通道阻滞剂和β受体阻滞剂中的一种或多种。
12.一种套装药盒，其特征在于，所述套装药盒包含如权利要求1-6任一项所述的siRNA或如权利要求7-11任一项所述的药物组合物中的一种或两种。
13.一种非治疗目的的降低AGT基因表达或抑制AGT复制的方法，其特征在于，所述方法包括对样本施用如权利要求1-6任一项所述的siRNA、如权利要求7-11任一项所述的药物组合物和如权利要求12所述的套装药盒中的一种或多种。
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