CN119040321A - 靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的dsRNA及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于林业生物技术领域，提供一种靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB‑JHEH的dsRNA及其制备方法与应用。本发明利用RNA干扰技术，通过干扰害虫关键调控基因RTB‑JHEH的表达，可以影响害虫的生长和发育，从而实现对害虫种群的控制，与传统的化学农药相比，具有更高的精准性和环境友好性，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于林业生物技术领域，具体地说，涉及一种靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的dsRNA及其制备方法与应用。
背景技术
红脂大小蠹（Dendroctonus valensLeConte），又名强大小蠹，英文名RedTurpentine Beetle(RTB)，属鞘翅目（Coleoptera），象虫科（Curculionidae），小蠹亚科（Scolytinae），大小蠹属（Dendroctonus），以幼虫和成虫在受害木树干基部和根部取食韧皮部，导致寄主韧皮被环食切断养分输送而死亡。红脂大小蠹于1998年于北美传入我国，红脂大小蠹在其原产地是一种无害的次生性害虫，但在新入侵地对油松危害极大，是中国最具破坏性的油松害虫，对中国森林生态安全造成了严重威胁。
RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术是一种基因沉默的方法，通过抑制特定基因的表达来研究其功能。基本原理是利用双链RNA（dsRNA,Double-strandedRNA）与特定mRNA序列互补结合并介导其降解或抑制其翻译，从而抑制目标基因的表达。在林业害虫防治中，RNAi技术可以被用于创造抗虫树种或者直接应用于害虫管理。通过设计特定的RNA分子，可以靶向性地沉默害虫基因，从而干扰害虫的正常生理过程或者增加其对农药的敏感性。RNAi技术具有更高的特异性和环境友好性，能够减少对非目标生物的影响，且有望减少对农药的过度使用。因此，RNAi技术在林业害虫防治中具有巨大的潜力，为实现可持续的林业发展提供了一种新的解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的dsRNA及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB-JHEH（基因RTB-JHEH序列如SEQ ID NO:6所示）的dsRNA，编码所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
第二方面，本发明提供含有所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第三方面，本发明提供所述dsRNA的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）提取红脂大小蠹总RNA，反转录为cDNA；
2）以cDNA为模板，分别利用SEQ ID NO:1、3所示引物和SEQ ID NO:2、4所示引物进行PCR扩增；
3）分别以2）得到的两种扩增产物作为正向模板和反向模板体外合成dsRNA。
第四方面，本发明提供所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或含有它们的生物材料在制备防治红脂大小蠹的制剂中的应用。
第五方面，本发明提供一种用于防治红脂大小蠹的制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒包含所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或含有它们的生物材料。
第六方面，本发明提供一种防治红脂大小蠹的方法，利用所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或含有它们的生物材料，采用注射法、喷洒法或饲喂法进行红脂大小蠹防治。
进一步地，所述dsRNA的有效剂量为每只≥2.5μg。
本发明中，防治对象包括红脂大小蠹幼虫。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明通过干扰害虫保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的表达，可以影响害虫的生长和发育，从而实现对害虫种群的控制，相比于传统农药，具有更低的非靶效应。
（二）由于本发明的高度特异性，可以减少化学农药对环境和非靶生物的污染和影响，有助于保护生态环境的健康。
（三）本发明通过基因干扰，可能导致害虫种群长期的生长和繁殖受阻，相比于化学农药，可能具有更持久的效果，减少了对频繁施药的需求，节约成本，同时降低了对环境和人类健康的潜在风险。
（四）dsRNA具有高度的靶向性，能够准确地作用于目标生物体内的保幼激素相关基因或信号通路，实现精准的生物调控，从而提高了调控效果。
（五）由于本发明的dsRNA可通过生物合成方法制备，因此其生产过程可能是可持续的，减少了对于化学合成原料的依赖，有利于可持续发展的目标。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中注射dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平。
图2为本发明较佳实施例中喷洒dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平。
图3为本发明较佳实施例中饲喂dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平。
图4为本发明较佳实施例中注射dsRNA后红脂大小蠹羽化畸形形态图。
具体实施方式
本发明提供一种提升红脂大小蠹防治效果的新方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种靶向红脂大小蠹基因的保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的dsRNA，所述dsRNA由第一RNA分子和第二RNA分子互补配对组成。
本发明提供一种制备所述dsRNA的引物组(RTB-JHEH引物组)，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：
5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGGCCTACGTTGGCATGTACT-3′ ；
所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体如下：5′-TTAAGTTGGGGTGCTGTTCC-3′ ；
所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体如下：
5′-GGCCTACGTTGGCATGTACT-3′ ；
所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，具体如下：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAGTTGGGGTGCTGTTCC-3′。
其中，GGATCCTAATACGACTCACTATAGGG（SEQ ID NO:5）为T7启动子。
本发明提供所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
（1）以红脂大小蠹的cDNA为模板，利用所述第一引物对进行第一PCR扩增，得到第一合成模板；
（2）以红脂大小蠹的cDNA为模板，利用所述第二引物对进行第二PCR扩增，得到第二合成模板；
（3）利用所述第一合成模板和第二合成模板，得到所述第一RNA分子和第二RNA分子；
（4）将所述第一RNA分子和第二RNA分子复性，得到所述RTB-JHEHdsRNA。
在本发明中，所述第一PCR扩增和第二PCR扩增的反应程序均优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
本发明对所述dsRNA合成的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。本发明实施例中优选利用Vazyme T7 RNAi Transcription Kit试剂盒进行dsRNA合成。
本发明还提供所述dsRNA或所述引物组或按照所述方法制备得到的dsRNA在防治红脂大小蠹中的应用。
本发明提供的dsRNA能高效沉默红脂大小蠹RTB-JHEH基因。注射dsJHEH后12hRTB- JHEH基因的相对表达量降低了98.64%，随着时间的增加沉默效果依旧存在；喷洒dsJHEH后24hRTB-JHEH基因的相对表达量降低了75.38%，饲喂dsJHEH后48hRTB-JHEH基因的相对表达量降低了92.04%，能够导致红脂大小蠹生长发育受到限制，影响幼虫进一步生命活动，最终达到防治的效果，为绿色防治林业害虫提供新思路。
本发明还提供所述dsRNA或所述引物组或按照所述方法制备得到的dsRNA在制备防治红脂大小蠹的制剂中的应用。
本发明提供一种防治红脂大小蠹的制剂。该制剂包含所述dsRNA，或由所述的引物组合制备的dsRNA，或采用所述方法制备得到的dsRNA。在本发明中，dsRNA的推荐有效剂量为每只≥2.5μg。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1RTB-JHEH克隆以及dsRNA合成
根据红脂大小蠹RTB-JHEH基因序列(SEQ ID NO:6)，设计合成红脂大小蠹RTB- JHEH的正向引物(SEQ ID NO:7)和反向引物(SEQ ID NO:8)，扩增获得3179bp的全长序列(SEQ ID NO:6)。通过上述第一引物对、第二引物对扩增得到片段长度为473bp的靶标序列(SEQ ID NO:9)，通过体外dsRNA合成试剂盒获得RTB-JHEH基因的dsRNA。
具体合成步骤如下：在特异性引物的5′端加一段T7启动子序列(SEQ ID NO:5)，通过带T7的引物和不带T7的引物交叉配对PCR扩增(即SEQ ID NO:1～4所示两对引物分别进行PCR扩增)，得到两种扩增产物；PCR扩增的模板是利用Yeasen总RNA提取试剂盒(参考细胞/组织总RNA提取试剂盒试剂说明书)提取红脂大小蠹幼虫总RNA，再利用Yeasen公司的Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA；PCR扩增的体系为：PCR 2 ×Phanta Max Buffer (诺唯赞)25μl、正、反向引物各2μl(浓度10μM)、cDNA模板1μl、ddH2O补足至50μl；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72 ℃延伸5min。得到的两种扩增产物，经电泳检测确认后可分别作为正向模板和反向模板合dsRNA(参照诺唯赞T7 RNAi Transcription Kit试剂盒说明书)，于微量分光光度计检测dsRNA浓度，并取1μL dsRNA于1％琼脂糖凝胶电泳检测确认，-80℃保存备用。
对照采用EGFP基因的dsRNA，合成方法参照上述RTB-JHEH基因的dsRNA。模板是含有EGFP基因片段的质粒。第一引物组正向引物为：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′(SEQ ID NO:10)，
反向引物为：5′-
CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′(SEQ ID NO:11)。
第二引物组正向引物为:5’- ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′(SEQ ID NO:12)
反向引物为：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′(SEQID NO:13)
实施例2 红脂大小蠹RTB-JHEH基因沉默效果的检测
将实施例1合成的RTB-JHEH基因dsRNA(记为dsJHEH，2.5μg/只)、实施例1合成的EGFP基因的dsRNA(记为dsEGFP，2.5μg/只)和ddH2O(1.5μL/只)，分别进行喷洒、饲喂红脂大小蠹实验，并显微注射入不同的红脂大小蠹幼虫腹部第二节间膜，分别于喷洒、饲喂、注射后12h、24h、48h，将整头幼虫液氮速冻后，放入-80℃备用。
利用Yeasen总RNA提取试剂(参考细胞/组织总RNA提取试剂盒试剂说明书)提取红脂大小蠹幼虫总RNA，再利用Yeasen公司的Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA，以此为模板运用荧光定量RT-PCR检测注射后RTB-JHEH基因的表达量。qRT-PCR涉及的JHEH引物序列为F: 5′-CCGCTTGCCCAGGTAGGATT-3′(SEQ ID NO:14)，R:5’-TGTAATGAGGTCCACGCT-3′(SEQ ID NO:15)。扩增程序：95℃预变性1min；94℃变性100s，60℃退火20s，35个循环。
注射dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平如图1所示。
喷洒dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平如图2所示。
饲喂dsRNA的红脂大小蠹RTB-JHEH基因表达水平如图3所示。
注射dsRNA后红脂大小蠹羽化畸形形态图如图4所示。
注射dsRNA后的红脂大小蠹死亡率如表1所示。
喷洒dsRNA后的红脂大小蠹死亡率如表2所示。
饲喂dsRNA后的红脂大小蠹死亡率如表3所示。
表1 注射dsRNA后的红脂大小蠹死亡率
表2 喷洒dsRNA后的红脂大小蠹死亡率
表3 饲喂dsRNA后的红脂大小蠹死亡率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.靶向红脂大小蠹保幼激素关键调控基因RTB-JHEH的dsRNA，其特征在于，编码所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
2.含有权利要求1所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
3.权利要求1所述dsRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取红脂大小蠹总RNA，反转录为cDNA；
2）以cDNA为模板，分别利用SEQ ID NO:1、3所示引物和SEQ ID NO:2、4所示引物进行PCR扩增；
3）分别以2）得到的两种扩增产物作为正向模板和反向模板体外合成dsRNA。
4.权利要求1所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或权利要求2所述生物材料在制备防治红脂大小蠹的制剂中的应用。
5.用于防治红脂大小蠹的制剂或试剂盒，其特征在于，所述制剂或试剂盒包含权利要求1所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或权利要求2所述生物材料。
6.一种防治红脂大小蠹的方法，其特征在于，利用权利要求1所述dsRNA或编码所述dsRNA的核苷酸序列或权利要求2所述生物材料，采用注射法、喷洒法或饲喂法进行红脂大小蠹防治。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述dsRNA的有效剂量为每只≥2.5μg。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，防治对象包括红脂大小蠹幼虫。
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